KR100611545B1 - 레트로바이러스 표면 당단백질을 함유하는 가용성 복합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 HIV 감염의 진단에 관한 것이다. 이는 가용성 레트로바이러스 표면 당단백질- (또는 막통과 당단백질)-샤페론 복합체의 제조 및, 특히, 바람직하게는 이중 항원 가교 개념에 따른 면역검정에서의 HIV 에 대한 항체 검출 또는 면역원으로서의 샤페론-항원 복합체의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 각각의 HIV-1 gp41 의 변이체 또는 HIV-2 gp36 변이체 및 샤페론의 펩티딜-프롤릴-이성화효소 클래스로부터 선택되는 샤페론을 포함하는 가용성 복합체를 개시한다. 각각의 HIV-1 gp41 또는 HIV-2 gp-36 의 N-나선 도메인에서 특이적인 아미노산 치환을 포함하는 변이체가 또한 기재되었다.
아밀로이드형성 표적 단백질, 펩티딜-프롤릴-이성화효소 클래스 샤페론

Description

레트로바이러스 표면 당단백질을 함유하는 가용성 복합체{A SOLUBLE COMPLEX COMPRISING A RETROVIRAL SURFACE GLYCOPROTEIN}
도 1a 및 1b HIV-1 엑토도메인 gp41 (535 - 681)- His 6 의 원거리 (1a) 및 근거리(1b) UV CD
폴딩된 gp41 (두꺼운 선): 완충액 조건 (30 mM 나트륨 포르미에이트, pH 3.0) 을 gp41 의 원래형의 모두 나선형인 구조를 유도하도록 셋팅했다; 변성된 gp41 (가는 선): 완충액 조건 (50 mM 나트륨 포스페이트 pH 3.0, 7.0 M GuHCl) 을 gp41 을 완전히 변성 (폴딩되지 않음) 시키도록 셋팅했다. 캐오트로픽 염의 높은 몰농도로 인하여, 도 1a 에서의 기준 이색 (dichroitic) 시그널 (가는 선) 을 215 nm 미만의 파장 영역에서 신뢰성있게 모니터링할 수 없다. 스펙트럼은 Jasco-720 분광편광계 상에서 기록하고, 노이즈를 줄이기 위해 9 회 평균을 냈다. 경로 길이는 원거리 UV CD (도 1a) 에 대해서는 0.2 cm, 근거리 UV CD (도 1b) 에 대해서는 0.5 cm 였다. 각각의 단백질 농도는 1.5 μM 및 29 μM 였다. 세로 좌표의 단위는 잔사 타원율을 의미하며, 각도 ×cm2 ×dmol- 1 의 차원을 갖는다.
도 2 생리학적 완충액 중에서 " 샤페론이 없는" gp41 의 응집
3.0 에서 7.5 로 pH 가 올라간 지 1 분 후 (하층 선) 및 10 분 후 (상층 선) 에서의 gp41 엑토도메인의 UV 스펙트럼을 나타낸다. 분자의 응집은 표유 광선 효과를 유도하며, 310 nm 초과에서 명백한 흡수를 초래한다. 본 도면은 gp41 의 엄청난 응집 경향을 나타내며; 상층 선으로 나타낸 단계에서 응집 과정이 정지하지 않음이 주목할 만한다.
도 3a 및 3b FkpA 가 중성 pH 에서 gp41 엑토도메인을 가용화함
gp41 및 성숙한 FkpA 를 낮은 pH 에서 함께 인큐베이션한 후, 20 mM 나트륨 포스페이트, pH 7.4; 50 mM NaCl, 1 mM EDTA 의 최종 완충액 조건으로 변동했다. 1 분 및 10 분 후 (각각 저층 선 및 상층 선), UV 스펙트럼을 기록하여 샘플에서의 응집 정도를 평가했다. 도 3a 는 2 배 몰 과량의 샤페론에 의한 응집 억제를 나타내며, 도 3b 는 4 배 과량의 효과를 나타낸다. gp41 의 최종 농도는 약 1 μM 였다. 표유 광선 (300 nm 초과에서 명백한 흡수를 유도함) 이 최소가 되도록 감소시켰기 때문에, FkpA 가 gp41 엑토도메인을 투여량 의존성 양식으로 유효하게 가용화한다는 괄목할 분광학적 증거가 있었다.
도 4 pH 2. 5 에서의 FkpA - gp41 의 UV 스펙트럼
50 mM 나트륨 포스페이트, pH 2.5; 50 mM NaCl에 대한 투석 후, 융합 폴리펩티드 FkpA-gp41 의 UV 스펙트럼. 놀랍게도, 2-도메인 구축물은 가용화 캐오트로픽제 GuHCl 의 제거 후에도 완전히 용해되어 잔존한다. 기준선 표류 및 300 nm 초과의 파장에서의 현격한 흡수를 야기하는 것으로 예상되는 광선 표유성 응집물의 존재에 대한 증거가 없다.
도 5 pH 2. 5 에서의 FkpA - gp41 의 근거리 UV CD 스펙트럼
20 mM 나트륨 포스페이트, pH 2.5; 50 mM NaCl 중에서 20℃ 에서 Jasco 720 분광편광계 상에서 스펙트럼을 기록했으며, 노이즈를 줄이기 위해 9 회 누적했다. 단백질 농도는 경로 길이 0.5 cm 에서 22.5 μM 였다. 방향족 타원율은 gp41 의 전형적인 모습을 나타낸다 (도 1b 참조). pH 2.5 에서, FkpA 는 대부분 비구조화되어 있고, 근거리 UV-CD 에서 시그널을 전혀 부여하지 않는다.
도 6 pH 2. 5 에서의 FkpA - gp41 의 원거리 UV CD 스펙트럼
20 mM 나트륨 포스페이트 pH 2.5; 50 mM NaCl 중에서 20℃ 에서 Jasco 720 분광편광계 상에서 스펙트럼을 기록했고, 시그널 대 노이즈 비율을 개선하기 위해 9 회 누적했다. 단백질 농도는 경로 길이 0.2 cm 에서 2.25 μM 였다. 220 및 208 nm 에서의 최소값은 융합 단백질에 관하여 gp41 의 대규모 나선 구조를 지적한다. 197 nm 미만에서의 스펙트럼 노이즈는 높은 아미드 흡수 때문이며, 융합 단백질의 구조적 특징에 대해 기록하지 않는다. 그럼에도 불구하고, 193 nm 에서의 전형적인 나선-최대값이 추정될 수 있다.
도 7 생리학적 완충액 조건 하에서의 FkpA - gp41 의 근거리 UV CD.
20 mM 나트륨 포스페이트, pH 7.4; 50 mM NaCl 중에서 20℃ 에서 Jasco 720 분광편광계 상에서 스펙트럼을 기록했으며, 노이즈를 줄이기 위해 9 회 누적했다. 단백질 농도는 경로 길이 0.5 cm 에서 15.5 μM 였다. 놀랍게도, gp41 및 FkpA 의 공유결합으로 결합된 단백질 도메인의 방향족 타원율 (연속 선) 은, pH 3.0 에서 원래형의 모두 나선인 gp41 의 기여 (하부 사선) 및 pH 7.4 에서의 FkpA 의 기여 (상부 사선) 를 합하여 이루어진다. 이는 담체 FkpA 및 표적 gp41 (즉, 2 개의 상이한 기능성 폴딩 단위) 가 폴리펩티드 융합 단백질 중에서 결합되는 경우 가역적으로 및 준-독립적으로 리폴딩된다는 것을 의미한다.
도 8 생리학적 완충액 조건 하에서의 FkpA - gp41 의 원거리 UV CD.
20 mM 나트륨 포스페이트, pH 7.4; 50 mM NaCl 중에서 20℃ 에서 Jasco 720 분광편광계 상에서 스펙트럼을 기록하고, 시그널 대 노이즈 비율을 개선하기 위해 9 회 누적했다. 단백질 농도는 경로 길이 0.2 cm 에서 1.55 μM 였다. 222 nm 및 208 nm 각각에서의 강한 시그널은 융합 구축물과 관련하여 gp41 의 대규모 나선 구조를 지적한다. 198 nm 미만에서의 노이즈는 높은 단백질 흡광때문이며, FkpA-gp41 의 2 차 구조 특성을 전혀 반영하지 않는다.
도 9 HIV 검정에서 FkpA -결합 gp41 은 가용성이며 높은 면역반응성이다.
FkpA-gp41 는 COBAS CORE HIV 콤비 검정법에서 강한 경쟁자이다. gp41 엑토도메인 단독 (빈 원) 과 비교하여, 희석 완충액 (헬퍼 세정제로서 Triton X-100 를 함유함) 으로 예비처리한 후의 가용성 FkpA-gp41 폴리펩티드 (채운 원) 의 저해 잠재성을 나타낸다. gp41 엑토도메인 (융합 단백질의 분자내 복합체 내에 위치) 가 세정제의 존재 하에서도 높은 면역 반응성을 갖는 반면, 네이키드 엑토도메인 (naked ectodomain) 은 면역 반응성을 거의 완전히 상실한다는 것이 증명된다. 시험한 HIV-양성 혈청은 1:3000 로 희석한 당소 혈청 번호 21284 였다.
도 10 복원 겔여과 후 FF36 의 UV-스펙트럼
스펙트럼은 gp36 융합 펩티드가 가용성이며, 실시예 부분에서 기재된 바와 같이 복원 겔여과법에 따라 Sux 200 칼럼 상에서 리폴딩할 때 응집하지 않는다는 괄목할 증거를 제공한다.
도 11 (a+b) FkpA - gp21 은 가용성이며 면역학적으로 반응성인 융합 폴리펩티드이다.
복원 겔여과 후, 리폴딩된 FkpA-gp21 융합 단백질 용출물은 매우 가용성이며, UV-스펙트럼에서 응집 성향을 나타내지 않는다 (11a). HTLV-양성 혈청 858893-00 (1:10 희석물) 을 사용한 COBAS CORE 에서의 경쟁형 면역 검정에서 평가시, FkpA-gp21 은 탁월한 면역학적 특성을 보유한다는 것이 밝혀졌다 (11b).
본 발명은 HIV 감염의 진단에 관한 것이다. 이는, 가용성 레트로바이러스 표면 당단백질- (또는 막통과 당단백질)-샤페론 (chaperone) 복합체의 제조, 및 특별히, 바람직하게는 이중 항원 가교 개념에 따른 면역 검정에서, 또는 면역원으로서의 HIV 에 대한 항체의 검출에서 샤페론-항원 복합체의 유리한 용도를 특별히 교시한다. 본 발명은 또한 HIV-1 gp41 의 변이체 또는 HIV-2 gp36 각각의 변이체, 및 샤페론의 펩티딜-프롤릴-이성화효소 클래스로부터 선택되는 샤페론을 함유하는 가용성 복합체를 개시한다. HIV-1 gp41 또는 HIV-2 gp36 각각의 N-나선 도메인에서 특이적인 아미노산 치환을 포함하는 변이체도 또한 기재되었다.
인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 는 일반적으로 그의 두문자어 AIDS 로 명명되는 후천성 면역결핍증의 병원체이다. HIV-1 및 HIV-2 로 명명된 상기 바이러스 의 2 가지 주요한 균주가 있다. HI 바이러스는 최근 널리 만연되어, 전세계적으로 건강 및 재산에 심각한 위협이 되고 있으며, 공중 보건 업무 시스템에서 HIV 의 진단 및 AIDS 의 치료에 막대한 자금을 소모하게 한다.
바이러스 전파의 경로 중 하나는, 감염된 혈액 또는 혈액 제제 (blood product) 의 수혈이다. 사실상 모든 산업 국가 뿐만 아니라 다수의 개발 도상국에서는 요즘 상기 바이러스의 추가적인 전파를 방지하기 위해 모든 혈액 기증물의 필수적인 기본 시험을 요구한다. 감염 후 가능한 한 신뢰성있게 신속히 HIV 에 의한 감염을 혈액으로부터 진단하는 것이 당 분야의 모든 진단법의 과제이다.
기본적으로, 진단법의 3 가지 상이한 모드가 이용가능하다:
(1) 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 과 같이 민감한 핵산 진단 과정에 의한, 혈액으로부터의 바이러스 게놈 물질의 진단,
(2) 혈액으로부터의 바이러스 항원의 검출, 및
(3) 체액으로부터의 HIV 에 대한 항체의 검출.
HIV 감염 과정 동안, 여러가지 진단학적으로 상이하며 진단학적으로 연관성있는 상들이 공지되어 있다. 감염의 초기 상에서는, HI 바이러스로부터 유도되는 단백질 또는 펩티드 ("바이라믹 상 (viraemic phase)") 만이 발견될 수 있는 반면, 항-HIV 항체는 아직 존재하지 않는다. 혈청 전환 (seroconversion) 으로 명명되는 후속적인 상에서, HIV 항원에 대한 항체가 출현하면서, 바이러스 항원의 양 (바이러스 부하) 은 감소한다. 혈청 전환의 초기 상에서 생성된 대부분의 항체들은 면역글로불린 클래스 M (IgM) 에 속한다. 이후, HIV 에 대한 면역 응 답에서 면역글로불린 클래스 G (IgG) 로 바뀌고, 이어서 HIV 에 대한 대부분의 항체를 축적한다. 감염의 추가적인 경로 동안 항-HIV 항체의 수준은 감소할 수 있는 반면, 체액에서의 바이러스 부하 (바이러스 입자 또는 바이러스 항원의 존재) 는 다시 증가할 수 있다. HIV 감염의 존재성에 대한 스크리닝은 바람직하게는 HIV 항원에 대해 항체를 검출하는, 종종 HIV 항원의 검출과 조합되는 혈청학적 검정으로 수행된다. 환자에서의 면역 응답성이 감염 경로 동안 변화하며, 또한 환자마다 가변적이므로, 서브클래스 IgM 및 IgG 에 속하는 항-HIV 항체를 검출하는 매우 민감하고 신뢰성있는 면역 검정법을 보유하는 것이 중요하다. HIV 감염의 검출을 위한 다수의 상이한 접근법이 개시되었다. 초기에는, 바이러스 단백질에 대한 항체의 신뢰성있고 민감한 검출이 중대하며, 주된 중요점이다.
바이러스성 단백질은 종종 바이러스 항원으로 명명되는데, 감염의 발발시 및 질병의 매우 늦은 단계에서만 검출가능하다. 따라서, 모두 바이러스의 중심 (core) 단백질인 p24 (HIV-1 유래) 또는 p26 (HIV-2 유래) 를 측정하는 검정과 같은 바이러스 항원 검출을 위한 검정은, 신뢰성있게 HIV 감염을 검출하기 위해서 다른 진단 수단과 조합해야만 이용가능하다.
이론적으로 3 개 군의 바이러스 항원이 이용가능하며, 이는 숙주에서의 항체 형성을 유도할 수 있고, 따라서 진단 과정에서 항원으로서 이용될 수 있다. 이들은 외피성 단백질 (envelope proteins; env 유전자 영역에 의해 코딩됨), 바이러스성 효소 또는 제어 단백질, 예컨대 역전사 효소 또는 인테그라아제 (integrase; pol 유전자 영역에 의해 코딩됨) 및 구조 중심 단백질 (gag 유전자 영역에 의해 코 딩됨) 이다. HIV-1 및 HIV-2 에서의 두 바이러스성 외피성 단백질은, 폴리펩티드 전구체 단백질 (HIV-1 의 경우 gp16O, HIV-2 의 경우 gp140) 로서 합성되는 당단백질이다. 상기 고분자량 전구체들은 합성 후 절단되어, 각각 gp120 및 gp41 (HIV-1) 또는 gp11O 및 gp36 (HIV-2) 를 형성한다. 더 큰 폴리펩티드들 (각각 gp12O 또는 gp110) 은 느슨한 접촉을 통해 막 전체 (membrane spanning) 의 더 작은 폴리펩티드 (각각 gp41 및 gp36) 와 회합되는 표면 서브유닛을 형성한다. 다수의 숙주 (환자) 에서, 외피성 당단백질은 항-바이러스성 면역 응답성의 바람직한 표적이다. 문헌 [Ratner, L. 등, Nature 313 (1985) 277-84] 에서는 막 전체의 상기 외피성 단백질, 즉 각각 gp41 또는 gp36 이 상기 바이러스성 단백질들 중 가장 큰 면역원성 잠재성을 갖고 있다는 것을 밝혔다.
예를 들어, ELISA (효소 연계 면역 흡광 검정) 과 같은, HI 바이러스에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 이용한 면역 검정은, 진단 및 스크리닝에서 광범위하게 이용되고 있다. 바이러스성 폴리펩티드는 바이러스성 물질로부터 직접 제조되거나, 또는 생체외 또는 생체내 발현 시스템에서 재조합 DNA 기술을 이용해 유도된다. 항원 제조에서의 두 가지 방식은 심각한 한계점이 있다. 바이러스성 제제로부터 유도되는 폴리펩티드는 생존가능한 바이러스 또는 감염성 유전자 물질에 의해 오염될 수 있으므로, 상기 물질을 사용하는 사람들에게 위험을 야기한다. 재조합-유도 물질은 비-HIV 숙주 단백질에 의해 오염될 수 있어, 상기 검정의 특이성 감소 또는 감응성 감소를 야기할 수 있다.
상기 바이러스성 병소와 같은 병원성 소인에 대한 항체의 검출에서, 예를 들 어 US 4,945,042 에 기재된 이중 항원 가교 포맷에 따른 항체 검출 시스템이 큰 장점을 가지며 매우 빈번하게 이용된다. 상기 가교 개념에 따른 면역 검정에서는 고체 상에 직접 또는 간접으로 결합하는 항원, 및 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한, 상동이거나 또는 교차반응성 (cross-reactive) 인 즉시 가용화되는 항원의 사용이 필요하다. 연구 중인 항체는, 존재하는 경우, 고체 상 결합 항원 및 표지된 검출 항원 사이에 가교를 형성한다. 두 항원이 특이적인 항체에 의해 가교되는 경우에만 양성 시그날이 생성된다.
항-HIV 항체의 검출을 위한, 항원으로서 재조합적으로 제조된 gp41 을 사용하려는 여러가지 시도가 개시되었다. 일부 한계가 있는 재조합적으로 제조된 gp41 가, 항-HIV 항체 검출에 사용될 수 있다. 항-HIV 항체 측정을 위해 상기 gp41 은 단독으로 사용되거나 또는 다른 HIV 항원과 조합되어 사용된다. 최근에는, HIV 항원 및/또는 항-HIV 항체를 모두 검출하고자 독립적으로 목적하는 검정법이 공지되었다. WO 93/21346 에는, gp24 항원, 및 HIV-1 gp41 및 HIV-2 gp36 에 대한 항체의 동시적인 검출을 위한 "콤비 테스트 (combi-test)" 가 기재되어 있다. 상기 검정법에서는, 재조합적으로 제조된 gp41 이 직접 코팅되는 고체 상이 사용된다.
또한, 특별히 높거나 낮은 pH 값을 이용하여 용액 중에 gp41 (또는 gp36) 를 보존하는 한 가지 방법이 잘 정립되어 있다. 재조합적으로 제조된 gp41 는 pH 3.0 이하 정도 또는 pH 11.0 이상 정도에서 가용성인 것으로 공지되어 있다.
