JPH05260963A - ペプチド−ポリサッカライド−蛋白質複合体ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 アニオン性ポリサッカライドであるリンカー
を介してNeisseria の外膜たん白複合体（ＯＭＰＣ）に
共有結合で結合されたヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）
主中和決定（ＰＮＤ）ペプチドを有する共有結合性複合
体免疫原。 【効果】 哺乳動物に抗ペプチド免疫応答を誘発させる
ために、哺乳動物にＨＩＶを中和する抗体を誘発させる
ために、後天性免疫不全病候群（ＡＩＤＳ）を含むＨＩ
Ｖ感染又は疾患を予防するためのワクチンを調製するた
めに、又はＡＩＤＳを含むＨＩＶ感染又はＨＩＶ疾患に
係るヒトを治療するために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、新規ペプチド−多類−タンパク
の共有結合体及びその調製法及びその様な結合体の使用
方法に関してのものである。ヒト免疫不全ウィルス（Hu
man Immunodeficiency Virus) （ＨＩＶ）を中和しうる
抗体に高い親和性で結合する特性を持つ主中和決定基
（ＰＮＤ）ペプチドとは、免疫原性タンパクあるいはネ
イセリア（Neisseria)の外側メンブランタンパク複合体
（ＯＭＰＣ）の様なタンパク複合体に結合した、陰イオ
ン性のポリサッカライド（ＰＳＡ）より成る担体に結合
したものである。“中和”という、抗体に対して用いら
れる用語はインビトロであろうとまたはインビボであろ
うと、抗体と、ウィルスとの作用によりＨＩＶ感染及び
後天性免疫不全症候群あるいは、細胞融合、細胞性感
染、ＣＤ４レセプター保有細胞涸渇、及びウィルス増殖
をも含めたＡＩＤＳ関連症候群（ＡＲＣ）などの病気に
特有の、認識されたウィルスの介在による病理形態学的
な機能の幾つかあるいはすべてを

【０００２】弱毒化あるいは阻止する事をもたらす反応
を意味するものである。これらの基準を満たす“中和”
抗体はＨＩＶ感染患者の血清中において検出されたり、
種々のＨＩＶ関連抗原を用いた免疫により動物及びヒト
において誘発されるものである。

【０００３】弱毒化したあるいは殺した丸ごとのＨＩ
Ｖ、ＨＩＶサブユニットタンパク、ＨＩＶ遺伝的物質を
組み込んだものを含む組み換え生ワクシニアウィルス、
ＨＩＶ特異的ペプチドが予防として、あるいは感染後の
治療として利用しうる能力をもった免疫原であるかの評
価を行なった。

【０００４】しかしながら、少量であっても完全粒子ウ
ィルスからのアプローチにはワクチン接種者中での感染
の活性化をもたらすという危険性を伴なうが、サブユニ
ット−タンパク−ワクチンのアプローチはウィルス中和
抗体の誘導を限られてはいるけれども、もたらすもので
ある。生の組み換え体ワクシニアウィルスワクチンのア
プローチは有望であり、本質的に生のウィルスの導入は
危険であり、既に免疫無防備な受容者には特に危険であ
る事は明白である。今までは、ペプチドを基礎とした免
疫原が最も有望である。以下に示す文献はワクチン評価
に関する一般的な全体像を提供するものである。ラスキ
ィー，エル．エー．（Lasky, L. A.) 、クリト. レビ.
イン イムノル. （Crit. Rev. in Immunol.) 、第９
巻、１５３（１９８９）；ガリソン，エル．（Garriso
n, L.) 、クレメンツ，エル．エム．（Clements, L.
M.)、コンプリヘンシブ セラピー（Comprehensive The
rapy)、第１５巻、４７（１９８９）；ダルグリーシ
ュ，エー．（Dalgleish, A.)、ドラッグス オブ トデ
エー，（Drugs of Today) 、第２５巻、７０９（１９８
９）；シュルハファー，イー．ピー．（Schulhafer, E.
P.)、ベルマ，アール．エス．（Verma, R. S.) 、イン
ビボ（In Vivo)、第３巻、６１（１９８９）；ファウ
チ，エー．エス．（Fauci, A.S.) 、等、アナルズ オ
ブ インターナル メディシン（Annals of Internal M
edicine)、第１１０巻、３７３（１９８９）；ローゼン
バーグ，ゼット．エフ．（Rosenberg, Z. F.) 、ファウ
チ, エ. エス．（Fauci, A. S.) 、アドバンセスイン
イムノル（Advances in Immunol)、第４７巻、３７７
（１９８９）；及びスナート，アール．アス．（Snart,
R. S.) 、エイズ（ＡＩＤＳ）、第２巻、Ｓ１０７（１
９８８）。

【０００５】本発明の期待しうるペプチドとは以降中和
決定基（ＰＮＤｓ）として記載され哺乳動物中において
ＨＩＶ中和免疫応答を引き出す能力を持つものと同定さ
れたペプチドである。本発明に従がい、他のＨＩＶ関連
あるいは関連のないペプチドの結合体においても免疫原
性というものはもたらされるけれども、本明細書中にお
いて特に期待されうるものは、ＨＩＶ IIIＢ及びＭＮ分
離株の様な他のＨＩＶ分離株のほとんどすべての中に局
在しているＰＮＤであり、ＨＩＶエンベロープ糖タンパ
クである２９６から３４１のアミノ酸部位あるいはその
近隣部位にあるgp１２０である〔アミノ酸番号はラント
ナー（Rantner)等のネイチャー（Nature) 、第３１３
巻、２７７（１９８５）の配列に従がう〕。この領域に
おけるアミノ酸配列はＨＩＶ分離株中で多様性を示すけ
れども、分離株間においてコアアミノ酸配列として保存
されている、Ｇly−Ｐro−Ｇly（ＧＰＧ）は、用いた分
離株の９０％以上の株の中に見られる配列であり、Ｇly
−Ｐro−Ｇly−Ａrg−Ａla−Ｐhe（ＧＰＧＲＡＦ）配列
は一般的分離株の大多数が保有する配列でもある〔ゴー
ドスミット，ジェイ．（Goudsmit, J.) 、エイズ（Aid
s) 、第２巻、Ｓ４１（１９８８）〕。ＧＰＧ三量体の
前後におけるアミノ酸の保存はそれ程高くない。ＧＰＧ
を含む最小５ないし８個のアミノ酸がＨＩＶ中和応答の
誘導に必要な配列と思われる〔ジャバヘリアン（Javahe
rian) 、等、プナス ユーエスエ（PNAS USA) 、第８６
巻、６７６８（１９８９）；ゴードスミット（Goudsmi
t) 等、レス. ヴィロル（Res. Virol) 、第１４０巻、
４１９（１９８９）〕。

【０００６】ペプチドは直鎖状でも環状でもＨＩＶ中和
免疫応答を引き出す結合体の作成に有効である。またア
ミノ酸配列中においてアラニンからバリンへ、あるいは
グルタミン酸からアスパラギン酸への置換などの若干の
相違があったとしても、同様に免疫応答を引き出しうる
ペプチドとなりうる。さらに一連の環状ＰＮＤペプチド
（ｃＰＮＤｓ）の様に、保存３次構造を有するが、分岐
の一次構造を有するペプチドは同様な免疫応答を引き出
すことができる。ＨＩＶはセルフリーあるいは細胞付着
状態において伝播される事はよく知られる所であり、抗
ＨＩＶ免疫原として利用する為には、抗体産生及び抗体
依存性細胞性細胞障害などの、Ｂ−細胞及びＴ細胞介在
免疫応答を誘起しうる能力を有するペプチドエピトープ
が本質的に必要である。上記記載のgp１２０領域からも
たらされるペプチド配列はその両方の免疫応答を引き出
す事が示されている〔ゴードスミット，ジェイ．（Goud
smit, J.) 、エイズ（ＡＩＤＳ）、第２巻、Ｓ４１（１
９８８）〕。

【０００７】さらに、有効な抗ＨＩＶワクチンを作成す
る為に、ＰＮＤペプチドはそれ自体では一般的に免疫原
性が乏しいので、しばしば、再現性のあるしかも定量的
な形態を保有する担体に結合されるべきものである。非
結合状態のペプチドはＢ細胞由来の抗体産生が低いばか
りでなく、防御Ｔ細胞応答の誘導性にも乏しいものであ
る。本発明はＰＮＤペプチドと免疫賦活剤による新規免
疫学的結合体を提出しこれらの問題を打開する事にあ
る。

【０００８】ＵＳ特許４，６９５，６２４において、マ
ーブルグ（Marburg)等は、ヘモフィラス インフルエン
ザ（Haemophilus Influenzae) ｂの夾膜ポリサッカライ
ドであるポリリボシルリビトールホスフェート（ＰＲ
Ｐ）とナイセリア メニンジャイティディス（Neisseri
a meningitidis) のＯＭＰＣとの共有結合の様子を化学
的に述べている。彼等の発明による結合体は抗ＰＲＰ免
疫応答と引き出し、ヘモフィラス インフルエンザＢの
感染を防御しうる免疫原として有効であった。本発明に
おける結合体は特許４，６９５，６２４中にはないもの
であり、ＨＩＶＰＮＤペプチドに対してまったく異なっ
た免疫反応を誘起しうる結合体である。

【０００９】本発明の新規結合体は結合体に含まれるペ
プチド領域に対する哺乳動物での免疫応答の誘導に有効
である。結合体中におけるペプチド成分とはＨＩＶ Ｐ
ＮＤペプチドあるいはＨＩＶ ＰＮＤペプチドを認識す
る免疫応答を引き出しうるペプチドとして示されるなら
ば、それらの結合体は、ＨＩＶ感染あるいはＨＩＶ疾患
及びＡＩＤＳをも含めて、この様な病気にかかる前、あ
るいはかかった後に哺乳動物中でのＨＩＶ中和抗体の産
生あるいはヒトへのワクチン接種などの為にまた哺乳動
物中で抗ＨＩＶ ＰＮＤペプチド抗体産生の為に有効に
利用される。

【００１０】本発明の結合体は陰イオンポリサッカライ
ド（ＰＳＡ）を介した、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ
Ｖ）のプリンシパルニュートラライジングデターミナン
ト（ＰＮＤ）ペプチドと、免疫原性タンパク（ＰＲＯ）
との共有結合より構成されている。本発明おける好まし
い構造は以下に示されるＩＶ式であり：

【化２１】 式中ＰＥＰとは直鎖状あるいは環状構造をもつ共有結合
ＨＩＶ ＰＮＤペプチド；ＰＳＡとは陰イオン性ポリサ
ッカライドである；ＰＲＯとは免疫原性タンパクあるい
はタンパク複合体であり、好ましくはナイセリアメニン
ジャイティディス（Neisseria meningitidis) の外側メ
ンブランタンパク複合体である；−ｒ−とはペプチド及
びポリサッカライド結合体間の共有結合を架橋するスペ
ーサーである；−Ｂ−とはポリサッカライドとタンパク
結合体間の共有結合を架橋するスペーサーである；ＰＦ
＝０．００１から１０ミリグラムＰＥＰ／ミリグラムＰ
ＳＡであり、好ましくは約０．０１から１である；ＧＦ
＝０．００１から１０ミリグラムＰＳＡ／ミリグラムＰ
ＲＯであり、好ましくは約０．０１から０．３３であ
る；ＥＬＦ＝エピトープ容量率、ミリグラムＰＥＰ／ミ
リグラムＰＲＯであり、好ましくは０．０００１から
０．５mgＰＥＰ／mgＰＲＯである。

【００１１】本発明の複合体は、別々に活性化されたペ
プチド、ポリサッカライド、及びタンパク成分をそれぞ
れ互いに共有結合させる事により調製されるものであ
る。ペプチド及びタンパク成分はそれぞれ活性化されて
付随的に求電子性あるいは求核性を示すが、互いには反
応し得ないものである。逆に、ポリサッカライド成分は
活性化されて付随的な求核性あるいは求電子性基を示
し、反対の位置にある活性化されたペプチドあるいはタ
ンパクと反応をする。これらの反応はペプチドあるいは
タンパクとポリサッカライドを結合する、安定で共有結
合的な二層間のスペーサーを形成させうるものである。

【００１２】この一連の反応によりもたらされる共有結
合免疫原は多重ペプチド部分が、次の段階ではタンパク
に固定されるポリサッカライドの土台の上に構築される
骨格として便宜上、考えられている。ペプタイド成分が
ＨＩＶのＰＮＤｓと等価であるならば、本方法により作
成された結合体は免疫学的効果容量をもって、イムノモ
デュレーター、抗ウィルス剤あるいは抗菌性物質の添加
のあるなしにかかわらず、哺乳動物に投与され、かつま
た、結合体のペプチド部分に対する哺乳動物中での免疫
応答の誘導、哺乳動物中におけるＨＩＶ中和抗体の誘発
あるいはＨＩＶ感染またはＨＩＶ疾患からの予防、防御
の為のヒトに投与しうるワクチンの製造、あるいはＡＩ
ＤＳをも含めたＨＩＶ感染またはＨＩＶ疾患で悩む人達
への投与という面で有効である。

【００１３】従がって本発明の目的は高い免疫原性をも
ち、しかも結合体中のペプチド部分によって示されてい
るエピトープに特異的な免疫応答をヒトにおいて上昇さ
せうる結合体を提供する事にある。他の目的はペプチド
−ポリサッカライド−タンパク結合体におけるペプチド
部分がＨＩＶプリンスパルニュートラライジングデター
ミナンツを認識する免疫応答を哺乳動物中で引き出しう
るところの共有結合免疫原を提供する事にある。他の目
的はヒト免疫不全ウィルスを中和する抗体産生を哺乳動
物中で上昇させうる結合免疫原を提供する事にある。他
の目的は水溶性であるペプチド−ポリサッカライド−タ
ンパク共有結合体を高度に産生しうる方法を提供する事
にある。他の目的は被検哺乳動物中において抗ペプチ
ド、抗ＨＩＶあるいはＨＩＶ中和免疫応答を上昇させう
るその様な結合体の使用方法を提供する事にある。他の
目的はＡＩＤＳあるいはＡＲＣも含めた、ＨＩＶ感染あ
るいはＨＩＶ疾患にかかる前あるいはかかった後にヒト
に対して免疫する時の本発明の結合体を含む、ワクチン
の使用を提供する事にある。

【００１４】ＡＡアッセイ アミノ酸分析法であり、
ペプチドあるいはタンパクを酸加水分解して遊離アミノ
酸を定量する Ａｃｍ アセトアミドメチルチオール保護基 アクティベーション その後の反応が起こりうる様に
ある種の試薬を用いてペプチド、タンパクあるいはポリ
サッカライド部分からそれらの誘導体をもたらす反応 ＡＩＤＳ 後天性免疫不全症候群 アミノ酸 酸及びアミノ官能基を保有する分子；一般
的に H₂N-CHR-COOH なる構造式で示される２０個のα−
アミノ酸がよく知られており；式中Ｒ基はそのアミノ酸
種を血清するものである；これらのアミノ酸はＤあるい
はＬの立体化学的異性体をもち、もし他の点で特異性が
ないならば、以下の表示にある様に一文字表記の略号を
用いて、あるいはアミノ酸名の前に接頭語“Ｄ−”を付
けて表記するが以下のアミノ酸は天然のものでありＬ形
を示すものである。表の構成：２０個のアミノ酸名及び
Ｒ基の構造は以下の表に従がい一文字表記により、表示
されている。

【００１５】 アミノ酸の名称 三文字表記 一文字表記 側鎖（Ｒ） Alanine Ala Ａ −CH₃ Arginine Arg Ｒ −(CH₂)₃NHCHNH₂NH₂+ Asparagine Asn Ｎ −CH₂CONH₂ − Aspartic Acid Asp Ｄ −CH₂COOH Cysteine Cys Ｃ −CH₂SH Glutamic Acid Glu Ｅ −(CH₂)₂COOH Glutamine Gln Ｑ −(CH₂)₂CONH₂ Glycine Gly Ｇ −Ｈ Histidine His Ｈ −CH₂-imidazole Isoleucine Ile Ｉ −CH(CH₃)CH₂CH₃ Leucine Leu Ｌ −CH₂CH(CH₃)₂ Lysine Lys Ｋ −(CH₂)₄NH₃ ⁺ Methionine Met Ｍ −(CH₂)₂SCH₃ Phenylalanine Phe Ｆ −CH₂-Phenyl Proline Pro Ｐ −α，N-(CH₂)₃− − Serine Ser Ｓ −CH₂OH Threonine Thr Ｔ −CH(OH)CH₃ Tryptophan Trp Ｗ −CH₂-indole Tyrosine Tyr Ｙ −CH₂-Phenyl−OH Valine Val Ｖ −CH(CH₃)₂

【００１６】抗体 哺乳動物Ｂ細胞より産生されるタ
ンパクで特定の抗原と結合しうるもの ＡＲＣ ＡＩＤＳ関連症候群 ＡＺＴ アジドチミジン、抗ＡＩＤＳ化合物

【００１７】二属間スペーサー 別々に誘導されたパ
ートナーとの反応により得られる分子的な鎖であり；ス
ペーサーを介して形成している結合体を分析分解により
遊離させる事により電子対結合部位の程度の測定をもっ
て定量化される

【００１８】ＢＯＰ ベンゾトリアゾール−１−イル
オキシトリス−（ジメチルアミノ）ホスフォニウムヘキ
サフルオロホスフェート キャッピイング 低分子物質との反応による結合体中
の反応部位の除去 Ｃｂｚ ベンジルオキシカルボニル

【００１９】結合体 別々の化学物質の一つが別の化
学物質と共有的に結合した複合体であり；少なくとも一
つの物質は目的の抗原（たとえば、ＨＩＶ ＰＮＤ）で
あり、一方の別の物質は担体である コアアミノ酸 哺乳動物中においてＨＩＶ中和免疫応
答を誘起するのに必要なＨＩＶ ＰＮＤ中のアミノ酸群 ＤＰＰＡ ジフェニルホスフォリルアジド

【００２０】ＥＬＦ エピトープ容量率；担体タンパ
クのミリグラム当たりのペプチドエピトープの存在をミ
リグラムによって定量的に表示されるものであり、（Ｐ
Ｆ×ＧＦ）の結果により計算されるあるいは直接的にノ
ルロイシンまたはオルニチンなどのマーカーアミノ酸を
定量する事により計算され、及び結合体中の総タンパク
量に対するペプチドの比率が計算できる

【００２１】ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着アッセイ Ｆmoc ９−フルオロレニルメチルオキシカルボニル ＧＦ グリコシレーション率；結合体中に存在するタ
ンパクミリグラム当りのポリサッカライドのミリグラム
として表示される ＨＩＶ ヒト免疫不全ウィルス、レンチウィルスの一
員でありＡＩＤＳ及び関連症候群と関係があると称され
ている原因因子である；またＨＩＶはＨＴＬＶIII(ヒト
−Ｔ細胞リンパ球指向性ウィルスIII 型）、ＬＡＶ（リ
ンパ節腫張を伴なうウィルス）、及びＡＲＶ（ＡＩＤＳ
関連ウィルス）などとしても知られている。

【００２２】ＨＩＶ疾患 ＨＩＶ感染によってもらさ
れたと思われる生理学的な機能異常の出現によって特徴
づけられる臨床的に認められた疾患の状態 免疫原 哺乳動物中における免疫応答を刺激する為に
用いる分子 免疫学的に等価なペプチド ＨＩＶ主要中和エピトー
プに結合しうる抗体を含めて、哺乳動物中でＨＩＶ中和
免疫応答を引き出しうる環状あるいは直鎖状のペプチド

【００２３】マーカーアミノ酸 ＡＡアッセイにおけ
るシグナルを保有するアミノ酸であり、他のペプチドあ
るいはタンパクアミノ酸のシグナルによる干渉を受けな
いものであり；例えばノルロイシン(Nle) 、オルニチ
ン、β−アラニン、ガンマアミノブチル酸（ＧＡＢＡ） Ｍtr ４−メトキシ−２，３，６−トリメチルフェニ
ルスルホニル ＮＥＭ Ｎ−エチルマレイミデ

【００２４】ＯＭＰＣ ナイセリア メニンジャイテ
イディス(Neisseria meningitidis)の外側メンブランタ
ンパク複合体で；イムノエンハンサー及びペプチド担体
として用いる ペプチド アミド（ペプチド）結合により連結されて
いるアミノ酸の重合体 ＰＥＰ ペプチド ＰＦ ペプチド化率；結合体中に存在するポリサッカ
ライドのミリグラム当りのペプチドのミリグラムとして
表示される

【００２５】ＰｎＰｓ ストレプトコッカス ニュー
モニア（Streptococcus pneumonia)夾膜ポリサッカライ
ド；本略語における番号は、例えば PnPs ６Ｂ、ポリサ
ッカライドが誘導されたきた株を示すものである ＰＮＤ プリンスパルニュートラライジングデターミ
ナント；ＨＩＶ中和抗体に結合する能力及び本ＰＮＤを
含む免疫原を接種した哺乳動物中にＨＩＶ中和抗体の産
生を上昇させうる能力を保有するペプチド配列を特定す
る名称である

