ES2623891T3 - Variantes de la lipoproteína 15 (Lp15) de Vibrio cholerae como aditivo anti-interferencia en inmunoensayos basados en TpN17 para la detección de anticuerpos anti-Treponema - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para detectar anticuerpos contra el antígeno TpN17 de Treponema pallidum en una muestra aislada, en el que se usa una secuencia peptídica de la lipoproteína 15 de Vibrio cholerae (VcLp15) como reactivo para reducir las interferencias y para minimizar los resultados falsos positivos, en el que dicha secuencia de VcLp15 comprende los restos de aminoácido 26-163 de las SEQ ID NO. 1 o 2 y en el que se pueden truncar de 1 a 5 aminoácidos del extremo N-terminal o C-terminal o de ambos extremos de dicha secuencia de VcLp15 y en el que dicha secuencia de Vc Lp15 se puede modificar por sustituciones conservadoras de aminoácidos de manera que la estructura tridimensional de la lipoproteína 15 de Vibrio cholerae (VcLp15) no sufra cambios.

Description

Variantes de la lipoproteína 15 (Lp15) de Vibrio cholerae como aditivo anti-interferencia en inmunoensayos basados en TpN17 para la detección de anticuerpos anti-Treponema

Campo de la invención

La invención se refiere a un procedimiento para detectar anticuerpos contra el antígeno TpN17 de Treponema pallidum en una muestra aislada en el que se usa una secuencia peptídica de la lipoproteína 15 de Vibrio cholerae (VcLp15) como reactivo para reducir interferencias y para minimizar los resultados falsos positivos. Además, la invención se refiere a polipéptidos de fusión que comprenden una secuencia peptídica de VcLp15 y una chaperona, a su uso como aditivo en un inmunoensayo para reducir interferencias y para minimizar los resultados falsos positivos y a un kit de reactivos para detectar anticuerpos contra antígenos de Treponema pallidum en una muestra aislada que comprende un antígeno TpN17 y dicho polipéptido de fusión de VcLp15-chaperona.

Antecedentes de la invención

La sífilis, también llamada lúes, es una enfermedad infecciosa grave que está causada por Treponema pallidum, que pertenece a la familia bacteriana de espiroquetas. Se transmite principalmente por contacto sexual, pero también se puede transmitir de una mujer embarazada al nonato durante el embarazo. La enfermedad se caracteriza por distintas fases clínicas y largos periodos de infección latente, asintomática. Muchos individuos infectados no notan los síntomas y, por tanto, no son conscientes de su infección por sífilis durante años. La infección primaria es localizada y habitualmente provoca una pequeña úlcera indolora (fase primaria, "lúes I"). Si no se trata con penicilina, la enfermedad pasa a la segunda fase lúes II (aproximadamente ocho semanas después de la infección), lo que conlleva síntomas similares a los de la gripe, erupciones cutáneas no pruriginosas e inflamación de los ganglios linfáticos. Después de algunos años, en la fase lúes III, aparecen ganglios sifilíticos por todo el cuerpo. La fase final (lúes IV) se caracteriza por destrucción del sistema nervioso central lo que, finalmente, da lugar a trastornos neurológicos y cardíacos, parálisis general, ataxia, demencia y ceguera.

Aunque se dispone de tratamientos eficaces desde la introducción de la penicilina a mediados del siglo XX, la sífilis sigue siendo un importante problema de salud mundial con 12 millones de nuevas infecciones estimadas en todo el mundo cada año. Es imprescindible identificar de forma fiable a los pacientes con infección por Treponema para iniciar el tratamiento con antibióticos y así prevenir la propagación de la sífilis.

Por ello, es necesario proporcionar herramientas de diagnóstico fiables tales como inmunoensayos para la detección de anticuerpos contra Treponema pallidum. Sin embargo, para poder utilizar las proteínas derivadas recombinantes como compuestos específicos en aplicaciones serológicas, tienen que cumplir varios requisitos tales como solubilidad, estabilidad y antigenicidad.

La TpN17 (Treponema pallidum cepa Nichols, 17 kDa), una pequeña proteína que consta de 134 restos de aminoácido en su forma madura, es el antígeno inmunodominante de Treponema pallidum , el agente causante de la sífilis (J. Clin. Lab. Immunol. (1998), 50, 27-44; Folia Microbial. (2003) 48 (4), 549-553). Los anticuerpos contra TpN17 son frecuentes y abundantes en los individuos infectados con Treponema, y es imprescindible usar TpN17 en un inmunoensayo que pretenda detectar de forma sensible y fiable las infecciones por Treponema.

El documento DE10207135A1 describe un inmunoensayo que usa TpN17 recombinante entre otros antígenos recombinantes de Treponema pallidum como antígeno para detectar anticuerpos contra Treponema pallidum. Los antígenos recombinantes se expresan en células huésped de E. coli. Después de la expresión de los antígenos, las células huésped se centrifugan, se resuspenden y se lisan. Un pequeño volumen de este lisado de E. coli se extiende a continuación sobre un portaobjetos de vidrio y se seca. El portaobjetos de vidrio sirve como sustrato en fase sólida para un inmunoensayo para detectar anticuerpos contra los antígenos TpN depositados.

Sin embargo, los autores de la presente invención observaron que un inmunoensayo usando TpN17 como antígeno tiende a mostrar resultados falsos positivos, es decir, proporciona una señal aparentemente positiva aunque, de hecho, no hay anticuerpos contra Treponema presentes en esa muestra. Estas interferencias son un fenómeno raro pero significativo. Comprometen la especificidad del inmunoensayo y se deben claramente al uso del antígeno TpN17 de Treponema pallidum, que es casi indispensable en un inmunoensayo de sífilis.

Por lo tanto, el problema subyacente de la presente invención se puede solucionar al proporcionar medios y procedimientos para evitar los resultados falsos positivos y aumentar la especificidad de los inmunoensayos basados en TpN17 para la detección de anticuerpos anti-Treponema.

Sumario de la invención

La presente invención, tal como se caracteriza en las reivindicaciones, resuelve el problema. En particular, la invención se refiere a un procedimiento para detectar anticuerpos contra el antígeno TpN17 de Treponema pallidum

en una muestra aislada en el que se usa una secuencia peptídica de la lipoproteína 15 de Vibrio cholerae (VcLp15) o una secuencia parcial de la misma como reactivo para reducir las interferencias, es decir, para minimizar los resultados falsos positivos. Dicha secuencia parcial de la secuencia del polipéptido VcLp15 puede comprender los aminoácidos 26-163 de la SEQ ID NO. 1. En un modo de realización adicional, dicha secuencia peptídica de VcLp15

5 o secuencia parcial de la misma se fusiona con una chaperona.

La invención también se refiere a un polipéptido de fusión que comprende una secuencia peptídica de VcLp15 de acuerdo con la SEQ ID NO. 1 o una secuencia parcial de la misma y una chaperona. En un modo de realización preferente, la chaperona fusionada a la secuencia peptídica de VcLp15 se selecciona del grupo que consiste en

10 SlyD, SlpA, FkpA y Skp.

En otro modo de realización preferente, el polipéptido de fusión comprende la SEQ ID NO. 3 que es un polipéptido de fusión de SlyD de E. coli y VcLp15 (EcSlyD-VcLp15).

15 La presente invención también abarca el uso de un polipéptido de fusión que comprende un péptido VcLp15 y opcionalmente una chaperona como aditivo en un inmunoensayo para reducir las interferencias y para minimizar los resultados falsos positivos.

En otro modo de realización, la invención se refiere a un kit de reactivos para la detección de anticuerpos contra 20 antígenos de Treponema pallidum en una muestra aislada mediante un inmunoensayo, que comprende un antígeno TpN17 y un polipéptido de fusión que comprende un péptido VcLp15 y opcionalmente una chaperona.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para detectar anticuerpos contra al antígeno TpN17 de Treponema pallidum en una muestra aislada, comprendiendo dicho procedimiento

25 a) formar una mezcla de inmunorreacción mezclando una muestra de fluido corporal con un ligando de unión específica al que se pueden unir específicamente dichos anticuerpos presentes en dicha muestra

b) añadir un polipéptido de fusión que comprende un péptido VcLp15 y opcionalmente una chaperona a dicha 30 mezcla de inmunorreacción antes, al mismo tiempo o después de que se añada dicho ligando de unión específica a dicha muestra

c) mantener dicha mezcla de inmunorreacción durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que los anticuerpos presentes en dicha muestra de fluido corporal inmunorreaccionen con dicho ligando de unión específica 35 para formar un producto de inmunorreacción; y

d) detectar la presencia y/o la concentración de cualquier cantidad de dicho producto de inmunorreacción.