그러나, 불운하게도, 각각의 HIV-1 gp41 및 HIV-2 gp36 는 모두 생리학적인 완충액 조건 하에서는 본질적으로 불용성이다.
일반적인 면역검정은 생리학적인 pH 에서 수행된다. 생리학적 완충액 조건 하에서의 이들의 불용성때문에, 다수의 면역검정에서 레트로바이러스 표면 당단백질 항원은 고체 상 물질 상에 직접 코팅되어 사용된다. 그러나, 고체 상 물질에 대한 항원의 직접적인 코팅은 다수의 경우 불리하며, 구조적인 변화, 분자의 언폴딩 (unfolding), 항원성에서의 변화, 불안정성, 및 백그라운드 문제점 (background problem) 과 같은 단점들을 초래한다 (참고, Butler, J. E. 등, J. Immunol. Methods 150 (1992) 77-90).
강한 캐오트로픽제 (chaotropic reagent) 또는 적당한 세정제 (detergent) 에 의해 레트로바이러스 표면 당단백질 (rsgp) 을 가용화할 수 있지만, 상기 방법으로 가용화되는 물질은 진단 도구로서는 한정된 용도를 갖는다.
생리학적 완충액 조건에서의 레트로바이러스 표면 당단백질의 불용성은 추가로 상기 단백질들이 일상적인 (생-) 화학적 과정에서 매우 난해한 표적이 되도록 한다. 방대한 다수의 "표지 화학", 즉, 표지의 결합에 사용되는 화학적 과정, 예를 들어, 폴리펩티드에 대한 마커 기는, 친핵성 화학에 근거하며, 따라서 약 pH 6 내지 약 pH 8 의 pH 범위로 한정되므로, 생리학적 완충액 조건 부근에서만 작용한다. 상기의 일상적인 과정들, 예를 들어 문헌 [Aslam, M. 및 Dent, A., The preparation of protein-protein conjugates in "Bioconjugation" (1998) 216-363, Eds. M. Aslam and A. Dent, McMillan Reference, London] 에 기재된 것들은, 레트로바이러스 표면 당단백질을 가용화해야 하는 극한의 pH 값에서 (또는 SDS 와 같은 세정제의 존재 하에서) 는 충분히 작용하지 않거나 또는 수행하기 어렵다.
상기 언급된 바와 같이, 가교 개념에 따른 면역 검정은 병원성 유기체와 반응성인 항체의 검출을 목표로 하는 광범위한 상이한 검정들에서 유리하다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 그의 불용성때문에, 예를 들어 상기 검정 셋업에서 각각의 HIV-1 의 e-gp41 분자 (즉, "당단백질 41 의 엑토도메인 (ectodomain of glycoprotein 41)" ) 또는 e-gp36 를 각각 사용하는 것이 불가능했다.
직접 코팅의 단점을 벌충하기 위해, 각종 검정법이 고안되었으며, e-gp41 항원을 사용하는 대신에, 합성하거나 또는 재조합적으로 제조한 그의 부분적인 서열, 루프 영역 (loop region) 으로 명명되는 다소 전체적인 면역우성을 이용한다. 상기 검정법의 예시는 하기 논의되는 특허 문헌에 기재되어 있다.
gp41 의 세포외 부분에서의 루프 영역은, N-말단 나선형 도메인이 비슷한 나선형 C-말단 도메인에 연결된, 분자의 비나선형 정상 헤어핀 (hairpin) 이다. gp41 에 반응성인 항혈청의 주요 부분은 정상 루프 모티브에 대한 항체를 포함한다. 따라서, 상기 디설파이드 가교 헤어핀 또는 루프 구조는 gp41 의 면역우성영역을 나타낸다. 따라서, 재조합적으로 유도된 gp41 과 관련된 문제점을 극복하기 위한 한 가지 우회법은 gp41 의 부분 서열을 나타내는 펩티드의 화학물 제조이다. 본 발명에서 각각 엑토도메인 (ectodomain) 으로 정의되는 gp41 또는 gp36 가, 루프 연결 N- 및 C-나선을 포함하나, N-말단 융합 펩티드 및 C-말단 막통과 단편이 없는 소위 엑토도메인으로서 정의된다는 사실을 주지해야 함이 중요하다.
각종 HIV 항원의 펩티드 절편은 관련 특허 문헌 (호주 특허 출원 제 597884 (57733/86), 및 U.S. 특허 제 4735896 및 제 4879212) 에 개시되어 있다. 특히, 상기 세 명세서들에는 gp41 당단백질의 보존 면역우성 영역, HIV 의 주요 외피성 단백질의 루프 영역이 개시되어 있다. HIV-2 의 gp36 단백질의 유사 면역 우성 영역이 또한 합성되었다. 상기 루프 영역에 상응하는 펩티드는, 엑토도메인의 단 (端) 으로 구성되고, HIV-1 및 HIV-2 의 조기 진단을 가능케하며, 검정에 충분하지만 최적은 아닌 감응성 및 우수한 특이성을 제공한다. 그러나, 이들의 한계는 특정 환자에서의 혈청전환 제 1 일 동안 IgM 항체의 검출에 대해서 명확해진다.
WO 92/22573 에는 골격에 일반적으로 면역학적 특징을 갖는 펩티드, 즉 각종 포유류 면역결핍 바이러스의 막통과 외피성 단백질의 면역우성 영역 (예를 들어, gp41 또는 gp36) 이 개시되어 있다. 추가로, 상기 문헌은 상기 면역우성 영역이 상이한 포유류 종으로부터 유도되는 면역결핍 바이러스 분리주에서 빈도높게 보존되는 디설파이드 루프를 포함한다는 것을 확인시킨다.
EP 396 559 는 HIV 의 천연 발생 아미노산 서열에 해당하는 아미노산 서열을 가진 인공 펩티드에 관한 것이다. 에피토프는 gp41 또는 gp36 의 각각의 루프 구조에 해당하는 서열로부터 다시 유도된다. 이들은 또한 면역우성 루프의 2 개의 시스테인 잔기 사이에 화학적 산화 단계에 의해 형성되는 디설파이드 가교를 포함하도록 재정비된다.
그러나, HIV 감염 환자의 항-HIV 항혈청에 포함된 것과 같은 상당한 백분율 의 항체가 gp41 또는 gp36 의 면역우성 루프로부터 유도되는 서열 모티브 또는 그의 변이체와 반응하지 않는다. 상기 펩티드 항원이 유리한 가교 개념과 병용되는 반면, HIV gp41 의 루프 영역 외부의 에피토프와 반응성인 항체는 검출되지 않는다. HIV 감염의 매우 이른 조기 진단이 중요할 뿐만 아니라, HIV-1 및 HIV-2 의 가능한 한 많은 서브타입을 검출하는 것도 또한 극히 중요하다. 에피토프, 특히 rsgp 의 정확히 폴딩된 구조의 에피토프가 많이 존재할수록, 잘못된 음성 진단으로 인해 감염 샘플을 놓치게 되는 일이 더 적다.
따라서, 용해된 형태의, 레트로바이러스 표면 당단백질 분자, 특히 HIV-1 유래의 gp41 의 더 큰 부분을 제공하려는 지속적인 노력이 있어 왔다.
수년 간 gp41 의 생물리학적 특징 및 생화학적 특징이 집중적으로 연구되었다. 문헌 [Lu, M., 등, Nat. Struct. Biol. 2 (1995) 1075-82)] 에서는 gp41 의 삼량체 구조를 부분적으로 설명했다. 생리학적 조건 하의 gp41 는 불용성 응집물을 형성하기 때문에, 상기 연구는 엑토도메인 gp41 의 불완전한 버전에 한정되었다.
NMR 분광법에 의해 최근 gp41 의 천연 삼량체가, 서로 반대 방향으로 C-말단 나선이 팩킹된 3 개의 평행 N-말단 중심 나선을 포함하는 6 개의 나선 다발을 형성한다는 것을 확인했다 (Caffrey, M., 등, J Biol Chem 275 (2000) 19877-82).
gp41 의 고분자량 응집물이 또한 기재되어 있다. 상기 응집물은 대부분 gp41 의 소위 정점 루프 영역의 상호작용으로 형성된다.
단백질 고안에 의해, HIV-1 의 표적 세포 침입의 저해제가 Root, M. J., 등 [Science 291 (2001) 884] 에 의해 개발되었다. 상기 저해제는 gp41 유래의 N-말단 나선 도메인에서 유도된 3 개의 스트렛치 및 상기 분자 유래의 C-말단 나선 도메인의 2 개의 스트렛치를 포함한다. 그러나, 상기의 유전적으로 조작된 구축물은 천연 분자의 다수의 도메인 및 다수의 항원성 에피토프가 부족하며, 특히 면역원성인 에피토프에 정착하는 것으로 공지된 소위 루프 모티브를 포함하지 않는다 (상기 문헌 참조).
따라서, 가능하면 많은 용해된 형태의 레트로바이러스 표면 당단백질 에피토프를 제공해야 할 상당한 필요성이 여전히 존재한다. 특히, 치료용으로서 뿐만 아니라 진단 용도를 위해 각각 HIV-1 유래의 gp41 또는 HIV-2 유래의 gp36 를 포함하는 상기 가용성 항원을 제공해야 할 필요가 있다.
본 발명의 과제는 가용성 형태의, 더 많은 레트로바이러스 표면 당단백질 에피토프 또는 각각 e-gp41 분자 또는 e-gp36 이라도 제공할 수 있는지 여부를 연구하는 것이었다.
본 발명의 또다른 과제는, 더 쉽게 취급할 수 있고/있거나, 특히 면역검정 수행 또는 면역화에 필요한 완충액 조건 하에서, 변이체 및 샤페론의 펩티딜-프롤릴-이성화효소 클래스의 샤페론을 포함하는 복합체의 형태에서 가용성인 gp41 및/또는 gp36 의 변이체를 각각 제공할 수 있는지 여부를 연구하는 것이었다.
고전적으로 "폴딩 헬퍼" 로서 공지된 샤페론은 폴딩 및 다른 단백질들의 구조적인 통합성 유지를 보조하는 폴리펩티드이다. 이들은 생체내 및 시험관 내 에서 모두 폴리펩티드의 폴딩을 촉진하는 능력을 보유한다. 일반적으로, 폴딩 헬퍼들은 폴딩 촉매 및 샤페론으로 분류된다. 폴딩 촉매는 그들의 촉매 기능으로 인해 단백질 폴딩에서의 속도 결정 단계를 가속시킨다. 촉매의 예는 하기에 추가로 기재될 것이다. 샤페론은 변성되거나 또는 부분적으로 변성된 폴리펩티드에 결합하여 단백질을 복원 (re-nature) 시키는 것을 돕는 것으로 공지되었다. 따라서, 폴딩 촉매와는 달리, 샤페론은 단지 결합 기능을 발휘한다 (Buchner, J., Faseb J. 10 (1996) 10-19).
샤페론은 단백질 성숙, 폴딩, 전위 및 분해에 관련된 편재하는 스트레스 유발성 단백질이다 (Gething, M. J. 및 Sambrook, J., Nature 355 (1992) 33-45). 또한 정상적인 성장 조건 하에 있다고 해도, 이들은 스트레스 조건 하에서는 다량으로 유도된다. 이는 또한 이들의 생리학적인 기능이 스트레스 조건을 극복하려는 것이라는 아이디어를 지지한다.
근래에, 샤페론의 여러 상이한 패밀리들이 공지되었다. 모든 상기 샤페론들은 폴딩되지 않거나 또는 부분적으로 폴딩되지 않은 단백질에 결합하는 이들의 능력을 특징으로 하며, 단백질의 정확한 폴딩 또는 변성 또는 응집된 단백질의 제거와 연관된 생리학적 기능을 갖는다.
샤페론의 잘 특징화된 예는 단백질의 소위 힛샥 (heat-shock) 패밀리의 구성원들로, 이들은 이들의 상대적인 분자량에 따라 명명된다; 예를 들어, hsp100, hsp9O, hsp7O 및 hsp6O, 뿐만 아니라 소위 shsps (소형 힛샥 단백질; small heat-shock-proteins) 은 문헌 [Buchner, J., Faseb J. 10 (1996) 10-19] 및 [Beissinger, M. 및 Buchner, J. Biol. Chem. 379 (1998) 245-59] 에 기재되어 있다.
샤페론과 달리 폴딩 촉매는, 정해진 속도 결정 단계를 가속시켜 응집 성향 단백질 폴딩 중간체의 농도를 감소시킴으로써 폴딩을 보조한다. 촉매의 한 클래스인, 단백질 디설파이드 이성화효소 (또는 티올-디설파이드-옥시도-환원효소로도 명명됨) 는, 분비 단백질에서의 디설파이드 결합의 형성 또는 재배열을 촉매한다. 그람 음성 (Gram-negative) 박테리아에서, 주변세포질에서의 분비 단백질의 산화적 폴딩은 문헌 [Bardwell, J. C., Mol Microbiol 14 (1994) 199-205] 및 [Missiakas, D., 등, Embo J 14 (1995) 3415-24] 에서 DsbA, DsbB, DsbC 및 DsbD 로 정의된 단백질 디설파이드 이성화효소의 캐스캐이드에 의해 조정된다.
펩티딜 프롤릴 시스/트란스 이성화효소 (PPIs) 로서 명명된 폴딩 촉매의 또다른 중요한 클래스에는 상이한 구성원들, 예컨대 CypA, PpiD [Dartigalongue, C. 및 Raina, S., Embo J. 17 (1998) 3968-80], FkpA [Danese, P. N., 등, Genes Dev 9 (1995) 387-98)], 트리거 인자 [(Crooke, E. 및 Wickner, W., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84 (1987) 5216-20 및 Stoller, G., 등, Embo J 14 (1995) 4939-48], 및 SlyD [Hottenrott, S., 등, J Biol Chem 272 (1997) 15697-701] 가 포함된다. 이들 중에서, FkpA, SlyD 및 트리거 인자가 서열 정렬을 근거로 연관성이 있는 것으로 발견되었다.
펩티딜 프롤릴 이성화효소 FkpA 는 그람 음성 박테리아의 주변세포질에 위치한다. 상기 샤페론은 박테리아 외부 막 단백질의 수송 및 전이에 중요한 것으 로 추측된다. 문헌 [Ramm, K. 및 Pluckthun, A., J Biol Chem 275 (2000) 17106-13] 에서는 FkpA 가 2 가지 상이한 방법으로 단백질의 정확한 폴딩에 도움이 되는 효과를 나타낸다는 것을 보여준다. 우선, FkpA 는 초기 폴딩 중간체와 상호작용을 함으로써, 그의 응집을 방지한다. 두번째로, 응집된 형태로 평형을 이루며 존재할 수 있는, 부분적으로 폴딩되지 않은 종류에 결합할 수 있음으로써 비반응성 단백질을 재활성화하는 능력을 갖는다.
일부 폴딩 헬퍼들은 촉매적으로 활성인 도메인 뿐만 아니라 샤페론 (또는 폴리펩티드 결합) 도메인을 모두 포함한다. 대표적인 예는, 예를 들어, 트리거 인자 [Zarnt, T., 등, J Mol Biol 271 (1997) 827-37, Wang, C. C. 및 Tsou, C. L., Faseb J. 7 (1993) 1515-7], SurA [Behrens 등, EMBO J.(2001) 20(1), 285-294] 및 DsbA [Frech, C., 등, Embo J. 15 (1996) 392-98] 이 포함된다. 본 출원인의 관찰에 의하면, 동일한 분자 구조가 PPIases FkpA 및 SlyD 에서 각각 실현되는 것으로 보인다.
상이한 독립적인 시스템에서 샤페론의 증강된 발현이 폴리펩티드의 재조합적 생산을 촉진할 수 있다는 것이 증명되었다. 그에 대한 한 예가 WO 94/08012 에 기재되어 있다.
단백질의 생산 증가는 폴리펩티드 코딩 서열 뿐만 아니라 샤페론 서열을 포함하는 유전자 구축물을 이용함으로써 달성될 수 있음이 공지되었다. 상기의 융합 개념은, 예를 들어, 인간 프로-인슐린 (pro-insulin) 유전자 및 DsbA 를 포함하는 유전자 구축물을 이용함으로써 Escherichia coli 의 주변세포질에서 인간 프 로-인슐린의 상당한 생산 증가를 초래하는 것으로 나타났다 (Winter, J., 등, Journal of Biotechnology 84 (2000) 175-185).
원래형으로 폴딩된 폴리펩티드의 생산 증가를 위한 샤페론을 이용하는 접근법은 주로 샤페론 단백질의 결합 및 그에 따른 가용화 기능에 기인한다. 샤페론 및 표적 단백질을 포함하는 융합 폴리펩티드의 재조합적 생산 후에, 일반적으로 샤페론은 수득한 폴리펩티드로부터 절단되어, 순수한 형태의 원하는 폴리펩티드를 수득한다. 대조적으로, 본 발명은 레트로바이러스 표면 당단백질과 회합하는, 적당한 샤페론의 유익한 가용화 효과를 근거로 한다.
놀랍게도 폴딩 헬퍼들, 예를 들어 펩티딜 프롤릴 이성화효소 (PPI) 클래스, 특히 FKBP 패밀리 유래의 다수의 구성원들이, 촉매 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 아밀로이드형성 단백질, 또는 더욱 일반적으로 언급하면, 응집하려는 경향을 갖는 단백질의 가용화에 매우 유익한 효과를 야기한다는 것을 발견했다. 달리 언급하면, 응집성향의 (즉, 샤페론이 없는, 분리된 형태) 상기 단백질과 가용성 복합체를 형성함으로써 상기와 같이 된다. 달리 언급하면, 생리학적 조건 하에서 거의 용해되지 않거나 또는 불용성인 상기 단백질들은, 적당한 PPI 샤페론과의 복합체에 일단 결합하면 약한 생리학적 조건 하에서 (즉, 세정제 또는 캐오트로픽제 (chaotropic agent) 와 같은 가용화 첨가제를 필요로 하지 않음) 가용화되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 예를 들어, 응집성향 표적 단백질로서의 HIV-1 의 gp41 단백질 및 용해능 부여 샤페론으로서의 FkpA 또는 기타 FKBP 를 포함하는 가용성 단백질-샤페론 복합체를 제조할 수 있었다.
또한, HIV-1 gp41 또는 HIV-2 gp36 각각의 특정한 뚜렷한 변이체가 PPI-클래스의 샤페론과 가용성 복합체를 형성하기에 특별히 적합하다는 것을 발견했다.
gp41 및 FkpA 또는 gp36 및 FkpA 의 복합체는, 예를 들어, 생리학적 조건 하에서 즉시 가용화되며, 이들은 통상적인 pH 범위에서 용이하게 표지될 수 있으며, 이들은 HIV (1 또는 2, 각각) 의 gp41 또는 gp36 각각에 대한 항체의 검출에서 매우 유리하게 사용될 수 있으며, 따라서 HIV 감염의 진단에서 매우 유리하게 사용될 수 있다.
