JPH0616569A - 免疫学的担体特性および免疫促進特性を有するナイセリア・メニンギチジスの外膜のクラスｉｉ蛋白、およびそれを含むワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉ
ｓ血清型ｂの外膜から直接精製あるいはＮｅｉｓｓｅｒ
ｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＭＩＥＰをコードす
るＤＮＡをクローニングし組換え発現させて得られたＮ
ｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのクラスＩ
Ｉ主要免疫促進蛋白（ＭＩＥＰ）。 【効果】本発明のＭＩＥＰは免疫担体特性、免疫促進お
よび細胞分裂促進特性を有し、抗原と結合させて投与す
ると結合抗原に対する免疫反応を促進する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本出願は１９９０年７月１９日に出願した
米国特許出願第５５５，３２９号の一部継続出願であ
る。ナイセリア メニンギチジス（Neisseria meningit
idis、髄膜炎菌）の外膜複合タンパク質（ＯＭＰＣ）は
ヒト用ワクチンの免疫担体として使用される。ＯＭＰＣ
は種々のタンパク質並びにリポ多糖（リポポリサッカリ
ドＬＰＳ又は内毒素）を含む膜脂質を含有する小胞体か
らなる。ＯＭＰＣは免疫増強特性を有し、抗体がこれに
化学的に結合した場合この抗原に対する抗体応答が増大
する。ＯＭＰＣは現在ヘモフィルスインフルエンザ（Ha
emophilus influenzae、インフルエンザ菌）のような感
染因子に対するヒト乳児用ワクチンに用いられ、Ｈ．イ
ンフルエンゼのポリリボシルリビトールホスフェート
（ＰＲＰ）をＯＭＰＣに化学的に結合した場合乳児のＰ
ＲＰに対するＩｇＧ及び記憶免疫応答を高めることがで
きる。

【０００２】ＯＭＰＣは種々のタンパク質及び脂質の混
合物であり、どのＯＭＰＣの成分又は成分群が結合した
抗原に有益な免疫増強効果を与えるかは知られていなか
った。しかしながらヒトワクチンに使用するＯＭＰＣの
いくつかの潜在的にマイナスの要素としては熱内毒素シ
ョック、低血圧症、好中球減少症、別の補体経路の活性
化、脈管内凝固及び恐らくは死のようなＬＰＳに関連し
た反応である。更にその上ＯＭＰＣ−抗原結合体は極め
て不均一であり、抗原はＯＭＰＣを構成する任意のタン
パク質部分に結合することができる。

【０００３】本発明の目的は他のナイセリアメニンギチ
ジス外膜成分を含まない、ナイセリアメニンギチジスの
外膜に直接由来する実質的に純粋なクラスII主要免疫増
強タンパク質（ＭＩＥＰ）を提供することである。本発
明の別の目的は他のナイセリアメニンギチジスタンパク
質を全く含まない、組換え宿主細胞に於て生産されるナ
イセリアメニンギチジスの外膜の実質的に純粋な組換え
体ＭＩＥＰを提供することである。更に本発明の目的は
ナイセリアメニンギチジスの外膜から直接精製されるＭ
ＩＥＰ又は組換え宿主細胞に於て生産されるナイセリア
メニンギチジスの組換え体ＭＩＥＰからなる、抗原に対
する免疫応答増強に有効な免疫担体タンパク質を提供す
ることである。本発明のもう１つの目的はナイセリアメ
ニンギチジスの外膜から直接精製されるＭＩＥＰ又は組
換え宿主細胞に於て生産されるナイセリアメニンギチジ
スの組換え体ＭＩＥＰからなる免疫マイトジェン活性を
有するタンパク質を提供することである。本発明の別の
目的は組換え体ＭＩＥＰ又はナイセリアメニンギチジス
の外膜から直接精製されるＭＩＥＰを含むワクチン組成
物を提供することである。これらの及び他の目的は次の
記述から明らかになるであろう。

【０００４】要約すると本発明は他の混入しているＮ．
メニンギチジス外膜タンパク質及びＬＰＳを含まない実
質的に純粋な形のナイセリアメニンギチジス外膜のクラ
スII主要免疫増強タンパク質（ＭＩＥＰ）に関する。ナ
イセリアメニンギチジス細胞の外膜から直接精製される
かあるいはナイセリアメニンギチジスの組換え体ＭＩＥ
Ｐを産生する組換え宿主細胞に由来する本発明のＭＩＥ
Ｐは免疫担体及びマイトジェン活性を有する。抗原に結
合した場合、本発明のＭＩＥＰは免疫を増強することが
でき、結合抗原に対する抗体応答を促進するか又は抗原
をＩｇＧクラスの免疫グロブリンが産生されることが確
実なＴ細胞依存性抗原に転換する。本発明のＭＩＥＰに
結合することができる抗原としてはウイルスタンパク
質、細菌タンパク質及び多糖類、合成ペプチド、他の免
疫原性抗原及び弱又は非免疫原性抗原がある。

【０００５】以下本発明を詳細に説明するそれだけでは
ＩｇＭクラスのみの抗体と無記憶からなる免疫応答を誘
発させるだけのある種の物質を、強力な（Ｔ−細胞依存
性）抗原物質に化学結合させることによりＩｇＭ及びＩ
ｇＧ抗体を誘発する完全な免疫原抗原に転換することが
できることは既知である。この免疫現象は“担体効果”
と呼ばれるが弱又は無免疫原性部分及び強力な抗原物質
は各々“ハプテン”及び“担体”と呼ばれる。ハプテン
−担体複合体を動物に注入するとＢ−リンパ球による抗
体の生成が生じそのいくつかはハプテンに特異的でこれ
に結合し、他のものは担体に特異的でこれに結合する。
担体効果の別の特徴はこれ以後にハプテン−担体複合体
にさらされると、ハプテンに対して激しい応答が続いて
起ることである。これは記憶又は既往性応答と呼ばれ
る。担体効果は“ヘルパーＴ−リンパ球”と言われるあ
る種Ｔ−リンパ球によって仲介される機能を含むと思わ
れる。担体分子はヘルパーＴ−リンパ球を刺激して抗−
ハプテンＩｇＧクラス抗体−産生Ｂ−リンパ球及び記憶
応答の生成をある方法で助ける。

【０００６】ヘルパーＴ−リンパ球は通常は“Ｔ−依存
性”抗原と呼ばれるある種の抗原に特異的であるが“Ｔ
−非依存性”抗原と呼ばれる他の抗原には特異的でない
抗体のＢ−リンパ球による産生に関与する。担体分子は
Ｔ−非依存性、弱又は非免疫原ハプテンをＴ−依存性強
力抗原分子に変換することができる。更にその上、記憶
応答はこれ以後にハプテン−担体複合体にさらされると
記憶応答が続いて起り、これはＩｇＧを主とし、Ｔ−依
存性抗原に特有でありＴ−非依存性抗原に特有ではな
い。担体分子の有用性はＴ−非依存性抗原で使用するこ
とに限定されずＴ−依存性抗原で使用することもでき
る。Ｔ−依存性抗原に対する抗体応答は抗原がそれ自体
で抗体応答を誘発させることができる場合でさえ抗原を
担体に結合させることによって増強することができる。

【０００７】他の分子のあるものは全体の免疫系を一般
的に刺激する能力を有している。これらの分子は“マイ
トジェン”と呼ばれ、植物タンパク質並びに細菌性産物
を包含する。マイトジェンはＴ及び／又はＢ−リンパ球
を増殖させ、食作用の増加、感染に対する耐性の増加、
腫瘍免疫の促進及び抗体産生を含む免疫応答の多くの態
様を広く増強することができる。多くの感染症原因物質
はそれ自体で病気原因物質とその副産物に結合して破
壊、無害にするか又は破壊又は無害にさせることができ
る保護抗体を誘発することができる。これらの疾患から
の回復は通常感染性物質の強い抗原性成分に対して生じ
る保護抗体による長い永続的な免疫をもたらす。

【０００８】保護抗体はヒト及び多くの他の動物の自然
防禦機構の一部であり、血液並びに他の組織及び体液に
見られる。感染性物質及び／又はこれらの副産物に対し
て保護抗体を病気の原因とならずに誘発することはほと
んどのワクチンの主要機能である。Ｎ．メニギチジスか
らのＯＭＰＣはＯＭＰＣを細菌多糖類を含めたＴ−細胞
非依存性抗原に化学的に結合した場合ヒトに於て抗体応
答を誘発させるために使用することに成功している。Ｏ
ＭＰＣは数種の細菌外膜タンパク質並びに細菌脂質を含
有している。更にＯＭＰＣは小胞体三次元構造を有す
る。

【０００９】ＯＭＰＣの免疫担体としての効能は細菌膜
タンパク質、細菌脂質、小胞性三次元構造又は細菌タン
パク質、脂質及び小胞性構造の組合わせの１種以上によ
ると考えられた。出願人はタンパク質の１種ＭＩＥＰが
ＯＭＰＣ小胞の免疫担体及び免疫増強特性を有し、他の
Ｎ．メニンギチジス膜タンパク質及び脂質を含まない精
製形で及び小胞性三次元構造を有さなくても有効である
ことを発見した。出願人はまたＭＩＥＰが細菌多糖類に
結合した場合、多糖類に対する抗体応答を誘発する点で
ＯＭＰＣと同様に機能することを発見した。出願人は更
にＭＩＥＰがＮ．メニンギチジスの外膜のクラスIIタン
パク質であることを発見した。Ｎ．メニンギチジスのク
ラスIIタンパク質はポリタンパク質〔ムラカミ，Ｋ．等
（１９８９年）、インフェクション アンド イムニテ
ィ第５７巻、２３１８〜２３頁〕である。ポリン類は全
てのグラム陰性菌の外膜に見られる。

【００１０】本発明はＮ．メニンギチジスのＭＩＥＰに
よって例示されるが免疫担体及び免疫増強活性を有する
任意のグラム陰性菌からの外膜タンパク質が本発明に包
含されることは当業者に容易に明白である。グラム陰性
菌の具体例としてはナイセリア（Neisseria)、エシェリ
キア（Escherichia)、シュードモナス（Pseudomonas)、
ヘモフィルス（Hemophilus) 、サルモネラ（Salmonell
a) 、シゲラ(Shigella)、ボルデテラ（Bordetella）、
クレブシエラ（Klebsiella）、セラチア（Serratia) 、
エルシニア（Yersinia) 、ビブリオ（Vibrio) 及びエン
テロバクター（Enterobacter) 属の種があるがこれらに
限定されない。

【００１１】ＭＩＥＰは強抗原性、弱抗原性及び非抗原
性物質に対する抗体応答を増強するために使用すること
ができる。本明細書で同じ意味で用いられる“抗原”及
び“抗原物質”としては細菌、ウイルス又は他の由来の
１種以上の非生育性の免疫原弱性免疫原、非免疫原又は
脱感作（抗アレルギー）物質がある。抗原成分は非生育
性の免疫原、弱性免疫原、非免疫原又は脱感作物質又は
物質群を含有する乾燥末、水溶液又は水性懸濁液のよう
な水相等からなることができる。

【００１２】水相は非経口的に使用し得る液体中に抗原
物質を含むことが都合が良い。例えば水相は、抗原を平
衡塩溶液、生理的食塩水、リン酸緩衝食塩溶液、組織培
養液、又は生物体が生育することができる他の媒体に溶
解させたワクチンとすることができる。水相はまた防腐
剤及び／又はワクチン製剤に通常取り入れられる物質を
含有することができる。ＭＩＥＰ結合抗原を含有するア
ジュバントエマルジョンは当該技術で周知の技術を用い
て調製することができる。

【００１３】抗原は細菌、ウイルス、哺乳類細胞、真
菌、リケッチア由来の抗原を含む精製又は一部精製抗原
とすることができるが、これらに限定されない。あるい
は抗原は花粉、塵、鱗屑又はその抽出液を含むアレルゲ
ンであることができるが、これらに限定されない。ある
いは抗原は有毒昆虫又は爬虫類由来の毒物又は毒液を含
む毒物又は毒液とすることができるがこれらに限定され
ない。抗原はまた合成ペプチド、又はより大きなポリペ
プチドの断片又は細菌、哺乳類細胞、真菌、ウイルス、
リケッチア、アレルゲン、毒物又は毒液由来の分子又は
成分の一部分とすることができる。全ての場合に於て抗
原は毒性又はビルレント特性が低下又は破壊されている
形とし、適当な宿主に導入した場合、特異的タンパク
質、ペプチド、微生物、抽出液又は抗原、毒物、毒液の
調製に用いられた微生物の生産的に対する抗体の産生に
よって活性免疫を誘発させるか又はアレルゲンの場合に
は特異的アレルゲンによるアレルギーの症状を軽減する
ことを助ける。

【００１４】抗原は単独で又は組合わせて使用すること
ができ、例えば複数の細菌抗原、複数のウイルス抗原、
複数のマイコプラズマ抗原、複数のリケッチア抗原、複
数の細菌又はウイルストキソイド、複数のアレルゲン、
複数のタンパク質、複数のペプチド又は前述の生産物の
いずれかの組合わせをＭＩＥＰに結合することができ
る。個々の重要な抗原は細菌（Ｂ．パータッシス（pert
ussis 、百日咳菌）、レプトスピラポモナ（Leptospira
pomona)及び黄疸出血性レプトスピラ（ictero-haemorr
hagiae）、Ｓ．パラチフィ（paratyphi)Ａ及びＢ、Ｃ．
ジフテリエ（diphtheriae)、Ｃ．テタニ（tetani、破傷
風菌）、Ｃ．ボツリナム（botulinum.ボツリヌス菌）、
Ｃ．パーフリンゲンス（perfringens.ウェルシュ菌）、
Ｃ．フェセリ（feseri）及び他のガス壊疸菌、Ｂ．アン
スラシス（anthrasis 、炭疸菌）、Ｐ．ペスチス（pest
is) 、Ｐ．マルトシダ（multocida)、Ｖ．コレラ（chol
erae)、ナイセリアメニンギチジス、Ｎ．ゴノレア（gon
orrheae、淋菌）、ヘモフィルス インフルエンゼ、ト
レポネマ パリダム（Treponema palidum 、梅毒トレポ
ネマ）等を含む）、哺乳類細胞（腫瘍細胞、ウイルス感
染細胞、遺伝的に操作した細胞、培養で増殖した細胞、
細胞又は組織抽出液等を包む）、ウイルス（ヒトリンパ
球ウイルス（多重型）、ヒト免疫不全ウイルス（多重変
異型）、ポリオウイルス（多重型）、アデノウイルス
（多重型）、パラインフルエンザウイルス（多重型）、
麻疹、流行性耳下腺炎、ＰＳウイルス、インフルエンザ
ウイルス（多重型）、発疹チフスウイルス（ＳＦ₄ ）、
西部型及び東部型馬脳脊髄炎ウイルス、日本Ｂ脳脊髄
炎、森林ダニ脳脊髄炎、豚コレラウイルス、ニューカッ
スル病ウイルス、鶏痘、狂犬病、猫及び犬ジステンパー
等のウイルスを含む）、リケッチア（流行性及び地方流
行性発疹チフス又は斑点熱群の他の種類を包含する）、
種々のクモ及びヘビ毒液又はサワギク、家庭の塵、花粉
エキス、草の花粉等の任意の既知アレルゲンに由来する
が、これらに限定されない。

【００１５】本発明の多糖類は酸基を有する任意の細菌
多糖類であることができるが個々の種類に限定されるも
のではない。このような細菌多糖類の具体例としてはス
トレプトコッカスニューモニエ（肺炎球菌）型６Ａ，６
Ｂ，１０Ａ，１１Ａ，１８Ｃ，１９Ａ，１６ｆ，２０，
２２Ｆ及び２３Ｆ多糖類、グループＢストレプトコッカ
ス型Ｉａ，Ｉｂ，II及びIII ；ヘモフィルスインフルエ
ンザ血清型ｂ多糖類；ナイセリアメニンギチジス血清グ
ループＡ，Ｂ，Ｃ，Ｘ，Ｙ，Ｗ１３５及び２９Ｅ多糖類
及びエシェリチア コリＫ１，Ｋ１２，Ｋ１３，Ｋ９２
及びＫ１００多糖類がある。しかしながら特に好適な多
糖類はローゼンバーグ等 J. Biol. Chem. 第２３６巻、
２８４５〜２８４９頁（１９６１年）及びザンメンホッ
フ等 J.Biol. Chem. 第２０３巻、６９５〜７０４頁
（１９５３年）に記載されるようなＨ．インフルエンゼ
血清型ｂ多糖類、ロビンス（Robbins)等インフェクショ
ンアンド イムニティ第２６巻 No.３ １１１６〜１１
２２頁（１９７９年１２月）に記載されるようなストレ
プトコッカスニューモニエ（肺炎球菌）６Ｂ型又は６Ａ
型多糖類、Ｃ．Ｊ．リー（Lee)等、レビュース オブ
インフェクシアスディジーズス第３巻、No. ２、３２３
〜３３１頁（１９８１年）に記載されるような肺炎球菌
１９Ｆ型多糖類及びＯ．ラーム（Larm）等、 Adr, Carb
ohyd Chemand Biochem.第３３巻、２９５〜３２１頁
（Ｒ．Ｓ．チプソン（Tipson）等、編集アカデミックプ
レス１９７６年）に記載されるような肺炎球菌２３Ｆ型
多糖類からなる群から選択される莢膜多糖類である。

【００１６】ＭＩＥＰは米国特許第４，４５９，２８６
号及び同第４，８３０，８５２号に記載される通常の方
法で増殖したＮ．メニンギチジスの培養菌由来のＯＭＰ
Ｃから精製することができる。ＯＭＰＣ精製は米国特許
第４，２７１，１４７号及び同第４，８３０，８５２号
に記載される方法に従って行なうことができる。ＭＩＥ
Ｐはまた組換体ＤＮＡ操作される宿主細胞からＭＩＥＰ
をコードしている組換え体ＤＮＡの発現により得ること
ができる。ＭＩＥＰをコードしているＤＮＡはＮ．メニ
ンギチジス細胞〔ムラカミ，Ｋ．等（１９８９年）、イ
ンフェクション アンド イムニティ第５７巻、２３１
８頁〕から得ることができ又はこのＤＮＡは標準のＤＮ
Ａ合成技術を用いて合成的に生産することができる。Ｍ
ＩＥＰをコードしているＤＮＡはこれらに限定されない
が細菌、酵母、昆虫、哺乳類又は他の動物細胞を包含す
る組換え宿主細胞に於て発現させて、組換え体ＭＩＥＰ
を得ることができる。本発明のＭＩＥＰを得るために好
適な方法はＭＩＥＰのＯＭＰＣからの精製とＮ．メニン
ギチジス由来のＭＩＥＰをコードしているＤＮＡの組換
え体ＤＮＡ発現であり、ＯＭＰＣからの精製が最も好ま
しい。

【００１７】精製ＭＩＥＰはＯＭＰＣ小胞から小胞のド
デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶解次にＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって調製し
た。ＭＩＥＰをゲルから溶離し、高pH緩衝液で透析して
濃縮した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動の標準方法
はＭＩＥＰをＯＭＰＣ小胞から精製するために使用する
ことができる。このような方法はモレキュラークローニ
ング：ラボラトリーマニュアル、サムブルック（Sambro
ok）、Ｊ．等、（１９８９年）、（コールドスプリング
ハーバーラボラトリープレス、ニューヨーク）及びカレ
ントプロトコールスインモレキュラーバイオロジー（１
９８７年）（アウスベル（Ausubel)Ｆ．Ｍ．等、編集者
ウイリー及びサンズ，ニューヨーク）に記載される。Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルからタンパク質を溶離す
る標準方法はハンカピラー（Hunkapiller)Ｍ．Ｗ及びル
ジャン（Lujan)、Ｅ．（１９８６年）「ポリアクリルア
ミドゲルによるマイクログラム量のタンパク質の精製」
（「タンパク質の微量特性決定法」Ｊ．シベリー（Shiv
ely)編集、フマンナプレス、クリフトンＮ．Ｊ．）及び
カレント プロトコールス イン モレキュラー バイ
オロジー（１９８７年）、（アウスベル、Ｆ．Ｍ．等、
編集者、ウイリー及びサンズ、ニューヨーク）に記載さ
れる。この方法で調製したＭＩＥＰは細菌、ウイルス、
哺乳類細胞、リケッチア、アレルゲン、毒物又は毒液、
真菌、ペプチド、タンパク質、多糖類又は任意の他の抗
原由来の抗原への結合に容易に適している。

【００１８】組換え体ＭＩＥＰは細菌例えばＥ．コリ又
は酵母例えばＳ．セレビシエ（cerevisiae）に於てＭＩ
ＥＰをコードしているゲノムＮ．メニンギチジスＤＮＡ
を発現させて調製することができる。ＭＩＥＰをコード
しているゲノムＤＮＡを得るためにゲノムＤＮＡをＮ．
メニンギチジスから抽出しマニアチス（Maniatis）、
Ｔ．等（１９７８年）、セル第１５巻、６８７頁の技術
による高分子量ＤＮＡのランダム断片化あるいはスミシ
ース（Smithies) 等、（１９７８年）、サイエンス第２
０２巻、１２４８頁の方法による制限エンドヌクレアー
ゼを用いる切断によるクローニングに調製される。次に
ゲノムＤＮＡを適当なクローニングベクター例えばラム
ダファージに取込まれる〔サムブルック，Ｊ．等、（１
９８９年）モレキュラークローニング、アラボラトリー
マニュアル，コールドスプリングハーバープレス，ニュ
ーヨーク参照〕。また、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）技術（パーキン エルマー）をゲノムＤＮＡの特異
的ＤＮＡ配列を増幅するために使用することができる
〔ルー（Roux) 等、（１９８９年）、バイオテクニクス
第８巻、４８頁〕。ＰＣＲ処理にはゲノムＤＮＡの特異
的ＤＮＡ配列とハイブリダイズさせることができるＤＮ
Ａオリゴヌクレオチドを必要とする。Ｎ．メニンギチジ
スゲノムＤＮＡのＭＩＥＰＤＮＡにハイブリダイズさせ
ることができるＤＮＡオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列
はＭＩＥＰのアミノ酸配列から又はＮ．メニンギチジス
のII類主要膜タンパク質の決定ＤＮＡ配列によって決定
することができる〔ムサカミ（MusaKami）、Ｋ．等、
（１９８９年）インフェクション アンド イムニテ
ィ，第５７巻、２３１８頁〕。

【００１９】組換え体ＭＩＥＰはＭＩＥＰに特異的なモ
ノクロナール又はポリクロナール抗体でつくられたアフ
ィニティーカラムの使用により他の細胞タンパク質かさ
分離することができる。これらのアフィニティーカラム
は抗体がアガロースゲルビース支持体と共有結合を生成
するようにＮ−ヒドロスクシンイミドエステルで予め活
性したアフィゲル−１０（バイオランド）、ゲル支持体
に抗体を加えることによってつくられる。次に抗体をス
ペーサーとアミド結合によりゲルに結合する。次に残存
する活性化エステルを１ＭエタノールアミンHCl （pH
８）で不活化する。カラムを水次に０．２３Ｍグリシン
HCl （pH２．６）で洗浄していくらかの非結合抗体又は
外来性タンパク質を除去する。次にカラムをリン酸緩衝
食塩水（pH７．３）に平衡化し、ＭＩＥＰを含有する細
胞培養上清又は細胞抽出液をカラムにゆっくりと通過さ
せる。次にカラムを吸光度（Ａ₂₈₀)がバックグラウンド
に下がり次にタンパク質が０．２３Ｍグリシン−HCl
（pH２．６）で溶離するまでリン酸緩衝食塩水で洗浄す
る。次にタンパク質をリン酸緩衝食塩水で透析する。

【００２０】本発明の複合体はチオエーテル基と第一ア
ミンを含有する二属スペーサー（bigeneric spacer）に
より結合し、多糖類とＭＩＥＰによる加水分解的に分解
される共有結合を生成する任意の安定な多糖類−ＭＩＥ
Ｐ複合体であることができる。しかしながら本発明によ
る好ましい複合体は式Ｐｓ−Ａ−Ｅ−Ｓ−Ｂ−Ｐro又は
Ｐｓ−Ａ′−Ｓ−Ｅ′−Ｂ′−Ｐro｛Ｐｓは多糖類を表
わし、Ｐroは細菌タンパク質ＭＩＥＰを表わし、Ａ−Ｅ
−Ｓ−Ｂ及びＡ′−Ｓ−Ｅ′−Ｂ′は加水分解的に安定
な共有チオエーテル結合を含んで巨大分子Ｐro及びＰｓ
と共有結合（たとえば加水分解できるエステル又はアミ
ド結合）を生成する二属スペーサーを構成する｝によっ
て表わすことができるものである。スペーサーＡ−Ｅ−
Ｓ−Ｂに於て、Ｓはイオウであり、Ｅはチオール基と反
応したイオウ好性基の転換産物であり、