Breve descripción de las figuras, tablas y SEQ ID NO.

40 La figura 1 muestra los espectros de CD en el UV cercano (espectros de dicroísmo circular en las regiones del ultravioleta) del polipéptido de fusión EcSlyD-VcLp15 de acuerdo con la invención; para más detalles, remítase el ejemplo 4 que describe la desnaturalización térmica de EcSlyD-VcLp15 por espectroscopia CD.

45 La figura 2 muestra las curvas de fusión del polipéptido de fusión EcSlyD-VcLp15 de acuerdo con la invención, por espectroscopia CD en la región del UV cercano. Para más detalles, ver el ejemplo 4.

La tabla 1 muestra los parámetros de las proteínas de las variantes de los polipéptidos de fusión usadas en este estudio (ejemplo 2).

50 Las tablas 2 a 5 muestran los resultados de los experimentos realizados de acuerdo con el ejemplo 5 sobre la actividad anti-interferencia de Lp15 de Vibrio cholerae en un inmunoensayo de sífilis.

La tabla 2 muestra los resultados para TpN17 oligomérico como antígeno específico de Treponema al que se añade 55 VcLp15 monomérica (fusionada con SlyD como chaperona) para reducir las interferencias.

La tabla 3 muestra los resultados para TpN17 monomérico como antígeno específico de Treponema al que se añade VcLp15 monomérica (fusionada con SlyD como chaperona) para reducir las interferencias.

60 La tabla 4 muestra los resultados para TpN17 oligomérico como antígeno específico de Treponema al que se añade VcLp15 oligomérica (fusionada con Skp como chaperona) para reducir las interferencias.

La tabla 5 muestra los resultados para TpN17 monomérico como antígeno específico de Treponema al que se añade VcLp15 oligomérica (fusionada con Skp como chaperona) para reducir las interferencias. 65

La SEQ ID NO. 1 muestra la secuencia completa de aminoácidos (163 restos) de la lipoproteína 15 de Vibrio cholerae (Vc Lp15) recuperada de la base de datos pública UniProt, n.º de acceso Q9KQN6. Los restos de aminoácido 1-25 constituyen la secuencia señal; la VcLp15 madura comprende los restos de aminoácido 26-163 (subrayados).

La SEQ ID NO. 2 muestra la secuencia de VcLp15 (26-163) como se usa en la fusión con diferentes módulos de chaperona. La secuencia de la VcLp15 madura (restos de aminoácido 26-163) carece de la secuencia de señal N

10 terminal (restos de aminoácido 1-25) y está desprovista de restos de cisteína. Los dos restos originales de cisteína de VcLp15 de las posiciones 74 y 77 [numeración de la proteína precursora] se remplazaron por restos de alanina – subrayados -para facilitar el procedimiento de replegamiento y para suprimir la formación de aductos de disulfuro. La VcLp15 alberga una cola de hexa-histidina en el extremo C-terminal (subrayada) para facilitar la purificación y para posibilitar el replegamiento acoplado a la matriz a través de una columna de metal (Ni, Zn, Cu).

La SEQ ID NO. 3 muestra EcSlyD-VcLp15 que es un polipéptido de fusión de acuerdo con la invención, que comprende una molécula de SlyD de E. coli como chaperona y la secuencia de VcLp15 madura (26-163, 20 subrayada).

La SEQ ID NO. 4 muestra EcSkp-VcLp15 que es un polipéptido de fusión de acuerdo con la invención, que 25 comprende una molécula de Skp de E. coli como chaperona y la secuencia de VcLp15 madura (26-163, subrayada).

La SEQ ID NO. 5 muestra la secuencia completa de TpN17 (restos de aminoácido 1-156) de Treponema pallidum 30 recuperada de la base de datos pública UniProt, accesible en UniProt ID P29722.

La SEQ ID NO. 6 muestra la secuencia de TpN17 como se usa en el ejemplo 5. Para este inmunoensayo, se usó la

35 proteína TpN17 madura (restos de aminoácido 23-156) que carecía de la secuencia de señal (restos de aminoácido 1-22). Los autores encontraron que los cuatro restos originales de cisteína de TpN17 eran prescindibles para la antigenicidad de la proteína (no se muestran datos). Por tanto, los restos de cisteína de las posiciones 25, 29, 42 y 58 (numeración de la proteína precursora) se remplazaron por restos de alanina (subrayados) para facilitar el procedimiento de replegamiento y para reducir las reacciones secundarias perjudiciales tales como la formación de

40 aductos de disulfuro.

La SEQ ID NO. 7 muestra los restos 23-156 de la secuencia de aminoácidos de TpN17 (véase también la SEQ ID NO. 6) como se usa en la fusión con diferentes módulos de chaperona. El TpN17 alberga una cola de hexa-histidina en el extremo C-terminal (subrayada) para facilitar la purificación y para posibilitar el replegamiento acoplado a la matriz a través de una columna de metal (Ni, Zn, Cu). Se omitió la secuencia de señal N-terminal de TpN17 (restos de aminoácido 1-22) para obtener la forma madura (procesada) de la proteína en su conformación de tipo nativo.

La SEQ ID NO. 8 muestra la secuencia de TpN17 (subrayada) a la que se han fusionado dos moléculas de SlyD 10 ("SlyD en tándem") de E. coli en el extremo N-terminal; esta molécula también se denomina EcSlyD-EcSlyD-TpN17

o EcSS-TpN17.

15 La SEQ ID NO. 9 muestra la secuencia de TpN17 (subrayada) a la que se han fusionado dos moléculas de SlyD ("SlyD en tándem") de Pasteurella multocida en el extremo N-terminal; esta molécula también se denomina PmSlyDPmSlyD-TpN17 o PmSS-TpN17.

La SEQ ID NO. 10 muestra la secuencia de TpN17 (subrayada) a la que se ha fusionado una molécula de FkpA de

E. coli en el extremo N-terminal; esta molécula también se denomina EcFkpA-TpN17.

La SEQ ID NO. 11 muestra la secuencia de TpN17 (subrayada) a la que se ha fusionado una molécula de Skp de E. coli en el extremo N-terminal; esta molécula también se denomina EcSkp-TpN17.

La SEQ ID NO. 12 muestra la secuencia de aminoácidos del espaciador rico en glicina (que comprende unidades triples de glicina separadas por una serina) que se puede usar como espaciador o conector flexible, soluble y resistente a las proteasas entre varios restos de chaperona.

Descripción detallada de la invención

Los inmunoensayos para la detección de anticuerpos contra Treponema pallidum tienden a mostrar resultados falsos positivos como podrían demostrar los autores de la invención. Especialmente, cuando se usa el antígeno TpN17 de Treponema, el número de señales falsas positivas es muy elevado. Este fenómeno se ha observado con sueros humanos que se han caracterizado definitivamente como anti-Treponema negativos: cuando se usa el antígeno TpN17, se encontró un número significativo de falsos positivos (véase el ejemplo 5). Sin embargo, TpN17 es un inmunógeno crucial en las infecciones por Treponema y un antígeno fundamental en la serología de la sífilis. Por eso no es una opción viable eludir este problema de interferencia omitiendo simplemente el antígeno TpN17.

Por lo tanto, los autores comenzaron diseñando una variante de TpN17 recombinante que posibilita la detección fiable y sensible de anticuerpos anti-TpN17. De forma más precisa, fusionamos TpN17 a una chaperona que confiere solubilidad (SlyD en tándem, concretamente EcSlyD-EcSlyD y PmSlyD-PmSlyD) a través de un conector flexible rico en restos de glicina y serina. Debido a los efectos beneficiosos de los auxiliares de plegamiento fusionados, el polipéptido de fusión resultante cumple todas las exigencias fisicoquímicas e inmunológicas de un buen antígeno con fines serológicos (es decir, para su uso en un inmunoensayo).

