JP2002262883A

JP2002262883A - モノクローナル抗体の製造方法

Info

Publication number: JP2002262883A
Application number: JP2001070928A
Authority: JP
Inventors: Akira Ideno; 晃井手野; Tadashi Maruyama; 正丸山; Masahiro Furuya; 昌弘古谷
Original assignee: Marine Biotechnology Institute Co Ltd; Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Marine Biotechnology Institute Co Ltd; Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 2001-03-13
Filing date: 2001-03-13
Publication date: 2002-09-17

Abstract

(57)【要約】【課題】安価で、効率的な、イン・ビトロでの高特異
性、高親和性モノクローナル抗体の製造方法の提供。【解決手段】（ａ）抗体遺伝子とシャペロン様活性を
有するＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子とを形質転換体
内で共発現させ、モノクローナル抗体を可溶画分として
産生させること、又は、（ｂ）封入体として発現させた
モノクローナル抗体を、変性剤によって可溶化させ、さ
らにシャペロン様活性を有するＰＰＩａｓｅの共存下で
フォールディングさせることにより提供。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、イン・ビトロでの
モノクローナル抗体の製造方法に関し、さらに詳しく
は、シャペロン様活性を有するＰＰＩａｓｅの機能を利
用した、安価で、高効率な、イン・ビトロでの高特異
性、高親和性モノクローナル抗体の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】抗体は、分子量が１０万Ｄａを越える巨
大分子であり、特定の抗原物質に特異的に結合する機能
が利用され、分析用試薬、生体外診断薬等として幅広く
使用されている。抗体分子において、抗原物質との結合
に寄与している部分は、Ｖ領域（可変領域）と呼ばれ、
Ｈ鎖のＶ領域とＬ鎖のＶ領域とから構成されている。特
定抗原に対する抗体を取得する方法としては、ラットや
ウサギ等の実験動物に抗原物質を免疫感作させ、その血
清に含まれる抗体（ポリクロナール抗体）を得る方法
と、次に述べるモノクローナル抗体を得る方法が一般的
である。

【０００３】モノクローナル抗体は、単一クローンの抗
体産生細胞が産生する抗体であり、その特徴は一次構造
が均一なことである。モノクローナル抗体は、ケーラー
とミルシュタインによるハイブリドーマ技術の確立によ
って容易に製造できるようになった。この方法では、ま
ず、所定の抗原物質をマウス等の実験動物に投与して免
疫感作を行う。次に、免疫感作された動物の脾臓から、
該抗原物質に対する抗体産生能を獲得した脾臓細胞を取
り出し、これをミエローマのような適切な腫瘍細胞と融
合させてハイブリドーマを作製する。次いで、ＥＬＩＳ
Ａ等の適当な免疫分析法を用いたスクリーニングによ
り、目的の抗体物質を産生しているハイブリドーマを選
択する。その後、限界希釈法等を用いてクローニングす
ることにより、目的のモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマ株を樹立する。こうして樹立されたハイブ
リドーマを適当な培地中で培養した後、その代謝産物を
含む培地をクロマトグラフ等を用いて分離することによ
り、目的のモノクローナル抗体が得られる。

【０００４】現在、ハイブリドーマ技術はモノクローナ
ル抗体を取得するための方法として汎用されているが、
この方法は、動物に対する免疫感作というイン・ビボで
の生体反応を利用しているため、必然的に実験動物の介
在を必要とする。即ち、モノクローナル抗体を取得する
ためには、実験動物を飼育維持しなければならず、煩雑
な労力を必要とするとともに、多大なコストが必要とな
る。また、この方法では、生体反応を利用しているため
に試行錯誤的な要素が含まれ、必ずしも全ての抗原物質
に対するモノクローナル抗体が製造できるとは限らない
という問題がある。

【０００５】一方、近年、遺伝子工学技術が飛躍的に進
歩し、大腸菌の表層に、抗体のＨ鎖及びＬ鎖のＶ領域の
みを適当なリンカーを介して連結させたｓｃＦＶ（ｓｉ
ｎｇｌｅｃｈａｉｎＦｖ）、抗体のＦａｂ部分等を
発現することが可能となった。また、ＰＣＲ法を用いて
抗体遺伝子をランダムに増幅することで抗体遺伝子のラ
イブラリーを作製、細胞外に提示させ、これらのライブ
ラリーから特定抗原に親和性を有するものをスクリーニ
ングする方法が開発されつつある（熊谷ら，タンパク質
・核酸・酵素，１９９８，４３，１５９−１６７）。従
って、このスクリーニング法によって得られた抗体遺伝
子を、大腸菌等を用いて遺伝子工学的に発現できれば、
実験動物を用いることなく目的の抗原に対する抗体を生
産することが可能となる。

【０００６】しかしながら、上記技術には、例えば、大
腸菌を用いて抗体遺伝子を大量発現させる場合、抗体の
ほとんどが不溶性のインクルージョンボディ（封入体）
として発現され、活性型を直接的に得ることはできない
という問題がある。

【０００７】このため、抗体遺伝子にシグナル配列を連
結し、ペリプラズム領域に抗体を分泌発現させる方法も
提案されているが、分泌量が極めて少ない（Ｐｌｕｃｋ
ｔｈｕｎ，Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９１，
９，５４５）ため、実用的な方法とはいい難い。ところ
で、ＦａｂはｓｃＦＶと比べて構造が安定であるため機
能性に優れているという利点を有するが、技術的な困難
性が高いためか、ｓｃＦＶタイプの抗体の大腸菌細胞内
での発現に関する報告（Ｗｉｒｔｓｅｔａｌ．，（２
０００）ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ．８，２２４５）はあ
るものの、Ｆａｂタイプの抗体の発現に関する報告は未
だない。

【０００８】また、活性型の抗体を効率的に生産するた
めに、タンパク質の立体構造形成や構造変化に関与する
因子を、抗体のリフォールディングに利用することも検
討されており、例えば、特開平９−２２００９２号公報
には、封入体として発現された抗体を、塩酸グアニジン
等で可溶化し、シャペロニンを用いてリフォールディン
グさせる方法や、抗体遺伝子をシャペロニン遺伝子と大
腸菌内で共発現させる方法が開示されている。しかしな
がら、シャペロニンをタンパク質生産に応用する場合に
は、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＤＰといった高エネルギー物質
を共存させる必要があり、また、シャペロニンは、目的
タンパク質と１：１のモル比率で作用するため、分子量
が１００万Ｄａに近い高分子量のシャペロニンを目的タ
ンパク質に対して非常に高濃度で用いる必要もあり、利
便性に欠け、経済性にも欠けるという問題がある。

【０００９】なお、シャペロニンは、熱ショックタンパ
ク質の一群であり、細胞が温度変化等の様々な環境スト
レスにさらされた際に産生されるが、これらは、原核生
物、真核生物を問わず広く存在しており、特に、大腸菌
から産生される分子シャペロンとしてのＧｒｏＥが良く
知られている。また、このＧｒｏＥは、タンパク質の種
類を選ばず、非特異的にタンパク質の立体構造形成に関
与することも明らかにされている。例えば、上記Ｇｒｏ
Ｅの構成体であるＧｒｏＥＬは、７個のサブユニットが
環状に連なったドーナツ型構造が２段に重なった、合計
１４サブユニットからなる特徴的な構造を有している
が、このドーナツ構造の凹部に変性タンパク質を捕捉
し、ＡＴＰ等のヌクレオチドの消費と、補助因子である
ＧｒｏＥＳの結合によって、変性タンパク質を正しい立
体構造のタンパク質へと効率的に折り畳むことが知られ
ている。

【００１０】さらに、特開平１１−２８５３９８号公報
には、メタノコッカス属細菌から調製したＰＰＩａｓｅ
（Ｐｅｐｔｉｄｙｌｐｒｏｌｙｌｃｉｓ−ｔｒａｎ
ｓｉｓｏｍｅｒａｓｅ）を変性タンパク質のリフォール
ディングに利用することが開示されているが、高い特異
性、親和性を要求される抗体のリフォールディングへの
適用は検討されておらず、また、変性タンパク質のリフ
ォールディング効率の点からも十分満足できるものでは
なかった。なお、ＰＰＩａｓｅは、後述のように、ポリ
ペプチド鎖中のプロリン残基のＮ末端側ペプチド結合の
回転を促し、タンパク質高次構造の再生速度を促進させ
る機能（ＰＰＩａｓｅ活性）を有する酵素である。