【００２６】ＰＲＯ 免疫原性タンパク タンパク ペプチドが連結して大きくなったもの ＰＳＡ 陰イオン性ポリサッカライド；その重合体中
の一つの単量体ユニットが常にリン酸塩ユニットの繰り
返し構造を有するもの

【００２７】レジン 固相化ペプチド合成に用いられ
る固相支持マトリックスウォング（Wang) ：コポリスチ
レン−１％ジビニルベンゼンに連結した４−（ヒドロキ
シメチル）フェノキシメチルレジンでありFmoc固相ペプ
チド合成の大量処理に使用され解離は最終濃度95％のＴ
ＦＡにより行なわれ、酸感受性側鎖保護基を付随的に脱
保護するサスリン（Sasrin) ：コポリスチレン−１％ジ
ビニルベンゼンに連結した４−（ヒドロキシメチル）−
３−メトキシフェノキシメチルレジンであり、Ｆmoc 固
相ペプチド合成の大量処理に使用され、解離は最終濃度
１％のＴＦＡ／CH₂Cl₂により行なわれ酸に不安定な側鎖
保護基には変化を与えないペプシン（Pepsyn) ＫＡ：ポ
リアミドに連結した４−（ヒドロキシメチル）フェノキ
シメチルが珪藻土に吸着しているレジンであり、流動カ
ラムを用いたＦmoc 固相ペプチド合成に使用される。ペ
プチドはウォングレジンと同様に上記に従がいレジンよ
り解離される、ペプシン（Pepsyn)KH ：ポリアミドに連
結した４−（ヒドロキシメチル）−３−メトキシメチル
が珪藻土に吸着しているレジンであり、Ｆmoc 固相ペプ
チド合成に使用され、側鎖保護されているペプチドはサ
スリンレジンと同様に上記に従がいレジンより解離され
る。

【００２８】“骨格” 担体上に構築された多重ペプ
チドエピトープの免疫原 ＳＣＭＨＣ Ｓ−カルボキシメチルホモシステアミン
であり；共有結合体免疫原の分解により遊離されてくる
酸安定な二属間スペーサーでＡＡアッセイにより定量で
きる。 ＳＣＭＣ Ｓ−カルボキシメチルシステアミンであ
り；共有結合体免疫原の分解により遊離されている酸安
定な二属間スペーサーでＡＡアッセイにより定量でき
る。 Ｚ ベンジルオキシカルボニル

【００２９】Ｉ．結合体作成方法及びそれを用いた結合
体の産生、及びその結合体の有用性：本発明の新規結合
体は、別々に活性化されたペプチド、ポリサッカライ
ド、及びタンパク成分をそれぞれ互いに共有結合させる
事により調製される。ペプチド及びタンパク成分は同様
に活性化されて、付随的に求電子性あるいは求核性を示
すが、それらは互いには反応しない。逆にポリサッカラ
イド成分は活性化されて付随的に求核性あるいは求電子
性基を示し反対の位置にある活性化されたペプチド及び
タンパクと反応する。これらの反応は安定な電子対を共
有するスペーサーの形成をもたらし、ペプチドあるいは
タンパクをポリサッカライド結合させ、その形成におけ
る二分子的な作用により二属間スペーサーと称される。
この一連の反応によりもたらされる共有結合免疫原は多
重ペプチド部分が、次の段階ではタンパクに固定される
ポリサッカライドの土台の上に構築される骨格として便
宜上、考えられている。

【００３０】ペプチド成分がＨＩＶのＰＮＤｓと等価で
あるならば、本方法により作成された結合体は、免疫学
的効果容量をもってイムノモデュレーター、抗ウィルス
剤あるいは抗菌性物質の添加のあるなしにかかわらず、
哺乳動物に投与されるものであり、かつまた結合体のペ
プチド部分に対する哺乳動物中での免疫応答の誘導、哺
乳動物中におけるＨＩＶ中和抗体の誘発あるいはＨＩＶ
感染またはＨＩＶ疾患からの予防、防御の為のヒトに投
与しうるワクチンの製造、あるいはＡＩＤＳをも含めた
ＨＩＶ感染またはＨＩＶ疾患が悩む人達への投与という
面で有効である。

【００３１】ポリサッカライドの活性レベルを測定し、
たとえ添加したペプチドがすべてポリサッカライドに結
合するとしてもポリサッカライド中にある活性部位へ適
切なペプチドの限界量を添加して結合体作成反応を行な
う。さらにこのポリサッカライドの活性部位へ、ペプチ
ドと同様に活性化されたタンパクを反応させ、本発明で
あるペプチド−ポリサッカライド−タンパク結合体を作
成した。

【００３２】本作成方法の最終段階はこの結合体中に残
った求電子性あるいは求核性部位の除去である。これは
低分子量の求核性試薬、好ましくはＮ−アセチルシステ
アミン（ＮＡＣ）、で求電子性部位をキャッピイングす
ることにある。残っている遊離スルフヒドリル基などの
様な求核性部位は低分子量の求電子性試薬、好ましくは
Ｎ−エチルマレイミデ（ＭＥＭ）、でキャップされた。
このキャッピング処理の後、分離遠心により本結合体を
反応物中より単離した。

【００３３】本共有結合免疫原の化学的及び物理的特性
を正確かつ適切に確立した。結合体作成方法の適切な段
階においてペプチドとポリサッカライド及びポリサッカ
ライドとタンパクの量的な比率を測定した。ペプチド−
ポリサッカライド結合体あるいは最終ペプチド−ポリサ
ッカライド−タンパク結合体のトータルな酸加水分解は
遊離アミノ酸とＳ−（カルボキシメチル）システアミン
（ＳＣＭＣＡ）あるいはＳ−（カルボキシメチル）ホモ
システィン（ＳＣＭＨＣ）などの様な二属間スペーサー
である酸安定部分を生ずる。ＡＡアッセイにより二属間
スペーサーにより引き出される単離されたシグナルや異
常を定量し、またそれにより結合体試料中に存在する共
有結合のスペーサー数が直接的に定量される。またペプ
チド及びタンパクを構成しているアミノ酸も同様に定量
されるのでスペーサーとアミノ酸との比率が容易に計算
される。

【００３４】リボースアッセイ〔例えば、ディッシュ
（Dische) 及びシュワルツ（Schwartz) 、ミクロケミカ
ーアクター（Mikrochemica-acta)、第２巻、１３（１９
３７）〕の様なモノサッカライドアッセイ、及び分離ア
ミノ酸分析をペプチド−ポリサッカライド結合体作成後
に行ないペプチド化率（ＰＦ）を調べポリサッカライド
のミリグラム当りに存在するペプチドのミリグラムとし
て表示した。最終的な結合体作成時におけるモノサッカ
ライドアッセイと上記アッセイを合わせ、トータルなタ
ンパクアッセイを行ないグリコシル化率（ＧＦ）を調べ
タンパクのミリグラム当たりに存在するポリサッカライ
ドのミリグラムとして表示した。得られた結果（ＰＦ×
ＧＦ）を基に、タンパクのミリグラム当りに存在するペ
プチドのミリグラムとして表示される、エピトープ容量
率（ＥＬＦ）が計算される。また別法として、本発明の
ペプチドあるいはタンパク部分のいずれにも存在しない
ユニークなアミノ酸より成るペプチド中へ組み入れる事
によりＥＬＦが算出される。よってノルロイシンを一つ
のペプチド中のいずれかの部位、好ましくは−ＧＰＧ−
より離れて、最も好ましくはそのペプチドのアミノ酸末
端、に組み入れる事により、簡便な方法として用いられ
本発明の結合体中のトータルペプチドが測定される。

【００３５】上記概略に示されている方法による結合免
疫原の作成を構造式IV及び評価パラメーターであるＰ
Ｆ、ＧＦ及びＥＬＦにより以下に記載した；

【化２２】 式中ＰＥＰ とは直鎖状あるいは環状構造をもつ共有
結合ＨＩＶ ＰＮＤペプチド；ＰＳＡ とは陰イオン
性ポリサッカライドである；ＰＲＯ とは免疫原性タ
ンパクあるいはタンパク複合体であり、好ましくはナイ
セリアメニンジャイティディスの外側メンブランタンパ
ク複合体（ＯＭＰＣ）である；−ｒ− とはペプチド
及びポリサッカライド結合体間の共有結合を架橋するス
ペーサーである；−Ｂ− とはポリサッカライドとタ
ンパク結合体間の共有結合を架橋するスペーサーであ
る；ＰＦ＝ ０．００１から１０ミリグラムＰＥＰ／
ミリグラムＰＳＡであり、好ましくは約０．０１から１
である；ＧＦ＝ ０．００１から１０ミリグラムＰＳ
Ａ／ミリグラムＰＲＯであり、好ましくは約０．０１か
ら０．３３である；ＥＬＦ＝ エピトープ容量率、好ま
しくは０．０００１から０．５ミリグラムPEP ／mgＰＲ
Ｏである。パラメーターＰＦ、ＧＦ及びＥＬＦを、用い
る成分の量を変える事により容易に操作され、要求通り
の免疫応答を得る為の至適条件が決められる。

【００３６】本発明中の共有結合体を表わす構造式IVに
おけるスペーサー −ｒ−、及び−Ｂ−、に関する化学
的性質は非特異的交鎖結合あるいは“一属間”または
“二属間”スペーサーの使用に依存するものである〔マ
ーブルグ（Marburg)等、ジェイ. アム．ケム．ソック．
（J. Am. Chem. Soc) 、第１０８巻、５２８２（１９８
６）参照〕。好ましくは、マーブルグにより開発された
二属間スペーサー技術が有効である。二属間技術に従が
い調製された結合体は加水分解して分析される。スペー
サー −ｒ−及び−Ｂ−の酸安定部分は、マーカーアミ
ノ酸誘導体よりアミノ酸分析スペクトラム（ＡＡアッセ
イ）から、他のアミノ酸による干渉は受けずに定量され
る。例えば、以下の略図Ａにおける化学的方法に従が
い、結合体の酸加水分解は−ｒ−及び−Ｂ−の酸安定部
分であるユニークなアミノ酸Ｓ−（カルボキシメチル）
システアミン（ＳＣＭＣＡ＝NH₂(CH₂)₂-S-CH₂COOH ）を
遊離する。同様に略図Ｂに従がい、結合体の酸加水分解
は−ｒ−及び−Ｂ−からユニークなアミノ酸Ｓ−（カル
ボキシメチル）ホモシステイン（ＳＣＭＨＣ＝HOOCCH₂S
(CH₂)₂CHNH₂COOH ）を遊離させる。スペーサー −ｒ
−、及び−Ｂ−を形成する他のアミノ酸が別な化学的方
法により得られたとしても、本来その構造及び分析の原
理は本明細書に述べられている事と同じである。

【００３７】好ましい方法としては、本発明の結合体
は、略図ＡあるいはＢによって示されているステップに
従がって調製される事にある。略図Ａに示されている方
法とはＰＳＡのブロモアセチル化、及び反応パートナー
であるＰＲＯ及びＰＥＰを活性化してスルフヒドリル基
を持たせる事にある。逆に略図Ｂに示されている方法と
は、ＰＳＡを活性化してスルフヒドリル基を持たせ、Ｐ
ＲＯ及びＰＥＰなる反応パートナーをブロモアセチル化
する事にある。他の求核性及び求電子性基なども化学的
結合体作成の使用に効果がある〔マーブルグ（Marburg)
等、ジェイ. アム. ケム．ソク（J. Am. Chem. Soc.)、
第１０８巻、５２８２（１９８６）；米国特許＃４，６
９５，６２４〕。 Ａ．ペプチド−ＰＳＡ−ＰＲＯ結合体の調製（略図Ａ参
照） Ａ）チオール化ＰＳＡ：

【００３８】次の３つの主要なステップよりなる調製法 １．陰イオン性ポリサッカライド、ＰＳＡ、の単離であ
り、ポリサッカライド夾膜の主要成分が陰イオン性ポリ
サッカライドの重合体であるところのグラム陰性菌の培
養より単離される。例えば、ヘモフィラス インフルエ
ンザ（Haemophilus influenzae）ｂあるいはストレプト
コッカス ニューモニア（Streptococcus pneumoniae)
６Ｂ、１９Ｆ、２３Ｆ、等の発酵培養上清より単離した
ポリサッカライドの粗作成物を凍結乾燥して、それぞれ
パウダー状のポリリボシルリビトールホスフェートＰＲ
Ｐあるいはパウダー状のＰｎＰｓ６Ｂ、ＰｎＰｓ１９
Ｆ、ＰｎＰｓ２３Ｆポリサッカライドとした。これら得
られた凍乾パウダーを水に溶解し、トリあるいはテトラ
ブチルアモニウムイオンによりチャージされている陽イ
オン交換カラムに通す事により酸性水素を疎水性イオン
と交換する。好ましくはトリあるいはテトラブチルアモ
ニウムなどの陽イオンである。これはマーブルグ等のジ
ェイ．アム．ケム．ソック.,第１０８巻、５２８２−５
２８７（１９８６）及び米国特許４，６９５，６２４に
記載されている。溶出されたＰＳＡを凍結乾燥した後、
有機溶媒、好ましくはＤＭＦあるいはＤＭＳＯ、に再懸
濁し、炭酸誘導物、好ましくはカルボニルジイミダゾー
ル（COIm₂)、などの二価の求電子物質で活性化した。得
られたイミダゾイルウレタンに求核反応を行なった。好
ましくはチオール結合ジアミン、最も好ましくはシスタ
ミンによるものである。アミン誘導体されたＰＳＡの力
価はウデンフリーンド（Udenfriend) 等の、サイエンス
（Science)、第１８２巻、８７１（１９７２）によるフ
ルオレッスカミン（fluorescamine)アッセイにより定量
される。略図Ａに従がい、シスタミン作用ＰＳＡ、Ｉ
Ａ、のＸモルをジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオ
エルイスレイトール（ＤＴＥ）、あるいは類似の強還元
剤で、還元し２−アミノエタン−チオールなどの様な低
分子物質を透析、あるいは窒素気流下でのダイアフィル
トレーションにより除去する。得られたIIＡＸモルの溶
液をエルマン，ジー．エル．（Ellman, G. L.)のアール
バイオケム．バイオフィズ．（Arch Biochm. Biophy
s.)、第８２巻、７０（１９５９）の方法によりアッセ
イしＸの量を測定した。

【００３９】２．Ｎ−ブロモアセチル化ペプチドあるい
は別のブロモアセチル化ペプチド混合物をペプチドとブ
ロモアセチルドーナー、好ましくはｐ−ニトロフェニル
ブロモアセテート、との反応によりＹモル調製した。こ
れを逆相ＨＰＬＣにかけブロモアセチル化ペプチドとし
て再単離した。このブロモアセチル化ペプチドのＹモル
をＸモルのＰＳＡ−ＳＨ、IIＡ、と反応させた。ＹはＸ
に対して約１０％から８０％であり好ましくは、IIＡの
チオールアッセイ力価の約１／２相等量である（すなわ
ちＹ＝０．５Ｘ）。この反応の後、残存チオールの力価
をエルマンアッセイにより測定した。その差をもってこ
の段階におけるポリサッカライドへ結合したペプチドの
量が推定される。得られた数値は以下の（ii) において
記載されている直接的に得られた数値の確認に用いられ
る。反応産物はさらに２通りの追加の方法により特徴づ
けられる：

【００４０】(i) ＰＳＡにおけるモノサッカライドアッ
セイの導入。当業者にとってはよく知られている種々の
モノサッカライドアッセイ。例えば、リボース感受性方
法がＰＲＰ及び他のリボースを含むポリサッカライドの
定量に有効である〔ディッシュ（Dische) とシュワルツ
（Schwartz) 、ミクロケミカーアクタ（Mikrochemica-a
cta)、第２巻、１３（１９３７）〕。及び

【００４１】(ii) 酸加水分解後のＡＡアッセイ。Ｓ−
カルボキシメチルシステアミン（ＳＣＭＣ）数値の定量
による共有結合ペプチドの力価。上記に述べた様に、こ
の数値はIIＡと IIIＡ間でのエルマンアッセイによるチ
オール力価の差によって確認される。別法として、ノル
ロイシンの様なアミノ酸がペプチド中に組み込まれてい
れば、NaI を定量する直接的なＡＡアッセイが結合体中
のペプチド量の計算に用いられ、ＰＦの算出あるいは下
方に述べられている様に、より重要なパラメーターであ
るＥＬＦが直接的に算出される。これらのアッセイの結
果を集計し、ペプチド化率を次に示すユニットとして導
いた：ＰＦ＝ミリグラムペプチド／ＰＳＡmg。

【００４２】３．この部分的にチオール化及びペプチド
化されたＰＳＡ、 IIIＡ、をさらにｎモルのブロモアセ
チル化ＰＲＯと反応させ、ＰＳＡに共有結合したＰＲＯ
である結合体ＩＶＡをｍモル作成した。ｍ＜（Ｘ−Ｙ）
ならば、（Ｘ−Ｙ−ｍ）＝ＺであるＺモルの未反応の反
応基がＰＳＡ上に残っており、これはＮＥＭのキャッピ
ングにより中和される。不溶性物質を低速遠心により除
去した後、未結合ＰＳＡを超遠心にかけ、マクロ分子結
合体を沈殿させ、上清中に存在する未結合ＰＳＡを除去
する事により、未結合ＰＳＡをその結合体中より分離除
去した。ＩＶＡは水溶溶剤で沈殿物を再懸濁する事によ
り回収し、滅菌濾過後、ＰＳＡの測定及びローリー（Lo
wry)によるタンパクアッセイを行ない、グリコシル化
率、ＧＦ＝mgＰＳＡ／mgＰＲＯを計算した。ＧＦ及び上
記セクション２により測定されたＰＦを用いて、ＥＬＦ
がＥＬＦ＝（ＧＦ×ＰＥ）＝ミリグラムペプチド抗原／
ミリグラムＰＲＯとして計算される。

【化２３】

【００４３】Ｂ．ペプチド−ＰＳＡ−ＰＲＯ結合体の調
製（略図Ｂ参照） ブロモアセチル化ＰＳＡ：次の３つの主要なステップよ
りなる調製法 １．最初のステップは上記ステップＡ−１中のシスタミ
ンを用いた反応の前段階までステップＡ−１と同様であ
る。しかしながらこの方法においては、ＰＳＡを二価の
求核物質、好ましくは、ジアミンそして、最も好ましく
はブタンジアミン、と反応させる。アミン誘導されたＰ
ＳＡ、ＩＢ、の力価はフルオレッスカミンアッセイ〔ウ
デンフリーンド（Udenfriend) 等、サイエンス（Scienc
e)、第１８２巻、８７１（１９７２）〕により定量され
る。ＩＢＸモルに対して過剰のブロモアセチルドーナ
ー、好ましくはｐ−ニトロフェニルブロモアセテート、
を加え反応性のあるブロモアセチル基を持ったＸモルの
IIＢを作成した。

【００４４】２．チオール化ペプチド、ＰＥＰ−ＳＨ、
がペプチドのアミノ酸末端がチオール保護されたＡｃ−
Ｃys（Ａcm) ペプチドとして調製された。Ａｃ−Ｃys
（Ａcm) 側鎖からのＡcm保護基の解離時には〔アセルト
ン，イー．（Atherton, E.) 等の、ケム. ソック．パー
キントランス（Chem. Soc. Perkin Trans.) 、Ｉ、２０
５７（１９８５）〕、遊離スルフヒドリルがブロモアセ
チル化−ＰＳＡとの反応の為に現われてくる。ＰＥＰ−
ＳＨのＹモルをプロモアセチル化ＰＳＡ、IIＢ、Ｘモル
と反応させ、中間産生物 IIIＢを得た。ここでＹはＸに
対して約１０％から８０％であり好ましくは約５０％で
あり、それは別のＰＥＰ−ＳＨ種の混合物においても同
じである。この IIIＢはＹモルの結合体ＰＥＰとＰＲＯ
−ＳＨと反応しうる、残存している反応性ブロモアセチ
ル基を（Ｘ−Ｙ）モル含んでいる。

【００４５】３．この部分的にブロモアセチル化及びペ
プチド化されたＰＳＡ、 IIIＢ、をさらにｎモルのＰＲ
Ｏ−ＳＨと反応させ、結合体ＰＲＯ ｍモルを含む結合
体ＩＶＢを作成した。ｍ＜（Ｘ−Ｙ）ならば、たとえ
ば、立体障害によりＰＲＯ−ＳＨと反応しうるブロモア
セチル化部位が利用できなくなるので、キャッピング反
応によりこれら活性部位の除去が必要である。小さな求
核性物質、好ましくはＮ−アセチルシステアミン（ＮＡ
Ｃ）がこれら残存活性部位を中和する為に用いられる。
上記（Ａ）に記載されている様に、不溶性物質を低速遠
心により沈降除去した後、マクロ分子結合体を超遠心に
より未結合ＰＳＡから分離した。超遠心沈殿物を緩衝水
溶液でホモジナイズし回収したＩＶＢを滅菌濾過した。
（Ａ）と同様にアッセイしてパラメーターＧＦ及びＥＬ
Ｆを算出した。

