JP2000157268A - Ｈｉｖ―１ｏ群の検出用のペプチド - Google Patents
Ｈｉｖ―１ｏ群の検出用のペプチドInfo
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- C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
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- G01N2333/16—HIV-1, HIV-2
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Abstract
(57)【要約】
本発明はペプチドとそれらの調製に関する。前記各ペプ
チドは、ＨＩＶ−１のＯ群gp41エンベロープタンパク質
の免疫優性領域に相当する配列を有する。前記配列は、
それがどんな既知の天然Ｏ群配列または変異体にも一致
しないことにより特徴づけられる。更に、前記ペプチド
は抗ＨＩＶ−１ Ｏ群抗体を結合する。そのようなペプ
チドは幾つかの用途があり、その例としてはＨＩＶ−１
のＯ群感染に応答して生産される抗体の検出が挙げられ
る。前記ペプチドをモザイク中に組み込みそして組換え
発現せしめることもできる。
チドは、ＨＩＶ−１のＯ群gp41エンベロープタンパク質
の免疫優性領域に相当する配列を有する。前記配列は、
それがどんな既知の天然Ｏ群配列または変異体にも一致
しないことにより特徴づけられる。更に、前記ペプチド
は抗ＨＩＶ−１ Ｏ群抗体を結合する。そのようなペプ
チドは幾つかの用途があり、その例としてはＨＩＶ−１
のＯ群感染に応答して生産される抗体の検出が挙げられ
る。前記ペプチドをモザイク中に組み込みそして組換え
発現せしめることもできる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ペプチド、それら
の調製および使用に関する。各ペプチドは、ＨＩＶ−１
のＯ群のgp41エンベロープタンパク質の免疫優性（immu
nodominant）領域に相当する配列を有する。この配列
は、それが任意の既知の天然に存在するＯ群変異体には
一致しないことにより特徴づけられる。
の調製および使用に関する。各ペプチドは、ＨＩＶ−１
のＯ群のgp41エンベロープタンパク質の免疫優性（immu
nodominant）領域に相当する配列を有する。この配列
は、それが任意の既知の天然に存在するＯ群変異体には
一致しないことにより特徴づけられる。
【０００２】
【従来の技術】後天性免疫不全症候群（AIDS）として知
られるようになった病気を引き起こす原因である主な病
因物質は、レンチウイルス属に属する非形質転換レトロ
ウイルスである (1)。ヒト免疫不全ウイルスＩ型 (ＨＩ
Ｖ−１) と呼ばれるこのウイルスは、現在広く散在して
おり、それが世界中の健康や生産性に対して重大な驚異
となっている。事実上全ての工業先進国に加えて多くの
発展途上国が、汚染された血液や血液製剤の使用を通し
たこのウイルスの更なる伝染戦と病気の蔓延を防ぐため
に献血の試験を強制している。同様な病気を引き起こす
ことができ、関連しているが遺伝的には別々であり、あ
まり広範囲に散在しておらず、且つ病理学的には侵略性
が低いウイルスが1986年に報告されており、このウイル
スはＨＩＶ−２と呼ばれる (2)。ＨＩＶ−２は主として
西アフリカに見られ、ＨＩＶ−１よりは広く散在してい
ないけれども、多くの国がこのウイルスに対する抗体に
ついても同様に献血のスクリーニングを要求している。
ＨＩＶ−１はヨーロッパ特許第178 978 号公報に開示さ
れており、ＨＩＶ−２はヨーロッパ特許第0 239 425号
公報に開示されている。
られるようになった病気を引き起こす原因である主な病
因物質は、レンチウイルス属に属する非形質転換レトロ
ウイルスである (1)。ヒト免疫不全ウイルスＩ型 (ＨＩ
Ｖ−１) と呼ばれるこのウイルスは、現在広く散在して
おり、それが世界中の健康や生産性に対して重大な驚異
となっている。事実上全ての工業先進国に加えて多くの
発展途上国が、汚染された血液や血液製剤の使用を通し
たこのウイルスの更なる伝染戦と病気の蔓延を防ぐため
に献血の試験を強制している。同様な病気を引き起こす
ことができ、関連しているが遺伝的には別々であり、あ
まり広範囲に散在しておらず、且つ病理学的には侵略性
が低いウイルスが1986年に報告されており、このウイル
スはＨＩＶ−２と呼ばれる (2)。ＨＩＶ−２は主として
西アフリカに見られ、ＨＩＶ−１よりは広く散在してい
ないけれども、多くの国がこのウイルスに対する抗体に
ついても同様に献血のスクリーニングを要求している。
ＨＩＶ−１はヨーロッパ特許第178 978 号公報に開示さ
れており、ＨＩＶ−２はヨーロッパ特許第0 239 425号
公報に開示されている。
【０００３】ヒト免疫不全ウイルスに特有である１つの
特徴は、それらが配列可変性であることである。全ての
ＨＩＶのゲノムが逆転写酵素をコードしている。ウイル
スが宿主細胞ＤＮＡ中への組込みに先立ってそのＲＮＡ
ゲノムを二本鎖ＤＮＡ相当物へと変換するのに必要とす
るこの酵素は、ウイルス複製にとって不可欠である。多
くのポリメラーゼとは異なり、このMg2+依存性酵素は、
通常はプルーフリーディング機能を果たす３′→５′エ
キソヌクレアーゼ活性を欠いている。結果として、この
酵素は誤りがちな（error-prone ）傾向を有する。ＨＩ
Ｖに感染したいずれの個体の中にも、多数の該ウイルス
の天然の配列変異体が観察され得るが、その全てが生存
可能であるわけではない。この観察は、準種（quasi-sp
ecies ）という疑念を引き起こした。準種という語は、
その全てが密接に関連しており天然に存在する配列変異
体の１集団として個体に感染するＨＩＶの特定の株を記
載するのに用いられる (3)。
特徴は、それらが配列可変性であることである。全ての
ＨＩＶのゲノムが逆転写酵素をコードしている。ウイル
スが宿主細胞ＤＮＡ中への組込みに先立ってそのＲＮＡ
ゲノムを二本鎖ＤＮＡ相当物へと変換するのに必要とす
るこの酵素は、ウイルス複製にとって不可欠である。多
くのポリメラーゼとは異なり、このMg2+依存性酵素は、
通常はプルーフリーディング機能を果たす３′→５′エ
キソヌクレアーゼ活性を欠いている。結果として、この
酵素は誤りがちな（error-prone ）傾向を有する。ＨＩ
Ｖに感染したいずれの個体の中にも、多数の該ウイルス
の天然の配列変異体が観察され得るが、その全てが生存
可能であるわけではない。この観察は、準種（quasi-sp
ecies ）という疑念を引き起こした。準種という語は、
その全てが密接に関連しており天然に存在する配列変異
体の１集団として個体に感染するＨＩＶの特定の株を記
載するのに用いられる (3)。
【０００４】感染個体に見つかる天然の配列変異体に加
えて、世界中から集められたＨＩＶ−１株の系統分析か
ら、それらの株が配列の類似性に基づいて少なくとも９
つの型（Ａ〜Ｉ）に分類できることが証明された (4)。
型間の相違は、一人の感染した人の中での個々のウイル
ス変異体間に観察される相違、または同じ型に属する別
の変異体間の相違よりも大きい。それらのＨＩＶ−１型
の地理的分布は大きく異なっており、ある型は特定の地
理的領域で流行しているが別の領域では稀であるかまた
は存在しない。集約すると、それらのＨＩＶ−１型は１
つの群を形成していると考えられ、その群は一般にＭ群
（Ｍ＝major ）と称される。
えて、世界中から集められたＨＩＶ−１株の系統分析か
ら、それらの株が配列の類似性に基づいて少なくとも９
つの型（Ａ〜Ｉ）に分類できることが証明された (4)。
型間の相違は、一人の感染した人の中での個々のウイル
ス変異体間に観察される相違、または同じ型に属する別
の変異体間の相違よりも大きい。それらのＨＩＶ−１型
の地理的分布は大きく異なっており、ある型は特定の地
理的領域で流行しているが別の領域では稀であるかまた
は存在しない。集約すると、それらのＨＩＶ−１型は１
つの群を形成していると考えられ、その群は一般にＭ群
（Ｍ＝major ）と称される。
【０００５】1987年に、一般に遭遇するＨＩＶ株とは容
易に免疫学的に識別できるＨＩＶ−１の高度に分岐した
変異体が単離された (5)。この変異体はヨーロッパ特許
第0345 375 号公報、米国特許第5,304,466 号および米
国特許第5,567,603 号明細書に記載されている。このウ
イルス (ANT70)は、抗原上はＨＩＶ−２よりもＨＩＶ−
１参考株に類似していたが、それにもかかわらず明らか
に大きく異なっていた。その後、完全なプロウイルスの
配列が決定された (6)。このウイルスのゲノム構成はこ
の分離株がＨＩＶ−１であることを確証し、その配列と
多数の他の参考株の配列との比較はこのウイルスが高度
に分岐していることを示し、系統分析はこの分離株をＨ
ＩＶ系統樹のそれ自体ユニークな枝に配置した。
易に免疫学的に識別できるＨＩＶ−１の高度に分岐した
変異体が単離された (5)。この変異体はヨーロッパ特許
第0345 375 号公報、米国特許第5,304,466 号および米
国特許第5,567,603 号明細書に記載されている。このウ
イルス (ANT70)は、抗原上はＨＩＶ−２よりもＨＩＶ−
１参考株に類似していたが、それにもかかわらず明らか
に大きく異なっていた。その後、完全なプロウイルスの
配列が決定された (6)。このウイルスのゲノム構成はこ
の分離株がＨＩＶ−１であることを確証し、その配列と
多数の他の参考株の配列との比較はこのウイルスが高度
に分岐していることを示し、系統分析はこの分離株をＨ
ＩＶ系統樹のそれ自体ユニークな枝に配置した。
【０００６】1991年に、第二の高度に分岐したＨＩＶ−
１株（MVP5180 ）が単離されそして記載された (7)。こ
の分離株はヨーロッパ特許第0 591 914 号公報に開示さ
れており、これはANT70 と系統的に集団（クラスター）
を形成していることがわかった。それらの２つの分離株
間の遺伝的距離は、Ｍ群に属するウイルス型間の距離と
ほぼ同じくらい大きかった。これらの２つの分離株は一
緒にＨＩＶ−１分離株の新しい群を限定した。それらの
分離株は従来のＨＩＶ−１分離株の通常の集団の外側に
集団化しているので、それらは一般にＯ群（Ｏ＝outlie
r ）と称される新しい群を構成する。
１株（MVP5180 ）が単離されそして記載された (7)。こ
の分離株はヨーロッパ特許第0 591 914 号公報に開示さ
れており、これはANT70 と系統的に集団（クラスター）
を形成していることがわかった。それらの２つの分離株
間の遺伝的距離は、Ｍ群に属するウイルス型間の距離と
ほぼ同じくらい大きかった。これらの２つの分離株は一
緒にＨＩＶ−１分離株の新しい群を限定した。それらの
分離株は従来のＨＩＶ−１分離株の通常の集団の外側に
集団化しているので、それらは一般にＯ群（Ｏ＝outlie
r ）と称される新しい群を構成する。
【０００７】1992年に、フランスでＯ群の株に感染した
三番目の人が確認された (8)。免疫学的に重要なウイル
ス env遺伝子の配列が決定され、WO 96/12809 に記載さ
れた。続いて、フランスで数人の追加のＯ群感染患者が
確認され、それらの分離株のウイルス envタンパク質の
部分配列も決定された。それらの配列はPCT/FR96/00294
に記載された。入手可能な全ての配列の分析は、それら
がＯ群に相当する系統樹の枝において一緒に集団を形成
することを示した。Ｍ群とは異なり、Ｏ群内の個別的な
ウイルス型の存在についての証拠はほとんどないようで
ある。フランスのＶＡＵ分離株を除いて、Ｏ群分離株の
事実上全てが今日まで西〜中央アフリカへの関連性を共
有している。アフリカのこの地域では、ＨＩＶ−１感染
の全症例の５％〜８％がＯ群変異体により引き起こされ
ると見積もられているが、しかしこの比率は特定の地理
的領域に強く依存している（10, 11）。
三番目の人が確認された (8)。免疫学的に重要なウイル
ス env遺伝子の配列が決定され、WO 96/12809 に記載さ
れた。続いて、フランスで数人の追加のＯ群感染患者が
確認され、それらの分離株のウイルス envタンパク質の
部分配列も決定された。それらの配列はPCT/FR96/00294
に記載された。入手可能な全ての配列の分析は、それら
がＯ群に相当する系統樹の枝において一緒に集団を形成
することを示した。Ｍ群とは異なり、Ｏ群内の個別的な
ウイルス型の存在についての証拠はほとんどないようで
ある。フランスのＶＡＵ分離株を除いて、Ｏ群分離株の
事実上全てが今日まで西〜中央アフリカへの関連性を共
有している。アフリカのこの地域では、ＨＩＶ−１感染
の全症例の５％〜８％がＯ群変異体により引き起こされ
ると見積もられているが、しかしこの比率は特定の地理
的領域に強く依存している（10, 11）。
【０００８】Ｍ群株とＯ群株との間には病理学または病
気進行の面から有意な相違はないように見えるが、血清
試験に使用する抗原がＭ群株からのみ誘導される場合に
は、Ｏ群感染に応答して生産される抗体の検出は信頼で
きないことがある（12, 13）。Ｏ群抗原に対して生産さ
れる抗体はしばしば対応するＭ群抗原と交差反応するだ
ろうが、抗Ｏ群抗体に対する感受性は、その試験にＯ群
抗原を取り入れることにより大きく改善することができ
る。
気進行の面から有意な相違はないように見えるが、血清
試験に使用する抗原がＭ群株からのみ誘導される場合に
は、Ｏ群感染に応答して生産される抗体の検出は信頼で
きないことがある（12, 13）。Ｏ群抗原に対して生産さ
れる抗体はしばしば対応するＭ群抗原と交差反応するだ
ろうが、抗Ｏ群抗体に対する感受性は、その試験にＯ群
抗原を取り入れることにより大きく改善することができ
る。
【０００９】ＨＩＶ−１の群および型の存在は十分に確
立されているけれども、ＨＩＶ−１Ｍ群の特定の型に便
利に割り当てることのできない、確認される分離株が増
加してきている。配列分析を通して、それらの分離株は
２以上の異なる型に属するウイルス間の組換えの産物で
あることを証明することができる。ある場合には、「モ
ザイク」ゲノムをもたらす複雑な組換え現象が起こった
に違いない。１人の患者に複数の型が共存することが示
され、そして１人の患者にＯ群株と共に多数のＭ群型が
共存することが示されている（14, 15）。また、Ｍ群株
とＯ群株のゲノムは非常に高度に保存される領域を共有
しているので、おそらくそれらのウイルス間でも同様に
理に適った組換えが起こり得るだろう。
立されているけれども、ＨＩＶ−１Ｍ群の特定の型に便
利に割り当てることのできない、確認される分離株が増
加してきている。配列分析を通して、それらの分離株は
２以上の異なる型に属するウイルス間の組換えの産物で
あることを証明することができる。ある場合には、「モ
ザイク」ゲノムをもたらす複雑な組換え現象が起こった
に違いない。１人の患者に複数の型が共存することが示
され、そして１人の患者にＯ群株と共に多数のＭ群型が
共存することが示されている（14, 15）。また、Ｍ群株
とＯ群株のゲノムは非常に高度に保存される領域を共有
しているので、おそらくそれらのウイルス間でも同様に
理に適った組換えが起こり得るだろう。
【００１０】ＨＩＶ感染に応答して生産される抗体の検
出用に好ましい抗原は、ウイルスエンベロープタンパク
質の膜貫通部分である。gp41と呼ばれるこのタンパク質
は、感染細胞中で細胞性プロテアーゼによりgp160 前駆
体から開裂される。このタンパク質は、ウイルスが新し
い宿主細胞と融合しそして宿主細胞中に侵入するために
必要とするウイルス融合ペプチドをＮ末端に含む。それ
は表面エンベロープ糖タンパク質 gp120のためのアンカ
ーも提供する。gp120 は、感受性細胞の表面上に存在す
るCD4 とウイルスのコレセプターを認識する働きをす
る。しかしながら、gp120 とgp41の間の相互作用は非共
有結合であり従って幾らか不安定である。gp41タンパク
質は、それ自体で疎水性膜貫通領域によってウイルスま
たは細胞膜に固定される。