【００１１】上記のとおり、実験動物を用いることな
く、目的の抗原に対する抗体を遺伝子工学的に生産する
ための方法が種々検討されているが、発現−フォールデ
ィング効率の点からは十分満足できるものではなく、高
い特異性、親和性を有するモノクローナル抗体を遺伝子
工学的に生産する方法のさらなる効率向上が望まれてい
た。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
の従来技術の問題点に鑑み、安価で、高効率な、イン・
ビトロでの高特異性、高親和性モノクローナル抗体の製
造方法を提供することにある。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を達成すべく鋭意研究した結果、（ａ）抗体遺伝子とシ
ャペロン様活性を有するＰＰＩａｓｅをコードする遺伝
子とを形質転換体内で共発現させ、モノクローナル抗体
を可溶画分として産生させること、又は、（ｂ）インク
ルージョンボディとして発現させたモノクローナル抗体
を、変性剤によって可溶化させ、さらにシャペロン様活
性を有するＰＰＩａｓｅの共存下でフォールディングさ
せることにより、上記課題が達成されることを見出し、
斯かる知見に基づいて本発明を完成するに至った。

【００１４】即ち、本発明の第１の発明によれば、抗体
遺伝子とシャペロン様活性を有するＰＰＩａｓｅをコー
ドする遺伝子とを含む形質転換体が提供される。

【００１５】また、本発明の第２の発明によれば、第１
の発明の形質転換体を培養して、抗体遺伝子とシャペロ
ン様活性を有するＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子とを
形質転換体内で共発現させ、モノクローナル抗体を可溶
画分として産生させることを特徴とするモノクローナル
抗体の製造方法が提供される。

【００１６】また、本発明の第３の発明によれば、第１
又は第２の発明において、シャペロン様活性を有するＰ
ＰＩａｓｅをコードする遺伝子が、古細菌由来ＦＫＢＰ
タイプＰＰＩａｓｅ遺伝子、バクテリア由来トリガーフ
ァクタータイプＰＰＩａｓｅ遺伝子、及び真核生物由来
ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ遺伝子からなる群から
選ばれた少なくとも１種であることを特徴とするモノク
ローナル抗体の製造方法が提供される。

【００１７】また、本発明の第４の発明によれば、第３
の発明において、古細菌由来ＦＫＢＰタイプＰＰＩａｓ
ｅ遺伝子が、１６〜１８ｋＤａの古細菌由来ＦＫＢＰタ
イプＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子であることを特徴
とするモノクローナル抗体の製造方法が提供される。

【００１８】また、本発明の第５の発明によれば、第１
〜第４のいずれかの発明において、抗体遺伝子が、Ｆａ
ｂ遺伝子であることを特徴とするモノクローナル抗体の
製造方法が提供される。

【００１９】さらに、本発明の第６の発明によれば、第
５の発明において、Ｆａｂ遺伝子が、マウスＩｇＧ由来
Ｆａｂ遺伝子であることを特徴とするモノクローナル抗
体の製造方法が提供される。

【００２０】一方、本発明の第７の発明によれば、イン
クルージョンボディとして発現させたモノクローナル抗
体を、変性剤によって可溶化させ、さらにシャペロン様
活性を有するＰＰＩａｓｅの共存下でフォールディング
させることを特徴とするモノクローナル抗体の製造方法
が提供される。

【００２１】また、本発明の第８の発明によれば、第７
の発明において、シャペロン様活性を有するＰＰＩａｓ
ｅが、古細菌由来ＦＫＢＰタイプＰＰＩａｓｅ、バクテ
リア由来トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅ、及び
真核生物由来ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅからなる
群から選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする
モノクローナル抗体の製造方法が提供される。

【００２２】また、本発明の第９の発明によれば、第８
の発明において、古細菌由来ＦＫＢＰタイプＰＰＩａｓ
ｅが、１６〜１８ｋＤａの古細菌由来ＦＫＢＰタイプＰ
ＰＩａｓｅであることを特徴とするモノクローナル抗体
の製造方法が提供される。

【００２３】また、本発明の第１０の発明によれば、第
７〜第９のいずれかの発明において、モノクローナル抗
体が、Ｆａｂであることを特徴とするモノクローナル抗
体の製造方法が提供される。

【００２４】さらに、本発明の第１１の発明によれば、
第７〜第９のいずれかの発明において、モノクローナル
抗体が、マウスＩｇＧ由来のＦａｂであることを特徴と
するモノクローナル抗体の製造方法が提供される。

【００２５】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【００２６】１．ＰＰＩａｓｅ（Ｐｅｐｔｉｄｙｌｐ
ｒｏｌｙｌｃｉｓ−ｔｒａｎｓｉｓｏｍｅｒａｓ
ｅ）本発明で用いられるＰＰＩａｓｅ（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ
ｐｒｏｌｙｌｃｉｓ−ｔｒａｎｓｉｓｏｍｅｒａｓ
ｅ）は、シャペロン様活性を有する、古細菌由来のＦＫ
ＢＰタイプＰＰＩａｓｅ、バクテリア由来トリガーファ
クタータイプＰＰＩａｓｅ、及び真核生物由来５２ｋＤ
ａＦＫＢＰタイプＰＰＩａｓｅからなる群から選ばれ
た少なくとも１種のＰＰＩａｓｅである。

【００２７】ＰＰＩａｓｅは、免疫抑制剤として知られ
るサイクロスポリンやＦＫ５０６のターゲット分子であ
り、これらの免疫抑制剤に対する感受性から、シクロフ
ィリンタイプとＦＫＢＰ（ＦＫ５０６ｂｉｎｄｉｎｇ
ｐｒｏｔｅｉｎ）タイプとに大別される。

【００２８】また、ＰＰＩａｓｅは、ポリペプチド鎖中
のプロリン残基のＮ末端側ペプチド結合のシストランス
異性化反応を触媒することにより、タンパク質高次構造
の再生速度を高める機能（ＰＰＩａｓｅ活性）を有する
ことから、前記シャペロニンと同様に、タンパク質の安
定化や変性タンパク質の再生に利用できるものとして期
待されていた。

【００２９】興味深いことに、古細菌由来のＦＫＢＰタ
イプＰＰＩａｓｅは、上記ＰＰＩａｓｅ活性だけでな
く、本来シャペロニンの機能とされていた、タンパク質
巻き戻りの収量そのものを増大させる活性やタンパク質
の不可逆的凝集を抑制する活性（シャペロン様活性）を
有し（Ｍａｒｕｙａｍａｅｔａｌ．，２０００，Ｆ
ｒｏｎｔＢｉｏｓｃｉ．２０００Ｓｅｐ１，
５，Ｄ８２１−８３６）、また、このシャペロン様活性
は、バクテリア由来のトリガーファクター型ＰＰＩａｓ
ｅ（Ｈｕａｎｇ，Ｇ．−Ｃ．，ｅｔａｌ．（２０００）
ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ．９，１２５４−１２６１）、
真核生物由来ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ（Ｂｏｓ
ｅ，Ｓ．，ｅｔａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２
７４，１７１５−１７１７）にも見られる機能である。

【００３０】また、ＰＰＩａｓｅは、シャペロニンとは
異なり、タンパク質生産への応用において、ＡＴＰ等と
いった高エネルギー物質を必要とせず、分子量が小さい
ため、安価で、かつ取り扱い上の利便性も高く、さら
に、発現−フォールディングの効率も高いという特徴を
有する。

【００３１】ここで、上記のシャペロン様活性は、ロダ
ネーゼやクエン酸合成酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グル
コース−６−リン酸脱水素酵素等をモデル酵素とし（河
田１９９８，バイオサイエンスとインダストリー５６，
５９３−５９８）、これらを６Ｍ塩酸グアニジン等のタ
ンパク質変性剤で変性処理後、ＰＰＩａｓｅやシャペロ
ニンを含む緩衝液で変性剤を希釈した際に開始する変性
タンパク質の再生率や、変性タンパク質の凝集の抑制率
で評価することができる。変性タンパク質の再生率を評
価する方法としては、例えば、ホロビッチらの方法が
（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，１９９５，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．４０，３６１−３６８）、変性タンパ
ク質の凝集抑制を評価する方法としては、田口らの方法
（Ｔａｇｕｃｈｉｅｔａｌ．１９９４，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，８５２９−８５３４）等が
それぞれ挙げられる。