【化２４】

【００４６】上記記載における本発明の結合体作成方法
に従がい、ペプチドとポリサッカライド、及びポリサッ
カライドとタンパクを、結合させるスペーサー −ｒ−
及び−Ｂ−をそれぞれ作成した。ＰＳＡヒドロキシル由
来の酸素原子はスペーサーに連結するウレタンを形成
し、一方ＰＥＰあるいはＰＲＯ部分の遊離アミノ基はス
ペーサーとのアミド結合を形成する。好ましいものとし
て、あるいは本発明中において、スペーサー −ｒ−、
及び−Ｂ−は以下より選ばれる： ａ） -CONH(CH₂)₄NHCOCH₂SCH₂CH(NHCOCH₃)CO- 、 ｂ） -CONH(CH₂)₄NHCOCH₂SCH₂CH₂CH(NHCOCH₃)CO-、及び ｃ） -CONH(CH₂)₂SCH₂CO- 。 これらスペーサー種のカルボニル基はペプチドあるいは
タンパク中のアミンと結合しアミド結合を形成し、また
ポリサッカライド中の酸素と結合してウレタン連結を形
成する。化学的結合体作成の方法を改良する事により、
本質的に異なる構造を有する二層間スペーサーが調製さ
れる（米国特許４，６９５，６２４）。酸加水分解によ
りペプチド（アミド）結合などの酸不安定性結合はすべ
て開裂され、またスペーサーの酸安定部分はペプチド及
びタンパク構成成分アミノ酸と伴に遊離されてくる。

【００４７】Ｃ．有用性：本明細書記載の結合体は、ワ
クチンとして適切に調製する時には不活性な担体を構成
成分として含み、利用される。ここには、ワクチン製造
関係者にはよく知られているアルムへの重要な吸着ある
いは乳剤またはアジュバントの併用が含まれている。本
発明の共用結合免疫原の使用方法には次の事が含まれて
いる： (a) ＨＩＶ ＰＮＤペプチドの構造的機能的相関性の特
徴を知る為の実験室的材料としての使用； (b) ＨＩＶによる感染を防御し、あるいは感染後のＨＩ
Ｖ増殖の抑制、あるいはＡＩＤＳも含めたＨＩＶの感染
あるいは疾患に悩む人達への治療などの為に、分離して
ヒトに投与されうるＨＩＶ中和抗体の産生を上昇させる
哺乳動物への免疫原としての使用； (c) ＨＩＶからの感染に対するヒトへの免疫として、あ
るいは感染後の治療として、あるいはＡＩＤＳも含めた
ＨＩＶの感染あるいは疾患に悩む人におけるＨＩＶ中和
免疫応答を高める為のワクチンとしての使用。

【００４８】実験室的材料としてならば、結合体は抗Ｐ
ＮＤペプチド、抗ＨＩＶあるいはＨＩＶ中和免疫応答を
誘導する為の免疫学的効果容量で哺乳動物中に投与され
れば有効である。哺乳動物は結合体の追加投与によりそ
の免疫応答が増強される。抗血清は当業者にとってよく
知られている方法に従がい、哺乳動物より採血した血液
を遠心にかけ細胞性成分と血清とに分離し、もし必要が
あればその血清中より抗体タンパクを単離する事により
得られる。その様な抗血清あるいは抗体調製物質は、哺
乳動物における抗ＰＮＤペプチド、抗ＨＩＶ、あるいは
ＨＩＶ中和抗体産生の上昇に対しての結合体中にあるＨ
ＩＶ ＰＮＤペプチドの効力を知る為に使用される。未
結合ペプチド及び抗血清に用いられるＥＬＩＳＡアッセ
イは抗ペプチド抗体の誘導を測定するインビトロアッセ
イとして有効である。抗血清の抗ＨＩＶ及びＨＩＶ中和
能力の測定に使用されるインビトロアッセイとは次の様
にして行なわれる。

【００４９】まず生ＨＩＶを抗血清とインキュベーショ
ンし、次にこの抗血清処理ＨＩＶをＣＤ４レセプター保
有細胞とインキュベーションする。そして抗血清によっ
てもたらさせる細胞防御の程度を測定する。これらのア
ッセイ及び結合体によって産生されてくる抗血清の特性
はＰＮＤペプチドの構造的機能的相関性の研究に利用さ
れる。本結合体は先の段落に記載されている様に、哺乳
動物中の抗体応答の誘導に有効であると同時にその様な
抗体はＨＩＶ感染の予防あるいは感染後のＨＩＶ増殖の
抑制あるいはＡＩＤＳをも含めたＨＩＶ感染あるいは疾
患に悩む人達への治療という面でヒトへの受動免疫とし
て使用される。

【００５０】本結合体はＨＩＶの感染あるいは増殖の防
御の為に、あるいはＡＩＤＳ及び関連症候群に罹患して
いる人達あるいはＨＩＶウィルスに対してセロポジティ
ブである人達へ投与されるワクチンとして有効である。
また本結合体はＡＺＴの様な他の抗ＨＩＶ化合物、ある
いはより一般的な抗ウィルス剤として併用してあるいは
他のワクチン、抗菌性物質、イムノモデュレーターと併
用して投与される（第１表参照）。

【００５１】ワクチン中における免疫原の調製は種々の
分子的形態を有する。抗原としての結合体ＩＶの単独分
子種はたいてい、ＡＩＤＳあるいはＡＲＣを含むＨＩＶ
疾患の予防あるいは治療のための有効的かつ安定した抗
原としては十分なものである。カクテル調製された他の
抗原も同様に有効であり、それらは例えばペプチドとポ
リサッカライドの比率（ＰＦ）、ポリサッカライドとタ
ンパクの比率（ＧＦ）、あるいはペプチドと総タンパク
の比率（ＥＬＦ）などの異なった結合体の混合物より成
るものである。さらに混合物中の結合体はＰＮＤのアミ
ノ酸配列が異なっていてもよい。

【００５２】免疫学的ベクター、担体あるいはアジュバ
ントを一般的な免疫学的テストあるいは実施に従がって
免疫学的賦形剤として添加されてもよい。

【００５３】本発明のワクチン調製においてアジュバン
トの添加はしてもしなくてもよい。人体用ワクチンにお
いて、アラムは代表的かつ好ましいアジュバントであ
る。特にその形態な面における揺変性、粘性及びアルミ
ニウムヒドロキサイドゲルの均一性において、例えば、
本発明の一つの具体例は賦形剤としてのアラムアジュバ
ントとの懸濁液を、及び免疫原あるいは抗原の組み合わ
せを選択し結合体のカクテルを用いて患者に予防的ワク
チン接種をする事である。本発明のワクチンは、感染前
及び／あるいは感染のいずれの時期においてもＡＩＤＳ
抗ウィルス剤、イムノモデュレーター、抗菌性物質ある
いは第１表中にあるワクチンなどの効果容量を併用し
て、有効に投与されるものである〔マーケットレター
（Market Letter)、１１月、３０、１９８７、ｐ２６−
２７；ジェネテックエンジニアリングニュース（Geneti
c Engineering News) 、１月、１９８８、第８巻、p.２
３、による〕。

【００５４】 第 １ 表¹ Ａ．抗ウィルス剤 薬品名 製造会社 適応症 ＡＬ−７２１ エチゲン ＡＲＣ，ＰＧＬ ベータセロン トリトン バイオ ＡＩＤＳ，ＡＲＣ， （インター サイエンス ＫＳ フェロンベータ） キャリシン キャリントン ラブズ ＡＲＣ （ポリマンノアセテート） サイトベン シンテックス ＣＭＶ （ガンシクロビール） ＤＤＣ ホフマン ラ ロッシュ ＡＩＤＳ，ＡＲＣ （ジデオキシシチジン） フォスカーネット アストラＡＢ ＨＩＶ感染、 （トリソジウム ＣＭＶ網膜炎 ホスホノフォルメート） ＨＰＡ−２３ ローン−ポーレンク サン ＨＩＶ感染 テ オルニジル メレーレ ドウ ＰＣＰ （エフロルニチン） ペプタイドＴ ペニンシュラ ラブズ ＡＩＤＳ （オクタペプチド配列） レチキュロース アドバンスド ヴァイラル ＡＩＤＳ，ＡＲＣ （ヌクレオホスフォ リサーチ プロテイン） ＩＲ （ジドブジン：ＡＺＴ） ブローズ ウェルカム ＡＩＤＳ， 進行性ＡＲＣ 小児ＡＩＤＳ，ＫＳ

【００５５】 薬品名 製造会社 適応症 無症状ＨＩＶ， 軽度ＨＩＶ， 神経性を含む リスァブチン アドリア ラブズ ＡＲＣ （アンサマイシン ＬＭ４２７） （トリメトレキセート） ワーナー−ランバート ＰＣＰ ＵＡ００１ ウエノ ファイン ケム ＡＩＤＳ，ＡＲＣ インダストリー ヴィラゾーレ ヴィラテック／ＩＣＮ ＡＩＤＳ，ＡＲＣ， （リバビリン） ＫＳ ウェルフェロン ブローズウェルカム ＫＳ，ＨＩＶ，レトロ （アルファー ヴィールとの併用 インターフェロン） ゾヴィラックス ブローズウェルカム ＡＩＤＳ，ＡＲＣ， （アシクロビール） レトロヴィールとの 併用 Ｂ．イムノモジュレーター 薬品名 製造会社 適応症 ＡＢＰＰ （ブロピリミン） アップジョン 進行性ＡＩＤＳ，KS アンプリゲン デュポンＨＥＭリサーチ ＡＲＣ，ＰＧＬ （ミスマッチＲＮＡ） （抗ヒトアルファー アドバンスド バイオテラ ＡＩＤＳ，ＡＲＣ， インターフェロン抗体） ピー コンセプツ ＫＳ

【００５６】 薬品名 製造会社 適応症 コロニー刺激因子 サンドス ジェネティックス （ＧＭ−ＣＳＦ） インスティテュート ＡＩＤＳ，ＡＲＣ， ＨＩＶ，ＫＳ ＣＬ２４６，７３８ アミリカン シナミッド ＡＩＤＳ （ＣＬ２４６，７３８） ＩＭＲＥＧ−１ イムレグ ＡＩＤＳ，ＡＲＣ， ＰＧＬ，ＫＳ ＩＭＲＥＧ−２ イムレグ ＡＩＤＳ，ＡＲＣ， ＰＧＬ，ＫＳ イムチオール メルユー インスティ ＡＩＤＳ，ＡＲＣ （ジエチルジチオ テュート カルバメート） ＩＬ−２ シータス ＡＩＤＳ，ＫＳ （インターロイキン−２） ＩＬ−２ ホフマンラロッシュ ＡＩＤＳ，ＫＳ （インターロイキン−２） イムネックス イントロン−Ａ シェーリング−プロ− ＫＳ （インターフェロン アルファ） イソプリノシン ニューポート ＡＲＣ，ＰＧＬ， （イノシンプラノベックス） ＨＩＶの血清陽性 ファーマキューティカルス 患者 （メチオニン ＴＮＩ ＡＩＤＳ，ＡＲＣ エンケファリン） ファーマキューティカルス ＭＴＰ−ＰＥ チバ−ガイギー ＫＳ （ムラミル−トリペプチド）

【００５７】 薬品名 製造会社 適応症 サイモペンチン（TP−５） オルト ＨＩＶ感染 （胸腺由来化合物） ファーマキューティカルス ロフェロン （インターフェロン ホフマン ラ ロッシュ ＫＳ アルファ） （リコンビナント オルト ＡＩＤＳ， エリスロポエチン） レトロウィルス ファーマキューティカルス 惹起重度貧血症の 治療薬 トレキサン デュポン ＡＩＤＳ，ＡＲＣ （ナルトレキソン） ＴＮＦ ジェネンテック ＡＲＣ，インターフェ （腫瘍壊死因子） ロンガンマーとの併用 Ｃ．抗生物質 ペンタム３００ リンホメッド ＰＣＰ （ペンタミジン イセチオネート） Ｄ．ワクチン Ｇａｇ メルク ＡＩＤＳ，ＡＲＣ

【００５８】１ 略語：ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候
群）；ＡＲＣ（ＡＩＤＳ関連症候群）；ＣＭＶ（ＡＩＤ
Ｓ患者に対して失明あるいは死亡をもたらす日和見感染
を起こすサイトメガロウィルス）；ＨＩＶ（ヒト免疫不
全ウィルス、これまではＬＡＶ、ＨＴＬＶ-III、あるい
はＡＲＶとして知られていた）；ＫＳ（カポジ肉腫）；
ＰＣＰ（カリニ肺炎、日和見感染の一種）；ＰＧＬ（持
続性全身性リンパ節腫張）。

【００５９】本発明のワクチンと併用しうるＡＩＤＳ抗
ウィルス剤、イムノモジュレーター、抗生物質あるいは
ワクチンなどは、上記表中の物質に限定されるものでは
なく、しかもＡＩＤＳの治療に有効な製剤との併用もあ
る事は明白である。本発明のＡＩＤＳあるいはＨＩＶワ
クチンにはＨＩＶ感染あるいは疾患の予防あるいは治療
の為に感染の前後に使用されるワクチンなどが含まれ、
かつ免疫原に対して特異的な免疫応答を引き起こしうる
ワクチンである。

【００６０】本発明の結合体をワクチンとして使用する
場合には、その免疫学的効果容量をもって投与されるも
のである。結合体タンパクは１μｇから５００μｇ、好
ましくは５０μｇから３００μｇの容量をもって抗ペプ
チド、抗ＨＩＶ、あるいはＨＩＶ中和免疫応答を誘導さ
せる為に哺乳動物へ投与される。最初の投与から約２週
間目に、ブースター投与を行ない、しかも血中抗体力価
が減少している様な場合には必ずブースターを行なう。
結合体は免疫学的効果に必要十分な容積において、その
濃度が１０μｇ／mlから１mg／mlである容量をもって筋
肉内接種されるものであり、好ましくは５０から５００
μｇ／mlを用いる。結合体はあらかじめアルミニウムヒ
ドロキサイドゲルあるいはリビ（Ribi) アジュバント
（ＧＢ２２２０２１１Ａ、ＵＳ優先権２１２，９１９登
録２９／０６／１９８８）に吸着させておき、これを接
種前に滅菌生理食塩水で懸濁する。結合免疫原の好まし
い具体例を以下においてさらに詳細に記載し、かつ本発
明の結合免疫原作成に必要な各成分の選択及び調製法に
関しても言及してある。

【００６１】Ａ．ポリサッカライドＰＳＡの選択と調製 ポリサッカライドキャリアの選択は重要である。なぜな
ら免疫反応は主としてポリサッカライドに結合したポリ
ペプチド決定基に対するものであることが望ましいから
である。さらに被投与者において、ポリサッカライド部
分による副作用が表われないことが必要である。ＰＳＡ
自体がある種の保護効果をもたらすようなＰＳＡ部分を
選択することによる利点も期待できる。例えば、エイズ
患者はStreptococcus pneumoniaeのどの型に対しても感
染する危険が高い。この菌は一般に肺炎双球菌と呼ば
れ、亜型としてPn6A, Pn6B, Pn10A, Pn11A, Pn18C, Pn1
9A,Pn20, Pn22F, Pn23Fがある。したがってPnPs6B, PnP
s23F のような莢膜多糖（PnPs）や、他のこのような病
原性微生物の莢膜多糖を用いると、ＨＩＶに対する免疫
を誘導するのみでなく致死的な二次細菌感染から保護す
ることができる可能性がある。しかしながら、ポリサッ
カライドの上に構築された付加ペプチドのために多糖の
抗原がある程度マスクされることが予想される。Haemop
hilus influenzae bの莢膜多糖から得られたポリリボシ
ル−リビトールホスフェート（ＰＲＰ）及びPn6Bを含む
肺炎双球菌の莢膜多糖のあるものは本発明の複合体を作
成するのに適していることが証明された。

【００６２】ポリサッカライドの選択に際してさらに考
慮しなければならないのは、ペプチド部分によって複合
体に付加された余分な電荷を中和することである。ＨＩ
Ｖペプチドの場合、アルギニン残基が多いために複合体
あたり数個の正電荷が付与されることになる。よって、
ポリサッカライドに期待されるのは陽電荷ペプチドを中
和することであろう。この点においても、陰イオン性の
リン酸基の繰り返しモチーフを有するＰＲＰ、またPn6B
のような肺炎双球菌の莢膜多糖のあるものは適している
ことが証明された。

【００６３】ＰＲＰおよび肺炎双球菌の莢膜多糖は、Ha
emophilus influenzae ｂ型、あるいはStreptococcus
pneumoniaeのサブクラスのあるものを培養して、殺菌し
た培養液から当分野に知られた方法により多糖を単離す
ることによって得ることができ、ついでこれをすべて述
べたようにまた以下の実施例にしたがって複合体に調製
する。

【００６４】Ｂ．免疫原性蛋白質ＰＲＯの選択と調製 蛋白部分は免疫のエンハンサーとして働くべきである。
蛋白を選択するにあたっては、被投与者の非特異的免疫
反応の活性化（reactogenicity) を起こさないものが望
ましい。米国特許第４，６５９，６２４号において、Ma
rburg らはNeisseria meingitidis の外膜蛋白複合体
（ＯＭＰＣ）を用いてポリサッカライド−蛋白質複合体
を作成した。ＯＭＰＣは本発明においても適しているこ
とが証明された。他の免疫原性蛋白質を用いることも可
能である。

【００６５】グラム陰性菌からＯＭＰＣを精製する方法
はいろいろ工夫されている。Fraschら、J. Exp. Med.１
４０巻、８７頁（１９７４）、同１４７巻、６２９頁
（１９７８）、Zollinger ら、米国特許第４，７０７，
５４３号（１９８７）、Helting ら、Acta Path. Micro
biol. Scand. Sect. C. ８９巻６９頁（１９８１）、He
lting ら、米国特許第４，２７１，１４７号参照。本発
明で用いたＯＭＰＣは基本的にはHelting の方法によっ
て調製した。さらに、主要外膜蛋白質であるNeisseria
meningitidisのクラス２蛋白（Murakamiら、Infection
and Immunity, ５７巻、２３１８頁（１９８９））のよ
うなＯＭＰＣのサブユニットはＨＩＶ ＰＮＤペプチド
に対するほ乳類の免疫反応を誘導するのに必要な免疫活
性促進をもたらした。これらのサブユニットは単離した
ＯＭＰＣをかい離させても得られるし、組換えによって
必要なＯＭＰＣ免疫原性部分を発現させて生産すること
もできる。ＯＭＰＣサブユニットの調製と使用方法は併
願の米国特許出願番号５５５，３２９、５５５，９７
８、及び５５５２０４に開示してある。

【００６６】Ｃ．ＰＮＤペプチド １．ＰＮＤペプチドの定義 当分野で良く知られたＰＮＤペプチドおよび本発明に開
示するが併願（米国特許出願番号５５５，１１２および
５５５，２２７において特許を請求している新規ＰＮＤ
ペプチドはともに、ほ乳類においてＨＩＶ中和免疫反応
（ＨＩＶ中和抗体の産生を含む）を誘導できるペプチド
配列と定義される。

【００６７】本発明に置いて克服された主要な点は、Ｈ
ＩＶの単離株間の配列の変動である。上に定義したＰＮ
Ｄペプチドはｇｐ１２０の三番目の超可変流域に存在
し、多くの単離株においてある種のアミノ酸は決まった
位置に存在することが見出されているが、厳密に保存さ
れた一次配列のモチーフは存在しない。本発明において
は広範囲の保護を得るのに必要な多くの異なる単離株の
ＰＮＤ配列のカクテルを複合体にすることができるの
で、この難点を乗り越えることができる。あるいは、保
護範囲の広い複合体のカクテルは、単一あるいは数種の
ＨＩＶ単離株に対し保護効果のあるペプチド部分を有す
る複合体を別々に作成してから混合することによっても
作成することができる。

【００６８】ｇｐ１２０のアミノ酸２９６から３４１の
間またはその近傍に存在するアミノ酸が、ＰＮＤを定義
する基準に合うことが示された。ＨＩＶの単離株 IIIＢ
において、４１アミノ酸配列は以下のように報告されて
いる（「略号と定義」の３文字暗号とアミノ酸名を参
照）。ＩＮＣＴＲＰＮＮＮＴＲＫＳＩＲＩＱＲＧＰＧＲ
ＡＦＶＴＩＧＫＩＧＮＭＲＱＡＨＣＮＩＳ。−ＧＰＧ−
三量体−はＰＮＤループの先端で露出している。山羊や
モルモットの免疫系に対し、keyhole-limpetへモシアニ
ンと複合化して投与した場合、異なる単離株のｇｐ１２
０のこれと同一部位は単離株特異的中和抗体を誘導す
る。上に示した４１量体配列中の主要中和エピトープ
は、ＧＰＧトリマーを囲む８アミノ酸からなる（Javahe
rianら、PNAS USA８６巻、６７６８頁（１９８９））。
下記の表IIに、本発明の複合体に用いられる異なる長
さ、組成の線形ポリペプチドを多数示す。表にしたペプ
チド配列を有するペプチドを含む単離株の名は、参照し
易くするためにそのペプチドに付けた名称とともに記し
てある。各ペプチドの左側のｒの文字はそのペプチドが
ＰＳＡにその位置で連結する可能性を示している。さら
に、ノルロイシンやオルニチンのようなマーカーアミノ
酸はｒ−の一部をなすことができる。