出用に好ましい抗原は、ウイルスエンベロープタンパク
質の膜貫通部分である。gp41と呼ばれるこのタンパク質
は、感染細胞中で細胞性プロテアーゼによりgp160 前駆
体から開裂される。このタンパク質は、ウイルスが新し
い宿主細胞と融合しそして宿主細胞中に侵入するために
必要とするウイルス融合ペプチドをＮ末端に含む。それ
は表面エンベロープ糖タンパク質 gp120のためのアンカ
ーも提供する。gp120 は、感受性細胞の表面上に存在す
るCD4 とウイルスのコレセプターを認識する働きをす
る。しかしながら、gp120 とgp41の間の相互作用は非共
有結合であり従って幾らか不安定である。gp41タンパク
質は、それ自体で疎水性膜貫通領域によってウイルスま
たは細胞膜に固定される。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】このタンパク質の詳細
な三次元構造はほとんど知られていない。このタンパク
質の細胞外領域に関する限定量の構造情報がBrookhaven
Protein Data Baseから入手可能である。しかしなが
ら、gp41の免疫学的に最も重要な領域の情報は欠けてお
り、これは多分、非常に移動性であるので鏡映を生成で
きないためであろう。この免疫学的に重要な領域に相当
するウイルスgp41アミノ酸配列の比較は、恐らくジスル
フィド結合で安定化された堅固なループの最上部にある
部分において、非常に高度に保存されたアミノ酸の存在
を明らかにする。このことは、それらのアミノ酸が不可
欠な構造的および機能的役割を果たしていることを示唆
する。
な三次元構造はほとんど知られていない。このタンパク
質の細胞外領域に関する限定量の構造情報がBrookhaven
Protein Data Baseから入手可能である。しかしなが
ら、gp41の免疫学的に最も重要な領域の情報は欠けてお
り、これは多分、非常に移動性であるので鏡映を生成で
きないためであろう。この免疫学的に重要な領域に相当
するウイルスgp41アミノ酸配列の比較は、恐らくジスル
フィド結合で安定化された堅固なループの最上部にある
部分において、非常に高度に保存されたアミノ酸の存在
を明らかにする。このことは、それらのアミノ酸が不可
欠な構造的および機能的役割を果たしていることを示唆
する。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明は、ペプチド、そ
れらの調製および使用に関する。各ペプチドはＨＩＶ−
１のＯ群 gp41 エンベロープタンパク質の免疫優性領域
に相当する配列を有する。それらの配列は、天然に存在
する既知のＯ群変異体のいずれにも一致しないことによ
り特徴づけられる。
れらの調製および使用に関する。各ペプチドはＨＩＶ−
１のＯ群 gp41 エンベロープタンパク質の免疫優性領域
に相当する配列を有する。それらの配列は、天然に存在
する既知のＯ群変異体のいずれにも一致しないことによ
り特徴づけられる。
【００１３】別の面では、本発明は抗原性である前記ペ
プチドに関する。好ましくは、それは抗ＨＩＶ−１ Ｏ
群抗体と結合する。更に別の面では、本発明は、ＨＩＶ
−１のＯ群感染に応答して生産される抗体の検出のため
の前記ペプチドの使用に関する。
プチドに関する。好ましくは、それは抗ＨＩＶ−１ Ｏ
群抗体と結合する。更に別の面では、本発明は、ＨＩＶ
−１のＯ群感染に応答して生産される抗体の検出のため
の前記ペプチドの使用に関する。
【００１４】更に別の面では、本発明は、前記ペプチド
またはその類似体を含んで成る、ＨＩＶ−１のＯ群抗体
の存在を検出するための組成物およびキットに関する。
更に別の面では、抗ＨＩＶ−１ Ｏ群抗体、前記ペプチ
ドを使ったそれらの生産、並びにＨＩＶ−１抗原および
ＨＩＶ−１感染の検出におけるそれらの使用に関する。
またはその類似体を含んで成る、ＨＩＶ−１のＯ群抗体
の存在を検出するための組成物およびキットに関する。
更に別の面では、抗ＨＩＶ−１ Ｏ群抗体、前記ペプチ
ドを使ったそれらの生産、並びにＨＩＶ−１抗原および
ＨＩＶ−１感染の検出におけるそれらの使用に関する。
【００１５】本明細書中で「ペプチド147 」と称する好
ましいペプチドは、下記のアミノ酸配列を有する：ＮＱ
ＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ（アミノ
末端が配列の左端である）。このペプチドは、その使用
を促進するような性質を付与するために、一方の末端の
ところで化学的に修飾されてもよく（16）、例えばＮ末
端アセチル化、ビオチン化、または固相もしくは担体に
前記ペプチドを固定するのに使われる官能基と前記ペプ
チドとの間に物理的距離を提供するためのスペーサーア
ームの付加を行ってもよい。
ましいペプチドは、下記のアミノ酸配列を有する：ＮＱ
ＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ（アミノ
末端が配列の左端である）。このペプチドは、その使用
を促進するような性質を付与するために、一方の末端の
ところで化学的に修飾されてもよく（16）、例えばＮ末
端アセチル化、ビオチン化、または固相もしくは担体に
前記ペプチドを固定するのに使われる官能基と前記ペプ
チドとの間に物理的距離を提供するためのスペーサーア
ームの付加を行ってもよい。
【００１６】ペプチド147 の他に、ペプチド147 のアミ
ノ酸配列の幾つかの変異体も有用であることがわかっ
た。ペプチド147 に関連する好ましいペプチドは下記の
配列を有する：ＸＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴ
ＳＡＲＷＨここで、ＸはＬ−アスパラギン以外の任意の
天然アミノ酸または非天然アミノ酸（即ち20種類の認識
される天然アミノ酸に含まれないもの）であってもよい
が、天然に存在してもよくまたは人為的デザインによる
ものであってもよい。
ノ酸配列の幾つかの変異体も有用であることがわかっ
た。ペプチド147 に関連する好ましいペプチドは下記の
配列を有する：ＸＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴ
ＳＡＲＷＨここで、ＸはＬ−アスパラギン以外の任意の
天然アミノ酸または非天然アミノ酸（即ち20種類の認識
される天然アミノ酸に含まれないもの）であってもよい
が、天然に存在してもよくまたは人為的デザインによる
ものであってもよい。
【００１７】ペプチド147 に関連する別のペプチドは次
のアミノ酸配列を有する：ＥＴＬＭＱＸＱＱＲＬＮＳＷ
ＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨここでＸはＬ−アスパ
ラギン以外の任意の天然アミノ酸または非天然アミノ酸
を表す。
のアミノ酸配列を有する：ＥＴＬＭＱＸＱＱＲＬＮＳＷ
ＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨここでＸはＬ−アスパ
ラギン以外の任意の天然アミノ酸または非天然アミノ酸
を表す。
【００１８】前記の好ましいペプチドはいずれも、その
使用を促進するような性質を付与するために、それらの
アミノ末端またはカルボキシ末端のところで化学的に修
飾されてもよく、例えばＮ末端アセチル化、ビオチン
化、または固相もしくは担体に前記ペプチドを固定する
のに使われる官能基と前記ペプチドとの間に物理的距離
を提供するためのスペーサーアームの付加を行うことが
できる。
使用を促進するような性質を付与するために、それらの
アミノ末端またはカルボキシ末端のところで化学的に修
飾されてもよく、例えばＮ末端アセチル化、ビオチン
化、または固相もしくは担体に前記ペプチドを固定する
のに使われる官能基と前記ペプチドとの間に物理的距離
を提供するためのスペーサーアームの付加を行うことが
できる。
【００１９】本発明は更にモザイクの調製にも関する。
モザイクは、Ｍ群免疫優性領域がＯ様免疫優性配列によ
り置き換えられている組換えＭ群gp41タンパク質であ
る。免疫優性領域の下流に位置するα−ヘリックス抗原
性領域も、それが抗Ｏ群抗体により認識される可能性を
増加させるように変更したが、該タンパク質のヘリック
ス間相互作用および構造的安定化に必要なアミノ酸は保
持した。従って、得られた組換え体は、人工的に作製さ
れた天然に存在しないＭ群／Ｏ群ハイブリッドである。
モザイクは、Ｍ群免疫優性領域がＯ様免疫優性配列によ
り置き換えられている組換えＭ群gp41タンパク質であ
る。免疫優性領域の下流に位置するα−ヘリックス抗原
性領域も、それが抗Ｏ群抗体により認識される可能性を
増加させるように変更したが、該タンパク質のヘリック
ス間相互作用および構造的安定化に必要なアミノ酸は保
持した。従って、得られた組換え体は、人工的に作製さ
れた天然に存在しないＭ群／Ｏ群ハイブリッドである。
【００２０】別の面では、本発明は、ＨＩＶ−１のＯ群
感染に応答して生産される抗体の検出のための前記組換
えタンパク質の使用に関する。別の面では、本発明は、
抗ＨＩＶ−１ Ｏ群抗体を優先的に結合する前記組換え
タンパク質に関する。
感染に応答して生産される抗体の検出のための前記組換
えタンパク質の使用に関する。別の面では、本発明は、
抗ＨＩＶ−１ Ｏ群抗体を優先的に結合する前記組換え
タンパク質に関する。
【００２１】更に別の面では、本発明は、前記組換えタ
ンパク質を含んで成る、ＨＩＶ−１のＯ群抗体の存在を
測定するための組成物およびキットに関する。更に別の
面では、本発明は、抗ＨＩＶ−１ Ｏ群抗体、前記組換
えタンパク質を使ったそれらの生産、並びにＨＩＶ−１
抗原およびＨＩＶ−１感染の検出のためのそれらの使用
に関する。
ンパク質を含んで成る、ＨＩＶ−１のＯ群抗体の存在を
測定するための組成物およびキットに関する。更に別の
面では、本発明は、抗ＨＩＶ−１ Ｏ群抗体、前記組換
えタンパク質を使ったそれらの生産、並びにＨＩＶ−１
抗原およびＨＩＶ−１感染の検出のためのそれらの使用
に関する。
【００２２】好ましいＯ群置換配列は下記のものであ
る： i) ＲＡＲＬＱＡＬＥＴＬＭＱＮＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫ
ＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，および ii) ＤＱＱＶＮＮＶＳＳＩＩＹＤＫＩＬＥＡＱＤＱＱＥ
ＥＮＶＲＥＬＬＥＬＤ（ここでアミノ末端は配列の左端
である）。
る： i) ＲＡＲＬＱＡＬＥＴＬＭＱＮＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫ
ＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，および ii) ＤＱＱＶＮＮＶＳＳＩＩＹＤＫＩＬＥＡＱＤＱＱＥ
ＥＮＶＲＥＬＬＥＬＤ（ここでアミノ末端は配列の左端
である）。
【００２３】組換えタンパク質は、その使用を促進する
ような性質を付与するために、いずれかの末端のところ
で化学的に修飾されてもよく、例えばＮ末端アセチル
化、ビオチン化、または固相もしくは担体に前記ペプチ
ドを固定するのに使われる官能基と前記ペプチドとの間
に物理的距離を提供するためのスペーサーアームの付加
を行うことができる。
ような性質を付与するために、いずれかの末端のところ
で化学的に修飾されてもよく、例えばＮ末端アセチル
化、ビオチン化、または固相もしくは担体に前記ペプチ
ドを固定するのに使われる官能基と前記ペプチドとの間
に物理的距離を提供するためのスペーサーアームの付加
を行うことができる。
【００２４】別の面では、本発明は、前記ペプチドまた
は前記組換えタンパク質および別の抗ＨＩＶ−１型抗体
に向けられた１または複数の抗原、を含んで成る組成物
およびキットに関する。更に別の面では、本発明は、別
のＨＩＶ−１型抗体に向けられた１または複数の抗原と
組み合わせて、前記ペプチドまたは前記組換えタンパク
質を使ってＨＩＶ−１感染を検出する方法に関する。
は前記組換えタンパク質および別の抗ＨＩＶ−１型抗体
に向けられた１または複数の抗原、を含んで成る組成物
およびキットに関する。更に別の面では、本発明は、別
のＨＩＶ−１型抗体に向けられた１または複数の抗原と
組み合わせて、前記ペプチドまたは前記組換えタンパク
質を使ってＨＩＶ−１感染を検出する方法に関する。
【００２５】
【発明の実施態様】本明細書中で用いる「試料」という
語は、着目の分析物を含有すると思われる任意の物質を
指す。試料は生物学的液体、例えば全血または全血成
分、例えば赤血球、白血球、血小板、血清および血漿、
腹水、尿、脳脊髄液、並びに着目の分析物を含み得る他
の体内成分であることができる。
語は、着目の分析物を含有すると思われる任意の物質を
指す。試料は生物学的液体、例えば全血または全血成
分、例えば赤血球、白血球、血小板、血清および血漿、
腹水、尿、脳脊髄液、並びに着目の分析物を含み得る他
の体内成分であることができる。
【００２６】本明細書中で用いる「抗体」はモノクロー
ナル抗体またはポリクローナル抗体であることができ、
そして例えばヒト、ラット、マウス、ウサギ、ウマ、ヒ
ツジをはじめとする任意の種起源の抗体であるか、また
はキメラ抗体であることができる。抗体は組換えモノク
ローナル抗体または化学的に作製された抗体であること
ができる。M. Walker 他, Molec. Immunol. 26, 403-11
(1989) ; 米国特許第4,474,893 号；米国特許第4,816,
567 号および米国特許第4,676,980 号明細書を参照のこ
と。
ナル抗体またはポリクローナル抗体であることができ、
そして例えばヒト、ラット、マウス、ウサギ、ウマ、ヒ
ツジをはじめとする任意の種起源の抗体であるか、また
はキメラ抗体であることができる。抗体は組換えモノク
ローナル抗体または化学的に作製された抗体であること
ができる。M. Walker 他, Molec. Immunol. 26, 403-11
(1989) ; 米国特許第4,474,893 号；米国特許第4,816,
567 号および米国特許第4,676,980 号明細書を参照のこ
と。
【００２７】本明細書中で用いる「抗原」は、適当な動
物体組織との接触の結果として、感染に対する感受性お
よび／または耐性の状態を誘導する任意の物質を指す。
「抗原性」とは、免疫原性であるかまたは抗原の性質
（非限定的に抗原を結合する抗体の生成を含む）を有す
ることを意味する。抗原はタンパク質、オリゴペプチド
またはポリペプチドであり、そして合成方法の他に組換
え技術を使って調製することができる。
物体組織との接触の結果として、感染に対する感受性お
よび／または耐性の状態を誘導する任意の物質を指す。
「抗原性」とは、免疫原性であるかまたは抗原の性質
（非限定的に抗原を結合する抗体の生成を含む）を有す
ることを意味する。抗原はタンパク質、オリゴペプチド
またはポリペプチドであり、そして合成方法の他に組換
え技術を使って調製することができる。
【００２８】本発明の目的上、遺伝暗号は縮重であるた
めに１つの特定アミノ酸をコードするのに複数のコドン
を用いることができ、従って、アミノ酸配列は１組の類
似のＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかによりコード
することができる。
めに１つの特定アミノ酸をコードするのに複数のコドン
を用いることができ、従って、アミノ酸配列は１組の類
似のＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかによりコード
することができる。
【００２９】更に、特定アミノ酸をコードする様々なコ
ドンには相当量の重複性があることが知られている。従
って本発明は、同一アミノ酸の最終的翻訳をコードする
別のコドンを含むＤＮＡ配列にも向けられる。本発明の
目的上、１または複数の置換されたコドンを有する配列
は縮重変異体として定義される。本発明の範囲内には、
発現されるタンパク質の最終的な物理的特性を実質上変
更しないＤＮＡ配列中または翻訳タンパク質中のいずれ