Las proteínas de fusión chaperona-TpN17 que los autores diseñaron para un inmunoensayo automatizado de sífilis son altamente solubles y reactivas y se usan ventajosamente en un formato de tipo sándwich de doble antígeno. Como se menciona anteriormente, durante los estudios de viabilidad para un inmunoensayo de sífilis, resultó que TpN17 es, de hecho, un antígeno de Treponema inmunodominante con una importancia diagnóstica sobresaliente. En otras palabras, es imprescindible usar una variante de TpN17 en un inmunoensayo de sífilis para garantizar la sensibilidad deseada. Sin embargo, cuando se usaron construcciones de fusión de polipéptidos de chaperona y TpN17 en el formato de tipo sándwich de doble antígeno (DAGS), el problema se hizo evidente: a pesar de que las construcciones de fusión de TpN17 se habían diseñado de manera asimétrica (es decir, la simetría del formato DAGS se evitó deliberadamente usando diferentes ligandos de fusión en el lado de la biotina y el lado del rutenio) y a pesar del uso de polímeros de chaperona como aditivos anti-interferencia, se produjo un buen número de resultados positivos en un panel de sueros humanos bien caracterizados anti-Treponema negativos, dando lugar a un empeoramiento sustancial de la especificidad del ensayo. Obviamente, algunos de los sueros humanos anti-Treponema negativos contenían al menos un factor desconocido que era capaz de interactuar específicamente con el antígeno TpN17.

Para la sorpresa de los autores, resultó que la adición de la proteína Lp15 derivada recombinante del patógeno humano Vibrio cholerae (VcLp15) – que, a pesar de ciertas homologías de secuencia, es un organismo muy diferente al Treponema pallidum a la mezcla de inmunoensayo redujo las señales elevadas de los falsos positivos al nivel de señal de sueros negativos como puede verse en el ejemplo 5 y en las tablas 2-5. Se concluye que VcLp15 (cuando se añade sin marcar) es capaz de reconocer, unirse e inactivar el factor o factores de interferencia desconocidos que interactúan con TpN17. De hecho, ha resultado que VcLp15 es una herramienta inestimable para reducir los resultados falsos positivos y para mejorar la especificidad de los inmunoensayos de sífilis basados en el antígeno TpN17 de Treponema.

Concretamente, la presente invención se refiere a un procedimiento para detectar anticuerpos contra el antígeno TpN17 de Treponema pallidum en una muestra aislada, en el que se usa una secuencia peptídica de la lipoproteína 15 de Vibrio cholerae (VcLp15) o una secuencia parcial de la misma como reactivo para reducir las interferencias y para minimizar los resultados falsos positivos.

Se puede usar cualquier antígeno TpN17 o variante del mismo con la condición de que la conformación del antígeno sea suficientemente similar a la nativa como para ser reconocida por los anticuerpos presentes en la muestra. En su huésped natural, T. pallidum, la secuencia de señal N-terminal de TpN17 (restos 1-22) se escinde de la proteína precursora para permitir el plegamiento de la parte de TpN17 madura en su conformación nativa. En otras palabras, la secuencia de señal es prescindible cuando TpN17 se produce de forma recombinante en un huésped procariota tal como E. coli. Más bien impide el plegamiento apropiado de la molécula diana y, por tanto, se omite. Preferentemente, se usa una secuencia peptídica de acuerdo con UniProt ID P29722 (SEQ ID NO. 5) o la SEQ ID NO. 6 o una secuencia parcial de las SEQ ID NO. 5 o 6. La secuencia parcial comprende al menos aproximadamente 100 aminoácidos de las SEQ ID NO. 5 o 6. La más preferente es una secuencia de aminoácidos que comprende los restos de aminoácido 23-156 de la SEQ ID NO. 5 o los restos de aminoácido 1-134 de la SEQ ID NO. 6.

Un antígeno TpN17 preferente es un polipéptido de acuerdo con las SEQ ID NO. 7 a 11 en el que TpN17 se ha fusionado a diversas secuencias peptídicas de chaperona. Para facilitar el procedimiento de replegamiento después de la purificación y para inhibir la formación de aductos de disulfuro, los restos de cisteína de todos los anticuerpos anti-TpN17 previstos se pueden remplazar por otros restos de aminoácido, tales como alanina o serina. Estos restos remplazan el resto tiol sensible a la oxidación de la cadena lateral de cisteína, pero son casi del mismo tamaño que el resto de cisteína. Por lo tanto, habitualmente encajan en la estructura tridimensional global de la proteína y no comprometen seriamente el plegamiento ni la estabilidad de la variante de la proteína libre de cisteína.

De acuerdo con el procedimiento de la presente invención, se usa una secuencia peptídica de la lipoproteína 15 de Vibrio cholerae (VcLp15) o una secuencia parcial de la misma como reactivo para reducir las interferencias, es decir, para minimizar los resultados falsos positivos. Preferentemente, dicha secuencia parcial de VcLp15 comprende los restos de aminoácido 26-163 de las SEQ ID NO. 1 o 2. La secuencia de señal N-terminal que comprende los restos 1-25 de la SEQ ID NO. 1 es prescindible. En otro modo de la invención se pueden truncar de 1 a 5 aminoácidos del extremo N-terminal o C-terminal o de ambos extremos de dicha secuencia parcial de VcLp15 de los restos de aminoácido 26-163 de las SEQ ID NO. 1 o 2. En otro modo de realización, dicha secuencia parcial de VcLp15 de los restos de aminoácido 26-163 de las SEQ ID NO. 1 o 2 se puede modificar de tal manera que se pueden introducir sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, se puede sustituir un resto de alanina por un resto de serina o cisteína. Cualquiera de estos tres aminoácidos se puede remplazar por los otros dos aminoácidos. Otros ejemplos de sustituciones conservadoras de aminoácidos conocidas por un experto en la técnica son serina/cisteína/alanina, isoleucina/valina o fenilalanina/tirosina. Para cualquiera de estas modificaciones es importante que la estructura tridimensional de la lipoproteína 15 de Vibrio cholerae (VcLp15) no sufra cambios.

Preferentemente, la secuencia peptídica de VcLp15 o la secuencia parcial de la misma usada en el procedimiento descrito anteriormente se fusiona a una chaperona para proporcionar altos rendimientos de expresión y para facilitar el procedimiento de replegamiento después de la purificación.

Otro aspecto de la invención es un polipéptido de fusión que comprende una secuencia peptídica de VcLp15 de acuerdo con la SEQ ID NO. 1 o 2 o una secuencia parcial de las SEQ ID NO. 1 o 2 y una chaperona.

El uso de proteínas de fusión con polipéptidos en las que las chaperonas se fusionan a secuencias de antígenos diana difíciles para solubilizarlas y hacerlas más inocuas es bien conocido en la técnica y se ha descrito con gran detalle anteriormente, tal como en la solicitud de patente internacional WO 2003/000878. Los ejemplos conocidos y bien documentados de chaperonas de fusión útiles son SlyD, FkpA, Skp y SlpA, véase también la solicitud de patente europea EP2127678A1.

Por lo tanto, otro aspecto de la invención es un polipéptido de fusión que comprende una secuencia peptídica de VcLp15 y una chaperona. En un modo de realización preferente, la chaperona se selecciona del grupo que consiste en SlyD, SlpA, FkpA y Skp. Estas chaperonas pueden proceder de diversos organismos, preferentemente las secuencias de chaperona se derivan de E. coli.

En otro modo de realización de la invención, el polipéptido de fusión que comprende una secuencia peptídica de VcLp15 comprende la SEQ ID NO. 3 (EcSlyD-VcLp15).

El uso de un polipéptido de fusión que comprende una secuencia peptídica de VcLp15 y una chaperona como aditivo en un inmunoensayo para reducir interferencias y para minimizar los resultados falsos positivos es también un aspecto de la presente invención.

Otro aspecto de la invención es un kit de reactivos para la detección de anticuerpos contra antígenos de Treponema pallidum en una muestra aislada mediante un inmunoensayo, que comprende un antígeno TpN17 y un polipéptido de fusión que comprende una secuencia peptídica de VcLp15 y una chaperona como se describe con más detalle anteriormente.

Además, la invención cubre un procedimiento para detectar anticuerpos contra el antígeno TpN17 de Treponema pallidum en una muestra aislada, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de

a) formar una mezcla de inmunorreacción mezclando una muestra de fluido corporal con un ligando de unión específica al que se puede unir específicamente dichos anticuerpos presentes en dicha muestra

b) añadir un polipéptido de fusión que comprende una secuencia peptídica de VcLp15 como se define anteriormente a dicha mezcla de inmunorreacción antes, al mismo tiempo o después de añadir dicho ligando de unión específica a dicha muestra

c) mantener dicha mezcla de inmunorreacción durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que los anticuerpos presentes en dicha muestra de fluido corporal inmunorreaccionen con dicho ligando de unión específica para formar un producto de inmunorreacción; y

d) detectar la presencia y/o la concentración de cualquier cantidad de dicho producto de inmunorreacción.