【化１】 （ＲはＨ又はCH₃ であり、ｐは１〜３である）によって
表わされＡは

【化２】 ｛ＷはＯ又はＮＨであり、ｍは０〜４であり、ｎは０〜
３であり、ＹはCH₂ 、Ｏ、Ｓ、NR′又は CHCO₂H （Ｒ′
はＨ又はＣ₁ −又はＣ₂ −アルキルである）である。例
えばＹがCH₂ である場合にはｍとｎは共に同じＯである
ことができずＹがＯ又はＳである場合にはｍは１より大
きくｎは１より大きい｝であり、Ｂは

【化３】 （ｑは０〜２であり、Ｚは NH₂, NHCOR′, COOH 又は
Ｈであり、Ｒ′及びｐは上で定義した通りであり、Ｄは
Ｃ＝Ｏ、NR′又は NH-CO(CH₂)₂COである）である。次い
でスペーサーＡ′−Ｓ−Ｅ′−Ｂ′に於て、Ｓはイオウ
であり、Ａ′は -C(=W)H(CH₂) _a R ″- （ａは１〜４で
あり、Ｒ″はCH₂ である）又は NHCOC(Y′)H(CH₂)
_p （Ｙ′は NH₂又は NHCOR′であり、ｗ，ｐ及びＲ′は
上で定義した通りである）であり、Ｅ′はチオール基と
反応したイオウ好性基の転換産物であり、 -C(R)H-（Ｒ
は上で定義した通りである）によって表わされ、Ｂ′は
-C(=O)-であるか又はＥ′は

【化４】 であり、Ｂ′は -(CH₂) _p CO- （ｐは１〜３である）で
ある。更にビジェネリックスペーサー、Ａ−Ｅ−Ｓ−Ｂ
及びＡ′−Ｓ−Ｅ′−Ｂ′のＥ−Ｓ−Ｂ及びＡ′−Ｓ−
Ｅ′成分は決定可能で定量可能でありこの同定は共有結
合的に修飾した多糖類に由来するチオエーテルイオウ側
と機能化したタンパク質に由来するスペーサー側と結合
する共有結合の共有原子価を反映する。

【００２１】次いで本発明による複合体Ｐｓ−Ａ−Ｅ−
Ｓ−Ｂ−Ｐroは成分が特に二酸化炭素、１，４−ブタン
ジアミン及びＳ−カルボキシメチル−Ｎ−アセチルホモ
システイン；二酸化炭素、１，５−ペンタンジアミン及
びＳ−カルボキシメチル−Ｎ−アセチルホモシステイ
ン；二酸化炭素、３−オキサ−１，５−ペンタンジアミ
ン及びＳ−カルボキシメチル−Ｎ−アセチルホモシステ
イン；二酸化炭素、１，４−ブタン−ジアミン及びＳ−
カルボキシメチル−Ｎ−アセチルシステイン；二酸化炭
素、１，３−プロパンジアミン及びＳ−カルボキシメチ
ル−Ｎ−ベンゾイルホモシステイン；二酸化炭素、３−
アザ−１，５−ペンタンジアミン及びＳ−カルボキシメ
チル−Ｎ−アセチルシステイン及び二酸化炭素、１，２
−エタンジアミン、グリシン及びＳ−（スクシン−２−
イル）−Ｎ−アセチルホモシステインの誘導体を包含す
るスペーサーを含有することができる。本発明による複
合体Ｐｓ−Ａ′−Ｓ−Ｅ′−Ｂ′−Ｐroは成分が特に二
酸化炭素及びＳ−カルボキシメチルシステアミン；二酸
化炭素及びＳ−（α−カルボキシエチル）システアミ
ン；二酸化炭素及びＳ−カルボキシメチルホモシステア
ミン；二酸化炭素、Ｓ−（スクシン−２−イル）システ
アミン及びグリシン及び二酸化炭素及びＳ−カルボキシ
メチルシステインの誘導体を包含するスペーサーを含有
することができる。

【００２２】本発明の方法に於て、多糖類は（ａ）これ
を非水酸基有機溶媒に可溶化し次に（ｂ）これを２官能
基試薬で活性化し、（ｃ）この活性化多糖類を二求核基
と反応させ最後に必要があれば更に（ｄ）この修飾多糖
類を（ｉ）求電子（例えばチオール好性）部位生成試薬
あるいは（ii）チオール基生成試薬と反応させて機能化
することによって共有結合的に修飾する。逆にタンパク
質を（ｉ）チオール基生成試薬あるいは（ii）チオール
好性部位生成試薬と反応させ、次に共有結合的に変性し
た多糖類と機能化タンパク質を一緒に反応させて安定な
共有結合的に結合した結合体を生成し、最後の混合物を
精製して未反応多糖類とタンパク質を除去する。

【００２３】本発明の方法はまたペンダント求電子部位
又はペンダントチオール基を有する共有結合的変性多糖
類を生成するために活性化多糖類と反応する求核基又は
二求核基の選択を包含し、これによって共有結合的変性
多糖類を共有結合的変性タンパク質と反応させる前に二
求核基変性多糖類を更に機能化する必要が取り除かれ
る。タンパク質の両方の部分への機能化はこれらの工程
に於ける反応物の選択により１工程以上で達成すること
ができる。

【００２４】多糖類を共有結合的に修飾する第１工程で
は固形多糖類を可溶化させなければならない。多糖類の
求核アルコール性ヒドロキシル基が水溶液中の水のヒド
ロキシルと求電子試薬として化学的に拮抗することがで
きないことから多糖類は非水性（非ヒドロキシル）溶媒
に溶解するべきである。適当な溶媒としてはジメチルホ
ルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトア
ミド、ホルムアミド、Ｎ，Ｎ′−ジメチルイミダゾリジ
ノン及び他の類似の極性非プロトン性溶媒好適にはジメ
チルホルムアミドがある。

【００２５】これらの溶媒を使用するほかにリン酸モノ
及びジエステルのような酸水素を有する多糖類（例えば
リボース−リビトールリン酸重合体であるＨ．インフル
エンゼｂ型の莢膜多糖類）を適当な塩に変換することに
より多糖類を上記溶媒に容易に可溶化させる。これらの
巨大分子の酸性水素は大きな疎水性カチオン例えばトリ
又はテトラ−（Ｃ₁ 〜Ｃ₅ ）アルキルアンモニウム、１
−アザビシクロ〔２．２．２〕オクタン、１，８−ジア
ザビシクロ〔５．４．０〕ウンデセ−７−エンまたは類
似のカチオン特にトリ又はテトラ−（Ｃ₁ 〜Ｃ₅ ）アル
キルアンモニウムに置き換えることができ、得られたホ
スホリル化多糖類のトリ又はテトラアルキルアンモニウ
ム又は類似塩は１分から１時間攪拌するが約１７〜５０
℃に於て上記溶媒に容易に溶解する。部分的に加水分解
されたＨ．インフルエンゼ血清型Ｂ多糖類をテトラブチ
ルアンモニウム塩に変換したときにはジメチルスルホキ
シドに溶解する（エガン（Egan）等、 J. Amer. Chem.
Soc.第１０４巻、２８９８頁（１９８２年））が、この
生成物はもはや抗原性ではなく、従ってワクチンの製造
に役に立たない。対照的に出願人は自然のままの加水分
解されていない多糖類をテトラアルキルアンモニウムと
して強酸カチオン交換樹脂に通過させるか又は多糖類を
水酸化テトラアルキルアンモニウムで注意して中和させ
て好ましくは前者の方法によって可溶化を行ない、これ
によって多糖類の免疫原ワクチン用の能力を保存する。

【００２６】次の工程では結合が望まれる単位の機能化
に一般に又は実際的に用いられる試薬と十分に反応する
ヒドロキシル基以外の官能基が存在しない多糖類に共有
結合を生成させるためにこの著しい生理化学的制限を克
服することに向けられる。活性化多糖類を生成するため
の多糖類の活性化、求核機能化多糖類を生成するための
二求核基との反応及び求電子部位又はチオール基生成試
薬による機能化は全て多糖類を共有結合的に修飾し、多
糖類上に官能基を結合体の調製のために出現させること
に向けられる。

【００２７】次の工程では可溶化多糖類を二官能性試薬
と多糖類に対する活性化剤の決定的重量比１：５〜１：
１２により約０〜５０℃で１０分から１時間攪拌しなが
ら反応させて活性化する。過去に於てこの活性化は多糖
類と臭化シアンとの反応により行なわれた。しかしなが
ら近接ジオールに“傾向”をもつ臭化シアンで活性化し
た誘導体はリン酸緩衝液で透析中一過性の安定性を示し
た。従って臭化シアノジェンによる活性化も本発明によ
り可能であるがこの試薬は多糖類の活性化に使用するの
に不十分であり、好ましくない。代わりに多糖類を活性
化するのに好ましい二官能性試薬としては炭酸誘導体 R
²-C(=0)-R³（Ｒ² 及びＲ³ は独立してアゾリル例えばイ
ミダゾリル、ハライド又はフェニルエステル例えばｐ−
ニトロフェニル又はポリハロフェニルであることができ
る）がある。特に好適な試薬であるカルボニルジイミダ
ゾールはヒドロキシル基と反応して多糖類のイミダゾリ
ルウレタンを生成し、例えばニトロフェニルクロロホー
メートを含むアリールクロロホーメートは多糖類の混合
炭酸塩を生成する。各々の場合、得られた活性化多糖類
はアミンのような求核試薬に極めて感受性があり、これ
によって各々のウレタンに転換される。

【００２８】次の段階では、活性化多糖類はアミン特に
ジアミン例えば H₂N(CH₂) _m Y(CH₂)_n -NH₂｛ｍは０〜４
でありｎは０〜３であり、Ｙは CH₂, Ｏ，Ｓ，NR′, CH
CO₂H（Ｒ′はＨ又はＣ₁ 又はＣ₂ −アルキルである）で
ある。例えばＹがCH₂ である場合にはｍとｎは共に同じ
０であることができず、ＹがＯ又はＳである場合にはｍ
は１より大きく、ｎは１より大きい｝のような求核試薬
と著しく過剰のアミン（即ち具体的には使用される活性
化剤に対して５０〜１００倍モル過剰量）として反応さ
せる。反応は氷浴中で１５分から１時間次に約１７〜４
０℃で１５分から１時間維持する。ジアミン例えば１，
４−ブタンジアミンと反応させた場合、活性化多糖類は
ペンダントアミンを有するウレタン形多糖類を生成し次
いでアシル化によって更に機能化することができる。混
合炭酸塩もまたジアミンと容易に反応してペンダントア
ミン基を生成する。

【００２９】また活性化多糖類をジアミノアルカンのモ
ノハロアセトアミド例えば４−ブロモアセタミドブチル
アミンのような求核体（Ｗ．Ｂ．ロウソン（Lawson）
等、Hoppe Seyler′s Z. Physiol Chem. 第３４９巻、
２５１頁（１９６８年）参照）と反応させるとペンダン
ト求核部位を有する共有結合的に変性した多糖類を生成
する。あるいは活性化多糖類をシステアミン（アミノエ
タンチオール）又はシステインのようなこの誘導体の具
体例はペプチド合成の技術上周知である。アミノチオー
ルと反応させると．ペンダントチオール基を有する多糖
類を生成することができる。両方の場合共に共有結合的
修飾多糖類を修飾細菌“担体”タンパク質に結合する前
に別の機能化を必要としない。

【００３０】必要な場合には多糖類を調製する最後の工
程である多糖類の機能化は更に求核機能化多糖類を試薬
と反応させて求核（即ちチオ好性）部位を生成するか又
は試薬と反応させてチオール基を生成する形を取ること
ができる。求核部位を生成するために用いる適当な試薬
としては例えばα−ハロアセチル又はα−ハロプロピオ
ニル XC(O)C(R)HX（ＲはＨ又はCH₃ であり、ＸはCl、Br
又はＩであり、Ｘ′はニトロフェノキシ、ジニトロフェ
ノキシ、ペンタクロロフェノキシ、ペンタフルオロフェ
ノキシ、ハライド、Ｏ−（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ジル）又はアジドである）特にクロロ酢酸又はα−ブロ
モプロピオン酸があり、反応はpH８〜１１（必要な場合
塩基の添加によりこの範囲に維持する）に於て約０〜３
５℃の温度で１０分から１時間行なう。アミド誘導多糖
類はチオ置換を受け易い適当に機能化した多糖類を生成
するために活性化マレイミドアミノ酸（Ｏ．ケラー（Ke
ller）等、 Helv. Chim Acta. 第５８巻、５３１頁（１
９７５年））でアシル化してマレイミド基を生成させる
か

【化５】 （ｐは１〜３である）、２−ハロアセチル化剤例えばｐ
−ニトロフェニルブロモアセテートで又はα−ハロケト
ンカルボン酸誘導体例えば

【化６】 （Ber. 第６７巻、１２０４頁（１９３４年））でアシ
ル化することができる。チオール基を生成するために用
いる適当な試薬としては具体的にはチオラクトンのよう
なアシル化剤、例えば

【化７】 （Ｒ⁴ はＣ₁ 又はＣ₄ −アルキル又は単又は二環アリー
ル例えば C₆H₅ 又は C₁₀H₁₃ であり、ｐは１〜３であ
る）、

【化８】 （ｍは０〜４であり、Ｒ⁵ はＣ₁ 〜Ｃ₄ −アルキル又は
C₆H₅ であり、Ｘ′は上で定義した通りである）があ
り、次いで HSCH₂CH₂OH 又は

【化９】 （ｍ、Ｒ⁵ 及びＸ′はこの上で定義した通りである）で
処理され、次いでジチオトレイトールで処理される。こ
のような反応は窒素雰囲気下約１０〜３５℃でpH８〜１
１（必要に応じて塩基を添加してこの範囲内にpHを維持
する）に於て１〜２４時間行なわれる。例えばアミノ誘
導多糖類を

【化１０】 と反応させて適当に機能化した多糖類を生成することが
できる。これらの工程により次にはＰｓ−Ａ−Ｅ^* −又
はＰｓ−Ａ′−ＳＨ−（Ｅ^* は-CCHX 又は

【化１１】 であり、Ａ，Ａ′，Ｒ，Ｘ及びｐは上で定義した通りで
ある）形の共有結合的に変性した多糖類が生成される。

【００３１】タンパク質を多糖類に結合させる別の機能
化はタンパク質を１種以上の試薬と反応させてチオール
基を生成させるか又はタンパク質を１種以上の試薬と反
応させて求電子（即ちイオウ好性）中心を生成させるこ
とを含む。求電子機能化多糖類との結合を調製する場合
にはタンパク質を前に述べた多糖類にチオール基を生成
させるために使用したアシル化試薬のようなチオール基
を生成させる１種以上の試薬と１又は２工程で反応させ
る。チオール化タンパク質はまたアタッシ（Atassi）等
Biochem et Biophys. Acta. 第６７０巻、３００頁
（１９８１年）に示されるようなカルボキシ活性化タン
パク質をアミノチオールでアミノ化してチオール化タン
パク質を生成させることによって調製することができ
る。この方法工程の好ましい実施態様はタンパク質のペ
ンダントアミノ基（即ちリシル基）をＮ−アセチルホモ
システインチオールアアクトンで等重量の反応物を用い
て０〜３５℃pH８〜１１に於て５分から２時間直接アシ
ル化することを含む。

【００３２】Ｅ′Ｂ′が

【化１２】 である場合、機能化タンパク質の製造条件及び方法は活
性化マレイミド酸との反応による反対部分の多糖類の調
製で上述した通りである。ペンダントチオール基を有す
る共有結合的に変性した細菌多糖類との結合を調製する
場合には、タンパク質を例えば XCH₂COX′及びXC(CH₃)H
C(O)X ′（Ｘ及びＸ′は上で定義した通りである）及び

【化１３】 （Ｘ′は上で定義した通りである）を含むアシル化剤の
ような求電子中心を生成する試薬でアシル化する。求電
子中心を有する適当なタンパク質としてはまた例えばペ
ンダントリシルアミノ基を活性化マレイミド酸例えば

【化１４】 のような試薬でアシル化するか又はカルボキシ活性化タ
ンパク質をジアミンのモノハロアセチル誘導体と反応さ
せて調製したものがある。両方の調製反応共に温度は０
〜３５℃で５分から１時間でありpHは８〜１１である。

【００３３】次いで結合体の生成は単にペンダント求電
子中心を有する任意の共有結合的に変性した多糖類をペ
ンダントチオール基を有する細菌タンパク質ＭＩＥＰと
pH７〜９に於てほぼ等重量比で窒素雰囲気下約１７〜４
０℃で６〜２４時間反応させて共有結合体を得る問題で
ある。このような反応の具体例としては

【化１５】 （４−ブロモアセタミドブチルアミンと反応させた活性
化多糖類をＮ−アセチルホモシステインチオールアクト
ンと反応させたタンパク質と反応させて結合体を生成さ
せる）及び

【化１６】 （Ｙ″はＣ₂ 〜Ｃ₈ アルキルラジカルである）（活性化
マレイミド酸と反応させたアミノ誘導化多糖類をアミノ
チオールでアミノ化したカルボキシ活性化タンパク質と
反応させて結合体を生成させる）がある。

【００３４】同様にペンダントチオール基を有する任意
の共有結合的に変性した多糖類をペンダント求電子中心
を有する細菌タンパク質ＭＩＥＰと反応させて共有結合
体を得ることができる。このような反応の具体例は

【化１７】 （アミノチオールと反応させた活性化多糖類をジアミン
のモノハロアセチル誘導体と反応させたカルボキシ活性
化タンパク質と反応させて結合体を生成させる）であ
る。過剰のハロアセチル基の求電子活性を脱離させる必
要があれば、この結合体とｎ−アセチルシステアミンの
ような低分子量チオールとの反応がこの目的を達成す
る。またこの試薬ｎ−アセチルシステアミンの使用によ
り、生成したＳ−カルボキシメチルシステアミンがスパ
ックマン、モーア及びスタインの方法によってユニーク
に検出されるために使用したハロアセチル部分の説明を
確認することができる。

【００３５】次いでこの結合体を所定角半径を用いて約
１００，０００ｘｇに於て約１〜２０℃で約２時間遠心
分離するか又はゲルパーミエーション、イオン排除クロ
マトグラフィー、勾配遠心分離又は他の分画吸着クロマ
トグラフィーを含む種々の任意の他の精製方法にかけて
非共有結合多糖類とタンパク質を除去し、所望の生物活
性を追究する方法としてビジェネリック、スペーサー
（以下参照）の共有原子価検定を用いる。更に試薬の分
離はカラムのサイズ排除クロマトグラフィーによって達
成することができあるいは非常に大きな不溶性タンパク
質の場合には分離は超遠心分離によって達成することが
できる。

【００３６】結合体の共有原子価を確認するための分析
従って結合体の安定性は結合体を加水分解（好適には６
NHCl で１１０℃に於て２０時間）し、次いでチオエー
テルとタンパク質の構成アミノ酸を含有する加水分解的
に安定なスペーサーのアミノ酸を量的に分析することに
よって達成される。タンパク質のアミノ酸の寄与は必要
な場合含まれるタンパク質の適当なアミノ酸標準と比較
して除去して残存するアミノ酸値を結合体の共有原子価
に反映させるか又はスペーサーのアミノ酸を分析に於て
タンパク質のアミノ酸標準の外側に見えるように計画す
ることができる。共有原子価検定はまた生物学的に活性
な成分の濃度の増大をマークする精製方法を監視するの
に有用である。上の具体例に於て

【化１８】 の加水分解によりＰｓ−Ａ−Ｅ−Ｓ−Ｂ−Ｐro分子のペ
プチド結合及び他の加水分解的に不安定な結合に於ける
切断によってＳ−カルボキシメチルホモシステイン

【化１９】 の脱離が生じ、

【化２０】 の加水分解はアミノジカルボン酸 HO₂CCH₂CH(COOH)SCH₂
CH₂NH₂の脱離が生じ、 PsC(=O)NHCH₂CH₂SCH₂C(=O)NH(C
H)₄NHC(=O)CH₂CH₂C(=O)Pro の加水分解により、Ｓ−カ
ルボキシメチルシステアミンH₂NCH₂CH₂SCH₂CO₂H の脱離
が生じる。次いでスパックマン、モーア及びスタインの
ようなクロマトグラフィー法が都合良く用いられ、アミ
ノ酸成分の比を決定することができる。

【００３７】ＩｇＧ抗体の最適な産生は問題の抗原に特
異性を有するＢ及びＴリンパ球の協力を必要とする。Ｔ
リンパ球は多糖類を確認することができないがＴ細胞が
確認可能であるタンパク質に多糖類を共有結合的に結合
する場合、抗多糖類ＩｇＧ抗体応答を助けることができ
る。マウスに於てこの要件は二次並びに一次抗体応答に
存在し担体特異的であり即ち二次抗体応答はＴヘルパー
細胞が二次免疫化に用いられる担体で予め感作された場
合にのみ生じる。従ってマウスのＰＲＰ−タンパク質結
合体に対する二次抗体応答を産生する能力は担体タンパ
ク質に特異性を有する感作Ｔリンパ球の存在に依存す
る。抗−ＰＲＰ抗体応答に感作する担体を与えるＭＩＥ
Ｐの能力の証明は異種担体ジフテリアトキソイド（Ｄ
Ｔ）に共有結合したＰＲＰを養子感作したマウスで行な
った。養子移入はＭＩＥＰ単独を感作したリンパ球の投
与がＰＲＰ−ＯＭＰＣに対する応答に於て抗−ＰＲＰ抗
体生成に有効なヘルパーＴ細胞活性を十分生じるかを決
定するために使用した。ＭＩＥＰ又はＯＭＰＣで感作し
たリンパ球を移入した場合匹敵し得る二次抗−ＰＲＰ抗
体応答がＰＲＰ−ＯＭＰＣにより誘発され、ＯＭＰＣの
Ｔ細胞認識がＭＩＥＰ部分に残ることを示した。

【００３８】ＰＲＰ−ＭＩＥＰ結合体をマウス並びに乳
児アカゲザルに於て免疫原性を試験した。これらの両方
の動物モデルに於ける免疫応答は細菌多糖類のようなＴ
−非依存性抗原に対して抗体応答を産生する能力が乳児
ヒトと共に不十分である。これらの動物は一般に種々の
抗原に対する乳児ヒトの免疫応答を評価するモデルとし
て用いられる。同様に例えばペプチドがＨＩＶ主中和決
定基（ＰＮＤ）ペプチドである場合、ＭＩＥＰ−ペプチ
ド結合体を調製することができる。このような結合体を
調製する１方法としては同時係属中の米国特許出願番号
， （メルクケースＭＲＬ９１／１２５）に
記載され特別に特許を請求した活性化ＭＩＥＰと活性化
ＨＩＶ ＰＮＤペプチド間にビジェネリックスペーサー
を生成させることを包含する。リンカーは米国特許出願
第５５５，５５８号（メルクケース１８０６８）に記載
される多糖類部分を包含することができる。

【００３９】本発明の新規な結合体はＨＩＶ ＰＮＤペ
プチドに共有結合したナイセリアメニンギチジスｂの外
膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）のＭＩＥＰ、主要免疫
増強タンパク質を包含する。結合体は活性化ペプチドを
活性化タンパク質に共有結合する方法によって調製され
る。ペプチド及びタンパク質成分は別々に活性化されて
ペンダント求電子基又は求核基を示すので接触の時にペ
プチドとタンパク質間で共有結合が生成する。上述した
反応系から生じる共有結合体免疫原は複数のペプチド機
能性がＭＩＥＰの基礎の上に作られる結合体として考え
るのが都合が良い。結合体のペプチド成分がＨＩＶ中和
免疫応答を誘発させることができる場合、本発明の結合
体は免疫学的に有効な量で更に免疫活性調節、抗ウイル
スは抗菌化合物を加えて又は加えずに哺乳類に投与する
ことができ、結合体のペプチジル部分に対して哺乳類免
疫応答を誘発させるか哺乳類に於てＨＩＶ−中和抗体を
誘発させるか又はＡＩＤＳを含むＨＩＶ感染又は疾患の
罹患を予防するためにヒトに投与するか又はＡＩＤＳを
含むＨＩＶ感染又は疾患に罹患したヒトに投与するため
のワクチンの製造に有用である。

【００４０】好ましい実施態様に於て、本発明の結合体
は一般構造式_j (PEP-A-)-MIEP （式中ＰＥＰはＨＩＶ ＰＮＤペプチド又はＨＩＶ Ｐ
ＮＤを認識する哺乳類の免疫応答を高めることができる
ペプチドである。ＭＩＥＰはＯＭＰＣから組換え的に産
生又は精製したナイセリアメニンギチジスｂの外膜タン
パク質複合体（ＯＭＰＣ）の免疫原タンパク質である。
−Ａ−は共有結合、好適にはビジェネリックスペーサー
である。ｊは双対結合体中ペプチド量の％であり、結合
体中１〜５０％の全タンパク質量が好適である。） 又はその医薬的に使用し得る塩を有する。本発明の結合
体は例えば米国特許第４，６９５，６２４号及びマルブ
ルグ（Marburg)等 J. A. C. S. 第１０８巻、５２８２
頁（１９８６年）及び米国特許出願第３６２，１７９
号、同第５５，５５８号、同第５５５，９７４号、同第
５５５，９６６号及び同第５５５，３３９号に開示され
るビジェネリックケミストリーのペプチド−タンパク質
結合体の製造の技術に於て既知の任意の一般方法によっ
て製造することができる。好ましい実施態様にはリシン
のアミノ基、ヒスチジンのイミダゾール基又はセリン、
トレオニン又はチロシンのヒドロキシル基のようなタン
パク質に見られる有効な求核機能性を使用する方法が用
いられる。実際上では有効なタンパク質求核部位の数は
全遊離スルフヒドリル基の定量及び／又はアミノ酸分析
で分析可能なブロモアセチルアミノ酸によるアルキル化
のＮ−アセチルホモシステインチオラクトンを用いてチ
オール化することを包含することができる適当な検定次
のエルマン（Ellman）検定〔エルマン，G. L. Arch. Bi
ochem.Biophys, 第８２巻、７０頁（１９５９年）〕に
よって定量することができる。