かの突然変異も含まれる。例えば、バリンからロイシン
への置換、アルギニンからリジンへの置換、またはアス
パラギンからグルタミンへの置換はペプチドの機能性の
変更を引き起こさないであろう。
ドンには相当量の重複性があることが知られている。従
って本発明は、同一アミノ酸の最終的翻訳をコードする
別のコドンを含むＤＮＡ配列にも向けられる。本発明の
目的上、１または複数の置換されたコドンを有する配列
は縮重変異体として定義される。本発明の範囲内には、
発現されるタンパク質の最終的な物理的特性を実質上変
更しないＤＮＡ配列中または翻訳タンパク質中のいずれ
かの突然変異も含まれる。例えば、バリンからロイシン
への置換、アルギニンからリジンへの置換、またはアス
パラギンからグルタミンへの置換はペプチドの機能性の
変更を引き起こさないであろう。
【００３０】本明細書中で用いる時、ペプチドの「機能
的誘導体」とは、本発明のペプチドの生物性に実質的に
類似している生物活性を有する化合物である。「機能的
誘導体」という語は、ペプチドの「断片」、「変異
体」、「縮重変異体」、「類似体」および「相同体」ま
たは「化学的誘導体」を含むものである。「断片」とい
う語はペプチドの任意の部分配列を指す。「変異体」と
いう語は、完全なモザイクもしくはペプチド分子のいず
れかまたはそれらの断片に対して構造上および機能上実
質的に類似している分子を指す。従って、ある分子とモ
ザイクまたはペプチド分子の両者が実質的に類似した構
造を有する場合、またはその２つの分子が類似した生物
学的活性を有する場合、その分子はモザイクまたはペプ
チドに「実質的に類似」している。従って、２つの分子
が実質的に類似した活性を有するならば、一方の分子の
構造が他方の分子中に認められなくても、または２つの
分子のアミノ酸配列が同一でなくても、それらは変異体
であると見なされる。「類似体」という語は、完全なモ
ザイクもしくはペプチドのいずれかにまたはそれらの断
片に機能の面で実質的に類似している分子を言う。
的誘導体」とは、本発明のペプチドの生物性に実質的に
類似している生物活性を有する化合物である。「機能的
誘導体」という語は、ペプチドの「断片」、「変異
体」、「縮重変異体」、「類似体」および「相同体」ま
たは「化学的誘導体」を含むものである。「断片」とい
う語はペプチドの任意の部分配列を指す。「変異体」と
いう語は、完全なモザイクもしくはペプチド分子のいず
れかまたはそれらの断片に対して構造上および機能上実
質的に類似している分子を指す。従って、ある分子とモ
ザイクまたはペプチド分子の両者が実質的に類似した構
造を有する場合、またはその２つの分子が類似した生物
学的活性を有する場合、その分子はモザイクまたはペプ
チドに「実質的に類似」している。従って、２つの分子
が実質的に類似した活性を有するならば、一方の分子の
構造が他方の分子中に認められなくても、または２つの
分子のアミノ酸配列が同一でなくても、それらは変異体
であると見なされる。「類似体」という語は、完全なモ
ザイクもしくはペプチドのいずれかにまたはそれらの断
片に機能の面で実質的に類似している分子を言う。
【００３１】組換え宿主細胞中でのペプチドの発現後、
数種類のペプチド精製方法が利用可能であり且つ使用に
好適である。例えば、塩分別、イオン交換クロマトグラ
フィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシア
パタイト吸着クロマトグラフィーおよび疎水的相互作用
クロマトグラフィーの個々の適用または様々な組合せの
適用により、細胞溶解物と抽出物から、または順化培地
から、ペプチドを精製することができる。加えて、全長
ペプチドまたは断片に特異的なモノクローナル抗体また
はポリクローナル抗体を使って調製された免疫アフィニ
ティークロマトグラフィーを使って、組換えペプチドを
その他の細胞タンパク質から分離することができる。
数種類のペプチド精製方法が利用可能であり且つ使用に
好適である。例えば、塩分別、イオン交換クロマトグラ
フィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシア
パタイト吸着クロマトグラフィーおよび疎水的相互作用
クロマトグラフィーの個々の適用または様々な組合せの
適用により、細胞溶解物と抽出物から、または順化培地
から、ペプチドを精製することができる。加えて、全長
ペプチドまたは断片に特異的なモノクローナル抗体また
はポリクローナル抗体を使って調製された免疫アフィニ
ティークロマトグラフィーを使って、組換えペプチドを
その他の細胞タンパク質から分離することができる。
【００３２】下記に実施例を与える。この実施例は例示
のためであり本発明を限定するものではない。
のためであり本発明を限定するものではない。
【００３３】
【実施例】実施例１ 配列 。どのアミノ酸がＯ群株に特徴的であるかを決定す
るために、できるだけ多くの異なる分離株からのgp41配
列（完全なものと部分的なもの）を収集しそして整列さ
せた。それらの配列の多くが科学文献から入手可能であ
ったが、その他のものは本発明者らの研究室で決定し
た。比較に用いる配列は次の源より得られた。免疫原性
であることが知られているgp41の領域および特定の診断
的価値を有する領域に注意を集中させた。
るために、できるだけ多くの異なる分離株からのgp41配
列（完全なものと部分的なもの）を収集しそして整列さ
せた。それらの配列の多くが科学文献から入手可能であ
ったが、その他のものは本発明者らの研究室で決定し
た。比較に用いる配列は次の源より得られた。免疫原性
であることが知られているgp41の領域および特定の診断
的価値を有する領域に注意を集中させた。
【００３４】
【表１】
【００３５】ウイルスアミノ酸配列を、gp41の免疫優性
領域を含有する33アミノ酸断片に短縮し、MEGALIGNプロ
グラム（DNAStar)を使って整列させた。整列を図１に示
す。
領域を含有する33アミノ酸断片に短縮し、MEGALIGNプロ
グラム（DNAStar)を使って整列させた。整列を図１に示
す。
【００３６】各アミノ酸位置の上の欄の棒の高さは、各
位置のアミノ酸がどれくらい高度に保存されているかを
グラフ的に示す。着目の領域中の33個の位置のうち、18
アミノ酸が全ての株において完全に保存されている。低
度に保存されているその他の15の位置では、それらの位
置に見つかるアミノ酸の綿密な調査は、しばしば或る特
徴を有するアミノ酸に優先性があることを示す。例え
ば、９位と25位では、疎水性側鎖を有するアミノ酸が強
く優先される。21位ではリジンが、そして23位では正電
荷を有するアミノ酸に強い優先性が認められる。
位置のアミノ酸がどれくらい高度に保存されているかを
グラフ的に示す。着目の領域中の33個の位置のうち、18
アミノ酸が全ての株において完全に保存されている。低
度に保存されているその他の15の位置では、それらの位
置に見つかるアミノ酸の綿密な調査は、しばしば或る特
徴を有するアミノ酸に優先性があることを示す。例え
ば、９位と25位では、疎水性側鎖を有するアミノ酸が強
く優先される。21位ではリジンが、そして23位では正電
荷を有するアミノ酸に強い優先性が認められる。
【００３７】免疫優先領域は、主として表３に示される
領域中の11〜33位アミノ酸に位置することが知られてい
るので、１つのアミノ酸を天然株においても見つかる各
位置に組み込んだペプチド配列を誘導した。しかしなが
ら、得られる配列はユニークであり、且つ既知のＯ群ウ
イルスのいずれのものとも一致しない。この配列は元の
ANT70 分離株のものと約63％同一である。
領域中の11〜33位アミノ酸に位置することが知られてい
るので、１つのアミノ酸を天然株においても見つかる各
位置に組み込んだペプチド配列を誘導した。しかしなが
ら、得られる配列はユニークであり、且つ既知のＯ群ウ
イルスのいずれのものとも一致しない。この配列は元の
ANT70 分離株のものと約63％同一である。
【００３８】このペプチド（ペプチド 147）のアミノ酸
配列は次の通りである：ＮＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩ
ＩＣＹＴＳＡＲＷＨ
配列は次の通りである：ＮＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩ
ＩＣＹＴＳＡＲＷＨ
【００３９】下記に示すアミノ酸整列は、この配列と元
のANT70 分離株の配列との類似性と相違性を示す： ANT70 ＮＱＱＬＬＳＬＷＧＣＫＧＫＬＶＣＹＴＳＶＫＷＮ ペプチド 147 ＮＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ
のANT70 分離株の配列との類似性と相違性を示す： ANT70 ＮＱＱＬＬＳＬＷＧＣＫＧＫＬＶＣＹＴＳＶＫＷＮ ペプチド 147 ＮＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ
【００４０】ペプチド合成。ペプチド合成は、開裂後に
Ｃ末端アミドを有するペプチドを生成させるために修飾
されたRinkリンカーを有する、市販のポリスチレン：ジ
ビニルベンゼン架橋樹脂上で９−フルオレニルメトキシ
カルボニル（Fmoc）化学を使って行った。保護アミノ酸
は、等モル量のＮ−〔（ジメチルアミノ）−１Ｈ−１，
２，３−トリアゾロ〔４，５−ｂ〕ピリジン−１−イル
メチレン〕−Ｎ−メチルメタナミニウムヘキサフルオロ
リン酸Ｎ−オキシド（HATU）と１−ヒドロキシ−７−ア
ザベンゾトリアール（HOAt）、および２倍モル過剰量の
Ｎ−メチルピロリドン(NMP) 中のＮ−メチルモルホリン
(NMM) を使ってその場で活性化した。樹脂の負荷容量に
関して４倍過剰量の活性アミノ酸を使用した。グルタミ
ン、アスパラギン、システインおよびヒスチジンにはト
リチル(Trt) 側鎖保護基を使用した。セリン、スレオニ
ンおよびチロシンのヒドロキシル機能はｔ−ブチル (tB
u)基で保護し、リジンの側鎖はｔ−ブチルオキシカルボ
ニル (tBoc) 基で保護し、そしてアルギニンの側鎖には
２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スル
ホニル(Pmc) 基を使用した。その他の全てのアミノ酸は
側鎖保護を用いずにカップリングせしめた。
Ｃ末端アミドを有するペプチドを生成させるために修飾
されたRinkリンカーを有する、市販のポリスチレン：ジ
ビニルベンゼン架橋樹脂上で９−フルオレニルメトキシ
カルボニル（Fmoc）化学を使って行った。保護アミノ酸
は、等モル量のＮ−〔（ジメチルアミノ）−１Ｈ−１，
２，３−トリアゾロ〔４，５−ｂ〕ピリジン−１−イル
メチレン〕−Ｎ−メチルメタナミニウムヘキサフルオロ
リン酸Ｎ−オキシド（HATU）と１−ヒドロキシ−７−ア
ザベンゾトリアール（HOAt）、および２倍モル過剰量の
Ｎ−メチルピロリドン(NMP) 中のＮ−メチルモルホリン
(NMM) を使ってその場で活性化した。樹脂の負荷容量に
関して４倍過剰量の活性アミノ酸を使用した。グルタミ
ン、アスパラギン、システインおよびヒスチジンにはト
リチル(Trt) 側鎖保護基を使用した。セリン、スレオニ
ンおよびチロシンのヒドロキシル機能はｔ−ブチル (tB
u)基で保護し、リジンの側鎖はｔ−ブチルオキシカルボ
ニル (tBoc) 基で保護し、そしてアルギニンの側鎖には
２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スル
ホニル(Pmc) 基を使用した。その他の全てのアミノ酸は
側鎖保護を用いずにカップリングせしめた。
【００４１】サイクルの初めのFmoc基の除去は、NMP 中
の２％ピリジンと２％１，８−ジアザビシクロ〔５．
４．０〕ウンデカ−７−エンの混合物を用いて、樹脂に
結合したペプチドを処理することによって行った。
の２％ピリジンと２％１，８−ジアザビシクロ〔５．
４．０〕ウンデカ−７−エンの混合物を用いて、樹脂に
結合したペプチドを処理することによって行った。
【００４２】試験のための固相へのペプチドの結合を促
進するために、アミノ末端にビオチン残基を有するペプ
チドを合成した。ビオチンを付ける前にこのペプチドの
Ｎ末端に２個のグリシン残基を付加して、それをスペー
サーアームとして使った。ビオチンは、等モル量のＯ−
（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−
テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（TBT
U）と２倍モル過剰量のNMM を使って、それのカルボキ
シル基のその場での活性化により結合させた。ビオチン
は、活性化前に30％ジメチルスルホキシド（DMSO），70
％ NMP中に溶かした。
進するために、アミノ末端にビオチン残基を有するペプ
チドを合成した。ビオチンを付ける前にこのペプチドの
Ｎ末端に２個のグリシン残基を付加して、それをスペー
サーアームとして使った。ビオチンは、等モル量のＯ−
（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−
テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（TBT
U）と２倍モル過剰量のNMM を使って、それのカルボキ
シル基のその場での活性化により結合させた。ビオチン
は、活性化前に30％ジメチルスルホキシド（DMSO），70
％ NMP中に溶かした。
【００４３】樹脂に結合したペプチドの開裂は、該ペプ
チドをトリフルオロ酢酸、フェノール、チオアニソー
ル、エタンジオールおよび水（82.5：５：５：2.5 ：
５）の混合物（Ｋ試薬）で処理することにより行った。
開裂後、ペプチドを含む開裂混合物を濾過により回収
し、ロータリーエバポレーター中で体積を減らした。次
いでメチル−ｔ−ブチルエーテルを添加してペプチドを
沈澱させた。沈澱した粗製ペプチドを濾過により集め、
真空乾燥し、そして逆相HPLCにより精製した。所望の生
成物を含有する画分を電子衝撃質量分析法により同定
し、凍結乾燥し、そして４℃で乾燥保存した。
チドをトリフルオロ酢酸、フェノール、チオアニソー
ル、エタンジオールおよび水（82.5：５：５：2.5 ：
５）の混合物（Ｋ試薬）で処理することにより行った。
開裂後、ペプチドを含む開裂混合物を濾過により回収
し、ロータリーエバポレーター中で体積を減らした。次
いでメチル−ｔ−ブチルエーテルを添加してペプチドを
沈澱させた。沈澱した粗製ペプチドを濾過により集め、
真空乾燥し、そして逆相HPLCにより精製した。所望の生
成物を含有する画分を電子衝撃質量分析法により同定
し、凍結乾燥し、そして４℃で乾燥保存した。
【００４４】実施例２ ＨＩＶ−１のＯ群血清によるペプチドの血清学的認識 。
感染個体からのヒト血清中に存在する抗ＨＩＶ−１ Ｏ
群抗体により認識される能力についてペプチド147 を評
価した。全てのＯ群試料は、Ｏ特異的プライマーを使っ
たウイルスgp41配列の逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反
応（RT-PCR）増幅によりＨＩＶ−１のＯ群について陽性
であると確認された。得られたＰＣＲ生成物の素性をＤ
ＮＡ配列決定により更に確認した。
感染個体からのヒト血清中に存在する抗ＨＩＶ−１ Ｏ
群抗体により認識される能力についてペプチド147 を評
価した。全てのＯ群試料は、Ｏ特異的プライマーを使っ
たウイルスgp41配列の逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反
応（RT-PCR）増幅によりＨＩＶ−１のＯ群について陽性
であると確認された。得られたＰＣＲ生成物の素性をＤ
ＮＡ配列決定により更に確認した。
【００４５】抗体結合を証明するのに好ましい方法はエ
ンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ(ELISA) で
ある。この技術は、固相に抗原を結合させ、試験しよう