El polipéptido de fusión de la invención se puede añadir a la mezcla de inmunoensayo (que comprende la muestra y un ligando de unión que se une específicamente a los anticuerpos analito de la muestra) antes, al mismo tiempo o después de añadir dicho ligando de unión específica a la muestra. Preferentemente, el polipéptido de fusión se añade a los reactivos de prueba antes de que la muestra de fluido corporal, que contiene los anticuerpos analito, se ponga en contacto con los ligandos de unión específica.

En un modo de realización de la invención, el inmunoensayo para detectar anticuerpos anti-Treponema en una muestra aislada se realiza de acuerdo con el denominado concepto de tipo sándwich de doble antígeno (DAGS). A veces, este concepto de ensayo también se denomina concepto de puente de doble antígeno, porque los dos antígenos son unidos en puente por un analito de anticuerpo. En dicho ensayo, se requiere y se usa la capacidad de un anticuerpo de unirse a al menos dos moléculas diferentes de un antígeno dado con sus dos (IgG, IgE), cuatro (IgA) o diez/doce (IgM) parátopos.

En mayor detalle, se lleva a cabo un inmunoensayo para determinar la presencia de anticuerpos anti-Treponema de acuerdo con el formato de puente de doble antígeno incubando una muestra que contiene los anticuerpos anti-Treponema con dos antígenos TpN17 diferentes, es decir, un primer antígeno TpN17 ("fase sólida") y un segundo antígeno TpN17 ("detección"), en el que cada uno de dichos antígenos se une específicamente a dichos anticuerpos anti-Treponema. El primer antígeno está unido o se puede unir directa o indirectamente a una fase sólida y habitualmente porta un grupo efector que es parte de un par de unión con bioafinidad como biotina/avidina. Por ejemplo, si el primer antígeno se conjuga con biotina, la fase sólida se recubre con avidina o estreptavidina. El segundo antígeno porta un marcador detectable. Entonces se forma una mezcla de inmunorreacción que comprende el primer antígeno, el anticuerpo de la muestra y el segundo antígeno. Una fase sólida a la que se puede unir el primer antígeno se añade antes de agregar la muestra a dichos antígenos o después de que se forme la mezcla de inmunorreacción. Esta mezcla de inmunorreacción se mantiene durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que los anticuerpos anti-Treponema contra dichos antígenos TpN17 de la muestra de fluido corporal inmunorreaccionen con dichos antígenos TpN17 para formar un producto de inmunorreacción. La siguiente etapa es una etapa de separación en la que la fase líquida se separa de la fase sólida. Finalmente, la presencia de cualquiera de dichos productos de inmunorreacción se detecta en la fase sólida o líquida o en ambas.

En dicho inmunoensayo de DAGS, las estructuras básicas del "antígeno de la fase sólida" y el "antígeno de detección" son las mismas. También es posible usar antígenos TpN17 similares pero diferentes, que formen una reacción cruzada inmunológica en un ensayo de puente de doble antígeno. El requisito esencial para realizar dichos ensayos es que el epítopo relevante o los epítopos relevantes estén presentes en ambos antígenos. De acuerdo con la invención, es deseable usar diferentes restos de fusión para cada antígeno TpN17 (por ejemplo, Ec FkpA se fusiona a TpN17 en el lado de la fase sólida y EcSkp se fusiona a TpN17 en el lado de detección) ya que dichas variaciones rompen la simetría del formato DAGS y, por tanto, reducen el problema de formación de puentes mediada por anticuerpos de las chaperonas de fusión que daría lugar a un resultado falso positivo del inmunoensayo. En resumen, el uso de ligandos de fusión estructuralmente lejanos en ambos lados de un formato DAGS reduce las reacciones cruzadas inmunológicas no deseadas y mejora, por tanto, la especificidad.

Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un procedimiento para detectar anticuerpos contra el antígeno TpN17 de Treponema pallidum en una muestra aislada en el que se usa una secuencia peptídica de VcLp15 como reactivo para reducir las interferencias y para minimizar los resultados falsos positivos. Dicho procedimiento se caracteriza, además, porque el ensayo se lleva a cabo en el formato de tipo sándwich de doble antígeno (DAGS). Además, dicho ensayo usa dos polipéptidos de fusión del antígeno TpN17 -un primer y un segundo antígeno TpN17 -en el que ambos antígenos TpN17 son idénticos o al menos forman una reacción cruzada inmunológica con los mismos anticuerpos de modo que es posible la formación de puentes entre ambos antígenos por los anticuerpos presentes en la muestra. Además, el primer y el segundo antígenos se fusionan a diferentes chaperones como se describe en el párrafo precedente.

Además, el uso de ligandos de fusión de chaperonas específicos como Skp y FkpA puede facilitar un reconocimiento y detección considerablemente mejorados por parte de las IgM. Debido a la avidez de su modo de unión, las moléculas de IgM pueden reaccionar únicamente con antígenos poliméricos que poseen una densidad de epítopos media o alta. Tanto Skp como FkpA son chaperonas oligoméricas que cumplen una función como auxiliares de plegamiento en el periplasma de las bacterias Gramnegativas. Para sorpresa de los autores de la presente invención, se observó que la estructura cuaternaria de Skp y FkpA se mantenía cuando se fusionan moléculas diana grandes con los extremos C-terminales de las chaperonas. Como consecuencia, las proteínas de fusión FkpA-TpN17 y Skp-TpN17 forman de forma reproducible oligómeros naturales con densidades de epítopos definidas que son suficientes para detectar moléculas de IgM. La detección sensible y específica de las IgM es una característica muy importante que garantiza una detección fiable de infecciones precoces y primarias de sífilis. Como se pretende desarrollar un inmunoensayo para la detección de las inmunoglobulinas totales (es decir, la detección tanto de IgG como de IgM), los módulos antigénicos oligoméricos FkpA-TpN17 y Skp-TpN17 se pueden usar de forma ventajosa como determinantes en ambos lados de un formato DAGS (por ejemplo, FkpA-TpN17-biotina y Skp-TpN17-rutenio). Como FkpA y Skp son muy distintos entre sí en términos de estructura, el riesgo de reacción cruzada inmunológica

no deseada y de formación de puentes a través de los ligandos de fusión es muy bajo. Se reduce aún más añadiendo al ensayo los aditivos anti-interferencia FkpA y Skp polimerizados químicamente.

Se han descrito ampliamente diversos formatos y principios adicionales de inmunoensayos para detectar analitos y diferentes modos de detección y son conocidos para un experto en la técnica.

De acuerdo con la invención, se puede usar cualquier muestra biológica aislada en la que puedan detectarse anticuerpos anti-Treponema. En particular, la sangre humana, el suero, el plasma o la saliva son adecuados como material de muestra.

La invención se ilustra adicionalmente en la sección de ejemplos.

Ejemplo 1

Clonación y purificación de polipéptidos de fusión con chaperonas de TpN17 y VcLp15

Clonación de casetes de expresión

Sobre la base del plásmido de expresión pET24a de Novagen (Madison, WI, EE. UU.), se obtuvieron casetes de expresión que codifican proteínas de fusión de TpN17 y VcLp15, esencialmente como se describe (Scholz, C. et al.,

J. Mol. Biol. (2005) 345, 1229-1241). Las secuencias de los antígenos TpN17 y VcLp15 se recuperaron de la base de datos SwissProt (código de SwissProt: P29722 y Q9KQN6, respectivamente). Un gen sintético que codifica los aa 23-156 de TpN17 maduro (el péptido señal que abarca los restos de aminoácido 1-22 se omitió) con una región conectora rica en glicina fusionada en fase al extremo N-terminal se adquirió de Medigenomix (Martinsried, Alemania). Los restos de cisteína de TpN17 de las posiciones 25, 29, 42 y 58 se cambiaron a restos de alanina para evitar efectos secundarios no deseados tales como la oxidación o la formación de puentes disulfuro intermoleculares. Los sitios de restricción BamHI y Xhol estaban en los extremos 5' y 3' de la región codificante de TpN17, respectivamente. Otro gen sintético que codifica dos unidades EcSlyD (restos 1-165 de acuerdo con la SEQ ID NO. 1, SwissProt n.º de acceso P0A9K9) conectadas a través de una región conectora rica en glicina y que abarca parte de una región conectora adicional en el extremo C-terminal, también se adquirió de Medigenomix. Los sitios de restricción Ndel y BamHI estaban en los extremos 5' y 3' de este casete, respectivamente. Los genes y los sitios de restricción se diseñaron para posibilitar la fusión en fase de la parte de la chaperona EcSlyD-EcSlyD y la parte del antígeno TpN17 por ligamiento simple. Para evitar procesos de recombinación accidentales y para aumentar la estabilidad genética del casete de expresión en el huésped de E. coli, las secuencias de nucleótidos que codifican las unidades EcSlyD se degeneraron, al igual que las secuencias de nucleótidos que codifican las regiones conectoras ampliadas, es decir, se usaron diferentes combinaciones de codones para codificar secuencias de aminoácidos idénticas.