【００４１】好適な方法は配列、活性化方法及びタンパ
ク質とペプチド基の反応を変化することができるいくつ
かの方法で行なうことができる。この方法は 方法１ １ａ．タンパク質求核基を試薬例えばＮ−アセチルホモ
システインチオ−ラクトンと反応させてタンパク質にチ
オール基を生成させ １ｂ．工程１ａの生成物をペプチドに好適にはマレイミ
ドを包含している求電子基を付加するように予め誘導化
したペプチドと反応させる工程を包含することができ
る。この方法に従って製造することができる本発明の好
適な実施態様は構造

【化２１】 （式中ＰＥＰ、ＭＩＥＰ及びｊは上で定義した通りであ
る。 −Ｒ−はａ）−低級アルキル−、 ｂ）−置換低級アルキル−、 ｃ）−シクロアルキル−、 ｄ）−置換シクロアルキル−、 ｅ）−フェニル−である。 −Ｒ′−はａ）−水素、 ｂ）−低級アルキル又は ｃ）−SO₃Hである。 −Ｓ−はイオウである。）又はその医薬的に使用し得る
塩を有する。 構造

【化２２】 （式中可変のものは全て上で定義した通りである）を有
する本発明の好適な実施態様は方法２で製造することが
でき、 ２ａ．タンパク質求核基を求電子タンパク質を生成させ
るように二官能性求電子試薬例えばマレイミドアルカン
酸ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させ ２ｂ．工程２ａの生成物をチオール基のような求核基を
含有するペプチドと反応させる工程を包含する。

【００４２】工程１の非常に好ましい実施態様は以下で
詳細に図式１に記載される。図式によれば免疫原タンパ
ク質は細菌膜から精製したあるいは組換え手段によって
産生したナイセリアメニンギチジスｂの外膜タンパク質
複合体（ＯＭＰＣ）のII類タンパク質である。この方法
は ａ．ｉ．リシン又はタンパク質アミノ末端基の存在によ
り遊離アミノ基を含む求核基を有するＭＩＥＰ（Ｉ）を
チオール化剤好ましくはＮ−アセチルホモシステインチ
オラクトンと反応させてイオウ好性基との反応に有効な
“ｍ”モルのスルフヒドリル基を有するＭＩＥＰ（II）
を生成させ、ａ．ii．工程ａ．ｉ．でＭＩＥＰに付加し
た有効なスルフヒドリル数を定量して好適にはエルマン
検定によって“ｍ”値を決定し〔エルマン，G. L. Arc
h. Biochem. Biochem. Biophys,第８２巻、７０頁（１
９５９年）〕、ｂ．工程ａの生成物を求核基を付加する
ように予め誘導化した過剰（２ｍ）のＨＩＶ ＰＮＤ好
ましくはマレイミド−アルカン酸、最も好ましくはマレ
イミド−プロピオン酸（この誘導化は誘導化されるべき
ではないペプチドの全てのアミノ基をＮ−保護し遊離ペ
プチドアミノ基を二官能性試薬好ましくはマレイミドア
ルカノイルオキシスクシンイミド、最も好ましくはマレ
イミドプロピオニルオキシスクシンイミドと反応させ
る）と接触させて本発明の結合体を生成させる工程を包
含する。結合体生成物は例えばイオン強度０．００１Ｍ
〜１Ｍ、pH４〜１１を有する緩衝液最も好ましくはイオ
ン強度０．０１〜０．１Ｍ、pH６〜１０を有する水性媒
体中で透析して精製することができる。

【化２３】

【００４３】上述の図Ａで示した方法はＭＩＥＰをイオ
ウ好性基例えばマレイミドの誘導体に共有結合するよう
に誘導化し、一方ペプチドを遊離スルフヒドリルに共有
結合するように活性化させる。これらの方法の変更例え
ば活性化化合物の反応順序の変更又は反応物の比を含む
この及び他の方法は勿論本開示の範囲内に属する。本発
明の結合体を生成する方法はペプチド−タンパク質結合
体を所望し、特にペプチドの免疫原性の増強を必要とす
る場合に重要である任意の結合体を生成するために用い
ることができる。本明細書で記載した結合体は不活性担
体を含む組成物に含まれワクチンとして適当に処方され
る場合に有用である。これはミョウバンに吸着又はワク
チン製剤の技術上既知の乳化剤又はアジュバントと混合
する前に含むことができる。本発明の共有結合体免疫原
を使用する方法は（ａ）ＨＩＶ ＰＮＤペプチド構造−
機能相関を確認するための実験手段としての用途（ｂ）
抗体を単離し、ＨＩＶによる感染を予防する又は感染後
のＨＩＶ増殖を制限する又はＡＩＤＳを含むＨＩＶ感染
又は疾患に罹患したヒトを治療するようにヒトに投与す
ることができる哺乳類に於けるＨＩＶ−中和抗体を高め
るための免疫原としての用途（ｃ）ＨＩＶによる感染に
対してヒトを免疫化する又は感染後ヒトを治療する又は
ＡＩＤＳを含むＨＩＶ感染又は疾患に罹患したヒトのＨ
ＩＶ−中和免疫応答を上昇させるワクチンとしての用途
を含む。

【００４４】実験手段として、結合体は免疫学的に有効
な量で哺乳類に投与する場合、抗−ＰＮＤペプチド、抗
−ＨＩＶ又はＨＩＶ−中和免疫応答を起こすのに有用で
ある。免疫応答を高めるために更に結合体を哺乳類に追
加免疫することができる。抗血清は哺乳類の採血をし、
この血液を遠心分離して血清から細胞成分を分離し、必
要な場合技術上既知の方法に従って血清から抗体タンパ
ク質を単離することによってこのような哺乳類から得ら
れる。このような抗血清又は抗体製剤は哺乳類に於て哺
乳類の抗−ＰＮＤペプチド、抗−ＨＩＶ又はＨＩＶ−中
和抗体を高める場合に結合体のＨＩＶ ＰＮＤペプチド
を効能を確認するために使用することができる。非結合
ペプチド及び抗血清を使用するＥＬＩＳＡ検定は抗−ペ
プチド抗体の誘発を測定するために試験管内検定として
有用である。抗血清のＨＩＶ−中和能を測定するための
試験管内検定は生存ＨＩＶの調製物を抗血清の調製物と
温置し次に抗血清処理ＨＩＶ調製物を CD₄受容体を有す
る細胞と温置し抗血清によって得られる細胞保護の程度
を測定することを包含する。これらの検定及び一定の結
合体によって産生した抗血清はＰＮＤペプチド構造−機
能相関を研究するために使用することができる。

【００４５】結合体は前項で記載した哺乳類の抗体応答
を誘発させるのに有用であり、このような抗体はヒトを
受動免疫するために使用してＨＩＶ感染を予防又は感染
後のＨＩＶ増殖を制限又はＡＩＤＳを含むＨＩＶ感染又
は疾患に罹患したヒトを治療することができる。結合体
はＨＩＶ感染又は増殖を予防するためにヒトに又はＡＩ
ＤＳ及び関連症を含むＨＩＶ感染のＨＩＶ疾患にかかっ
ているヒトに又はＨＩＶウイルスに対する血清陽性を試
験するヒトに投与することができるワクチンとして有用
である。結合体はＡＺＴ又はより一般的な抗ウイルス化
合物のような他の抗−ＨＩＶ化合物と併用して又は他の
ワクチン抗生物質又は免疫活性調節剤と併用して（以下
の表Ｉ参照）投与することができる。

【００４６】ワクチン内の免疫原の形は種々の分子配置
を取る。抗原結合体III の単一分子化合物はしばしばＡ
ＩＤＳ又はＡＲＣを含むＨＩＶ疾患の予防又は治療に有
用で適当な抗原として十分である。反応混液の形の他の
抗原も有利であり、例えば全タンパク質に対するペプチ
ドの質量比によって異なる結合体の混合物からなる。更
に混合物中の結合体はＰＮＤのアミノ酸配列が異なって
もよい。免疫ベクター、担体又はアジュバントは通常の
免疫試験又は実施に従って免疫賦形剤として加えること
ができる。アジュバントは本発明のワクチンの製造中に
加えても加えなくてもよい。ミョウバンがヒトワクチン
に特にチキソトロピー性、粘性及び均一の水酸化アルミ
ニウムゲルの形として典型的な好適アジュバントであ
る。例えば本発明の１実施態様は賦形剤としてミョウバ
ンアジュバントの懸濁液及び免疫原又は抗原の選択セッ
トとして結合体の反応混液による患者の予防接種であ
る。本発明のワクチンは表ＩのＡＩＤＳ抗ウイルス剤、
免疫活性調節剤、抗生物質又はワクチンの有効量と併用
して罹患前か罹患後の段階で有効に投与することができ
る〔情報源：マーケットレター１９８７年１１月３０
日、２６〜２７頁、ジネティックエンジニアリングニュ
ース、１９８８年１月第８巻、２３頁〕。

【００４７】 表 Ｉ¹ Ａ．抗ウイルス剤 薬剤名 製造業者 適応症 AL-721 エチゲン ARC, PGL (Ethigen) BETASERON トリトンバイオサイ AIDS, ARC, KS （インターフェロンβ） エンシーズ (Triton Biosciences) CARRISYN カーリングトンラブス ARC （ポリマンノアセテート） (Carrington Labs) CYTOVENE シンテックス CMV （ガンシクロウィル） (Syntex) DDC ホフマン−ラロッシュ AIDS, ARC （ジデオキシシチジン） (Hoffmann-La Roche) FOSCARNET アストラ AB HIV感染, CMV （ホスホノギ酸三ナトリウム） (Astra) 網膜炎 HPA-23 ローン−プーランサン HIV感染 (Rhone-Poulenc Sante) ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━¹ 略語 ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）、ＡＲＣ
（エイズ関連症）、ＣＭＶ（サイトメガウイルス、日和
見感染を起こしエイズ患者の失明又は死に至る）、ＨＩ
Ｖ（ヒト免疫不全ウイルス、以前はＬＡＶ、ＨＴＬＶ−
III 又はＡＲＶとして知られていた）、ＫＳ（カポジ肉
腫）、ＰＣＰ（肺水腫、日和見感染）、ＰＧＬ（持続性
全身性リンパ節腫脹）

【００４８】 薬剤名 製造業者 適応症 DRNIDYL メレルダウ PCP (エフロルニチン) (Merrell Dow) PEPTIDET ペニンスララブス AIDS （オクタペプチド配列） (Peninsula Labs) PETICULOSE アドバンスドウイルス AIDS, ARC （ヌクレオホスホ リサーチ（Advanced プロテイン） Viral Research) IR バローズ ウェルカム AIDS, 進行性 （ジドブジン，AZT) ARC 小児 AIDS, KS, 無症候性 HIV, 重症でないHIV, 神経病併発 RIFABUTIN アドリアラブス ARC （マンサマイシンLM427) (Adna Labs) （トリメトレキサート） ワーナー−ランバート PCP (Warner-Lambert) UA001 上野製薬 AIDS, ARC VIRAZOLE ビラテック／ICN AIDS, ARC, KS （リバビリン） WELLFERON バローズ ウェルカム KS, HIV, （αインターフェロン） (Burroughs Wellcome) RETROVIRと併用 ZOVIRAX バローズ ウェルカム AIDS, ARC, (Burroughs Wellcome) RETROVIRと併用

【００４９】 Ｂ．免疫活性調節剤 薬剤名 製造業者 適応症 ABPP アップジョン 進行性AIDS, KS （ブロピリミン） (Upjohn) AMPLIGEN デュポン ＡＲＣ， ＰＧ
Ｌ （不適正 ＲＮＡ） (DuPont) HEM リサーチ （抗ヒトαインターフェロン (HEM Research) AIDS, ARC, KS 抗体） アドバンスド バイオセラ ピーコンセプツ (Advanced Biotherapy Concepts) コロニースチムレイティング サントス ジネティクス AIDS,ARC,HIV, ハクター（GM-CSF) インスチチュート KS (Sandoz Genetics Institute) CL246,738 アメリカン シナミド AIDS (CL 246, 738) (American Cynamid) IMREG-1 イムレグ AIDS, ARC, (Imreg) PGL, KS IMREG-2 イムレグ AIDS, ARC, (Imreg) PGL, KS IMUTHIOL メリオイクス AIDS, ARC （ジエチルジチオ インスチチュート カルバメート） (Merieux Institute) IL-2 シータス AIDS, KS （インターロイキン−２） (Cetus)

【００５０】 薬剤名 製造業者 適応症 IL-2 ホフマン−ラ ロッシュ AIDS, KS （インターロイキン−２） イムネクス(Hoffmann-La Roche Immunex) INTRON-A シェリング−プラウ KS （インターフェロンα） (Schering-Plough) ISOPRINOSINE ニューポート ARC, PGL, HIV （イノシンブラノベクス） ファーマシューティ 血清陽性患者 カルス（Newport Pharmaceuticals) （メチオニン TNI ファーマシュー AIDS, ARC エンケファリン） ティカルス (TNI Pharmaceuticals) MTP-PE チバガイギー KS （ムラミル−トリ (Ciba-Geigy) ペプチド） THYMOPENTIN(TP-5) オルト ファーマシュー HIV感染 （チムス化合物） ティカルス (Ortho Pharmaceu- ticals) ROFERON ホフマン−ラ ロッシュ KS （インターフェロンα） (Hoffmann-La Roche) （組換え体エリスロ オルト ファーマシュー AIDS 及び オペイエチン） ティカルス レトロウィル (Ortho 治療に伴う重 Pharmaceuticals) い貧血 TREXAN デュポン AIDS, ARC （ナルトレキソン） （DuPont) TNF （腫瘍壊死因子） ジェネンテック ARC, インター (Genentech) フェロンγ 併用 Ｃ．抗生物質 PENTAM300 リフォメド PCP （ペンタミジン (LyphoMed) イセチオネート）

【００５１】 Ｃ．ワクチン Gag メルク AIDS, ARC

【００５２】本発明のワクチンを、免疫調節剤、抗生物
質、あるいはワクチンとの組み合わせる範囲は上の表に
あげたものに限定されるものではなく、原則としてエイ
ズの治療に役立つ医薬組成物との組み合わせをすべて含
むことは、理解されるであろう。本発明のエイズあるい
はＨＩＶワクチンは、ＨＩＶ暴露前後に、ＨＩＶの感染
あるいは疾患を予防または治療するために用いられるワ
クチンであって、免疫原に特異的な免疫反応を引き起こ
すことができるものを包含する。本発明の複合体は、ワ
クチンとして用いられた場合、免疫学的に有効な量を投
与される。ほ乳動物に投与して、抗ペプチド、抗ＨＩ
Ｖ、ＨＩＶ中和性免疫反応を引き起こすには、用量とし
て、複合体蛋白の１μｇ−５００μｇの範囲、好ましく
は５０μｇ−３００μｇを投与する必要がある。初回の
投与後、約２週間経過後に、追加抗原刺激を行い、さら
にもう一度、血清中の抗体価が減少したさいに行なうこ
とができる。複合体は筋肉内、あるいは都合の良いまた
は効率のよい経路で投与するが、濃度は１０μｇ／mlと
１mg／ml、好ましくは５０−１００μｇ／mlの間であ
り、合計容量は免疫学的効力に必要とされる量とする。
複合体は水酸化アルミニウムゲルまたはRibiアジュバン
ト（ＧＢ ２２２０２１１Ａ，ＵＳ優先権２１２，９１
９（１９８８年６月２９日出願）にあらかじめ吸着さ
せ、注射前に滅菌生理食塩水に懸濁することができる。
蛋白部分は免疫のエンハンサーとして働くべきである。
蛋白を選択するにあたっては、被投与者の非特異的免疫
反応の活性化（reactogenicity）を起こさないものが望
ましい。米国特許第４，６５９，６２４号において、Ma
rburg らはNeisseria meingitidis の外膜蛋白複合体
（ＯＭＰＣ）を用いてポリサッカライド−蛋白質複合体
を作成した。ＯＭＰＣは本発明においても適しているこ
とが証明された。他の免疫原性蛋白質を用いることも可
能である。

【００５３】グラム陰性菌からＯＭＰＣを精製する方法
はいろいろ工夫されている。Ｆｒａｓｃｈら、Ｊ． Ｅ
ｘｐ． Ｍｅｄ．１４０巻、８７頁（１９７４）、同１
４７巻、６２９頁（１９７８），Zollinger ら、米国特
許第４，７０７，５４３号（１９８７）、Helting ら、
Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. C. ８９巻６９頁
（１９８１）、Helting ら、米国特許第４，２７１，１
４７号参照。本発明で用いたＯＭＰＣは基本的にはHelt
ing の方法によって調製した。さらに、主要外膜蛋白質
であるNeisseria meningitidisのクラス２蛋白（Muraka
miら、Infection and Immunity，５７巻、２３１８頁
（１９８９））のようなＯＭＰＣのサブユニットはＨＩ
Ｖ ＰＮＤペプチドに対するほ乳類の免疫反応を誘導す
るのに必要な免疫活性促進をもたらした。これらのサブ
ユニットは単離したＯＭＰＣをかい離させても得られる
し、組換えによって必要なＯＭＰＣ免疫原性部分を発現
させて生産することもできる。ＯＭＰＣサブユニットの
調製と使用方法は併願の米国特許出願番号５５５，３２
９、５５５，９７８、および５５５２０４に開示してあ
る。これらの複合体形成に用いられるＨＩＶペプチドは
線状あるいは環状ペプチドであることができる。これら
線状あるいは環状ペプチドはこの分野で知られた化学合
成の手法を用いて、あるいはその部分の組換え発現によ
り、または単離されたＨＩＶ蛋白質の断片として得るこ
とができる。環状ＨＩＶ ＰＮＤは線状ペプチドを環化
することにより合成できる。たとえば（ａ）少なくとも
２つのシステインを含むペプチドを酸化してジスルフィ
ド結合した環を作成する。（ｂ）アミド結合した環を作
成する。（ｃ）チオエーテル結合した環を作成する。こ
のようなペプチドを合成する方法はここに説明される
が、この説明は網羅的あるいは限定するものではない。
本発明の複合体は、構成要素のペプチドがＨＩＶＰＮＤ
であり、ほ乳動物にＨＩＶを認識する免疫反応を引き起
こすことができるならばかならず有用である。

【００５４】当分野で良く知られたＰＮＤペプチドおよ
び本発明に開示するが別に継続出願（米国特許出願番号
５５５，１１２および５５５，２２７）および同時出願
（米国特許出願第）において特許を請求している新規Ｐ
ＮＤペプチドはともに、ほ乳類においてＨＩＶ中和免疫
反応（ＨＩＶ中和抗体の産生を含む）を誘導できるペプ
チド配列と定義される。

【００５５】本発明に置いて克服された主要な点は、Ｈ
ＩＶの単離株間の配列の変動である。上に定義したＰＮ
Ｄペプチドはgp１２０の三番目の超可変流域に存在し、
多くの単離株においてある種のアミノ酸は決まった位置
に存在することが見出されているが、厳密に保存された
一次配列のモチーフは存在しない。本発明においては広
範囲の保護を得るのに必要な多くの異なる単離株のＰＮ
Ｄ配列のカクテルを複合体にすることができるので、こ
の難点を乗り越えることができる。あるいは、保護範囲
の広い複合体のカクテルは、単一あるいは数種のＨＩＶ
単離株に対し保護効果のあるペプチド部分を有する複合
体を別々に作成してから混合することによっても作成す
ることができる。

【００５６】gp１２０のアミノ酸２９６から３４１の間
またはその近傍に存在するアミノ酸が、ＰＮＤを定義す
る基準に合うことが示された。ＨＩＶの単離株ＩＩＩＢ
において、４１アミノ酸配列は以下のように報告されて
いる（ＳＥＱ ＩＤ：１：）。

【化２４】 〔２つのシステインは互いにジスルフィド結合してルー
プを形成している〕 三量体-Gly Pro Gly−はＰＮＤループの先端で露出して
いる。異なる単離株のgp１２０のこれと同一部位は山羊
やモルモットの免疫系に対し、Keyhole-limpetヘモシア
ニンと複合化して投与した場合、単離株特異的中和抗体
を誘導する。上に示した４１量体配列中の主要中和エピ
トープは、ＧＰＧトリマーを囲む８アミノ酸からなる
（Javaherianら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ８６巻、６７６８頁
（１９８９））。下記の表IIに、本発明の複合体に用い
られる異なる長さ、組成の線形ポリペプチドを多数示
す。表にしたペプチド配列を有するペプチドを含む単離
株の名は、参照し易くするためにそのペプチドに付けた
名称とともに記してある。各ペプチドの左側のｒの文字
はそのペプチドがＰＳＡにその位置で連結する可能性を
示している。さらに、ノルロイシンやオルニチンのよう
なマーカーアミノ酸はｒ−の一部をなすことができる。

【化２５】

【化２６】

【００５７】このリストは可能性のあるＰＮＤ配列を網
羅したものではなく、むしろ有用なＰＮＤ一次配列を示
唆し、説明するものである。したがってここに記載され
たように複合体として本発明の免疫原を形成するペプチ
ドは、表にあげられたどのペプチドでもよいし、これら
の配列が示唆するところの免疫学的に等価な変異体でも
よい。変異体の性質については次ぎに考察する。

【００５８】このＨＩＶ ＰＮＤの一次配列は、保存さ
れたコアアミノ酸配列を有するように見える。そのコア
アミノ酸配列はGly-Pro-Gly-Arg(−ＧＰＧＲ−）からな
る四量体配列からなり、その両側はＨＩＶ単離株の間で
違いが大きい。単離株のいくつかは、このテトラマーの
中も異なっており、−ＧＰＧＫ−、ＧＰＧＱ−、−ＧＬ
ＧＱ−などのコア配列を有する。これらすべての可能性
のある配列は本開示の範囲内にあり、本発明による複合
体形成に役立つペプチド配列とするものである。

【００５９】ペプチドの長さは交叉反応性の免疫反応を
促進するにあたって重要な因子である。すなわち、所定
のペプチド性エピトープに対して惹起された免疫反応
は、決定的中和エピトープのほかに同一あるいは異なる
ＨＩＶ単離株の類似のエピトープをエピトープ中のアミ
ノ酸の数に基づいて認識する。さらに、ペプチドの長さ
によって、ＨＩＶ中和反応の原因となる決定基が免疫シ
ステムに曝される確率が決まる。

【００６０】エピトープ提示の確率を最大にするため
に、ＰＮＤペプチドを所定の三次元構造に固定する化学
的手法が開発された。上記のＨＩＶ ＩＩＩＢの４１量
体アミノ酸ＰＮＤは、システイン−システイン間のジス
ルフィド結合により、１つのルプ構造をとることが知ら
れている。このジスルフィド結合は脆弱なため、ループ
が開いてペプチドが線状構造で存在する可能性がある。
したがって、線状ペプチドに加えて新規なジスルフィド
結合環状ペプチドあるいは新規な強固な環状構造を有す
るＨＩＶ ＰＮＤペプチドをここに開示し、別に遊離の
ペプチドとして米国特許出願第５５５，１１２および５
５５，２２７中に開示するが、これらペプチドはすべて
本発明の複合体形成においてＰＥＰ部分として利用でき
る。

【００６１】これらの複合体形成に用いられるペプチド
は天然の蛋白質（たとえばgp１２０）の断片として、あ
るいはその部分の組換え発現により、またはこの分野で
知られた化学合成の手法を用いて得ることができる。さ
らに新規な環状ＰＮＤはここに記載する方法により合成
することができる。配列には天然のＬ−アミノ酸でも天
然にない、すなわちＤ−アミノ酸でも含むことができ
る。さらに複合化の化学的手法は柔軟性があるので、ペ
プチド誘導化試薬を適切に選択すれば複合化は成功す
る。

【００６２】合成ペプチドは、液中や固相保持体上での
様々な手法により調製されている。基礎的な原理と技術
をカバーする優れたテキストは、「ペプチド合成の原
理」（Bodanzky, M.,Springer-Verlag (１９８４）），
「固相ペプチド合成」（StwertJ. M., Young, J.D., Pi
erce Chemical Company（１９８４第２版）、「ペプチ
ド」（Gross, E, Meienhofer, J., Academic Press（１
９７９）であるが、ここにのべるプロセスはこれらテキ
ストの記載に限定されるものではない。