とする液体を、抗原がコーティングされた固相と接触さ
せ、未結合の材料を洗い流し、次いで酵素標識した第二
抗体を用いて結合抗体を検出することを含んで成る。酵
素の存在は色素生成または蛍光生成基質を使って検出す
る。
ンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ(ELISA) で
ある。この技術は、固相に抗原を結合させ、試験しよう
とする液体を、抗原がコーティングされた固相と接触さ
せ、未結合の材料を洗い流し、次いで酵素標識した第二
抗体を用いて結合抗体を検出することを含んで成る。酵
素の存在は色素生成または蛍光生成基質を使って検出す
る。
【００４６】ビオチン化ペプチド147 を評価するため
に、マイクロタイタープレートのウエルを、50 mM 炭酸
塩緩衝液 pH 9.6 中の１μg/mlの濃度のストレプトアビ
ジン（200 μl ／ウエル）でコーティングした。余分な
未結合のストレプトアビジンをリン酸塩緩衝化食塩水(P
BS) での数回の洗浄により除去した。ビオチン化ペプチ
ド147 を最少量の純粋なDMSO中に溶かし、次いでPBS 中
に0.5 μg/mlの濃度にまで希釈した。各ウエルに200 μ
l のペプチド溶液を添加し、ペプチドをストレプトアビ
ジンに結合させた。未結合のペプチドをPBS での洗浄に
より除去した後、ＨＩＶ−１のＯ群に感染した患者から
得た血清試料をプレートのウエル中に添加した。適当な
インキュベーション期間の後、PBS での洗浄により未結
合の物質を除去した。各ウエルに抗IgＧ：西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ(HRP) 接合体の希釈液を添加し、37℃で
30分間インキュベートした。十分な洗浄により未結合の
物質を除去した。Ｏ−フェニレンジアミン(OPD) とH2O2
を含有する基質溶液を各ウエルに添加し、そして遮光下
でプレートを更にインキュベートした。室温で30分間の
インキュベーション期間の後、50μl の4 N H2SO4 の添
加により反応を終わらせ、そして各ウエルの吸光度を49
2 nmで読み取った。最初に未希釈（10μl ）の血清試料
を使ってペプチド147 を試験した。結果を表２に示す。
試料の測定値は光学濃度（ＯＤ）で与えられる。
に、マイクロタイタープレートのウエルを、50 mM 炭酸
塩緩衝液 pH 9.6 中の１μg/mlの濃度のストレプトアビ
ジン（200 μl ／ウエル）でコーティングした。余分な
未結合のストレプトアビジンをリン酸塩緩衝化食塩水(P
BS) での数回の洗浄により除去した。ビオチン化ペプチ
ド147 を最少量の純粋なDMSO中に溶かし、次いでPBS 中
に0.5 μg/mlの濃度にまで希釈した。各ウエルに200 μ
l のペプチド溶液を添加し、ペプチドをストレプトアビ
ジンに結合させた。未結合のペプチドをPBS での洗浄に
より除去した後、ＨＩＶ−１のＯ群に感染した患者から
得た血清試料をプレートのウエル中に添加した。適当な
インキュベーション期間の後、PBS での洗浄により未結
合の物質を除去した。各ウエルに抗IgＧ：西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ(HRP) 接合体の希釈液を添加し、37℃で
30分間インキュベートした。十分な洗浄により未結合の
物質を除去した。Ｏ−フェニレンジアミン(OPD) とH2O2
を含有する基質溶液を各ウエルに添加し、そして遮光下
でプレートを更にインキュベートした。室温で30分間の
インキュベーション期間の後、50μl の4 N H2SO4 の添
加により反応を終わらせ、そして各ウエルの吸光度を49
2 nmで読み取った。最初に未希釈（10μl ）の血清試料
を使ってペプチド147 を試験した。結果を表２に示す。
試料の測定値は光学濃度（ＯＤ）で与えられる。
【００４７】
【表２】
【００４８】試料ODS007ａおよびｂは同じ個体から連続
採血した血液である。陰性対照試料は未感染の血液提供
者からのものである。それらの結果は、ＨＩＶ−１のＯ
群感染に応答して生産された抗体がペプチド147 を認識
できることを示す。
採血した血液である。陰性対照試料は未感染の血液提供
者からのものである。それらの結果は、ＨＩＶ−１のＯ
群感染に応答して生産された抗体がペプチド147 を認識
できることを示す。
【００４９】ペプチド147 抗原を使ったELISA の感度を
評価するために、ペプチド147 を使って系列希釈したＯ
群血清のパネルを試験した。ストレプトアビジンでコー
ティングしたプレートを調製し、そこに上記と同様にペ
プチド147 を添加し、そして希釈パネルを使って試験し
た。更に、ペプチド147 の性能を純種のＯ群配列のもの
と比較するために、DUR 変異体の配列に相当する第二の
ペプチドを合成した（ペプチド 146）。それらのペプチ
ドはgp41の同一領域を正確にカバーしており、それらを
並行試験した。結果を表３に示す。
評価するために、ペプチド147 を使って系列希釈したＯ
群血清のパネルを試験した。ストレプトアビジンでコー
ティングしたプレートを調製し、そこに上記と同様にペ
プチド147 を添加し、そして希釈パネルを使って試験し
た。更に、ペプチド147 の性能を純種のＯ群配列のもの
と比較するために、DUR 変異体の配列に相当する第二の
ペプチドを合成した（ペプチド 146）。それらのペプチ
ドはgp41の同一領域を正確にカバーしており、それらを
並行試験した。結果を表３に示す。
【００５０】
【表３】
【００５１】これらの結果は、高倍率に希釈した試料を
使った場合でも、ペプチド147 がＯ群gp41免疫優性領域
に対する抗体を結合することができる適切な抗原である
ことを証明する。多数のパネルを用いてもペプチド147
の性能は純種のＯ群配列のものと同等であるかまたは有
意に優れていた。
使った場合でも、ペプチド147 がＯ群gp41免疫優性領域
に対する抗体を結合することができる適切な抗原である
ことを証明する。多数のパネルを用いてもペプチド147
の性能は純種のＯ群配列のものと同等であるかまたは有
意に優れていた。
【００５２】別の純種のＯ群配列に対してペプチド 147
の性能を比較するために、ANT70 配列に相当するペプチ
ドを合成した（ペプチド80）。ペプチド147 と80を同じ
濃度で溶解し、系列希釈し、そしてストレプトアビジン
をコーティングしたウエルに結合させた。血清試料 ODS
007b（表３参照）の１：60希釈液を全てのウエルに添加
し、インキュベートした。洗浄後、抗ヒトIgＧ−ＨＲＰ
接合体を添加し、インキュベートし、そしてウエルを徹
底的に再洗浄した。この場合、ルミノールと過酸塩から
成る化学発光基質を使った。蛍光計を使って発光を定量
した。結果を表４に示し、そして図２にグラフとして示
す。
の性能を比較するために、ANT70 配列に相当するペプチ
ドを合成した（ペプチド80）。ペプチド147 と80を同じ
濃度で溶解し、系列希釈し、そしてストレプトアビジン
をコーティングしたウエルに結合させた。血清試料 ODS
007b（表３参照）の１：60希釈液を全てのウエルに添加
し、インキュベートした。洗浄後、抗ヒトIgＧ−ＨＲＰ
接合体を添加し、インキュベートし、そしてウエルを徹
底的に再洗浄した。この場合、ルミノールと過酸塩から
成る化学発光基質を使った。蛍光計を使って発光を定量
した。結果を表４に示し、そして図２にグラフとして示
す。
【００５３】
【表４】
【００５４】上記結果は、ペプチド147 のアミノ酸配列
がＨＩＶ−１のＯ群に対する抗体の検出能について、天
然分離株のものと同等であることを証明する。
がＨＩＶ−１のＯ群に対する抗体の検出能について、天
然分離株のものと同等であることを証明する。
【００５５】実施例３ ペプチド147 の変異体の抗体認識 。次の２つのペプチド
を合成した。 ペプチド147-4 ：ＥＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹ
ＴＳＡＲＷＨ ペプチド147-5 ：ＧＲＥＴＬＭＱＤＱＱＲＬＮＳＷＧＣ
ＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ
を合成した。 ペプチド147-4 ：ＥＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹ
ＴＳＡＲＷＨ ペプチド147-5 ：ＧＲＥＴＬＭＱＤＱＱＲＬＮＳＷＧＣ
ＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ
【００５６】ペプチド147-5 には、スペーサーとして機
能するＮ末端グリシンを付加し、そして水性緩衝液中の
ペプチドの溶解度を高めるために２位にアルギニンを付
加した。上記の両ペプチドを抗体捕捉法によりＨＩＶ−
１のＯ群血清試料によって認識される能力について評価
した。一般に、そのようなアッセイでは、ペプチドを固
相に結合せしめ、そして固相に結合したペプチドに試料
中に存在する二価抗体が結合する。続いて、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼに接合した問題のペプチドから成る接
合体を使って、結合した抗体を検出する。次いで、ペプ
チド−ＨＲＰ接合体が、固相結合ペプチドに結合した抗
体に結合する。そのような接合体を調製するのに適した
方法は科学文献中に容易に見つけることができ、また当
業者に周知である。
能するＮ末端グリシンを付加し、そして水性緩衝液中の
ペプチドの溶解度を高めるために２位にアルギニンを付
加した。上記の両ペプチドを抗体捕捉法によりＨＩＶ−
１のＯ群血清試料によって認識される能力について評価
した。一般に、そのようなアッセイでは、ペプチドを固
相に結合せしめ、そして固相に結合したペプチドに試料
中に存在する二価抗体が結合する。続いて、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼに接合した問題のペプチドから成る接
合体を使って、結合した抗体を検出する。次いで、ペプ
チド−ＨＲＰ接合体が、固相結合ペプチドに結合した抗
体に結合する。そのような接合体を調製するのに適した
方法は科学文献中に容易に見つけることができ、また当
業者に周知である。
【００５７】ペプチド147-4 かペプチド147-5 のいずれ
かによりマイクロウエルプレートを予備コーティングし
た。次いで血清試料の希釈液を添加して37℃で１時間イ
ンキュベートした後、プレートを十分に洗浄した。次い
で、ＨＲＰに接合させたペプチド147-4 かペプチド147-
5 のいずれかの１：100 希釈液を添加し、37℃で更に１
時間インキュベートした。このインキュベーション後、
プレートを再度徹底的に洗浄した。ＨＲＰの基質（Ｏ−
フェニレンジアミン）とH2O2の添加によって、結合した
接合体の存在を検出した。ペプチド147-4 と147-5 の抗
体認識を下の表５に示す。
かによりマイクロウエルプレートを予備コーティングし
た。次いで血清試料の希釈液を添加して37℃で１時間イ
ンキュベートした後、プレートを十分に洗浄した。次い
で、ＨＲＰに接合させたペプチド147-4 かペプチド147-
5 のいずれかの１：100 希釈液を添加し、37℃で更に１
時間インキュベートした。このインキュベーション後、
プレートを再度徹底的に洗浄した。ＨＲＰの基質（Ｏ−
フェニレンジアミン）とH2O2の添加によって、結合した
接合体の存在を検出した。ペプチド147-4 と147-5 の抗
体認識を下の表５に示す。
【００５８】
【表５】
【００５９】両ペプチドを、感染個体からのヒト血清試
料中に存在する抗ＨＩＶ−１ Ｏ群抗体により認識され
る能力について評価した。Ｏ群血清は全て、Ｏ特異的プ
ライマを使ったウイルスgp41配列の逆転写酵素−ポリメ
ラーゼ連鎖反応（RT-PCR）増幅により、ＨＩＶ−１のＯ
群について陽性であると確認された。ＤＮＡ配列決定に
よりＰＣＲ生成物の素性を更に確かめた。
料中に存在する抗ＨＩＶ−１ Ｏ群抗体により認識され
る能力について評価した。Ｏ群血清は全て、Ｏ特異的プ
ライマを使ったウイルスgp41配列の逆転写酵素−ポリメ
ラーゼ連鎖反応（RT-PCR）増幅により、ＨＩＶ−１のＯ
群について陽性であると確認された。ＤＮＡ配列決定に
よりＰＣＲ生成物の素性を更に確かめた。
【００６０】上の表に与えられた結果は、血清試料を高
倍率に希釈した場合であっても、指摘のペプチド147 配
列変異体が、ＨＩＶ−１ Ｏ群感染に応答して生産され
る抗体の存在を検出するのに適することを証明する。上
記結果は、より長鎖のペプチドの使用が短鎖の変異体よ
りも幾分高いシグナルをもたらすことも示す。
倍率に希釈した場合であっても、指摘のペプチド147 配
列変異体が、ＨＩＶ−１ Ｏ群感染に応答して生産され
る抗体の存在を検出するのに適することを証明する。上
記結果は、より長鎖のペプチドの使用が短鎖の変異体よ
りも幾分高いシグナルをもたらすことも示す。
【００６１】ペプチド147 の基本的アミノ酸配列に変異
を導入し且つＨＩＶ−１のＯ群による感染に応答して生
産される抗体を検出する能力を保持することが可能であ
る。
を導入し且つＨＩＶ−１のＯ群による感染に応答して生
産される抗体を検出する能力を保持することが可能であ
る。
【００６２】実施例４ 抗体検出要の組換え抗原のデザイン 。多くの場合、大き
なタンパク質は、生来のタンパク質中のポリペプチド鎖
の遠隔領域の並置により構築される不連続エピトープを
提供できるので、短鎖ペプチドよりも抗体検出の機能が
しばしば優れている。組換えタンパク質を使用すること
の別の利点として、タンパク質の精製もしくは固相への
結合を容易にするために、またはタンパク質に別の望ま
しい特性を付与するために、実際の抗原に無関係のタン
パク質特異的配列中に組み込むことができる点が挙げら
れる。
なタンパク質は、生来のタンパク質中のポリペプチド鎖
の遠隔領域の並置により構築される不連続エピトープを
提供できるので、短鎖ペプチドよりも抗体検出の機能が
しばしば優れている。組換えタンパク質を使用すること
の別の利点として、タンパク質の精製もしくは固相への
結合を容易にするために、またはタンパク質に別の望ま
しい特性を付与するために、実際の抗原に無関係のタン
パク質特異的配列中に組み込むことができる点が挙げら
れる。
【００６３】Ｍ群ＨＩＶ−１Ｂ型ＭＮ分離株の配列を、
抗Ｏ群抗体の検出のために望ましい特性を有する新規抗
体をデザインする際の出発点として利用した。env 遺伝
子産物は855 アミノ酸の長さを有するポリペプチドであ
る。gp160 前駆体の開裂はアミノ酸513 と514 の間で起
こり、成熟ウイルス粒子中に見つかるエンベロープタン
パク質gp120 とgp41を与える。抗体検出用に特に注目さ
れるのは、図３に示されるgp41の外表領域（ectodomai
n）である。
抗Ｏ群抗体の検出のために望ましい特性を有する新規抗
体をデザインする際の出発点として利用した。env 遺伝
子産物は855 アミノ酸の長さを有するポリペプチドであ
る。gp160 前駆体の開裂はアミノ酸513 と514 の間で起
こり、成熟ウイルス粒子中に見つかるエンベロープタン
パク質gp120 とgp41を与える。抗体検出用に特に注目さ
れるのは、図３に示されるgp41の外表領域（ectodomai
n）である。
【００６４】新規組換えタンパク質のデザインは、溶液
中でその本来の構造を再生する能力を本質的に妨害する
タンパク質の生成を避けるためにあらゆる入手可能な構
造情報を考慮に入れるべきである。構造１ＡＩＫと１Ｅ
ＮＶはBrookhaven Protein Database から入手し、そし
てプログラム Rasmol とSwissModelを使って調査した。
それらの結晶構造は、渦巻き状コイルを形成する相互作
用している２つのヘリックス（らせん）の存在を示す。
１ＥＮＶ構造中にはそれらの２つのヘリックスを連結す
る（且つ免疫優性領域を包含する）配列は存在せず、こ
のことは、ループの最上部の免疫原性領域を含んで成る
相互連結領域が非常に移動性であるため鏡映を作れない