El vector pET24a se digirió con Ndel y Xhol y se insertó el casete que comprendía SlyD en tándem fusionado en fase a los aa 23-156 del TpN17 de Treponema. De este modo se construyeron casetes de expresión que comprenden SlyD de Pasteurella multocida (1-156, código de SwissProt: Q9CKP2) o Skp (21-161, código de SwissProt: P0AEU7) o FkpA de E. coli (26-270, código de SwissProt: P45523), así como casetes de expresión que comprenden polipéptidos diana diferentes de TpN17, especialmente la lipoproteína Lp15 de Vibrio cholerae (26-163, código de SwissProt: Q9KQN6). Al igual que con TpN17, los restos de cisteína originales de VcLp15 de las posiciones 74 y 77 (numeración de la Lp15 precursora) se cambiaron a restos de alanina para evitar efectos secundarios no deseados tales como la oxidación o la formación de puentes disulfuro intermoleculares. Todas las variantes del polipéptido de fusión recombinante contenían una cola de hexahistidina C-terminal para facilitar la purificación asistida por Ni-NTA y el replegamiento. Se utilizó QuikChange (Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU.) y técnicas estándar de PCR para generar mutaciones puntuales, variantes de deleción, de inserción y de extensión o sitios de restricción en los casetes de expresión respectivos.

A continuación, el dibujo muestra un esquema del antígeno TpN17 de longitud completa (23-156) de Treponema que porta dos unidades de chaperona SlyD fusionadas en fase a su extremo N-terminal. Para indicar que el ligando de fusión SlyD procede de E. coli, el polipéptido de fusión representado se ha denominado EcSlyD-Ec SlyD-TpN17 (23156); véase también la SEQ ID NO. 8.

Nde I Xho I

BamHI

EcSlyD (1-165)

L EcSlyD (1-165) L TpN17

L = conector (GGGS)5GGG

El inserto del plásmido resultante se secuenció y se descubrió que codificaba la proteína de fusión deseada. La secuencia completa de aminoácidos de los polipéptidos de la fusión TpN17 y VcLp15 se muestra en las SEQ ID NO. 2a4(VcLp15) y 7 a 11 (TpN17). La secuencia de aminoácidos del conector L se muestra en la SEQ ID NO. 12.

Purificación de proteínas de fusión que comprenden TpN17 o VcLp15

Todas las variantes de la proteína de fusión de TpN17 y VcLp15 se purificaron usando protocolos prácticamente idénticos. Las células de E. coli BL21 (DE3) que portaban el plásmido de expresión de pET24a particular se cultivaron a 37 ºC en medio LB más kanamicina (30 µg/ml) a una DO600 de 1,5 y se indujo la sobreexpresión citosólica añadiendo isopropil-β-D-tiogalactósido 1 mM. Tres horas después de la inducción, las células se recogieron por centrifugación (20 min a 5000 g), se congelaron y se almacenaron a -20 ºC. Para la lisis celular, el sedimento congelado se resuspendió en fosfato de sodio 50 mM enfriado a pH 8,0, GdmCl 7,0 M, imidazol 5 mM y la suspensión se agitó durante 2 h sobre hielo para completar la lisis celular. Después de la centrifugación y la filtración (0,45 µm/0,2 µm), el lisado en bruto se aplicó a una columna de Ni-NTA equilibrada con el tampón de lisis que incluía TCEP 5,0 mM. La etapa de lavado posterior se adaptó para la proteína diana respectiva y varió de 5 a 15 mM de imidazol (en fosfato de sodio 50 mM a pH 8,0, GdmCl 7,0 M, TCEP 5,0 mM). Se aplicaron al menos 10-15 volúmenes del tampón de lavado. A continuación, la solución de GdmCl se remplazó por fosfato de potasio 50 mM pH 8,0, KCl 100 mM, imidazol 10 mM, TCEP 5,0 mM para inducir el replegamiento conformacional de la proteína unida a la matriz. Para evitar la reactivación de las proteasas de copurificación, se incluyó un coctel inhibidor de proteasas (Complete® libre de EDTA, Roche) en el tampón de replegamiento. Se aplicó un total de 15-20 volúmenes de columna de tampón de replegamiento en una reacción durante la noche. A continuación, se eliminaron tanto el TCEP como el cóctel inhibidor Complete® libre de EDTA por lavado con 3-5 volúmenes de columna de fosfato de potasio 50 mM pH 8,0, KCl 100 mM, imidazol 10 mM. Posteriormente, la concentración de imidazol – aún en fosfato de potasio 50 mM a pH 8,0, KCl 100 mM – se elevó a 25 -50 mM (dependiendo de la proteína diana respectiva) para eliminar los contaminantes de proteína unidos de forma no específica. La proteína nativa se eluyó luego con imidazol 500 mM en el mismo tampón. Las fracciones que contenían proteínas se evaluaron para determinar la pureza por Tricina-SDS-PAGE y se combinaron. Finalmente, las proteínas se sometieron a cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex HiLoad, Amersham Pharmacia) y las fracciones que contenían proteínas se combinaron y se concentraron hasta 10-20 mg/ml en una celda de Amicon (YM10).

Después del protocolo de purificación y replegamiento acoplado, se pudieron obtener rendimientos de proteína de aproximadamente 10-30 mg de 1 g de células húmedas de E. coli, dependiendo de la proteína diana respectiva.

Ejemplo 2

Mediciones espectroscópicas

Las mediciones de concentración de proteínas se realizaron con un espectrofotómetro de doble haz Uvikon XL. Los coeficientes de extinción molar (ε280) se determinaron usando el procedimiento descrito por Pace (1995), Protein Sci. 4, 2411-2423. Los coeficientes de extinción molar (ε M280) usados para los distintos polipéptidos de fusión se especifican en la tabla 1.

Tabla 1: Parámetros de las proteínas de las variantes de los polipéptidos de fusión usadas en este estudio. Todos los parámetros se refieren a los monómeros de proteína respectivos.

proteína de fusión

longitud de peso pl

la proteína

molecular

diana

del M-1 cm -1 (= 1 mg/ml)

(restos de

polipéptido

aa)

de fusión

(Da)

variantes de TpN17

EcSlyD-EcSlyD-TpN17

23-156 54048 5,0 23380 0,433

PmSlyD-PmSlyD-TpN17

23-156 52171 4,9 23380 0,448

EcFkpA-TpN17

23-156 42995 8,3 27390 0,637

EcSkp-TpN17

23-156 32461 9,3 12950 0,399

variantes de VcLp15

EcSlyD-VcLp15

26-163 35156 4,6 22920 0,652

EcSkp-VcLp15

26-163 33010 5,3 18450 0,559

Las secuencias de aminoácidos de las variantes del polipéptido de fusión se muestran en las SEQ ID NO. 3, 4, 8, 9, 10 y 11, respectivamente. Ejemplo 3

Acoplamiento de restos de biotina y rutenio a las proteínas de fusión de TpN17 Los grupos ε-amino de las lisinas de los polipéptidos de fusión de TpN17 se modificaron a concentraciones de proteína de 10-30 mg/ml con moléculas marcadoras de biotina y rutenio activadas con N-hidroxi-succinimida,

respectivamente. La proporción de marcador/proteína varió de 2/1 a 5/1 (mol/mol), dependiendo de la proteína de fusión respectiva. El tampón de reacción era fosfato de potasio 150 mM a pH 8,0, KCl 100 mM, EDTA 0,5 mM. La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 15 min y se inactivó añadiendo L-lisina tamponada hasta una concentración final de 10 mM. Para evitar la inactivación hidrolítica de los marcadores, las soluciones madre respectivas se prepararon en DMSO seco (calidad SeccoSolv, Merck, Alemania). Todas las proteínas de fusión estudiadas toleraron bien las concentraciones de DMSO de hasta un 25 % en el tampón de reacción. Después de la reacción de acoplamiento, se eliminó el marcador libre sin reaccionar pasando el conjugado de proteína en bruto por una columna de filtración en gel (Superdex 200 HiLoad).