【００３２】なお、上記の免疫抑制剤に非感受性でアミ
ノ酸配列のホモロジーも異なるパーブリン（Ｐａｒｖｕ
ｌｉｎ）タイプが近年見つかってきており、また、バク
テリア由来のトリガーファクターはＦＫＢＰと相同性の
高い領域を持つため、ＦＫＢＰタイプＰＰＩａｓｅのサ
ブクラスと位置づけられている。

【００３３】本発明で用いられる古細菌由来のＦＫＢＰ
タイプＰＰＩａｓｅとしては、例えば、アシディアヌス
（Ａｃｉｄｉａｎｕｓ）属、メタロスファエラ（Ｍｅｔ
ａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ）属、スティジオロバス（Ｓｔ
ｙｇｉｏｌｏｂｕｓ）属、スルフォロバス（Ｓｕｌｆｏ
ｌｏｂｕｓ）属、スルフロコッカス（Ｓｕｌｆｕｒｏｃ
ｏｃｃｕｓ）属及びスルフリスファエラ（Ｓｕｌｆｕｒ
ｉｓｐｈａｅｒａ）属等のスルフォロバレス（Ｓｕｌｆ
ｏｌｏｂａｌｅｓ）目、アエロパイラム（Ａｅｒｏｐｙ
ｒｕｍ）属、デスルフロコッカス（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏ
ｃｏｃｃｕｓ）属、ステッテリア（Ｓｔｅｔｔｅｒｉ
ａ）属、スタフィロサーマス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅ
ｒｍｕｓ）属、サーモディスカス（Ｔｈｅｒｍｏｄｉｓ
ｃｕｓ）属、イグネオコッカス（Ｉｇｎｅｏｃｏｃｃｕ
ｓ）属、サーモスファエラ（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｅｒ
ａ）属、スルフォフォボコッカス（Ｓｕｌｆｏｐｈｏｂ
ｏｃｏｃｃｕｓ）属、ハイパーサーマス（Ｈｙｐｅｒｔ
ｈｅｒｍｕｓ）属、パイロディクティウム（Ｐｙｒｏｄ
ｉｃｔｉｕｍ）属、及びパイロロバス（Ｐｙｒｏｌｏｂ
ｕｓ）属等のイグネオコッカレス（Ｉｇｎｅｏｃｏｃｃ
ｕｌｅｓ）目、パイロバキュラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌ
ｕｍ）属、サーモプロテウス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅ
ｕｓ）属、サーモフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ）
属、及びカルドコッカス（Ｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ）属
等のサーモプロテアレス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅａｌ
ｅｓ）目、アーキオグロブス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂ
ｕｓ）属、及びフェログロブス（Ｆｅｒｒｏｇｌｏｂｕ
ｓ）属等のアーキオグロバレス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏ
ｂａｌｅｓ）目、メタノサーマス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈ
ｅｒｍｕｓ）属、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、メタノサーモバクター（Ｍｅ
ｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ）属、及びメタノ
スファエラ（Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ）属等のメ
タノバクテリアレス（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ
ｌｅｓ）目、メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃ
ｕｓ）属、メタノサーモコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈ
ｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属、メタノカルドコッカス（Ｍ
ｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、及びメタノ
イグニス（Ｍｅｔｈａｎｏｉｇｎｉｓ）属等のメタノコ
ッカレス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ）目、メタ
ノミクロバイアレス（Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａ
ｌｅｓ）目、メタノザルチナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃ
ｉｎａ）属等のメタノザルチナレス（Ｍｅｔｈａｎｏｓ
ａｒｃｉｎａｌｅｓ）目、メタノパイラレス（Ｍｅｔｈ
ａｎｏｐｙｒａｌｅｓ）目、パイロコッカス（Ｐｙｒｏ
ｃｏｃｃｕｓ）属、及びサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏ
ｃｏｃｃｕｓ）属等のサーモコッカレス（Ｔｈｅｒｍｏ
ｃｏｃｃａｌｅｓ）目、サーモプラズマ（Ｔｈｅｒｍｏ
ｐｌａｓｍａ）属、及びピクロフィラス（Ｐｉｃｒｏｐ
ｈｉｌｕｓ）属等のサーモプラスマレス（Ｔｈｅｒｍｏ
ｐｌａｓｍａｌｅｓ）目、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ハロコッカス（Ｈａｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ）属、ナトゥノバクテリウム（Ｎａｔｒｏｎｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ナトゥノコッカス（Ｎａｔｒ
ｏｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ハロアーキュラ（Ｈａｌｏａ
ｒｃｕｌａ）属、ハロフェラックス（Ｈａｌｏｆｅｒａ
ｘ）属、ハロバキュラム（Ｈａｌｏｂａｃｕｌｕｍ）
属、ハロルブラム（Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ）属、ナトゥ
リアルバ（Ｎａｔｒｉａｌｂａ）属、ナトゥロノモナス
（Ｎａｔｒｏｎｏｍｏｎａｓ）属、ハロジェオメトリカ
ム（Ｈａｌｏｇｅｏｍｅｔｒｉｃｕｍ）属、及びハロテ
リジェナ（Ｈａｌｏｔｅｒｒｉｇｅｎａ）属等のハロバ
クテリアレス（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）目等
由来のＰＰＩａｓｅが挙げられる。

【００３４】本発明においては、これら古細菌由来のＰ
ＰＩａｓｅの中でも、好熱性又は超好熱性古細菌由来の
ＰＰＩａｓｅを使用することが好ましく、とりわけメタ
ノコッカス属、サーモコッカス属、パイロコッカス属、
サーモプラズマ属、メタノバクテリウム属由来のＰＰＩ
ａｓｅを使用することが好ましい。

【００３５】また、古細菌由来のＦＫＢＰタイプのＰＰ
Ｉａｓｅは、分子量が１７−１８ｋＤａ程度の短いタイ
プのものと、分子量が２６−３３ｋＤａ程度の長いタイ
プのものとに分類される（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｔａ
ｎｄＦｕｒｕｔａｎｉ，ＭＦｒｏｎｔＢｉｏｓｃ
ｉ．２０００Ｓｅｐ１，５，Ｄ８２１−８３６；
Ｉｉｄａｅｔａｌ．，２０００，Ｇｅｎｅ２５６，
３１９−３２６）。本発明においては、いずれの分子量
のＰＰＩａｓｅを用いてもよいが、発現−リフォールデ
ィング効率の観点から、１７−１８ｋＤａ程度の短いも
のを用いることが好ましい。古細菌由来ＰＰＩａｓｅの
一例として、メタノコッカス・ヤナシイ由来の１８ｋＤ
ａＦＫＢＰタイプＰＰＩａｓｅのアミノ酸配列と遺伝
子配列を、配列番号１、２にそれぞれ示す。

【００３６】トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅ
は、ヒト由来１２ｋＤａＦＫＢＰタイプＰＰＩａｓｅ
と相同性の高い領域を有し、そのＮ末端とＣ末端に、そ
れぞれ約１４０アミノ酸と約２００アミノ酸からなるド
メインを形成するタンパク質である（Ｚａｒｎｔ，ｅｔ
ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７１，８
２７−８３７）。これらは、タンパク質新生の初期段階
においてリボゾームと相互作用し、タンパク質のフォー
ルディングに関与していると言われている。本発明で用
いられるトリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅとして
は、大腸菌やバチラス、サーモトガ、マイコバクテリウ
ム、マイコプラズマ等、バクテリア由来のものが挙げら
れる。バクテリア由来ＰＰＩａｓｅの一例として、大腸
菌由来のトリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅのアミ
ノ酸配列と遺伝子配列を、配列番号３、４にそれぞれ示
す。

【００３７】真核生物由来のＦＫＢＰタイプＰＰＩａｓ
ｅは、分子量が約５２ｋＤａであり、ｐ５９又はＨＳＰ
５６等と呼ばれる。そのアミノ酸配列は、ヒト由来１２
ｋＤａＦＫＢＰタイプＰＰＩａｓｅと相同性の高い領
域２つがタンデムに連なり、さらに、そのＣ末端側にカ
ルモジュリン結合部位を含む領域が連なった構造を有す
る（Ｒａｔａｊｃｚａｋ，Ｔ．，ｅｔａｌ．１９９３，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１３１８７−
１３１９２）。また、これらは、ＰＰＩａｓｅ活性だけ
でなく、シャペロン様活性を持つことが報告されている
（Ｂｏｓｅ，Ｓ．，ｅｔａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ２７４，１７１５−１７１７）。本発明において
は、ヒト由来のものと相同性が高く、シャペロン様活性
を示すものであれば、いずれのＦＫＢＰ５２タイプＰＰ
Ｉａｓｅを用いてもよい。真核生物由来ＦＫＢＰタイプ
ＰＰＩａｓｅの一例として、ヒト由来のＦＫＢＰ５２タ
イプＰＰＩａｓｅのアミノ酸配列と遺伝子配列を、配列
番号５、６にそれぞれ示す。