【００６３】合成環状ペプチドは２相にわけて合成され
る。まず線状ペプチドを合成するには、Milligen９０５
０ペプチドシンセサイザーあるいはＡＢＩ４３１Ａペプ
チドシンセサイザーを用い、９−フルオレニルメチルオ
キシ−カルボニル（Fmoc）化学と既知の試薬である側鎖
が保護されたFmoc- アミノ酸ペンタフルオロフェニルエ
ステルを用いるか、または誘導化Wang樹脂とFmoc化学手
法および試薬としてその場で調製された側鎖が保護され
たFmocアミノ酸対称無水物を用いた。

【００６４】つぎに線状ペプチドは液中あるいはまだ固
相に保持された状態で、環状化される。環状化は当分野
で既知の方法で行なうことができるが、その方法として
はたとえば ａ）ループを形成する予定の線状ペプチド配列の両端に
システイン残基を組み込み、既知の酸化条件下ジスルフ
ィド結合を起こさせる。 ｂ）ａ）と同様にシステイン残基を組み込んだペプチド
を調製するが、システインを遊離のスルフヒドリル基と
して保持し（あるいは脱保護されて遊離スルフヒドリル
基となるAcm で保護されたチオールとして保持）、この
ペプチドをｏ−キシレンジブロミドあるいは同様な試薬
（たとえばジイオジド、ジクロリド、ジハロゲン化され
たＣ_2-4 の直鎖あるいは分岐低級アルキル）で処理す
る。このような試薬はシステインのイオウ原子と反応し
て環状構造を形成するがその構造中ではベンゼンまたは
アルキルに結合した２つの強固なチオエーテル結合が存
在する。 ｃ）線状ペプチドの一端のアミノ酸と他の端のアミノ酸
のカルボキシル基とをＤＰＰＡ、ＢＯＰなどのペプチド
結合形成を仲介する試薬によりアミド結合させる。これ
ら戦略のいずれも以下に詳しくとりあげるが、まずこれ
らの方法で調製した環状ペプチドの一般的な説明をす
る。

【００６５】本複合体の発明を以下のペプチドまたはそ
の製造方法に限定することなく、適当な保護基を外した
後に本発明にしたがって連結できるＰＮＤペプチドは、
ＰＥＰ構造で表わされるものを包含し、上記の表IIの線
状ペプチドおよび以下の環状ペプチドを含む：

【化２７】 〔式中ｒはＰＥＰとＰＳＡの間の連結部位であって、Ｒ
¹ がマーカーアミノ酸でない場合はマーカーアミノ酸１
個を意味することができる。Ｒ¹ は ａ）結合、または ｂ）１から５個のアミノ酸からなるペプチドであって、
アミノ酸分析スペクトル中２０個の天然アミノ酸とは離
れた場所に移動するマーカーアミノ酸を一個含むことが
できる。このマーカーアミノ酸としてはノルロイシン、
γ−アミノ酪酸、βアラニン、あるいはオルニチンが好
ましい：Ｒ² は、 ａ）Ｒ³ が少なくとも２個以上のアミノ酸からなるペプ
チドである場合、単結合あるいは１７個までのアミノ酸
からなるペプチド、または ｂ）Ｒ³ が単結合である場合は、２ないし１７個のアミ
ノ酸からなるペプチド：Ｒ³ は、 ａ）Ｒ² が少なくとも２個以上のアミノ酸からなるペプ
チドである場合、単結合あるいは１７個までのアミノ酸
からなるペプチド、または ｂ）Ｒ² が単結合である場合は、２ないし１７個のアミ
ノ酸からなるペプチド： −ＧＰＧＲ−は四量体−GlyProGlyArg−： Ｒ⁴ は、 ａ）Ｒ⁷ がＲ⁸ である場合、Ｒ⁷ がメチン炭素に結合し
た−NH−CH−CO−である、または ｂ）Ｒ⁷ が−COCH₂CH₂CH(CONH₂)NHCO −またはカルボニ
ルの場合、Ｒ³ からＲ⁷ およびＲ⁵ への単結合である：
Ｒ⁵ は ａ）マーカーアミノ酸をふくむことができる１個ないし
５個のアミノ酸からなるペプチド、 ｂ）−OH、 ｃ）−COOH、 ｄ）−CONH₂ 、 ｅ）−NH₂ 、または ｆ）存在しない、である：Ｒ⁶ は ａ）Ｒ⁷ に対する任意の結合（．．．．．．．）が存在
しない場合、通常のＬ−またはＤ−アミノ酸の側鎖から
選択されるアミノ酸側鎖（定義および略号の表参照）、 ｂ）Ｒ⁷ がＲ⁸ の場合、−Ｒ⁸ −Ｓ−Ｓ−または−Ｒ⁸
−Ｓ−Ｒ⁸ −Ｒ⁹ −−Ｒ⁸ −Ｓ−、 ｃ）Ｒ⁷ が

【化２８】 場合、−Ｒ⁸ −NH−である。Ｒ⁷ は ａ）−Ｒ⁸ −

【化２９】 Ｒ⁸ は単結合あるいは１ないし８個の炭素の低級アルキ
ルである。Ｒ⁹ は ａ）Ｒ¹⁰、あるいは ｂ）キシレンである。Ｒ¹⁰は ａ）低級アルキル、または ｂ）−CH₂ −Ｏ−CH₂ −である：ここで基は互いに独立
であり、ペプチドがアミノ酸の末端アミノ基を保護して
合成された場合、アミンの保護基であるベンジルオキシ
カルボニル（Ｚ）あるいはスルフヒドリル基の保護基で
あるアセトアミドメチル（Acm)のような末端アミノ保護
基は当分野で知られた方法およびここに例示された方法
にしたがって除去することができる。脱保護されて露出
した基は、リンカーｒを介して免疫原性蛋白質との連結
結合形成に用いることができる。

【００６６】以降、ＰＮＤペプチドのコアを形成し、環
状ペプチドでループを形成することになるアミノ酸配
列、−Ｒ² −ＧＰＧＲ−Ｒ³ −、のことをループアミノ
酸という。しかしＲ⁶ とＴ⁷ の間の任意結合が存在しな
い場合、構造ＰＥＰは線状で、表IIの全線状ペプチドを
さす。

【００６７】ペプチドが環状であれ線状であれ、ＰＥＰ
のＲ² およびＲ³ を意味するアミノ酸配列は、表II中の
−ＧＰＧＲ−コア四量体を囲む配列を含めてどのアミノ
酸の組み合わせでもよい。したがって−Ｒ² −ＧＰＧＲ
−Ｒ³ −であらわされるコアアミノ酸はさらに進んで下
記のコアアミノ酸構造を有するものと定義することがで
きる。 −Ｘ_n Ｘ₁ Ｘ₂ −ＧＰＧＲ−Ｘ₃ Ｘ₄ Ｘ_m − 式中 −ＧＰＧＲ−は四量体−GlyProGlyArg−である Ｘ₁ はＲ² の構成体で下記から選ばれる： ａ）セリン ｂ）プロリン ｃ）アルギニン ｄ）ヒスチジン ｅ）グルタミン ｆ）スレオニン Ｘ₂ はＲ₂ の構成要素で下記から選ばれる： ａ）イソロイシン ｂ）アルギニン ｃ）バリン ｄ）メチオニン Ｘ_n はＲ² の構成要素であって単結合あるいは１５アミ
ノ酸までのペプチドである。Ｘ₃ はＲ³ の構成要素であ
って下記から選ばれる： ａ）アラニン ｂ）アルギニン ｃ）バリン Ｘ₄ はＲ³ の構成要素であって下記から選ばれる： ａ）フェニルアラニン ｂ）イソロイシン ｃ）バリン ｄ）ロイシン Ｘ_m はＲ³ の構成要素であって、単結合あるいは１５ア
ミノ酸までのペプチドである。

【００６８】環状ペプチドとは不安定なジスルフィド結
合による構造であるか、あるいは安定な結合あるいは構
造を介して形成される環である。安定な結合とは不安定
なジスルフィド結合以外の共有結合を指す。このような
安定な結合の例はアミドおよびチオエーテル結合であ
る。これらの共有結合はキシレンや低級アルキル−CH₂
−Ｏ−CH₂ のような架橋構造、またはアミノ酸ペプチド
結合架橋を介する。架橋構造を変えるおよび／またはペ
プチドに含まれるアミノ酸の数や種類を変えることによ
り免疫システムに提示されるエピトープを微妙に調節
し、環のループ構造の立体構造を最適にすることができ
る。たとえば架橋構造としてｏ−キシレンを用いるとた
とえば炭素数８の直鎖低級アルキルを架橋に用いた場合
よりループの構造がタイトになる。したがって本発明の
複合体は、ＰＮＤエピトープが抗ペプチド、抗ＨＩＶ、
ＨＩＶ中和、抗エイズ免疫反応をほ乳類中に起こさせる
にあたっての構造と機能との関係を分析するのに有用で
あるとともに、抗エイズワクチン製剤の成分としても有
用である。得られた合成ペプチドはＦＡＢ−ＭＳ、逆相
ＨＰＬＣ、アミノ酸分析あるいは核磁気共鳴（ＮＭＲ）
によって同定さる。

【００６９】ａ．ジスルフィド結合したシステイン基を
介した環状ペプチド ループアミノ酸配列の両側にシステイン残基を有するペ
プチドは酸化的条件下で、ジスルフィド結合により環状
となる。ジスルフィド結合をさせる方法は当分野で良く
知られている。本発明におけるジスルフィド結合化の例
は、ｃＰＮＤ４を製造する実施例１０およびｃＰＮＤ３
３を製造する実施例１８に示してある。実施例１０にお
いては、システインのAcm 誘導体を用いてジスルフィド
化したｃＰＮＤをつくるプロセスが示してあるが、他の
方法も同様に用いることができる。実施例１８において
は、２個の遊離のスルフヒドリル基を有するペプチドを
希薄酸中で酸化する。本発明においてはジスルフィド結
合したペプチドが好ましい。

【００７０】よって、本発明の好適な実施態様としては
ペプチドは以下の構造（ＳＥＱ ＩＤ：１８：）

【化３０】 あるいは、その医薬的に許容される塩である；式中ｒは
ａ）水素 ｂ）

【化３１】 式中Ｗは好ましくは−(CH₂)₂−、−(CH₂)₃−、あるいは
Ｒ⁶ であって、Ｒ⁶ は

【化３２】 式中Ｒ⁷ は低級アルキル、低級アルコキシあるいはハロ
である：Ｒ¹ は ａ）単結合、または ｂ）マーカーアミノ酸１個を含んでいても良い１ないし
５のアミノ酸からなるペプチド：Ｒ² は３ないし１０ア
ミノ酸からなるペプチドである：Ｒ³ は３ないし１０ア
ミノ酸からなるペプチドである：Ｒ⁵ は ａ）−OH、 ｂ）マーカーアミノ酸をふくむことができる１個ないし
５個のアミノ酸からなるペプチド、または ｃ）−NH₂ である：Ｒ⁸ は炭素数１から８の間の低級ア
ルキルである：

【００７１】低級アルキルとは特に断わらない限り、直
鎖あるいは分岐アルキルで炭素数１から８のものであ
る。以降、ＰＮＤペプチドのコアを形成し、環状ペプチ
ドでループを形成することになるアミノ酸配列、−Ｒ²
−GlyProGlyArg−Ｒ³ −、のことをループアミノ酸とい
う。本発明の１実施態様に置いて、以下の構造を有する
環状ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ：１８：）

【化３３】 は、以下の構造

【化３４】 を有する線状ペプチドを環化することにより調製され
る。式中Ｘ₁ はＲ² の構成体で下記から選ばれる： ａ）セリン ｂ）プロリン ｃ）アルギニン ｄ）ヒスチジン ｅ）グルタミン（これが好ましい） ｆ）スレオニン Ｘ₂ はＲ₂ の構成要素で下記から選ばれる： ａ）イソロイシン（これがもっとも好ましい） ｂ）アルギニン（好ましい） ｃ）バリン ｄ）メチオニン Ｘ_n はＲ² の構成要素であって１つのアミノ酸あるいは
８アミノ酸までのペプチドである：Ｘ₃ はＲ³ の構成要
素であって下記から選ばれる： ａ）アラニン ｂ）アルギニン ｃ）バリン Ｘ₄ はＲ³ の構成要素であって下記から選ばれる： ａ）フェニルアラニン ｂ）イソロイシン ｃ）バリン ｄ）ロイシン Ｘ_m はＲ³ の構成要素であって、１つのアミノ酸あるい
は８アミノ酸までのペプチドである。

【００７２】合成環状ペプチドは２相にわけて合成され
る。まず線状ペプチドを合成するには、Milligen９０５
０ペプチドシンセサイザーあるいはＡＢＩ４３１Ａペプ
チドシンセサイザーを用い、９−フルオレニルメチルオ
キシ−カルボニル(Fmoc)化学的手法と既知の試薬である
側鎖が保護されたFmoc- アミノ酸ペンタフルオロフェニ
ルエステルを用いるか、または誘導化Wang樹脂とFmoc法
および試薬としてその場で調製された側鎖が保護された
Fmocアミノ酸対称無水物を用いた。

【００７３】つぎに線状ペプチドは液中あるいはまだ固
相に保持された状態で、ループを形成する予定の線状ペ
プチド配列の両端にシステイン残基を組み込み、既知の
酸化条件下ジスルフィド結合を起こさせて環状化され
る。好適な実施態様としてはペプチドを（ａ）H₂O₂、
（ｂ）空気中の酸素、（ｃ）約０．１−０．５％ＴＦＡ
を含むCH₃CN 水溶液、（ｄ）約０．１Ｍフェリシアニン
のいずれかにさらして環化する。好ましい方法は空気中
の酸素にさらすことである。

【００７４】得られた合成ペプチドはＦＡＢ−ＭＳ、逆
相ＨＰＬＣ、アミノ酸分析あるいは核磁気共鳴（ＮＭ
Ｒ）によって同定される。本発明において有用なペプチ
ドはさらに以下の（ｉ），(ii)に記載するようにして調
製することができる。

【００７５】ｉ．固相状態でのペプチド環化 システインあるいはその他の遊離のスルフヒドリル基を
側鎖に持つアミノ酸であるＣ¹ とＣ² をループアミノ酸
の両端に有するペプチドを当分野で知られた方法により
調製する（上述）。環状ＰＮＤにおいて、スルフヒドリ
ル基を有する側鎖（−Ｒ⁸ −SH )は環化して−Ｒ⁸ Ｓ−
基となる。反応性のある側鎖（Ｒ基）を有するアミノ酸
を組み込む場合は適切にＲ基が保護された形で用いる。
例えば、ヒスチジンはトリフェニルメチル（Trt)，ある
いはBoc で保護し、アルギニンは４−メトキシメチル−
２，３，６−トリメチルフェニルスルホニル（Mtr)で保
護する。

【００７６】好ましくは、Acm で保護されたＣ² がすで
に結合している樹脂、たとえばFmoc-L-Cys(Amc)-O-Wang
樹脂を購入する。ループアミノ酸のアミノ末端に組み込
まれたシステイン残基（Ｃ¹)もまたAcm 誘導体である。
Ｃ¹ とＣ² のどちらも付加的なアミノ酸であるＲ¹ とＲ
⁵ にそれぞれ結合できる。このＲ¹ 、Ｒ⁵ はキャリア分
子と複合体を形成するのに利用され、あるいはノルロイ
シンやオルニチンが用いられた場合はアミノ酸分析用の
マーカーとして働く。

【００７７】アセトアミドメチル化システインのＳは、
室温約１５時間、樹脂と親和性のある溶媒、たとえば１
−５０％の有機酸濃度（好適には１０％酢酸を含む無水
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ））中、各Acm 基にたい
し約４倍の過剰モル重金属塩（たとえば酢酸水銀（Hg(O
Ac)₂) と反応させる。生じた重金属チオエーテル（たと
えばペプチドの酢酸水銀チオエーテル、ＰＥＰ（Ｓ−Ag
OAc)）は、洗浄し、乾燥する。過剰のＤＭＦ中硫化水素
を加えると、不溶性の金属硫化物（たとえば水銀硫化物
HgS)と遊離のスルフヒドリル基を有するペプチドが得ら
れる。遊離のスルフヒドリル基はついで上記の方法の１
つによって酸化される。別法としてはAcm で保護された
チオールは、メタノール／ＤＭＦ溶中でヨウ素で処理す
ることにより直接環状ジスルフィドに変換することもで
きる。

【００７８】ii．基本的には上述の固相環化法と同様で
あるが２点の主要な違いがある。ペプチドがpepsynＫＡ
樹脂から９５％ＴＦＡ／４％エタンジチオール／１％チ
オアニソールで切り出されると、酸に不安定な側鎖保護
基も同時にはずれ、Cys(Trt)基は遊離の−SH官能基を与
える。しかしCys(Acm)保護が用いられる場合、別に線状
ペプチドを樹脂についたままあるいは外した状態で酢酸
水銀／硫化水素を開裂して遊離の−SH基にする必要があ
る。

【００７９】１つの方法はCys(Acm)保護基とSasrinまた
はPepsynＫＨを用い、完全に保護されたペプチドを１％
ＴＦＡ／CH₂Cl₂で樹脂から開裂する方法を用いるもので
ある。酢酸水銀／硫化水素でCys(Acm)を遊離の−SH基に
変換し、環化は別に保護したペプチドにおいて行なう。
この時点でペプチドはその場で選択的にＮ−末端がマレ
イミド化されることができる。酸に不安定な側鎖保護基
を９８％ＴＦＡ／２％チオアニソールで開裂し、環状ペ
プチドをＨＰＬＣで単離する。しかし好ましい方法はペ
プチドを樹脂から切り出し、上述の方法の１つで環化を
おこさせるものである。もっとも好ましい方法は約１−
５０時間の間、１０から４０℃のあいだで空気酸化させ
ることである。

【００８０】本発明において特に好ましい実施態様は、
構造（ＳＥＱ ＩＤ：２２：）を有するペプチド（ｃＰ
ＮＤ３３）である。

【化３５】 を、アミノ末端ノルロイシンか内部のリシンの１つを介
してＭＩＥＰに連結し、構造の１つあるいは混合物を作
る。

【化３６】

【化３７】 〔式中、ｊは複合体中のペプチドの質量（％）で、好ま
しくは複合体中の全蛋白質量の１１から５０％であ
る。〕

【００８１】ｂ．ｏ−キシレンまたは低級アルキルにチ
オエーテル連結を介した環状ペプチド ｉ．固相状態でのペプチド環化 システインあるいはその他の遊離のスルフヒドリル基を
側鎖に持つアミノ酸であるＣ¹ とＣ² をループアミノ酸
の両端に有するペプチドを当分野で知られた方法により
調製する（上述）。環化しおわったＰＮＤにおいては、
Ｃ¹ とＣ² は上に示したＰＥＰ構造のＲ⁶ とＲ⁷ の一部
となる。反応性のある側鎖（Ｒ基）を有するアミノ酸を
組み込む場合は適切にＲ基が保護された形で用いる。例
えば、ヒスチジンはトリフェニルメチル（Trt)，アルギ
ニンは４−メトキシメチル−２，３，６−トリメチルフ
ェニルスルホニル（Mtr)で保護する。（「ペプチド合成
の原理」（Bodanzky, M.,Springer-Verlag（１９８
４）），「固相ペプチド合成」（Stwert J. M., Young,
J.D., Pierce Chemical Company（１９８４第２版）、
「ペプチド」（Gross, E, Meienhofer, J., Academic P
ress（１９７９））

【００８２】好ましくは、Acm で保護されたＣ² がすで
に結合している樹脂、たとえばFmoc-L-Cys(Amc)-O-Wang
樹脂を購入する。ループアミノ酸のアミノ末端に組み込
まれたシステイン残基（Ｃ¹)もまたAcm 誘導体である。
Ｃ¹ とＣ² のどちらも付加的なアミノ酸であるＲ¹ とＲ
⁵ にそれぞれ結合できる。このＲ¹ 、Ｒ⁵ はキャリア分
子と複合体を形成するのに利用され、あるいはノルロイ
シンやオルニチンが用いられた場合はアミノ酸分析用の
マーカーとして働く。

【００８３】アセトアミドメチル化システインのＳは、
室温約１５時間、樹脂と親和性のある溶媒、たとえば１
−５０％の有機酸濃度（好適には１０％酢酸を含む無水
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ））中、各Acm 基にたい
し約４倍の過剰モル重金属塩（たとえば酢酸水銀（Hg(O
Ac)₂) と反応させる。生じた重金属チオエーテル（たと
えばペプチドの酢酸水銀チオエーテル、ＰＥＰ（Ｓ−Ag
OAc)）は、洗浄し、乾燥する。過剰のＤＭＦ中硫化水素
を加えると、不溶性の金属硫化物（たとえば水銀硫化物
HgS)と遊離のスルフヒドリル基を有するペプチドが得ら
れる。

【００８４】ペプチドと等モルのｏ−キシレンジブロミ
ドまたはジクロリド、ジブロム化またはジクロル化低級
アルキル、あるいは所望の架橋長さをあたえるジハロゲ
ン化−CH₂ −Ｏ−CH₂ −の混合物を誘導体化した樹脂に
加える。大過剰の四級アミン、好ましくはＤＭＦ中のト
リエチルアミン（NEt₃) を徐々に加える。ビススルフヒ
ドリルペプチド部分との反応を室温で約１６時間進行さ
せて、樹脂に結合した状態の、架橋基で誘導体化された
環状ペプチドを得る。酸に不安定な側鎖の保護基の脱離
と、樹脂からの切り出しは、４％１，２−エタンジオー
ルと１％チオアニソールの存在下で９５％トリフルオロ
酢酸で処理することにより行なう。溶解した環状ペプチ
ドはついで濾過して樹脂と分離する。濾液は溶媒を留去
して粗製残渣をＨＰＬＣで精製する。ＨＰＬＣは当分野
に知られた方法、たとえば逆相ＨＰＬＣによって行な
う。

【００８５】ii. 溶液中でのペプチドの環化 基本的には上述の固相環化法と同様であるが２点の主要
な違いがある。ペプチドがpepsynＫＡ樹脂から９５％Ｔ
ＦＡ／４％エタンジチオール／１％チオアニソールで切
り出されると、必要な遊離の−SH官能基を与えるCys(Tr
t)基を含め酸に不安定な側鎖保護基も同時にはずれる。
しかしCys(Acm)保護が用いられる場合、別に線状ペプチ
ドを樹脂についたままあるいは外した状態で酢酸水銀／
硫化水素を開裂して遊離の−SH基にする必要がある。

【００８６】しかしながら好ましい１つの方法はCys(Ac
m)保護基とSasrinまたはPepsynＫＨを用い、完全に保護
されたペプチドを１％ＴＦＡ／CH₂Cl₂で樹脂から開裂す
る方法を用いるものである。酢酸水銀／硫化水素でCys
(Acm)を遊離の−SH基に変換し、環化は別に保護したペ
プチドにおいて行なう。この時点でペプチドはその場で
選択的にＮ−末端がマレイミド化されることができる。
酸に不安定な側鎖保護基を９８％ＴＦＡ／２％チオアニ
ソールで開裂し、環状ペプチドをＨＰＬＣで単離する。
未反応のキシレンジブロミドのような過剰の試薬を保護
基の脱離に先立って除去するには、まず１段階濃度勾配
逆相ＨＰＬＣを行なってからより選択的な濃度勾配溶出
を行なうのが便利である。

【００８７】このサブセクションの方法により調製され
た環状ＨＩＶ ＰＮＤペプチドは以下に示すサンプルｃ
ＰＮＤを包含するがこれに限定されるものではない。こ
のサブセクションの方法は一般に小さいペプチドに適用
でき、特に５個から３０個までのアミノ酸からなるペプ
チドに適用できる。最適な環のサイズは−ＧＰＧ−三量
体を含む５から１０個のあいだのアミノ酸を含むもので
ある。この環のサイズは適切なアミノ酸の数と組み合わ
せを有する線状ペプチドから環を作成することにより容
易に保つことができる。このサブセクションｂ．（ｉ）
と(ii)に記載されたプロセスで得られた代表的なペプチ
ドはＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．５５５，２２７に開示する。複合
体発明はこれらの特定の実施態様であるＨＩＶ環状ＰＮ
Ｄペプチドに限定されるものではない。他の線状ＨＩＶ
ＰＮＤペプチド配列もこれらのペプチドを作成したの
と基本的に同一のやり方で環状にすることができる。互
いに異なった一次配列を有するペプチドを作成すること
ができ、それらは抗ペプチド、抗ＨＩＶあるいはＨＩＶ
中和性免疫反応を引き出すことができるかぎり、本発明
においては有益である。

【００８８】ｃ．アミド結合形成を経る環化 複合体形成用の新規のアミド結合した環状ペプチドは、
基本的に２相で調製される。初めに、線状ペプチドを調
製するが、これにはたとえばＡＢＩ−４３１Ａペプチド
シンセサイザーを用い、既知の固相ペプチド合成化学手
法、たとえばFmoc法と適切に側鎖が保護されたFmoc−ア
ミノ酸を試薬に用いる。