Ejemplo 4

Desnaturalización de EcSlyD-VcLp15 inducida térmicamente, detectada por CD

Los espectros por CD en el UV cercano se registraron con un espectropolarímetro Jasco-720 con un portacubetas termorregulado y se convirtieron a la elipticidad media de los restos. El tampón era fosfato de potasio 50 mM a pH 7,0, KCl 250 mM, EDTA 0,5 mM. La longitud de la trayectoria fue de 0,2 cm, la concentración de proteína fue de ~ 74 µM (2,6 mg/ml). El intervalo de medición fue de 250 -330 nm, el ancho de banda fue de 1,0 nm, la velocidad de exploración fue de 20 nm/min a una resolución de 0,5 nm y la respuesta fue de 1 s. Para mejorar la proporción de señal a ruido, los espectros se midieron nueve veces y se promediaron.

La espectroscopía de dicroísmo circular (CD) es el procedimiento de elección para evaluar tanto la estructura secundaria como la terciaria de las proteínas. La elipticidad en la región aromática (260-320 nm) informa sobre los contactos terciarios dentro de una proteína (es decir, la estructura globular de una proteína plegada regularmente) y se considera como la región de huella dactilar de un plegamiento nativo (conformación).

Se controlaron los espectros por CD en el UV cercano de EcSlyD-VcLp15 para abordar la cuestión de si la proteína de fusión adopta una conformación ordenada después del procedimiento de replegamiento acoplado a la matriz que es la etapa crucial en el procedimiento de purificación. La respuesta es bastante clara: la señal por CD en el UV cercano de EcSlyD-VcLp15 informa inequívocamente de una estructura terciaria ordenada del polipéptido de fusión. Los restos aromáticos de EcSlyD-VcLp15 están obviamente incrustados en el núcleo de proteína lipófila y, por tanto, experimentan un entorno asimétrico que apunta claramente a una conformación nativa de Ec SlyD-VcLp15 dentro de la construcción de fusión (figura 1).

Para abordar la cuestión de si la desnaturalización inducida térmicamente de EcSlyD-VcLp15 es reversible, se obtuvieron las curvas de fusión en la región del UV cercano a una longitud de onda de detección de 281 nm. El intervalo de temperatura fue de 20-80 ºC, el ancho de banda fue de 1,0 nm, la rampa de temperatura fue de 1 ºC/min y la respuesta fue de 4 s (véase la figura 2).

La desnaturalización inducida térmicamente se controló a 281 nm (que es la longitud de onda de la amplitud de señal máxima para EcSlyD-VcLp15). Al calentarse, los contactos no covalentes que estabilizan la conformación nativa de la molécula EcSlyD-VcLp15 se aflojan y finalmente se rompen. Esta desnaturalización inducida térmicamente se refleja en un aumento en la señal de CD como se muestra en la figura 2. A 80 ºC, EcSlyD-VcLp15 se desplegó completamente. Sorprendentemente, la señal de CD nativa se restablece de nuevo cuando la solución de proteína se enfría hasta 20 ºC. A pesar de una ligera histéresis, la curva de desnaturalización y la curva de replegamiento prácticamente se superponen, lo que indica claramente un comportamiento de replegamiento reversible de EcSlyD-VcLp15. Debe admitirse que la cooperatividad de la desnaturalización es bastante baja y que no se observa la forma sigmoidea típica de una curva de fusión de proteínas en el caso de EcSlyD-VcLp15. Sin embargo, los autores descubrieron inequívocamente que EcSlyD-VcLp15 es capaz de volver a adoptar su conformación nativa cuando la solución de proteína se enfría de 80 ºC a 20 ºC. De hecho, los espectros de CD en el UV cercano controlados antes y después de la desnaturalización inducida térmicamente, prácticamente se superponen (véase la figura 1). En conclusión, EcSlyD-VcLp15 posee propiedades de plegamiento robustas que son sobresalientes para un polipéptido de fusión y que son altamente deseadas para una molécula que sirve como aditivo anti-interferencia en un inmunoensayo. Estas propiedades fisicoquímicas inocuas, en combinación con una solubilidad sobresaliente (> 130 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato) y el potencial anti-interferencia en un inmunoensayo anti-Treponema hacen de EcSlyD-VcLp15 una molécula muy atractiva que garantiza una alta especificidad en la serología de la sífilis.

Ejemplo 5:

Actividad anti-interferencia de la Lp15 de Vibrio cholerae en un inmunoensayo de sífilis

La actividad anti-interferencia de las variantes de los polipéptidos de fusión de Lp15 de Vibrio cholerae se evaluó en un analizador automatizado Elecsys® 2010 (Roche Diagnostics GmbH). Elecsys® es una marca registrada del grupo Roche. Las mediciones se llevaron a cabo en el formato de tipo sándwich de doble antígeno.

La detección de señales en Elecsys® 2010 se basa en la electroquimioluminiscencia. El conjugado de biotina (es decir, el antígeno de captura) se inmoviliza en la superficie de una perla magnética recubierta con estreptavidina mientras que el antígeno de detección alberga un catión de rutenio en complejo (cambio entre los estados de oxidorreducción 2+ y 3+) como resto de señalización. En presencia de un analito de inmunoglobulina específico, el complejo de rutenio cromogénico forma puentes con la fase sólida y emite luz a 620 nm después de la excitación en un electrodo de platino. La señal de salida está en unidades arbitrarias de luz.

Los polipéptidos recombinantes de Lp15 anti-interferencia se evaluaron en un formato de inmunoensayo de tipo sándwich de doble antígeno (DAGS). Para este fin, se usó el antígeno TpN17 recombinante de Treponema como un conjugado de biotina y rutenio, respectivamente, para detectar anticuerpos anti-TpN17 en sueros humanos. TpN17 es uno de los antígenos inmunodominantes de Treponema pallidum y las variantes solubles de TpN17 – como se divulga en la presente solicitud de patente -son herramientas inestimables para la detección de infecciones de sífilis. Para detectar moléculas de IgG anti-TpN17, se usaron EcSlyD-EcSlyD-TpN17-biotina y PmSlyD-PmSlyD-TpN17rutenio en R1 (tampón de reactivo 1) y R2 (tampón de reactivo 2), respectivamente. Para detectar tanto las moléculas de IgM como de IgG anti-TpN17, se usaron EcFkpA-TpN17-biotina y EcSkp-TpN17-rutenio en R1 (tampón de reactivo 1) y R2 (tampón de reactivo 2), respectivamente. Las concentraciones de los conjugados de antígeno en R1 y R2, respectivamente, fueron de 200 ng/ml cada una.

En un primer experimento, los sueros humanos negativos para Treponema se evaluaron con el sistema de inmunoensayo DAGS mencionado anteriormente. Para obtener un indicio a la tasa de incidencia de falsos positivos que están dirigidos únicamente al resto TpN17, se realizó un cribado en presencia de SS-Helix (GDA, P), un polímero SlyD heterogéneo soluble reticulado con GDA que se usa habitualmente como sustancia anti-interferencia. Además, se incluyó EcSkp-EcSlyD-EcSlyD, otro módulo anti-interferencia, en el tampón de ensayo para descartar fenómenos de interferencia debidos a restos diferentes de la misma parte TpN17. Se añadieron SS-Helix (GDA, P) y EcSkp-EcSlyD-EcSlyD a R1 (tampón de reactivo 1 que contenía el conjugado de biotina) en grandes cantidades en exceso (10 µg/ml). Después se mezclaron 75 µl de R1 (tampón de reactivo 1, conjugado de biotina y polímeros antiinterferencia), 75 µl de R2 (tampón de reactivo 2, conjugado de rutenio), 10 µl de muestra (suero humano) y 40 µl de suspensión de perlas y se incubaron para proporcionar un volumen de reacción de aproximadamente 200 µl.