본 발명은, 본질적으로 불용성인 표적 단백질 및 펩티딜-프롤릴-이성화효소 클래스 샤페론을 포함하는 가용성 복합체의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 단백질 및 상기 샤페론을, 단백질 및 샤페론이 모두 가용화되며, 형성된 단백질-샤페론 복합체가 용해되는 생리학적 조건으로 완충액을 조정한 완충액 중에서 혼합하는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 "표적 단백질" 은 20 mM 나트륨 포스페이트 및 150 mM 염화나트륨으로 이루어진 pH 7.4 의 완충 수용액 중에서 본질적으로 불용성인 임의의 단백질일 수 있다. 바람직한 표적 단백질은, 예를 들어 아밀로이드형성 단백질, 아밀로이드형성 바이러스의 표면 당단백질, 레트로바이러스 표면 당단백질, 특히 HIV-1 gp41, HIV-2 gp36 및 HTLV gp21 이다.
표적 폴리펩티드의 한 가지 중요한 군은 소위 아밀로이드형성 단백질 또는 폴리펩티드이다. 상기 아밀로이드형성 단백질은 체액 또는 체액 분획 중에서 응집된 형태로 발견된다. 공지된 예는 혈청 아밀로이드 A (sAA), 소위 β-A4 또는 Aβ (알츠하이머 병의 뇌에서 특징적인 아밀로이드 침전물을 형성하는 것으로 공지된 42 또는 43 아미노산의 폴리펩티드), 소위 프라이온 (prion) 단백질 (BSE 또는 크루츠펠트-제이콥 (Creutzfeldt-Jacob) 병에서의 응집물에서의 PrPsc 형태 축적물), 및 HAD (HIV 연관성 치매) 를 앓는 환자의 뇌에서 아밀로이드형 플라크에서 발견되는, HIV-1 gp41 과 같은 레트로바이러스 표면 당단백질이다. 바람직한 구현예에서, 샤페론, 바람직하게는 PPI 샤페론은 아밀로이드형성 단백질 및 샤페론을 포함하는 가용성 복합체 형성에 사용된다. 매우 유리하게도, 상기 복합체가 다수의 상이한 면역검정 과정에서 사용될 수 있다. 바람직하게는 상기 복합체가 이중 항원 가교 개념에 따른 면역검정에서 사용될 수 있다.
HIV 및 기타 외피성 (enveloped) 바이러스, 예컨대 HTLV, 인플루엔자 바이러스 및 에볼라 바이러스는 세포 부착 및 막 융합을 모두 매개하는 표면 당단백질을 발현한다. 상기 기능을 제공하기 위해, 모든 상기 표면 당단백질은, 이들을 시험관 내에서 취급하기에 어렵게 하며, 응집성향이 되도록 하고, 이들을 시험관 내 리폴딩 시도를 위한 표적이 되도록 하는 극히 소수성인 단편을 포함한다. 추가적인 바람직한 구현예에서, 본 발명은 PPI 샤페론 및 외피성 바이러스의 표면 당단백질을 포함하는 가용성 복합체에 관한 것이다. 특히, PPI 샤페론 및 외피성 바이러스의 표면 당단백질을 포함하는 복합체의, 표면 당단백질에 대한 항체의 검출을 위한 면역검정에서의 용도에 관한 것이다.
HAD 는 HIV 감염의 공지된 합병증이다. 세포학적 현상에 대해 상기 문헌에서 Caffrey, M., 등에 의해 기재된 바와 같이, HAD 는 크루츠펠트-제이콥 병으로 명명되는 스폰지형 뇌질환과 매우 유사하다. 크루츠펠트-제이콥의 병인은 일반적으로 변형된 프라이온 단백질을 포함하는 플라크의 아밀로이드형성 축적으로부터 일어나는 것으로 간주된다 (Prusiner, S. B., Proc Natl Acad Sci USA 95 (1998) 13363-83). e-gp41 의 고분자량 응집물과 관련된 HAD 에 대한 유사한 병소가 매우 있음직하다. HIV 뇌질환에서의 신경 병소는 빈스반거 병 (Binswanger's disease) 과 병리학적 및 방사선의학적인 특징을 공유한다.
본 발명에 따른 바람직한 아밀로이드형성 단백질은 각각 HIV-1 로부터 유도된 gp41, HIV-2 로부터 유도된 gp36, 또는 HTLV 로부터 유도된 gp21 이다.
단백질은 20 mM 나트륨 포스페이트 pH 7.4, 150 mM NaCl 로 이루어진 완충액 중에서 50 nM 이하의 농도로 용해하는 경우, "본질적으로 불용성인" 것으로 간주된다.
PPI-샤페론 및 표적 단백질을 포함하는 본 발명에 따른 복합체는, 생리학적인 완충액 조건, 예를 들어 20 mM 나트륨 포스페이트 pH 7.4, 150 mM NaCl 로 이루어진 완충액 중에 PPI-샤페론 복합체가 포함된 표적 단백질이 100 nM 이상의 농도로 용해하는 경우 "가용성" 인 것으로 간주된다.
단백질 및 샤페론이 모두 가용화되는 완충액 중에서 표적 단백질 및 샤페론을 혼합하는 단계, 및 형성된 단백질-샤페론 복합체가 용해되어 잔존하는 생리학적 조건으로 완충액을 조정하는 단계를 포함하는 방법을 개발했다.
가용성 샤페론-표적 단백질 복합체의 제조는 가용화 완충액 조건, 즉 표적 단백질 및 샤페론이 모두 가용화되는 완충액으로부터 출발한다. 적당한 완충액은, "비-생리학적" 또는 "가용성" 완충액으로도 명명될 수 있으며, 표적 단백질 및 PPI 샤페론이 모두 변성되지 않거나, 또는 적어도 비가역적으로 변성되지 않는 필요 조건을 만족시켜야 한다. 상기 완충액 조건으로부터 출발하여, 샤페론이 표적 단백질에 결합하면, 표적 단백질의 침전이 일어나지 않으면서 완충액의 비-생리학적 조건으로부터 생리학적 조건으로의 변화가 가능하다.
적당한 (비-생리학적) 완충액, 즉 본질적으로 불용성인 표적 단백질 및 PPI-샤페론이 모두 가용화되는 완충액은 높거나 또는 낮은 pH, 또는 높은 캐오트로픽 염 농도 또는 이들의 조합을 이용한다.
PPI-샤페론 및 본질적으로 불용성인 표적 단백질을 포함하는 분자간 복합체 제조의 경우, 비-생리학적 완충액은 바람직하게는 높거나 또는 오히려 낮은 pH 의 완충액이다. 바람직하게는 상기 완충액에서 높은 pH 범위는 pH 가 9 내지 12 이며, 낮은 pH 범위는 pH 가 2 내지 4.5 이다.
PPI-샤페론 및 본질적으로 불용성인 표적 단백질을 포함하는 분자간 복합체 제조의 경우, 가용화 완충액은 바람직하게는 약 6 의 pH 에서 상당히 높은 농도의 캐오트로픽 염, 예를 들어, 6.0 M 염화구아니딘을 함유하는 완충액이다. 복원시, 표적 단백질은 그의 원래 구조 및 분자간 복합체 형태를 취한다.
본 발명의 문맥에서, 완충액 내에 임의로 존재할 수 있는 염 외의 성분 (예를 들어, 당, 알콜, 세정제) 과 상관없이, 상기 첨가제가 표적 단백질 및 샤페론을 포함하는 복합체의 용해도를 약화시키지 않는 한, 생리학적 완충액 조건은 5.0 내지 8.5 의 pH 값 및 500 mM 미만의 전체 염 농도로 정의된다.
추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 가용성 레트로바이러스 표면 당단백질-샤페론 복합체의 제조 방법에 관한 것이다: 레트로바이러스 표면 당단백질 및 펩티딜 프롤릴 이성화효소를, 레트로바이러스 표면 당단백질 및 펩티딜 프롤릴 이성화효소가 모두 가용화되며 복합체를 형성하는 완충액 중에서 혼합하는 단계, 및 복합체가 용해되는 생리학적 조건으로 완충액을 조정하는 단계.
본 발명에서 사용되는 용어 "레트로바이러스 표면 당단백질" 또는 "rsgp" 는, HIV-1 의 gp41 및 HIV-2 의 gp36 뿐만 아니라, 기타 포유류 면역결핍 바이러스로부터 유도되는 상응하는 외피성 당단백질을 포함한다. 바람직한 레트로바이러스 표면 당단백질은, HIV-1 유래의 gp41, HIV-2 유래의 gp36 및 HTLV 의 gp21 이다. 특히 바람직한 rsgp 는 HIV-1 의 gp41 및 HIV-2 의 gp36 이다. 본원에서 개요된 바와 같은 용어 rsgp 는 또한 천연 발생의 것 뿐만 아니라, rsgp 의 합성된 조작 변이체를 포함한다.
gp41 또는 gp36 각각의 N-나선 도메인 내 아미노산의 특정한 뚜렷한 치환이, gp41 또는 gp36 각각의 야생형 서열을 가진 폴리펩티드에 비해 상기 분자들의 전반적인 특성에서 추가의 장점을 야기한다는 것이 발견되었다. 상기 변이체들은 본 발명에 따른 바람직한 구현예를 대표한다. 특히, 위치들 Leu 555, Leu 566, Ile 573 및 Ile 580 의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 위치에서의 하나 이상 및 4 개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 HIV-1 gp41 의 변이체로서, 상기 위치들이 HIV-1 gp41 야생형 서열 (서열 번호 1) 로부터 공지된 위치이거나 또는 이들로부터 공지되는 위치에 상응하는 것이며, 상기 치환 아미노산은 각각 독립적으로 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 아스파르트산 및 글루탐산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 HIV-1 gp41 의 변이체, 또는 위치들 Leu 554, Leu 565 및 Val 579 의 군으로부터 선택되는 위치에서 하나 이상 및 3 개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 HIV-2 gp36 의 변이체로서, 상기 위치들이 HIV-2 gp36 야생형 서열 (서열 번호 2) 로부터 공지된 위치이거나 또는 상기로부터 공지된 위치에 상응하는 위치이며, 치환 아미노산이 각각 독립적으로 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 아스파르트산 및 글루탐산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 HIV-2 gp36 의 변이체가 당 분야에 공지된 문제들을 적어도 부분적으로 해결하기에 적당하다.
gp41 또는 gp36 의 신규한 변이체는 각각 야생형 서열에 상응하는 이들의 폴리펩티드에 비해 응집 성향이 덜하며, 더욱 가용성이고 취급이 더욱 용이하다. 개선된 용해도는, 생리학적 완충액 조건 하에 가용화된 형태의 gp41 또는 gp36 를 함유하는 시약 (reagent) 에 대해 제공하는 시도에서 특히 명백해진다. 샤페론의 펩티딜-프롤릴-이성화효소 (PPI) 클래스로부터 선택되는 샤페론에 의해 야기되는 효과를 가진 신규한 변이체의 바람직한 특성들과 조합하는 것이 특히 유리한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 추가로, 상기 변이체 및 샤페론의 펩티딜-프롤릴-이성화효소 클래스의 샤페론을 포함하는 가용성 복합체 제조에서의 본 발명 에 기재된 바와 같은 gp41 의 변이체 및/또는 gp36 의 변이체의 용도에 관한 것이다.
변이체 HIV-당단백질 및 PPI-클래스 샤페론을 포함하는 가용성 복합체는 바람직하게는 각각의 변이체 HIV-1 gp41 또는 HIV-2 gp36, 및 PPI 클래스 샤페론을 포함하는 단일 재조합 단백질로부터 수득된다. 따라서, 바람직한 구현예는 본 발명에서 기재된 HIV-1 gp41 또는 HIV-2 gp36 의 변이체 및 샤페론의 펩티딜-프롤릴-이성화효소 클래스로부터 선택되는 샤페론을 포함하는 재조합 단백질이다.
gp41 또는 gp36 의 신규한 변이체가 야생형 폴리펩티드보다 취급하기에 더 용이하다는 사실은, 이들이 면역원으로서의 용도 또는 항원으로서의 용도와 같은 각종 목적에 이상적이 되도록 한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 gp41 및/또는 gp36 의 변이체 또는 PPI 샤페론 및 상기 변이체를 포함하는 복합체의 면역 검정에서의, 예를 들어, 단일 재조합 단백질로서의 용도에 관한 것이다. 가장 흥미로운 것은, 레트로바이러스 표면 당단백질 및 PPI 샤페론을 모두 포함하는 융합 단백질이 적당한 조건 하에 가용화 및 복원될 수 있으며, HIV 면역검정에서 통상적인 표지 및 신뢰성있는 검출을 가능하게 하는 가용성 분자내 rsgp-샤페론 복합체를 형성할 수 있는 것을 발견했다.
레트로바이러스 표면 당단백질 및 샤페론 사이의 가용성 복합체는 이중 항원 가교 개념에 따른 항체 검출을 위한 면역검정에서 큰 장점으로 사용될 수 있다.
HIV-1 유래의 gp41 또는 HIV-2 유래의 gp36 를 포함하는 rsgp-샤페론 복합체는 감염 초기 HIV 에 대한 항체의 검출에서 특히 유리하다. 가용성 샤페론- gp41 복합체 또는 가용성 샤페론-gp36 복합체로는, 바람직하게는 가교 개념에 따른, 면역검정을 수행할 수 있으며, 이는 체액 샘플에서의 HIV 에 대한 항체의 민감한 조기 검출을 가능하게 한다.
샤페론이 다른 불용성 단백질과 복합체를 형성할 수 있다는 사실은 또한 면역검정, 바람직하게는 가교 개념에 따른 면역검정을 전반적으로 더욱 개선하기 위해 큰 장점을 갖고 이용될 수 있다. 가교 개념은 제 1 항원 (대부분 고체 상 측면 상의 소위 포획 항원으로 명명됨) 으로서의 샤페론-항원 복합체 및 제 2 샤페론-항원 복합체 (대부분 검출 측면 상의 검출 항원) 이용을 가능하게 한다. 샤페론-반응성 항체의 결합으로 인한 백그라운드 반응 문제점을 최소화하기 위해, 상기 가교 검정은, 고체 상 측면에 대한 제 1 샤페론, 및 상이한 종으로부터 유도되는 검출 측면에 대한 제 2 샤페론을 이용하여 추가로 유리하게 변형될 수 있다.
현재, 표지된 샤페론-항원 복합체를 이용하는 가교 개념에 따른 면역검정 수행이 가능하다. 샤페론만을 단독으로 표지하여, 상기 표지로써 항원이 변형되지 않게 하거나 또는 불리하게 영향 (예를 들어, 구조적 측면) 을 받지 않도록 한 샤페론-항원 복합체를 제조하는 것도 가능하다.
화학적 커플링의 양태 및 전략은 필요에 따라 선택될 수 있다. 폴리펩티드의 경우, -SH, -NH2 또는 -COO- 잔기 뿐만 아니라, 타이로신의 -OH 기, 히스티딘의 이미다졸기, 또는 트립토판의 복소환 이미노기를 표적으로 하는 커플링 화학이 이용가능하다. 각종 적당한 커플링 화학이 각각의 상기 관능기에 대해 공지되 어 있다 (Aslam, M. 및 Dent, A., 상기 문헌). 통상적인 단백질 커플링 화학에서는, 예를 들어, 약 5 내지 8 의 pH 범위 내의 작업 완충액 조건 하에 가용화될 수 있는 단백질을 필요로 한다. 예를 들어, gp41 는, 예를 들어, SDS 로 변성되지 않는 한, 상기 pH 범위 내에서 가용화되지 않으며, 따라서 원래형으로 폴딩된 gp41 는 화학적 커플링의 여지가 없다. 본원에 기재된 gp41-샤페론 복합체들은, 사용되는 검출 포맷에 상관없이 면역검정용인 가용성의 표지된 HIV-외피성 단백질을 제조하기 위한 통상적인 수단을 제공한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 가용화된 레트로바이러스 표면 당단백질 및 펩티딜 프롤릴 이성화효소 클래스로부터 선택되는 샤페론을 비-생리학적 완충액 조건 하에서 혼합한 후, 완충액을 생리학적 조건으로 조정하여 분자간 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 가용성 rsgp-샤페론 복합체의 제조 방법에 관한 것이다.
샤페론 및 레트로바이러스 표면 당단백질은 분리된 폴리펩티드로서만 사용되는 것이 아니다. 놀랍게도 두 단백질을 공유결합으로 결합시키는 것이 유리하다는 것을 관찰했다. 상기 공유 결합은 통상적인 화학적 가교 결합 과정에 의해 가능하며; 그러나, 바람직하게는 공유 결합은 레트로바이러스 표면 당단백질 및 샤페론을 포함하는 재조합 폴리펩티드를 제조함으로써 달성된다.
추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 적당한 완충액 조건 하에서, 공유결합으로 결합된 레트로바이러스 표면 당단백질 및 펩티딜 프롤릴 이성화효소 클래스로부터 선택되는 샤페론 단백질을 포함하는 단백질을 가용화시킨 후, 완충액을 생리학적 조건으로 조정하는 단계를 포함하는 가용성 rsgp-샤페론 복합체의 제조 방 법에 관한 것이다. 상기 방식으로 분자간 복합체가 수득된다.
본 발명은 펩티딜 프롤릴 시스/트란스 이성화효소 (PPI) 로 명명되는 폴딩 헬퍼의 클래스로부터 유도되는 샤페론의 용도를 교시한다 (참고, Dartigalongue, C. 및 Raina, 상기 문헌). 상기 패밀리의 널리 공지된 예시는 CypA, PpiD (Dartigalongue, C. 및 Raina, S., Embo J 17 (1998) 3968-80; Schmid, F. X., Molecular chaperones in the life cyle of proteins (1998) 361-389, Eds. A. L. Fink 및 Y. Goto, Marcel Decker In., New York), FkpA (Danese, P. N., 등, Genes Dev 9 (1995) 387-98) 및 트리거 인자 (Crooke, E. 및 Wickner, W., Proc Natl Acad Sci USA 84 (1987) 5216-20; Stoller, G., 등, Embo J 14 (1995) 4939-48) 로 명명되는 구성원들이다.
펩티딜 프롤릴 이성화효소는 3 개의 패밀리인, 파르불린 (Schmid, F.X., 상기 문헌, Rahfeld, J. U., 등, FEBS Lett 352 (1994) 180-4), 싸이클로필린 (Fischer, G., 등, Nature 337 (1989) 476-8) 및 FKBP 패밀리 (Lane, W. S., 등, J Protein Chem. 10 (1991) 151-60) 로 분류된다. FKBF 패밀리는 그의 구성원들이 원래 마크로라이드 (macrolide), 예를 들어, FK 506 및 라파마이신에 결합하는 이들의 능력으로 동정되었으므로 흥미로운 생화학적 특징을 나타낸다 (Kay, J. E., Biochem J 314 (1996) 361-85).