ことを意味する。結晶学データがあるヘリックスを図３
に示す。各ヘリックスのＮ末端およびＣ末端限界線は、
結晶学データが入手できる限界であり、それらは必ずし
も生来のgp41タンパク質中に存在するヘリックスの真の
限界線ではない。
中でその本来の構造を再生する能力を本質的に妨害する
タンパク質の生成を避けるためにあらゆる入手可能な構
造情報を考慮に入れるべきである。構造１ＡＩＫと１Ｅ
ＮＶはBrookhaven Protein Database から入手し、そし
てプログラム Rasmol とSwissModelを使って調査した。
それらの結晶構造は、渦巻き状コイルを形成する相互作
用している２つのヘリックス（らせん）の存在を示す。
１ＥＮＶ構造中にはそれらの２つのヘリックスを連結す
る（且つ免疫優性領域を包含する）配列は存在せず、こ
のことは、ループの最上部の免疫原性領域を含んで成る
相互連結領域が非常に移動性であるため鏡映を作れない
ことを意味する。結晶学データがあるヘリックスを図３
に示す。各ヘリックスのＮ末端およびＣ末端限界線は、
結晶学データが入手できる限界であり、それらは必ずし
も生来のgp41タンパク質中に存在するヘリックスの真の
限界線ではない。
【００６５】図３に示す「下降」ヘリックスの中に含ま
れる配列のＯ群血清に対する潜在的重要性が証明されて
おり、WO 95/32293 に記載されている。ＭＮ配列中のど
のアミノ酸を変異させてはならないかを決定するため
に、入手可能な三次元構造を調査し、多分２つのヘリッ
クス間の相互作用を安定化するのに関与しているようで
あるアミノ酸を同定した。次の近接な接触点が同定され
た： Ｇ548 →Ｎ657 Ｑ551 →Ｑ653 Ｑ552 →Ｑ654 Ａ562 →Ｉ643 Ｈ565 →Ｙ639 Ｌ569 →Ｉ636 Ｗ572 →Ｗ632 Ｗ572 →Ｗ629
れる配列のＯ群血清に対する潜在的重要性が証明されて
おり、WO 95/32293 に記載されている。ＭＮ配列中のど
のアミノ酸を変異させてはならないかを決定するため
に、入手可能な三次元構造を調査し、多分２つのヘリッ
クス間の相互作用を安定化するのに関与しているようで
あるアミノ酸を同定した。次の近接な接触点が同定され
た： Ｇ548 →Ｎ657 Ｑ551 →Ｑ653 Ｑ552 →Ｑ654 Ａ562 →Ｉ643 Ｈ565 →Ｙ639 Ｌ569 →Ｉ636 Ｗ572 →Ｗ632 Ｗ572 →Ｗ629
【００６６】Los Alamos National Laboratoryに保存さ
れたＨＩＶ配列データベース中の入手可能な配列の調査
は、上記アミノ酸の多数が高度に保存されていることを
明らかにした。存在するとしても、突然変異はしばしば
類似した特徴を有しており、例えば疎水性側鎖または水
素結合に関与する能力を持つ側鎖を有している。下降ヘ
リックスの領域（アミノ酸633 〜665 ）中のＭＮ分離株
の配列を整列させ、そして配列情報が入手できる全ての
Ｏ群株のものと比較した。この整列を図４に示す。
れたＨＩＶ配列データベース中の入手可能な配列の調査
は、上記アミノ酸の多数が高度に保存されていることを
明らかにした。存在するとしても、突然変異はしばしば
類似した特徴を有しており、例えば疎水性側鎖または水
素結合に関与する能力を持つ側鎖を有している。下降ヘ
リックスの領域（アミノ酸633 〜665 ）中のＭＮ分離株
の配列を整列させ、そして配列情報が入手できる全ての
Ｏ群株のものと比較した。この整列を図４に示す。
【００６７】図４は、Ｂ型配列とＯ群配列との間であっ
ても、この領域中のどのアミノ酸が保存されているかも
示す。この配列比較は、Ｍ群株とＰ群株の間に高度の構
造相同性があることを非常に強く示唆する。
ても、この領域中のどのアミノ酸が保存されているかも
示す。この配列比較は、Ｍ群株とＰ群株の間に高度の構
造相同性があることを非常に強く示唆する。
【００６８】Ｏ群に典型的な配列に到達するために、Ｏ
群配列のみを考察した。各位置に見つかるアミノ酸の評
価の後に選択した配列は次のものである：ＤＱＱＶＮＮ
ＶＳＳＩＩＹＤＫＩＬＥＡＱＤＱＱＥＥＮＶＲＥＬＬＥ
ＬＤこの配列は、対応するANT70 配列と57.6％の同一性
を有する。
群配列のみを考察した。各位置に見つかるアミノ酸の評
価の後に選択した配列は次のものである：ＤＱＱＶＮＮ
ＶＳＳＩＩＹＤＫＩＬＥＡＱＤＱＱＥＥＮＶＲＥＬＬＥ
ＬＤこの配列は、対応するANT70 配列と57.6％の同一性
を有する。
【００６９】更に、ペプチド147 Ｏ群様免疫優性領域を
Ｎ末端方向に延長した。この長い免疫優性領域は下記配
列を有する：ＲＡＲＬＱＡＬＥＴＬＭＱＮＱＱＲＬＮＳ
ＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨＮ末端延長部分を有
するこの新規配列は、元のANT70 株と68.6％の同一性を
有する。
Ｎ末端方向に延長した。この長い免疫優性領域は下記配
列を有する：ＲＡＲＬＱＡＬＥＴＬＭＱＮＱＱＲＬＮＳ
ＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨＮ末端延長部分を有
するこの新規配列は、元のANT70 株と68.6％の同一性を
有する。
【００７０】当業者は、感染患者に認められる抗体を検
出するために本明細書中に記載のペプチドまたはその誘
導体を使って、または感染患者に認められる抗原を検出
するために上記ペプチドに対して惹起せしめた抗体を使
って、診断試験を開発することができる。
出するために本明細書中に記載のペプチドまたはその誘
導体を使って、または感染患者に認められる抗原を検出
するために上記ペプチドに対して惹起せしめた抗体を使
って、診断試験を開発することができる。
【００７１】実施例５ 「モザイク」Ｍ群／Ｏ群組換え抗原の作製 。gp41の構造
的特徴を考慮に入れ、そしてペプチド147 の中に含まれ
る配列が抗Ｏ群抗体の検出に適当であることを理解し
て、モザイク組換え体の作製を行った。目的は、出発点
としてＭＮ gp41 配列を使用しそして上記の２つのＯ群
領域を交換し、それにより免疫上重要な領域のための担
体としてＢ型ＭＮ配列を使ってＯ群抗原を作製すること
である。
的特徴を考慮に入れ、そしてペプチド147 の中に含まれ
る配列が抗Ｏ群抗体の検出に適当であることを理解し
て、モザイク組換え体の作製を行った。目的は、出発点
としてＭＮ gp41 配列を使用しそして上記の２つのＯ群
領域を交換し、それにより免疫上重要な領域のための担
体としてＢ型ＭＮ配列を使ってＯ群抗原を作製すること
である。
【００７２】そのような組換え体の作製手順を図５〜７
に示す。全ての重要な制限酵素開裂部位と共に、重複す
る合成オリゴペプチドを使った段階的再構成と免疫優性
領域の交換が図解される。使用するプライマーの配列を
図８に示す。
に示す。全ての重要な制限酵素開裂部位と共に、重複す
る合成オリゴペプチドを使った段階的再構成と免疫優性
領域の交換が図解される。使用するプライマーの配列を
図８に示す。
【００７３】ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）融合タ
ンパク質として２つの構成物を作製した。どちらの構成
物も全長gp41分子を示さないが、２つのうちの長い方
（DHFR-hENV-NH）は、Ｎ末端融合ペプチドを除く本質的
に全部のgp41外表領域を含む。構成物DHFR-hES-MH は長
い融合タンパク質の先端が切り取られた変異体である。
それらの融合タンパク質のアミノ酸配列を図６のａとｂ
に示す。
ンパク質として２つの構成物を作製した。どちらの構成
物も全長gp41分子を示さないが、２つのうちの長い方
（DHFR-hENV-NH）は、Ｎ末端融合ペプチドを除く本質的
に全部のgp41外表領域を含む。構成物DHFR-hES-MH は長
い融合タンパク質の先端が切り取られた変異体である。
それらの融合タンパク質のアミノ酸配列を図６のａとｂ
に示す。
【００７４】分析を促進するためにmyc 遺伝子に由来す
るＣ末端配列を付加し、そして精製を容易にするために
his6末尾配列を付加した。全ての非ＨＩＶ配列がボック
ス中に示されている。Ｏ群様配列には下線が引かれてい
る。この組換え体のＨＩＶ部分の他の全配列はＭ群由来
である。
るＣ末端配列を付加し、そして精製を容易にするために
his6末尾配列を付加した。全ての非ＨＩＶ配列がボック
ス中に示されている。Ｏ群様配列には下線が引かれてい
る。この組換え体のＨＩＶ部分の他の全配列はＭ群由来
である。
【００７５】両タンパク質の発現をエシェリキア・コリ
（Escherichia coli）中で試みた。端が切り取られた構
成物 DHFR-hES-MHを用いた場合に最大の発現レベルが観
察され、そして発現された組換えタンパク質は封入体と
して観察された。細胞を溶解させ、周知の方法により封
入体を収穫した。次いでドデシル硫酸ナトリウム(SDS)
とジチオスレイトールでの処理によりタンパク質を可溶
化し、そしてSDS の存在下でのポリアクリルアミドゲル
電気泳動により分析した。期待通りの分子サイズを有す
る１本のバンドが観察され、粗製抗原調製物中の全タン
パク質の約90％を占めると見積もられた。
（Escherichia coli）中で試みた。端が切り取られた構
成物 DHFR-hES-MHを用いた場合に最大の発現レベルが観
察され、そして発現された組換えタンパク質は封入体と
して観察された。細胞を溶解させ、周知の方法により封
入体を収穫した。次いでドデシル硫酸ナトリウム(SDS)
とジチオスレイトールでの処理によりタンパク質を可溶
化し、そしてSDS の存在下でのポリアクリルアミドゲル
電気泳動により分析した。期待通りの分子サイズを有す
る１本のバンドが観察され、粗製抗原調製物中の全タン
パク質の約90％を占めると見積もられた。
【００７６】実施例６ Ｏ群抗体検出についてのＭ群／Ｏ群「モザイク」構成物
の性能 。上述の通り発現させたタンパク質を、評価のた
めにマイクロタイタープレートのウエル中に0.5μg/ml
の濃度でコーティングした。タンパク質のコーティング
後、プラスチック上に残っている全ての結合部位をウシ
血清アルブミンによりブロックした。次いでＯ群血清の
希釈液を、組換え抗原を認識する能力について試験し
た。ＨＲＰ標識マウス抗ヒトIgＧ接合体とのインキュベ
ーションにより、結合した抗体を検出し、次いでＯＰＤ
とH2O2の添加により結合した接合体を検出した。結果を
表６に示す。
の性能 。上述の通り発現させたタンパク質を、評価のた
めにマイクロタイタープレートのウエル中に0.5μg/ml
の濃度でコーティングした。タンパク質のコーティング
後、プラスチック上に残っている全ての結合部位をウシ
血清アルブミンによりブロックした。次いでＯ群血清の
希釈液を、組換え抗原を認識する能力について試験し
た。ＨＲＰ標識マウス抗ヒトIgＧ接合体とのインキュベ
ーションにより、結合した抗体を検出し、次いでＯＰＤ
とH2O2の添加により結合した接合体を検出した。結果を
表６に示す。
【００７７】
【表６】
【００７８】それらの抗原は適度に大きい数のＨＩＶ−
１Ｏ群配列を考慮に入れることにより誘導したため、新
規配列は天然に存在するであろうＯ群変異体のスペクト
ルをより良好に象徴すると考えられ、従って抗Ｏ群抗体
の検出についてより広い特異性を有することができる。
実験結果は、それらの抗原がＨＩＶ−１のＯ群感染に応
答して生産される抗体の検出について天然のウイルス配
列と同等に機能し、より良好に機能する場合もあること
を示す。
１Ｏ群配列を考慮に入れることにより誘導したため、新
規配列は天然に存在するであろうＯ群変異体のスペクト
ルをより良好に象徴すると考えられ、従って抗Ｏ群抗体
の検出についてより広い特異性を有することができる。
実験結果は、それらの抗原がＨＩＶ−１のＯ群感染に応
答して生産される抗体の検出について天然のウイルス配
列と同等に機能し、より良好に機能する場合もあること
を示す。
【００７９】「モザイク」組換え体の使用は、所望の抗
原決定基を表示するが、イムノアッセイにおいて使用さ
れるペプチドよりも固相への直接コーティングにより一
層容易に結合できるという利点を提供する。更に、ペプ
チドに比較して長さが増加されそしてより構造がより安
定化されるために、組換え体はより一層正確な測定を与
える。本明細書中に言及される全ての資料は参考として
本明細書中に組み込まれる。従って、本発明は、特許請
求の範囲内に入る全ての変更を包含すると理解すべきで
ある。
原決定基を表示するが、イムノアッセイにおいて使用さ
れるペプチドよりも固相への直接コーティングにより一
層容易に結合できるという利点を提供する。更に、ペプ
チドに比較して長さが増加されそしてより構造がより安
定化されるために、組換え体はより一層正確な測定を与
える。本明細書中に言及される全ての資料は参考として
本明細書中に組み込まれる。従って、本発明は、特許請
求の範囲内に入る全ての変更を包含すると理解すべきで
ある。
【００８０】
【表７】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. <120> PEPTIDES FOR THE DETECTION OF HIV-1 GROUP O <130> A997238 <140> JP 11-338385 <141> 1999-11-29 <150> US 60/110292 <151> 1998-11-30 <150> US 60/119138 <151> 1999-2-8 <150> <151> 1999-11-4 <160> 69 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 1 Arg Leu Leu Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Ser 1 5 10 15 Leu Trp Gly Cys Lys Gly Lys Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Lys Trp 20 25 30 Asn <210> 2 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 2 Arg Leu Gln Ala Leu Glu Thr Leu Ile Gln Asn Gln Gln Arg Leu Asn 1 5 10 15 Leu Trp Gly Cys Lys Gly Lys Leu Ile Cys Tyr Thr Ser Val Lys Trp 20 25 30 Asn <210> 3 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 3 Arg Leu Leu Ala Leu Glu Thr Phe Ile Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn 1 5 10 15 Leu Trp Gly Cys Lys Asn Arg Leu Ile Cys Tyr Thr Ser Val Lys Trp 20 25 30 Asn <210> 4 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 4 Arg Leu Leu Ala Leu Glu Thr Leu Ile Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn 1 5 10 15 Leu Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Lys Trp 20 25 30 Asn <210> 5 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 5 Arg Leu Leu Ala Leu Glu Thr Leu Ile Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn 1 5 10 15 Leu Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Ile