Mediante esta estrategia, se pudieron encontrar aproximadamente 8 sueros humanos (de ~ 2500 sueros humanos negativos) que eran claramente negativos para los anticuerpos anti-Treponema pallidum, pero mostraban señales elevadas en el formato DAGS cuando se usaba TpN17 como antígeno. Sin embargo, las señales de Elecsys® no se incrementaron cuando se usaron otros antígenos de Treponema tales como TpN15 o TpN47 en lugar de TpN17 (no se muestran datos). Este hallazgo apunta a un factor de interferencia anti-TpN17 específico.

La tabla 2 ilustra el efecto anti-interferencia de EcSlyD-VcLp15 monomérica no marcada en un sistema de ensayo con TpN17 oligomérico. Se usaron EcFkpA-TpN17-Bi (DDS) y EcSkp-TpN17-BPRu (SK(2)DSS) como antígenos de detección oligoméricos y se le añadió EcSlyD-VcLp15 no marcado a R1 en concentraciones crecientes. Es obvio que las señales de los sueros positivos verdaderos se inactivan significativamente con la adición de Lp15. Sin embargo, las señales positivas siguen siendo claramente positivas, incluso cuando se añade VcLp15 en altas concentraciones tales como 1 µg/ml a R1. Como era de esperar, los sueros humanos bien caracterizados (Trina Bioreactives AG, Nänikon, Suiza) para los que se han descartado claramente las infecciones por Treponema, muestran señales muy bajas cerca de la señal de fondo inherente al sistema (~ 450 recuentos), independientemente de la adición de VcLp15. Los sueros de interferencia tales como C131839, C132663, C132723, R183554 y C132976 muestran señales significativamente elevadas cuando no se añade un módulo anti-interferencia de VcLp15. Como la señal promediada de los sueros negativos asciende a ~ 770 recuentos, es evidente que los niveles de señal de

15.146 recuentos (para el suero humano C132663) o 8.503 recuentos (para el suero humano C132723) apuntarían a un resultado positivo verdadero que suscitaría la sospecha de una infección de sífilis. Es extraordinario que la adición de VcLp15 a una concentración de 1,0 µg/ml en R1 reduce las señales elevadas al nivel normal de la señal de fondo, revelando los resultados supuestamente positivos como falsos positivos. Lo mismo ocurre cuando se añade EcSlyD-VcLp15 monomérico no marcado en un sistema DAGS de TpN17 monomérico (tab. 3). De nuevo, se reducen los niveles de señal significativamente elevados como con el suero humano C132663 de 11.128 recuentos a 651 recuentos cuando se añade EcSlyD-VcLp15 a R1 a una concentración de 1,0 µg/ml. Por el contrario, VcLp15 oligomérica (EcSkp-VcLp15) inactiva de forma eficaz las señales elevadas y falsas positivas, respectivamente, al fondo de la señal negativa en el sistema DAGS de TpN17 tanto oligomérico (tab. 4) como monomérico (tab. 5).

TpN17 de Treponema pallidum y la lipoproteína 15 de Vibrio cholerae comparten un 34 % de identidad de secuencia y un 55 % de homología en un tramo de 97 restos de aminoácido. Es probable que a través de este motivo de secuencia compartido (y probablemente estructural) tenga lugar la reacción cruzada inmunológica, lo que provoca señales elevadas y, por tanto, simula un resultado positivo en los ensayos de Treponema que se basan en el antígeno TpN17. La adición de la proteína anti-interferencia VcLp15 a la mezcla de ensayo reduce las señales elevadas a los negativos normales, como se muestra en las tablas 2-5. Los datos divulgados proporcionan pruebas convincentes de que incluso interferencias muy fuertes, es decir, altos falsos positivos, se pueden eliminar eficazmente por la adición de la lipoproteína 15 de Vibrio cholerae en forma monomérica u oligomérica. La conclusión de los resultados mostrados en las tablas 2-5 es la siguiente: las interferencias debidas al uso del antígeno TpN17 recombinante en un inmunoensayo DAGS son bastante frecuentes (> 1 de cada 500 sueros

negativos) y se pueden mitigar de manera eficaz por la adición de lipoproteína 15 de Vibrio cholerae, que es un género bacteriano bastante distante filogenéticamente de Treponema pallidum. En términos sencillos, la presente solicitud divulga que la adición de una proteína recombinante fácilmente disponible mejora significativamente la especificidad de un inmunoensayo de sífilis basado en TpN17 para la detección de anticuerpos anti-Treponema.

5 Tabla 2:

TpN17 oligomérico; adición de VcLp15 monomérica

10 R1 EcFkpA-TpN17-Bi(DDS)

R2 EcSkp-TpN17-BPRu(SK(2)DSS)

R1 c (µg/ml)

EcSlyD-VcLp15

0

0,1 0,2 0,3 0,5 1,0

recuentos

recuentos

recuentos

recuentos

recuentos

recuentos

sueros positivos

PLTP_124

sin dil. 1.274.726 1.171.468 1.166.110 1.092.657 973.974 793.911

PLTP_124

1:50 154.146 156.165 136.898 131.248 101.395 62.840

PLTP_121

1:50 223.230 211.697 205.298 190.606 151.374 93.737

PLTP_121

1:100 112.031 105.466 103.909 91.727 72.926 47.972

BM 146027

SC_056 1.408.728 1.357.227 1.258.085 1.217.480 1.149.624 1.133.749

BM 146623

SC_058 1.187.013 1.158.037 1.083.204 1.083.952 1.078.868 1.050.374

sueros negativos

Trina n.º 0642

neg. 778 716 722 698 698 661

Trina n.º 0645

neg. 725 703 722 682 715 706

Trina n.º 0646

neg. 797 795 817 802 784 784

Trina n.º 0647

neg. 774 786 764 773 762 742

sueros de interferencia

C131839

falso positivo 5.795 5.090 4.464 3.861 2.851 1.555

C132663

falso positivo 15.146 2.116 1.110 878 765 724

C132723

falso positivo 8.503 7.725 6.811 5.357 2.298 941

R183554

falso positivo 11.072 10.030 9.142 7.413 4.488 2.534

C132976

falso positivo 5.687 5.174 4.446 3.690 2.509 1.419

15 Tabla 3: TpN17 monomérico; adición de VcLp15 monomérica R1 EcSS-TpN17-Bi(DDS)

R2 PmSS-TpN17-BPRu(SK(2)DSS)

R1

EcSlyD-VcLp15

c (µg/ml)

0 0,1 0,2 0,3 0,5 1,0

recuentos

recuentos

recuentos

recuentos

recuentos

recuentos

sueros positivos

PLTP 124

sin dil. 1.467.523 1.374.990 1.272.604 1.272.720 1.208.354 1.164.404

PLTP 124

1:50 167.294 155.940 153.077 136.428 124.244 89.204

BM 146624

sin dil. 1.451.271 1.423.730 1.376.393 1.359.799 1.370.884 1.369.198

BM 146624

1:10 436.534 403.003 384.434 365.742 329.370 259.984

BM 145855

SC 055 901.047 816.640 766.258 707.030 616.574 511.011

BM 146027

SC 056 1.721.399 1.708.261 1.678.979 1.651.647 1.641.513 1.641.787

sueros negativos

Trina n.º 0642

neg. 657 613 638 626 623 610

Trina n.º 0643

neg. 698 703 699 704 687 665

Trina n.º 0644

neg. 660 653 638 636 620 616

Trina n.º 0646

neg. 634 617 634 628 621 613

Trina n.º 0647

neg. 623 614 606 620 618 623

sueros de interferencia

C131839

falso positivo 4.206 3.707 3.364 2.996 2.309 1.383

C132663

falso positivo 11.128 1.812 1.119 895 729 651

R179865

señal elev. 1.630 1.338 1.219 1.114 1.000 873

R183554

señal elev. 1.015 894 883 819 790 740

C132976

falso positivo 4.866 4.041 3.454 2.911 2.057 1.230

Tabla 4: TpN17 oligomérico; adición de VcLp15 oligomérica R1 EcFkpA-TpN17-Bi(DDS) R2 EcSkp-TpN17-BPRu(SK(2)DSS)

R1 c (µg/ml)