【００３８】本発明においては、上記ＰＰＩａｓｅのい
ずれを用いてもよく、また２種以上を併用してもよい
が、発現−リフォールディング効率の観点からは、古細
菌由来の約１６−１８ｋＤａのＦＫＢＰタイプＰＰＩａ
ｓｅを用いることが好ましい。さらに、本発明において
は、タンパク質のフォールディング効率を向上させるた
めに、ジスルフィド結合の組替えを促進する機能を有す
るＰＤＩ（プロテインジスルフィドイソメラーゼ）を併
用してもよい。

【００３９】２．抗体遺伝子とＰＰＩａｓｅ遺伝子との
共発現本発明においては、好ましい実施態様の一つとして、シ
ャペロン様活性を有するＰＰＩａｓｅ遺伝子とともに抗
体遺伝子を形質転換体内で共発現させ、抗体遺伝子の発
現産物を可溶画分に産生させる。

【００４０】ＰＰＩａｓｅ遺伝子とともに抗体遺伝子を
共発現させる方法としては、ＰＰＩａｓｅをコードする
遺伝子を、例えば、ｐＡＣＹＣ系プラスミドの発現プロ
モーターの下流部に挿入し、宿主菌内に導入すればよ
い。抗体遺伝子がｐＥＴ等のｃｏｌＥ１系のＤＮＡ複製
開始領域を持つ発現ベクターに挿入されている場合、ｐ
ＡＣＹＣベクターは同ベクターと宿主菌内で共存可能で
あるため、それぞれのプラスミドに別の薬剤耐性マーカ
ーを所有させておけば、両遺伝子が導入された形質転換
体を選別でき、また、両遺伝子はそれぞれのプロモータ
ー制御下で発現が可能となる。逆に、目的タンパク質を
ｐＡＣＹＣ系に、ＰＰＩａｓｅ遺伝子をＣｏｌＥ１系に
組み込んでもよい。もちろん、ＰＰＩａｓｅ遺伝子と抗
体遺伝子を、一つの発現ベクター上に直列に挿入し、１
つ又は２種以上のプロモーターで発現を制御してもよ
い。両遺伝子を含む形質転換体を適当な培地で培養し、
両遺伝子の発現を誘導すれば、ＰＰＩａｓｅのＰＰＩａ
ｓｅ活性及びシャペロン様活性等の効果により、抗体の
ミスフォールディングが抑制されるとともに、抗体の封
入体形成が妨げられ、可溶性画分に抗体が高効率に産生
される。

【００４１】３．封入体のリフォールディング本発明においては、好ましい他の実施態様の一つとし
て、大腸菌等の形質転換体によって封入体として発現さ
せたモノクローナル抗体を変性剤によって可溶化し、シ
ャペロン様活性を有するＰＰＩａｓｅの共存下でリフォ
ールディングさせる。

【００４２】封入体は、不溶性のため、菌体を超音波破
砕し、その不溶性画分を精製することで得られ、尿素又
は塩酸グアニジン等を用いて可溶化することができる。
可溶化した抗体をリフォールディングするには、可溶化
した目的の抗体を上記のＰＰＩａｓｅと共存させればよ
い。具体的には、封入体として発現した抗体を、あらか
じめ８Ｍ尿素や６Ｍ塩酸グアニジンで可溶化しておき、
ＰＰＩａｓｅを含む緩衝液で３０−２００倍に希釈すれ
ばよい。必要に応じて、緩衝液にはＤＴＴ等の様な還元
剤やＥＤＴＡ等のようなキレート剤等を加えておいても
よい。抗体とＰＰＩａｓｅの混合比率は、モル比で、抗
体１に対して、通常０．０１−１００、好ましくは０．
１−３０である。

【００４３】４．抗体本発明の製造方法が適用可能な抗体としては、いずれの
動物種由来の抗体であっても、いずれのサブクラスの抗
体であってもよく、また、抗体全長であっても、Ｆａ
ｂ、ｓｃＦＶ等であってもよい。本発明の製造方法は、
Ｆａｂの産生、特に、マウス由来ＩｇＧからのＦａｂの
産生に好適に用いることができる。

【００４４】

【実施例】以下、本発明の製造方法をさらに詳細に説明
するために、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発
明は、これらの実施例によって限定されるものではな
い。

【００４５】〔実施例１〕サーモコッカスｓｐ．ＫＳ−
１由来ＦＫＢＰタイプＰＰＩａｓｅのシャペロン様活性Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ由
来クエン酸合成酵素（以後ＣＳという；Ｓｉｇｍａ社）
を６Ｍ塩酸グアニジン及び５ｍＭＤＴＴを含む２５ｍ
Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中に溶解し、５０℃
で３０分変性させた。この変性ＣＳ１に対し、特開平
１１−３１８４６４号公報記載のサーモコッカスｓｐ．
ＫＳ−１由来ＦＫＢＰタイプＰＰＩａｓｅ（以後ＴｃＦ
Ｋ）１．５−３０倍量を含む２５ｍＭリン酸ナトリウム
（ｐＨ７．０）で４０倍に希釈することによりフォール
ディングを開始させた。反応は５０℃で５０分間（図１
−１）、及び、３０℃にて９０分間（図１−２）行っ
た。反応中のＣＳの最終濃度は０．３３μＭとした。Ｃ
Ｓの活性は文献［Ｓｒｅｒｅ，Ｐ．Ａ．，ｅｔａｌ．，
（１９６３）ＡｃｔａＣｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．１
７，Ｓ１２９−Ｓ１３４；Ｆｕｒｕｔａｎｉ，Ｍ．，ｅ
ｔａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２７３，２８３９９−２８４０７］に従って測定し、ネ
イティブ型ＣＳの活性を１００％として相対評価した。
５０℃の実験に関しては、ＴｃＦＫの代わりにＲＮａｓ
ｅＴ１を、３０℃の実験ではＢＳＡ及びヒト１２ｋＤａ
ＦＫＢＰタイプＰＰＩａｓｅをそれぞれ比較例として
用いた。図１−１に示すとおり、ＴｃＦＫは変性したＣ
Ｓのフォールディング収量を上げるシャペロン様活性を
示した。比較例として用いたＲＮａｓｅＴ１にはシャペ
ロン様活性は見られなかった。また、図１−２に示すよ
うに、３０℃においてもＴｃＦＫはＣＳのフォールディ
ング収量を向上させたのに対し、ＢＳＡ及びヒト１２ｋ
ＤａＦＫＢＰタイプＰＰＩａｓｅにはシャペロン様活
性は見られなかった。

【００４６】〔実施例２〕サーモコッカスｓｐ．ＫＳ−
１由来ＦＫＢＰタイプＰＰＩａｓｅ及びその発現ユニッ
トのクローニング特開平１１−３１８４６４号公報記載のサーモコッカス
ｓｐ．ＫＳ−１由来ＦＫＢＰタイプＰＰＩａｓｅ（Ｔｃ
ＦＫ）の発現用プラスミドｐＥＦＥ１−３を鋳型とし、
Ｔ７プロモーターを上流に含むＴｃＦＫ遺伝子をＰＣＲ
法によって増幅した。遺伝子増幅用のプライマーとし
て、ＴｃＦＫ−Ｆｃ２及びＴｃＦＫ−Ｒｃ１をそれぞれ
用いた（表１）。また、ＰＣＲの反応組成及び反応サイ
クルは、それぞれ表２び表３に示すとおりである。ＤＮ
Ａポリメラーゼは、ＴａＫａＲａ社Ｅｘ．Ｔａｑを使用
した。ＰＣＲ法によって得られた増幅産物を、２％アガ
ロースゲル電気泳動により分離後、ＤＮＡ断片を含むバ
ンド部分を切り出し、フェノール・クロロホルム処理及
びエタノール沈殿により目的ＤＮＡの抽出を行った。Ｄ
ＮＡ断片を滅菌水に溶解し、各約１０〜１００ｎｇに対
して１０倍量のｐＴ７ｂｌｕｅＴプラスミドベクタ
ー（Ｎｏｖｅｇｅｎ）を加え、さらに１６℃にて１時間
処理することによりＤＮＡ断片をライゲーションした。
上記ライゲーション液をコンピテントセル大腸菌ＪＭ１
０９株に加えることによりトランスフォーメーションし
た。これら菌株の懸濁液を１００μｇｍｌ^−１アンピシ
リンナトリウム、１００μＭＩＰＴＧ及び０．００４
％Ｘ−Ｇａｌを含有するＬＢ寒天培地に接種し、一晩
３７℃にて培養し、得られたホワイトコロニーについ
て、その菌株のプラスミドＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを
行い、ＤＮＡ断片に対応するプライマーで増幅されるコ
ロニーを陽性コロニーとした。陽性コロニーからｐＴ７
プラスミドＤＮＡを回収した後、プラスミドを鋳型と
し、ＢＩＧＤｙｅ（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ）を用
いたシーケンス反応（プライマーはＴ７プロモータープ
ライマー及びＵ−１９リバースプライマー）を行うこと
により、得られたＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。こ
の配列をサーモコッカスｓｐ．ＫＳ−１のＴｃＦＫ遺伝
子の塩基配列、及びＴ７プロモータ領域のそれと比較し
た結果、その遺伝子の配列と相違ないことを確認した。