프롤릴 이성화효소는 상이한 기능의 상이한 서브유닛 또는 단위체 (module), 예를 들어, 촉매 활성을 나타내는 단위체 및 샤페론 또는 결합 활성을 나타내는 단위체를 포함할 수 있다. FKBP 패밀리의 상기 단위체 구성원들은 FkpA (Ramm, K. 및 Pluckthun, A., J Biol Chem 275 (2000) 17106-13), SlyD (Hottenrott, S., 등, J. Biol Chem 272 (1997) 15697-701) 및 트리거 인자 (Scholz, C., 등, Embo J. 16 (1997) 54-8) 이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 레트로바이러스 표면 당단백질 및 폴딩 촉매의 펩티딜 프롤릴 이성화효소 클래스로부터 선택되는 샤페론을 포함하는 가용성 복합체에 관한 것이다.
물론, 본 발명은 펩티딜 프롤릴 이성화효소 클래스의 특별히 언급된 구성원의 용도에 제한되지 않으며, 상이한 종의 박테리아로부터 유도된 동일한 클래스 유래의 샤페론을 이용하여 수행될 수도 있다. 바람직하게는 샤페론의 PPI 클래스의 FKBP 패밀리의 구성원이 이용된다.
추가의 구현예에서, 진핵성 유기체로부터 유도되는 상동체를 이용하는 것이 바람직하며, 인간 기원의 PPIase 를 이용하는 것이 더욱 바람직한데, 이는 상기 PPIase 들이 인간 혈청 유래의 항체에 의해 인식되지 않아 혈청학적 검정 (예를 들어, 인간 항체의 검출을 근거로 하는 검정) 에서 상호작용하지 않기 때문이다.
또한 분자 샤페론의 완전한 서열이 언제나 필요한 것은 아니라는 것이 널리 공지되었으며 고려된다. 필요한 능력 및 기능을 여전히 보유하는 샤페론의 기능적 절편 (소위, 단위체) 이 또한 이용될 수 있다 (참고, WO 98/13496).
예를 들어, FkpA 는 박테리아 세포질 중의 비활성 전구체 분자로서 합성되며 세포막을 통해 전이되는 주변세포질 PPI 이다. FkpA 의 활성 형태 (성숙한 FkpA 또는 주변세포질 FkpA) 에는 시그널 서열 (아미노산 1 내지 25) 이 없으며, 따라서 전구체 분자의 아미노산 26 내지 270 을 포함한다. FkpA 에 대한 관련 서열 정보는 공지된 데이터베이스, 예를 들어 접근 번호 P 45523 하에 "SWISS-PROT" 로부터 용이하게 입수할 수 있다.
FkpA 의 가까운 관련자, 즉 SlyD 는, 촉매 및 샤페론 기능을 담당하는 구조화된 N-말단 도메인 및 히스티딘 및 시스테인 잔기가 예외적으로 풍부한 대부분이 구조화되지 않은 C-말단으로 이루어진다 (Hottenrott, S., 등, J Biol Chem 272 (1997) 15697-701). 아미노산 1 - 165 를 포함하는 SlyD 의 C-말단이 절단된 변이체는 gp41 및 gp36 상에서 그의 가용화 기능을 유효하게 발휘한다는 것을 발견했다. 야생형 SlyD 와는 달리, 사용된 절단 SlyD 변이체 (1 - 165) 에서는 디설파이드 셔플링을 포함할 위험은 성공적으로 회피할 수 있다.
하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 포함하는 상기 논의된 샤페론의 변이체는 또한 본 발명에 따른 공정 수행에 이용될 수 있다.
다른 공급원들 유래의 적당한 샤페론 및 샤페론의 적당한 절편 또는 돌연변이는 실시예에 기재된 과정을 이용하여 용이하게 선별할 수 있다. 이들은 가용성 rsgp-샤페론 복합체를 제조하기 위해 유리된 형태로 또는 레트로바이러스 표면 당단백질에 공유결합으로 결합된 형태로 이용될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 구현예에서, 결합 반응 능력 보유 (binding-competent) PPIase 샤페론이 레트로바이러스 표면 당단백질과 재조합적으로 결합하여 박테리아 세포질에서 유전자 생산물의 높은 발현을 제공할 수 있다. 본 발명에서 언급되는 결합 반응 능력 보유 PPIase 는 그의 촉매성 PPIase 활성과는 상관없이 적어도 확장된 폴리펩티드 기질로의 결합을 중재하는 기능성 유닛 (예를 들어, 기질 결합 또는 샤페론 모티 브) 을 포함한다.
폴딩 촉매의 PPI 클래스에 속하지 않는 일부 샤페론이 레트로바이러스 표면 당단백질을 가진 가용성 복합체를 형성할 수 있다는 것을 관찰했다. 본 발명에 따른 추가적인 바람직한 구현예는 Skp (OmpH 로도 공지되어 있음; Missiakas, D. 등, Mol Microbiol 21 (1996) 871-84) 및 레트로바이러스 표면 당단백질 사이의 가용성 복합체이다. 또다른 바람직한 구현예는 레트로바이러스 표면 당단백질 및 GroEL 또는 그의 일부를 포함하는 가용성 복합체이다. Skp 와 상동체인 샤페론도 이용될 수 있다.
단위체 (modular) PPI 는 변성되거나 또는 부분적으로 변성된 단백질에 우선적으로 결합한다는 것이 공지되었다 (예를 들어, Scholz et A, 상기 문헌). PPIase 들은 단백질의 폴딩을 촉매할 뿐만 아니라, 상기 단백질과 안정한 복합체를 형성함으로써, 용해도를 부여하는 놀라운 특성을 가진 것으로 발견되었다. 놀랍게도, 연구된 PPIase 들 (예컨대 TF, SlyD 및 FkpA) 은 예를 들어, 원래형의 폴딩된 레트로바이러스 표면 당단백질에 결합하여 가용화시킨다. 본 발명에 따른 "원래형 (Native-like)" 또는 "원래형으로 폴딩된 (native-like folded)" gp41 은, 원거리-UV-CD 에 의해 확인되는 2 차 구조에서의 높은 나선구조 함량 및 근거리-UV-CD 에 의해 확인되는 3 차 접촉을 특징으로 하며, 이는 도 1b 및 5 에 각각 나타낸 전형적인 "gp41-모습" 에 반영된다. 더욱이, 본 발명에 따른 "원래형" gp41 의 UV 스펙트럼은 320 nm 초과의 파장에서 현저한 흡광 (이는 응집물과 같은 광선 표유를 지적한다) 을 나타내지 않는다.
모델 생분자들 사이, 예를 들어, 항체 및 항원 사이의 복합체 형성에 대한 다수의 정보가 있다 (리뷰로서는 Braden, B. C. 및 Poljak, R. J., Faseb J. (1995) 9-16 를 참고). 일반적으로, 복합체 형성 및 용해는 동시에 발생하며, 복합체 및 결합 파트너는 자유 평형에서 공존한다. 이와 같이, 동일한 점이 본 발명에 기재된 PPI 샤페론 및 아밀로이드형성 단백질 사이의 복합체에 대해서도 사실인 것으로 보인다.
본 발명에 기재된 바와 같은 복합체의 형성은 특히 중요한 특성인데, 이는 PPI 샤페론, 및 예를 들어 비생리학적 완충액 조건 하에서 본질적으로 불용성인 단백질 사이의 복합체가 생리학적 완충액 조건 하에서 즉시 용해하는 것이 발견되었기 때문이다. 생리학적 조건 하에 가용성인 항원은 진단 응용에서 매우 유리하다. 이들은, 예를 들어 표준 물질로서 직접 사용될 수 있다. 더욱이, 이들은 적당한 마커 또는 적당한 결합기와 콘쥬게이션될 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, HIV-2 유래의 gp36 은 유사한 기능 (즉, 막 융합 및 바이러스 침입) 을 제공하며, HIV-1 유래의 gp41 와 유사한 진단 적절성이 있다. HIV-1 의 gp41 를 레트로바이러스 표면 당단백질의 원형적 예로서 이용하는 응용에서 다수의 기술적 문제점이 논의된다. 명확성에 대해서만은, 논의 및 기재가 전적으로 HIV-1 의 gp41 에 집중된다. 그러나, 다른 레트로바이러스 표면 당단백질, 특히 HIV-2 유래의 gp36 및 HTLV 유래의 gp21 에 대해서는 유사한 고려가 적용된다.
천연적으로 발생하는 HIV-1 또는 HIV-2 의 분리물에는 원래 분리되어 기재된 아미노산 서열의 변이체가 포함될 수 있다는 것이 공지되어 있다. 상기 천연 발생물 뿐만 아니라 포유류 면역결핍 rsgp 의 합성되어 조작된 변이체도 또한 본 발명의 범위 내에 있다.
바람직한 구현예에서 본 발명은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 의 rsgp 또는 막통과 당단백질의 변이체에 관한 것이다. HIV-1 gp41 또는 HIV-2 gp36 의 N-나선 도메인에서의 특정 아미노산 치환을 포함하는 변이체가 개시된다.
나선-대-나선 접촉에 연관된 N-나선 뿐만 아니라 C-나선 도메인 모두의 아미노산 위치는 HIV-1 gp41 에 대한 문헌에서 공지되어 있으며, HIV-2 상동체 gp36 에 대해 추정될 수 있다. 상기 위치들에서의 돌연변이는 gp41 또는 gp36 의 각각의 특성, 특히 상기 변이체 및 PPI-샤페론 도메인을 포함하는 융합 단백질의 측면에서 영향을 미친다는 것이 발견되었다.
gp41 류신 지퍼 (zipper) 의 나선 휠 영상에서 "a" 및 "d" 아미노산 위치들은, 본 발명에 따른 변이체의 창출을 위한 바람직한 표적이다. "a" 위치의 아미노산 잔기 (문헌 Chan, D. C., 등, Cell 89 (1997) 263-73 에 따라 번호를 매김) 들은 Q552, I559, L566, I573 및 I580 이며; 각각의 "d" 위치들은 I548, L555, Q562, T569 및 L576 이다.
지퍼 모티브의 나선 완결성과 절충하지 않고 용해도를 개선하기 위해, 적어도 나선 1 회전마다 돌연변이 위치를 서로 고립시키는 것이 바람직하다. 상기 필요조건은, 예를 들어 연속적인 "a" 잔기 Q552, I559, L566 및 I573 의 치환 뿐만 아니라, 예를 들어, 연속적인 "d" 잔기 I548, L555, Q562 및 T569 의 치환으로 만 족된다. 다시 말하면, 돌연변이화된 잔기는 적어도 6 개의 야생형 잔기마다 서로 고립되며, 따라서 정확히 7 배수 모티브가 된다. 또한, 치환 위치들이 적어도 나선 1 회전마다 고립되는 상기 언급된 조건 하에서의 변이체 내에서 "a" 및 "d" 잔기를 모두 돌연변이화시키는 것이 가능하다.
유사하게, HIV-2 의 gp36 엑토도메인에서의 변경은 놀랍게도 SlyD 또는 FkpA 와 융합시 즉시 가용화되는 재조합 단백질을 제공할 수 있음을 발견했다. 여기서, "a" 위치는 Q551, V558, L565, T572 및 V579 이며, "d" 위치는 I547, L554, Q561, T568 및 L575 이다.
바람직하게는, HIV-1 gP41 의 위치 Q552, I559, L566, I573, I580, I548, L555, Q562, T569 및 L576, 또는 HIV-2 gp36 의 Q551, V558, L565, T572, V579, I547, L554, Q561, T568 및 L575 를 포함하는 군으로부터 각각 선택되는 1 내지 6 개의 아미노산은 더 작거나 또는 더욱 친수성인 아미노산으로 치환된다.
바람직하게는, 치환될 아미노산 위치는 HIV-1 의 Q552, I559, L566, I573 및 I580 으로 이루어진 군, 및 HIV-2 의 L554, Q561, T568 및 L575 로 이루어진 군으로부터 각각 선택된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 위치들 Leu555, Leu566, Ile573 및 Ile580 의 군으로부터 선택되는 위치(들)에서의 하나 이상 및 4 개 이하의 아미노산 치환기(들)을 포함하는 HIV-1 gp41 에 관한 것으로서, 상기 위치들은 서열 번호 1 에 기재된 gp41 야생형 서열로부터 공지된 위치이거나 또는 이들로부터 공지된 상기 위치들에 상응하며, 치환 아미노산이 각각 독립적으로 세린, 트레오닌, 아스파라 긴, 글루타민, 아스파르트산 및 글루탐산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 상기 바람직한 구현예는, 야생형 gp41 의 변이체가 제공될 수 있으며, 이들이 gp41 야생형 서열의 상응하는 폴리펩티드에 비해 현저한 개선을 나타낸다는 놀라운 발견을 근거로 한다. 본 발명의 변이체를 유도하는 아미노산 치환은 문헌 [Chan, D. C., 등, Cell 89 (1997) 263-73] 으로부터 공지된, 서열 번호 1 로 제공된 gp41 야생형 서열의 아미노산 조성 및 번호매김을 근거로 기재되었다.
당연히, 본 발명에 기재된 아미노산 치환은 또한 다른 공지된 gp41 및 아직 동정되지 않은 HIV-1 분리물 내에서의 상응하는 서열 위치에서 아미노산을 치환하기 위해 이용될 수 있다. 용어 "위치에 상응하는" 은, HIV-1 분리물 및 그의 변이체가 또한 추가의 아미노산을 포함하거나 또는 아미노산이 없이 발견 또는 생성될 수 있음을 나타내는데 사용되며, 서열 번호 1 의 서열 상에서 상응하는 서열 위치 또는 서열 모티브에 대한 상이한 절대 숫자를 초래하게 된다.
서열 번호 1 의 야생형 서열을 가진 gp41 서열의 다중 지정 (alignment) 및 비교는 GCG Package Version 10.2 (Genetics Computer Group, Inc.) 의 PileUp 프로그램으로 수행된다. PileUp 은 문헌 [Feng, D. F. Doolittle, R. F., J Mol Evol 25 (1987) 351-60] 의 점진 지정 방법의 단순화를 이용하여 다중 서열 지정을 창출하며, 그에 따라 상동, 유사 또는 상이한 아미노산 잔기에 대한 스코어링 매트릭스를 정의한다. 상기 과정은 2 개의 가장 유사한 서열의 접합식 지정 (pairwise alignment) 으로 출발하여 2 개의 지정된 서열의 클러스터를 생성한다. 이어서, 상기 클러스터는 차선으로 가장 관련된 서열 또는 지정된 서열의 클러스터로에 지정될 수 있다. 서열의 두 클러스터는 2 개의 개별적인 서열의 접합식 지정의 단순한 연장에 의해 정렬될 수 있다. 최종 지정은, 모든 서열이 최종 접합식 지정에 포함될 때까지 점차 유사성이 덜한 서열 및 클러스터를 포함하는 일련의 점진적인 접합식 지정에 의해 수행된다. 따라서, 야생형 서열의 위치 555, 566, 573 및 580 에 상응하는, 신규한 HIV-1 분리물 또는 조작된 gp41 분자의 아미노산 위치는 용이하게 배치된다.
본 발명에 따른 HIV-1 gp41 폴리펩티드의 바람직한 변이체는 위치 555 에서의 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하며, 여기서, Leu555 가 아스파르트산 또는 글루탐산에 의해 치환되며, 글루탐산에 의한 치환이 가장 바람직한 치환이다.
본 발명에 따른 HIV-1 gp41 폴리펩티드의 추가적인 바람직한 변이체는 위치 566 에서의 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하며, 여기서 Leu566 은 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환되며, 글루탐산에 의한 치환이 가장 바람직한 치환이다.
본 발명에 따른 HIV-1 gp41 폴리펩티드의 추가적인 바람직한 변이체는 위치 573 에서의 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하며, 여기서 Ile573 은 세린 또는 트레오닌으로 치환되며, 세린에 의한 치환이 가장 바람직한 치환이다.
본 발명에 따른 HIV-1 gp41 폴리펩티드의 추가적인 바람직한 변이체는 위치 580 에서의 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하며, 여기서 Ile580 은 아스 파르트산 또는 글루탐산에 의해 치환되며, 글루탐산에 의한 치환이 가장 바람직한 치환이다.
본 발명은 또한 위치 Leu554, Leu565 및 Val579 의 군으로부터 선택되는 위치에서의 하나 이상의 아미노산 치환 및 3 개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 HIV-2 gp36 의 변이체에 관한 것이며, 상기 위치들은 HIV-2 gp36 야생형 서열 (서열 번호 2) 로부터 공지된 위치이거나 또는 이들로부터 공지된 위치에 상응하는 것으로서, 치환 아미노산이 각각 독립적으로 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 아스파르트산 및 글루탐산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
번호 매김은 문헌 [Guyader, M., 등, Nature 326 (1987) 662-9] 에서 공지된 야생형 서열 (서열 번호 2) 에 따른다. 상기 서열로부터 공지된 위치에 상응하는 gp36 내에서의 아미노산 위치는 gp41 에 대해 상기 기재된 바와 같이 결정된다.
본 발명에 따른 HIV-2 gp36 폴리펩티드의 바람직한 변이체는 위치 554 에서의 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하며, 여기서 Leu554 는 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환되며, 글루탐산에 의한 치환이 가장 바람직한 치환이다.
본 발명에 따른 HIV-2 gp36 폴리펩티드의 바람직한 변이체는 위치 565 에서의 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하며, 여기서 Leu565 은 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환되며, 글루탐산에 의한 치환이 가장 바람직한 치환이다.
본 발명에 따른 HIV-2 gp36 폴리펩티드의 바람직한 변이체는 위치 579 에서의 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하며, 여기서 Val579 은 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환되며, 글루탐산에 의한 치환이 가장 바람직한 치환이다. 바람직한 구현예에서, 변이체 gp41 또는 변이체 gp36 각각은 상기 기재된 바와 같이 2 개의 아미노산 위치에서의 치환을 포함한다. 3 개의 아미노산 치환을 포함하는 변이체가 또한 바람직하다. 추가의 바람직한 구현예에서, 변이체 gp41 은 상기에서 상세히 논의된 4 개의 아미노산 위치에서의 치환을 포함한다.
바람직한 구현예에서, gp41 또는 gp 36 각각 (즉, 융합 펩티드 및 막통과 단편이 없는 엑토도메인) 또는 상응하는 포유류 면역결핍 바이러스 외피성 단백질 (예를 들어, HTLV 유래의 gp21) 의 완전한 서열이 PPI 샤페론과의 복합체 형성에 사용된다. 레트로바이러스 표면 당단백질의 절편, 예컨대 Lu 등에 의한 상기 문헌에 기재된, HIV-1 유래의 gp41 중 하나를 이용하는 것이 고려된다. 상기 절편들은 바람직하게는 C-말단 나선 뿐만 아니라, gp41 의 세포외 부분의 N-말단 나선을 포함한다.
아미노산 위치 535 내지 681 을 포함하는 진단에서 적절한 gp41 (명명법은 문헌 [Chan, D. C., 등, Cell 89 (1997) 263-73] 에 따름) 은 표준 과정에 따른 재조합 기술로 제조될 수 있다. Lu 등의 상기 문헌에서의 도 1 에 기재된 바와 같이, 또다른 흥미로운 gp41 분자가 gp160 전구체 분자의 아미노산 540 - 669 에 편재한다.