EcSkp-VcLp15

0

0,1 1,0

recuentos

recuentos

recuentos

sueros positivos

PLTP_121

1:50 230.387 225.976 104.039

PLTP_121

1:100 116.383 112.747 55.150

BM 140149

SC_052 1.136.096 1.077.292 508.996

BM 200680

SC_054 826.355 737.483 354.883

BM 145855

SC_055 745.762 704.713 322.241

BM 146027

SC_056 1.446.006 1.380.464 1.192.282

sueros negativos

Trina n.º 0642

neg. 750 757 744

Trina n.º 0646

neg. 840 847 815

Trina n.º 0872

neg. 846 805 750

Trina n.º 0873

neg. 764 763 754

sueros de interferencia

R179865

falso positivo 3.951 1.580 782

C131839

falso positivo 6.142 4.805 1.587

C132663

falso positivo 16.565 2.510 755

C132723

falso positivo 7.868 4.406 875

R183554

falso positivo 10.511 8.747 1.306

C132976

falso positivo 6.274 3.062 1.088

Tabla 5: TpN17 monomérico; adición de VcLp15 oligomérica R1 EcSS-TpN17-Bi(DDS) R2 PmSS-TpN17-BPRu(SK(2)DSS)

R1 c (µg/ml)

EcSkp-VcLp15

0

0,1 1,0

recuentos

recuentos

recuentos

sueros positivos

PLTP_121

1:50 235.946 221.210 112.238

PLTP_121

1:100 118.333 113.770 60.259

BM 140149

SC_052 1.142.874 1.048.211 637.784

BM 200680

SC_054 757.518 672.745 382.894

BM 145855

SC_055 861.637 823.346 475.266

BM 146027

SC_056 1.550.267 1.553.275 1.516.740

sueros negativos

Trina n.º 0642

neg. 673 673 632

Trina n.º 0646

neg. 651 659 646

Trina n.º 0872

neg. 680 683 639

Trina n.º 0873

neg. 690 661 651

sueros de interferencia

C132221

señal elev. 1.301 1.204 950

C131839

falso positivo 3.928 3.108 1.144

C132663

falso positivo 11.457 2.270 671

C132927

señal elev. 1.551 1.284 877

R183554

señal elev. 1.003 858 672

C132976

falso positivo 4.476 2.373 829

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para detectar anticuerpos contra el antígeno TpN17 de Treponema pallidum en una muestra aislada, en el que se usa una secuencia peptídica de la lipoproteína 15 de Vibrio cholerae (VcLp15) como reactivo para reducir las interferencias y para minimizar los resultados falsos positivos, en el que dicha secuencia de VcLp15

   10 comprende los restos de aminoácido 26-163 de las SEQ ID NO. 1 o 2 y

   en el que se pueden truncar de 1 a 5 aminoácidos del extremo N-terminal o C-terminal o de ambos extremos de dicha secuencia de VcLp15 y

   15 en el que dicha secuencia de Vc Lp15 se puede modificar por sustituciones conservadoras de aminoácidos de manera que la estructura tridimensional de la lipoproteína 15 de Vibrio cholerae (VcLp15) no sufra cambios.
2. 2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha secuencia peptídica de VcLp15 se fusiona a

   una chaperona. 20
3. 3. Polipéptido de fusión que comprende una secuencia peptídica de VcLp15 de acuerdo con la SEQ ID NO. 1 o 2

   en el que dicha secuencia de VcLp15 comprende los restos de aminoácido 26-163 de las SEQ ID NO. 1 o 2 y

   25 en el que se pueden truncar de 1 a 5 aminoácidos del extremo N-terminal o C-terminal o de ambos extremos de dicha secuencia de VcLp15 y

   en el que dicha secuencia de VcLp15 se puede modificar por sustituciones conservadoras de aminoácidos y una chaperona

   30 de modo que la estructura tridimensional de la lipoproteína 15 de Vibrio cholerae (VcLp15) no sufra cambios cambios.

4. 4.

   Polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicha chaperona se selecciona del grupo que 35 consiste en SlyD, SlpA, FkpA y Skp.

5. 5. Polipéptido de fusión de acuerdo con las reivindicaciones 3 o 4, que comprende la SEQ ID NO. 3.

6. 6.

   Uso de un polipéptido de fusión de acuerdo con las reivindicaciones 3 a 5 como aditivo en un inmunoensayo para 40 reducir interferencias y para minimizar los resultados falsos positivos.

7. 7. Un kit de reactivos para detectar anticuerpos contra antígenos de Treponema pallidum en una muestra aislada mediante un inmunoensayo, que comprende un antígeno TpN17 y un polipéptido de fusión de acuerdo con las reivindicaciones 3 a 5.
8. 8. Un procedimiento para detectar anticuerpos contra el antígeno TpN17 de Treponema pallidum en una muestra aislada de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo dicho procedimiento

   a) formar una mezcla de inmunorreacción mezclando una muestra de fluido corporal con un antígeno TpN17 como 50 ligando de unión específica al que se pueden unir específicamente dichos anticuerpos presentes en dicha muestra

   b) añadir un polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 a dicha mezcla de inmunorreacción antes, al mismo tiempo o después de añadir dicho ligando de unión específica a dicha muestra

   55 c) mantener dicha mezcla de inmunorreacción durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que los anticuerpos presentes en dicha muestra de fluido corporal inmunorreaccionen con dicho antígeno TpN17 como ligando de unión específica para formar un producto de inmunorreacción; y

   d) detectar la presencia y/o la concentración de cualquier cantidad de dicho producto de inmunorreacción. 60
9. 9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que se usan dos antígenos TpN17 como ligandos de unión específica para los anticuerpos a detectar en la muestra aislada,

   un primer antígeno TpN17 que comprende una secuencia de TpN17 y una primera chaperona, en el que dicho 65 primer antígeno TpN17 puede estar unido a una fase sólida,

   un segundo antígeno TpN17 que comprende una secuencia de TpN17 y una segunda chaperona, en el que dicho segundo antígeno TpN17 porta un marcador detectable,

   en el que ambos antígenos TpN17 son idénticos o presentan una reacción cruzada inmunológica de manera que los 5 anticuerpos presentes en la muestra se pueden unir a ellos de forma específica, y

   en el que la primera y la segunda chaperona son diferentes.
10. 10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el primer antígeno TpN17 comprende FkpA de E. 10 coli como chaperona y el segundo antígeno TpN17 comprende Skp de E. coli como chaperona.

    5

    LISTADO DE SECUENCIAS

    10

    <110> Roche Diagnostics GmbH F. Hoffmann-La Roche AG

    15

    <120> Variantes de la lipoproteína 15 de Vibrio cholerae como aditivo anti-interferencia en inmunoensayos basados en TpN17 para la detección de anticuerpos anti-Treponema

    20

    <130> 32239 EP-1-IR <160> 12

    25

    <170> PatentIn versión 3.5

    30 35

    <210> 1 <211> 163 <212> PRT <213> Vibrio cholerae

    40

    <400> 1

    5

    <210> 2

    <211> 146

    10

    <212> PRT <213> Secuencia artificial

    15

    <220>

    <223> VcLp15 con cola de hexa-his en el extremo C-terminal

    20

    <400> 2

    5

    <210> 3

    <211> 334

    10

    <212> PRT <213> Artificial

    15

    <220>

    <221> EcS1yD-VcLp15

    20

    <400> 3

    5

    <210> 4

    <211> 311

    10

    <212> PRT <213> Artificial

    15

    <220>

    <223> EcSkp-VcLp15

    20

    <400> 4

    5

    <210> 5 <211> 156

    <212> PRT

    10

    <213> Treponema pallidum

    15

    <400> 5

    <210> 6

    <211> 134

    <212> PRT 30 <213> Artificial

    <220>

    <223> TpN17 23-156 con mutaciones de Cys a Ala

    <400> 6

    15

    <210> 7 <211> 142

    <212> PRT

    20

    <213> Artificial

    25

    <220> <223> TpN17 con hexa-his

    30

    <400> 7

    5

    <210> 8

    <211> 517

    10

    <212> PRT <213> Artificial

    15

    <220>

    <223> SlyD en tándem de E. coli fusionada a TpN17

    20

    <400> 8

    5

    <210> 9

    10

    <211> 497

    <212> PRT

    <213> Artificial

    15

    <220>

    20

    <223> SlyDen tándem de Pasteurella multicocida-TpN17

    <400> 9

    25

    5

    <210> 10

    <211> 411

    10

    <212> PRT

    <213> Artificial

    15

    <220>

    <223> FkpA-TpN17 de E. coli

    20

    <400> 10

    25

    5

    <210> 11

    <211> 307

    10

    <212> PRT <213> Artificial

    15

    <220>

    <223> Skp-TpNq17 de E. coli

    20

    <400> 11

    5 10

    <210> 12 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial

    15

    <220> <223> Conector rico en glicina

    20

    <400> 12