【００４７】

【表１】

【００４８】

【表２】

【００４９】

【表３】

【００５０】〔実施例３〕サーモコッカスｓｐ．ＫＳ−
１由来ＦＫＢＰタイプＰＰＩａｓｅの発現系構築ＰＰＩａｓｅ遺伝子及びＴ７プロモータ領域を含むｐＴ
７ｂｌｕｅプラスミドＤＮＡについて制限酵素処理を
行い、ＰＰＩａｓｅ遺伝子発現ユニットをコードするＤ
ＮＡ断片の切り出しを行った。制限酵素はＳｐｈＩ及
びＢａｍＨＩの組み合わせを用いた。切断した遺伝子断
片は２％アガロースゲルにより、分離・抽出した後、あ
らかじめ制限酵素処理したｐＡＣＹＣ１８４プラスミド
ＤＮＡ（和光純薬）にライゲーションした。得られたラ
イゲーション反応液を１００μｇｍｌ^−１クロラムフェ
ニコールを含有するＬＢ寒天培地に接種し、一晩３７℃
にて培養し、得られたコロニーについて、その菌株のプ
ラスミドＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片
に対応するプライマーで増幅されるコロニーを陽性コロ
ニーとした。ＰＰＩａｓｅ遺伝子を含む陽性コロニーか
らｐＡＣＹＣ１８４プラスミドＤＮＡを回収した。

【００５１】〔実施例４〕マウス由来抗−卵白リゾチー
ム（ＨＥＬ）Ｆａｂ遺伝子のクローニングＩｂａらによって構築されたＡｎｔｉ−ＨＥＬ−Ｆａｂ
発現用プラスミドｐＡＡＬＦａｂを鋳型とし（Ｉｂａ，
Ｙ．，ｅｔａｌ．１９９７，Ｇｅｎｅ１９４，３５
−４６）、Ｈ鎖及びＬ鎖をＰＣＲ法によって増幅した。
遺伝子増幅用のプライマーとして、Ｈ鎖についてはＨＥ
ＬＶＨ−Ｆ１及びＨＥＬＶＨ−Ｒ１を、Ｌ鎖については
ＨＥＬＶＬ−Ｆ１及びＨＥＬＶＬ−Ｒ１をそれぞれ用い
た（表４）。また、ＰＣＲの反応組成及び反応サイクル
は、それぞれ表５び表６に示とおりである。ＤＮＡポリ
メラーゼは、ＴａＫａＲａ社Ｅｘ．Ｔａｑを使用した。
ＰＣＲ法によって得られた各々の増幅産物を、２％アガ
ロースゲル電気泳動により分離後、ＤＮＡ断片を含むバ
ンド部分を切り出し、フェノール・クロロホルム処理及
びエタノール沈殿により目的ＤＮＡの抽出を行った。Ｈ
鎖及びＬ鎖それぞれのＤＮＡ断片を滅菌水に溶解し、各
約１０〜１００ｎｇに対して１０倍量のｐＴ７ｂｌｕ
ｅＴプラスミドベクター（Ｎｏｖｅｇｅｎ）を加え、
さらに１６℃にて１時間処理することによりそれぞれの
ＤＮＡ断片をライゲーションした。上記ライゲーション
液をそれぞれのコンピテントセル大腸菌ＪＭ１０９株に
加えることによりトランスフォーメーションした。これ
ら菌株の懸濁液を１００μｇｍｌ^−１アンピシリンナト
リウム、１００μＭＩＰＴＧ及び０．００４％Ｘ−Ｇ
ａｌを含有するＬＢ寒天培地に接種し、一晩３７℃にて
培養し、得られたホワイトコロニーについて、その菌株
のプラスミドＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行い、ＤＮＡ
断片に対応するプライマーで増幅されるコロニーを陽性
コロニーとした。それぞれの陽性コロニーからｐＴ７プ
ラスミドＤＮＡを回収した後、プラスミドを鋳型とし、
ＢＩＧＤｙｅ（ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ）を用いた
シーケンス反応（プライマーはＴ７プロモータープライ
マー及びＵ−１９リバースプライマー）を行うことによ
り、得られたＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。この配
列をＡｎｔｉ−ＨＥＬ−ＦａｂＨ鎖、及びＬ鎖の遺
伝子の塩基配列と比較した結果、それらの遺伝子の配列
と相違ないことを確認した。

【００５２】

【表４】

【００５３】

【表５】

【００５４】

【表６】

【００５５】〔実施例５〕マウス由来抗−卵白リゾチー
ム（ＨＥＬ）Ｆａｂ遺伝子の発現系構築Ａｎｔｉ−ＨＥＬ−ＦａｂＨ鎖、及び、Ｌ鎖をコード
する遺伝子を含むそれぞれのｐＴ７ｂｌｕｅプラスミ
ドＤＮＡについて制限酵素処理を行い、Ａｎｔｉ−ＨＥ
Ｌ−Ｆａｂ遺伝子断片の切り出しを行った。制限酵素は
Ｈ鎖についてはＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの組み
合わせを、Ｌ鎖についてはＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍ
ＨＩをそれぞれ用いた。切断した遺伝子断片はそれぞ
れ２％アガロースゲルにより、分離・抽出した後、Ｈ鎖
及びＬ鎖の順であらかじめ制限酵素（ＮｄｅＩ及びＢ
ａｍＨＩ）処理したｐＥＴ２１ａプラスミドＤＮＡ
（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。得られたラ
イゲーション反応液をコンピテントセル大腸菌ＪＭ１０
９株に加えることによりトランスフォーメーションした
後、Ｈ鎖及びＬ鎖双方のＡｎｔｉ−Ｈｅｌ−Ｆａｂ遺伝
子を含む陽性コロニーからｐＥＴ２１ａプラスミドＤＮ
Ａを回収した。

【００５６】〔実施例６〕ＰＰＩａｓｅ遺伝子とＦａｂ
遺伝子の共発現実施例３及び実施例５で得られたＴｃＦＫ遺伝子を含む
ｐＡＣＹＣ１８４プラスミド、及びＡｎｔｉ−ＨＥＬ−
Ｆａｂ遺伝子を含むｐＥＴ２１ａプラスミドの共発現を
試みた。両プラスミドをコンピテントセル大腸菌ＢＬ２
１（ＤＥ３）株に加えることによりトランスフォーメー
ションした後、１００μｇ／ｍｌアンピシリン及びクロ
ラムフェニコールを含む寒天培地にて培養した。得られ
たコロニーを２×ＹＴ培地（ＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃ
ｔ１６ｇＬ^−１，ＢＡＣＴＯＴＲＹＰＴＯＮ２０ｇ
Ｌ^−１，ＮａＣｌ５ｇＬ^−１，アンピシリン１００
μｇｍｌ^−１，クロラムフェニコール１００μｇｍ
ｌ^−１，ｐＨ７．５）７００ｍｌに接種した。３５℃で
回転培養（１１０ｒｐｍ）した後、ＯＤ６００が０．７
となった時点で１００ｍＭＩＰＴＧを添加することに
より、ＴｃＦＫ及びＡｎｔｉ−ＨＥＬ−Ｆａｂの発現を
誘導した。遠心分離（１００００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ）
にて菌体を回収した。得られた菌体は１ｍＭＥＤＴＡ
を含む２５ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．８）２０
ｍｌに懸濁し、−２０℃にて一晩凍結保存した。菌体を
超音波破砕後、上清及び沈澱画分に分離し、それぞれを
ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した（図２）。なお、図２−１中
のレーン１はＴｃＦＫ及びＡｎｔｉ−ＨＥＬ−Ｆａｂを
共発現させた大腸菌液、レーン２及び３は、それぞれ、
その破砕液上清及び沈澱画分である。また、レーン４
は、実施例４にて、大腸菌にＴｃＦＫ遺伝子を組み込ま
ず、クロラムフェニコールを除いた２ｘＹＴ培地で培養
した大腸菌の菌液である（比較例）。また、レーン５及
び６は、それぞれ、その破砕液上清及び沈澱画分であ
る。ＴｃＦＫを発現させなかった場合、Ａｎｔｉ−ＨＥ
Ｌ−Ｆａｂ遺伝子は不溶性画分に発現した（レーン
６）。また、図２−２に示すように、発現したＡｎｔｉ
−ＨＥＬ−Ｆａｂを、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧ抗
体を用いたウエスタンブロッティングにより確認した。
上記のように、従来封入体としてしか発現しなかった抗
体遺伝子を、ＴｃＦＫ遺伝子との共発現により、可溶画
分に産生することが可能となった。