레트로바이러스 표면 당단백질의 전형적인 예로서, HIV 의 소형 외피성 단백질이 취급이 극히 어렵고, 상당히 특이한 특성을 나타낸다. 이미 언급한 바와 같이, e-gp41 분자의 가장 중요한 특징 중 하나는 생리학적 완충액 조건에서의 불 용성이다. 재조합적으로 제조된 gp41 은 가용성이면서 pH 3.0 이하 및 낮은 이온 강도에서 천연형 구조를 나타낸다. 그러나, 상기 pH 에서도 여전히 완충액 중에서의 염 농도에 대해 민감하다. 사용되는 염에 따라, gp41 은 100 내지 500 mM 염의 존재 하에 침전한다. 하기에 더욱 상세히 논의된 바와 같이, 이는 (다시) 캐오트로픽제에 의해 (변성된 형태에서) 가용화된다.
생리학적 완충액 조건은 일반적으로 동물의 혈청 또는 혈장 내에서 발견되는 염 및 pH 조건에 상응하는 것으로 이해되며, 약 7.4 의 pH 값 및 약 150 mM 의 염 농도로 정의된다. 본 발명에 따른 rsgp-샤페론 복합체는 상기 완충액 조건 하에 즉시 용해된다. 그곳에 존재하는 rsgp 는 면역학적으로 활성이며, 따라서 원래형 구조를 지칭한다. 적당한 세정제의 부재 또는 그로 인한 예비처리없이 gp41 는 생리학적 완충액 조건 (예를 들어, 20 mM 나트륨 포스페이트 pH 7.4, 150 mM NaCl) 하에서 본질적으로 불용성인 반면에, 본 발명에 따라 기재된 복합체는 적당한 프로토콜에 따라 리폴딩 후 즉시 용해된다. 본 발명의 복합체에 함유된 gp41 엑토도메인은 적어도 100 nM 의 농도, 바람직하게는 1 μM 이상의 농도, 가장 바람직하게는 10 μM 이상의 농도로 용해된다. 따라서, 용해도는 나노몰 이하 내지 마이크로몰 농도 정도에서 실질적으로 증가한다.
본 발명의 범위의 더 나은 이해를 위해, 용해 및 복원에 적용되는 완충액 조건은 필요한대로 적당히 변경될 수 있음을 강조해야 하며, 본 발명의 부당한 제한으로서 이해되어서는 안되며, 광범위한 완충액 조건 상에서 성공적으로 수행된다.
생리학적 완충액의 전반적인 염 농도는 샤페론-gp41 복합체가 용해되지 않 고, gp41 에 용액 내에 머무르는 한 중요하지 않다. 바람직하게는 생리학적 완충액은 10 mM 이상 및 200 mM 이하의 완충계를 포함한다. 나머지 완충 성분들은, 존재하는 경우, 현저한 완충액 용량이 없는 염, 예를 들어, 염화나트륨일 수 있다. 생리학적 완충액은 바람직하게는 염농도가 20 내지 500 mM, 더욱 바람직하게는 50 내지 300 mM, 가장 바람직하게는 100 내지 200 mM 이다.
본 발명에 따른 방법에서, 생리학적 완충액은 pH 값이 5.0 내지 8.5 의 범위이며; 더욱 바람직하게는 상기 완충액의 pH 값이 내지 5.5 내지 8.3 의 범위이다. 더욱더 바람직하게는 상기 생리학적 완충액 조건은 상기 기재된 염 농도 및 6.0 내지 8.0 의 pH 값이며; 가장 바람직하게는 상기 생리학적 완충액의 pH 는 6.5 내지 7.8 이다. 본 발명에 기재된 바와 같은 방법에 따르면, 레트로바이러스 표면 당단백질은 비-생리학적 완충액 조건 하에서 가용화되며, 샤페론이 첨가되고 (또는 이미 공유결합된 추가적인 단백질 도메인으로서 존재한다), 이어서 가용화된 레트로바이러스 표면 당단백질 및 샤페론을 함유하는 혼합물을 생리학적 완충액 조건으로 조정한다. 이렇게 하여 레트로바이러스 표면 당단백질 단독으로 침전되는 반면에, 놀랍게도 상기 공정에서 용액 내에 머문다. 상기 중요한 발견은, 대부분 레트로바이러스 표면 당단백질과 샤페론 사이의 복합체 형성에 기인한다.
E. coli 에서의 gp41 의 재조합적 제조의 경우, 재조합적으로 제조된 gp41 은 봉입체의 형태로 수득된다. 상기 물질은 센 캐오트오픽제, 예를 들어, 7.0 M 구아니딘 티오시아네이트를 이용하여 가용화시킨다. gp41 폴리펩티드는 상기 조건 하에 대부분 구조화되어 있지 않다. 적당한 단계에서 상기 완충액을 pH 3.0 에서 30 mM 포름산으로 바꾸어, 용액 중의 gp41 는 그의 원래형인 모두 나선인 구조인 것으로 추정되도록 한다. 단백질의 정확한 또는 부정확한 폴딩의 상태를 모니터링하는 한 가지 용이한 방법은 아미드 (185 - 250 nm) 및 방향족 (260-320 nm) 영역에서의 상응하는 CD 스펙트럼을 분석하는 것이다. 이외에도, (응집물과 같은) 광선 표유 입자에 대한 정보는 표준 UV 스펙트럼으로부터 용이하게 입수할 수 있다.
여기서 강조할 중요한 점은, 본 발명에 따른, 레트로바이러스 표면 당단백질-샤페론 복합체 내의 레트로바이러스 표면 당단백질이 원래형 폴딩으로 간주되는 것을 취하는 것이다. 반면에, 레트로바이러스 표면 당단백질은, 캐오트로픽제에 의해 중성 pH 에서 용해되며, 대부분 구조화되지 않아서, 정돈된 구조 에피토프를 상실한다. 대안적으로 세정제를 사용하여 레트로바이러스 표면 당단백질을 가용화할 수도 있다. 예를 들어, 나트륨 도데실 설페이트 (SDS) 는 gp41 의 가용화에 성공적으로 이용된다. 그러나, 상기 "SDS-가용성 물질" 은, 예를 들어 gp41 에 대한 항체 검출을 위한 면역검정용으로 선택되는 물질은 아니다. 더욱이 (상기 논의된 바와 같이) 상기 면역검정이 또한 바람직하게는 gp41 의 구조적인 에피토프에 대한 항체를 검출하며, 세정제가 구조적인 에피토프를 부분적으로 파기한다는 것이 배제될 수 없다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 rsgp-샤페론 복합체는 rsgp 가 원래형으로 폴딩되는 것을 특징으로 한다. 상기 복합체 내에서 원래형으로 폴딩된 rsgp 는, 예를 들어, 필요한 면역학적 또는 물리적 특징을 나타낸다.
원래형의 폴딩은 바람직하게는 근거리 UV CD 분광계로 확인되며, 이는 조밀한 구형 단백질 내의 3 차 접촉에 대해 기록한다. gp41 은 약 pH 3.0 및 낮은 이온 강도의 염농도에서 즉시 가용화된다는 것이 공지되었다. 근거리 UV CD 데이터는, 상기 완충액 조건 하에서 gp41 가 원래형으로 폴딩된 구형 단백질의 전형적인 모습을 가진 특징적인 타원율 시그널을 나타낸다는 것을 알린다. 도 5 에 나타낸 바와 같이, gp41 및 FkpA 를 포함하는 융합 펩티드의 gp41 부분은 산성 완충액에서 상기의 전형적인 근거리 UV CD 스펙트럼을 나타낸다. 생리학적 완충액 조건 하에서, 본 발명에 따른 가용성 복합체의 근거리 UV CD 스펙트럼은 정확하게 폴딩된 샤페론 및 원래형으로 폴딩된 gp41 모두의 스펙트럼으로 구성된다. 이는 도 7 에서 FkpA-gp41 융합 단백질에 대해 나타냈다.
본 발명에 따른 바람직한 구현예에서, gp41-샤페론 복합체 중의 gp41 의 원래형 폴딩이 근거리 UV CD 분석으로 평가된다. 상기 근거리 UV CD 는 두 분자 gp41 및 샤페론이 원래형으로 폴딩되었음을 알리는데 이용하는 것이 바람직하다.
가용성 샤페론-gp41 복합체의 제조는 비-생리학적 완충액 조건으로부터 출발한다. 유리된 샤페론 및 유리된 표적 단백질 (예를 들어, HIV-1 유래의 gp41) 사이의 복합체 형성의 경우, "비-생리학적" 완충액은 2 가지 필요조건, 즉 (a) gp41 가 원래형 산성 구조로 존재해야 하며, (b) PPI 샤페론이 적어도 부분적으로는 관능성이어야 한다 (즉, 결합 능력 보유) 는 조건을 만족시켜야 한다. 상기 완충액 조건으로부터 출발하여, 샤페론은 아밀로이드형성 단백질에 결합하며, 비-생리학적인 것으로부터 다소 생리학적인 조건으로의 완충액의 변화가 아밀로이드형 성 단백질의 침전이 일어나지 않으면서도 가능하다.
샤페론은 일반적으로 변성된 단백질에 결합하며, 이들에 작용함으로써 이들의 정확학 (재)폴딩을 촉진하는 반면, 본 발명이 근거로 하는 상황은 놀랍게도 상이하다. 적당한 비-생리학적 완충액 조건 하에 가용화되는 gp41 는 원래형 형태로 존재하는 것으로 보인다 (참고, 도 1a 및 1b 및 도 5). 샤페론 기능의 통상적인 견해와는 달리, 본 발명의 방법에서는 gp41 이 그와 달리 불용성이며 침전하는 완충액 조건 하에서 샤페론이 원래형으로 폴딩된 단백질에 결합하며, 상기 단백질을 안정화시키는 것으로 보인다.
본 발명에 따른 바람직한 구현예에서, PPI 샤페론은 FkpA, SlyD 및 트리거 인자를 포함하는 군으로부터 선택된다.
특히 FkpA 또는 SlyD 가 gp41 의 용해도를 개선하며, 이들과 훨씬 안정한 복합체를 형성한다는 것을 발견했다. 따라서, 더욱 바람직한 구현예는 샤페론이 FkpA 및 SlyD 를 포함하는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다. 가장 바람직한 것은 샤페론 FkpA 이다.
상기에서 추가로 기재된 바와 같이, 샤페론의 절편도 또한 원하는 기능을 야기하기 위해 사용될 수 있다. 촉매 단위체 및 결합 단위체를 포함하는, FKBP 와 같은 단위체 (modular) 샤페론의 경우, 상기 절편이 적어도 결합 도메인을 포함하거나, 또는 상기 절편들이 적어도 본질적으로 결합 도메인에 필적할 기능을 나타내는 것이 바람직하다.
FKBP12 는 FKBP 패밀리의 인간 구성원이며, 본질적으로 PPIase 의 촉매적 이 성화효소 도메인을 포함한다. 이것은 추가적인 폴리펩티드-결합 도메인이 없기 때문에, FKBP 패밀리의 다른 구성원들에 비해 폴딩되지 않거나 또는 부분적으로 폴딩된 단백질 기질에 대해 현저히 감소된 결합 친화성을 나타낸다. FKBP12 의 언폴딩 (unfolding) 및 리폴딩 (refolding) 은 가역적인 과정인 것으로 나타났다 (Egan, D. A., 등, Biochemistry 32 (1993) 1920-7; Scholz, C., 등, J Biol Chem 271 (1996) 12703-7). FkpA (25-270) 및 SlyD (1-165) 의 리폴딩 및 언폴딩도 가역적이므로, 본원에 기재된 과정에 필요한 중추적인 필요조건을 만족시킨다는 것을 발견했다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 gp41 및 FKBP 패밀리로부터 선택되는 샤페론을 포함하는 가용성 복합체에 관한 것이다.
상기 기재된 바와 같이, HIV-1 유래의 gp 41 또는 다른 포유류 면역결핍 바이러스로부터 유도되는 상동체를 포함하는 상기 가용성 복합체는 PPI 샤페론 (예를 들어, 재조합 기술로 제조된 것) 및 재조합적으로 제조된 gp41 를 혼합하여 용이하게 제조할 수 있다. 이어서, 상기 복합체는 2 개의 독립적인 분자 사이에서, 즉 분자간에 형성된다.
복합체 형성은 용해 및 재회합이 병행하여 일어나는 동적인 과정이다. 이는 예를 들어 FkpA 및 gp41 사이의 분자간 및 분자내 (예를 들어, 융합 구축물 내에서) 회합에서 모두 사실이다. gp41 가 생리학적 완충 용액으로부터 즉시 정량적으로 침전하므로, 두 파트너의 농도는, 유리된 형태에서 gp41 의 부정확하거나 또는 비응집성인 농축물로만 존재하고, 대다수의 gp41 가 gp41-샤페론 복합체의 형태 내에서 결합하고 안정화되는 것을 보장하도록 선택되어야 한다.
사용되는 샤페론에 따라서, gp41 분자에 비해 2 배 이상의 몰 수의 샤페론이 혼합되어야 함을 발견했다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명은 gp41 및 샤페론, 바람직하게는 FkpA 의 혼합물을 함유하는 시약 (reagent) 에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 혼합물은 gp41 에 비해 과량의 몰 농도로 FkpA 를 함유한다. 3 내지 10 배 더 많은 FkpA 가 존재하는 것이 바람직하다. 가장 바람직한 FkpA 대 gp41 몰비는 4 내지 6 이다.
복합체, 예를 들어, 공유 결합으로 결합되는 하나 이상의 rsgp 도메인 및 하나 이상의 PPI-샤페론 도메인을 포함하는 상이한 단백질의 도메인 사이에서의, 분자내 복합체의 형성은, 추가적인 유리한 효과들, 예를 들어 안정성 및 제조 용이성을 유도한다는 것을 발견했다. 예를 들어, 두 도메인이 모두 공유결합으로 결합되는 경우, 1:1 (rsgp 대 샤페론) 의 비율이 충분하다는 것이 발견되었다.
재조합적으로 결합된 형태로 레트로바이러스 표면 당단백질 및 샤페론을 포함하는 가용성 복합체는 본 발명에 따른 추가적인 바람직한 구현예를 나타낸다. 상기 재조합 폴리펩티드를 포함하는 가장 바람직한 rsgp 는 HIV-1 유래의 gp41 및 HIV-2 유래의 gp36 이다.
하나 이상의 rsgp 도메인 및 하나 이상의 PPI 샤페론을 포함하는 재조합 단백질에 대해, 비-생리학적 조건으로부터 생리학적 완충액 조건으로의 전이는 상이한 방법으로 달성될 수 있다. gp41 및 FkpA 사이의 가용성 분자내 복합체는, 투석, 신속 희석 또는 매트릭스 보조 리폴딩으로써 비-생리학적 완충액 조건을 생 리학적 완충액 조건으로 조정함으로써 용이하게 수득할 수 있다. 가용성 gp41-샤페론 복합체를 함유하는 혼합물이 직접 변형에 사용될 수 있다.
예를 들어, gp41 및 PPI 샤페론을 함유하는 본 발명에 따른 가용성 복합체는, 재조합 기술로 수득한 단백질 도메인 (gp41 및 샤페론) 을 모두 함유하는 하나의 폴리펩티드로 출발하여 제조될 수 있다. 그 안의 gp41-샤페론 복합체는 본래 분자내의 것이다. 바람직하게는 본 발명에 따른 재조합 폴리펩티드는 gp41 및 샤페론 또는 gp36 및 샤페론을 함유한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 rsgp 도메인 및 2 개 이상의 PPI-샤페론 도메인을 포함하는 재조합 단백질에 관한 것이다. 하나의 rsgp 및 2 개의 PPI-샤페론을 포함하는 재조합 폴리펩티드가 또한 바람직하다.
본 발명에 따른 가용성 gp41-샤페론 복합체를 수득하기 위해 사용되는 재조합 폴리펩티드는 표준 분자생물학 기술을 적용하여 발현된다. 바람직하게는 샤페론 유전자는 gp41 및 샤페론 모두에 대한 유전적 정보 및 임의로는 적당한 펩티드성 링커 서열에 대한 유전 정보를 포함하는 발현 벡터에 표적 단백질 유전자 상류 프레임을 위치시킨다. 상기 재조합 융합 단백질의 대규모 제조용으로 바람직한 숙주는 E. coli 이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 각각 gp41 또는 gp36, 및 샤페론의 펩티딜 프롤릴 이성화효소 클래스로부터 선택되는 샤페론을 포함하는 가용성 복합체에 관한 것이다. 상기 가용성 복합체가 분자내 복합체, 바람직하게는 gp41 또는 gp36 및 PPI 샤페론을 포함하는 재조합 폴리펩티드 내에서의 분자내 복합체인 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, 재조합 폴리펩티드의 PPI 샤페론 부분이 (상응하는 전구체 분자의) 임의의 외부유출 시그널 펩티드가 없으며, 성숙한 PPI 샤페론에 상응한다. 상기 바람직한 구현예에서는 재조합 단백질은 기능성 시그널 서열이 없기 때문에, 유전자 생성물이 박테리아 세포질에 축적된다.
재조합적으로 제조된 FkpA-gp41 중에 함유되는 gp41 의 놀랄만한 특징은 "샤페론이 없는 (unchaperoned)" gp41 엑토도메인에 필적할 그의 예외적인 용해능이다. 흥미롭게도, "캐오트로픽 물질" (즉, 6.0 - 7.0 M GuHCl 중의 FkpA-gp41) 이 상이한 방식으로 리폴딩될 수 있으며, 모두 열적으로 안정하며 가용성인 원래형 형태를 형성한다. 리폴딩은 투석 및 신속 희석 모두에 의해서 뿐만 아니라, 복원 크기 배재 크로마토그래피 또는 매트릭스 보조 리폴딩에 의해서도 고수율로 달성된다. 상기 발견들은, 상기 공유결합으로 결합된 형태에서 gp41-FkpA 융합 폴리펩티드가 준안정성 단백질보다 더 열역학적으로 안정하다는 것을 시사한다.
재조합 FkpA-gp41 폴리펩티드는 상이한 폴딩 필요 조건을 가진 2 개의 단백질 도메인을 포함한다. 정제 프로토콜에는 초기 변성 단계가 포함되기 때문에, 샤페론의 폴딩이 가역적인 것이 필수적이다. 실제로, 공유결합으로 결합된 단백질 복합체 내에서 FkpA 및 gp41 모두의 가역적인 독립적 리폴딩에 대한 괄목할 분광학적 증거가 있다. C-말단이 절단된 SlyD 의 리폴딩이 또한 가역적인 것으로 발견되었다.