【００８９】次ぎに、線状ペプチドを樹脂から切り出
し、溶液中で環化を行なうが、これはアミノ末端のイソ
グルタミンの遊離のアミノ基、あるいはロープアミノ酸
の片端のリジンのε−あるいはα−アミノ基をループア
ミノ酸のカルボキシ末端の遊離のカルボキシル基とを、
ＤＰＰＡ、ＢＯＰなどのペプチド結合形成を行なわせる
試薬によりアミド結合させることにより行なう。本サブ
セクションに従って合成されたペプチドは以下の実施例
６−２６に示してある。得られた合成ペプチドはＦＡＢ
−ＭＳ、逆相ＨＰＬＣ、アミノ酸分析あるいは核磁気共
鳴（ＮＭＲ）によって同定される。

【００９０】したがって、ペプチド−ポリサッカライド
−蛋白質複合体の非常に好ましい実施態様は、基本的に
ＰＲＰあるいはＰｎＰｓ６Ｂであるスペーサーを介して
ＭＩＥＰとＨＩＶ ＰＮＤペプチドが共有結合している
ものである。ＰＮＤが優勢な単離株、たとえばＨＩＶ
ＩＩＩＢあるいはＨＩＶ ＭＮ単離株から得られたもで
ある場合、複合体ワクチンまたはこのような複合体ワク
チンの混合物はエイズあるいはＡＲＣの予防あるいは治
療に非常に有益である。以下の構造：

【化３８】 〔式中、ｊは複合体中のペプチドの質量（％）で、好ま
しくは複合体中の全蛋白質量の１１〜５０％である。〕
を有する、好ましい実施態様あるいは医薬的に許容され
るその塩は、ほ乳動物において抗−ペプチド免疫反応、
ＨＩＶ中和抗体を誘導し、ＨＩＶ疾患および感染を予防
するワクチンを作成し、エイズおよびＡＲＣを含むＨＩ
Ｖ疾患とＨＩＶ感染に苦しむヒトを治療するのに有用で
ある。

【００９１】本発明の好適な実施態様においては、ｂ型
Haemophius influenzae，あるいはヒト免疫不全ウイル
スによる疾患のような感染性の病原に対し、予防面、治
療面において能動あるいは受動的保護をほ乳類に与える
のに、本発明の複合体ワクチンの１つまたはそれ以上を
用いることができる。測定可能な抗体（たとえば約１〜
５０μｇ、抗原で異なる）を誘導できる抗原（たとえば
ＰＲＰ、ＨＩＶ ＰＮＤペプチド）−ＭＩＥＰ複合体の
有効量を、各複合体が用量あたり投与されるように注射
することにより、能動的保護をおこなうことができる。
ミョウバンのようなアジュバントを用いることも本発明
の範囲である。受動的保護は、あらかじめＭＩＥＰ複合
体を投与した動物から得られた全抗血清またはその抗血
清のグロブリンまたは他の抗体含有画分を単独で、ある
いは滅菌生理食塩水などの医薬的に許容される担体と一
緒に投与することによりおこなうことができる。このよ
うなグロブリンはクロマトグラフィ、塩析またはアルコ
ール沈殿、あるいは電気泳動などによって全抗血清から
得ることができる。受動免疫は、標準的なモノクローナ
ル抗体手法あるいは適当なほ乳動物ホストを免疫するこ
とによって行なうことができる。

【００９２】本発明の好ましい態様においては、複合体
はヒト、特に乳幼児、子供、免疫無防備状態にある人に
対して能動免疫予防接種をおこなうのに用いられる。こ
れら複合体は安定性を増すために、使用に先立ちラクト
ース存在下（たとえば、２０μｇ／mlＰＲＰ−４mg／ml
ラクトース）で凍結乾燥することができる。好ましい
投与量レベルは、H. influenzae, type b ポリサッカラ
イドあるいはＨＩＶ ＰＮＤペプチドの複合体では、約
２−２０μｇのＰＲＰ、あるいは約１−５mgのペプチド
に相当する量の各ＭＩＥＰ複合体またはその誘導体の単
回投与である。必要ならばさらに一回あるいは二回ＭＩ
ＥＰ複合体またはその誘導体を上述したような投与量で
投与する。本発明は以下の実施例を参照してさらに明ら
かにされるが、これら実施例は説明のためであって限定
するものではない。

【００９３】実施例１ 髄膜炎菌（Neisseria meningitidis) Ｂ１１血清型２
ＯＭＰＣの製造 Ａ．発酵 １．髄膜炎菌グループＢ１１ 髄膜炎菌（エム．アルテンステイン（M.Artenstein) 博
士、Walter Reed ArmyInstitute of Research（ＷＲＡ
ＩＲ）、ワシントンＤ．Ｃ．から入手）の凍結乾燥した
培養物を含むチューブを開封し、Eugonbroth（ＢＢＬ)
を加えた。培養物をミュエラーヒントン（Mueller Hint
on) 寒天斜面培地に画線し、３７℃、５％CO₂ で３６時
間温置し、この時増殖物を１０％スキムミルク培地（デ
フコ（Difco)）に回収し、そして分割量を−７０℃で凍
結した。菌の同定はＷＲＡＩＲにより供給された特定の
抗血清と凝集することにより、またデフコより供給され
た血清型を検査することにより確認された。第２継代か
らの培養のバイアルを解凍し、１０枚のコロンビア シ
ープ ブラッド（Columbia Sheep Blood) 寒天プレート
（ＣＢＡＢ−ＢＢＬ）に画線した。プレートを３７℃５
％CO₂ で１８時間温置し、その後増殖物を１０％スキム
ミルク培地１００mlに回収し、分割量を０．５mlの量に
し、−７０℃で凍結した。菌は特定の抗血清による凝
集、糖発酵およびグラム染色により明確に同定した。こ
の継代からの培養菌のバイアルを解凍し、ミュエラーヒ
ントン肉汁培地で希釈し、４０枚のミュエラーヒントン
寒天プレートに画線した。プレートを３７℃６％CO₂ で
１８時間温置し、その後増殖物を１０％スキムミルク培
地１７mlに回収し、０．３mlの量に分割し、−７０℃で
凍結した。この菌はグラム染色、特定の抗血清による凝
集、酸化酵素試験により明確に同点した。

【００９４】２．発酵および細胞ペーストの回収 ａ．接種原の調製−接種原を上記（継代４）からの髄膜
炎菌グループＢ、Ｂ１１の凍結バイアルから増殖させ
た。１０本のミュエラーヒントン寒天斜面に接種し、６
本を約１８時間後集菌して、ゴットシュリッヒ（Gotsch
lich) の酵母透析物培地（pH６．３５）２５０mlの入っ
たフラスコ３本への接種原として使用した。O.D.₆₆₀ を
０．１８に調整し、ＯＤ₆₆₀ が１と１．８の間になるま
でインキュベートした。この培養物１mlを使用して、５
つの２リットル容エーレンマイヤーフラスコ（培地１リ
ットルをそれぞれ含む、下記参照）のそれぞれに接種
し、２００rpm の振とう機中３７℃で温置した。接種後
ＯＤを、１時間ごとに経時的に監視した。ＯＤ₆₆₀ が
１．２８の液体培養物４リットルが得られた。

【００９５】７０リットル種菌発酵槽−約４リットルの
種培養菌を使用し、完全産生培地（下記参照）を約４０
リットルを含む滅菌した７０リットル容ファーメンター
に接種した。７０リットルファーメンターの運転条件は
１０リットル／分の通気および約pH７の一定pH制御で３
７℃、１８５rpm 約２時間とした。このバッチに関し
て、最終のO.D.₆₆₀ は２時間後０．７３２であった。 ８００リットル産生発酵槽 種培養物約４０リットルを使用し、完全産生培地（下記
参照）５６８．２リットルを含む滅菌の８００リットル
発酵槽に接種した。バッチは６０リットル／分の空気通
気およびpH７．０での一定pH制御で３７℃１００rpm で
温置した。このバッチに関し、最終Ｏ．Ｄ．は接種後１
３時間で５．５８であった。

【００９６】 ３．エーレンマイヤーフラスコ並びに７０および８００リットル発酵槽用完全 培地 ─────────────────────────────────── 画分Ａ ─────────────────────────────────── Ｌ−グルタミン酸 １．５ ｇ／リットル NaCl ６．０ ｇ／リットル Na₂HPO₄ 無水物 ２．５ ｇ／リットル NH₄Cl １．２５ｇ／リットル ＫCl ０．０９ｇ／リットル Ｌ−システインＨCl ０．０２ｇ／リットル ───────────────────────────────────

【００９７】画分Ｂ（ゴットシュリッヒの酵母透析物） ディフコ酵母抽出物１２８０ｇを蒸留水６．４リットル
に溶解した。溶液を３つのＨ１０ＳＭカートリッジを有
する２つのアミコン（Amicon) ＤＣ−３０中空糸膜透析
ユニット中で透析した。３８４ｇMgSO₄ ・７H₂O および
３２００ｇデキストロースを透析物中に溶解し、全容積
を蒸留水で１５リットルにした。pHはNaOHで７．４に調
整し、０．２２μフィルターを通して滅菌し、画分Ａを
含む発酵槽に移した。エーレンマイヤーフラスコについ
ては、１リットルの画分Ａと２５mlの画分Ｂを加え、Na
OHを用いてpHを７．０〜７．２に調整した。７０リット
ル発酵槽については、４１．８リットルの画分Ａと９０
０mlの画分Ｂを加え、NaOHを用いてpHを７．０〜７．２
に調整した。８００リットル発酵槽については、５５３
リットルの画分Ａと１５．０リットルの画分Ｂを加え、
NaOHを用いてpHを７．１〜７．２に調整した。

【００９８】ｄ．集菌および不活性化 発酵の終了後、フェノールを別の容器に加え、次にこれ
に細胞培養液を移し、約０．５％の最終フェノール濃度
を得た。培養物がもはや生存可能でなくなるまで（約２
４時間）、ゆるやかに撹拌しながら室温に保持した。

【００９９】ｅ．遠心分離 ４℃で約２４時間後、不活性化培養液体６１４．４リッ
トルをシャープレス（Sharples) 連続流遠心分離機によ
り遠心分離する。フェノール処理後の細胞ペーストの重
量は３．８７５kgであった。

【０１００】Ｂ．ＯＭＰＣ単離工程１ ．濃縮と透析濾過 フェノール不活性化培養物を約３０リットルに濃縮し、
０．１μ中空糸フィルター（ＥＮＫＡ）を使用し、滅菌
蒸留水中で透析濾過した。

【０１０１】工程２．抽出 ２Ｘ ＴＥＤ緩衝液〔０．１Ｍ ＴＲＩＳ ０．０１Ｍ
ＥＤＴＡ緩衝液、pH８．５、０．５％デオキシコール
酸ナトリウムを用いる〕を濃縮透析濾過細胞に等量加え
た。懸濁液をＯＭＰＣ抽出用の温度制御タンクに移し、
５６℃で３０分間撹拌した。抽出物を約１８，０００rp
m でシャープレス連続流遠心分離機中約８０ml／分の流
速、約４℃で遠心分離した。次に粘性の上清を集め４℃
で貯蔵した。抽出後の細胞ペレットは上記のＴＥＤ緩衝
液中で再抽出した。上清をプールし、４℃で貯蔵した。

【０１０２】工程３．限外濾過による濃縮 プールした抽出物をAG−Tech ０．１ミクロンポリスル
ホンフィルターの備え付けの温度制御容器に移した。抽
出物の温度を容器中２５℃に濃縮過程中保持した。試料
を１１と２４psi の間の平均経膜圧力で１０倍に濃縮し
た。

【０１０３】工程４．ＯＭＰＣの回収と洗浄 工程３からの濃縮液を約１６０，０００xg（３５，００
０rpm)で約７０℃で３００から５００ml／分の流速で連
続流遠心分離機中遠心分離し、上清を捨てた。ＯＭＰＣ
ペレットをＴＥＤ緩衝液（１９０ml緩衝液、２０ml／ｇ
ペレット）中に懸濁させ、工程２と工程４を２回繰り返
した（工程３は省略する）。

【０１０４】工程５．ＯＭＰＣ生産物の回収 工程４からの洗浄ペレットをガラス棒とドウンス（Doun
ce) 破砕器を用いて１００ml蒸留水中に懸濁して、完全
な懸濁液にした。水性ＯＭＰＣ懸濁液を０．２２μフィ
ルターを通してろ過滅菌し、０．１μ中空糸フィルター
を使用し滅菌蒸留水に対し透析濾過することによりＴＥ
Ｄ緩衝液を水で置き変えた。

【０１０５】実施例２ H.influenzaeタイプｂきょう膜ポリサッカライド（ＰＲ
Ｐ） 接種原と種菌の調製 Ａ段階：ヘモフィラス インフルエンザタイプｂ（Haem
ophilus influenzae type b)(Ross 768 からの培養、St
ate University of New Yorkから入手）の凍結乾燥チュ
ーブを滅菌しヘモフィラス接種用培地（下記参照）１ml
中に懸濁し、この懸濁液を９本のチョコレート寒天斜面
（ＢＢＬ）に広げた。接種用培地のpHを７．２±０．１
に調整し（代表値はpH７．２３）、培地溶液は使用する
前に１２１℃２５分間のオートクレーブにより滅菌し
た。３７℃でろうそく形広口ビン中２０時間接種後、各
プレートからの増殖物をヘモフィラス接種原用培地１〜
２mlに再懸濁し、斜面に対応するようプールした。 ─────────────────────────────────── ヘモフィラス接種用培地 ─────────────────────────────────── 大豆ペプトン ｇ／リットル １０ NaCl ｇ／リットル ５ NaH₂PO₄ ｇ／リットル ３．１ Na₂HPO₄ ｇ／リットル １３．７ K₂HPO₄ ｇ／リットル ２．５ 蒸留水 容積に応じて ─────────────────────────────────── 斜面の各対からの再懸濁した細胞をヘモフィラス種菌用
／生産培地を約１００ml含む３つの２５０ml容エーレン
マイヤーフラスコに接種した。２５０mlフラスコを、約
１．３のＯＤ₆₆₀ に達するまで３７℃で約３時間温置し
た。これらの培養物を使用して２リットルフラスコ（下
記参照）に接種した。

【０１０６】Ｂ段階：２リットル無バッフルエーレンマ
イヤーフラスコ “Ａ段階”（上記参照）からの５mlの培養物を使用し
て、５つの２リットルフラスコにそれぞれ接種した。各
フラスコは１リットルの完全ヘモフィラス種菌用／生産
培地（下記参照）を含んでいた。次にフラスコを３７℃
で約２００rpm の回転振とう機中約３時間温置した。温
置した間の終りでの代表ＯＤ₆₆₀ 値は約１．０であっ
た。 ─────────────────────────────────── 完全ヘモフィラス種菌用／生産培地 リットル当り ─────────────────────────────────── NaH₂PO₄ ３．１ｇ／リットル Na₂HPO₄ １３．７ｇ／リットル 大豆ペプトン １０ ｇ／リットル 酵母抽出透析濾過物（１） １０ ｇ／リットル K₂HPO₄ ２．５ｇ／リットル NaCl ５．０ｇ／リットル グルコース（２） ５．０ｇ／リットル ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド （ＮＡＤ）（３） ２mg／リットル ヘミン（４） ５mg／リットル ───────────────────────────────────

【０１０７】塩および大豆ペプトンを発熱物質を含まな
い熱水少量に溶解し、別の発熱物質を含まない熱水を用
いて最終容量に補正した。次に発酵槽またはフラスコを
約２５分間１２１℃のオートクレーブにより滅菌し、冷
却後酵母抽出透析濾過物（１）、グルコース（２）、Ｎ
ＡＤ（３）およびヘミン（４）を、接種前にフラスコま
たは発酵槽に無菌的に加えた。

【０１０８】（１）酵母抽出透析濾過物：１００ｇの醸
造酵母抽出物（Amber)を１リットルの蒸留水に溶解し、
排除限界５０kdのＨ１０×５０カートリッジを有するア
ミコン（Amicon) ＤＣ−３０空中糸ユニットを使用して
限外濾過した。濾液を集め、０．２２μフィルターを通
して滅菌した。 （２）グルコースは蒸留水中２５％滅菌溶液として調製
した。 （３）２０mg／ml含有ＮＡＤの原液を０．２２μフィル
ターを通して滅菌し、接種前に無菌的に加えた。 （４）ヘミン３Ｘの原液は０．１Ｍ NaOH の１０ml中に
２００mgを溶解することにより調製、容量は滅菌した蒸
留水を用い１００mlに調節した。溶液を２０分間１２１
℃で滅菌し、接種前に最終培地に無菌的に加えた。

【０１０９】Ｃ段階：７０リットル種菌発酵槽 Ｂ段階の生産物３リットルを使用し、完全ヘモフィラス
種菌および生産培地（上記の通り調製）約４０リットル
とＵＣＯＮ Ｂ６２５消泡剤１７mlを含む発酵槽に接種
した。接種時のpHは７．４であった。 Ｄ段階：８００リットル生産発酵槽 “Ｃ段階”の生産物約４０リットルを使用し、５７０リ
ットルのヘモフィラス種菌および生産培地（上記の通り
調製）を含む８００リットル発酵槽に接種し、必要量に
調整し、ＵＣＯＮ ＬＢ６２５消泡剤７２mlを加えた。
発酵を１００rpm で撹拌しながら３７℃に保持し、O.D.
₆₆₀ が２時間の間で安定するまで約２時間ごとにO.D.
₆₆₀ とpHレベルを測定し、この時発酵を終了した（約２
０時間後、一般的最終O.D.₆₆₀ は約１．２であった）。

【０１１０】収菌と不活性化 約６００リットルのバッチを１％チメロサール１２リッ
トルを含む“キルタンク（kill tank)" に収集して不活
性化した。 清澄化 ４℃での１８時間不活性化後、生産物が澄明に保たれる
ように調節した流速で（１．３から３．０リットル／分
で変化可能）、４インチボウルシャープレス連続流遠心
分離機でバッチを遠心分離した。遠心分離（１５，００
０rpm)後得られた上清を生産物の回収に使用した。

【０１１１】限外濾過による単離と濃縮 ２つの生産発酵からの上清をプールし、排除限界５０kd
の中空糸カートリッジ２０個（４．５m²膜面積、２．０
Lpm 通気および２０psi)を有するロミコンＸＭ−５０限
外濾過ユニット中で２から８℃で濃縮した。濃縮は約
４．５時間後約１，９００リットルが５７．４リットル
に濃縮されるようなものであった。濾液は捨てられた。 ４８％および６１％エタノール沈降 限外濾過濃縮液５７．４リットルに９５％エタノール５
３リットルを４℃で撹拌しながら１時間に渡って滴下添
加し、４８容量％エタノールの最終濃度にした。混合液
を４℃でさらに２時間撹拌し、完全な沈降を確実にし、
上清を集め、続いて約０．４リットル／分の流速で１
５，０００rpm で単一の４インチシャープレス連続流遠
心分離機にかけた。ペレットは捨てられ、清澄化した液
体に、１時間かけて９５％エタノール４０．７リットル
を加えて８２％エタノールにした。混合物をさらに３時
間撹拌し、完全な沈降を確実にした。

【０１１２】第２ペレットの回収 得られた４８％エタノール溶解性−８２％エタノール不
溶性沈降物を、約０．２４リットル／分の流速で１５，
０００rpm で４インチシャープレス連続流遠心分離機中
の遠心分離により集め、８２％エタノール上清を捨て
た。粗生産物の収量はウェットペースト約１．４kgであ
った。 塩化カルシウム抽出 ８２％エタノール不溶性物質１．４kgを冷蒸留水２４．
３リットルとダイマックス（Daymax) 分散容器中で混合
した。この混合液に冷２Ｍ CaCl₂・２H₂O ２４．３リッ
トルを加え、混合液を４℃１５分間温置した。次に容器
を１Ｍ CaCl₂・２H₂O ２リットルで洗い、約５０リット
ルの最終容積にした。

【０１１３】２３％エタノール沈降 CaCl₂ 抽出物５０リットルを、４℃で３０分間に渡り撹
拌しながら９５％エタノール１６．７リットルを滴下添
加して２５％エタノールにした。さらに１７時間撹拌し
た後、混合液を４℃でシャープレス連続流遠心分離機に
かけて集めた。上清を集め、ペレットを捨てた。 ３８％エタノール沈降と粗生産物ペーストの収集 ２５％エタノール可溶性上清を、３０分間に渡り撹拌し
ながら９５％エタノール１３．９リットルを滴下添加し
て３８％エタノールにした。次に混合液を１時間撹拌し
ながら放置し、さらに１４時間撹拌せずに放置し、完全
な沈降を確実にした。得られた混合液を１５，０００rp
m で４インチシャープレス連続流遠心分離機中（０．２
リットル／分の流速）で遠心分離し、沈降した粗製の
Ｈ．インフルエンザ（H.influenzae) のポリサッカライ
ドを集めた。

【０１１４】摩砕 遠心分離したペレットを無水エタノール２〜３リットル
含む約４．５リットル容（１ガロン）のワーリングブレ
ンダー（Waring Blender) に移した。混合は３０秒間行
ない３０秒間休みこれを続け、堅い白色粉末が得られる
までした。粉末をテフロンフィルターディスクを有する
ブフナー漏斗上に集め、続いてその場所で１リットルの
無水エタノールで２回、２リットルのアセトンで２回洗
浄した。次にこの物質を４℃２時間減圧乾燥し、生産物
約３３７ｇ（乾燥重量）を得た。 フェノール抽出 摩砕工程からの乾燥材料の約１６８ｇ（全量の約半分）
をダイマックス分散容器を使用してpH６．９で０．４８
８Ｍ酢酸ナトリウム１２リットル中に再懸濁した。この
酢酸ナトリウム溶液を次のように作られた新しい水性フ
ェノール溶液４．４８リットルで直ちに抽出した：pH
６．９の０．４８８Ｍ酢酸ナトリウム５９０mlを２０リ
ットル加圧容器中フェノール（マリンクロット（Mallin
ckrodt)結晶）の８つの１．５kgボトルのおのおのに加
え混合して懸濁液とした。各フェノール抽出液をＫ２限
外濾過機（エレクトロニュークレオニクス）中３０，０
００rpm ４℃で２．５時間遠心分離した。水性溶出液を
上記の新しい水性フェノール溶液で別に３回抽出した。
フェノール相を捨てた。

【０１１５】限外濾過 上記の第１フェノール抽出からの水性相（１２．２リッ
トル）を冷蒸留水３００リットルで希釈し、３つのＨ１
０Ｐ１０、１０kdカットオフカートリッジを用いたアミ
コンＤＣ−３０限外濾過装置で４℃で透析濾過し、繰越
しフェノールを除去した。アミコンユニットを洗い、洗
い液を濃縮液に加え、最終容積は３１．５リットルであ
った。限外濾過液は捨てられた。 ６７％エタノール沈降 ２．０Ｍ CaCl₂ ０．８１リットルを前工程からの透析
物３１．５リットルに加え（最終CaCl₂ 濃度は０．０５
Ｍであった）、１時間に渡り急速に撹拌しながら９５％
エタノール４８．５リットルを滴下添加し、溶液を８２
％エタノールにした。撹拌４時間、次に４℃で１２時間
放置した後、上清を吸い取り、沈降物を４℃４５分間で
４インチシャープレス連続流遠心分離機（１５，０００
rpm)での遠心分離により集めた。得られたポリサッカラ
イドペレットを３０秒パルスを使用し無水エタノール２
リットルで１ガロンワーリングブレンダー中で摩砕し、
テフロン／フィルターディスク固定のブフナー漏斗上に
集め、その場所で無水エタノール１リットルで４回、次
にアセトン１リットルで２回洗浄した。試料を４℃２０
時間風袋皿上で減圧乾燥した。収量は乾燥粉末約１０２
ｇであった。全部のフェノール抽出からの収量をプール
し、乾燥粉末全量２１２．６ｇを得た。

【０１１６】 ２９％エタノール中超遠心分離と最終生産物の回収 上記からの乾燥粉末２１２．６ｇを蒸留水８２．９リッ
トルに溶解し、これに２Ｍ CaCl₂・２H₂O ２．１３リッ
トルを加え（０．０５Ｍ CaCl₂、２．５mgポリサッカラ
イド／ml）、９５％エタノール２９．８６リットルを３
０分間に渡り滴下添加して混合液を２９％エタノールに
した。混合液を４℃でＫ３チタンボウルとＫ１１ノリル
コアを含むＫ２超遠心分離機中（３０，０００rpm 、１
５０ml／分流速）で遠心分離することにより直ちに清澄
化した。ペレットを捨て、上清を撹拌しながら３０分間
に渡り９５％エタノール１７．２２リットルを加えるこ
とにより３８％エタノールにした。さらに３０分間撹拌
した後、混合液を撹拌しないで４℃１７時間放置し、沈
降物を４インチシャープレス連続流遠心分離機を１５，
０００rpm で（４５分間は必要）使用して集めた。得ら
れたペーストを無水エタノール２リットル含む１ガロン
ワーリングブレンダーに移し、３０秒間作動−３０秒休
止の４または５サイクルにより最高速度で、堅い白色粉
体が形成されるまで混合した。この粉体をジテック（Zi
tex)テフロンディスク固定ブフナー漏斗上に集め、続い
てその場所で無水エタノールの新しい０．５リットルで
２回と１リットルで１回およびアセトン１リットルで洗
浄した。生産物を漏斗から除去し、４℃減圧乾燥（２５
時間）のために風袋皿に移した。生産物の最終収量は乾
燥重量で７９．１ｇであった。