【００５７】〔実施例７〕Ｆａｂの活性測定得られたＦａｂの活性は、ＨＥＬを抗原とするＥＬＩＳ
Ａ法において、１次抗体として機能するか否かで評価し
た。すなわち、９６穴プレートに０．１ｍｇ／ｍｌニワ
トリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）溶液１００μｌを添加
し、３０℃にて３時間インキュベーションすることによ
り、ＨＥＬを固定化した。ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）
にてプレートを洗浄後、ブロックエース（大日本製薬）
を含むＰＳＢ緩衝液でブロッキングした（４℃、オーバ
ーナイト）。ＰＢＳにて洗浄後、実施例６のＴｃＦＫと
の共発現の結果得られた可溶性Ａｎｔｉ−ＨＥＬ−Ｆａ
ｂを含む大腸菌上清液及び１０％ブロックエースを含む
ＰＢＳを１次抗体液として用い、室温にて３時間インキ
ュベートした。ＰＢＳにて洗浄後、２次抗体として０．
１％Ａｎｔｉ−マウスＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート
（フナコシ）を含むＰＢＳ緩衝液でインキュベート（２
時間、３０℃）した。ＰＢＳにて洗浄後、ＨＲＰの基質
としてＡＢＴＳ液（フナコシ）１００μｌを加え、３０
分間インキュベートし、ＯＤ４０５を測定した。得られ
た結果を図３に示す。ＴｃＦＫと共発現させたＡｎｔｉ
−ＨＥＬ−Ｆａｂを含む大腸菌破砕液を１次抗体液とし
て用いた場合、抗原に特異的に結合することが明らかで
ある（■）。ＴｃＦＫと共発現させたＡｎｔｉ−ＨＥＬ
−Ｆａｂを含む大腸菌破砕液の代わりに、共発現させな
かった大腸菌破砕液を用いた場合と比べ（□）、有意に
一次抗体として機能していることが明らかである。

【００５８】〔実施例８〕封入体のフォールディングと
活性評価実施例６で得られたＡｎｔｉ−ＨＥＬ−Ｆａｂの封入体
を精製し、６Ｍグアニジン塩酸を含むＰＢＳ緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）で１時間室温にてインキュベーションするこ
とにより、封入体を可溶化させた。この変性Ａｎｔｉ−
ＨＥＬ−Ｆａｂ１に対し、２０倍量のＴｃＦＫを含む２
５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で４０倍に希
釈することにより、Ａｎｔｉ−ＨＥＬ−Ｆａｂのフォー
ルディングを開始させた。反応は３０℃で９０分間行っ
た。得られた反応溶液を実施例７に記載した方法によ
り、フォールディングしたＡｎｔｉ−ＨＥＬ−Ｆａｂが
一次抗体として機能するか否かを検討した。実施例７で
用いた大腸菌破砕液の代わりに、上記反応溶液を用いて
ＥＬＩＳＡにて評価した。結果を図４に示す。ＴｃＦＫ
と反応させたＡｎｔｉ−ＨＥＬ−Ｆａｂは（■）、作用
させなかったものと比べ（□）、有意に一次抗体として
機能していることが明らかである。これらは抗原がない
場合、全く反応せず、高い特異性を示した。

【００５９】

【発明の効果】以上のとおり、本発明によれば、実験動
物を用いることなく、高効率に高特異性、高親和性のモ
ノクローナル抗体を調製することができる。また、本発
明によれば、抗体遺伝子と他のタンパク質やペプチド等
をコードする遺伝子とを結合させることにより、多機能
な抗体を調製することも可能となる。得られた抗体は、
基礎研究分野だけでなく、診断分野、医療分野等の応用
面においても極めて有用である。