【化２５】

【００６９】このリストは可能性のあるＰＮＤ配列を網
羅したものではなく、むしろ有用なＰＮＤ一次配列を示
唆し、説明するものである。したがってここに記載され
たように複合体として本発明の免疫原を形成するペプチ
ドは、表にあげられたどのペプチドでもよいし、これら
の配列が示唆するところの免疫学的に等価な変異体でも
よい。変異体の性質については次に考察する。

【００７０】このＨＩＶ ＰＮＤの一次配列は、保存さ
れたコアアミノ酸配列を有するように見える。そのコア
アミノ酸配列はＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（−Ｇ
ＰＧＲ−）からなる四量体配列からなり、その両側はＨ
ＩＶ単離株の間で違いが大きい。単離株のいくつかは、
このテトラマーの中も異なっており、−ＧＰＧＫ−、Ｇ
ＰＧＱ−、−ＧＬＧＱ−あどのコア配列を有する。これ
らすべての可能性のある配列は本開示の範囲内にあり、
本発明による複合体形成に役立つペプチド配列とするも
のである。

【００７１】ペプチドの長さは交叉反応性の免疫反応を
促進するにあたって重要な因子である。すなわち、所定
のペプチド性エピトープに対して惹起された免疫反応
は、決定的中和エピトープのほかに同一あるいは異なる
ＨＩＶ単離株の類似のエピトープをエピトープ中のアミ
ノ酸の数に基づいて認識する。さらに、ペプチドの長さ
によって、ＨＩＶ中和反応の原因となる決定基が免疫シ
ステムに曝される確率が決まる。

【００７２】エピトープ提示の確率を最大にするため
に、ＰＮＤペプチドを所定の三次元構造に固定する化学
的手法が開発された。上記のＨＩＶ III Ｂの４１量体
アミノ酸ＰＮＤは、システイン−システイン間のジスル
フィド結合により、１つのルプ構造をとることが知られ
ている。このジスルフィド結合は脆弱なため、ループが
開いてペプチドが線状構造で存在する可能性がある。し
たがって、線状ペプチドに加えて新規なジスルフィド結
合環状ペプチドあるいは新規な強固な環状構造を有する
ＨＩＶ ＰＮＤペプチドをここに開示し、別の遊離のペ
プチドとして米国特許出願第５５２，１１２および５５
５，２２７中に開示するが、これらペプチドはすべて本
発明の複合体形成においてＰＥＰ部分として利用でき
る。

【００７３】これらの複合体形成に用いられるペプチド
は天然の蛋白質（たとえばｇｐ１２０）の断片として、
あるいはその部分の組換え発現により、またはこの分野
で知られた化学合成の手法を用いて得ることができる。
さらに新規な環状ＰＮＤはここに記載する方法により合
成することができる。配列には天然のＬ−アミノ酸でも
天然にない、すなわちＤ−アミノ酸でも含むことができ
る。さらに複合化の化学的手法は柔軟性があるので、ペ
プチド誘導化試薬を適切に選択すれば複合化は成功す
る。

【００７４】合成ペプチドは、液中や固相保持体上での
様々な手法により調製されている。基礎的な原理と技術
をカバーする優れたテキストは、「ペプチド合成の原
理」（Bodanzky, M., Springer-Verlag （１９８
４））、「固相ペプチド合成」（Stwert J. M., Young,
J. D., Pierce Chemical Company （１９８４第２
版）、「ペプチド」（Gross, E, Meienhofer, J., Acad
emic Press（１９７９）であるが、ここにのべるプロセ
スはこれらテキストの記載に限定されるものではない。

【００７５】合成環状ペプチドは２相にわけて合成され
る。まず線状ペプチドを合成するには、Milligen９０５
０ペプチドシンセサイザーあるいはＡＢＩ４３１Ａペプ
チドシンセサイザーを用い、９−フルオレニルメチルオ
キシ−カルボニル（Fmoc) 化学と既知の試薬である側鎖
が保護されたFmoc−アミノ酸ペンタフルオロフェニルエ
ステルを用いるか、または誘導化Wang樹脂とFmoc化学手
法および試薬としてその場で調製された側鎖が保護され
たFmocアミノ酸対称無水物を用いた。

【００７６】つぎに線状ペプチドは液中あるいはまだ固
相に保持された状態で、環状化される。環状化は当分野
で既知の方法で行なうことができるが、その方法として
はたとえば ａ）ループを形成する予定の線状ペプチド配列の両端に
システィン残基を組み込み、既知の酸化条件下ジスルフ
ィド結合を起こさせる。 ｂ）ａ）と同様にシステイン残基を組み込んだペプチド
を調製するが、システインを遊離のスルフヒドリル基と
して保持し（あるいは脱保護されて遊離スルフヒドリル
基となるＡｃｍで保護されたチオールとして保持）、こ
のペプチドをｏ−キシレンジブロミドあるいは同様な試
薬（たとえばジイオジド、ジクロリド、ジハロゲン化さ
れたＣ_2-4 の直鎖あるいは分岐低級アルキル）で処理す
る。このような試薬はシステインのイオウ原子と反応し
て環状構造を形成するがその構造中ではベンゼ または
アルキルに結合した２つの強固なチオエーテル結合が存
在する。 ｃ）環状ペプチドの一端のアミノ酸と他の端のアミノ酸
のカルボキシル基とをＤＰＰＡ、ＢＯＰなどのペプチド
結合形成を仲介する試薬によりアミド結合させる。これ
ら戦略のいずれも以下に詳しくとりあげるが、まずこれ
らの方法で調製した環状ペプチドの一般的な説明をす
る。

【００７７】本複合体の発明を以下のペプチドまたはそ
の製造方法に限定することなく、適当な保護基を外した
後に本発明にしたがって連結できるＰＮＤペプチドは、
ＰＥＰ構造で表わされるものを包含し、上記の表IIの線
状ペプチドを含む。

【化２６】 式中ｒはＰＥＰとＰＳＡの間の連結部位であって、Ｒ¹
がマーカーアミノ酸でない場合はマーカーアミノ酸１個
を意味することができる。 Ｒ¹ は ａ）結合、または ｂ）１から５個のアミノ酸からなるペプチドであって、
アミノ酸分析スペクトル中２０個の天然アミノ酸とは離
れた場所に移動するマーカーアミノ酸を一個含むことが
できる。このマーカーアミノ酸としてはノルロイシン、
γ−アミノ酪酸、βアラニン、あるいはオルニチンが好
ましい： Ｒ² は、 ａ）Ｒ³ が少なくとも２個以上のアミノ酸からなるペプ
チドである場合、単結合あるいは１７個までのアミノ酸
からなるペプチド、または ｂ）Ｒ³ が単結合である場合は、２ないし１７個のアミ
ノ酸からなるペプチド： Ｒ³ は ａ）Ｒ² が少なくとも２個以上のアミノ酸からなるペプ
チドである場合、単結合あるいは１７個までのアミノ酸
からなるペプチド、または ｂ）Ｒ² が単結合である場合は、２ないし１７個のアミ
ノ酸からなるペプチド： −ＧＰＧＲ−は四量体−ＧＬｙＰｒｏＧｌＹＡｒｇ−： Ｒ⁴ は、 ａ）Ｒ⁷ がＲ⁸ である場合、Ｒ⁷ がメチン炭素に結合し
た−ＮＨ−ＣＨ−ＣＯ−である、または ｂ）Ｒ⁷ が

【化２７】 の場合、Ｒ³ からＲ⁷ およびＲ⁵ への単結合である： Ｒ⁵ は ａ）マーカーアミノ酸をふくむことができる１個ないし
５個のアミノ酸からなるペプチド、 ｂ）−ＯＨ、 ｃ）−ＣＯＯＨ、 ｄ）−ＣＯＮＨ₂ 、 ｅ）−ＮＨ₂ 、または ｆ）存在しない、 である： Ｒ⁶ は ａ）Ｒ⁷ に対する任意の結合（．．．．．．．）が存在
しない場合、通常のＬ−またはＤ−アミノ酸の側鎖から
選択されるアミノ酸側鎖、 ｂ）Ｒ⁷ がＲ⁸ の場合、−Ｒ⁸ −Ｓ−Ｓ−または−Ｒ⁸
−Ｓ−Ｒ⁸ −Ｒ⁹ −Ｒ⁸ −Ｓ−、 ｃ）Ｒ⁷ が

【化２８】 場合、−Ｒ⁸ −ＮＨ−である。 Ｒ⁷ は ａ）−Ｒ⁸ −

【化２９】 Ｒ⁸ は単結合あるいは１ないし８個の炭素の低級アルキ
ルである。 Ｒ⁹ は ａ）Ｒ¹⁰、あるいは ｂ）キシレンである。 Ｒ¹⁰は ａ）１ないし８個の炭素の低級アルキルである、または ｂ）−ＣＨ₂ −Ｏ−ＣＨ₂ −である： ここで基は互いに独立であり、ペプチドがアミノ酸の末
端アミノ基を保護して合成された場合、アミンの保護基
であるベンジルオキシカルボニル（Ｚ）あるいはスルフ
ヒドリル基の保護基であるアセトアミドメチル（Ａｃ
ｍ）のような末端アミノ保護基は当分野で知られた方法
およびここに例示された方法にしたがって除去すること
ができる。脱保護されて露出した基は、リンカーｒを介
して陰イオン性多糖ＰＳＡとの連結結合形成に用いるこ
とができる。

【００７８】以降、ＰＮＤペプチドのコアを形成し、環
状ペプチドでループを形成することになるアミノ酸配
列、−Ｒ² −ＧＰＧＲ−Ｒ³ −、のことをループアミノ
酸という。しかしＲ⁶ とＴ⁷ の間の任意結合が存在しな
い場合、構造ＰＥＰは線状で、表IIの全線状ペプチドを
さす。

【００７９】ペプチドが環状であれ線状であれ、ＰＥＰ
のＲ² およびＲ³ を意味するアミノ酸配列は、表II中の
−ＧＰＧＲ−コア四量体を囲む配列を含めてどのアミノ
酸の組み合わせでもよい。したがって−Ｒ² −ＧＰＧＲ
−Ｒ³ −であらわされるコアアミノ酸はさらに進んで下
記のコアアミノ酸構造を有するものと定義することがで
きる。 −Ｘ_n Ｘ₁ Ｘ₂ −ＧＰＧＲ−Ｘ₃ Ｘ₄ Ｘ_m − 式中−ＧＰＧＲ−は四量体 −ＧｌｙＰｒｏＧｌｙＡｒ
ｇ−である Ｘ₁ はＲ² の構成体で下記から選ばれる： ａ）セリン ｂ）プロリン ｃ）アルギニン ｄ）ヒスチジン ｅ）グルタミン ｆ）スレオニン Ｘ₂ はＲ₂ の構成要素で下記から選ばれる： ａ）イソロイシン ｂ）アルギニン ｃ）バリン ｄ）メチオニン Ｘ_n はＲ² の構成要素であって単結合あるいは１５アミ
ノ酸までのペプチドである。Ｘ₃ はＲ³ の構成要素であ
って下記から選ばれる： ａ）アラニン ｂ）アルギニン ｃ）バリン Ｘ₄ はＲ³ の構成要素であって下記から選ばれる： ａ）フェニルアラニン ｂ）イソロイシン ｃ）バリン ｄ）ロイシン Ｘ_m はＲ³ の構成要素であって、単結合あるいは１５ア
ミノ酸までのペプチドである。

【００８０】本発明の好適な実施態様としては、たとえ
ばＨＩＶのＭＮ単離株のＰＮＤのようにＸ₂ はイソロイ
シンである。またペプチドのループ中に全部で１２−３
０アミノ酸が含まれることが好ましい実施態様である。

【００８１】環状ペプチドとは不安定なジスルフィド結
合による構造であるか、あるいは安定な結合あるいは構
造を介して形成される環である。安定な結合とは不安定
なジスルフィド結合以外の共有結合を指す。このような
安定な結合の例はアミドおよびチオエーテル結合であ
る。これらの共有結合はキシレンや低級アルキルのよう
な架橋構造、またはアミノ酸ペプチド結合架橋を介す
る。架橋構造を変えるおよび／またはペプチドに含まれ
るアミノ酸の数や種類を変えることにより免疫システム
に提示されるエピトープを微妙に調節し、環のループ構
造の立体構造を最適にすることができる。たとえば架橋
構造としてｏ−キシレンを用いるとたとえば炭素数８の
直鎖低級アルキルを架橋に用いた場合よりループの構造
がタイトになる。したがって本発明の複合体は、ＰＮＤ
エピトープが抗ペプチド、抗ＨＩＶ、ＨＩＶ中和、抗エ
イズ免疫反応をほ乳類中に起こさせるにあたっての構造
と機能との関係を分析するのに有用であるとともに、抗
エイズワクチン製剤の成分としても有用である。

【００８２】得られた合成ペプチドはＦＡＢ−ＭＳ、逆
相ＨＰＬＣ、アミノ酸分析あるいは核磁気共鳴（ＮＭ
Ｒ）によって同定される。

【００８３】２．環状ＰＮＤペプチド製造のプロセス ａ．ジスルフィド結合したシステイン基を介した環状ペ
プチド ループアミノ酸配列の両側にシステイン残基を有するペ
プチドは酸化的条件下で、ジスルフィド結合により環状
とする。ジスルフィド結合をさせる方法は当分野で良く
知られている。本発明におけるジスルフィド結合化の１
例は、ｃＰＮＤ４を製造する実施例５に示してある。こ
の例においては、システインのＡｃｍ誘導体を用いでジ
スルフィド化したｃＰＮＤをつくるプロセスが示してあ
るが、他の方法も同様に用いることができる。たとえば
実施例４３においては、ｃＰＮＤ３３を調製するために
２個の遊離のスルフヒドリル基を有する線状のペプチド
をトリフルオロ酢酸中に高度に希釈し、１−５０時間以
上、約１０−４０℃においてジスルフィド結合を形成さ
せる。

【００８４】よって、本発明の好適な実施態様としては
ペプチドは以下の構造

【化３０】 あるいは、その医薬的に許容される塩である；式中 ｒはａ）水素 ｂ）

【化３１】 式中Ｗは好ましくは−(CH₂)₂−、−(CH₂)₃−、あるいは
Ｒ⁶ であって、Ｒ⁶ は

【化３２】 式中Ｒ⁷ は低級アルキル、低級アルコキシあるいはハロ
である： Ｒ¹ は ａ）単結合、または ｂ）マーカーアミノ酸１個を含んでいても良い１ないし
５のアミノ酸からなるペプチド： Ｒ² は３ないし１０アミノ酸からなるペプチドである： Ｒ³ は３ないし１０アミノ酸からなるペプチドである： Ｒ⁵ は ａ）−ＯＨ、 ｂ）マーカーアミノ酸をふくむことができる１個ないし
５個のアミノ酸からなるペプチド、または ｃ）−ＮＨ₂ である： Ｒ⁸ は炭素数１から８の間の低級アルキルである：

【００８５】低級アルキルとは特に断わらない限り、直
鎖あるいは分岐アルキルで炭素数１から８のものであ
る。以降、ＰＮＤペプチドのコアを形成し、環状ペプチ
ドでループを形成することになるアミノ酸配列、−Ｒ²
−ＧＰＧＲ−Ｒ³ −、のことをループアミノ酸という。
本発明の１実施態様に置いて、以下の構造を有する環状
ペプチド

【化３３】 は、以下の構造

【化３４】 を有する線状ペプチドを環化することにより調製され
る。式中Ｘ₁ はＲ² の構成体で下記から選ばれる： ａ）セリン ｂ）プロリン ｃ）アルギニン ｄ）ヒスチジン ｅ）グルタミン（これが好ましい） ｆ）スレオニン Ｘ₂ はＲ₂ の構成要素で下記から選ばれる： ａ）イソロイシン（これがもっとも好ましい） ｂ）アルギニン（好ましい） ｃ）バリン ｄ）メチオニン Ｘ_n はＲ² の構成要素であって１つのアミノ酸あるいは
８アミノ酸までのペプチドである：Ｘ₃ はＲ³ の構成要
素であって下記から選ばれる： ａ）アラニン、 ｂ）アルギニン ｃ）バリン Ｘ₄ はＲ³ の構成要素であって下記から選ばれる： ａ）フェニルアラニン ｂ）イソロイシン ｃ）バリン ｄ）ロイシン Ｘ_m はＲ³ の構成要素であって、１つのアミノ酸あるい
は８アミノ酸までのペプチドである。

【００８６】合成環状ペプチドは２相にわけて合成され
る。まず線状ペプチドを合成するには、Milligen９０５
０ペプチドシンセサイザーあるいはＡＢＩ４３１Ａペプ
チドシンセサイザーを用い、９−スルオレニルメチルオ
キシ−カルボニル（Fmoc) 化学的手法と既知の試薬であ
る側鎖が保護されたFmoc−アミノ酸ペンタフルオロフェ
ニルエステルを用いるか、または誘導化Wang樹脂とFmoc
法および試薬としてその場合で調製された側鎖が保護さ
れたＦｍｏｃアミノ酸対称無水物を用いた。

【００８７】つぎに線状ペプチドは液中あるいはまだ固
相に保持された状態で、ループを形成する予定の線状ペ
プチド配列の両端にシステイン残基を組み込み、既知の
酸化条件下ジスルフィド結合を起こさせて環状化され
る。好適な実施態様としてはペプチドを（ａ）H₂O₂、
（ｂ）空気中の酸素、（ｃ）約０．１−０．５％ＴＦＡ
を含むCH₃CN 水溶液、（ｄ）約０．１Ｍフェリシアニン
のいずれかにさらして環化する。好ましい方法は空気中
の酸素にさらすことである。

【００８８】得られた合成ペプチドはＦＡＢ−ＭＳ、逆
相ＨＰＬＣ、アミノ酸分析あるいは核磁気共鳴（ＮＭ
Ｒ）によって同定される。本発明において有用なペプチ
ドはさらに以下の（ｉ）、（ii）に記載するようにして
調製することができる。

【００８９】ｉ．固相状態でのペプチド環化 システインあるいはその他の遊離のスルフヒドリル基を
側鎖に持つアミノ酸であるＣ¹ とＣ² をループアミノ酸
の両端に有するペプチドを当分野で知られた方法により
調製する（上述）。環状ＰＮＤにおいて、スルフヒドリ
ル基を有する側鎖（−Ｒ⁸ −ＳＨ）は環化して−Ｒ⁸ Ｓ
−基となる。反応性のある側鎖（Ｒ基）を有するアミノ
酸を組み込む場合は適切にＲ基が保護された形で用い
る。例えば、ヒスチジンはトリフェニルメチル（Trt)、
あるいはＢｏｃで保護し、アルギニンは４−メトキシメ
チル−２，３，６−トリメチルフェニルスルホニル（Mt
r)で保護する。

【００９０】好ましくは、Ａｃｍで保護されたＣ² がす
でに結合している樹脂、たとえばFmoc-L-Cys(Amc)-O-Wa
ng樹脂を購入する。ループアミノ酸のアミノ末端に組み
込まれたシステイン残基（Ｃ¹ ）もまたＡｃｍ誘導体で
ある。Ｃ¹ とＣ² のどちらも付加的なアミノ酸であるＲ
¹ とＲ⁵ にそれぞれ結合できる。このＲ¹ 、Ｒ⁵ はキャ
リア分子と複合体を形成するのに利用され、あるいはノ
ルロイシンやオルニチンが用いられた場合はアミノ酸分
析用のマーカーとして働く。

【００９１】アセトアミドメチル化システインのＳは、
室温約１５時間、樹脂と親和性のある溶媒、たとえば１
−５０％の有機酸濃度（好適には１０％酢酸を含む無水
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ））中、各Ａｃｍ基にた
いし約４倍の過剰モル重金属塩（たとえば酢酸水銀（Hg
(OAc)₂) と反応させる。生じた重金属チオエーテル（た
とえばペプチドの酢酸水銀チオエーテル、ＰＥＰ（S-Ag
OAc)は、洗浄し、乾燥する。過剰のＤＭＦ中硫化水素を
加えると、不溶性の金属硫化物（たとえば水銀硫化物 H
gS) と遊離のスルフヒドリル基を有するペプチドが得ら
れる。遊離のスルフヒドリル基はついで上記の方法の１
つによって酸化される。別法としてはＡｃｍで保護され
たチオールは、メタノール／ＤＭＦ溶液中でヨウ素で処
理することにより直接環状ジスルフィドに変換すること
もできる。

【００９２】ii. 基本的には上述の固相環化法と同様で
あるが２点の主要な違いがある。ペプチドがpepsyn KA
樹脂から９５％ＴＦＡ／４％エタンジチオール／１％チ
オアニソールで切り出されると、酸に不安定な側鎖保護
基も同時にはずれ、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）基は遊離の−ＳＨ
官能基を与える。しかしＣｙｓ（Ａｃｍ）保護が用いら
れる場合、別に線状ペプチドを樹脂についたままあるい
は外した状態で酢酸水銀／硫化水素を開裂して遊離の−
ＳＨ基にする必要がある。