【０１１７】実施例３ ＭＩＥＰをコード化するゲノムＤＮＡのクローニング フェノールで不活化した髄膜炎菌（N. meningitidis)の
細胞（実施例１参照）の約０．１ｇをきれいなチューブ
に移した。フェノールで不活化した細胞を、５６７μl
のＴＥバッファー（１０mM トリス−HCl 、１mM ＥＤ
ＴＡ、pH８．０）に再懸濁させた。この懸濁した細胞
に、３０μl の１０％ＳＤＳ及び３μl の２０mg／mlの
プロライナーゼＫ（Sigma)を加えた。細胞をかきまぜて
３７℃で約１時間インキュベートした後、１００μl の
５Ｍ NaClを加えてよく混合した。その後０．７Ｍ Na
Cl中の１％臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡ
Ｂ）８０μl を加えてよく混合し、６５℃で１０分間イ
ンキュベートした。同体積（約０．７〜０．８ml）のク
ロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を加え
て、よく混合し、約１０，０００xgでおよそ５分間遠心
分離した。水性相（上層）を新しいチューブに移し、有
機相はすてた。同体積のフェノール／クロロホルム／イ
ソアミルアルコール（２５：２４：１）を水性相に加え
て、よく混合し、１０，０００xgで約５分間遠心分離し
た。水性相（上層）を新しいチューブに移して、０．６
倍の体積（約４２０μl ）のイソプロピルアルコールを
加えて、よく混合し、沈殿したＤＮＡを１０，０００xg
で１０分間遠心分離した。上澄みをすてて、ペレットを
７０％エタノールで洗浄した。ＤＮＡペレットを乾燥し
て１００μl のＴＥバッファーに再懸濁して、髄膜炎菌
（N. meningitidis)ゲノムＤＮＡとした。ＭＩＥＰ遺伝
子の５′末端及び３′末端に対応する２つのＤＮＡオリ
ゴヌクレオチドを合成した（村上、Ｅ．Ｃ．ら（１９８
９）Infection and Immunity, ５７、pp２３１８−２
３）。ＭＩＥＰ遺伝子の５′末端に特異的なＤＮＡオリ
ゴヌクレオチドの配列は、５′−ACTAGTTGCAATGAAAAAAT
CCCTG −３′であり、３′末端に特異的な配列は、５′
−GAATTCAGATTAGGAATTTGTT−３′であった。これらのＤ
ＮＡオリゴヌクレオチドを、１０ngの髄膜炎菌（N. men
ingitidis)ゲノムＤＮＡを用いたポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）増殖のプライマーとして用いた。ＰＣＲ増殖
の手順は、製造元（Perkin Elmer) の提供する方法に従
がって行なった。増殖したＭＩＥＰ ＤＮＡを、次に制
限エンドヌクレアーゼＳpeＩとＥcoＲＩで消化した。Ｍ
ＩＥＰの完全なコード化領域を含む１．３キロベース
（kb）のＤＮＡフラグメントを、１．５％アガロースゲ
ル上で電気泳動して単離し、ゲルから電気溶離した
（“Current Protocols in Molecular Biology" （「分
子生物学の最新の方法」）（１９８７）、Ausubel, R.
M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Smit
h, J. A., Seidman, J. G.及びStruhl,K. 編。Greene P
ublishing Assoc.) 。プラスミドベクターｐＵＣ−１９
をＳpeＩとＥcoＲＩで消化した。ゲルで精製したＳpeＩ
−ＥcoＲＩ ＭＩＥＰ ＤＮＡをＳpeＩ−ＥcoＲＩ ｐ
ＵＣ−１９ベクターに連結させて大腸菌（E. coli)株Ｄ
Ｈ５を形質転換するのに用いた。１．３kbp のＭＩＥＰ
ＤＮＡを持つｐＵＣ１９ベクターを含んだ形質転換細
胞を制限エンドヌクレアーゼのマッピングにより、ＭＩ
ＥＰ ＤＮＡの配列を調べて同定した。

【０１１８】実施例４ pc１／１．Ｇａ１１０ｐ（Ｂ）ＡＤＨ１ｔベクターの構
成 ＧaI １０プロモーターを、プラスミドＹＥｐ５２（Br
oachら（１９８３）、Inouye, M 編 "Experimeutal Man
ipulation of Gene Expression" （「形質発現における
実験操作」）に収録。Academic Press pp ８３−１１
７）をSau ３Ａ及びＨind III で切断して得られる０．
５キロベースペアのフラグメントをゲル精製することに
より、単離した。ＡＤＨ１ターミネーターを、ベクター
ｐＧＡＰ、ｔＡＤＨ２（Kniskernら、（１９８６）Gen
e, ４６、pp. １３５−１４１）をＨind III 及びSpeI
で切断して得た０．３５kbp のフラグメントをゲル精製
して、単離した。この２つのフラグメントを、Ｔ４ Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて、ゲル精製した前もってＢamＨＩ
とＳphＩで消化したpuc １８ΔＨind III ベクター（Ｈ
ind III 部位はＨind III によるｐＵＣ１８の消化によ
りとりのぞかれており、大腸菌（E. coli)ＤＮＡポリメ
ラーゼＩのKlenowフラグメントによって平滑末端になっ
ており、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと連結している）に連結
し、親ベクターｐＧａ１１０−ｔＡＤＨ１を作った。こ
れはＧａ１１０ｐ−ＡＤＨ１ｔ結合部に唯一のＨind II
I クローニング部位を有する。ｐＧａ１１０．ｔＡＤＨ
１をＨind III で消化して、この唯一のｐＧａ１１０．
ｔＡＤＨ１のＨind III クローニング部位を切断したＤ
ＮＡをゲル精製して、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
てＨind III −ＢamＨＩリンカー： ５′−ＡＧＣＴＣＧＧＡＴＣＣＧ−５′ ３′−ＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＧＡ−５′ に連結させることによって、唯一のＢamＨＩクローニン
グ部位に変えた。得られたプラスミドｐＧａ１１０
（Ｂ）ｔＡＤＨ１はＨind III 部位を欠失しており、唯
一のＢamＨＩクローニング部位を生じていた。このＧａ
１１０ｐ．ｔＡＤＨ１フラグメントをＳmaＩ及びＳphＩ
で消化してｐＧａ１１０（Ｂ）ｔＡＤＨ１を単離し、Ｔ
４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にして、ゲル精製し
た。イーストシャトルベクターｐＣ１／１（Brake ら、
（１９８４）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ８１、p
p. ４６４２〜４６４６）をＳphＩで消化し、Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼで平滑末端にして、精製した。このフラ
グメントをＴ４ＤＮＡリガーゼでベクターに連結した。
その後、連結反応混合物を用いて大腸菌（E. coli)ＨＢ
１０１細胞をアニピシリン耐性に形質転換し、形質転換
細胞は、一本鎖の³²Ｐで標識化したＨind III ＢamＨＩ
リンカーとハイブリダイゼーションすることによりスク
リーニングした。この新しく構成したベクターを、Ｈin
d III とＢamＨＩで消化して、ｐＣ１／１．Ｇａ１１０
ｐ（Ｂ）ＡＤＨ１ｔと確認した。

【０１１９】実施例５ＭＩＥＰとリーダーＤＮＡ配列を有するイーストＭＩＥ
Ｐ発現ベクターの構成 ＭＩＥＰの完全なコード化領域を持つＤＮＡフラグメン
トを、ＳpeＩとＥcoＲＩによるｐＵＣ１９．ＭＩＥＰ＃
７の消化により製造し、ＭＩＥＰ ＤＮＡをゲル精製し
て、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にした。イース
ト内発現ベクターｐＣ１／１．Ｇａ１１０ｐ（Ｂ）ＡＤ
Ｈ１ｔをＢamＨＩで消化し、子ウシ腸アルカリ性ホスフ
ァターゼで脱リン酸し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑
末端にする。このＤＮＡをゲル精製して切断されないベ
クターをとりのぞいた。 １．１kbp の平滑末端にしたＭＩＥＰフラグメントを、
平滑末端化ｐｃ１／１．Ｇａ１１０ｐ（Ｂ）ＡＤＨ１ｔ
ベクターに連結し、連結反応混合物を用いて、受容能の
ある大腸菌（E. coli)ＤＨ５細胞をアンピシリン耐性に
形質転換した。形質転換細胞は、ＭＩＥＰベクター結合
に重なり合う配列と相同に設計してある³²Ｐで標識化し
たＤＮＡオリゴヌクレオチド：５′…AAGCTCGGATCCTAGT
TGCAATG…３′とハイブリダイゼーションしてスクリー
ニングした。ハイブリダイゼーション陽性の形質転換細
胞からＤＮＡを製造し、ＫpnＩとＳａＩＩで消化して、
ＭＩＥＰフラグメントがＧａ１１０プロモーターからの
発現のために正しい位置にあることをたしかめた。さら
にＧＡ１１０プロモーターからＭＩＥＰコード化領域へ
ジデオキシ配列決定してＤＮＡの構成を確認した。形質
転換細胞によるＭＩＥＰの発現は、ウェスタンブロット
分析で検知した。形質転換細胞の生産した組み換えＭＩ
ＥＰを、ＯＭＰＣ小胞体から精製したＭＩＥＰとともに
ポリアクリアミドゲルに移すと、ＭＩＥＰに特異的な抗
体と免疫学的に反応性があった。

【０１２０】実施例６ ５′−修飾ＭＩＥＰ ＤＮＡ配列を有するイーストＭＩ
ＥＰ発現ベクターの構成 Ｈind III 部位、保存されたイースト５′の翻訳されな
いリーダー（ＮＴＬ）配列、メチオニン出発コドン（Ａ
ＴＧ）、完全なＭＩＥＰ（＋２０の位置のＡspからはじ
まる）の最初の８９個のコドン及び（＋８９の位置の）
ＫpnＩ部位を有するＤＮＡオリゴヌクレオチドを、ポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の技術を用いて生産した。
ＰＣＲは、製造元（Perkin Elmer Cetus) が提案するよ
うに、プラスミドｐＵＣ１９ＭＩＥＰ４２＃７を鋳型と
して、また以下のＤＮＡオリゴマーをプライマーに用い
て行なった。すなわち： ５′CTAAGCTTAACAAAATGGACGTTACCTTGTACGGTACAATT ３′ 及び５′ACGGTACCGAAGCCGCCTTTCAAG３′。 ５′領域のＭＩＥＰクローンをとりのぞくために、プラ
スミドｐＵＣ１９ＭＩＥＰ４２＃７を、Ｋpn１とＨind
III で消化し、３．４Kbp のベクターフラグメントをア
ガロースゲル精製した。２８０bp ＰＣＲフラグメント
をＫpn１とＨind III で消化してアガロースゲル精製
し、３．４Kbp のベクターフラグメントと連結した。大
腸菌（E. coli)ＨＢ１０１（ＢＲＬ）の形質転換細胞
を、ＤＮＡオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション
によってスクリーニングし、陽性の形質転換細胞からの
ＤＮＡを、制限酵素加水分解によって分析した。ＰＣＲ
の段階で突然変異がおこっていないことを確かめるため
に、２８０bpのＰＣＲで生産した陽性形質転換細胞のＤ
ＮＡを配列決定した。得られたプラスミドは、イースト
ＮＴＬ、ＡＴＧコドン及びＡspコドン（アミノ酸＋２
０）からはじまる完全なオープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ）から成るＨind III −ＥcoＲＩ挿入断片を有
した。イーストＭＩＥＰ発現ベクターを以下のように構
成した。ｐＧＡＬ１０／pc１／１及びｐＧＡＰ／ｐＣ１
／１ベクター（Vlasuk. G. P. ら（１９８９）J. B.C.
２６４、pp１２，１０６−１２，１１２）をＢamＨＩで
消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩのKlenowフラグメントで
平滑末端にして、子ウシ腸アルカリ性ホスファターゼで
脱リン酸した。これらの直鎖状ベクターを、Klenow処理
してゲル精製した前記のＨind III −ＥcoＲＩ挿入断片
と連結させた。これはイーストＮＴＬ、ＡＴＧ及びＭＩ
ＥＰのＯＲＦを有し、ｐＧＡ１１０／pc１／ＭＩＥＰと
ｐＧＡＰ／ｐＣ１／ＭＩＥＰを形成する。サッカロミセ
ス（Saccharomyces. cerevisiae)Ｖ９株（ga１１０pga
１４−）をプラスミドｐＧａ１１０／ｐ／ｐＣ１／ＭＩ
ＥＰで形質転換した。組み換えクローンを単離して、Ｍ
ＩＥＰの発現を試験した。クローンを、２％（ｗ／ｖ）
グルコースを含む合成培地で、３７℃で振とうしながら
ＯＤ６６０が約６．０となるまで増殖させた。その後ガ
ラクトースを２％（ｗ／ｖ）となるまで加えて、Ｇａ１
１０プロモーターからのＭＩＥＰの発現を誘導した。ガ
ラクトースによる誘導後、細胞をさらに増殖させて、Ｏ
Ｄ６００は約９．０となった。その後、細胞を遠心分離
して収穫した。細胞ペレットを蒸留水で洗浄して凍結し
た。

【０１２１】組み換えＭＩＥＰに対するウェスターンブ
ロット イーストがＭＩＥＰを発現しているかどうか決定するた
めにウェスタン（Western)ブロット分析を行なった。１
２％、１mm厚、１０ないし１５個の試料溝を有するNove
x Laemmli ゲルを用いた。イースト細胞を、ガラスビー
ズを用いて水中で破砕した（ドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）を細胞をこわす時に２％用いてもよい）。細
胞破片を、１分間１０，０００xgで遠心分離してとりの
ぞいた。上澄みを、ＭＩＥＰのポリアクリルアミドゲル
精製で述べたように、サンプル泳動バッファーと混合し
た。サンプルは、ＯＭＰＣを対照のためのコントロール
として用いて、３５mAで、色素マーカーがゲルを出るま
で泳動した。タンパク質を、ポアサイズ０．４５μのニ
トロセルロース紙に、Novex トランスファー装置を用い
て移した。移した後に、ニトロセルロース紙を、リン酸
で緩衝生理食塩水中の５％ウシ血清アルブミンで１時間
ブロックした後、１５mlのウサギ抗ＭＩＥＰ抗血清（標
準的方法を用いて、ゲル精製したＭＩＥＰで免疫処理し
て作ったもの）の１０００倍希釈液を加えた。室温でひ
と晩インキュベートした後、１５mlのアルカリ性ホスフ
ァターゼと複合した抗ウサギＩｇＧの１０００倍希釈液
を加えた。２時間インキュベートした後、ＦＡＳＴ Ｒ
ＥＤ ＴＲ ＳＡＬＴ（Sigma)とナフトール−ＡＳ−Ｍ
Ｘ−リン酸塩（Sigma)を用いて、ブロットを発色させ
た。

【０１２２】実施例７ 組み換えＭＩＥＰの細菌による発現 １．３Kbp のＭＩＥＰ遺伝子挿入断片を持つプラスミド
ｐＵ１９−ＭＩＥＰを、制限エンドヌクレアーゼＳpeＩ
とＥcoＲＩで消化した。１．１Kbp のフラグメントを単
離し、この分野で既知の標準的方法を用いてアガロース
ゲル上で精製した。２つのシストロンＴＡＣプロモータ
ーと唯一のＥcoＲＩ部位を有するプラスミドｐＴＡＣＳ
ＤをＥcoＲＩで消化した。製造元の指示に従がって、Ｔ
４ ＤＮＡポリメラーゼ（Boehringer Mannheim)を用い
て、１．３Kbp のＭＩＥＰ ＤＮＡとｐＴＡＣＳＤベク
ターをともに平滑末端にした。製造元の指示に従がっ
て、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Boehringer Mannheim)を用い
て、平滑末端化した１．３Kbp ＭＩＰ ＤＮＡを、平滑
末端化したベクターに連結した。製造元の指示に従がっ
て、大腸菌（E. coli)ＤＨ５ａＩＱＭＡＸ株（ＢＲＬ）
を形質転換するのに、連結したＤＮＡを用いた。形質転
換した細胞を、２５μg カナマイシン／mlと５０Ｕペニ
シリン／mlを含む寒天プレートに移して、約１５時間３
７℃でインキュベートした。ＭＩＥＰと相同な配列を持
つＤＮＡオリゴヌクレオチドを³²Ｐで標識化して、標準
的なＤＮＡハイブリダイゼーション技術を用いて形質転
換細胞のプレートから溶解して変性させてコロニーを含
むニトロセルロースフィルターをスクリーニングするの
に用いた。ハイブリダイゼーションにより陽性のコロニ
ーを、制限エンドヌクレアーゼを用いてマッピングし、
ＭＩＥＰ遺伝子の位置を決定した。形質転換細胞による
ＭＩＥＰの発現を、Western ブロット分析で検知した。
形質転換細胞の生産した組み換えＭＩＥＰを、ＭＩＥＰ
とともにポリアクリルアミドゲルに移すと、ＭＩＥＰに
特異的な抗体と免疫学的に反応性があった。

【０１２３】実施例８ ポリアクリルアミドゲル電気泳動による、ＯＭＰＣベシ
クル又は組み換え細胞から精製したＭＩＥＰの製造 アクリルアミド／ＢＩＳ（３７．５：１）ゲル、１８×
１４cm、３mm厚を用いた。濃縮用ゲルは４％ポリアクリ
ルアミドで、分離用ゲルは１２％ポリアクリルアミドで
あった。ゲルあたり約５μg のベシクルタンパク質又は
組み換えホスト細胞タンパク質を用いた。１mlのＯＭＰ
Ｃベシクルに、０．５mlのサンプルバッファー（４％グ
リセロール、３００mM ＤＴＴ、１００mMトリス、０．
００１％ブロモフェノールブルー、pH７．０）を加え
た。混合物は、ゲルにのせる前に、１０５℃で２０分間
熱して、室温まで放冷した。ゲルを２００〜４００mAで
冷却しながら、ブロモフェノールブルーがグルの底に達
するまで流した。たてに細長く（約１〜２cm幅に）ゲル
を切りとって、Coomassie ／酢酸銅で染めた。このひも
状のゲルを、ＭＩＥＰバンド（約３８Kd) が見えるよう
になるまで脱色した。その後このひも状のゲルをもとの
場所にもどして、ＭＩＥＰの部分をメスで残りのゲルか
ら切り離した。切り離したゲルを（約５mmの）立方体に
切り、０．０１ＭトリスバッファーｐＨ０．１で溶出し
た。溶出を２回くりかえした後に、溶離液の純度をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで評価した。溶離液を通常の溶離液用容器
にあつめて、ホウ酸バッファー（０．１Ｍ、ｐＨ１１．
５）で透析した。透析後、溶出したタンパク質をＹＭ１
０膜を有するアミコン攪拌セルを使用して濃縮した（１
０，０００分子量カットオフ）。さらにこの物質をＰＤ
１０分粒カラム（Pharmacia, Piscataway. NJ ）を通し
て精製して、ホウ酸バッファー中室温に保存した。

【０１２４】実施例９ ＰＲＰ−ＯＭＰＣ共有結合複合体におけるＭＩＥＰの担
体活性 免疫処理：オスのＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス（Charles Rive
r, Wilmington, MA ）を、０．５mlの０．０１Ｍリン酸
緩衝生理食塩水に懸濁したＯＭＰＣに共有結合したＰＲ
Ｐ（ＰＲＰ−ＯＭＰＣ；２．５μg のＰＲＰと１７μg
のＯＭＰＣから成る）又はＤＴに結合したＰＲＰ（ＰＲ
Ｐ−ＤＴ；２．５〜７．５μg のＰＲＰと１．８〜５．
４μg のＤＴから成る）（Connaught Laboratories, Wi
llowdale, ONT ）を用いて、腹膜注射（ＩＰ）により免
疫処理した。オスのＣ３Ｈ−ＨｅＮマウスの第２のグル
ープは、１７μg のＭＩＥＰ、１７μg のＯＭＰＣ、又
は１７μg のＯＭＰＣ−ＩＡＡ（Ｎ−アセチルホモシス
ティンチオラクトンを用いて誘導してヨードアセトアミ
ドでキャッピングしたＯＭＰＣ）のいずれかを与えた。
養子免疫移入実験の細胞提供マウスは、２１日間の間を
あけて２度ＩＰで免疫処理し、２度目の処理の１０日後
に脾臓細胞を収集した。養子免疫移入受容マウスは、
¹³⁷Ｃｓ源から５００Ｒの全身γ照射をしたオスのＣ３
Ｈ／ＨｅＮマウスであり、ＰＲＰ−ＤＴ及び、ＯＭＰ
Ｃ、ＭＩＥＰ、ＯＭＰＣ−ＩＡＡのいずれかでそれぞれ
感作した２個体のシンジェネイックな提供者の脾臓細胞
８×１０⁷個をただちに静脈注射して再構成した。対照
マウスには、ＰＲＰ−ＯＭＰＣで感作した１個体の提供
者マウスからの８×１０⁷ 個の脾臓細胞、及び感作しな
い提供者マウスからの同数の脾臓細胞を与えた。

【０１２５】抗ＰＲＰ抗体に関するＥＬＩＳＡ：反応性
アミンを、Marburg らが米国特許第４，８８２，３１７
号に記述するように、カルボニルジイミダゾール処理及
びブタンジアミンとの反応によって、精製したＨ．イン
フルエンザ（H. influenzae)ＰＲＰに導入した。この誘
導したＰＲＰを Sephadex Ｇ−２５上で０．１Ｍ炭酸水
素ナトリウムバッファーpH８．４を用いてクロマトグラ
フィーにかけた。ジメチルスルホキシド中のＮ−ヒドロ
キシスクシンイミドビオチン（Pierce Chemical, Rockf
ord IL）を溶出液に加えて、最終濃度を０．３mg／mlと
し、暗所で４時間、常温（約２５〜２８℃）で反応させ
た。反応しなかったＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオ
チンは、 Sephadex Ｇ−２５にかけて、ＰＢＳを用いて
ゲル濾過してとりのぞいた。Costar（Cambridge, MA)塩
酸ポリビニルＥＬＩＳＡプレートを、０．１Ｍ炭酸水素
ナトリウムバッファーpH９．５中の１０μg ／mlのアビ
ジン（Pierce Chemical)（５０μg ／ウェル）を用いひ
と晩常温で湿度１００％にしてコーティングした。プレ
ートを３回、０．０５％ Tween−２０（ＴＢＳ−Ｔ）を
含むpH８．５で０．０５Ｍのトリスで緩衝した生理食塩
水で洗浄し、０．１％のゼラチンを加えたＴＢＳ−Ｔ
（ブロッキングバッファー）を用いて、常温、湿度１０
０％で１時間ブロッキングした。プレートを洗浄せず
に、１５〜４０μg ／mlのＰＲＰ−ビオチンＰＢＳ溶液
をウェルごとに５０μg 加えて、プレートを１時間イン
キュベートした。サンプルを加える前に、プレートを３
回、ＴＢＳ−Ｔで洗浄した。サンプルは、ブロッキング
バッファーを加えて２倍ずつに希釈して、常温、湿度１
００％で２時間インキュベートした。その後、プレート
をＴＢＳ−Ｔで３回洗浄して、アルカリホスファターゼ
と複合化した適当なイムノグロブリンをブロッキングバ
ッファーで希釈して加えた。用いた抗体は、ヤギ抗マウ
スＩｇＭ（Jackson Immunoreseach, West Grove, PA)、
ＩｇＧ（Fc) (JacksonImmunoreserch) 、ＩｇＧ１（gam
ma)（BRL, Gaithersburg, MD)、ＩｇＧ２ａ（gamma)
（ＢＲＬ）、ＩｇＧ２ｂ（gamma)（Southern Biotechno
logy Associates,Birmingham, AL)、ＩｇＧ３（gamma)
（Southern Biotechnology Associates)及びヤギ抗ウサ
ギＩｇＧ（Jackson Immunoreserch)であった。プレート
を常温、湿度１００％で２時間インキュベートして、ブ
ロッキングバッファーで洗浄し、ｐ−ニトロフェニルリ
ン酸塩（１Ｍジエタノールアミン中に１mg／ml、Kirkeg
aardand Perry, Gaithersburg, MD) を用いて、基質の
発色を行わせた。サンプルの吸収度が、８個の試薬ブラ
ンクの平均値にその標準偏差の３倍をたしたものを超え
ており、希釈段階間の吸収度の差が０．０１以上の場合
に、希釈液を陽性とみなした。終点タイターを、前記の
ようにＥＬＩＳＡで陽性に反応する最高の希釈液の逆数
と定義した。逆数をとったタイターの対数を、分散二元
配置による分析によって（Lindeman, R. H. ら（１９８
０）“Introduction to Bivariate andMuHivarite Anal
ysis"（「二変量及び多変量解析入門」）Scott Foresma
n刊、New York) 、処置したグループ間で比較した。