상기 두 폴리펩티드 도메인 사이에 적당한 펩티드 링커 서열을 추가적으로 포함하는 샤페론 및 레트로바이러스 표면 당단백질을 포함하는 재조합 폴리펩티드 가 또한 바람직하다. 상기 펩티드 링커 서열은 사용되는 rsgp 및 샤페론 도메인의 최적의 분자내 회합을 보장하도록 선택된다. 바람직하게는, 상기 링커 서열은 길이가 약 20 아미노산이며, 유동능 및 용해능을 모두 지지하는 아미노산, 예를 들어 글리신 및 세린을 포함한다. 바람직하게는, 링커는 10 내지 50 아미노산 길이이다. 더욱 바람직하게는, 길이는 12 내지 40 아미노산 길이이며, 가장 바람직하게는 링커는 15 내지 35 아미노산을 포함한다. rsgp 및 샤페론은 모두 언제나 가까운 접근영역에 있다 (예를 들어, 적당한 링커에 의해 함께 붙들려 있음). 바람직한 구현예에서, 재조합 폴리펩티드는 유동적인 링커를 통해 그의 표적 단백질과 결합된 성숙한 FkpA 를 포함한다. 데이터가 나타내는 바와 같이, 이는 추가적인 안정화 효과를 초래한다.
놀랍게도, PPI 샤페론 및 gp41 사이의 분자간 복합체의 일부로서의 gp41 가, 가용성이면서 안정하다는 것을 발견했다. PPI 샤페론 및 gp36 또는 PPI 샤페론 및 HTLV 유래의 gp21 을 함유하는 분자간 복합체에 대해서도 동일한 것이 적용된다. 상기 복합체에서의 gp41 의 개선된 안정성은 추가적인 장점을 야기한다. 예를 들어, 완전히 복원된 재조합 gp41-샤페론 분자를 매우 용이하게 수득할 수 있다. 재조합 단백질은 초기에 캐오트로픽제 (예를 들어, 구아니딘 클로라이드) 를 처리해 가용화될 수 있다. 용해된 물질을 적당한 생리학적 완충액으로 평형화시킨 겔 여과 칼럼 상에 단순히 통과시킴으로써, 공유결합으로 결합된 단백질 도메인을 포함하는 완전히 복원된 단백질이 수득될 수 있다 (참고, 실시예 2.3 및 도 7 및 8).
가용성 분자내 gp41-샤페론 복합체는 추가적인 놀랄만한 장점을 나타낸다: 이는 세정제의 변성 효과에 대해 훨씬 안정하다. 상기 영향은, 융합 단백질이 2 개의 샤페론 및 1 개의 gp41 또는 1 개의 gp36 를 각각 포함하는 경우 더욱 분명해진다. 대부분의 면역검정은, 비특이적인 결합에 의해 야기되는 문제점을 줄이고, 적어도 부분적으로는 회피하기 위해 세정제의 존재 하에 수행한다. HIV 진단의 경우, 상기 이유 때문 뿐만 아니라, 바이러스 입자를 붕괴 및 파괴하여 gp24 과 같은 바이러스 항원의 검출을 촉진시키기 위해 더 강한 세정제를 사용한다.
SDS (나트륨 도데실 설페이트) 에 의해 가용화되는 재조합적으로 제조된 gp41 엑토도메인은 일상적으로 사용되는 검정용 완충액에서, 예를 들어 항-HIV-항체 또는 p24 항원의 검출에서 면역반응성이 아니다 (도 9 참조). 그러나, 동일한 완충액 조건 하에서, 본 발명에 따른 PPI 샤페론과의 분자내 복합체의 일부인 gp41 은 강하게 면역반응성이다. 도 9 에서 알 수 있는 바와 같이, 동일한 환자 혈청을 사용한 동일한 검정 조건 하에서, 상기 물질은 탁월한 경쟁 곡선을 제공하며, 이는 원래형 가용성 gp41 의 존재성으로만 설명될 수 있고, 또한 시험된 세정제의 존재 하에서도 안정하다.
본 발명에 따르면, 가용성 rsgp-샤페론 복합체가 생리학적 완충액 조건, 예를 들어, 20 mM 포스페이트 150 mM 염화나트륨 완충액 중 pH 7.4 에서 원래형으로 폴딩된다는 것은 매우 중요한 특징이다. 이는 치료면에서 뿐만 아니라 진단 응용에서도 굉장한 장점이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은, 레트로바이러스 표면 당단백질 및 샤페론의 펩티딜 프롤릴 이성화효소 클래스로부터 선택되는 샤페론을 함유하는 분자내- 또는 분자간- 복합체를 포함하는, 생리학적 완충액 조건 하에서 가용성인 시약의 조성물에 관한 것이다.
따라서, HIV-1 유래의 원래형으로 폴딩된 gp41 및 샤페론의 펩티딜 프롤릴 이성화효소 클래스로부터 선택되는 샤페론을 함유하는 가용성 복합체는 본 발명의 매우 바람직한 구현예를 나타낸다.
따라서, HIV-2 유래의 원래형으로 폴딩된 gp36 및 샤페론의 펩티딜 프롤릴 이성화효소 클래스로부터 선택되는 샤페론을 포함하는 가용성 복합체는 본 발명의 매우 바람직한 구현예를 나타낸다.
치료 측면에서, "가용성인 원래형으로 폴딩된" gp41 또는 gp36 를 각각 제공하는 과정은 매우 당연하다. 최초로, 예를 들어, gp41 가 현재 생리학적 완충액 조건 하에서의 주사용으로 이용가능하다.
바람직한 구현예에서, 기재된 바와 같은 가용성 복합체는 의약으로서 사용하기 위한 시약의 조성물 제조에 사용된다. 시약의 조성물은 gp41-샤페론 복합체와 함께 생리학적으로 허용되는 부형제 및 적당한 곳에 적합한 첨가제 및/또는 통상적인 보조 물질을 함유한다.
gp41 7 배수 반복체 또는 gp41 C-말단 나선으로부터 유도되는 펩티드가 항바이러스 활성을 갖는다는 것이 공지되었다 (Wild, C., 등, Proc Natl Acad Sci USA 89 (1992) 10537-41). 이들은 gp41 의 소위 "헤어핀 중간체" 와 특이적으로 상호작용하여 바이러스 침입 (virus entry) 을 막는다 (리뷰로서는, Doms, R. W. and Moore, J. P., J Cell Biol 151 (2000) F9-14 를 참조). 본 발명에 따른 rsgp-샤페론 복합체가 항바이러스 활성을 갖는 것을 발견했다. gp41-샤페론 복합체 또는 gp36-샤페론 복합체 또는 이들 모두를 가장 바람직한 치료 응용에서 치료 유효 투여량 중에 함유하는 시약의 조성물은 숙주 유기체 내에서 HIV 침입 및 HIV 만연 방지에 사용된다 ("바이러스 침입 저해").
이는 포유류에서 면역 응답성을 도출하기 위한 gp41-샤페론 복합체를 함유하는 시약의 조성물의 추가적인 바람직한 치료 응용을 나타낸다. 기재된 복합체는 기타 공지된 HIV 면역원보다 더 많은 gp41 에피토프를 이용가능하도록 한다 (참고, Root 등, 상기 문헌). 따라서, 신규한 면역원은 더욱 광범위한 면역 응답성을 유도할 것으로 예측된다.
진단 과정에 있어서, 본 발명에 따른 가용성 rsgp-샤페론 복합체의 자명한 장점은, 예를 들어, 레트로바이러스 표면 당단백질, 예컨대 gp41 의 생리학적 완충액 조건 하에서의 증가된 안정성 및/또는 진단 감응성에서의 증가 및/또는, 존재하는 형태적 에피토프 수 및/또는 정확하게 폴딩된, gp41 와 같은 rsgp 의 용이하게 표지될 가능성의 증가이다.
*널리 공지된 표지는, 고체 상 결합기와 같은, 마커 기 또는 작동기이다. 표지된 가용성 rsgp-샤페론 복합체는 본 발명에 따른 추가적인 바람직한 구현예를 나타낸다.
표지 기는 임의의 공지된 검출이능한 마커 기, 예컨대 염료, 발광 표지기, 예컨대 화학발광기, 예를 들어, 아크리디늄 에스테르 또는 디옥세탄, 또는 형광 염료, 예를 들어 예를 들어, 플루오르세인 (fluorescein), 쿠마린 (coumarin), 로다민, 옥사진, 레소르핀, 시아닌 및 이들의 유도체로부터 선택된다. 표지 기의 기타 예는 발광 금속 복합체, 예컨대 루테늄 또는 유로퓸 복합체, 효소, 예를 들어, ELISA 또는 CEDIA (Cloned Enzyme Donor Immunoassay, 예를 들어, EP-A-0 061 888) 용으로 사용되는 효소, 및 방사성 동위원소이다.
작동기 (effector group) 에는, 예를 들어, 바이오아핀 (bioaffine) 결합쌍의 한 파트너가 포함된다. 검정을 수행하면서, 작동기는 바이오아핀 결합쌍의 다른 파트너와 특이적으로, 바람직하게는 비-공유결합적으로 상호작용한다. 적합한 결합쌍의 예는 합텐 (hapten) 또는 항원/항체, 바이오틴 또는 바이오틴 유사체, 예컨대 아미노바이오틴, 이미노바이오틴 또는 데스티오바이오틴/아비딘 또는 스트렙타비딘, 당/렉틴, 핵산 또는 핵산 유사체/상보적 핵산, 및 수용체/리간드, 예를 들어, 스테로이드성 호르몬 수용체/스테로이드성 호르몬이다. 바람직한 결합쌍 구성원에는 합텐, 항원 및 호르몬이 포함된다. 특히 바람직한 것은 디곡신 및 바이오틴 및 이들의 유사체와 같은 합텐이다.
rsgp 및 PPI 샤페론을 포함하는 가용성 복합체는 바람직하게는 rsgp 에 대한 항체의 검출을 위한 면역검정에 사용된다. 바람직하게는 gp41- 및/또는 gp36-샤페론 복합체가 사용된다. 매우 바람직한 구현예에서, gp41 및 PPI 샤페론을 포함하는 표지된 가용성 복합체가 gp41 에 대한 항체의 검출을 위한 면역검정에 사용된다. 가장 바람직하게는, 표지된 복합체는 PPI 샤페론 및 gp41 을 포함하는 재조합 폴리펩티드 내의 분자간 복합체이다.
면역검정은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 상기 검정을 수행하는 방법 뿐 아니라 실제적인 응용 및 과정이 관련 교과서에 요약되어 있다.
관련 교과서의 예는, [Tijssen, P., Preparation of enzym-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates in "Practice and theory of enzyme immunoassays" (1990) 221-278, Eds.R. H. Burdon and v. P. H. Knippenberg, Elsevier, Amsterdam)] 및 면역학적 검출법을 다룬 [Tijssen, in "Methods in Enzymology" (1980), Eds. S. P. Colowick, N. 0. Caplan and S. P., Academic Press)] 에서의 여러 권, 특히 제 70, 73, 74, 84, 92 및 121 권이다.
신규한 가용성 rsgp-PPI 샤페론 복합체는, 검출 (예를 들어, 방사성 동위원소 검정, 효소 면역검정, 전기화학적발광 검정 등) 또는 검정 원칙 (예를 들어, 테스트 스트립 검정, 샌드위치 검정, 또는 균등 검정 (homogenous assay) 등) 의 방식에서 독립적으로 항-HIV 항체의 검출을 위한 검정법을 개선하는데 이용될 수 있다.
HIV 감염의 신뢰성있는 민감한 조기 검출을 위해, 체액 샘플 내의 바이러스 항원 뿐만 아니라 항바이러스성 항체를 모두 측정하는 것이 필수적이다. 본 발명에 따른 가용성 복합체는 생리학적 완충액 조건에서의 항-gp41 및/또는 항-gp36 항체의 검출을 가능케한다. 항-gp41 및/또는 항-gp36 항체의 검출은 상기 HIV 검출 시스템에서 가치있는 부분이다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명은 gp41 및/또는 gp36 샤페론 복합체의 사용을 근거로 하는 항-gp41 및/또는 항-gp36 항체의 검출을 포함하는 HIV 검출 시스템에 관한 것이다. 가장 바람직하게는, 상기 복합체를 근거로 하는 항-gp41 및/또는 항-gp36 항체의 검출은 HIV 항원, 바람직하게는 p24 항원의 검출와 함께 수행된다.
당 분야에 공지된 바와 같이, 박테리아, 진균류 또는 바이러스와 같은 감염원에 대한 항체는 바람직하게는 이중 항원 가교 개념 (종종 상기 검정 개념은 이중 항원 가교 개념으로 일컬어지는데, 이는 2 개의 항원이 항체에 의해 가교되기 때문이다) 에 따라 수행되는 검정법에 의해 검출된다. 상기 검정법에서, 그의 2 가지 (IgG, IgA, IgE) 또는 10 가지 (IgM) 파라토프를 가진 주어진 항원의 2 개 이상의 상이한 분자에 결합하는 항체의 성능이 필요하며 이용된다.
가교 개념에 따른 체액으로부터의 항체의 검출은 다수의 상이한 검정법 셋업에서 수행될 수 있다. 간단한 셋업에는 고체 상에 대한 항원의 직접 코팅 및 표지된 형태의 동일한 항원의 사용이 포함된다. 적당한 검정 조건 하에서, 샘플 중의 항체는 고체 상 결합 항원 및 표지된 항원 사이에 가교를 형성한다. 따라서, 찾는 항체가 샘플 중에 존재하는 경우에만 가교가 형성되어, 시그널이 검출될 수 있다.
"고체 상 항원" 및 "검출 항원" 의 기본적인 구조는 바람직하게 동일하다. 예를 들어, 하나 이상의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드는 고체 상에 직접 또는 간접적으로 코팅되어 사용될 수 있으며, 그러나, 표지 또는 마커에 결합된 동일한 합성 폴리펩티드는 검출 항원으로서 사용된다. 또한, 이중 항원 가교 검정에서 면역학적으로 교차반응성인, 유사하나 상이한 항원을 사용하는 것도 가능하다. 상기 검정 수행에 필수적인 필요조건은 관련 에피토프 또는 관련 에피토프들이 두 항원에 모두 존재해야 한다는 것이다. 당연히, 이중 항원 가교 검정 포맷의 다수의 변이체가 있다. 상기 변이체는, 예를 들어, 고체 상에 대한 항원의 간접 코팅을 포함한다. 바람직하게는, 특이적인 결합쌍, 가장 바람직하게는 바이오틴-스트렙타비딘 (또는 -아비딘) 계가 항원을 고체 상에 간접적으로 결합시키는데 사용된다. 한편, 상기 계에서의 검출에 이용되는 항원은 직접 마커 (예를 들어, 방사성 동위원소, 효소, 형광 분자 등) 을 직접 갖고 있지 않아도 되나, 예를 들어, 합텐 (예를 들어, 디곡신) 을 보유함으로써 간접적으로 검출될 수 있다. 이에 따라, 상기 간접 검출은, 예를 들어 표지된 항-디곡신 항체에 의해 수행될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 이중 항원 가교 개념에 따른, 하기를 포함하는 면역검정에 관한 것이다: 제 1 샤페론-항원 복합체를 포함하는 제 1 항원, 및 제 2 샤페론-항원 복합체를 포함하는 제 2 항원.
추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 제 1 샤페론항원 복합체가 포획 항원으로 사용되며, 제 2 샤페론-항원 복합체가 검출 항원으로서 사용되는 것을 특징으로 하는, 이중 항원 가교 개념에 따른 면역 검정에 관한 것이다.
본 발명에 기재된 바와 같은 샤페론-항원 복합체들은 취급하기 어려운 각종 폴리펩티드의 용해능을 야기할 뿐만 아니라, 이중 항원 가교 개념에 따른 매우 유리한 면역 검정을 허용한다.
이중 항원 가교 개념에 따른 상기 면역 검정의 특별히 매력적인 특징은, 고 체 상 결합 항원이 있는 복합체 형성 및 검출 항원이 있는 복합체 형성 각각에 대해 상이한 샤페론을 이용하는 것이 가능하다는 점이다. 검정법의 상기 변형은 비특이적인 결합의 문제점을 추가로 개선한다. 샘플 중의 항체는, 샤페론에 대해 반응성이므로 틀린 양성 시그널을 야기할 수 있는데, 상이한 샤페론이 고체 상 항원 및 검출 항원 각각의 복합체에 사용되는 경우 가교를 형성하지 않는다. 따라서, 발명의 상기 양태에서, 비특이적인 결합에 의한 유사 양성 시그널이 대폭 감소한다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명은 제 1 및 제 2 샤페론-항원 복합체의 제 1 샤페론 및 제 2 샤페론이 상이한 것을 특징으로 하는 이중 항원 가교 개념에 따른 면역검정에 관한 것이다.
가장 특징화된 대부분의 샤페론은 Escherichia coli 로부터 분리되었으며, 이는 생명공학 연구에서 널리 이용된다. Escherichia coli 는 광범위하게 분포하는 박테리아 종이므로, 다수의 포유류는 상기 박테리아로부터 유도된 단백질에 대한 항체를 개발해 왔다. 상기 항체에 의한 틀린 양성 반응을 줄이기 위해, 상이한 박테리아 종, 바람직하게는 호열성의 것으로부터 유도되는 하나 이상의 PPI 샤페론을 이용하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 샤페론은 극호열성 (extremophilic) 박테리아, 특히 Thermatoga maritima , Aquifex aeolicu s 및 Thermus thermophilus 을 포함하는 박테리아의 군으로부터 유도된다.
일반적으로 면역검정에서, 바람직하게는 가교 개념에 따른 면역 검정에서의 샤페론-항원 복합체의 사용은 또한 상기 복합체의 샤페론을 유도할 가능성을 제공하며, 항원 자체의 변형을 필요로 하지 않는다. 제 2 의 화학적 부분에 의한 폴리펩티드의 변형, 예를 들어 해당 분자에 대한 표지의 커플링에는 폴리펩티드에 부정적으로 영향을 줄 위험이 포함된다는 것이 일반적으로 수용된다. 예를 들어, 상기 표지로 인해 연구 중인 에피토프는 손상될 수 있거나 또는 비특이적인 결합이 초래될 수도 있다. 본 발명에 따르면, 샤페론-항원 복합체 내에서 특이적으로 샤페론을 유도하는 것이 현재 가능하다 .
바람직한 구현예에서, 이중 항원 가교 개념에 따른 면역검정법은 추가적으로 포획 항원으로서 사용되는 제 1 샤페론-항원 복합체가 고체 상 결합기를 포함하는 것을 특징으로 한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 검출 항원으로서 사용되는 제 2 샤페론-항원 복합체가 마커 기를 포함하는 것을 추가적인 특징으로 하는 가교 개념에 따른 면역검정이 수행된다.
또다른 구현예에서, rsgp 및 PPI 샤페론, 예컨대 gp41- 및/또는 gp36- 샤페론 복합체를 포함하는 가용성 복합체는 또한 대상체, 예컨대 인간 또는 비인간 동물에서의 면역 응답성 유도에 사용될 수 있다. 가용성 복합체들은, 부형제 또는 담체를 함유할 수 있는 것과 같은 조성물로 대상체에게 투여될 수 있다. 상기 조성물들은 또한 면역보강제 (adjuvant) 를 포함할 수 있다. 통상적인 면역보강제의 예에는, 이에 한정되지 않으나, 프로인트 (Freund's) 불완전 면역보강제, 프로인트 (Freund's) 완전 면역보강제, Merck 65, AS-2, 명반, 알루미늄 포스페이트, 미네랄 겔, 예컨대 수산화알루미늄, 및 표면 활성 물질, 예컨대 리소레시틴, 플루론계 폴리올, 다가음이온, 펩티드, 오일 에멀션, 키홀 림페트 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin), 및 디니트로페놀 (dinitrophenol) 이 포함된다. 기타 유용한 면역보강제에는, 이에 한정되지 않으나, 박테리아의 캡슐 다당류, 덱스트란, IL-12, GM-CSF, CD40 리간드, IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-10, IL-13, IL-18 또는 임의의 싸이토카인 또는 박테리아의 DNA 절편이 포함된다.