【００６０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING ＜110＞ Sekisui Chemical Co.,Ltd ＜110＞ Marine Biotechnology Institute ＜130＞ 01P00164 ＜160＞ 6 ＜210＞ 1 ＜211＞ 157 ＜212＞ PRT ＜213＞ Methanococcus jannaschii ＜400＞ 1 Met Ile Asn Leu Ile Lys Lys Gly Asp Tyr Val Lys Val Asp Tyr Ile 1 5 10 15 Leu Glu Val Asp Gly Lys Val Ile Asp Thr Ser Ile Glu Glu Val Ala 20 25 30 Lys Glu Asn Lys Ile Tyr Tyr Pro Glu Arg Glu Tyr Glu Pro Ile Gly 35 40 45 Phe Ile Val Gly Asn Gly Glu Leu Ile Glu Gly Phe Glu Glu Ala Val 50 55 60 Ile Gly Met Glu Val Gly Glu Glu Lys Thr Val Thr Ile Pro Pro Glu 65 70 75 80 Lys Gly Tyr Gly Leu Arg Asp Glu Arg Leu Ile Gln Glu Ile Pro Lys 85 90 95 Glu Met Phe Ala Asp Ala Asp Phe Glu Pro Gln Glu Gly Met Leu Ile 100 105 110 Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Lys Ile Ile Lys Val Thr Asp Asp Thr 115 120 125 Val Thr Leu Asp Phe Asn His Glu Leu Ala Gly Lys Glu Leu Lys Phe 130 135 140 Thr Ile Lys Val Arg Asp Val Gln Pro Ala Glu Ser Glu 145 150 155 ＜210＞ 2 ＜211＞ 471 ＜212＞ DNA ＜213＞ Methanococcus jannaschii ＜400＞ 2 atg att aac ttg att aaa aaa ggt gac tat gtc aaa gta gat tat ata 48 tta gaa gta gat gga aaa gtt att gac aca tca att gaa gaa gta gct 96 aaa gaa aat aaa ata tac tat cct gaa aga gaa tat gag cca att gga 144 ttt att gta ggt aat gga gaa tta atc gaa ggt ttt gaa gag gct gtt 192 ata ggc atg gaa gtt gga gaa gaa aaa act gta aca att cct cct gaa 240 aaa ggt tat gga ctt aga gat gag aga tta atc caa gaa ata cct aag 288 gaa atg ttt gct gat gct gac ttt gaa cca cag gag gga atg tta atc 336 tta gcc agt gga att cct gca aag ata ata aaa gtt act gat gat act 384 gta act tta gac ttt aac cac gag ctt gct gga aaa gaa tta aaa ttc 432 aca ata aaa gta aga gat gtc cag cca gct gag tca gaa taa 471 ＜210＞ 3 ＜211＞ 432 ＜212＞ PRT ＜213＞ Escherichia coli ＜400＞ 3 Met Gln Val Ser Val Glu Thr Thr Gln Gly Leu Gly Arg Arg Val Thr 1 5 10 15 Ile Thr Ile Ala Ala Asp Ser Ile Glu Thr Ala Val Lys Ser Glu Leu 20 25 30 Val Asn Val Ala Lys Lys Val Arg Ile Asp Gly Phe Arg Lys Gly Lys 35 40 45 Val Pro Met Asn Ile Val Ala Gln Arg Tyr Gly Ala Ser Val Arg Gln 50 55 60 Asp Val Leu Gly Asp Leu Met Ser Arg Asn Phe Ile Asp Ala Ile Ile 65 70 75 80 Lys Glu Lys Ile Asn Pro Ala Gly Ala Pro Thr Tyr Val Pro Gly Glu 85 90 95 Tyr Lys Leu Gly Glu Asp Phe Thr Tyr Ser Val Glu Phe Glu Val Tyr 100 105 110 Pro Glu Val Glu Leu Gln Gly Leu Glu Ala Ile Glu Val Glu Lys Pro 115 120 125 Ile Val Glu Val Thr Asp Ala Asp Val Asp Gly Met Leu Asp Thr Leu 130 135 140 Arg Lys Gln Gln Ala Thr Trp Lys Glu Lys Asp Gly Ala Val Glu Ala 145 150 155 160 Glu Asp Arg Val Thr Ile Asp Phe Thr Gly Ser Val Asp Gly Glu Glu 165 170 175 Phe Glu Gly Gly Lys Ala Ser Asp Phe Val Leu Ala Met Gly Gln Gly 180 185 190 Arg Met Ile Pro Gly Phe Glu Asp Gly Ile Lys Gly His Lys Ala Gly 195 200 205 Glu Glu Phe Thr Ile Asp Val Thr Phe Pro Glu Glu Tyr His Ala Glu 210 215 220 Asn Leu Lys Gly Lys Ala Ala Lys Phe Ala Ile Asn Leu Lys Lys Val 225 230 235 240 Glu Glu Arg Glu Leu Pro Glu Leu Thr Ala Glu Phe Ile Lys Arg Phe 245 250 255 Gly Val Glu Asp Gly Ser Val Glu Gly Leu Arg Ala Glu Val Arg Lys 260 265 270 Asn Met Glu Arg Glu Leu Lys Ser Ala Ile Arg Asn Arg Val Lys Ser 275 280 285 Gln Ala Ile Glu Gly Leu Val Lys Ala Asn Asp Ile Asp Val Pro Ala 290 295 300 Ala Leu Ile Asp Ser Glu Ile Asp Val Leu Arg Arg Gln Ala Ala Gln 305 310 315 320 Arg Phe Gly Gly Asn Glu Lys Gln Ala Leu Glu Leu Pro Arg Glu Leu 325 330 335 Phe Glu Glu Gln Ala Lys Arg Arg Val Val Val Gly Leu Leu Leu Gly 340 345 350 Glu Val Ile Arg Thr Asn Glu Leu Lys Ala Asp Glu Glu Arg Val Lys 355 360 365 Gly Leu Ile Glu Glu Met Ala Ser Ala Tyr Glu Asp Pro Lys Glu Val 370 375 380 Ile Glu Phe Tyr Ser Lys Asn Lys Glu Leu Met Asp Asn Met Arg Asn 385 390 395 400 Val Ala Leu Glu Glu Gln Ala Val Glu Ala Val Leu Ala Lys Ala Lys 405 410 415 Val Thr Glu Lys Glu Thr Thr Phe Asn Glu Leu Met Asn Gln Gln Ala 420 425 430 ＜210＞ 4 ＜211＞ 1296 ＜212＞ DNA ＜213＞ Escherichia coli ＜400＞ 4 atg caa gtt tca gtt gaa acc act caa ggc ctt ggc cgc cgt gta acg 48 att act atc gct gct gac agc atc gag acc gct gtt aaa agc gag ctg 96 gtc aac gtt gcg aaa aaa gta cgt att gac ggc ttc cgc aaa ggc aaa 144 gtg cca atg aat atc gtt gct cag cgt tat ggc gcg tct gta cgc cag 192 gac gtt ctg ggt gac ctg atg agc cgt aac ttc att gac gcc atc att 240 aaa gaa aaa atc aat ccg gct ggc gca ccg act tat gtt ccg ggc gaa 288 tac aag ctg ggt gaa gac ttc act tac tct gta gag ttt gaa gtt tat 336 ccg gaa gtt gaa ctg cag ggt ctg gaa gcg atc gaa gtt gaa aaa ccg 384 atc gtt gaa gtg acc gac gct gac gtt gac ggc atg ctg gat act ctg 432 cgt aaa cag cag gcg acc tgg aaa gaa aaa gac ggc gct gtt gaa gca 480 gaa gac cgc gta acc atc gac ttc acc ggt tct gta gac ggc gaa gag 528 ttc gaa ggc ggt aaa gcg tct gat ttc gta ctg gcg atg ggc cag ggt 576 cgt atg atc ccg ggc ttt gaa gac ggt atc aaa ggc cac aaa gct ggc 624 gaa gag ttc acc atc gac gtg acc ttc ccg gaa gaa tac cac gca gaa 672 aac ctg aaa ggt aaa gca gcg aaa ttc gct atc aac ctg aag aaa gtt 720 gaa gag cgt gaa ctg ccg gaa ctg act gca gaa ttc atc aaa cgt ttc 768 ggc gtt gaa gat ggt tcc gta gaa ggt ctg cgc gct gaa gtg cgt aaa 816 aac atg gag cgc gag ctg aag agc gcc atc cgt aac cgc gtt aag tct 864 cag gcg atc gaa ggt ctg gta aaa gct aac gac atc gac gta ccg gct 912 gcg ctg atc gac agc gaa atc gac gtt ctg cgt cgc cag gct gca cag 960 cgt ttc ggt ggc aac gaa aaa caa gct ctg gaa ctg ccg cgc gaa ctg 1008 ttc gaa gaa cag gct aaa cgc cgc gta gtt gtt ggc ctg ctg ctg ggc 1056 gaa gtt atc cgc acc aac gag ctg aaa gct gac gaa gag cgc gtg aaa 1104 ggc ctg atc gaa gag atg gct tct gcg tac gaa gat ccg aaa gaa gtt 1152 atc gag ttc tac agc aaa aac aaa gaa ctg atg gac aac atg cgc aat 1200 gtt gct ctg gaa gaa cag gct gtt gaa gct gta ctg gcg aaa gcg aaa 1248 gtg act gaa aaa gaa acc act ttc aac gag ctg atg aac cag cag gcg 1296 taa 1299 ＜210＞ 5 ＜211＞ 459 ＜212＞ PRT ＜213＞ Homo sapiens ＜400＞ 5 Met Thr Ala Glu Glu Met Lys Ala Thr Glu Ser Gly Ala Gln Ser Ala 1 5 10 15 Pro Leu Pro Met Glu Gly Val Asp Ile Ser Pro Lys Gln Asp Glu Gly 20 25 30 Val Leu Lys Val Ile Lys Arg Glu Gly Thr Gly Thr Glu Met Pro Met 35 40 45 Ile Gly Asp Arg Val Phe Val His Tyr Thr Gly Trp Leu Leu Asp Gly 50 55 60 Thr Lys Phe Asp Ser Ser Leu Asp Arg Lys Asp Lys Phe Ser Phe Asp 65 70 75 80 Leu Gly Lys Gly Glu Val Ile Lys Ala Trp Asp Ile Ala Ile Ala Thr 85 90 95 Met Lys Val Gly Glu Val Cys His Ile Thr Cys Lys Pro Glu Tyr Ala 100 105 110 Tyr Gly Ser Ala Gly Ser Pro Pro Lys Ile Pro Pro Asn Ala Thr Leu 115 120 125 Val Phe Glu Val Glu Leu Phe Glu Phe Lys Gly Glu Asp Leu Thr Glu 130 135 140 Glu Glu Asp Gly Gly Ile Ile Arg Arg Ile Gln Thr Arg Gly Glu Gly 145 150 155 160 Tyr Ala Lys Pro Asn Glu Gly Ala Ile Val Glu Val Ala Leu Glu Gly 165 170 175 Tyr Tyr Lys Asp Lys Leu Phe Asp Gln Arg Glu Leu Arg Phe Glu Ile 180 185 190 Gly Glu Gly Glu Asn Leu Asp Leu Pro Tyr Gly Leu Glu Arg Ala Ile 195 200 205 Gln Arg Met Glu Lys Gly Glu His Ser Ile Val Tyr Leu Lys Pro Ser 210 215 220 Tyr Ala Phe Gly Ser Val Gly Lys Glu Lys Phe Gln Ile Pro Pro Asn 225 230 235 240 Ala Glu Leu Lys Tyr Glu Leu His Leu Lys Ser Phe Glu Lys Ala Lys 245 250 255 Glu Ser Trp Glu Met Asn Ser Glu Glu Lys Leu Glu Gln Ser Thr Ile 260 265 270 Val Lys Glu Arg Gly Thr Val Tyr Phe Lys Glu Gly Lys Tyr Lys Gln 275 280 285 Ala Leu Leu Gln Tyr Lys Lys Ile Val Ser Trp Leu Glu Tyr Glu Ser 290 295 300 Ser Phe Ser Asn Glu Glu Ala Gln Lys Ala Gln Ala Leu Arg Leu Ala 305 310 315 320 Ser His Leu Asn Leu Ala Met Cys His Leu Lys Leu Gln Ala Phe Ser 325 330 335 Ala Ala Ile Glu Ser Cys Asn Lys Ala Leu Glu Leu Asp Ser Asn Asn 340 345 350 Glu Lys Gly Leu Phe Arg Arg Gly Glu Ala His Leu Ala Val Asn Asp 355 360 365 Phe Glu Leu Ala Arg Ala Asp Phe Gln Lys Val Leu Gln Leu Tyr Pro 370 375 380 Asn Asn Lys Ala Ala Lys Thr Gln Leu Ala Val Cys Gln Gln Arg Ile 385 390 395 400 Arg Arg Gln Leu Ala Arg Glu Lys Lys Leu Tyr Ala Asn Met Phe Glu 405 410 415 Arg Leu Ala Glu Glu Glu Asn Lys Ala Lys Ala Glu Ala Ser Ser Gly 420 425 430 Asp His Pro Thr Asp Thr Glu Met Lys Glu Glu Gln Lys Ser Asn Thr 435 440 445 Ala Gly Ser Gln Ser Gln Val Glu Thr Glu Ala 450 455 ＜210＞ 6 ＜211＞ 1377 ＜212＞ DNA ＜213＞ Homo sapiens ＜400＞ 6 atg aca gcc gag gag atg aag gcg acc gag agc ggg gcg cag tcg gcg 48 ccg ctg ccc atg gag gga gtg gac atc agc ccc aaa cag gac gaa ggc 96 gtg ctg aag gtc atc aag aga gag ggc aca ggt aca gag atg ccc atg 144 att ggg gac cga gtc ttt gtc cac tac act ggc tgg cta tta gat ggc 192 aca aag ttt gac tcc agt ctg gat cgc aag gac aaa ttc tcc ttt gac 240 ctg gga aaa ggg gag gtc atc aag gct tgg gac att gcc ata gcc acc 288 atg aag gtg ggg gag gtg tgc cac atc acc tgc aaa cca gaa tat gcc 336 tac ggt tca gca ggc agt cct cca aag att ccc ccc aat gcc acg ctt 384 gta ttt gag gtg gag ttg ttt gag ttt aag gga gaa gat ctg acg gaa 432 gag gaa gat ggc gga atc att cgc aga ata cag act cgc ggt gaa ggc 480 tat gct aag ccc aat gag ggt gct atc gtg gag gtt gca ctg gaa ggg 528 tac tac aag gac aag ctc ttt gac cag cgg gag ctc cgc ttt gag att 576 ggc gag ggg gag aac ctg gat ctg cct tat ggt ctg gag agg gcc att 624 cag cgc atg gag aaa gga gaa cat tcc atc gtg tac ctc aag ccc agc 672 tat gct ttt ggc agt gtt ggg aag gaa aag ttc caa atc cca cca aat 720 gct gag ctg aaa tat gaa tta cac ctc aag agt ttt gaa aag gcc aag 768 gag tct tgg gag atg aat tca gaa gag aag ctg gaa cag agc acc ata 816 gtg aaa gag cgg ggc act gtg tac ttc aag gaa ggt aaa tac aag caa 864 gct tta cta cag tat aag aag atc gtg tct tgg ctg gaa tat gag tct 912 agt ttt tcc aat gag gaa gca cag aaa gca cag gcc ctt cga ctg gcc 960 tct cac ctc aac ctg gcc atg tgt cat ctg aaa cta cag gcc ttc tct 1008 gct gcc att gaa agc tgt aac aag gcc cta gaa ctg gac agc aac aac 1056 gag aag ggc ctc ttc cgc cgg gga gag gcc cac ctg gcc gtg aat gac 1104 ttt gaa ctg gca cgg gct gat ttc cag aag gtc ctg cag ctc tac ccc 1152 aac aac aaa gcc gcc aag acc cag ctg gct gtg tgc cag cag cgg atc 1200 cga agg cag ctt gcc cgg gag aag aag ctc tat gcc aat atg ttt gag 1248 agg ctg gct gag gag gag aac aag gcc aag gca gag gct tcc tca gga 1296 gac cat ccc act gac aca gag atg aag gag gag cag aag agc aac acg 1344 gca ggg agc cag tct cag gtg gag aca gaa gca tag 1377