【０１２６】抗ＰＲＰ抗体定量のためのＲＩＡ：抗ＰＲ
Ｐ抗体の量をテストするのに用いた血清の実験用サンプ
ルを、ウシ胎児血清を希釈液に用いて、１：２、１：５
及び１：２０に希釈した。２５μl の各希釈血清サンプ
ルを０．５ml ＲＩＡバイアル（Sarstedt) に移したも
のを２個ずつ作った。 ¹²⁵Ｉで標識化したＰＲＰ溶液
を、希釈液としてリン酸で緩衝した生理食塩水を用い
て、５０μl あたり１分間に３００ないし８００カウン
ト（cpm)となるように希釈して作った。５０μl の希釈
した ¹²⁵Ｉ−ＰＲＰを各ＲＩＡバイアルに移してよく混
合し、４℃で約１５時間インキュベートした。７５μl
の４℃の飽和硫酸アンモニウム溶液を各ＲＩＡバイアル
に加えて、よく混合し、４℃で１時間インキュベートし
た。その後、ＲＩＡバイアルを１０分間１０，０００xg
で遠心分離して、上澄みをすてて、ペレットのcpm をガ
ンマカウンター（ＬＫＢ）で測定した。既知量の抗ＰＲ
Ｐ抗体を含む抗血清の連続二倍希釈液についての標準曲
線を、前記のように作って、実験した血清サンプルとい
っしょにアッセイした。標準曲線の抗ＰＲＰ抗体量は、
抗体の最大量が１４μg ／ml、最小量０．０５６μg ／
mlの範囲であった。すべてのサンプルは２個づつ作って
アッセイした。２個づつ作ったサンプルの平均cpm を標
準曲線と比較して、実験した血清サンプル中に存在する
抗ＰＲＰ抗体の量を計算した。

【０１２７】養子免疫移入受容者の抗体反応：ＰＲＰ−
ＤＴ及び、ＭＩＥＰ、ＯＭＰＣ、ＩＡＡ−ＯＭＰＣのい
ずれかでそれぞれ感作した脾臓細胞の受容者は、ＰＲＰ
−ＯＭＰＣによる免疫処理に対し、４日以内に同量の血
清ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗ＰＲＰ抗体を生産する反応
を示した（第１図参照）。ＭＩＥＰ、ＯＭＰＣ、ＩＡＡ
−ＯＭＰＣのいずれかでキャリアー感作した脾臓細胞で
再構成した照射マウスは、ＰＲＰ−ＤＴ感作はしたがＯ
ＭＰＣ感作はしなかった脾臓細胞を与えた対照マウスに
くらべて、ＰＲＰ−ＯＭＰＣ免疫処理後に、いちじるし
く高いＩｇＧ１（ｐ＜０．００１）及びＩｇＧ２ａ（ｐ
＜０．０４）抗ＰＲＰ抗体タイターを示した。ＰＲＰ−
ＤＴ及び、ＭＩＥＰ、ＯＭＰＣ、ＩＡＡ−ＯＭＰＣのい
ずれかでそれぞれ感作した脾臓細胞を与えたマウスにお
けるＰＲＰ−ＯＭＰＣ免疫処理に対する血清抗体反応
は、ＰＲＰ−ＯＭＰＣで感作した脾臓細胞を与えたマウ
ス反応と同程度であった（６〜１３日でＩｇＧ１抗体の
ｐ＞０．１２、９〜１３日でＩＧＧ２ａ抗体のｐ＞０．
５）。ＰＲＰ−ＤＴ及び、ＭＩＥＰ、ＯＭＰＣのいずれ
かで感作した脾臓細胞で再構成した照射マウスが、タン
パク質キャリアーなしにＰＲＰで免疫処理された場合、
全く抗体反応は見られなかった。統計的分析を、分散二
元配位分析（ＡＮＯＶＡ）によって行なった（Lindeman
R. H.ら "Introdution to Bivariate and MuHivarite
Analysis" （「二変量及び多変量解析入門」）（１９８
０）、Scott Foresman, New York) 。この結果、ＭＩＥ
ＰはＯＭＰＣと同様にマウスにおいて機能して、抗ＰＲ
ＰＩｇＧ抗体を生産するキリャアーＴヘルパー細胞の反
応を誘導することが証明された。

【０１２８】実施例１０ ＭＩＰの分裂促進作用 髄膜炎菌（N. meniugitidis)ＯＭＰＣから精製したＭＩ
ＥＰの分裂促進作用を、リンパ球増殖アッセイでテスト
した。マウス脾臓リンパ球を、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ、Ｃ３Ｈ
／ＦｅＪ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ又はＢａ１ｂ／ｃマウスから
得た。マウスは未処理あるいは前もってＰＲＰ−ＯＭＰ
Ｃを接種しておいた。脾臓細胞を無菌の新しいメッシュ
スクリーンを通して基質破片をとりのぞき、Ｋ培地（Ｒ
ＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ）＋１０％ウシ胎児血清
（Armoor）、２mMグルタミン（ＧＩＢＣＯ）、１０mM H
epes（ＧＩＢＣＯ）、１００μ／mlペニシリン、１００
μg／mlストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）及び５０μ
Ｍβ−スルカプトエタノール（Biorad））に懸濁した。
細胞の凝塊をピペットでくずした後、懸濁液を３００xg
で５分間遠心分離して、ペレットを赤血球溶解バッファ
ー（９０％ ０．１６Ｍ NH₄Cl(Fisher) 、１０％
０．７トリス−HCl(Sigma)、pH７．２）に、室温で、バ
ッファー１mlに対し細胞０．１mlで２分間再懸濁した。
５mlのウシ胎児血清を細胞の下層にして、４，０００xg
で１０分間遠心分離した後に、Ｋ培地で２回洗浄して、
Ｋ培地１mlにつき５×１０⁶ 個にして細胞を再び懸濁さ
せた。この細胞を９６穴のプレートに、各１００μl ず
つ、タンパク質又はペプチドサンプル１００μl ととも
に入れたものを３組作った。髄膜炎菌（N. meniugitidi
s)のＭＩＥＰを、前記実施例７で述べたように精製し
た。対照タンパク質は、ウシ血清アルブミン、ＰＲＰ−
ＯＭＰＣとＯＭＰＣ自体、そしてリポ多糖（ユンドトキ
シン）を含んだ。全サンプルをＫ培地で希釈して濃度を
１、６．５、１３、２６、５２、１０５及び１３０μｇ
／mlとした後、前記のようにもとの濃度の半分の最終濃
度になるようにプレートに移した。Ｋ培地のみに懸濁し
たそれぞれのタイプの細胞を入れた３組のウェルをさら
に、インキュベートして細胞増殖のベースラインを決定
した。培養３日目、５日目又は７日目に、ウェルを、１
mCi ／２５μl の ³Ｈ−チミジン（Amersham) ２５μl
でパルスラベルした。１６〜１８時間後、ウェルをSkat
ron ハーベスターに集め、液体シンチレーションカウン
ターでcpm を測定した。cpm の実効変化量を、Ｋ培地の
みの細胞のウェルごとのcpm の平均数を実験したcpm の
平均数からひいて計算した。刺激率は、実験した平均cp
m 数を対照のウェルの平均cpm 数でわって決定した。第
２図に示すように、ＭＩＥＰは、ＯＭＰＣ及びＰＲＰ−
ＯＭＰＣワクチンと同様に、前もって接種したマウスか
らのリンパ球を増殖させた。ウサギ発熱原性アッセイに
よる測定ではＭＩＥＰにはリポ多糖（ＬＰＳ）は検知さ
れず、また銀染色したポリアクリルアミドゲル上に検知
できる量以下しか存在しないＬＰＳによってひきおこす
ことのできる増殖効果より大きいということから、この
増殖作用は、ＬＰＳによるものとは思われなかった。

【０１２９】実施例１１ インフルエンザ（H. influenzae)ｂ型ＰＲＰ多糖と髄膜
炎菌（N. meniugitidis)ＭＩＥＰの複合体化 米国特許第４，８８２，３１７号に記述の方法で、化学
的複合体化を行なった。pH１１．５の０．１Ｍホウ酸塩
バッファー３ml中の１０mgのＭＩＥＰを、１０mgのエチ
レンジアミン四酢酸二ナトリウム塩（ＥＤＴＡ、Sigma
Chemicals)及び４mgのジチオトレイトール（Sigma Chem
icals)と混合した。このタンパク質溶液にＮ₂ を十分に
通した。１２５mgのＮ−アセチルホモシスラインチオラ
クトン（Aldrich Chemicals)をＭＩＥＰ溶液に加えて、
混合物を１６時間室温でインキュベートした。その後、
これを２回、Ｎ₂ 雰囲気下に、４mM ＥＤＴＡを含むpH
９．５の０．１Ｍホウ酸塩バッファー２リットルで、２
４時間室温で透析した。その後、チオール化したタンパ
ク質のチオール含有量を、Ellman試薬（Sigma Chemical
s)を用いてアッセイし、タンパク質濃度をBradford試薬
（Pierce Chemicals) で決定した。ＭＩＥＰをＰＲＰに
複合するために、１．５倍の過剰量（wt／wt）のブロモ
アセチル化したインフルエンザ（H. influenzae)ｂ型Ｐ
ＲＰを、ＭＩＥＰ溶液に加えて、１Ｎ NaOHでpHを９〜
９．５に調整した。混合物をＮ₂ 雰囲気下に６ないし８
時間室温でインキュベートした。反応時間が修了した
時、２５μl のＮ−アセチルシステアミン（Chemical D
ynamics)を混合物に加えて、Ｎ₂雰囲気下で室温で１８
時間放置した。複合体溶液を１Ｎ HCl でpH３ないし４
の酸性にして、１０，０００xgで１０分間遠心分離し
た。１mlの上澄みをそのまま、ＦＰＬＣ Superose６Ｂ
（１．６×５０cm、Pharmacia)のカラムにかけて、複合
体をＰＢＳで溶出した。多糖タンパク質複合体（ＰＲＰ
−ＭＩＥＰ）を含む空隙容量で溶出したピークを保存し
た。複合体溶液を、その後、０．２２μフィルターで濾
過して滅菌した。

【０１３０】実施例１２ ＰＲＰ−ＭＩＥＰ複合体の免疫原性の証明 免疫処理：オスのBa1b／ｃマウス（Chaeles River, Wil
mington, MA)を、０．５mlの前もって作っておいたミョ
ウバン中の２．５μｇのＰＲＰを用いて、実施例１１で
述べたＭＩＥＰに共有複合したＰＲＰをＩＰで免疫処理
した。対照マウスを、同量のＰＲＰ−ＣＲＭ（Anderso
n, M. E. ら、（１９８５）、J. Pediatrics,１０７pp
３４６−３５１）（２．５μg ＰＲＰ／６．２５μg Ｃ
ＲＭ；ヒトの服用量の１／４）としてのＰＲＰ、ＰＲＰ
−ＤＴ（同量のＰＲＰが使われるようにヒトの服用量の
１／１０、２．５μg ＰＲＰ／１．８μg ＤＴ）及びＰ
ＲＰ−ＯＭＰＣ（２．５μg ＰＲＰ／３５μg ＯＭＰ
Ｃ；ヒトの服用量の１／４）を用いて免疫処理した。生
後６〜１３．５週の幼児アカゲザルを、ミョウバンに吸
着させたＰＲＰ−ＭＩＥＰ複合体で免疫処理した。各サ
ルに、２ケ所の別の部位から０．２５mlの複合体を注射
した。全投与量を０．５mlとした。サルは０日目、２８
日目そして５６日目に免疫処理し、２ないし４週または
血液のサンプルをとった。実施例９に述べたＥＬＩＳＡ
によって抗体応答を測定すると、クラスとサブクラスの
免疫グロブリン反応を区別した。さらに抗ＰＲＰ抗体の
全量を定量するＲＩＡ（実施例９参照）を用いて、サル
の反応を評価した。ＰＲＰ−ＭＩＥＰ受容者の抗体反応
を第３図に示す。この結果は、ＰＲＰ−ＭＩＥＰ複合体
は、幼児アサゲザル及びマウスに、ＩｇＧ抗ＰＲＰ抗体
及び記憶応答から成る免疫反応を生じさせ得ることを示
す。これは、測定可能な量の抗ＰＲＰ抗体を誘導しない
ＰＲＰ−ＣＲＭやＰＲＰ−ＤＴと対照的である。したが
って、ＭＩＥＰは、ＰＲＰの免疫学的なキャリアータン
パク質として機能し、ＰＲＰ抗原と共有複合すると抗Ｐ
ＲＰ抗体反応をひきおこすことができる。したがって精
製ＭＩＥＰは、細菌多糖複合ワクチンを構成する際の不
均一なＯＭＰＣにとってかわる、効果的な免疫学的キャ
リアータンパク質である。

【０１３１】実施例１３ＭＩＥＰ−ｃＰＮＤ１５複合体の製造： ５０mlフラスコ
中のＭＩＥＰ溶液の１０．５ml（１．８５mg／ml、１
９．４mg総計）に０．１Ｍ、pH１１のホウ酸塩緩衝液
２．６mlを加えた。３７mgのＥＤＴＡ及び１１mgのジチ
オトレイトールの添加後溶液のpHを５Ｎ NaOHで１０．
８に調整した。次いで３４６mgのＮ−アセチルホモシス
ティンチオラクトンを加えてpHを５Ｎ NaOHで再び１１
に調整した。この溶液を脱気し、空気を窒素に置換して
溶液を窒素雰囲気下で２３時間熟成した。次いでサンプ
ルを１０mlのＥＤＴＡを含むpH９．５のホウ酸塩４リッ
トルで７時間透析し、新鮮な４リットルで２２時間そし
て最終的に１．９mgのＤＴＴを含むpH９．５の０．０１
Ｍホウ酸塩緩衝液で１６時間透析した。この処理はチオ
ールの総量４．８４μmoleを含む（Ellmanアッセイによ
る）溶液を与えた。これは２４９ナノモルＳＨ／mgタン
パク質に相当する。実施例１３からのマレインイミド化
ｃＰＮＤ１５のサンプル１０mgを１mlのH₂O に溶解さ
せ、５０μl のこの溶液を逆エルマン法によるマレイン
イミドアッセイに対して使用し５．４μmole（総量）の
マレインイミドを示した。この溶液の０．９ml（４．８
８μmole）部分をチオール化したＭＩＥＰ溶液（pH９．
５）に加え、これはすぐに濁り、３時間４０分後にはチ
オールタイターは残っていなかった（エルマンアッセイ
による）。この溶液（１４ml）をpH９．５、０．０１Ｍ
ホウ酸塩緩衝液の４リットルで２７．５時間そして３８
時間で２回透析した。アミノ酸組成に対する１００μl
のアッセイは以下の結果を示した： ナノモル／０．１mlサンプル ノルロイシン １５．９ β−アラニン １３．７ リジン ４８．４ １００μl のブラッドホード（Bradford) タンパク質ア
ッセイは０．９５mg／mlを示した。分子量１１１１を用
いると、これは１７６．７μg ／mlのペプチドとして解
釈される。従って、タンパク質へのペプチドのローディ
ングは１８．６％であった。

【０１３２】実施例１４ＭＩＥＰ−ｃＰＮＤ３１複合体の製造： ６．５mlのＭＩ
ＥＰ溶液（１．７mg／ml）にpH１１、０．１Ｍホウ酸塩
緩衝液の１．５mlを加え、５Ｎ NaOHの５μl でpH１１
に調整した。この溶液に２１mgのＥＤＴＡ及び６．５mg
のＤＴＴを加え、溶液を１５分間タンブリングにより有
効にした。次いで２００mgのＮ−アセチルホモシスティ
ン チオラクトンを加え、溶液を脱気し、空気をＮ₂ で
置換した。Ｎ₂ ボックス中で１．５時間熟成した後、５
Ｎ NaOHでpH１０．６６に調整し、脱気法を繰り返し、
２０．５時間熟成を続けた。溶液を０．０１Ｍ ＥＤＴ
Ａを含む０．１Ｍ、pH９．５ホウ酸塩４リットルで６．
５時間、続いて０．１Ｍ、pH９．６ホウ酸塩、１mgのジ
チオールトレイトールを含む１０mM ＥＤＴＡの４リッ
トルで１７時間透析した。エルマンアッセイは２．２７
μmole（総量）のチオールを示し、これは２０５ナノモ
ルＳＨ／mgタンパク質に相当する。このチオール化タン
パク質溶液に実施例１４からのマレインイミド化したｃ
ＰＮＤ３１（３．７７μmole／mg、逆エルマンアッセイ
により、２．０７μmole総量）の０．５５mlを加えた。
すぐに濁りが見られた。さらに０．５mgのマレインイミ
ド化したｃＰＮＤ３１を添加し、混合物を１時間熟成し
た。未複合ペプチドを取り除くために、混合物を１２，
０００〜１４，０００の分子量排除限界を有する透析管
中で、pH９．４８、０．１Ｍホウ酸塩の４リットルで
５．２５時間そしてpH９．６８、０．０１Ｍホウ酸塩の
４リットルで６６時間透析した。残りの溶液の全８mlか
ら２００μl をアミノ酸分析に対して取り出した： ノルロイシン ２２．８ ナノモル／２００μl リジン ８５．９ ナノモル／２００μl 次いでこの溶液を尿素として５ＭであるpH７．０７、
０．１Ｍリン酸緩衝液の２００mlで透析し、最終容量
６．５mlを与えた。ブラッドホードタンパク質アッセイ
は１．２５mgタンパク質／ml（８．２mg全量）を示し
た。これは分子量１２０４での０．９１２μmoleペプチ
ド（８ml×２２．８ナノモル／０．２ml）であり、１．
１mgペプチド（総計）に等しい。従って、この場合、ペ
プチドのタンパク質ローディングは１３％達成された。

【０１３３】実施例１５ ジスルフィドー結合ｃＰＮＤ４の固相合成 直線形ＰＮＤペプチドを、Fmoc-L-Cys(Acm)-O-ワング樹
脂（６０．６１ミリ当量／ｇ）から出発して、ＡＢＩ−
４３１Ａペプチド合成機を用いてワング樹脂上に製造し
た。Ｆmoc 化学及びＦmoc −アミノ酸対称無水物（４ｘ
過剰、自然位で製造）を、０．２５ミリモルスケールに
おいて試薬として使用し、ペプチド７４５mgを生じた。

【化３９】 ５％メタノール／無水ＤＭＦ（１ml）中ヨウ素の溶液
を、乾燥し、誘導体化された上記ワング樹脂へ加え、室
温で４時間攪拌した。樹脂をロ過し、無水ＤＭＦ（５×
２ml）で洗浄し、最後にＤＭＦ（２ml）に再懸濁させ
た。水中０．１Ｍチオ硫酸ナトリウム溶液２滴を加え、
数分間攪拌した。樹脂を、水性９５％ＤＭＦ（３×２m
l）、無水ＤＭＦ（２ml）、塩化メチレン（３×２m
l）、エーテル（３×２ml）で洗浄し、乾燥させた。Ｆm
oc 及び他の保護機を、２０分にわたって、ＤＭＦ中２
０％ピペリジンで処理することにより除去し、樹脂を洗
浄し、乾燥させた。樹脂を、室温で６時間９５％ＴＦＡ
／４％エタンジチオール／１％チオアニソール（１ml）
で処理することにより、ジスルフィド結合環状ペプチド
から開裂させた。溶液をロ過し、樹脂を追加の１００％
ＴＦＡ（３×１ml）で洗浄し、合体したロ液を乾燥させ
た。エーテルに不溶の材料を抽出（３×２ml）により除
去し、溶液を再び乾燥させた。連続する２つの２．１２
×２５cmヴィダックＣ１８逆相カラムを用いる調製用Ｈ
ＰＬＣ及び９０′にわたる２０〜２４％ CH₃CNの勾配溶
出により、これら条件下で、３６．６６′で溶出するシ
ャープなピークを単離した。分析用ＨＰＬＣにより、調
製用ＨＰＬＣから得られた生成物と既知のジスルフィド
結合環状標準物の共通クロマトグラフィーにより、単一
のピークが得られた。ＦＡＢ−ＭＳにより１１７１の
〔Ｍ＋Ｈ〕⁺ を得、これはジスルフィド結合環状構造ｃ
ＰＮＤ４（ＳＥＱ ＩＤ：２３：）と一致した。

【化４０】

【０１３４】実施例１６ １．ペプチド結合ｃＰＮＤ１５の溶液合成 直線形ペプチド Cbz-Nle-Lys(Boc)-Gln-Arg(Mtr)-Gly-P
ro-Gly-Arg(Mtr)-Ala-Phe を、市販の入手可能なＦmoc
−フェニルアラニル−Ｐ−アルコキシベンジルアルコー
ル樹脂３７３mg（０．１ミリモル）を用いて、ＡＢＩ４
３１Ａペプチド合成機における固相法により合成した。
ベンジルオキシカルボニル（Ｃbz) 保護形として取得し
たノルロイシンを除き、使用されたＬ−アミノ酸は、適
切な酸反応活性側鎖保護基を有するフルオレニルメトキ
シカルボニル（Ｆmoc)誘導体であった。ポリペプチド誘
導体化樹脂生成物を、焼結ガラス漏斗へ移し、ジクロロ
メタンで洗浄し、乾燥させて、ポリペプチド樹脂生成物
０．６ｇを得た。ペプチドを、ＴＦＡ：１，２エタンジ
オール：アニソールの９５：２：３の混合物６mlで１６
時間処理することにより樹脂から開裂させた。反応混合
物を焼結ガラス漏斗によりロ過し、樹脂を１０mlＴＦＡ
で洗浄し、ロ液を合体させた。直線形ペプチドを、ジエ
チルエーテル４００mlを５０mlづつで、粉砕し、焼結ガ
ラス漏斗でロ過することにより回収した。１％ＴＦＡ１
００mlでの分解、次いで凍結乾燥により、直線形ペプチ
ド２９８mgを得た。ペプチド粉をＤＭＦ８００mlに溶解
し、０．４２mlジイソプロピルエチルアミンで中性化
し、０．０７７mlジフェニルホスホリルアシドで処理し
た。溶液を４℃で７０時間暗室で攪拌し、環状ラクタム
を形成した。氷酢酸３mlを加えて反応を停止させた後、
反応混合物を約１〜２mlの油状まで濃縮し１０％水性酢
酸に溶解し、凍結乾燥させた。環状ペプチドを、移動相
として５％酢酸を用いるＧ−１５ゲルろ過クロマトグラ
フィーにより精製した。ペプチドを含む、ＵＶ検出によ
りモニターされた分画でプールし、凍結乾燥して、乾燥
環状ペプチド１３５mgを得た。得られた全ての結果は、
ｃＰＮＤ１５の構造と一致した。

【化４１】 それはまた次のように表わしてもよい。

【化４２】

【０１３５】２．水素形態を産出するためのｃＰＮＤ１５の脱保護 ３０％水性酢酸２０mlに環状ペプチドを溶解し、炭素上
１０％パラジウム１００mg上での水素化（１６時間、４
０psi で）により、ｃＰＮＤ１５の脱保護を行なった。
反応混合物をシーライト上でロ過し、触媒を除去し、ロ
液を凍結乾燥した。ヴィダックＣ１８セミ−プレプ（se
mi-prep)カラムを用いる逆相ＨＰＣＬにより、純粋な脱
保護環状ペプチド８．５mgを得た。脱保護のこの方法
は、ベンジルオキシカルボニルＮ−保護ペプチドのよう
な合成された全てのペプチドに適用して、結合の用意に
アミノ末端で即座に活性化されるペプチドの遊離水素形
態を産出することができる。生成物の構造は、ＦＡＢ−
ＭＳ、分析的ＨＰＬＣ及びアミノ酸分析により確認さ
れ、ｃＰＮＤ１５の構造とすべての結果が一致した。

【化４３】 それはまた次のように表わしてもよい。

【化４４】

【０１３６】実施例１７ ｃＰＮＤ３１の合成 Ｆmoc −Ｐhe−ワング樹脂２ｇ（０．６ミリ当量／ｇ）
を、ＡＢＩ４３１Ａ合成機に入れた。Ｆmoc 単一カップ
リング実験を、Fmoc-Ala、Fmoc-Arg(Tos) 、Fmoc-Pro、
Fmoc-Ile、Fmoc-His(Trt) 、Boc-Lys(Fmoc) 及びCbz-Nl
e を加えて行い、以下の配列を有する直線形ペプチド樹
脂３．７ｇを生成した。 Boc-Lys(Ｎε-Z-Nle)-His(Trt)-Ile-Gly-Pro-Gly-Arg(T
os)-Ala-Phe ペプチドを、９５％ＴＦＡ：５％水で２時間処理するこ
とにより樹脂から開裂させた。樹脂をロ過により除去
し、ＴＦＡを真空下蒸発によりロ液から除去し、残渣を
ジエチルエーテルとともに粉砕した。沈殿をロ過により
回収し、乾燥させて、配列 H-Lys（Ｎε-Z-Nle)-His-Il
e-Gly-Pro-Gly-Arg(Tos)-Ala-Pheを有する直線形ペプチ
ド１．７ｇを得た。ペプチドをＤＭＦ（１０ml）中Ｂoc
−イソグルタミン−ＯＮp(０．７１ｇ、２ナノモル）及
びＤＩＥＡ（０．３５ml、２ミリモル）で、室温下一晩
処理した。ＤＭＦを蒸発させ、残渣をジエチルエーテル
で処理した。沈殿をロ過により回収し、酢酸エチルで洗
浄した。乾燥させたペプチド（１．９ｇ）をＴＦＡ（１
００ml）で５時間処理した。ＴＦＡを真空下蒸発させ、
残渣をジエチルエーテルとともに粉砕し、沈殿をロ過に
より回収し、乾燥させた。ペプチドを、溶離剤として１
０％水性酢酸を用いるセファデックスＧ−１０により脱
塩した。ペプチド分画を凍結乾燥させ、H-イソGln-Lys
(Ｎε-Z-Nle)-His-Ile-Gly-Pro-Gly-Arg(Tos)-Ala-Phe
を１．２ｇ（０．７９ミリモル）を得た。ペプチドの２
バッチ（０．５５ｇ、０．３６ミリモル）を別々に、１
０００ml氷冷ＤＭＦ及びＤＩＥＡ（０．１６ml、０．９
ミリモル）に溶解し、ＤＰＰＡ（０．１２ml）を加え、
溶液を一晩室温で攪拌した。ＤＭＦを真空下蒸発させ、
残渣を合体し、CHCl₃ において可溶化された。有機分画
を５％水性クエン酸で洗浄し、次いでMgSO₄ 上で乾燥さ
せ、蒸発させてクルード環状ペプチド０．７８ｇを得
た。この材料を、アニソール（１ml）を含む液状ＨＦ
（１０ml）で、２時間０℃で処理した。ＨＦを蒸発さ
せ、残渣を逆相ＨＰＬＣ（ヴィダックＣ−１８、０〜５
０％ CH₃CN、緩衝液として０．１％水性ＴＦＡを用いて
５０分にわたって）勾配溶出により精製し、純粋なｃＰ
ＮＤ３１（２５０mg）を得た（Ｍ＋Ｈ＝１２０４）。