【００９３】１つの方法はＣｙｓ（Ａｃｍ）保護基とSa
srinまたはPepsyn KH を用い、完全に保護されたペプチ
ドを１％ＴＦＡ／CH₂Cl₂で樹脂から開裂する方法を用い
るものである。酢酸水銀／硫化水素でＣｙｓ（Ａｃｍ）
を遊離の−ＳＨ基に変換し、環化は別に保護したペプチ
ドにおいて行なう。この時点でペプチドはその場で選択
的にＮ−末端がマレイミド化されることができる。酸に
不安定な側鎖保護基を９８％ＴＦＡ／２％チオアニソー
ルで開裂し、環状ペプチドをＨＰＬＣで単離する。しか
し好ましい方法はペプチドを樹脂から切り出し、上述の
方法の１つで環化をおこさせるものである。もっとも好
ましい方法は約１−５０時間の間、１０から４０℃のあ
いだで空気酸化させることである。

【００９４】本発明において特に好ましい実施態様は、
構造（ＳＥＱ ＩＤ：１：）を有するペプチド（ｃＰＮ
Ｄ）である。

【化３５】 を、アミノ末端ノルロイシンか内部のリシンの１つを介
してＯＭＰＣに連結し、構造の１つあるいは混合物を作
る。

【化３６】 式中−ｒ−および−Ｂ−は下記から選ばれる

【化３７】 ＰＳＡはＰＲＰまたはＰｎＰｓ６Ｂのどちらかである。
ＰＦはＰＲＰまたはＰＮＰｓ６Ｂ１mgあたりのペプチド
の質量比で、０．０１と１mgのあいだにある。ＧＦはＯ
ＭＰＣ１mgあたりのＰＲＰまたはＰＮＰｓ６Ｂの質量比
で、０．０１と０．３３mgのあいだにある。

【００９５】ｂ．ｏ−キシレンまたは低級アルキルにチ
オエーテル連結を介した環状ペプチド ｉ．固相状態でのペプチド環化 システインあるいはその他の遊離のスルフヒドリル基を
側鎖に持つアミノ酸であるＣ¹ とＣ² をループアミノ酸
の両端に有するペプチドを当分野で知られた方法により
調製する（上述）。環状ＰＮＤにおいて、スルフヒドリ
ル基を有する側鎖（−Ｒ⁸ −ＳＨ）は環化して−Ｒ⁸ Ｓ
−基となる。反応性のある側鎖（Ｒ基）を有するアミノ
酸を組み込む場合は適切にＲ基が保護された形で用い
る。例えば、ヒスチジンはトリフェニルメチル（Trt)、
アルギニンは４−メトキシメチル−２，３，６−トリメ
チルフェニルスルホニル（Mtr)で保護する。（「ペプチ
ド合成の原理」（Bodanzky, M., Springer-Verlag(１９
８４））、「固相ペプチド合成」（Stwert J. M., Youn
g, J. D., Pierce Chemical Company(１９８４第２
版）、「ペプチド」（Gross, E, Meienhofer, J., Acad
emic Press（１９７９))

【００９６】好ましくは、Ａｃｍで保護されたＣ² がす
でに結合している樹脂、たとえばFmoc-L-Cys(Amc)-O-Wa
ng樹脂を購入する。ループアミノ酸のアミノ末端に組み
込まれたシステイン残基（Ｃ¹ ）もまたＡｃｍ誘導体で
ある。Ｃ¹ とＣ² のどちらも付加的なアミノ酸であるＲ
¹ とＲ⁵ にそれぞれ結合できる。このＲ¹ 、Ｒ⁵ はキャ
リア分子と複合体を形成するのに利用され、あるいはノ
ルロイシンやオルニチンが用いられた場合はアミノ酸分
析用のマーカーとして働く。

【００９７】アセトアミドメチル化システインのＳは、
室温約１５時間、樹脂と親和性のある溶媒、たとえば１
−５０％の有機酸濃度（好適には１０％酢酸を含む無水
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ））中、各Ａｃｍ基にた
いし約４倍の過剰モル重金属塩（たとえば酢酸水銀（Hg
(OAc)₂) と反応させる。生じた重金属チオエーテル（た
とえばペプチドの酢酸水銀チオエーテル、ＰＥＰ（S-Ag
OAc)）は、洗浄し、乾燥する。過剰のＤＭＦ中硫化水素
を加えると、不溶性の金属硫化物（たとえば水銀硫化物
HgS) と遊離のスルフヒドリル基を有するペプチドが得
られる。

【００９８】ペプチドと等モルのｏ−キシレンジブロミ
ドまたはジクロリド、あるいは所望の架橋長さをあたえ
るジブロム化またはジクロル化低級アルキルまたは類似
の試薬（たとえばジハロゲン化−ＣＨ₂ −Ｏ−ＣＨ
₂ −）の混合物を誘導体化した樹脂に加える。大過剰の
四級アミン、好ましくはＤＭＦ中のトリエチルアミン
（NEt₃) を徐々に加える。ビススルフヒドリルペプチド
部分との反応を室温で約１６時間進行させて、樹脂に結
合した状態の、架橋基で誘導体化された環状ペプチドを
得る。酸に不安定な側鎖の保護基の脱離と、樹脂からの
切り出しは、４％１，２−エタンジオールと１％チオア
ニソールの存在下で９５％トリフルオロ酢酸で処理する
ことにより行なう。溶解した環状ペプチドはついで濾過
して樹脂と分離する。濾液は溶媒を留去して粗製残渣を
ＨＰＬＣで精製する。ＨＰＬＣは当分野に知られた方
法、たとえば逆相ＨＰＬＣによって行なう。

【００９９】ii. 溶液中でのペプチドの環化 基本的には上述の固相環化法と同様であるが２点の主要
な違いがある。ペプチドがpepsyn KA 樹脂から９５％Ｔ
ＦＡ／４％エタンジチオール／１％チオアニソールで切
り出されると、必要な遊離の−ＳＨ官能基を与えるＣｙ
ｓ（Ｔｒｔ）基を含め酸に不安定な側鎖保護基も同時に
はずれる。しかしＣｙｓ（Ａｃｍ）保護が用いられる場
合、別に線状ペプチドを樹脂についたままあるいは外し
た状態で酢酸水銀／硫化水素を開裂して遊離の−ＳＨ基
にする必要がある。

【０１００】しかしながら好ましい１つの方法はＣｙｓ
（Ａｃｍ）保護基とSasrinまたはPepsyn KH を用い、完
全に保護されたペプチドを１％ＴＦＡ／CH₂Cl₂で樹脂か
ら開裂する方法を用いるものである。酢酸水銀／硫化水
素でＣｙｓ（Ａｃｍ）を遊離の−ＳＨ基に変換し、環化
は別に保護したペプチドにおいて行なう。この時点でペ
プチドはその場で選択的にＮ−末端がマレイミド化され
ることができる。酸に不安定な側鎖保護基を９８％ＴＦ
Ａ／２％チオアニソールで開裂し、環状ペプチドをＨＰ
ＬＣで単離する。未反応のキシレンジブロミドのような
過剰の試薬を保護基の脱離に先立って除去するには、ま
ず１段階濃度勾配逆相ＨＰＬＣを行なってからより選択
的な濃度勾配溶出を行なうのが便利である。

【０１０１】このサブセクションの方法により調製され
た環状ＨＩＶ ＰＮＤペプチドは以下に示すサンプルｃ
ＰＮＤを包含するがこれに限定されるものではない。こ
のサブセクションの方法は一般に小さいペプチドに適用
でき、、特に５個から３０個までのアミノ酸からなるペ
プチドに適用できる。最適な環のサイズは−ＧＰＧ−三
量体を含む５から１０個のあいだにアミノ酸を含むもの
である。この環のサイズは適切なアミノ酸の数と組み合
わせを有する線状ペプチドから環を作成することにより
容易に保つことができる。このサブセクションｂ．
（ｉ）と（ii) に記載されたプロセスで得られた代表的
なペプチドを以下に示す。複合体発明はこれらの特定の
実施態様であるＨＩＶ環状ＰＮＤペプチドに限定される
ものではない。他の線状ＨＩＶ ＰＮＤペプチド配列も
これらのペプチドを作成したのと基本的に同一のやり方
で環状にすることができる。互いに異なった一次配列を
有するペプチドを作成することができ、それらは抗ペプ
チド、抗ＨＩＶあるいはＨＩＶ中和性免疫反応を引き出
すことができるかぎり、本発明においては有益である。

【化３８】

【０１０２】ｃ．アミド結合形成を経る環化 複合体形成用の新規のアミド結合した環状ペプチドは、
基本的に２相で調製される。初めに、線状ペプチドを調
製するが、これにはたとえばＡＢＩ−４３１Ａペプチド
シンセサイザーを用い、既知の固相ペプチド合成化学手
法、たとえばFmoc法と適切に側鎖が保護されたＦｍｏｃ
−アミノ酸を試薬に用いる。

【０１０３】次ぎに、線状ペプチドを樹脂から切り出
し、溶液中で環化を行なうが、これはアミノ末端のイソ
グルタミンの遊離のアミノ基、あるいはループアミノ酸
の片端のリジンのε−あるいはα−アミノ基をループア
ミノ酸のカルボキシ末端の遊離のカルボキシル基とを、
ＤＰＰＡ、ＢＯＰなどのペプチド結合形成を行なわせる
試薬によりアミド結合させることにより行なう。本サブ
セクションに従って合成されたペプチドは以下の実施例
６−２６に示してある。得られた合成ペプチドはＦＡＢ
−ＭＳ、逆相ＨＰＬＣ、アミノ酸分析あるいは核磁気共
鳴（ＮＭＲ）によって同定される。

【０１０４】したがって、ペプチド−ポリサッカライド
−蛋白質複合体の非常に好ましい実施態様は、基本的に
ＰＲＰあるいはＰｎＰｓ６Ｂであるスペーサーを介して
ＯＭＰＣとＨＩＶ ＰＮＤペプチドが共有結合している
ものである。ＰＮＤが優勢な単離株、たとえばＨＩＶ I
IIＢあるいはＨＩＶ ＭＮ単離株から得られたもなの
で、１種類の複合体のワクチンあるいはこれらの複合体
の混合ワクチンは、エイズやＡＲＣの予防や治療に非常
に有益である。このような好ましい実施態様は以下の構
造を有する。

【化３９】 〔式中−ｒ−および−Ｂ−は下記から選ばれる：

【化４０】 ＰＳＡはＰＲＰまたはＰｎＰｓ６Ｂのどちらかである：
ＰＦはＰＲＰまたはＰＮＰｓ６Ｂ１mgあたりのペプチド
の質量比で、０．０１と１mgのあいだにある：ＧＦはＯ
ＭＰＣ１mgあたりのＰＲＰまたはＰＮＰｓ６Ｂの重量比
で、０．０１と０．３３mgのあいだにある。〕以下の実
施例は本発明の複合体（コンジュゲート）の製造方法及
び使用方法をより特定的に説明するためのものである。
しかしながら、それらの実施例は本発明の範囲を限定す
るものと解釈されてはならない。

【０１０５】Ａ．ペプチド製造の実施例 実施例１ ｃＰＮＤ１を形成するための溶液環化 無水ＤＭＦ（２０ml）を脱気し、ＨＰＬＣにより単離さ
れた直線形１１−merＨ−ＮleＣＨＩＧＰＧＲＡＦＣ−
ＯＨ（２０mg、１７μモル）を溶解し、窒素雰囲気下で
密閉した。無水ＤＭＦ（５０μｌ）中ｏ−キシリレンジ
ブロミド（４．７mg、１７．９μモル）の溶液を加え
た。次にＤＭＦ中ＮＥt₃（１１．９μｌ、８５．２μモ
ル）を約６．５時間にわたって加えた。塩基の添加終了
後約１時間で、溶液を乾燥させた。残渣をエーテルに再
懸濁し、遠心して不溶生成物を回転沈降させ、次いで再
乾燥させた。迅速な原子衝撃質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）
により分析されたアリコートは、１２７５の主イオン
［Ｍ＋Ｈ］⁺ を産出した。２．０ml／分で、０．１％Ｔ
ＦＡ／２４％ CH₃CNを用いるヴィダック（Vydac)Ｃ１８
カラム（０．４６×２５．０cm）上でのイソクラティッ
ク（Isocratic)逆相ＨＰＬＣ（２１５nmでモニター）
は、保持時間約１８．５分を有するシャープな生成物ピ
ークを示した。製造的スケールでの単離が、２４〜２９
％ CH₃CNから１０ml／分で１３５分にわたって行われ、
これら条件下で、保持時間７６．４１分を有する生成物
が集められ、分析的条件下で再びクロマトグラフィーに
かけ、その同一性を確認した。アミノ酸分析及び４００
MHz ＮＭＲ分析は、構造ｃＰＮＤ１と一致した。

【化４１】

【０１０６】実施例２ ｃＰＮＤ２を形成するための溶液環化 直線形１０−mer Ｈ−Ｎle−ＣＩＧＰＧＲＡＦＣ−ＯＨ
（２０mg、１９．３μモル）を使用すること以外、実施
例１の方法が実施された。塩基の添加後、溶液を窒素下
さらに９時間保持した。ＦＡＢ−ＭＳにより、［Ｍ＋
Ｈ］⁺ ＝１１３８及び［Ｍ＋Na］⁺ ＝１１６０を産出
し、これは、ｃＰＮＤ２についての構造と一致した。ヴ
ィダックＣ１８カラム（２．１２×２５cm）を２つ用い
る製造的ＨＰＬＣを、１０ml／分で、２４％〜２８％ C
H₃CN／０．１％ＴＦＡから９０分にわたって行った。溶
出液を２１５nmでモニターし、６３．４２′及び７０．
８２′の保持時間での２つの生成物ピークを集め、乾燥
させ、ＦＡＢ−ＭＳにかけた。いずれの材料も１１３８
の［Ｍ＋Ｈ］⁺ を有し（後者のピークもまた１１６０の
［Ｍ＋Na］⁺ を有した。）、これは、構造ｃＰＮＤ２と
一致した。

【化４２】

【０１０７】実施例３ ｃＰＮＤ３を形成するための溶液環化 直線形１５−mer Ｈ−Ｎle−ＣＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶ
ＴＣ−ＯＨ（２１．２mg、１１．９２μモル）を使用
し、ＮＥt₃を約１０時間にわたって加えること以外、実
施例１及び２におけると同様の方法が行われた。分析的
ＨＰＬＣによる分析前に、塩基へさらに５時間さらし
た。粗生成物のＦＡＢ−ＭＳは、１７７９の単一強度の
［Ｍ＋Ｈ］⁺ を示し、これは、ｃＰＮＤ３の構造と一致
した。

【化４３】

【０１０８】実施例４ ｃＰＮＤ１を形成するための固相環化 直線形ＰＮＤペプチドを、Fmoc-L-Cys(Acm)-O-ワング
（Wang) 樹脂（０．６１ミリ当量／ｇ）から出発して、
ＡＢＩ−４３１Ａペプチド合成機において、ワング樹脂
上に製造した。Fmoc化学及びFmoc−アミノ酸対称無水物
（４×過剰、その場で製造）を、０．２５ミリモルのス
ケールで試薬として用い、ペプチド７４５mgを生じた。

【化４４】

【０１０９】Hg(OAC)₂（６４mg、０．２ミリモル）をＤ
ＭＦ（０．５ml）中１０％酢酸に溶解し、上記の乾燥樹
脂（１４９mg、０．０５ミリ当量）へ加えた。ＤＭＦ
（０．２ml）中１０％酢酸をさらに膨張した樹脂に加
え、溶液を一晩攪拌した。その後、樹脂をロ過し、ＤＭ
Ｆ（５×１ml）、CH₂Cl₂（３×１ml）及びエーテル（３
×２ml）で洗浄した。続いて、樹脂を乾燥させ、１ml H
₂S飽和ＤＭＦを加え、次に同一の第２のアリコートを加
えた。次に、樹脂をロ過し、上記のごとく洗浄し、乾燥
させて、黒色樹脂性粉（１７９mg）を得た。ＤＭＦ（２
ml）中ｏ−キシリレンジブロミド（３．２mg）及びＮＥ
t₃（３．４μｌ）の混合物を室温で樹脂（３５mg）に加
え、１６時間反応させた。樹脂をロ過し、上記のごとく
洗浄し、乾燥させた。Fmocを、室温で２０分にわたって
ＤＭＦ（１ml）中２０％ピペリジンで処理することによ
り除去した。樹脂を上記のごとく再び洗浄し、乾燥させ
た。

【０１１０】ｃＰＮＤ１ペプチドを樹脂から開裂させ、
Ｔrt及びＭtr保護基を、室温で６時間にわたって９５％
ＴＦＡ／４％エタンジチオール／１％チオアニソール
（１ml）で処理することによって同時に除去した。溶液
をロ過し、樹脂を別の１００％ＴＦＡ（３×１ml）で洗
浄し、合体させたロ液を２０℃／０．１mm圧で蒸発させ
た。エーテルに不溶の材料を抽出（３×２ml）により除
去し、不溶性粗生成物を２０℃／０．１mm圧で再乾燥さ
せた。０．４６×２５cmヴィダックＣ１８カラムを用い
る分析的ＨＰＬＣにより、生成物を同定した。実施例１
から得られた生成物との比較により、真の生成物が存在
することが確認された（１２．９７′と比較した１２．
８８′の保持時間）。連続する２つの２．１２×２５cm
ヴィダックＣ１８カラムを用いる２５％〜３０％ CH₃CN
／０．１％ＴＦＡからの調製用ＨＰＬＣが、１０ml／分
で９０分にわたって行われた。５４．１２′で溶出する
ピークが集められた。実施例１で製造された材料と本材
料とを分析的スケールで、共通のクロマトグラフィーに
かけると、単一のシャープなピークが示された。ＦＡＢ
−ＭＳは１２７５の［Ｍ＋Ｈ］⁺ を有し、ｃＰＮＤ１の
製造を確認した（構造につき上記実施例１参照）。

【０１１１】実施例５ ジスルフィド−結合ｃＰＮＤ４の固相合成 直線形ＰＮＤペプチドを、Fmoc-L-Cys(Acm)-O-ワング樹
脂（０．６１ミリ当量／ｇ）から出発して、ＡＢＩ−４
３１Ａペプチド合成機を用いてワング樹脂上に製造し
た。Fmoc化学及びFmoc−アミノ酸対称無水物（４×過
剰、自然位で製造）を、０．２５ミリモルスケールにお
いて試薬として使用し、ペプチド７４５mgを生じた。

【化４５】

【０１１２】５％メタノール／無水ＤＭＦ（１ml）中ヨ
ウ素の溶液を、乾燥し、誘導体化された上記ワング樹脂
へ加え、室温で４時間攪拌した。樹脂をロ過し、無水Ｄ
ＭＦ（５×２ml）で洗浄し、最後にＤＭＦ（２ml）に再
懸濁させた。水中０．１Ｍチオ硫酸ナトリウム溶液２滴
を加え、数分間攪拌した。樹脂を、水性９５％ＤＭＦ
（３×２ml）、無水ＤＭＦ（２ml）、塩化メチレン（３
×２ml）、エーテル（３×２ml）で洗浄し、乾燥させ
た。

【０１１３】Fmoc及び他の保護基を、２０分にわたっ
て、ＤＭＦ中２０％ピペリジンで処理することにより除
去し、樹脂を洗浄し、乾燥させた。樹脂を、室温で６時
間９５％ＴＦＡ／４％エタンジチオール／１％チオアニ
ソール（１ml）で処理することにより、ジスルフィド結
合環状ペプチドから開裂させた。溶液をロ過し、樹脂を
追加の１００％ＴＦＡ（３×１ml）で洗浄し、合体した
ロ液を乾燥させた。エーテルに不溶の材料を抽出（３×
２ml）により除去し、溶液を再び乾燥させた。連続する
２つの２．１２×２５cmヴイダックＣ１８逆相カラムを
用いる調製用ＨＰＬＣ及び９０′にわたる２０〜２４％
CH₃CNの勾配溶出により、これら条件下で、３６．６
６′で溶出するシャープなピークを単離した。分析用Ｈ
ＰＬＣにより、調製用ＨＰＬＣから得られた生成物と既
知のジスルフィド結合環状標準物の共通のクロマトグラ
フィーにより、単一のピークが得られた。ＦＡＢ−ＭＳ
により１１７１の［Ｍ＋Ｈ］⁺ を得、これはジスルフィ
ド結合環状構造ｃＰＮＤ４と一致した。