Cys Tyr Thr Ser Val Lys Trp 20 25 30 Asn <210> 6 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 6 Arg Leu Leu Ala Leu Glu Thr Leu Ile Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn 1 5 10 15 Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Glu Trp 20 25 30 Asn <210> 7 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 7 Arg Leu Leu Ala Leu Glu Thr Leu Ile Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn 1 5 10 15 Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Gln Val Cys Tyr Thr Ser Val Lys Trp 20 25 30 Asn <210> 8 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 8 Arg Leu Leu Ala Leu Glu Thr Leu Ile Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn 1 5 10 15 Leu Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Ile Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp 20 25 30 Asn <210> 9 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 9 Arg Leu Leu Ala Leu Glu Thr Leu Met Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn 1 5 10 15 Leu Trp Gly Cys Lys Gly Arg Ile Leu Cys Tyr Thr Ser Val Lys Trp 20 25 30 Asn <210> 10 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 10 Arg Leu Leu Ala Leu Glu Thr Leu Ile Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn 1 5 10 15 Leu Trp Gly Cys Lys Gly Arg Ile Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp 20 25 30 Asn <210> 11 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 11 Arg Leu Leu Ala Leu Glu Thr Leu Ile Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn 1 5 10 15 Leu Trp Gly Cys Lys Gly Lys Ile Val Cys Tyr Thr Ser Val Glu Trp 20 25 30 Asn <210> 12 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 12 Arg Leu Leu Ala Leu Glu Thr Leu Met Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn 1 5 10 15 Leu Trp Gly Cys Lys Gly Lys Leu Ile Cys Tyr 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immunodeficiency virus type 1 <400> 17 Arg Leu Gln Ala Leu Glu Thr Leu Met Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn 1 5 10 15 Leu Trp Gly Cys Lys Gly Lys Ser Ile Cys Tyr Thr Ser Val Lys Trp 20 25 30 Asn <210> 18 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 18 Arg Leu Leu Ala Leu Glu Thr Phe Val Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn 1 5 10 15 Leu Trp Gly Cys Lys Gly Arg Ile Val Cys Tyr Thr Ser Val Lys Trp 20 25 30 Asn <210> 19 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 19 Arg Leu Leu Ala Leu Glu Thr Leu Met Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn 1 5 10 15 Leu Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Ile Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp 20 25 30 Asn <210> 20 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 20 Arg Leu Gln Ala Leu Glu Thr Leu Ile Gln Asn Gln Gln Leu Leu Ser 1 5 10 15 Leu Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Lys Trp 20 25 30 His <210> 21 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 21 Arg Leu Leu Ala Leu Glu Thr Leu Ile Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn 1 5 10 15 Leu Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Leu Cys Tyr Thr Ser Val Lys Trp 20 25 30 Asn <210> 22 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 22 Arg Leu Leu Ala Leu Glu Thr Phe Ile Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn 1 5 10 15 Leu Trp Gly Cys Lys Gly Lys Leu Ile Cys Tyr Thr Ser Val Glu Trp 20 25 30 Asn <210> 23 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 23 Arg Leu Gln Ala Leu Glu Thr Leu Met Gln Asn Gln Gln Arg Leu Asp 1 5 10 15 Leu Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Ile Cys Tyr Thr Ser Val Lys Trp 20 25 30 Asn <210> 24 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 24 Arg Leu Gln Ala Leu Glu Pro Leu Ile Gln Asn Gln Gln Arg Leu Ser 1 5 10 15 Leu Trp Gly Cys Lys Gly Arg Ile Ile Cys Tyr Thr Ser Ala Lys Trp 20 25 30 Asn <210> 25 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 25 Arg Leu Leu Ala Leu Glu Thr Leu Ile Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn 1 5 10 15 Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr 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immunodeficiency virus type 1 <400> 30 Arg Leu Leu Ala Leu Glu Thr Leu Ile Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn 1 5 10 15 Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Ile Val Cys Tyr Thr Ser Val Lys Trp 20 25 30 Asn <210> 31 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 31 Glu Arg Glu Ile Asp Asn Tyr Thr Ser Leu Ile Tyr Ser Leu Leu Glu 1 5 10 15 Lys Ser Gln Thr Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu 20 25 30 Asp <210> 32 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 32 Asp Arg Gln Ile Ser Asn Ile Ser Ser Thr Ile Tyr Glu Glu Ile Gln 1 5 10 15 Lys Ala Gln Val Gln Gln Glu Gln Asn Glu Lys Lys Leu Leu Glu Leu 20 25 30 Asp <210> 33 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 33 Asp Gln His Ile Asn Asn Val Ser Ser Ile Ile Tyr Asp Glu Ile Gln 1 5 10 15 Ala Ala Gln Asp Gln Gln Glu Lys Asn Val Lys Ala Leu Leu Glu Leu 20 25 30 Asp <210> 34 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 34 Asp Gln Gln Ile Asn Asn Val Ser Ser Phe Ile Tyr Glu Lys Ile Gln 1 5 10 15 Glu Ala Gln Glu Gln Gln Glu Lys Asn Glu Lys Glu Leu Leu Glu Leu 20 25 30 Asp <210> 35 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 35 Asp Gln Gln Ile Asp Asn Ile Ser Ser Thr Ile Tyr Asp Glu Ile Gln 1 5 10 15 Lys Ala Gln Val Gln Gln Glu Gln Asn Glu Gln Lys Leu Leu Glu Leu 20 25 30 Asp <210> 36 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 36 Asp Gln Gln Ile Asn Asn Ile Ser Ser Ile Ile Tyr Gly Glu Ile Gln 1 5 10 15 Lys Ala Gln Val Gln Gln Glu Glu Asn Glu Lys Lys Leu Leu Glu Leu 20 25 30 Asp <210> 37 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 37 Asp Gln Gln Ile Asn Asn Ile Ser Ser Ile Ile Tyr Gly Glu Ile Gln 1 5 10 15 Lys Ala Gln Val Gln Gln Glu His Asn Glu Lys Lys Leu Leu Glu Leu 20 25 30 Asp <210> 38 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 38 Asp Gln Gln Val Asn Asn Val Ser Ser Phe Ile Tyr Asp Lys Ile Gln 1 5 10 15 Glu Ala Gln Glu Gln Gln Glu Glu Asn Glu Arg Ala Leu Leu Glu Leu 20 25 30 Asp <210> 39 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 39 Asp Gln Gln Ile Ser Asn Val Ser Ser Ile Ile Tyr Glu Glu Ile Gln 1 5 10 15 Lys Ala Gln Glu Gln Gln Glu Gln Asn Glu Lys Lys Leu Leu Glu Leu 20 25 30 Asp <210> 40 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 40 Asp Gln Gln Ile Ala Asn Val Ser Ser Phe Ile Tyr Asp Gln Ile Gln 1 5 10 15 Glu Ala Gln Glu Arg Gln Asp Lys Asn Glu Lys Thr Leu Leu Glu Leu 20 25 30 Asp <210> 41 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 41 Asp Gln Gln Ile Asp Asn Val Ser Ser Thr Ile Tyr Glu Glu Ile Leu 1 5 10 15 Lys Ala Gln Ile Gln Gln Glu Gln Asn Glu Lys Lys Leu Leu Glu Leu 20 25 30 Asp <210> 42 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 42 Asp Arg Glu Ile Asp Asn Ile Ser Ser Tyr Ile Tyr Glu Lys Ile Gln 1 5 10 15 Glu Ala Gln Asp Gln Gln Glu Asn Asn Glu Arg Glu Leu Leu Glu Leu 20 25 30 Asp <210> 43 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 43 Asp Lys Gln Ile Ser Asn Ile Ser Ser Ile Ile Tyr Asp Glu Ile Gln 1 5 10 15 Thr Ala Gln Asp Gln Gln Glu Arg Asn Val Lys Ala Leu Leu