가용성 복합체 조성물의 1 회 투여량 (투여) 이 주어질 수 있다. 그러나, 제 1 투여에는, 예컨대 1 회, 2 회, 3 회 또는 그 이상의 추가 투여 (boosting administration) 가 후속될 수 있다. 대상체에 투여되는 투여 횟수는, 부분적으로는 수용성 복합체 조성물에 대한 대상체의 응답성에 좌우된다. 본 발명의 범위 내에서, 적절한 투여 횟수는 동물을 가용성 복합체로 면역화하는데 필요한 임의의 횟수를 포함한다.
가용성 복합체 조성물의 제 2 투여 (추가 접종) 는, 제 1 투여 후 약 7 일 내지 1 년 사이에 제공될 수 있다. 제 1 및 제 2 투여 사이의 기간은 14 일 내지 6 개월, 21 일 내지 3 개월, 종종 원래 투여 후 약 28 일 내지 2 개월일 수 있다. 제 3 투여 (제 2 추가 접종) 는 제 1 투여 후 약 14 일 내지 10 년 사이, 예를 들어 약 14 일 내지 3 년, 종종 제 1 투여 후 약 21 일 내지 1 년, 더욱 종종 약 28 일 내지 6 개월 사이에 제공될 수 있다. 후속적인 추가 접종은 2 주 간격, 또는 1 개월, 3 개월 또는 6 개월 내지 10 년 간격으로 투여될 수 있다.
전형적으로, 항원에 대해 동물을 면역화하기에 충분한 가용성 복합체의 양이 대상체에 투여된다 (즉, "면역학적 유효 투여량" 또는 "치료 유효 투여량"). "면역학적 유효 투여량" 을 달성하기에 적절한 양은 부분적으로는 대상체의 체중 및 일반적인 건강 상태, 및 처방 의사 또는 기타 적임자의 판단에 좌우된다.
가용성 복합체의 유효 투여량은 면역 응답성 유도를 달성하기 위해 동물 모델에서 제형화될 수 있다; 상기 데이터는 동물 데이터를 근거로 인간으로의 투여를 즉시 최적화하는데 이용될 수 있다. 투여량은 전형적으로는 약 1 fg 내지 100 ㎍, 종종 약 1 pg 내지 약 100 ㎍, 더욱 빈번하게는 약 1 ng 내지 약 50 ㎍, 일반적으로 약 100 ng 내지 약 50 ㎍ 이다. 일부 구현예에서, 투여량은 대상체의 체중 kg 당 약 1 fg 내지 약 100 ㎍, 종종 약 1 pg 내지 약 100 ㎍, 더욱 빈번하게는 약 1 ng 내지 약 50 ㎍, 일반적으로는 대상체의 체중 kg 당 약 100 ng 내지 약 50 ㎍ 이다.
본 발명의 가용성 복합체-함유 조성물은 각종 방법으로 및 각종 형태로 투여될 수 있다. 가용성 복합체 조성물은 담체 및 부형제, 예컨대 완충액, 탄수화물, 만니톨, 단백질, 폴리펩티드 또는 아미노산, 예컨대 글리신, 산화방지제, 박테리아제거제, 킬레이트제, 현탁제, 증점제 및/또는 보존제; 물, 오일, 식염수 용액, 수성 덱스트로오스 및 글리세롤 용액, 생리학적 조건으로 맞추는데 필요한 기타 약제학적으로 허용되는 보조 물질, 예컨대 완충제, 강직성 조정제 (tonicity adjusting agent), 습윤제 등을 함유할 수 있다. 통상적인 보조제가 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
임의의 적합한 담체가 본 발명의 조성물에 이용될 수 있으며, 담체의 유형은 투여 양태에 좌우된다. 화합물들은 또한 리포솜 내에 캡슐화될 수 있다. 일부의 경우 생분해가능한 마이크로스피어가 담체로서 편리하다; 예를 들어, 문헌 (Tice 등, US 특허 5,942,252, 1999) 에 기재된 것.
조성물을 멸균하는 것이 바람직하며, 이는 통상적인 기술, 예컨대 멸균 필터로써 수행된다. 수득되는 수용액은 그대로 사용하기 위해 포장되거나 또는 동결건조될 수 있다.
본 발명의 가용성 복합체 조성물은 주사 (예를 들어, 피내, 경피내, 근육내, 안구 내 등), 흡입, 국부 투여, 좌제, 경피 팻치의 사용 또는 구강에 의한 것을 포함하는 각종 수단으로 투여될 수 있다.
주사로 투여되는 경우, 조성물은 수용액, 바람직하게는 생리학적으로 상용성인 완충액, 예컨대 행크스 용액 (Hanks' solution), 링거 용액 (Ringer's solution), 20 mM 포스페이트 150 mM 염화나트륨 완충액 (pH 7.4), 또는 생리적 식염수 완충액으로 제형화될 수 있다. 용액은 제형화제, 예컨대 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로는, 본 발명의 조성물은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어, 멸균된 피로겐-프리 물 (pyrogen-free water) 과 함께 이루어지는 분말 형태일 수 있다. 흡입 전달 조성물은 적합한 추진체, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 이산화탄소 또는 기타 적합한 기체를 사용하는 가압 포장 또는 분무기로부터의 에어로졸 스프레이로서 존재할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투여량 단위는 계량된 양을 전달하기 위해 밸브를 공급함으로써 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취분기에서 사용하기 위한, 예를 들어 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 단백질 및 적합한 분말 베이스, 예컨대 락토오스 또는 전분의 분말 믹스를 함유하도록 제형화될 수 있다. 국부 투 여를 위해서는, 조성물은 당 분야에 공지된 바와 같이 용액, 겔, 연고, 크림, 현탁액 등으로서 제형화될 수 있다. 일부의 구현예에서, 투여는 경피용 팻치를 수단으로 한다. 좌제용 조성물도 또한 통상적인 좌제용 베이스를 함유하도록 제형화될 수 있다.
경구 투여되는 경우, 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 가진 조성물을 배합함으로써 즉시 제형화될 수 있다. 고체 담체에는, 만니톨, 락토오스, 스테아르산망간 등이 포함되며; 상기 담체는 경구 섭취를 위한 정제, 필, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등의 제형을 이용가능하게 한다. 상기 제형물은 분말, 캡슐 및 정제일 수 있으며; 적합한 부형제에는 당, 셀룰로오스 제제, 과립화제 및 결합제와 같은 충전제가 포함된다.
절편 (예를 들어, F(ab)2) 및 단독 사슬 버젼을 포함하는 폴리클로날 및 모노클로날 항체의 제조 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 그러나, 다수의 항원은 적합한 항체 응답성을 유인할 수 없다. 한 구현예에서, 본 발명의 가용성 복합체 및 항원을 함유하는 조성물을 동물에게 투여하여, 동물에서 면역 응답성을 유발한다. 후속적으로, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체가 표준 기술로 제조된다.
rsgp 및 PPI 샤페론, 예컨대 gp41- 및/또는 gp 36 샤페론 복합체를 함유하는 가용성 복합체는, 예컨대 막 융합을 저해함으로써 세포로의 바이러스 침입을 저해하는데 사용될 수 있다. 세포는 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외의 것일 수 있다. 조성물 및 투여 방법은, 면역 응답성을 유발하기 위해 사용되는 조성물 및 투여 방법에 대해 기재된 것과 유사하다. 세포로의 바이러스 침입 저해가 백신화에 의해 달성되는 경우, 보조제가 사용될 수 있다. 시험관 내 또는 생체 외 투여를 위해서는, 당업자라면 부분적으로는 세포(들), 배양 조건 및 시간 제한 (있는 경우) 을 근거로 적합한 방법을 선택할 것이다. 예를 들어, 상기 한 가지 유용한 방법은 가용성 복합체를 운반하는 리포솜을 제형화하는 것이다.
하기의 실시예, 참고 문헌, 및 도면은 본 발명의 이해 보조를 위해 제공되며, 첨부된 청구의 범위에서 진정한 범위가 정해진다. 본 발명의 진의를 벗어나지 않으면서 변형이 가해질 수 있다는 것이 이해될 것이다.
[실시예]
실시예 1 gp41 및 PPI 샤페론을 포함하는 가용성 분자간 복합체의 제조
1.1 E. coli FkpA 의 제조
약간의 미미한 변형을 가한, 문헌 [Bothmann, H. 및 Pluckthun, A., J Biol Chem 275 (2000) 17100-5] 에 따라 FkpA 를 클로닝하고, 발현시키고 정제했다. 보관을 위해, 단백질 용액을 20 mM NaH2PO4/NaOH (pH 6.0), 100 mM NaCl 에 대해 투석하고 26 mg/ml (1 mM) 로 농축했다.
세포질 발현을 위해, 상기 발현 벡터의 FkpA-코딩 서열을, 시그널 펩티드를 코딩하는 서열 부분이 없고, 대신 성숙한 FkpA 의 코딩 영역만을 포함하도록 변형했다.
1.2 gp41 (535-681)- His 6 의 제조
T7 프로모터 기재 발현계에서 gp41 (535-681)-His6 를 클로닝하고 발현시켜, 숙주 세포 내의 봉입체에서 축적시켰다. 분리된 봉입체를 6 M 구아니딘 클로라이드로 가용화시켰다. His-표식 단백질을 Ni-킬레이트 칼럼 상에서 정제한 후, 세파크릴 (Sephacryl) 100 상에서의 6 M 구아니딘 중에서 겔여과했다. 문헌 [Wingfield, P. T., 등, Protein Sci 6 (1997) 1653-60] 에 기재된 바와 같이 신속 희석에 의해 단백질을 리폴딩시켰다. 최종 완충액 조건은 30 mM 포름산나트륨, pH 3 였다. 폴딩의 상태는 근거리 및 원거리 UV CD 를 이용해 두 완충액 조건에 대해 평가했다. 도 1a 및 1b 에 나타낸 바와 같이, 원거리 및 근거리 UV CD 스펙트럼은 모두, gp41 가 캐오트로픽제의 부재 하에서 pH 3.0 에서만 원래형 폴딩을 취한다는 것을 시사한다.
1.3 E. coli FkpA 존재 하의 pH 3.0 내지 생리학적 pH 에서의 gp41 엑토도메인 (HIV)의 pH-변동 (shift)
1.3.1 대조군 실험
대조군 실험에서, 가용성 e-gp41 (30 mM 포르미에이트 중, pH 3.0) 는, 최종 완충액 조건인 20 mM 나트륨 포스페이트 (pH 7.5), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA 로 100 배 희석했다. 최종 단백질 농도는 약 1 μM 였다. UV 스펙트럼은 1 분 및 10 분 후에 기록되었다. 도 2 에서의 UV 스펙트럼으로부터 알 수 있듯, 샤페론이 없는 엑토도메인은 중성으로의 pH 변동에서 연속적으로 응집되었다. 도 2 는 gp41 의 예외적인 응집 경향을 강조된다는 것을 의미한다; 상부 선으로 단계에 서 멀리까지 분자의 연속적인 응집이 진행된다.
1.3.2 pH 3. 0 에서의 gp41 과 FkpA 의 예비인큐베이션은 중성 pH 로의 변동을 가능하게 한다.
분자 샤페론 FkpA 의 가용화 잠재성에 대해 시험하기 위해, 엑토도메인 gp41 및 FkpA 를 몰비 1:2 내지 1:4 로 (약 3.5 의 pH 에서 30 mM 포르미에이트 중) 혼합하고 1 분 동안 함께 인큐베이션했다. 이어서, 수득한 복합체를, 20 mM 나트륨 포스페이트 pH (7.4), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA 의 완충 조건으로 12 배 희석하여 중성 pH 로 변동시켰다. 시험관에서의 결합 파트너의 최종 농도는 각각 1 μM gp41, 2 μM 및 4 μM FkpA 였다. 모든 반응을 실온에서 수행했다. 1 분 및 10 분 후, 응집에 대한 gp41 샘플의 시험을 위해 UV 스펙트럼을 기록했다. 도 3a 및 3b 로부터, FkpA 가 실질적으로 투여량 의존 성향으로 gp41 의 응집을 실질적으로 감소시킨다는 것이 명백하다. 비교가능한 데이터를 Thermatoga maritima 유래의 트리거 인자 및 E. coli 유래의 C-말단 절단된 SlyD 와 함께 수득했다.
실시예 2 공유결합으로 결합된 gp41 - FkpA 의 재조합적 제조
2.1 FkpA 및 gp41 를 포함하는 발현 플라스미드의 구축
제 1 단계에서, Stratagene (La Jolla, CA; USA) 의 QuikChange site-directed mutagenesis kit 및 하기의 프라이머를 이용하여 실시예 1.1 의 플라스미드 유래의 성숙한 E. coli FkpA 의 코딩 영역에서의 제한효소 부위 BamHI 를 결실시켰다.
5'-gcgggtgttccgggtatcccaccgaattc-3' (서열 번호 3)
5'-gaattcggtgggatacccggaacacccgc-3' (서열 번호 4)
구축물은 EcFkpA(ΔBamHI)[GGGS]3 로 명명했다.
제 2 단계에서, HIV-1 외피성 단백질 유래의 아미노산 535 - 681 을 코딩하는 유전자 절편을 하기 프라이머를 사용하여 실시예 1.2 의 구축물로부터 PCR 로써 증폭했다.
5'-cgggatccggtggcggttcaggcggtggctctggtggcggtacgctg-acggtacaggccag-3' (서열 번호 5)
5'-ccgctcgaggtaccacagccaatttgttat-3' (서열 번호 6)
절편을 BamHI 및 XhoI 제한 효소 부위를 이용하여 EcFkpA(ΔBamHI)[GGGS]3 로 삽입했다.
FkpA 및 e-gp41 사이의 글리신-세린 링커에 대한 코돈에 FkpA 의 클로닝을 위한 리버스 프라이머 및 e-gp41 의 클로닝을 위한 상류 프라이머를 삽입했다.
수득한 구축물을 서열분석하고, 원하는 단백질을 코딩하는 것으로 나타났다.
2.2 융합 단백질의 정제
발현 벡터를 지닌 E. coli BL21 세포를 OD600 가 0.7 이 될 때까지 배양하고, 세포질 과발현을 1 mM 의 IPTG 를 배양 온도 37℃ 에서 첨가하여 유도했다. 유도 4 시간 후, 세포를 원심분리 (5000 g 에서 20 분) 로써 수합했다. 박테리아 펠렛을 50 mM 나트륨 포스페이트 pH 7.8, 6.0 M GuHCl (구아니딘 클로라이드), 5 mM 이미다졸 중에 재현탁하고, 완전 용해를 위해 실온에서 교반 (10 분) 했다. 반복 원심분리 (Sorvall SS34, 20000 rpm, 4℃) 후, 상청액을 여과하고 (0.8/0.2 ㎛), 용해 완충액 (lysis buffer) 에서 미리 평형화 한 Ni-NTA-칼럼 (NTA: 니트릴로트리아세테이트; Qiagen; Germantown, MD) 에 적용했다. 비특이적으로 결합된 단백질을 10 칼럼 부피의 용해 완충액을 적용함으로써 세척 단계에서 제거했다. 최종적으로, 결합된 표적 단백질을 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 2.5, 6.0 M GuHCl 로 용출하고, 4 ml 분획으로 수집했다. 흡광도는 280 nm 에서 기록했다.
수득한 산성 캐오트로픽 용액을 추가의 정제 단계 또는 시험관 내 리폴딩 실험을 위해 4℃ 에서 보관할 수 있다.
상기 폴딩되지 않은 물질로 출발하는 경우, 상이한 리폴딩 방법, 예컨대 투석, 신속 희석, 복원 크기 배제 크로마토그래피 또는 매트릭스 보조 리폴딩이 이용될 수 있으며, 연속하여 수행해 이들 모두를 실제로 동일한 원래형으로 폴딩된 가용성 단백질로 유도한다.
2.3 투석 및 신속 희석에 의한 복원
상기 기재된 바와 같이 가용화된 물질을 투석에 의해 생리학적 완충액 조건으로 이동시켰다. 투석 튜브의 선택된 컷-오프 값은 4000 - 6000 달톤이었다.
엑토도메인 (공유결합으로 결합된 gp41 및 FkpA 단백질 도메인의 gp41 부분) 의 리폴딩을 유도하기 위해, GuHCl 을 50 mM 나트륨 포스페이트, pH 2.5, 50 mM NaCl (염화나트륨) 에 대한 투석에 의해 용출된 단백질로부터 제거했다. 분리된 엑토도메인은 모두 나선형이며, 상기 극한 pH 에서 3 차 접촉을 형성한다는 것 이 널리 공지되었다. 근거리 UV CD 에 의해 재조합적으로 제조된 FkpA 를 분석하는 경우, 동일한 조건 하에서는 FkpA 가 본질적으로 비구조화되어 있음이 발견되었다. 놀랍게도, 투석에 의한 gp41-FkpA 의 리폴딩이 공유결합으로 결합된 gp41 및 FkpA 단백질 도메인을 포함하는, 즉시 용해되는 단백질 복합체를 제공한다. UV 스펙트럼 (도 4) 은 표유 광선, 즉 300 nm 초과에서의 뚜렷한 흡광이 없다. 표유 광선은 응집물을 지시하는 것이므로, 도 4 에 나타낸 스펙트럼은 리폴딩된 물질이 현저한 양의 응집물을 함유하지 않음을 의미한다.
원편광 이색성 분광법 (CD) 은 단백질에서 2 차 및 3 차 구조를 모두 평가하기 위한 방법이다. 방향족 영역 (260-320 nm) 에서의 타원율은 단백질 내에서의 3 차 접촉 (즉, 규칙적으로 폴딩된 단백질의 구형 구조) 를 보고하며, 아미드 영역에서의 타원율은 단백질 골격에서의 규칙적인 반복 구성원, 즉 2 차 구조를 반영한다.
도 5 에 나타낸 근거리 UV CD 스펙트럼은 엑토도메인 (융합 단백질의 측면에서) 이 pH 2.5 에서 원래형 3 차 접촉을 나타낸다는 명확한 증거를 제공한다. 공유결합으로 결합된 gp41/FkpA 단백질 도메인의 스펙트럼은 동일한 조건 하에서 분리된 엑토도메인의 스펙트럼과 거의 일치한다 (데이터는 나타내지 않음). gp41 의 전형적인 모습이 발견되었다: 290 nm 에서의 최대 타원율, 285 nm 에서의 특징적인 등성이 (shoulder), 및 260 nm 에서의 또다른 최대값은 광학적으로 활성인 디설파이드 가교를 반영한다. FkpA 가 해당 조건 하에 근거리 UV 시그널을 부여하지 않는다는 것이 중요하게 인식된다. 실제로, pH 2.5 에서의 FkpA 의 방향족 타원율은 기준선과 거의 동일하다 (데이터는 나타내지 않음).