【化４６】

【０１１４】実施例５−ｂ ジスルフィド結合ｃＰＮＤ３３の合成 １． H-Nle Cys Tyr Asn Lys Arg Lya Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Ly
sAsn Ile Ile Gly Cys-OH (C₁₃₅H₂₂₀N₄₂O₃₃S_{2 ,}式重量＝
３０２３．６）の合成 ２６mer を、ミリゲン（Milligen) ＃９０５０合成機に
より、部分的ラセミ化Fomc-L-Cys(Trt)-OPKA樹脂（ミリ
ゲンバッチＢ０９０４２６）使用量０．０８１ミリ当量
／ｇ（約６０４mg）、２．４７ｇ（０．２００ミリ当
量）から出発して組み立てた。樹脂を当量のガラスビー
ズ（シグマ１５０〜２１２μｍ）と混合した。混合物を
連続的に接続された２つの１×１０cmカラムに完全に満
たした。試薬はFmoc-Pftエステル（トレオニンを除く、
ｄＨＢｔである）であり、Ｎ−メチルピロリジン溶媒中
４倍モル過剰量で使用した。側鎖保護基は、Ｙ９ｔ−ブ
チル、Ｋ(Boc) 、Ｒ(Mtr) 、Ｈis(Boc) 、Ｔ（ｔ−ブチ
ル）、Ｃ(Trt) であった。実験を修正し、Ｋ⁷ 、Ｉ⁹ 、
Ｉ¹¹、Ｇ¹²、Ｐ¹³、Ｇ¹⁴、Ｒ¹⁵、Ｆ¹⁷、Ｙ¹⁸、Ｔ¹⁹、Ｔ
²⁰、Ｉ²³、Ｉ²⁴と二重カップリングを行った。アシル化
循環時間をＧ¹⁴とＡ¹⁶を除き、及びＩ⁹(２ｘ）、Ｉ
¹¹（２ｘ）、Ｉ²³（２ｘ）、Ｉ²⁴（２ｘ）については９
０分へ延ばした以外、全べてのユニットについて３０〜
６０分へ延ばした。誘導体化樹脂を、遊離末端アミンと
して維持し、それをCH₂Cl₂で洗浄して自然乾燥した。

【０１１５】乾燥誘導体化樹脂とガラスビーズの混合物
を、８時間振動トレイ上でゆるやかに攪拌しながら、密
閉フラスコ中９５％ＴＦＡ、４％エタンジチオール、１
％ CH₃Sph(３０ml）へ、２３℃で再懸濁させた。次い
で、あざやかな黄色混合物を、ロ過し、不溶物を１００
％ＴＦＡ（３×２０ml）で完全に抽出した。合体した濃
オレンジ色ロ液を、蒸発させ、油状ゴム状物（淡褐色）
を得た。エーテル（２０ml）とともに粉砕する際、この
材料は即座に無色固体となり、エーテル（３×２０ml）
を追加し粉砕することによりロ紙上に移した。乾燥後、
粗生成物を、無色微粉末として得た（５８３mg）。

【０１１６】水性０．１％ＴＦＡ／２０％ CH₃CNに溶解
されたサンプル約５０μｇを、０．４６×２５．０cmヴ
ィダックＣ１８カラム上での分析用逆相ＨＰＬＣにかけ
て主成分及び、後に溶出した少量成分が明らかとなっ
た。それらを、連続した２つの２．２１×２５．０cm調
製用カラムに、サンプルの３０mg及び他の５０mgアリコ
ートを注入した後、分離して集めた。全量３５．２mgの
初期溶出材料及び８．２mgの後の溶出材料を回収し、次
いで凍結乾燥した。ＦＡＳ−ＭＳにより、３０２２．１
の［Ｍ＋Ｈ］⁺ 及び３０４４．２の［Ｍ＋Na］を得、こ
れは、計算質量と一致した。

【０１１７】２．環状ジスルフィドの製造

【化４７】 ａ．K3Fe(CN)6 誘導酸化 直線形２６mer ジチオール化合物（３５．０mg）を、２
３℃で、脱気蒸留水（３８ml）に溶解し、pH２．７３の
無色透明溶液を得た。pHを０．１Ｎ NH₄OH で８．５に
調節し、溶液を窒素雰囲気下においた。材料のアリコー
トを直ちに、分析用逆相ＭＰＬＣにかけると初期ピーク
の出現により、証明されるごとく酸化を受けていること
が見い出された。新たに調製された０．０１Ｍ K₃Fe(C
N)6の溶液を、磁気攪拌をしながら、窒素下２３℃で、
強力駆動皮下注射器により加えた。ＨＰＬＣによる少ア
リコートの分析により、初期溶出時間までに、出発材料
の全変換が明らかとなった。反応混合物（pH８．３）を
１０％水性酢酸と混合し、攪拌してpH４．０とした。溶
液をロ過し、不溶性材料を除去し、わずかに黄色の溶液
を蒸発させ、次いで凍結乾燥させて、淡黄色粉末約２
７．９mgを得た。材料を０．１％ＴＦＡ、２０％ CH₃CN
に溶解し、勾配を、調製用ＨＰＬＣにて溶出した。主な
初期溶出ピーク及び後の溶出ピーク（４：１）を分別し
て集め、初期溶出物６．１mg及び後の溶出液１．５mgを
得た。初期溶出物のＦＡＢ−ＭＳ分析により、［Ｍ＋
Ｈ］⁺ ３０１９．７、［Ｍ＋Na］⁺ ３０４２．５を示
し、後のもののＦＡＢ−ＭＳ分析により［Ｍ＋Ｈ］⁺ ３
０２１．０、［Ｍ＋Na］⁺ 初期材料＝３０４１．５を示
した。これらの全ては、環化ｃＰＮＤ３３の正確な質量
と一致した。後の溶出物は、Ｄ−システイン異性体であ
る。生成物のアミノ酸分析により、環化生成物について
の、予期されたアミノ酸成分を得、後の溶出物がＤ−シ
ステイン含有ジアステレオマーであることを確認した。

【０１１８】ｂ．空気酸化 上記（1)において製造された直線形２６mer （８６mg、
２８．４μモル）を、２３℃で、水性０．１％ＴＦＡ、
２０％アセトニトリル（２８４ml）に溶解し、溶液を空
気中に置いた。環化を、逆相ＨＰＬＣによりモニター
し、サンプルがｔ＝２４時間で、出発直線形材料のほぼ
完全な消失とともに、初期溶出物へほぼ完全に変換され
ていることを見い出した。無色透明の溶液を約８mlまで
蒸発させ、その時点で、上記８６mgから同様の方法で製
造されたサンプル１０mgを追加して加えた。合体したサ
ンプルを約９mlまで蒸発させた。濁った無色溶液を、連
続した２つの２．１２×２５．０cmヴィダックＣ１８カ
ラムにおける２つの分離行程でのＨＰＬＣ分離にかけ
た。材料の２つのピーク、初期溶出ピークと後の溶出ピ
ークが別々に集められた。各ピークを別々に蒸発させ、
凍結乾燥させて、初期及び後の材料をそれぞれ３０．１
mg及び９．７mg得た。初期溶出物を、別に製造された初
期溶出環化物と合体し、全量４７．５mgのわずかに薄青
色の綿毛状粉末を得た。この材料の分析用ＨＰＬＣによ
り、単一ピークを得た。

【０１１９】実施例６ ペプチド結合ｃＰＮＤ７の溶液合成 直線形ペプチド Cbz-Nle-Lys(Boc)-His(Trt)-Ile-Gly-P
ro-Gly-Arg(Mtr)-Ala-Phe を、市販の入手可能なFmoc−
フェニルアラニル−ｐ−アルコキシベンジルアルコール
樹脂３７３mg（０．１ミリモル）を用いて、ＡＢＩ４３
１Ａペプチド合成機における固相法により合成した。ベ
ンジルオキシカルボニル（Cbz)保護形として取得したノ
ルロイシンを除き、使用されたＬ−アミノ酸は、適切な
酸反応活性側鎖保護基を有するフルオレニルメトキシカ
ルボニル（Fmoc）誘導体であった。ポリペプチド誘導体
化樹脂生成物を、焼結ガラス漏斗へ移し、ジクロロメタ
ンで洗浄し、乾燥させて、ポリペプチド樹脂生成物０．
６ｇを得た。

【０１２０】ペプチドを、ＴＦＡ：１，２エタンジオー
ル：アニソールの９５：２：３の混合物６mlで１６時間
処理することにより樹脂から開裂させた。反応混合物を
焼結ガラス漏斗によりロ過し、樹脂を１０mlＴＦＡで洗
浄し、ロ液を合体させた。直線形ペプチドを、ジエチル
エーテル４００mlを５０mlづつで、粉砕し、焼結ガラス
漏斗でロ過することにより回収した。１％ＴＦＡ１００
mlでの分解、次いで凍結乾燥により、直線形ペプチド２
９８mgを得た。ペプチド粉をＤＭＦ８００mlに溶解し、
０．４２mlジイソプロピルエチルアミンで中性化し、
０．０７７mlジフェニルホスホリルアシドで処理した。
溶液を４℃で７０時間暗室で攪拌し、環状ラクタムを形
成した。氷酢酸３mlを加えて反応を停止させた後、反応
混合物を約１〜２mlの油状まで濃縮し、１０％水性酢酸
に溶解し、凍結乾燥させた。

【０１２１】環状ペプチドを、移動相として５％酢酸を
用いるＧ−１５ゲルろ過クロマトグラフィーにより精製
した。ペプチドを含む、ＵＶ検出によりモニターされた
分画をプールし、凍結乾燥して、乾燥環状ペプチド１３
５mgを得た。得られた全ての結果は、ｃＰＮＤ７の構造
と一致した。

【化４８】

【０１２２】実施例７ 水素形態ｃＰＮＤ８を産生するためのｃＰＮＤ７の脱保
護 ３０％水性酢酸２０mlに環状ペプチドを溶解し、炭素上
１０％パラジウム１００mg上での水素化（１６時間、４
０psi で) により、ｃＰＮＤ７の脱保護を行なった。反
応混合物をシーライト上でロ過し、触媒を除去し、ロ液
を凍結乾燥した。ヴィダックＣ１８セミ−プレプ（semi
-prep)カラムを用いる逆相ＨＰＬＣにより、純粋な脱保
護環状ペプチド８．５mgを得た。脱保護のこの方法は、
ベンジルオキシカルボニルＮ−保護ペプチドのような合
成された全てのペプチドに適用して、結合の用意にアミ
ノ末端で即座に活性化されるペプチドの遊離水素形態を
産出することができる。生成物の構造は、ＦＡＢ−Ｍ
Ｓ、分析的ＨＰＬＣ及びアミノ酸分析により確認され、
ｃＰＮＤ８の構造とすべての結果が一致した。

【化４９】

【０１２３】実施例８ ｃＰＮＤ１０の合成 ペプチドアミノ末端でＡcm保護Ａｃ−システインを有す
るｃＰＮＤ１０の合成は、この合成がＺ−Ｎleよりはむ
しろFmoc−ノルロイシンを包含し、追加のアミノ酸Ac-C
ys(Acm) をＮ末端アミノ酸として使用されること以外、
実施例１の方法と同一である。従って、直線形ペプチド
Ac-Cys(Acm)-Nle-Lys(Boc)-His(Trt)-Ile-Gly-Pro-Gly
-Arg(Mtr)-Ala-Phe は、市販の入手可能な Fmoc-Nle 及
びFmoc-Cys(Acm) を用いて製造された。この実施例１の
修正法は、Ｎ−末端 Ac-Cys(Acm)が望まれる場合の他の
ｃＰＮＤペプチド合成に適用される。

【０１２４】実施例９ ｃＰＮＤ９を産生するためのｃＰＮＤ１０の脱保護 Ａcm保護 Ac-Cys(Acm)は、アザントンイー.(Atherton
E.)等、ケム．ソク．パーキントランス．（Chem. Soc.
Perkin Trans.) Ｉ、２０５７（１９８５）に記載の方
法によりペプチドの遊離 Ac-Cys-SH（遊離スルフィドリ
ル（ＳＨ））形態へ転化される。この方法は、ボロアセ
チル化又はマレイミド化タンパク質又はポリサッカライ
ドのようなチオフィリック剤との結合製造において、ペ
プチドのＡcmチオール保護の除去に適用できる。ｃＰＮ
Ｄ１０の一部を１０％水性酢酸に溶解し、水銀トリフル
オロアセテート（１０倍過剰）で処理した。pHを４に再
び調節し、溶液を室温で攪拌しつつ、Ｓ−Ａcm基の開裂
を逆相ＨＰＬＣでモニターした。反応が終了したと判断
したとき、溶液を硫化水素ガスで飽和した。硫化水銀
（II）沈殿を遠心により除去し、ｃＰＮＤ９をＲＰ−Ｈ
ＰＬＣにより精製した。ｃＰＮＤ９の構造及び純度を、
ＦＡＢ−ＭＳ、分析的ＨＰＬＣ及びアミノ酸分析により
確認した。

【０１２５】実施例７〜２６ 実施例６〜９及び１９〜２０の方法に従って合成された
ｃＰＮＤペプチド ｃＰＮＤ７、ｃＰＮＤ８、ｃＰＮＤ９、ｃＰＮＤ１０、
ｃＰＮＤ３１及びｃＰＮＤ３２の合成についてそれぞれ
実施例６〜９において上記に、実施例２５〜２６におい
て以下に確立した方法は、いずれの実質的修正を加える
ことなく適用される。但し、多くの異なる分離体からの
合成ＰＮＤペプチドの環形態の合成において、ペプチド
一次配列及び適切な保護基の介在の変更は別とする。従
って、これらの方法により合成される以下の全てのペプ
チドは、必要に応じてＮ−末端脱保護され、−ｒ−を介
して結合され本発明の結合体を形成する。

【化５０】

【化５１】

【化５２】

【０１２６】実施例２５ ｃＰＮＤ３１の合成 Fmoc-Phe−ワング樹脂２ｇ（０．６ミリ当量／ｇ）を、
ＡＢＩ４３１Ａ合成機に入れた。Fmoc単一カップリング
実験を、Fmoc-Ala、Fmoc-Arg(Tos) 、Fmoc-Pro、Fmoc-Il
e、Fmoc-His(Trt) 、Boc-Lys(Fmoc) 及びCbz-Nle を加
えて行い、以下の配列を有する直線形ペプチド樹脂３．
７ｇを生成した。 Boc-Lys(Nε-Z-Nle)-His(Trt)-Ile-Gly-Pro-Gly-Arg(Tos)-Ala-Phe

【０１２７】ペプチドを、９５％ＴＦＡ、５％水で２時
間処理することにより樹脂から開裂させた。樹脂をロ過
により除去し、ＴＦＡを真空下蒸発によりロ液から除去
し、残渣をジエチルエーテルとともに粉砕した。沈殿を
ロ過により回収し、乾燥させて、配列 H-Lys(Nε-Z-Nl
e)-His-Ile-Gly-Pro-Gly-Arg(Tos)-Ala-Pheを有する直
線形ペプチド１．７ｇを得た。

【０１２８】ペプチドをＤＭＦ（１０ml）中Ｂoc−イソ
グルタミン−ＯＮｐ（０．７１ｇ、２ナノモル）及びＤ
ＩＥＡ（０．３５ml、２ミリモル）で、室温下一晩処理
した。ＤＭＦを蒸発させ、残渣をジエチルエーテルで処
理した。沈殿をロ過により回収し、酢酸エチルで洗浄し
た。乾燥させたペプチド（１．９ｇ）をＴＦＡ（１００
ml）で５時間処理した。ＴＦＡを真空下蒸発させ、残渣
をジエチルエーテルとともに粉砕し、沈殿をロ過により
回収し、乾燥させた。

【０１２９】ペプチドを、溶離剤として１０％水性酢酸
を用いるセファデックスＧ−１０により脱塩した。ペプ
チド分画を凍結乾燥させ、H-イソGln-Lys(Nε-Z-Nle)-H
is-Ile-Gly-Pro-Gly-Arg(Tos)-Ala-Pheを１．２ｇ
（０．７９ミリモル）を得た。

【０１３０】ペプチドの２バッチ（０．５５ｇ、０．３
６ミリモル）を別々に、１０００ml氷冷ＤＭＦ及びＤＩ
ＥＡ（０．１６ml、０．９ミリモル）に溶解し、ＤＰＰ
Ａ（０．１２ml）を加え、溶液を一晩室温で攪拌した。
ＤＭＦを真空下蒸発させ、残渣を合体し、CHCl₃ におい
て可溶化された。有機分画を５％水性クエン酸で洗浄
し、次いでMgSO₄ 上で乾燥させ、蒸発させてクルード環
状ペプチド０．７８ｇを得た。この材料を、アニソール
（１ml）を含む液状ＨＦ（１０ml）で２時間０℃で処理
した。ＨＦを蒸発させ、残渣を逆相ＨＰＬＣ（ヴィダッ
クＣ−１８、０〜５０％ CH₃CN、緩衝液として０．１％
水性ＴＦＡを用いて５０分にわたって）勾配溶出により
精製し、純粋なｃＰＮＤ３１（２５０mg）を得た（Ｍ＋
Ｈ＝１２０４）。

【化５３】

【０１３１】実施例２６ ｃＰＮＤ３２の合成 環化された直線形ペプチドがH-イソGln-Lys(N ε-Z-Nl
e)-Gln-Arg(Tos)-Gly-Pro-Gly-Arg(Tos)-Ala-Phe の構
造を有すること以外ｃＰＮＤ３１の合成について実施例
２０のものと基本的に同様の方法を用いた。

【化５４】

【０１３２】Ｂ．中間体活性化、結合体形成及び免疫学
的分析の実施例 実施例２７ ＯＭＰＣのＮ−（ブロモアセチル）−６−アミノカプロ
ン酸誘導体（ＢｒＡｃ−６−ＡＣＡ−ＯＭＰＣ）の製造 ＯＭＰＣ溶液（１０ml、５９mg／ml）を、４℃２時間４
３Ｋrpm で遠心した。ペレットを、pH９コルソフ（Kolt
hoff) 緩衝液６ml中でダウンス（Dounce) ホモジナイザ
ーと用いて再懸濁させ、Ｎ−（ブロモアセチル）−６−
アミノカプロン酸ｐ−ニロトフェニルエステル溶液（８
５mg／mlアセトニトリル）１mlを加えた。得られた混合
物を４５時間攪拌した。不溶性材料を低速遠心により、
ペレット化し、上澄を次いで４℃２時間４３Ｋrpm で遠
心した。ペレットをH₂O １０mlに再懸濁し、４３Ｋで４
℃２時間再び遠心した。このペレットをH₂O １０mlに再
懸濁し、ＢｒＡｃ−６−ＡＣＡ−ＯＭＰＣを得た。アミ
ノ酸分析により２６８ナノモル／mlの−６−アミノカプ
ロン酸及び１９６ナノモル／mlのリシンが示された。タ
ンパク質濃度は、２．４mg／ml（４１％回収）であっ
た。ブロモアセチル化能をアッセイするために、この溶
液１mlをＮ−アセチルシステアミン３０μｌとともにpH
８でインキュベートした。過剰の試薬を除去するための
透析の後、溶媒を蒸発させ標題化合物を得た。サンプル
のアリコートを酸加水分解し、ＡＡアッセイによりアッ
セイし、５４ナノモル／mlのＳ−カルボキシメチルシス
テアミン及び１４０ナノモル／mlのリシン（ＳＣＭＣ／
lys ＝０．３８）を明らかにした。これは、リシンの３
８％がブロモアセチル化部分であることを示している。

【０１３３】実施例２８ ＰＲＰのシスタミン（ビス−２−アミノエチルジスルフ
ィド）誘導体（ＰＲＰ−ｃｙｓ−ＮＨ₂)の製造 ＰＲＰのテトラブチルアルミニウム塩（３００mg）を、
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１１mlに溶解した。次
いで、カルボニルジイミダゾール３０mgを加え、溶液を
室温（r.t.) で１時間攪拌した。ＤＭＦ溶液を次いで、
シスタミンジヒドロクロリドのチルド（氷）溶液（４５
０mg／１０ml H₂O、pHをNaOHで１０．３に調節）へ攪拌
しながら加え、攪拌を氷浴中１５分間継続した。次いで
溶液を氷浴から取り出し、透析バッグへ移した後、室温
で４５分間エージングした。次いで、連続して変更する
緩衝液に対する透析を行った。緩衝液は以下のごとく変
更される。 （ａ）４リットル pH ７、 0.1M PO₄ 、4.2 時間 （ｂ）４リットル pH ７、 0.01M PO₄、８時間 （ｃ）４リットル pH ７、 0.01M PO₄、１６時間 （ｄ）１６リットル、H₂O 、８時間

【０１３４】凍結乾燥により標題化合物、ＰＲＰのシス
タミン誘導体、１５０mgを得た。この材料のＮＭＲによ
りＰＲＰのシスタミン誘導体化を確認した。３ppm （CH
₂ −Ｓ）に中心をおく２つのメチレン共鳴と、配糖体プ
ロトン（５．１ppm)又は全ＰＲＰプロトン総和とを比較
することにより、１００リボシル−リビトールホスフェ
ート部分当たり４８シスタミン部分の平均値（すなわち
ＰＲＰ単量体単位）を計算した。