Glu Leu 20 25 30 Asp <210> 44 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 44 Asp Gln Gln Val Asn Asn Val Ser Ser Ile Ile Tyr Glu Glu Ile Gln 1 5 10 15 Arg Ala Gln Val Gln Gln Glu Gln Asn Glu Lys Arg Leu Leu Glu Leu 20 25 30 Asp <210> 45 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 45 Asp Gln Gln Ile Asp Asn Val Ser Ser Ile Ile Tyr Glu Glu Ile Gln 1 5 10 15 Lys Ala Gln Gly Gln Gln Glu Gln Asn Glu Lys Lys Leu Leu Glu Leu 20 25 30 Asp <210> 46 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: HIV Consensus Sequence <400> 46 attttggaag cccaggatca acaagaggag aacgttcgtg agttgctgga gctagataaa 60 tgg 63 <210> 47 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: HIV Consensus Sequence <400> 47 agcaagttaa caatgtttct tctattattt atgataagat tttggaagcc caggatca 58 <210> 48 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: HIV Consensus Sequence <400> 48 attttggaag cccaggatca acaagaggag aacgttcgtg agttgctgga gctagataaa 60 tgg 63 <210> 49 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: HIV Consensus Sequence <400> 49 agcaagttaa caatgtttct tctattattt atgataagat tttggaagcc caggatca 58 <210> 50 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: HIV Consensus Sequence <400> 50 ccagatatcc tccagagact tattagacca agaagcatgc caacgggcac tagtataaca 60 aa 62 <210> 51 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: HIV Consensus Sequence <400> 51 acattgttaa cttgctggtc ccattgcatc caggtcatgt tatcccagat atcctccaga 60 ga 62 <210> 52 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: HIV Consensus Sequence <400> 52 ccagatatcc tccagagact tattagacca agaagcatgc caacgggcac tagtataaca 60 aa 62 <210> 53 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: HIV Consensus Sequence <400> 53 acattgttaa cttgctggtc ccattgcatc caggtcatgt tatcccagat atcctccaga 60 ga 62 <210> 54 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: HIV Consensus Sequence <400> 54 accggaattc cgatttcctt gggtt 25 <210> 55 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: HIV Consensus Sequence <400> 55 cataaagctt gtcccagaag ttcc 24 <210> 56 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: HIV Consensus Sequence <400> 56 gccactgcag ccagactatt attgtc 26 <210> 57 <211> 439 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:HIV Consensus Sequence <400> 57 Met Arg Gly Ser Gly Ile Met Val Arg Pro Leu Asn Ser Ile Val Ala 1 5 10 15 Val Ser Gln Asn Met Gly Ile Gly Lys Asn Gly Asp Leu Pro Trp Pro 20 25 30 Pro Leu Arg Asn Glu Phe Lys Tyr Phe Gln Arg Met Thr Thr Thr Ser 35 40 45 Ser Val Glu Gly Lys Gln Asn Leu Val Ile Met Gly Arg Lys Thr Trp 50 55 60 Phe Ser Ile Pro Glu Lys Asn Arg Pro Leu Lys Asp Arg Ile Asn Ile 65 70 75 80 Val Leu Ser Arg Glu Leu Lys Glu Pro Pro Arg Gly Ala His Phe Leu 85 90 95 Ala Lys Ser Leu Asp Asp Ala Leu Arg Leu Ile Glu Gln Pro Glu Leu 100 105 110 Ala Ser Lys Val Asp Met Val Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr 115 120 125 Gln Glu Ala Met Asn Gln Pro Gly His Leu Arg Leu Phe Val Thr Arg 130 135 140 Ile Met Gln Glu Phe Glu Ser Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu 145 150 155 160 Gly Lys Tyr Lys Leu Leu Pro Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Glu Val 165 170 175 Gln Glu Glu Lys Gly Ile Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Lys 180 185 190 Gly Ser Arg Ser Ala Arg Leu Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln 195 200 205 Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Met Leu Gln Leu 210 215 220 Thr Ala Trp Gly Ile Lys Gln Leu Arg Ala Arg Leu Gln Ala Leu Glu 225 230 235 240 Thr Leu Met Gln Asn Gln Gln Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly 245 250 255 Arg Ile Ile Cys Tyr Thr Ser Ala Arg Trp His Ala Ser Trp Ser Asn 260 265 270 Lys Ser Leu Glu Asp Ile Trp Asp Asn Met Thr Trp Met Gln Trp Asp 275 280 285 Gln Gln Val Asn Asn Val Ser Ser Ile Ile Tyr Asp Lys Ile Leu Glu 290 295 300 Ala Gln Asp Gln Gln Glu Glu Asn Val Arg Glu Leu Leu Glu Leu Asp 305 310 315 320 Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe Asp Ile Thr Asn Trp Leu Trp 325 330 335 Tyr Ile Lys Ile Phe Ile Met Ile Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Arg 340 345 350 Ile Val Phe Ala Val Leu Ser Ile Val Asn Arg Val Arg Gln Gly Tyr 355 360 365 Ser Pro Leu Ser Leu Gln Thr Arg Pro Pro Val Pro Arg Gly Pro Asp 370 375 380 Arg Pro Glu Gly Ile Glu Glu Glu Gly Gly Glu Arg Asp Arg Asp Thr 385 390 395 400 Ser Gly Arg Leu Val His Gly Phe Leu Ala Ile Ile Trp Val Asp Leu 405 410 415 Gly Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val 420 425 430 Asp His His His His His His 435 <210> 58 <211> 368 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:HIV Consensus Sequence <400> 58 Met Arg Gly Ser Gly Ile Met Val Arg Pro Leu Asn Ser Ile Val Ala 1 5 10 15 Val Ser Gln Asn Met Gly Ile Gly Lys Asn Gly Asp Leu Pro Trp Pro 20 25 30 Pro Leu Arg Asn Glu Phe Lys Tyr Phe Gln Arg Met Thr Thr Thr Ser 35 40 45 Ser Val Glu Gly Lys Gln Asn Leu Val Ile Met Gly Arg Lys Thr Trp 50 55 60 Phe Ser Ile Pro Glu Lys Asn Arg Pro Leu Lys Asp Arg Ile Asn Ile 65 70 75 80 Val Leu Ser Arg Glu Leu Lys Glu Pro Pro Arg Gly Ala His Phe Leu 85 90 95 Ala Lys Ser Leu Asp Asp Ala Leu Arg Leu Ile Glu Gln Pro Glu Leu 100 105 110 Ala Ser Lys Val Asp Met Val Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr 115 120 125 Gln Glu Ala Met Asn Gln Pro Gly His Leu Arg Leu Phe Val Thr Arg 130 135 140 Ile Met Gln Glu Phe Glu Ser Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu 145 150 155 160 Gly Lys Tyr Lys Leu Leu Pro Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Glu Val 165 170 175 Gln Glu Glu Lys Gly Ile Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Lys 180 185 190 Gly Ser Arg Ser Ala Arg Leu Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln 195 200 205 Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Met Leu Gln Leu 210 215 220 Thr Ala Trp Gly Ile Lys Gln Leu Arg Ala Arg Leu Gln Ala Leu Glu 225 230 235 240 Thr Leu Met Gln Asn Gln Gln Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly 245 250 255 Arg Ile Ile Cys Tyr Thr Ser Ala Arg Trp His Ala Ser Trp Ser Asn 260 265 270 Lys Ser Leu Glu Asp Ile Trp Asp Asn Met Thr Trp Met Gln Trp Asp 275 280 285 Gln Gln Val Asn Asn Val Ser Ser Ile Ile Tyr Asp Lys Ile Leu Glu 290 295 300 Ala Gln Asp Gln Gln Glu Glu Asn Val Arg Glu Leu Leu Glu Leu Asp 305 310 315 320 Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe Asp Ile Thr Asn Trp Leu Trp 325 330 335 Tyr Ile Lys Ile Phe Ile Met Ile Val Gly Pro Glu Gln Lys Leu Ile 340 345 350 Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His 355 360 365 <210> 59 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:HIV Consensus Sequence <400> 59 Asn Gln Gln Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Ile Ile Cys 1 5 10 15 Tyr Thr Ser Ala Arg Trp His 20 <210> 60 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:HIV Consensus Sequence <400> 60 Xaa Gln Gln Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Ile Ile Cys 1 5 10 15 Tyr Thr Ser Ala Arg Trp His 20 <210> 61 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:HIV Consensus Sequence <400> 61 Glu Gln Gln Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Ile Ile Cys 1 5 10 