【化４５】

【０１３７】実施例１８ マレイミドプロピオニル−ｃＰＮＤ１５の製造 １０mgのｃＰＮＤ１５−トリフルオロアセテート塩を H
₂O：MeCNの１：２混合物０．３ml中に溶解させた。その
溶液を氷浴中で冷却しそれから０．３４５ＭNaHCO₃溶液
１００μl 、続いてマレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロ
キシサクシンイミドエステル３．５mgを加えた。反応
を、１ｈの攪拌により進むに任せ、続いてトリフルオロ
酢酸３μl により反応停止させた。反応混合物を０．２
μフィルターを通してろ過し、フィルターを０．２１ml
の水で洗浄した。合わせたろ液を２．１５×２５cm Ｖ
ydacＣ１８逆相カラム上に注入した。カラムを２５％ M
eCN ／０．１％ＴＦＡで１０ml／min の流量で１０min
で均等に溶出し、２０minにわたって２５乃至４０％ Me
CN ／０．１％ＴＦＡの勾配で溶出した。２０minと３２
min の間で溶出した生成物を濃縮し凍結乾燥し、マレイ
イミドプロピオニル−ｃＰＮＤ１５のトリフルオロ酢酸
塩７mgを白色非晶質粉末として得た。ＦＡＢ−ＭＳは１
２６２で主イオン（Ｍ＋Ｈ）を示した。エルマン（Ellm
an) アッセイクエンエンチングによるマレイミドの滴定
ではマレイミドプロピオニル−ｃＰＮＤ１５のmg当たり
０．５４μmol の濃度を得た。

【０１３８】実施例１９ マレイミドプロピオニル−ｃＰＮＤ３１の製造 実施例１３の方法にしたがって、ｃＰＮＤ３１のトリフ
ルオロ酢酸塩３７．６mgを０．３２２Ｍ NaHCO₃溶液
０．４１mlおよび１：２ H₂O： MeCN １．２ml中マレイ
ミドプロピオニル Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエス
テル８．３mgと反応させ、ＴＦＡ１０．５μl で反応停
止させた。３０％ MeCN ／０．１％ＴＦＡ均等液で１０
min 、続いて３０−５０％ MeON 勾配液で５min の溶出
させる調製用ＨＰＬＣにより１８−２５min 間に溶出す
る生成物ピークを得た。凍結乾燥した生成物は２６mgで
あり、マレイミド力価は０．５７μM ／mgであった。Ｆ
ＡＢ−ＭＳは１３５６で主イオン（Ｍ＋Ｈ）を与えた。
アミノ酸分析は Nle＝４６０、β−アラニン＝４２０及
び Lys＝４６０nmol／mg．であった。ＮＭＲ分析は６．
９３ppm にシングレットを示した（マレイミドのＨ）。

【０１３９】実施例２０ 本発明のＭＩＥＰ−ｃＰＮＤ１５及びＭＩＥＰ−ｃＰＮ
Ｄ３１結合体の動物への接種のための実験 ミョウバンを一連の接種の際のアジュバンドとして用い
た。接種物を生理食塩水に結合体を該結合体最終濃度が
３００μg ／mlとなるように溶解することにより調製し
た。前もって形成したミョウバン（水酸化アルミニウム
ゲル）を、５００μg ／mlアルミニウムの最終レベルま
で溶液へ加えた。結合体を、室温で２時間ミョウバンゲ
ルに吸着させた。吸収後、結合体を有するゲルを生理食
塩水で２回洗浄し、タンパク質濃度が３００μg ／mlに
なるまで食塩水に再懸濁させた。アフリカ緑ザルのそれ
ぞれに、ミョウバンへ吸着された結合体３００μg ３回
投与量又は、結合体１００μg ３回投与量を接種した。
各投与物を筋肉内注射した。投与は１ケ月ごとに行なっ
た（０、４、８及び２８週）。動物を２週間間隔で採血
した。血清サンプルを各血液から調製し、以下の実施例
に記載されるように、特異的抗体の発生についてアッセ
イした。

【０１４０】実施例２１ 抗−ペプチドＩｇＧ抗体についての血清分析 各血清サンプルを、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩ
ＳＡ）により分析した。ポリスチレンミクロタイタープ
レートを、ウェル当たりリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）中合成ペプチド（ＭＩＥＰへ結合していない）０．
５μg で４℃下コートした。次いで各ウェルを０．０５
％トウィーン−２０（ＰＢＳ−Ｔ）を含むＰＢＳで洗浄
した。ＰＢＳ−Ｔ中に順次希釈された試験血清を、ペプ
チド含有ウェルへ加え、吸着ペプチドと３６℃で１時間
反応させた。ＰＢＳ−Ｔでの洗浄後、アルカリホスファ
ターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧを試験ウェルに加え、３６
℃で１時間反応させた。各ウェルは、０．５mM MgCl₂・
６H₂O を含有する１０％ジエタノールアミンpH９．８を
受けた。続いて起こる反応が室温で３０分進行し、その
時点で３．０Ｎ NaOHの添加により終了された。ペプチ
ド基質と試験血清中の抗体との相互作用の増大は、ウェ
ル上に結合したアルカリホスファターゼの量としてとら
えることができる。ホスファターゼ酵素は、波長４０５
nmの光を吸収する分子物質へのＰ−ニトロフェニルホス
フェートの分解を成立させる。従って、ＥＬＩＳＡ反応
の終了時点での４０５nmの光の吸光度とペプチド結合抗
体の量の間には直接的関連性が存在している。マレイミ
ドプロピオニル−ｃＰＮＤ１５−ＭＩＥＰ及びマレイミ
ドプロピニルｃＰＮＤ３１−ＭＩＥＰ結合体を接種され
た全てのサルが、ペプチドに特異的に結合できる抗体を
生じさせた。

【０１４１】実施例２２ ＨＩＶ感染性を特異的に中和する活性についての血清分
析 ウイルス中和活性を、ロバートソン等、ジェー．バイオ
ル．メソッド（J. Virol. Methods)２０；１９５〜２０
２（１９８８）に記載のアッセイにより測定する。その
アッセイにより、試験血清における特異的ＨＩＶ中和活
性が測定される。そのアッセイは、ＭＴ−４細胞（ヒト
Ｔ−リンパ細胞系）がＨＩＶへ容易に感染すること、及
びウイルス複製の期間後に感染の結果として殺されるこ
とを観察することに基づく。試験血清を、アッセイ前６
０分間５６℃で処理した。この処理は、ＨＩＶ複製の非
特異的インヒビターを除くために必要である。ＲＰＭＩ
−１６４０細胞培地に順次希釈された熱処理血清を、Ｈ
ＩＶの標準感染量と混合する。この量は、７〜８日後に
アッセイ培地中のＭＴ−４細胞の全てを殺すのに必要な
ウイルスの最少量を含むように、アッセイ前に決定され
る。血清−ウイルス混合物を、３７℃で１時間、相互作
用させる。次いで、それを、１０％ウシ胎児血清で補足
されたＲＰＭＩ−１６４０増殖培地に懸濁された１．０
×１０⁵ ＭＴ−４細胞へ加える。培地を、５％ＣＯ₂ 雰
囲気下で７日間３７℃で培養する。培養の終了時点で、
代謝染料ＤＴＴを各培地に加える。この染料は、視覚的
検査では黄色である。生細胞の存在下では、この染料
は、視覚的に青色を生ずる分子種に対して代謝的に処理
される。中和ＨＩＶは、標的ＭＴ−４細胞においては複
製できない。従って、細胞を殺すことはない。それ故
に、ポジティブな中和は代謝染料の添加による青色の発
生により評価される。

【０１４２】実施例２３ 結合体のための環式ジスルフィドの調製 １．ｃＰＮＤ３３（ＳＥＱ ＩＤ：２２：）： H-Nle Cys Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Asn Ile Ile Gly Cys-OH (C₁₃₅H₂₂₀N₄₂O₃₃S₂ ,式重量＝3023.6）の合成 ２６mer を、ミリゲン（Milligen) ＃９０５０合成機に
より、部分的ラセミ化Fmoc-L-Cys(Trt)-OPKA樹脂（ミリ
ゲンバッチＢ０９０４２６、０．０８１ミリ当量／ｇ）
使用量２．４７ｇ（０．２００ミリ当量）から出発して
組み立てた。理論上の収量は６０４mgである。樹脂を当
量のガラスビーズ（シグマ１５０〜２１２μm ）と混合
した。混合物を連続的に接続された２つの１×１０cmカ
ラムに完全に満たした。試薬はFmoc-Pftエステル（トレ
オニンを除く、ｄＨＢｔである）であり、Ｎ−メチルピ
ロリジン溶媒中４倍モル過剰量で使用した。側鎖保護基
は、Tyr(t-ブチル) 、Lys(Boc)、Arg(Mtr)、His(Boc)、
Thr(t-ブチル) 、Cys(Trt)であった。実験を修正（Ly
s⁷; Ile⁹; Ile¹¹; Gly¹²; Pro¹³; Gly¹⁴; Arg^{1 5};
Phe¹⁷; Tyr¹⁸; Thr¹⁹; Thr²⁰; Ile²³; Ile²⁴ と
二重カップリングを行った。アシル化循環時間を Gly¹⁴
とAla¹⁶ を除き、及びIle⁹（２ｘ）、Ile¹¹(２ｘ）、Il
e²³(２ｘ）、Ile²⁴(２ｘ）については９０分へ延ばした
以外、全べてのユニットについて３０〜６０分へ延ばし
た。誘導体化樹脂を遊離末端アミンとして維持し、それ
をCH₂Cl₂で洗浄して自然乾燥した。乾燥誘導体化樹脂と
ガラスビーズの混合物を、８時間振動トレイ上でゆるや
かに攪拌しながら、密閉フラスコ中９５％ＴＦＡ、４％
エタンジチオール、１％ CH₃Sph(３０ml）へ、２３℃で
再懸濁させた。次いであざやかな黄色混合物を、ロ過
し、不溶物を１００％ＴＦＡ（３×２０ml）で完全に抽
出した。合体した濃オレンジ色ロ液を、蒸発させ、油状
ゴム状物（淡褐色）を得た。エーテル（２０ml）ととも
に粉砕する際、この材料は即座に無色固体となり、エー
テル（３×２０ml）を追加して粉砕することによりロ紙
上に移した。乾燥後、粗生成物を、無色微粉末として得
た（５８３mg）。水性０．１％ＴＦＡ／２０％ CH₃CN５
０μl に溶解されたサンプル約５０μgを、０．４６×
２５．０cmヴィダックＣ１８カラム上での分析用逆相Ｈ
ＰＬＣ〔水性０．１％ＴＦＡ／２２％ CH₃CN、λ＝２１
５nm、Ａ＝０．０５、２．０ml／min 〕にかけて４μl
注入し、主成分及び後に溶出した少量成分が明らかとな
った。それらを、連続した２つの２．２１×２５．０cm
調製用Vydac Ｃ１８カラムにサンプルの３０mg及び他の
５０mgアリコートを注入した後、分離して集めた〔６
０′上の線型勾配：０．１％ＴＦＡ／２３−２７％ CH₃
CN、λ＝２１５nm、Ａ＝３．００、１０ml／min 〕。全
量３５．２mgの初期溶出材料及び８．２mgの後の溶出材
料を回収し、次いで凍結乾燥した。主生成物のＦＡＢ−
ＭＳにより、３０２２．１の〔Ｍ＋Ｈ〕⁺ 及び３０４
４．２の〔Ｍ＋Ｎａ〕を得、これは、計算質量と一致し
た。

【０１４３】２．環状ジスルフィド：（ＳＥＱ ＩＤ：２２）：

【化４６】 の製造ａ．Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６誘導酸化 直線形２６mer ジチオール化合物（３５．０mg）を、２
３℃で、脱気蒸留水（３８ml）に溶解し、pH２．７３の
無色透明溶液を得た。pHを、０．１Ｎ NH₄OHで８．５に
調節し、溶液を窒素雰囲気下においた。材料のアリコー
トを直ちに分析用逆相ＨＰＬＣにかけると初期ピークの
出現により、証明されるごとく酸化を受けていることが
見い出された。新たに調製された０．０１Ｍ K₃Fe(CN)₆
の溶液を、磁気攪拌をしながら、窒素下２３℃で、強力
駆動皮下注射器により加えた。ＨＰＬＣによる少アリコ
ートの分析により、初期溶出時間までに、出発材料の全
変換が明らかとなった。反応混合物（pH８．３）を１０
％水性酢酸と混合し、攪拌してpH４．０とした。溶液を
ロ過し、不溶生材料を除去し、わずかに黄色の溶液を蒸
発させ、次いで凍結乾燥させて、淡黄色粉末約２７．９
mgを得た。材料を０．１％ＴＦＡ／２０％ CH₃CNに溶解
し、勾配を、調製用ＨＰＬＣにて溶出した。主な初期溶
出ピーク及び後の溶出ピーク（４：１）を分別して集
め、初期溶出物６．１mg及び後の溶出物１．５mgを得
た。初期溶出物のＦＡＢ−ＭＳ分析により、〔Ｍ＋Ｈ〕
⁺ ３０１９．７、〔Ｍ＋Na〕⁺ ３０４２．５を示し、後
のもののＦＡＢ−ＭＳ分析により〔Ｍ＋Ｈ〕⁺ ３０２
０．０、〔Ｍ＋Na〕⁺ 初期材料＝３０４１．５を示し
た、これらの全ては、環化ｃＰＮＤ３３の正確な質量と
一致した。後の溶出物は、Ｄ−システィンカルボキシ末
端ジアステレオマーである。生成物のアミノ酸分析によ
り、環化生成物についての予期されたアミノ酸成分を
得、後の溶出物がＤ−システィン含有ジアステレオマー
であることを確認した。

【０１４４】ｂ．空気酸化 上記（１）において製造された直線形２６mer(８６mg、
２８．４μモル）を、２３℃で、水性０．１％ＴＦＡ／
２０％アセトニトリル（２８４ml）に溶解し、溶液を空
気中に置いた。環化を、逆相ＨＰＬＣによりモニター
し、サンプルがｔ＝２４時間で、出発直線形材料のほぼ
完全な消失とともに、初期溶出物へほぼ完全に変換され
ていることを見い出した。無色透明の溶液を約８mlまで
蒸発させ、その時点で、上記８６mgから同様の方法で製
造されたサンプル１０mgを追加して加えた。合体したサ
ンプルを約９mlまで蒸発させた。濁った無色溶液を、連
続した２つの２．１２×２５．０cmヴィダックＣ１８カ
ラムにおける２つの分離行程でのＨＰＬＣ分離にかけ
た。２つのフラクション、初期溶出ピークと後の溶出ピ
ークとが別々に集められた。各ピークを別々に蒸発さ
せ、凍結乾燥させて、初期及び後の材料をそれぞれ３
０．１mg及び９．７mg得た。初期溶出物を、別に製造さ
れた初期溶出環化物と合体し、全量４７．５mgのわずか
に薄青色の綿毛状粉末を得た。この材料の分析用ＨＰＬ
Ｃにより、単一ピークを得た。

【０１４５】 ３．３−マレイミドプロピオン酸無水物の製造 ３−マレイミドプロピオン酸２２６mgに無水酢酸５mlを
加え混合物を１３０℃で３．７５ｈ加熱し、室温で一晩
放置した。溶液を油状物にまで濃縮した。ＮＭＲスペク
トル（CDCl₃)は酢酸及びマレイミドプロピオン酸のホモ
無水物と混合無水物の混合物を示した。無水物ではカル
ボニルに隣接したメチレンの共鳴は２．８１ppm に現れ
るのに対して、出発物質の酸はこれらのメチレンを２．
６８ｐｐｍに中心を有するトリプレットとして示してい
る。精製は最初に７０℃０．２ｍｍ次に１２０℃０．２
mmでの分別昇華によって成された。後者の画分は CDCl₃
に溶解させることによって装置から取り出され、溶媒の
蒸発で純粋なホモ無水物３４mgが得られた。これを CDC
l₃とシクロヘキサンから再結晶させ融点１４３−１４７
℃の物質を得た。 計算値：for C₁₄H₁₂N₂O₇ : C, 52.51; H, 3.78; N,
8.75。 実測値：C, 51.73; H, 3.67; N, 8.16。 200 MHz NM
R (CDCl₃) : 2.83 (2H, t) 3.84 (2H, t), 6.73 (2H, s)
。

【０１４６】４．ｃＰＮＤ３３の「選択的」アシル化 ｃＰＮＤ３３（２２．５mg、７０％ペプチドは１５．７
５mgあるいは５．２１２μmol と等価であると見積もら
れた）をpH５．２５の０．１Ｍモルフォリノエタンスル
ホン酸緩衝液１２．０mlに溶解させ、氷浴中で冷却し
た。この溶液の分析と反応の進行は、溶出液として２５
％アセトニトリル：０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ）を用いた２３cmＯＤＳカラム上のＨＰＬＣによって
追跡された。マレイミドプロピオン酸無水物２．０mg、
６．２５μmol を乾燥テトラヒドロフラン０．６００ml
に溶解させた。そしてこの溶液０．５ml（無水物５．２
μmolに相当）を上記ペプチド溶液に加えた。３０秒
後、７μl 部分を分離し、ＨＰＬＣで評価した。このア
ッセイを０．２５、０．５０、１．２５、２．２５及び
３．０ｈで繰り返した。３．５ｈ後溶液を凍結乾燥し
た。凍結乾燥物を２０％水性アセトニトリル２．０mlに
溶解し、０．２μフィルターでろ過し、２１．２mm×２
５cm Zorbax Ｃ−１８カラムに０．７００mlづつ、３回
かけて調製用クロマトグラフィに付した。以下の溶出プ
ログラムを用いた。流量＝１０ml／min 、２５％水性ア
セトニトリル／０．１％ＴＦＡによる均等溶出（１２mi
n)、２８％アセトニトリルまでの勾配液（１０min)、３
５％アセトニトリルまでの勾配液（８min)。最後の画分
は濃縮と凍結乾燥によって分離され、取り出された出発
物質８．９mg（終わりから２番目の画分）及び分子量３
１７２を示す質量スペクトル（ＦＡＢ）を有する生成物
（すなわち、ｃＰＮＤ３３のモノ−マレイミドプロピニ
ル誘導体）９．６mgを得た。生成物を更にシーケンス分
析を行い、リジンが存在しないことによって特徴づけた
（他のシーケンスの不在は末端アミノアシル化を意味す
るであろう）。その結果はマレイモドプロピオニル部分
の全てではないがそのほとんどがカルボキシ末端に最も
近いリジンに結合するこということを示している。例証
の目的のために提供された実施例を伴う上記明細書は本
発明の原理を教示しているが、本発明の実際は特許請求
の範囲そしてそれと等価であるような全ての有用な変
形、付加、改良、もしくは削除を含むということは理解
されるであろう。

【配列表】

【０１４７】配列番号：１ 配列の長さ：４１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル配列（Ｎｏ） フラグメント型（中間型フラグメント） 配列の特徴 特徴を表わす記号：disulfide-bonds, 存在位置：３．．３８ 配列：

【化４７】

【０１４８】配列番号：２ 配列の長さ：２４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：

【化４８】

【０１４９】配列番号：３ 配列の長さ：２５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：

【化４９】

【０１５０】配列番号：４ 配列の長さ：２５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：

【化５０】

【０１５１】配列番号：５ 配列の長さ：１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：

【化５１】

【０１５２】配列番号：６ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：

【化５２】

【０１５３】配列番号：７ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：

【化５３】

【０１５４】配列番号：８ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：

【化５４】

【０１５５】配列番号：９ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：

【化５５】

【０１５６】配列番号：１０ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：

【化５６】

【０１５７】配列番号：１１ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：

【化５７】

【０１５８】配列番号：１２ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：

【化５８】

【０１５９】配列番号：１３ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：

【化５９】

【０１６０】配列番号：１４ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：

【化６０】

【０１６１】配列番号：１５ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：

【化６１】

【０１６２】配列番号：１６ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：

【化６２】

【０１６３】配列番号：１７ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：

【化６３】

【０１６４】配列番号：１８ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：

【化６４】

【０１６５】配列番号：１９ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：

【化６５】

【０１６６】配列番号：２０ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：

【化６６】

【０１６７】配列番号：２１ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：

【化６７】

【０１６８】配列番号：２２ 配列の長さ：２６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を表わす記号：modifide-site, 存在位置：１ 他の情報：Ｎｌｅ 特徴を表わす記号：disulfide-bonds, 存在位置：２．．２６

【化６８】

【０１６９】配列番号：２３ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 （特徴のある箇所ごとに記載） 特徴を表わす記号：modifide-site, 存在位置：１ 他の情報：Ｎｌｅ 配列：

【化６９】

【０１７０】配列番号：２４ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：

【化７０】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＰＲＰ−ＤＴ及びＭＩＥＰ又はＯＭＰＣ又はＩ
ＡＡ−ＯＭＰＣで別々に感作した脾臓細胞を受け入れた
養子免疫細胞移入体の抗体応答をＰＲＰ−ＯＭＰＣによ
る免疫後指示した日に採取した血液試料でＥＬＩＳＡ及
びＲＩＡにより測定した図である。

【図２】試験管内に於けるＭＩＥＰのマイトジェン活性
に対するリンパ球増殖検定を示す図である。細胞ＤＮＡ
への ³Ｈ−チミジン取込みの増加は細胞をウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）、ＰＲＰ−ＯＭＰＣ、ＯＭＰＣ、ＭＩ
ＥＰ又はＣＮＢｒと反応させて測定した。

【図３】ＰＲＰ−ＭＩＥＰ結合体はマウス並びに乳児ア
カゲザルに於て免疫原性を試験した図である。抗体応答
はＥＬＩＳＡ及びＲＩＡによって測定した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マーガレット エー．リウ アメリカ合衆国，19190 ペンシルヴァニ ア，ローズモント，クシュマン ロード ４ (72)発明者 アーサー フリードマン アメリカ合衆国，18966 ペンシルヴァニ ア，チャーチヴィル，フロッグ ホロー ロード 121 (72)発明者 ジョセフ ワイ．タイ アメリカ合衆国，19034 ペンシルヴァニ ア，フォート ワシントン，シナモン ド ライヴ 1370 (72)発明者 ジョン ジェー．ドネリー アメリカ合衆国，19083 ペンシルヴァニ ア，ヘイヴァータウン，ブライアーウッド ロード 1505

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ナイセリア・メニンギチジス（Neisseri
   a meningitidis）（血清型ｂ）の外膜のクラスII蛋白と
   抗原が結合したものからなる、哺乳類において該抗原特
   異的な抗体の形成を誘導または促進する、ほ乳類に用い
   るワクチン。
2. 【請求項２】 抗原が細菌、ウイルス、哺乳類細胞、真
   菌、リケッチア、アレルゲン、毒、毒液、合成ペプチ
   ド、ポリペプチドフラグメントから得られたものであ
   る、請求項１記載のワクチン。
3. 【請求項３】 ナイセリア・メニンギチジス（Neisseri
   a meningitidis）（血清型ｂ）の外膜のクラスII蛋白
   が、組換え宿主細胞で生産された組換え蛋白である、請
   求項１記載のワクチン。
4. 【請求項４】 ヘモフィルス・インフルエンザ（Heamop
   hilus influenzae）（血清型ｂ）のポリサッカライドと
   ナイセリア・メニンギチジス（Neisseria meningitidi
   s）（血清型ｂ）の外膜のクラスII蛋白、および医薬的
   に許容される担体とからなる、ほ乳類を免疫するのに有
   効な量のポリサッカライド／蛋白複合体から成る組成
   物。