【０１３５】実施例２９ ＰＲＰ−ＳＨを産出するためのＰＲＰ−ｃｙｓ−ＮＨ₂
の還元 pH８の緩衝液（ＰＯ₄ ０．０１Ｍ、ＥＤＴＡ０．００５
Ｍ＝緩衝液Ａ）へ、ＰＲＰ−ｃｙｓ−ＮＨ₂ （製造につ
いては実施例２８参照）４０mgを加えた。完全に溶解
（１５分）した後、固体ジチオトレイトール（ＤＴＴ）
４２mgを加えた。混合物を脱気し、窒素化し、室温で
４．５時間エージングした。溶液を次いで透析チューブ
に移し、以下のごとく緩衝液を変更させて、透析を行っ
た。 １）４リットル緩衝液Ａ、１６時間 ２）４リットル緩衝液Ａ、７．２５時間 ３）１リットル、pH８、０．１M PO₄ 緩衝液、ＥＤＴＡ
０．００５（緩衝液Ｂ）、１７時間この時点で、溶液の
エルマン（Ellman) アッセイを行い、チオールタイター
２．０４ミリモルＳＨ／ml、及びそれ故、７．５ml容量
について全量１５．３ミリモルの標題ＰＲＰ−ＳＨが示
された。

【０１３６】実施例３０ ＰＮＤ１４２−ＰＲＰ−ＳＨを産出するためのブロモア
セチル化ＰＮＤ１４２（ＢｒＡｃ−ＹＮＫＲＫＲＩＨＩ
ＧＰＧＲＡＦＹＴＴＫＮＩＩＧＴ−ＯＨ）とＰＲＰ−Ｓ
Ｈの反応 実施例２９にて製造されたＰＲＰ−ＳＨ溶液へ、１５．
３mgブロモアセチル化ＰＮＤ１４２を加えた（トリスト
リフルオロアセテート塩の分子量＝３２６８、概算４．
７μモル、ペプチドへのＮ−（ブロモアセチル）−６−
アミノカプロン酸Ｐ−ニトロフェニルエステル添加及び
逆相ＨＰＬＣでのブロモアセチル化ペプチドの再単離に
よる試薬の除去により、ブロモアセチル化された）。混
合物を脱気し、６．２５時間シエークした。この時点で
エルマンズアッセイによるＳＨタイターは、１．２μモ
ルにまで減じられた。pHを５ノルマル NaOH で９．０１
へ調節し、溶液を、さらに１６時間エージングした。こ
の時点でのエルマンアッセイにより、ＳＨ７．９μモル
のロスがあることが示された。溶液１００μｌをＡＡア
ッセイ法によりアッセイし、ml当たりＳ−カルボキシメ
チル−システアミン（ＳＣＭＣ）２１３ナノモル（すな
わち結合ペプチド）を有することを見い出した。１００
μｌをリボースについてアッセイし、３．１８mgＰＲＰ
／mlの濃度を測定した。従って標題化合物は、６７ナノ
モル（０．０６７ミリモル）ペプチド／mgＰＲＰ（又
は、分子量２９２６、ＰＦ＝０．１９６mgペプチド／mg
ＰＲＰを用いて）を含んでいる。

【０１３７】実施例３１ ＰＮＤ１４２−ＰＲＰ−ＯＭＰＣの産出するためのブロ
モアセチル化ＯＭＰＣとＰＮＤ１４２−ＰＲＰ−ＳＨの
反応 ＢｒＡｃ−ＡＣＡ−ＯＭＰ（５．５ml、２．４mgタンパ
ク質／ml）の溶液を、実施例３０で製造されたペプチジ
ル化、チオール化ＰＲＰ溶液、ＰＮＤ１４２−ＰＲＰ−
ＳＨへ加えた。pHを７．９８とし、溶液を窒素下１．５
時間室温でエージングした。この時点でのエルマンアッ
セイにより、４μモルのＳＨ（初期全量７．４μモルＳ
Ｈ）が残存することが示された。「キャップ」、これら
の残基の反応性部位へ、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥ
Ｍ）４mgを加え、溶液を２１時間エージングした。溶液
を次いでポリカーボネート遠心管へ移し、H₂O で頂部を
おおい、４℃２時間４３，０００rpm で遠心した。ペレ
ットを、ダウンス組織ホモジナイザーを用いて、H₂O １
０mlに再懸濁した。上記条件での再遠心の後、ペレット
をH₂O ６．５mlに再懸濁した。ロウリー（Lowry)アッセ
イにより、１．４mgタンパク質／mgを示し、リボースア
ッセイにより、６２．６μｇＰＲＰ／mlを示し、ＧＦ＝
０．０４４７を生じた。このＧＦ及び実施例３０で得ら
れたＰＦを用いて、標題化合物における（ＰＦ×ＧＦ）
＝ＥＬＦ＝０．００８８mgペプチド／mgタンパク質を得
る。

【０１３８】実施例３２ ＰＮＤ１３５−ＰＲＰ−ＳＨを産出するためのブロモア
セチル化ＰＮＤ１３５（ＢｒＡｃ−ＮＮＴＲＫＳＩＲＩ
ＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫＩＧＮ−ＯＨ）とＰＲＰ−
ＳＨの反応 ＰＲＰ−ｃｙｓ−ＮＨ₂ の反応を、実施例２９と同様の
方法で行った。エルマンタイターは、４．２μモルＳＨ
／mlを示し、８．７ml中全量３６．６μモルＳＨを生じ
た。約２５．８mgのブロモアセチル化ＰＮＤ１３５
（７．５μモル、分子量２８７５、概算ペンタトリフル
オロアセテート、３５００）を、上記チオール化ＰＲＰ
溶液へ加えた。溶液を脱気し、８時間エージングした。
この溶液１００μｌをＡＡアッセイにより分析し、０．
３００μモルのＳ−カルボキシメチル−システアミン／
mlを含むことを見い出した。分離１００μｌアッセイに
より、３．３mgＰＲＰ／mlの存在を示した。これは９１
ナノモルペプチド／mgＰＲＰファクターを与え又は分子
量２８７５を用いて、０．８６２５mgＰＥＰ／mlを生ず
る。従って、ＰＦは、標題化合物において、０．２６１
mgペプチド／mgＰＲＰである。

【０１３９】実施例３３ ＰＮＤ１３５−ＰＲＰ−ＯＭＰＣを産出するためのブロ
モアセチル化ＯＭＰＣとＰＮＤ１３５−ＰＲＰ−ＳＨの
反応 実施例３２において製造された溶液を、０．２μｍフィ
ルタを通して、無菌ロ過し、次いで、１２mlのＢｒＡｃ
−ＡＣＡ−ＯＭＰＣ溶液（ロウリーアッセイにより２．
７mgタンパク質／ml）へ加えた。脱気後、溶液を４４時
間エージングし、次いで、０．５mlのpH８ PO₄緩衝液中
ＮＥＭ５mgで処理することによりキャップした。溶液
を、４℃で２時間４３Ｋrpm で遠心した。ペレットをH₂
O ２０mlに再懸濁し、遠心工程をくり返した。最終ペレ
ットを、H₂O １２mlに再懸濁した。ロウリータンパク質
アッセイにより、１．７mgＰＲＯ／mlが示され及びリボ
ースアッセにより０．１６７mgＰＲＰ／mlが示され、Ｇ
Ｆ＝０．０９８２を生じた。このＧＦ及び実施例３２で
得られたＰＦを用いて、生成物（ＰＦ×ＧＦ）が、標題
化合物においてＥＬＦ＝０．０２５６mgペプチド／mgタ
ンパク質を生じた。

【０１４０】実施例３４ ＰＮＤ１３５−１８−ＰＲＰ−ＳＨを産生するための、
ブロモアセチル化ＰＮＤ１３５−１８（ＢｒＡｃ−ＲＩ
ＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫＩＧＮ）とＰＲＰ−ＳＨの
反応 ＰＲＰ−ＳＨ溶液（pH８）と、ＰＲＰ−ｃｙｓ−ＮＨ₂
５１mgから実施例２９のごとく調製し、エルマンアッセ
イによりＳＨ（全体）１８．４μモルを得た。これに、
ＢｒＡｃ−ＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫＩＧＮ−Ｏ
Ｈを加え、溶液を１８．５時間エージングした。少量の
沈殿を低速遠心により除去し、溶液を０．２ミクロンフ
ィルターを通してロ過した。この溶液は、３μモルＳＨ
のチオールタイター（全体）を有し、約１５μモルのチ
オールのロスを示した。この溶液１００μｌをリボース
アッセイし、１．６６mgＰＲＰ／mlのタイターを得た。
他の１００μｌアリコートとＡＡ分析によりアッセイ
し、０．１９５μモル／mlのＳＣＭＣ濃度を得た。これ
により、０．１１７マイクロモルペプチド／mgＰＲＰの
ファクターを得た。分子量２０６１を用いて、ＰＦ＝
０．２４２mgのペプチド／mgＰＲＰを得た。

【０１４１】実施例３５ ＰＮＤ１３５−１８−ＰＲＰ−ＯＭＰＣを産生するため
のブロモアセチル化ＯＭＰＣとＰＮＤ１３５−１８−Ｐ
ＲＰ−ＳＨの反応 実施例３４からのロ過溶液へ、Ｂｒ−ＡＣＡ−ＯＭＰＣ
（２．４mg／ml）４．５mlを加えた。次いで溶液を脱気
し、５２時間室温でエージングした。次いでＮＥＭ４．
７mgを加え、さらに１６時間つづけてエージングした。
次いで溶液をH₂O で２０mlに希釈し、４℃２時間４３，
０００rpm で遠心した。ペレットをH₂O１０mlに再懸濁
させ、２時間４℃下４３，０００rpm で再び遠心した。
ペレットをH₂O ６．５mlに懸濁させ、リボース及びタン
パク質についてアッセイした。０．１１５mg／mlＰＲＰ
及び０．８７３mg／mlタンパク質の値が得られ、ＧＦ＝
０．１３２mgＰＲＰ／mgＯＭＰＣを生じた。実施例３４
からのＰＦ＝０．２４２を用いて、ファクター（ＰＦ×
ＧＦ）＝ＥＬＦ＝０．０３１９mgＰＥＰ／mgＯＭＰＣを
得た。

【０１４２】実施例３６ ＰＮＤ１３５−１２−ＰＲＰ−ＳＨを産出するための、
ブロモアセチル化ＰＮＤ１３５−１２（ＢｒＡｃ−ＲＩ
ＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴ−ＯＨ）とＰＲＰ−ＳＨの反応 ＰＲＰ−ＳＨ溶液（pH８）を、１６．５mgＰＲＰ−ｃｙ
ｓ−ＮＨ₂ で出発して、実施例２９のごとく調製し、エ
ルマンアッセイにより全ＳＨ１４．４μモルを得た。こ
の溶液（約５ml）へ、ブロモアセチル化ＰＮＤ１３５−
１２、（ＢｒＡｃ−ＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴ）１１．
２mgを加えた。混合物を脱気し、室温で６時間エージン
グした。この時点でのエルマンアッセイにより、残存Ｓ
Ｈ７．８μモルが示された。１００μｌＡＡ分析アッセ
イにより、共有結合ペプチド（ＳＣＭＣ）０．１４６μ
モル／mlの存在が示された。ペプチドについての分子量
１．３３８を用いて、この値を０．１９５３mgＰＥＰ／
mlに変更した。リボースアッセイにより、ＰＲＰ３．３
mg／mlの存在が示され、標題化合物におけるＰＦ＝０．
０５９２mgＰＥＰ／mgＰＲＰを得た。

【０１４３】実施例３７ ＰＮＤ１３５−１２−ＰＲＰ−ＯＭＰＣを産出するため
の、ブロモアセチル化ＯＭＰＣとＰＮＤ１３５−１２−
ＰＲＰ−ＳＨの反応 実施例３６からのロ過溶液へ、Ｂｒ−ＡＣＡ−ＯＭＰＣ
（pH７．８）４．５mlを加えた。溶液を脱気し、室温で
８７時間エージングし、その後ＮＥＭ６mgを加え、室温
で２４時間さらに継続してエージングした。次いで混合
物を遠心管に移し、H₂O でトッピングし、４℃２時間４
３，０００rpm で遠心した。ペレットをH₂O ５mlに再懸
濁し、タンパク質についてアッセイし（ロウリー）、
２．９mgＯＭＰＣ／mlの値を得た。リボースアッセイに
より、ＰＲＰ０．２０２mg／mlが示され、計算によりＧ
Ｆ＝０．０６９７mgＰＲＰ／mgＯＭＰＣを得た。このＧ
Ｆ及び実施例３６で得られたＰＦを用いて、生成物（Ｐ
Ｆ×ＧＦ）＝ＥＬＦ＝０．００４１mgＰＥＰ／mgＯＭＰ
Ｃが標題化合物について得られた。

【０１４４】実施例３８ ＰＮＤ１４２−ＰＲＰ−ＯＭＰＣ又はＰＮＤ１３５−Ｐ
ＲＰ−ＯＭＰＣ結合体の動物への接種のための実験 ミゥウバンを、一連の接種の際のアジュバントとして用
いた。接種物を生理食塩水に、ＰＮＤ１４２−ＰＲＰ−
ＯＭＰＣ又はＰＮＤ１３５−ＰＲＰ−ＯＭＰＣ結合体を
該結合体最終濃度が３００μｇ／mlとなるように溶解す
ることにより調製した。前もって形成したミョウバン
（水酸化アルミニウムゲル）を、５００μｇ／mlアルミ
ニウムの最終レベルまで溶液へ加えた。結合体を、室温
で２時間ミョウバンゲルに吸着させた。吸収後、結合体
を有するゲルを生理食塩水で２回洗浄し、タンパク質濃
度が３００μｇ／mlになるまで食塩水に再懸濁させた。
アフリカ緑ザルのそれぞれに、ミョウバンへ吸着された
ＰＮＤ１４２−ＰＲＰ−ＯＭＰＣ結合体３００μｇ３回
投与量又は、ＰＮＤ１３５−ＰＲＰ−ＯＭＰＣ結合体１
００μｇ３回投与量を接種した。各投与物を筋肉内注射
した。投与は１ケ月ごとに行なった（０、４、８週）。
動物を２週間間隔で採血した。血清サンプルを各血液か
ら調製し、以下の実施例に記載されるように、特異的抗
体の発生についてアッセイした。

【０１４５】実施例３９ 抗−ペプチドＩｇＧ抗体についての血清分析 各血清サンプルを、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩ
ＳＡ）により分析した。ポリスチレンミクロタイタープ
レートを、ウェル当たりリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）中合成ペプチド（ＰＲＰ−ＯＭＰＣへ結合していな
い）０．５μｇで４℃下コートした。次いで各ウェルを
０．０５％トウィーン２０（ＰＢＳ−Ｔ）を含むＰＢＳ
で洗浄した。ＰＢＳ−Ｔ中に順次希釈された試験血清
を、ペプチド含有ウェルへ加え、吸着ペプチドと３６℃
で１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔでの洗浄後、アルカリ
ホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧを試験ウェルに加
え、３６℃で１時間反応させた。各ウェルは、０．５mM
MgCl₂ ・６H₂O を含有する１０％ジエタノールアミン
pH９．８を受けた。続いて起こる反応が室温で３０分進
行し、その時点で３．０Ｎ NaOHの添加により終了され
た。ペプチド基質と試験血清中の抗体との相互作用の増
大は、ウェル上に結合したアルカリホスファターゼの量
としてとらえることができる。ホスファターゼ酵素は、
波長４０５nmの光を吸収する分子物質へのｐ−ニトロフ
ェニルホスフェートの分解を成立させる。従って、ＥＬ
ＩＳＡ反応の終了時点での４０５nmの光の吸光度とペプ
チド結合抗体の量の間には直接的関連性が存在してい
る。ＰＥＰ−ＰＲＰ−ＯＭＰＣ（ＰＮＤ１４２−ＰＲＰ
−ＯＭＰＣ又はＰＮＤ１３５−ＰＲＰ−ＯＭＰＣ）を接
種された全てのサルが、ペプチドに特異的に結合できる
抗体を生じさせた。

【０１４６】実施例４０ ＨＩＶ感染性を特異的に中和する活性についての血清分
析 ウイルス中和活性を、ロバートソン等、ジェー．バイオ
ル．メソッド（J. Virol. Methods)２０；１９５〜２０
２（１９８８）に記載のアッセイにより測定した。その
アッセイにより、試験血清における特異的ＨＩＶ中和活
性が測定される。そのアッセイは、ＭＴ−４細胞（ヒト
Ｔ−リンパ細胞系）がＨＩＶへ容易に感染すること、及
びウイルス複製の期間後に感染の結果として殺されるこ
とを観察することに基づく。

【０１４７】試験血清を、アッセイ前６０分間５６℃で
処理した。この処理は、ＨＩＶ複製の非特異的インヒビ
ターを除くために必要である。ＲＰＭＩ−１６４０細胞
培地に順次希釈された熱処理血清を、ＨＩＶの標準感染
量と混合した。この量は、７〜８日後にアッセイ培地中
のＭＴ−４細胞の全てを殺すのに必要なウイルスの最少
量を含むように、アッセイ前に決定されている。血清−
ウイルス混合物を、３７℃で１時間、相互作用させた。
次いで、それを、１０％ウシ胎児血清で補足されたＲＰ
ＭＩ−１６４０増殖培地に懸濁された１．０×１０⁵ Ｍ
Ｔ−４細胞へ加えた。培地を、５％ＣＯ₂ 雰囲気下で７
日間３７℃で培養した。

【０１４８】培養の終了時点で、代謝染料ＤＴＴを各培
地に加えた。この染料は、視覚的検査では黄色である。
生細胞の存在下では、この染料は、視覚的に青色を生ず
る分子種に対して代謝的に処理される。中和ＨＩＶは、
標的ＭＴ−４細胞においては複製できない。従って、細
胞を殺すことはない。それ故に、ポジティブな中和は、
代謝染料の添加による青色の発生により評価される。Ｐ
ＮＤ１４２−ＰＲＰ−ＯＭＰＣ又はＰＮＤ１３５−ＰＲ
Ｐ−ＯＭＰＣ結合体を接種された全てのサルは、特異的
ＨＩＶ感染−中和活性を生じた。

【０１４９】実施例４１ ｃＰＮＤ９−ＰｎＰｓ６Ｂ−ＯＭＰＣの製造

【化５５】 ＰｎＰｓ６Ｂ（ｎ−Ｂｕ４Ｎ＋）：ＰｎＰｓ６Ｂ（４８
４mg）を蒸留水（４８ml）に溶解し、溶液を、全ての固
体が溶液状になるまで、磁気攪拌した（１．５時間）。
多糖を溶解する一方で、カラム（２０mm）を、ドウェッ
クス（Dowex)５０×２（ｎ−Ｂu₄Ｎ⁺ ) イオン交換樹脂
３０mlで満たし、レジンベッドを水で１．５時間洗浄し
た。粘性多糖溶液を、洗浄された樹脂へ加え、重力によ
りベッドを通過させた（１６時間）。カラムを水（８m
l）で洗浄し、合体した溶出物を凍結乾燥して、淡黄色
固体８００mgを得た。これをP₂O₅上での真空デシケータ
ー（５０mmHg、６０時間）内で乾燥させた。この方法に
より、乾燥ＰｎＰｓ６Ｂテトラ−ｎ−ブチルアンモニウ
ム塩、ＰｎＰｓ６Ｂ（ｎ−Ｂｕ４Ｎ＋）５６４mgを得
た。

【０１５０】ＰｎＰｓ６Ｂ−ＢｕＡ₂ ：ＰｎＰｓ６Ｂ
（ｎ−Ｂu₄Ｎ⁺ ) （１４０mg）をジメチルスルホキシド
（５ml）に溶解し、１５分間磁気攪拌し、この時点で、
固体全てが溶液化した。この混合物へ１，１′−カルボ
ニルジイミダゾール（１５mg）を一度に加え、反応物を
室温で８０分攪拌した。分離フラスコで、水（５ml）中
ブタンジアミンジヒドロクロリド（BuA₂・２HCl 、３４
４mg）の溶液を、２．５Ｎ NaOH を加えて塩基性（pH１
０．２）とし、次いで０℃へ冷却した。この冷却混合物
へ、ゆっくりした安定した流れで、活性化多糖を加え、
得られた溶液を０℃で３０分攪拌した。反応混合物を室
温まで加温し、さらに１時間攪拌し、その後透析管（２
ml／cm）へ移し、以下に対して４℃下透析した。 ４リットル0.1 Ｍ pH 7.0 HPO₄ 緩衝液、５時間 ４リットル0.01Ｍ pH 7.0 HPO₄ 緩衝液、１５時間 ４リットル0.01Ｍ pH 7.0 HPO₄ 緩衝液、９時間 ４リットル蒸留水（H₂O)、１５時間 透析管の内容物を凍結乾燥し、白色固体を得、これをP₂
O₅上でのデシケーターにおいて一晩（１６時間）乾燥さ
せ、ＰｎＰｓ６Ｂ−ブタンジアミン（ＰｎＰｓ６Ｂ−Ｂ
ｕＮ₂ ）を得た。この材料のＮＭＲ（３００ＭHz、D₂O
）により、ブタンジアミンの５０％ローディング（５
０ＢｕＡ₂ 単位／１００６Ｂモノマー単位）が達成され
ていることを明らかにした。パーセントローディング
は、ラムノースメチルプロトンに対するブタンジアミン
メチレンプロトンの総和を比較することにより決定され
た。