15 Tyr Thr Ser Ala Arg Trp His 20 <210> 62 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:HIV Consensus Sequence <400> 62 Glu Thr Leu Met Gln Xaa Gln Gln Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys 1 5 10 15 Gly Arg Ile Ile Cys Tyr Thr Ser Ala Arg Trp His 20 25 <210> 63 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:HIV Consensus Sequence <400> 63 Gly Arg Glu Thr Leu Met Gln Xaa Gln Gln Arg Leu Asn Ser Trp Gly 1 5 10 15 Cys Lys Gly Arg Ile Ile Cys Tyr Thr Ser Ala Arg Trp His 20 25 30 <210> 64 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:HIV Consensus Sequence <400> 64 Arg Ala Arg Leu Gln Ala Leu Glu Thr Leu Met Gln Xaa Gln Gln Arg 1 5 10 15 Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Ile Ile Cys Tyr Thr Ser Ala 20 25 30 Arg Trp His 35 <210> 65 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:HIV Consensus Sequence <400> 65 Asp Gln Gln Val Asn Asn Val Ser Ser Ile Ile Tyr Asp Lys Ile Leu 1 5 10 15 Glu Ala Gln Asp Gln Gln Glu Glu Asn Val Arg Glu Leu Leu Glu Leu 20 25 30 Asp <210> 66 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:HIV Consensus Sequence <400> 66 Ala Arg Leu Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu 1 5 10 15 Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Met Leu Gln Leu Thr Ala Trp Gly 20 25 30 Ile Lys Gln Leu Arg Ala Arg Leu Gln Ala Leu Glu Thr Leu Met Gln 35 40 45 Asn Gln Gln Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Ile Ile Cys 50 55 60 Tyr Thr Ser Ala Arg Trp His Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu 65 70 75 80 Asp Ile Trp Asp Asn Met Thr Trp Met Gln Trp Asp Gln Gln Val Asn 85 90 95 Asn Val Ser Ser Ile Ile Tyr Asp Lys Ile Leu Glu Ala Gln Asp Gln 100 105 110 Gln Glu Glu Asn Val Arg Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser 115 120 125 Leu Trp Asn Trp Phe Asp Ile Thr Asn Trp Leu Trp Tyr Ile Lys Ile 130 135 140 Phe Ile Met Ile Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Arg Ile Val Phe Ala 145 150 155 160 Val Leu Ser Ile Val Asn Arg Val Arg Gln Gly Tyr Ser Pro Leu Ser 165 170 175 Leu Gln Thr Arg Pro Pro Val Pro Arg Gly Pro Asp Arg Pro Glu Gly 180 185 190 Ile Glu Glu Glu Gly Gly Glu Arg Asp Arg Asp Thr Ser Gly Arg Leu 195 200 205 Val His Gly Phe Leu Ala Ile Ile Trp Val Asp Leu 210 215 220 <210> 67 <211> 149 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:HIV Consensus Sequence <400> 67 Ala Arg Leu Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu 1 5 10 15 Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Met Leu Gln Leu Thr Ala Trp Gly 20 25 30 Ile Lys Gln Leu Arg Ala Arg Leu Gln Ala Leu Glu Thr Leu Met Gln 35 40 45 Asn Gln Gln Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Ile Ile Cys 50 55 60 Tyr Thr Ser Ala Arg Trp His Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu 65 70 75 80 Asp Ile Trp Asp Asn Met Thr Trp Met Gln Trp Asp Gln Gln Val Asn 85 90 95 Asn Val Ser Ser Ile Ile Tyr Asp Lys Ile Leu Glu Ala Gln Asp Gln 100 105 110 Gln Glu Glu Asn Val Arg Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser 115 120 125 Leu Trp Asn Trp Phe Asp Ile Thr Asn Trp Leu Trp Tyr Ile Lys Ile 130 135 140 Phe Ile Met Ile Val 145 <210> 68 <211> 23 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 68 Asn Gln Gln Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Lys Gly Lys Leu Val Cys 1 5 10 15 Tyr Thr Ser Val Lys Trp Asn 20 <210> 69 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: HIV Consensus Sequence <400> 69 Gly Arg Glu Thr Leu Met Gln Asp Gln Gln Arg Leu Asn Ser Trp Gly 1 5 10 15 Cys Lys Gly Arg Ile Ile Cys Tyr Thr Ser Ala Arg Trp His 20 25 30
【図１】図１は、ＨＩＶ−１ Ｏ群の免疫優性領域アミ
ノ酸配列の整列を示す。
ノ酸配列の整列を示す。
【図２】図２は、ＨＩＶ−１ Ｏ群の試料によるペプチ
ド147 およびペプチド80の認識を示す。
ド147 およびペプチド80の認識を示す。
【図３】図３は、gp41の外表領域を示す（ＭＮ分離
株）。
株）。
【図４】図４は、下降ヘリックスの領域中のＭＮ（Ｂ
型）およびＯ群gp41配列の整列を示す。
型）およびＯ群gp41配列の整列を示す。
【図５】図５は、重複する合成オリゴヌクレオチドを使
った免疫優性領域の段階的再構成と置換を示す。
った免疫優性領域の段階的再構成と置換を示す。
【図６】図６は、重複する合成オリゴヌクレオチドを使
った免疫優性領域の段階的再構成と置換を示す。
った免疫優性領域の段階的再構成と置換を示す。
【図７】図７は、重複する合成オリゴヌクレオチドを使
った免疫優性領域の段階的再構成と置換を示す。
った免疫優性領域の段階的再構成と置換を示す。
【図８】図８は、図３において使用したプライマーのヌ
クレオチド配列を示す。
クレオチド配列を示す。
【図９】図９は、DHFR-hENV-MHのアミノ酸配列を示す。
【図１０】図１０は、DHFR-hES-MH のアミノ酸配列を示
す。
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｈ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 ジャン チェン アメリカ合衆国，ニュージャージー 08869，ラリタン，レンジ ロード ７
Claims (15)
- 【請求項１】 次のアミノ酸配列：ＮＱＱＲＬＮＳＷＧ
ＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，ＥＱＱＲＬＮＳＷＧＣ
ＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，ＧＲＥＴＬＭＱＤＱＱＲ
ＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，ＸＱＱＲＬ
ＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，ＥＴＬＭＱＸ
ＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，ＲＡ
ＲＬＱＡＬＥＴＬＭＱＮＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩ
ＣＹＴＳＡＲＷＨ，およびＤＱＱＶＮＮＶＳＳＩＩＹＤ
ＫＩＬＥＡＱＤＱＱＥＥＮＶＲＥＬＬＥＬＤから成る群
より選ばれたアミノ酸配列を含んで成るペプチド、また
はそれの機能的誘導体。 - 【請求項２】 前記ペプチドが抗原性である、請求項１
に記載のペプチド。 - 【請求項３】 前記ペプチドが抗ＨＩＶ Ｏ群抗体と結
合する、請求項１に記載のペプチド。 - 【請求項４】 請求項１に記載のペプチドに対して惹起
された抗体。 - 【請求項５】 前記ペプチドが組換え化学法または合成
化学法により製造される、請求項１に記載のペプチド。 - 【請求項６】 請求項１に記載のペプチドをコードする
核酸配列。 - 【請求項７】 請求項６に記載の核酸配列を含有する発
現ベクター。 - 【請求項８】 請求項８に記載の発現ベクターを含有す
る宿主細胞。 - 【請求項９】 組換え宿主細胞中でのペプチドの発現方
法であって、(a) 請求項７に記載の発現ベクターを適当
な宿主細胞中に導入する段階、および(b) 前記発現ベク
ターからの前記ペプチドの発現を可能にする条件下で、
段階(a) の宿主細胞を培養する段階を含んで成る方法。 - 【請求項１０】 試験キットであって、ＮＱＱＲＬＮＳ
ＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，ＥＱＱＲＬＮＳＷ
ＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，ＧＲＥＴＬＭＱＤＱ
ＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，ＸＱＱ
ＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，ＥＴＬＭ
ＱＸＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，
ＲＡＲＬＱＡＬＥＴＬＭＱＮＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲ
ＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，ＤＱＱＶＮＮＶＳＳＩＩＹＤＫ
ＩＬＥＡＱＤＱＱＥＥＮＶＲＥＬＬＥＬＤから成る群よ
り選ばれた１もしくは複数のペプチド、それの機能的誘
導体、前記ペプチドに結合する抗体、または前記機能的
誘導体に結合する抗体を含んで成る試験キット。 - 【請求項１１】 試験管内診断アッセイ方法であって、
ＮＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，Ｅ
ＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，ＧＲ
ＥＴＬＭＱＤＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡ
ＲＷＨ，ＸＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲ
ＷＨ，ＥＴＬＭＱＸＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹ
ＴＳＡＲＷＨ，ＲＡＲＬＱＡＬＥＴＬＭＱＮＱＱＲＬＮ
ＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，およびＤＱＱＶ
ＮＮＶＳＳＩＩＹＤＫＩＬＥＡＱＤＱＱＥＥＮＶＲＥＬ
ＬＥＬＤから成る群より選ばれた１もしくは複数のペプ
チドまたはそれの機能的誘導体と試料とを接触させ、そ
して前記ペプチドと抗体との間の結合を測定することを
含んで成る試験管内診断アッセイ方法。 - 【請求項１２】 試験管内診断アッセイ方法であって、
請求項１のペプチドまたはそれの機能的誘導体に対して
惹起せしめた１または複数の抗体と試料とを接触させ、
そして前記抗体と抗原との間の結合を測定することを含
んで成る方法。 - 【請求項１３】 組換えＭ群gp41タンパク質を含んで成
るモザイクであって、Ｍ群免疫優性領域が１または複数
のＯ様免疫優性配列により置き換えられているモザイ
ク。 - 【請求項１４】 前記Ｏ様免疫優性配列が、ＮＱＱＲＬ
ＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，ＥＱＱＲＬＮ
ＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，ＧＲＥＴＬＭＱ
ＤＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，Ｘ
ＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，ＥＴ
ＬＭＱＸＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷ
Ｈ，ＲＡＲＬＱＡＬＥＴＬＭＱＮＱＱＲＬＮＳＷＧＣＫ
ＧＲＩＩＣＹＴＳＡＲＷＨ，ＤＱＱＶＮＮＶＳＳＩＩＹ
ＤＫＩＬＥＡＱＤＱＱＥＥＮＶＲＥＬＬＥＬＤ，および
それの機能的誘導体から成る群より選ばれる、請求項１
３に記載のモザイク。 - 【請求項１５】 Ｍ群免疫優性領域が１または複数のＯ
様免疫優性配列により置き換えられている組換えＭ群gp
41タンパク質を含んで成るモザイクであって、 【化１】 および 【化２】 から成る群より選ばれるモザイク。
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