【図面の簡単な説明】

【図１】サーモコッカスｓｐ．ＫＳ−１由来ＦＫＢＰタ
イプＰＰＩａｓｅのシャペロン様活性を示す図である。

【図２】古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとマウス由
来Ａｎｔｉ−ＨＥＬ−Ｆａｂの共発現を示す図である。

【図３】共発現で得られたＡｎｔｉ−ＨＥＬ−Ｆａｂの
活性を示す図である。

【図４】封入体をリフォールディングして得られたＡｎ
ｔｉ−ＨＥＬ−Ｆａｂの活性を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:01） 5/00 Ａ (72)発明者丸山正岩手県釜石市平田第３地割75番１株式会社バイオテクノロジー研究所釜石研究所内 (72)発明者古谷昌弘大阪府三島郡島本町百山２−１積水化学工業株式会社内Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA20 BA07 BA43 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 4B050 CC07 DD02 EE10 LL05 4B064 AG27 CA02 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01Y AA26X AA91Y AB01 AC14 BA02 BC50 CA25 CA44 CA46 4H045 AA20 BA10 CA11 CA42 DA76 DA89 EA20 EA50 FA67 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】抗体遺伝子とシャペロン様活性を有する
ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子とを含む形質転換体。
【請求項２】請求項１に記載の形質転換体を培養し
て、抗体遺伝子とシャペロン様活性を有するＰＰＩａｓ
ｅをコードする遺伝子とを形質転換体内で共発現させ、
モノクローナル抗体を可溶画分として産生させることを
特徴とするモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項３】シャペロン様活性を有するＰＰＩａｓｅ
をコードする遺伝子が、古細菌由来ＦＫＢＰタイプＰＰ
Ｉａｓｅ遺伝子、バクテリア由来トリガーファクタータ
イプＰＰＩａｓｅ遺伝子、及び真核生物由来ＦＫＢＰ５
２タイプＰＰＩａｓｅ遺伝子からなる群から選ばれた少
なくとも１種であることを特徴とする請求項１又は２に
記載のモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項４】古細菌由来ＦＫＢＰタイプＰＰＩａｓｅ
遺伝子が、１６〜１８ｋＤａの古細菌由来ＦＫＢＰタイ
プＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子であることを特徴と
する請求項３に記載のモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項５】抗体遺伝子が、Ｆａｂ遺伝子であること
を特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノ
クローナル抗体の製造方法。
【請求項６】Ｆａｂ遺伝子が、マウスＩｇＧ由来Ｆａ
ｂ遺伝子であることを特徴とする請求項５に記載のモノ
クローナル抗体の製造方法。
【請求項７】インクルージョンボディとして発現させ
たモノクローナル抗体を、変性剤によって可溶化させ、
さらにシャペロン様活性を有するＰＰＩａｓｅの共存下
でフォールディングさせることを特徴とするモノクロー
ナル抗体の製造方法。
【請求項８】シャペロン様活性を有するＰＰＩａｓｅ
が、古細菌由来ＦＫＢＰタイプＰＰＩａｓｅ、バクテリ
ア由来トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅ、及び真
核生物由来ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅからなる群
から選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする請
求項７に記載のモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項９】古細菌由来ＦＫＢＰタイプＰＰＩａｓｅ
が、１６〜１８ｋＤａの古細菌由来ＦＫＢＰタイプＰＰ
Ｉａｓｅであることを特徴とする請求項８に記載のモノ
クローナル抗体の製造方法。
【請求項１０】モノクローナル抗体が、Ｆａｂである
ことを特徴とする請求項７〜９のいずれか１項に記載の
モノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１１】Ｆａｂが、マウスＩｇＧ由来のＦａｂ
であることを特徴とする請求項１０に記載のモノクロー
ナル抗体の製造方法。