근거리 UV 영역으로부터의 결과와 일치하게, pH 2.5 에서의 융합 구축물의 원거리 UV CD 는 대부분이 구조화된 p41 분자를 지적한다. 220 nm 및 208 nm 에서의 두 최대값은 모두 나선형인 엑토도메인의 전형적인 모습을 형성하며 대응된다 (도 6). 표시된 조건 (50 mM 나트륨 포스페이트, pH 2.5, 50 mM NaCl) 으로부터, 신속 희석에 의해 FkpA-gp41 융합 폴리펩티드가 생리학적 완충액 조건으로 용이하게 전이될 수 있다. 결론적으로, 밑줄친 근거리 및 원거리 UV CD 는 모두 원래형 구조 gp41 이 (FkpA 도 포함하는 융합 단백질의 측면에서) 매우 편리한 양식으로 이용가능하다. 흥미롭게도, SlyD (1-165)-gp41 유형의 원래형 융합 폴리펩티드가 실온에서 50 mM 나트륨 포스페이트 pH 7.4, 150 mM NaCl 에 대한 캐오트로픽 물질 (예를 들어 7.0 M GuHCl 에 용해) 의 투석으로 훨씬 간단히 수득될 수 있음을 발견했다. 예외적으로 본 발명에 따라 잘 수행된 두 샤페론-gp41 융합 구축물의 뉴클레오티드 서열 분석은 서열 번호 7 및 서열 번호 8 로 각각 표시했다.
2.4 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 에 의한 복원
폴딩되지 않은 gp41-FkpA 폴리펩티드 (50 mM 나트륨 포스페이트, pH 7.8, 7.0 M GuHCl 에 용해) 를 20 mM 나트륨 포스페이트, pH 7.4, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA 로 평형화시킨 Superdex 200 겔 여과 칼럼 상에 적용했다. FkpA-gp41 는 본질적으로 3 개의 주요 분획으로 용출한다: 고분자량 회합물, 명확한 6 량체 종 및 명확한 3 량체 종. 명확한 3 량체 분획을 농축하고, 그의 3 차 구조를 근거 리 UV CD 측정에서 평가했다 (도 7).
수득한 그래프는 담체 단백질 FkpA 및 표적 단백질 gp41 이 모두 1:1 비율로 부여된 사실상 중복 곡선이다. 가장 다행스럽게도, gp41 는 중성 pH 에서 3 차 구조를 나타내며, 공유결합으로 결합된 샤페론에 의해 분명히 가용화된다. 즉, 샤페론 FkpA 은 기질로서 원래형으로 구조화된 엑토도메인 gp41 을 수용하고, 중성 작업 pH 에서 상기의 폴딩하기 어려운 단백질을 가용화하는 것으로 보인다. 따라서, 진단 목적을 위한 가용성 gp41 항원의 대량 생산을 위한 필수 조건이 만족된다.
pH 7.4 에서의 FkpA-gp41 의 원거리 UV CD (도 8) 는 근거리 UV CD 가 결과적으로 FkpA 및 gp41 각각의 시그널 부여의 누적성을 나타내는 것을 확인한다. 예상된 바와 같이, 스펙트럼은 대부분이 나선형인 gp41 엑토도메인 (220 nm 및 208 nm 에서 각각 최대 타원율) 에 의해 조절된다.
상기 언급된 조건 하에 pH 7.4 에서 가용화되는 공유결합으로 결합된 gp41/FkpA 단백질 도메인으로 수득되는 데이터는 FkpA 및 gp41 이 폴리펩티드 구축물 내에서 독립적으로 폴딩하는 단위로서 거동한다는 것을 나타낸다.
실시예 3 면역검정에서 항원으로서 사용되는 재조합 gp41 및 재조합 FkpA -gp41 복합체 상의 상이한 세정제의 영향
3.1 경쟁 유형 면역검정
COBAS CORE HIV Combi test (Roche Diagnostics GmbH, 독일) 은 재조합 gp41 의 면역반응성에 대한 시험에 편리한 수단을 제공한다. 원칙적으로, 상기 검정 법은 또한 HIV 의 gp41 에 대한 항체 검출을 위한 이중 항원 가교 개념에 따라 작동한다. 고체 상 항원은 직접 코팅된다. 그러나, 검출 항원은 SDS-가용화 gp41 물질을 함유하는 페록시다아제-표지 gp41 이다.
HIV 의 검출을 위한 면역검정에서, 사용되는 시약이 비교적 높은 농도의 세정제를 함유하는 인큐베이션 완충액 중에서 즉시 용해하며 안정한 것이 매우 바람직하다. 상기 세정제, 예를 들어, Triton X-100
Figure 112006018489268-pat00001
또는 Nonidet P-40
Figure 112006018489268-pat00002
가 바이러스 입자를 파열시키기 위해 0.1 내지 0.2% 의 농도로 사용된다.
실시예 1 에 기재된 바와 같이 제조되는 SDS-가용화 gp41 및 FkpA-gp41 는 모두 COBAS CORE HIV Combi 검정에서 경쟁 항원으로서 시험된다. 그렇게 하기 위해, 시판되는 인큐베이션 완충액 대신에, 인간 혈청이 없는 완충액 매트릭스 중에 0.1% Triton X 100
Figure 112006018489268-pat00003
를 함유하는 인큐베이션 완충액을 사용한다. 시험될 항원은 gp41 와 반응성인 것으로 공지된 인간 혈청과 함께 인큐베이션한다.
투여량 의존성 양식의 gp41-FkpA 항원은 경쟁형 검정에서 시그널을 강하게 켄치하는 반면, SDS-가용화 gp41 는 본질적으로 비반응성이다 (도 9). 50% 저해는 2.2 nM 의 몰 농도에 해당하는, 농도 0.1 ㎍/ml 의 FkpA-gp41 항원에서 달성된다.
시험에서 온전한 바이러스 막을 붕괴하기 위한 세정제 (헬퍼 세정제) 로서 0.1% Triton X-100 를 함유하는 희석 완충액으로 예비처리한 후, FkpA-gp41 가 그의 탁월한 면역반응성을 보유하는 것이 특기할 만하다. 이는, 헬퍼 세정제의 존재 하에 그의 면역반응성을 거의 완전히 상실하는 gp41 엑토도메인 단독 (SDS 중 gp41) (도 9) 과 특히 대조적이다.
FkpA 가 불충분한 결합 역학관계에 의해 중요한 에피토프를 마스킹하거나 또는 시험 고유의 세정제 Triton X-100 가 gp41 항원의 응집을 유도함으로써 시험 성능을 해치는지의 여부가, 공유결합으로 결합된 gp41-FkpA 구축물의 개발에서 주요 관심사이다. COBAS CORE 플랫폼 상의 다수의 경쟁 시험의 실험적인 결과들은 중요한 gp41 에피토프가 공유결합으로 결합된 단백질 도메인의 측면에서 접근성이 우수하다는 분명한 증거를 제공한다.
더욱이, 분자간 샤페론-gp41 복합체 내에서의 gp41 의 면역반응성은 Triton X-100 과 같은 헬퍼 세정제의 존재 하에 유지된다.
3.2 전기화학발광 검정
이중 항원 가교 포맷에 따른 면역검정은 감염성 소인의 혈청학적 진단에서 큰 장점이 있다. 본 발명에 따른 FkpA-gp41 가 생리학적 완충액 조건에서 가용성이므로, 상기 물질이 검출 원리로서 전기화학발광을 이용하는 이중 항원 가교 검정에서 사용하기에 적합한지를 연구하는 것이 가능하다.
SDS-가용화 gp41 를 루테늄 표지에 커플링하려는 시도는 성공하지 않았다.
그러나, FkpA-gp41 가 생리학적 완충액 조건 하에서 즉시 가용화되므로, 상기 물질의 소수성 Ru-표지에 대한 커플링은 즉시 증명되었다. 기재된 바와 같이 변형된 표적-샤페론 복합체 조차도 용해되어 잔존하는 것이 특기할 만하다. Elecsys
Figure 112006018489268-pat00004
시험 시스템 (Roche Diagnostics GmbH, 독일) 상에서의 검정을 수행하기 위해, FkpA-gp41 를 각각 바이오틴화시키고 루테닐화시켜, 이중 항원 가교 검정에서의 면역반응성에 대해 시험했다.
주로 IgG (면역글로불린 G) 클래스 항체를 포함하는 여러 대표적인 항-HIV 혈청은 공유결합으로 결합된 FkpA-gp41 단백질 도메인으로는 매우 양성인 것으로 시험되었다. 또한, 항원 농도가 500 ng/ml 로 높더라도, 배경 시그널이 내인성인 장치 배경에 접근한다는 것을 발견했다. 시그널 대 노이즈의 비율이 탁월한 것으로 나타났다. 더욱이, 담체 단백질, E. coli 유래의 분자 샤페론 FkpA 이 인간 혈청 중에 포함된 항체의 비특이적인 결합을 초래하지 않는다는 증거가 없었다.
상기 논의된 바와 같이, 혈청전환의 조기진단은 HIV 의 신뢰성있는 진단에 중요하다. 감염 경로 동안, IgM 클래스의 항체가 가장 먼저 나타난다. 따라서, 매우 조기에 HIV 감염을 신뢰성있게 검출하기 위해서는, IgM 인식 및 결합에 대한 높은 에피토프 밀도를 가진 항원 단위체를 고안하는 것이 중요하다. 한편, FkpA-gp41 은 전형적인 항-HIV, IgM-유형 혈청에 의해 잘 인식된다. 더욱 중요한 것은, NABI (Miami, Florida) 에 의해 공급되는 9003 및 4009 혈청전환 패널 유래의 B 및 C 혈청과 같이, 양성인 것을 시험하기 어려운 샘플을 본 발명에 따른 융합 구축물이 사용하여 시험된다는 사실이다. 펩티드 기재 상의 gp41 항원이 상기의 IgM 혈청을 사용해 시험하는 경우 아예 반응성이 아니므로 주요 성과물이다.
실시예 4 가용성 샤페론 - gp41 복합체가 바이러스 침입을 저해한다.
상이한 gp41-샤페론 융합 단백질을 시험관 내 검정에서 HIV-1 매개 막 융합을 저해하는 이들의 능력을 평가했다. 간단히, CD4, CCR5 및 CXCR4 를 발현하는 MAGI P4-CCR5 리포터 세포주를 HIV-1 균주 NL4-3 로 감염시키고, 문헌 [Meister 등, Virology (2001) 284(2), 287] 에 따른 Tat-의존성 β-갈락토시다아제 활성에 대해 평가했다. 한편, nM 범위에서의 IC50 값으로 감염의 실질적인 저해를 관찰했다. 예를 들어, SlyD-gp41 (서열 번호 6 참조) 는 IC50 < 70 nM 로 바이러스 침입을 현저히 저해한다.
결론적으로, 각각의 HIV-1 gp41 또는 HIV-2 gp36 및 펩티딜-프롤릴-이성화효소 샤페론을 각각 포함하는 가용성 분자간 복합체는 개선된 항-HIV 항체 시험의 고안 및 기타 상업적인 응용을 가능케하는 용해도 및 구조 완결성에 대한 뛰어난 특징을 보유한다.
실시예 5 gp36 엑토도메인에 대한 샤페론 FkpA 의 융합은 시험관 내에서 용이하게 리폴딩될 수 있는 세포질 폴리펩티드를 제공한다.
가용성의 면역학적으로 활성인 형태인 HIV-2 상동체 gp41, gp36 를 수득하기 위해, FF36 로 명명된 구축물을 클로닝했다. 상기 융합 폴리펩티드는 2 개의 FkpA 단위 및 gp36 단위를 포함하며, 각각은 글리신이 풍부한 유연한 스트렛치로 결합된다. 정제를 촉진하기 위해, 융합 구축물은 C-말단에 His6 로 표식했다. 단백질을 상기 언급한 프로토콜에 따라 본질적으로 정제했다: 캐오트로픽 용해 후, 단백질을 Ni-NTA-칼럼에 결합시키고, 50 mM 나트륨 포스페이트 pH 7.8, 7.0 M GuHCl 로 과세척한 후, pH 를 낮춰 용출했다. 이어서, 용출된 단백질을 50 mM 나트륨 포스페이트 pH 7.8, 100 mM 염화나트륨, 1 mM EDTA 로 평형화시킨 겔 여과 칼럼 상에 통과시켜 리폴딩시켰다. 상기 "복원 겔 여과법" 으로 수득한 원래형 단백질은 만족할만한 면역학적 및 분광학적 특징을 나타내므로 (도 10 참고), F41 또는 FF41 과 같은 gp41 짝에 상응한다. 본원에 기재된 바와 같은 정제 및 리폴딩 프로토콜은 gp36 (서열에 대해서는 서열 번호 9 를 참조) 의 N-말단 7 배수 반복 영역에 3 점 돌연변이를 가진 FF36 로 수행된다. 동일한 프로토콜이, 가용성 단백질의 수율이 낮기는 하지만, 야생형 gp36 엑토도메인을 포함하는 융합 구축물에 성공적으로 적용될 수 있었다.
실시예 6 가용성의, 면역반응성 FkpA - gp21 는 편리한 재생산가능한 양식으로 수득될 수 있다.
FkpA-gp21-과생산 E. coli 세포 (서열 번호 10 을 포함) 를 상기 기재된 바와 같이 배양, 유도 및 수합했다. 완전 용해를 위해, 세포 펠렛을 50 mM 나트륨 포스페이트 pH 7.8, 7.0 M GuHCl 중에서 실온에서 1 시간 동안 교반했다. 캐오트로픽 세포 용해물을, 용해 완충액으로 미리 평형화시킨 Ni-NTA-칼럼 상에 적용했다. 세척 단계 후, 표적 단백질 (C-말단 Hexa-His-Tag 을 보유함) 을 pH 를 낮춰 용출했다. 리폴딩을 위해, FkpA-gp21 (4℃ 에서 50 mM 나트륨 포스페이트 pH 6.0, 7.0 M GuHCl 중에 보관) 를 50 mM 나트륨 포스페이트 pH 7.8, 100 mM 염화나트륨으로 미리 평형화시킨 Superdex 200 겔 여과 칼럼 상에 통과시켰다. UV-스펙트럼은 FkpA-gp21 이 - 샤페론이 없는 gp21 와 대조적으로 - 응집 성향이 없는 가용성 단백질로서 용출한다는 것을 증명한다 (도 11a). 더욱이, 수득한 FkpA-gp21 은 경쟁형 COBAS CORE 실험에서 평가시 탁월한 면역학적 활성을 나타낸다 (도 11a).
실시예 7 FkpA - gp41 에 대한 부가적인 FkpA -서브유닛의 융합은 gp41 엑토도메인의 면역학적 특징을 개선한다.
융합 폴리펩티드 측면에서 추가적인 PPIase 서브유닛이 gp41 엑토도메인-샤페론 복합체의 전반적인 특징을 개선할 수 있는지의 여부를 검토했다. 이를 해결하기 위해, 상기 프로토콜에 따라 본 발명에 따른 F41 (gp41 변이체의 상류에 위치하는 하나의 FkpA 도메인) 및 FF41 (gp41 변이체의 상류에 위치하는 2 개의 FkpA 도메인) 를 모두 제조했다. 이어서, 바이오틴화 및 루테닐화된 융합 단백질을 Elecsys
Figure 112006018489268-pat00005
E2010 시스템에서 평가했다. 결과는, 추가적인 샤페론 도메인을 포함하는 FF41 구축물의 개선된 특성에 대해 강하게 지시한다.
낮은 역가 혈청의 시그널 대 노이즈 비율 및 신뢰성 있는 측정을 결정하는, 음성 혈청을 사용한 배경 시그널은 FF41 (약 1600 카운트) 를 F41 (약 3800 카운트) 와 비교시 50% 이상 감소했음을 발견했다.
F41 및 FF41 의 비교
F41 FF41
RI: EMHR220 EMHR221
RI 중의 ESS F-41-Bi(UE)25 FF-41-Bi-UEEK
β(AL) 5OO ng/ml 750 ng/ml
R2 EMHR221 EMHR222
R2 중의 ESS F-41-Ru-(UE)25 FF41-2Ru-SK(4)
β(AL) 5OO ng/ml 750 ng/ml
7 개의 음성 혈청에서의 평균 갯수 3,768 1,589
유사한 양성 결과를 SS41 융합 단백질, 즉 샤페론 도메인에 2 개의 SlyD 도메인 및 1 개의 gp41 도메인 C-말단을 포함하는 융합 단백질을 사용하여 수득했다.
참고문헌 목록
Figure 112006018489268-pat00006
Figure 112006018489268-pat00007
본 발명에 기재된 바와 같은 샤페론-항원 복합체들은 취급하기 어려운 각종 폴리펩티드의 용해능을 야기할 뿐만 아니라, 이중 항원 가교 개념에 따른 매우 유리한 면역 검정을 허용한다.
이중 항원 가교 개념에 따른 상기 면역 검정의 특별히 매력적인 특징은, 고체 상 결합 항원이 있는 복합체 형성 및 검출 항원이 있는 복합체 형성 각각에 대해 상이한 샤페론을 이용하는 것이 가능하다는 점이다. 검정법의 상기 변형은 비특이적인 결합의 문제점을 추가로 개선한다. 샘플 중의 항체는, 샤페론에 대해 반응성이므로 틀린 양성 시그널을 야기할 수 있는데, 상이한 샤페론이 고체 상 항원 및 검출 항원 각각의 복합체에 사용되는 경우 가교를 형성하지 않는다. 따라서, 발명의 상기 양태에서, 비특이적인 결합에 의한 유사 양성 시그널이 대폭 감소한다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

  1. 하기의 단계를 포함하는, 항체 검출을 위한 면역 검정법:
    (a) 항원에 대한 항체를 포함하는 것으로 알려지거나 의심되는 샘플에 제 1 샤페론-항원 복합체 및 제 2 샤페론-항원 복합체를 혼합하고,
    (b) 상기 혼합물을 배양하여 제 1 샤페론-항원 복합체, 항체 및 제 2 샤페론-항원 복합체를 포함하는 면역 복합체를 형성시키고,
    (c) 상기 (b) 에서 형성된 복합체를 검출함.
  2. 제 1 항에 있어서, 제 1 샤페론 및 제 2 샤페론이 단일 종에서 유도된 상이한 분자들인 면역 검정법.
  3. 제 1 항에 있어서, 제 1 샤페론 및 제 2 샤페론이 상이한 종에서 유도되는 면역 검정법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 샤페론이 호열성 박테리아 (thermophilic bacterium) 유래인 면역 검정법.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 샤페론이 호열성 박테리아 유래인 면역 검정법.
  6. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 제 1 샤페론 및 제 2 샤페론이 호열성 박테리아 유래인 면역 검정법.
  7. 제 1 항에 있어서, 제 1 항원 복합체가 고체 상 결합기를 포함하는 면역 검정법.
  8. 제 1 항에 있어서, 제 2 항원 복합체가 마커 기를 포함하는 면역 검정법.
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