【０１５１】ＰｎＰｓ６Ｂ−ＢｕＡ₂ −ＢｒＡｃ：６Ｂ
−ＢｕＡ₂ （９４mg）をpH９．０４のコルソフ（Koltho
ff) 緩衝液に溶解し、混合物を３０分磁気攪拌し、溶液
化した。この水溶液へ、アセトニトリル（１ml）中ｐ−
ニロトフェニルブロモアセテート（９４mg）よりなる混
合物を加え、反応物を冷却室（４℃）において一晩（２
２時間）攪拌した。得られた粘性黄色溶液を透析管（２
ml／cm）へ移し、以下に対して４℃下透析した。 １５リットル蒸留H₂O 、２３時間 ４リットル蒸留H₂O 、２３時間 透析バッグの内容物を、溶液として保存した。この溶液
１mlを凍結乾燥し、白色固体のＰｎＰｓ６Ｂ−ＢｕＡ₂
−ＢｒＡｃ３．５mgを得た。この材料のＮＭＲ（３００
ＭHz、D₂O ）により、ブタンジアミンのローディングが
２８％であることが示された。この値と初期に得られた
もの（ＰｎＰｓ６Ｂ−ＢｕＡ₂ において）の間の不一致
は、凍結乾燥材料の全ては溶液状にもどらない故に、溶
解度の問題によるものであり得る。

【０１５２】ＰｎＰｓ６Ｂ−ｃＰＮＤ９：水性ＰｎＰｓ
６Ｂ−ＢｕＡ₂ −ＢｒＡｃ（１１ml、約３８．５mg）
を、以下の環状ペプチド（８．５mg、６．９μモル、分
子量１２２１）を含むびんへ加えた。

【化５６】 得られた溶液（２００μｌサンプル）について、エルマ
ン試験をただちに行い、３．３μモルのＳＨタイター
（ＯＤ₄₁₂ ＝０．２７０）が示された。反応混合物を１
５ml遠心管に移し、脱気し、窒素でおおい、次いで室温
で５時間タンブルした。反応混合物を透析管（２ml／c
m）に移し、４リットル蒸留水（４℃、２３時間）に対
して透析した。透析管に含まれる溶液１mlを除去し、凍
結乾燥した。残り（１３．５ml）の溶液のpHを、乾燥し
たpH８のHPO₄緩衝塩（１８０mg）の添加及び数滴の５Ｎ
NaOH の添加により、pH８．３に調節した。このpH調節
溶液をチオール化ＯＭＰＣとの結合のために使用した。

【０１５３】ｃＰＮＤ９−ＰｎＰｓ６Ｂ−ＯＭＰＣ：滅
菌ＯＭＰＣ（１０ml、約４５mg）を、超遠心（４℃〜２
０℃、４３Krpm、１．５時間）によりペレット化した。
ペレットを、以下で構成される滅菌ロ過（ミリポアミレ
ックス（Millipore Millex) −ＧＶ０．２２μｍ滅菌フ
ィルター）チオール化混合物６mlに再懸濁した。pH１１
ホウ酸塩緩衝液（１０ml）中ホモシステインチオラクト
ンヒドロクロリド（８６mg）、エチレンジアミンテトラ
アセティックアシド２ナトリウム塩（８６mg）及びジチ
オトレイトール（１７mg）ペレットをホモジナイズし
（ダウンス）、滅菌１５ml遠心管へ移し、脱気し、窒素
でおおった。反応混合物を室温で一晩（２０．５時間）
タンブルし、次いで超遠心管へ移し、１Ｍ KH₂PO₄ でト
ッピングした。タンパク質をペレット化し（４℃、４３
Krpm、２時間）、０．１Ｍ HPO₄ 緩衝液（１０ml）に再
懸濁し、ホモジナイズし（ダウンス）、再びペレット化
した（４℃、４３Krpm、２時間）。滅菌タンパク質ペレ
ットを、ペプチド−多糖溶液との結合に直接使用した。

【０１５４】滅菌タンパク質ペレットを、滅菌ロ過（ミ
リポアミレックス−ＧＶ、０．２２μｍ滅菌フィルタ
ー）多糖−ペプチド溶液に再懸濁し、ホモジナイズした
（ダウンス）。エルマン試験を適当に行い、１５．３μ
モル（ＯＤ₄₁₂ ＝０．７３０）のＳＨタイターが示され
た。反応混合物を、滅菌１５ml遠心管に移し、脱気し、
窒素でおおい一晩（２１時間）エージングした。エルマ
ン試験により８．２μモル（ＯＤ₄₁₂ ＝０．３９０）の
ＳＨタイターが示された。タンパク質を、以下で構成さ
れる滅菌ロ過（ミリポアミレックス−ＧＶ０．２２μｍ
滅菌フィルター）溶液１mlの添加によりキャップした。

【０１５５】pH８．０ HPO₄ 緩衝液（５ml）中Ｎ−エチ
ルマレイミド（７５mg）この混合物を室温で一晩（１６
時間）エージングした。エルマン試験は、明らかにネガ
ティブであった（ＯＤ₄₁₂ ＝０．０６６、ＳＨタイター
＝１．３８μモル）。滅菌されたキャップ結合体を、超
遠心（４℃、４３Krpm、２時間）でペレット化し、次い
で、滅菌H₂O(１０ml）に再懸濁し、ホモジナイズし、滅
菌プラスティック１５ml遠心管に保存した。以下のアッ
セイが行われた。 （使用溶液量）：ロウリータンパク質、１．５０mg／ml
（１００μｌ）；アミノ酸 分析；Ｎle＝２ナノモル／１００μｌ（１００μｌ） Ｎle濃度が、ペプチド分子量についての１２２１の換算
を用いるペプチド濃度と同一である故に、ＥＬＦは、上
記値から直接に計算される。従って、ペプチド濃度は、
０．０２４２mg／mlであると計算され、標題結合体につ
いて０．０１６１mgＰＥＰ／mgＯＭＰＣのＥＬＦを得
た。

【０１５６】実施例４２ 以下のｃＰＮＤ９−ＰＲＰ−ＯＭＰＣの製造

【化５７】 実施例４６におけるＰｎＰｓ６Ｂ−ＢｕＡ₂ −ＢｒＡｃ
と同様の方法で製造されたＰＲＰ−ＢｕＡ₂ −ＢｒＡｃ
（１７ＢｕＡ₂ −ＢｒＡｃ／１００ＰＲＰモノマー単
位）３３mgを、３．５ml pH８（０．１Ｍ PO₄) 緩衝液
に溶解した。溶液を脱気し、Ｎ₂ とエアー交換し、６．
９mgのｃＰＮＤ９を加えた。もし純粋であれば、これ
は、環状ペプチド（分子量１２２１）５．６５ミリモル
と一致する。しかしながら、エルマンアッセイは、１．
５μモルのみのＳＨの存在を示した。ペプチド−ＰＲＰ
溶液を７時間エージングし（エルマン＝０）、次いで４
リットルH₂O に対して１６時間透析した。アリコートを
凍結乾燥し、ＰＲＰへ結合したペプチドの存在につい
て、診断に役立つ、フェニル共鳴（７．２８及び７．４
３ppm ）を有するＮＭＲスペクトルを得た。ＯＭＰＣを
通常どおりＮ−アセチルホモシステインチオラクトンで
官能化し、チオール化ＯＭＰＣ（７．３５μモルＳＨ／
４５mgＯＭＰＣ出発ＯＭＰＣ＝０．１６３μモルＳＨ／
mg）を得た。チオール化タンパク質を、リン酸塩でpH８
へ初めに緩衝されたペプチジル化ＰＲＰ３mlに再懸し、
０．２２μ滅菌ミレックスＧＶフィルターを通してロ過
した。このＯＭＰＣ−ペプチジル化ＰＲＰ混合物を脱気
し、４１時間エージングした。この時点で、約５５％の
チオールタイターが残った。pH８の緩衝液中Ｎ−エチル
マレイミド（３１mg／３．５ml）の滅菌ロ過溶液０．６
mlを加え、反応混合物を２５時間エージングした。その
時点でチオールは存在しなかった。溶液をH₂O で１０ml
へ希釈し、４℃２時間４３，０００rpm で遠心した。ペ
レットをH₂O １０mlに再懸濁し、上記のように再び遠心
した。２回目の遠心からのペレットをH₂O ７mlに再懸濁
し、４℃で６０時間エージングした。低速（クリニカル
スピン）で少量の沈殿をペレット化した。上澄をＡＡ分
析によりアッセイし、ＳＣＭＨＣ／lys ＝０．０５５及
び０．００５６mgＰＥＰ／mlのペプチド濃度へ変換す
る。４．８ナノモル／mlのノルロイシン（Ｎle) 濃度
（ペプチドについての分子量として１２２１を用いて）
を明らかにした。プロティン（ロウリー）アッセイによ
り、０．８１０mg／mlの存在が示された。従って、ＥＬ
Ｆ＝標題結合体について０．００７２であった。

【０１５７】上記詳述は、説明のために記載された実施
例とともに、本発明の本質を教示するものであるが、本
発明の実施は、特許請求の範囲及びその同等の部分の範
囲内となるような通常の変更、適応、修正、又は削除の
すべてを包含するものと理解される。

【配列表】

配列番号 ：１ 配列の長さ：２６ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状又は環状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴： 特徴を表す記号：Modified-site 存在位置：Ｉ 他の情報：Ｎle 特徴を表す記号：Disulfide-bond 存在位置：２．．２６ 配列 Leu Cys Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala 1 5 10 15 Phe Tyr Thr Thr Lys Asn Ile Ile Gly Cys 20 ２５

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 15/14 7731−4Ｈ (31)優先権主張番号 ７１５２７７ (32)優先日 1991年６月19日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 リチャード エル．トルマン アメリカ合衆国，07059 ニュージャーシ ィ，ウォーレン，アッパー ウォーレン ウェイ 29 (72)発明者 エミリオ エー．エミニ アメリカ合衆国，19301 ペンシルヴァニ ア，パオリ，ファッグス マナー レーン ６

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 主ＨＩＶ中和決定（ＰＮＤ）ペプチド、
   あるいは免疫学的にそれと同等なペプチド（ＰＥＰ）を
   含み、そのペプチドが免疫原性の蛋白質あるいは複合蛋
   白質（ＰＲＯ）と陰イオン性ポリサッカライド（ＰＳ
   Ａ）リンカーを介して共有結合していることを特徴とす
   る複合体。
2. 【請求項２】 免疫原性蛋白質がNeisseria meningitit
   is bの外膜複合蛋白質（ＯＭＰＣ）であり、ＰＮＤペプ
   チドが線状構造、ジスルフィド結合した環状構造、アミ
   ド結合した環状構造、あるいはチオエーテル結合した環
   状構造を有することを特徴とする、請求項１記載の複合
   体。
3. 【請求項３】 ＰＮＤペプチドが下記の群 【化１】 から選択される配列を有することを特徴とする請求項２
   記載の複合体。
4. 【請求項４】 ＰＮＤペプチドがコアあるいはループア
   ミノ酸構造 −ｘ−Ｘ_n −Ｘ₁ −Ｘ₂ −ＧＰＧＲ−Ｘ₃ −Ｘ₄ −Ｘ_m −ｙ 〔式中−ＧＰＧＲ−は四量体−ＧｌｙＰｒｏＧｌｙＡｒ
   ｇ−であり、 Ｘ₁ は： ａ) セリン ｂ) プロリン ｃ) アルギニン ｄ) ヒスチジン ｅ) グルタミン ｆ) スレオニン Ｘ₂ は： ａ) イソロイシン ｂ) アルギニン ｃ) バリン ｄ) メチオニン Ｘ_n は単結合あるいは１５アミノ酸までのペプチドであ
   る。 Ｘ₃ は： ａ) アラニン ｂ) アルギニン ｃ) バリン Ｘ₄ は： ａ) フェニルアラニン ｂ) イソロイシン ｃ) バリン ｄ) ロイシン Ｘ_m は単結合あるいは１５アミノ酸までのペプチドであ
   る。−ｘ−および−ｙ−は互いに共有結合で一緒になっ
   て環状ペプチドを形成し、その環状ペプチドは陰イオン
   性ポリサッカライドを介してＰＲＯに共有結合してい
   る〕を有することを特徴とする請求項３記載の複合体。
5. 【請求項５】 ｘとｙの間の環共有結合構造が ａ) ループアミノ酸の片側にあるアミノ基と、ループア
   ミノ酸のもう一方の側にあるカルボキシル基とのあいだ
   でのアミド結合 ｂ) ループアミノ酸の両側にあるスルフヒドリル基を含
   むアミノ酸の間のキシレンチオエーテル結合あるいは低
   級アルキルチオエーテル結合 ｃ) ループアミノ酸の両側にあるスルフヒドリル基を含
   むアミノ酸の間のジスルフィド結合 のいずれかからなることを特徴とする請求項４記載の複
   合体。
6. 【請求項６】 構造IV 【化２】 〔式中：ＰＥＰは線状あるいは環状構造を有する共有結
   合したＨＩＶ ＰＮＤペプチドからなる：ＰＳＡは陰イ
   オン性ポリサッカライドからなる：ＰＲＯはNeisseria
   meningitidisの外膜複合蛋白質（ＯＭＰＣ）からなる：
   −ｒ−は共有結合を形成するスペーサーからなる：−Ｂ
   −は共有結合を形成するスペーサーからなる：ＰＦはＰ
   ＳＡ１mgあたりＰＥＰ０．００１−１０mgの範囲にある
   ペプチジル化ファクターである：ＧＦはＰＳＡ１mgあた
   りＰＥＰ０．００１−１０mgの範囲にあるグリコシル化
   ファクターである：ＥＬＦはＰＲＯ１mgあたりのＰＥＰ
   のmg数であらわしたエピトーブ負荷ファクターであって
   ０．００１−０．５mgＰＥＰ／mgＰＲＯの範囲にあ
   る。〕を有する複合体あるいは医薬的に許容されるその
   塩。
7. 【請求項７】 ＰＥＰが下記式 【化３】 〔式中ｒはＰＥＰとＰＳＡの間の連結部位である： Ｒ¹ は ａ) 単結合、または ｂ) １から５個のアミノ酸からなるペプチドであって、 アミノ酸分析スペクトル中２０個の天然アミノ酸とは離
   れた場所に移動するマーカーアミノ酸を一個含むことが
   できる。 Ｒ² は、 ａ) Ｒ³ が少なくとも２個以上のアミノ酸からなるペプ
   チドである場合、単結合あるいは１７個までのアミノ酸
   からなるペプチド： ｂ) Ｒ³ が単結合である場合は、２ないし１７個のアミ
   ノ酸からなるペプチド： Ｒ³ は ａ) Ｒ² が少なくとも２個以上のアミノ酸からなるペプ
   チドである場合、単結合あるいは１７個までのアミノ酸
   からなるペプチド： ｂ) Ｒ² が単結合である場合は、２ないし１７個のアミ
   ノ酸からなるペプチド： −ＧＰＧＲ−は四量体−ＧｌｙＰｒｏＧｌｙＡｒｇ−： Ｒ⁴ は、 ａ) Ｒ⁷ がＲ⁸ である場合、Ｒ⁷ がメチン炭素に結合し
   ている−ＮＨ−ＣＨ−ＣＯ−である、 ｂ) Ｒ⁷ が 【化４】 の場合、Ｒ³ からＲ⁷ およびＲ⁵ 間の単結合である： Ｒ⁵ は ａ) マーカーアミノ酸をふくむことができる１個ないし
   ５個のアミノ酸からなるペプチド、 ｂ) −ＯＨ、 ｃ) −ＣＯＯＨ、 ｄ) −ＣＯＮＨ₂ 、 ｅ) −ＮＨ₂ 、 ｆ) 存在しない、 のいずれかである。 Ｒ⁶ は ａ) Ｒ⁷ に対する任意の結合（．．．．．．．）が存在
   しない場合、通常のＬ−またはＤ−アミノ酸の側鎖から
   選択されるアミノ酸側鎖、 ｂ) Ｒ⁷ がＲ⁸ の場合、−Ｒ⁸ −Ｓ−Ｓ−または−Ｒ⁸
   −Ｓ−Ｒ⁸ −Ｒ⁹ −Ｒ⁸ −Ｓ−、または ｃ) Ｒ⁷ が 【化５】 の場合、−Ｒ⁸ −ＮＨ−である： Ｒ⁷ は ａ) −Ｒ⁸ − ｂ) −Ｃ＝Ｏまたは 【化６】 Ｒ⁸ は単結合あるいは１ないし８個の炭素の低級アルキ
   ルである： Ｒ⁹ は ａ) Ｒ¹⁰、または ｂ) キシレンである： Ｒ¹⁰は ａ) 低級アルキル、または ｂ) −ＣＨ₂ −Ｏ−ＣＨ₂ である： −Ｒ² −ＧＰＧＲ−Ｒ³ はＰＥＰコアあるいはループア
   ミノ酸構造である。〕に限定される請求項６記載の複合
   体。
8. 【請求項８】 ＰＥＰコアアミノ酸構造−Ｒ² −ＧＰＧ
   Ｒ−Ｒ³ が −Ｘ_n Ｘ₁ Ｘ₂ −ＧＰＧＲ−Ｘ₃ Ｘ₄ Ｘ_m − 〔式中−ＧＰＧＲ−は四量体−ＧｌｙＰｒｏＧｌｙＡｒ
   ｇ−である：Ｘ₁ はＲ² の構成体で下記から選ばれる： ａ) セリン ｂ) プロリン ｃ) アルギニン ｄ) ヒスチジン ｅ) グルタミン ｆ) スレオニン Ｘ₂ はＲ₂ の構成要素で下記から選ばれる： ａ) イソロイシン ｂ) アルギニン ｃ) バリン ｄ) メチオニン Ｘ_n はＲ² の構成要素であって単結合あるいは１５アミ
   ノ酸までのペプチドである。Ｘ₃ はＲ³ の構成要素であ
   って下記から選ばれる： ａ) アラニン ｂ) アルギニン ｃ) バリン Ｘ₄ はＲ³ の構成要素であって下記から選ばれる： ａ) フェニルアラニン ｂ) イソロイシン ｃ) バリン ｄ) ロイシン Ｘ_m はＲ³ の構成要素であって、単結合あるいは１５ア
   ミノ酸までのペプチドである。
9. 【請求項９】 ＰＥＰが構造 【化７】 【化８】 【化９】 【化１０】 【化１１】 〔式中ｒは複合体のペプチドと陰イオン性ポリサッカラ
   イドの間の連結位置である。ただしｃＰＮＤ３３はアミ
   ノ末端Ｎｌｅあるいは内部のリジン残基を介して結合さ
   れている〕を有するペプチドの１つまたはそれ以上から
   なる請求項８記載の複合体。
10. 【請求項１０】 ＰＥＰがアミド結合、チオエーテル結
    合あるいはウレタン結合のいずれかを介してポリサッカ
    ライドに結合している請求項９記載の複合体。
11. 【請求項１１】 ＰＳＡがＰＲＰ、ＰｎＰｓ６Ａ、Ｐｎ
    Ｐｓ６Ｂ、ＰｎＰｓ１０Ａ、ＰｎＰｓ１１Ａ、ＰｎＰｓ
    １８Ｃ、ＰｎＰｓ１９Ａ、ＰｎＰｓ２０、ＰｎＰｓ２２
    Ｆ、ＰｎＰｓ２３Ｆから選ばれる陰イオン性ポリサッカ
    ライドである、請求項１０記載の複合体。
12. 【請求項１２】 ポリサッカライドがＰＲＰまたはＰｎ
    Ｐｓ６Ｂからなり、ペプチドおよび蛋白質に下記のスペ
    ーサーの１つを介して共有結合しており、 【化１２】 蛋白質はNeisseria meningitidis bの外膜複合蛋白から
    なり、 ペプチドは下記のペプチド 【化１３】 【化１４】 【化１５】 【化１６】 【化１７】 〔式中ｒは複合体のペプチドと陰イオン性ポリサッカラ
    イドの間の連結位置である。ただしｃＰＮＤ３３はアミ
    ノ末端Ｎleあるいは内部のリジン残基を介して結合され
    ており、複合体はＰＲＰまたはＰｎＰｓ６Ｂ１mgあたり
    ペプチド０．００１−１０mg、ＯＭＰＣ１mgあたりＰＲ
    ＰまたはＰｎＰｓ６Ｂ０．００１−１０mg、全蛋白質１
    mgあたりのペプチドが０．００１−０．５mgの範囲にあ
    る。〕の１つまたはそれ以上からなるペプチド−ポリサ
    ッカライド−蛋白複合体。
13. 【請求項１３】 以下の構造の１つ、 【化１８】 【化１９】 〔式中−ｒ−と−Ｂ−は下記から選ばれ 【化２０】 ＰＳＡはＰＲＰまたはＰｎＰｓ６Ｂのどちらかである：
    ＰＦはＰＲＰまたはＰＮＰｓ６Ｂ１mgあたりのペプチド
    の質量比で、０．０１と１mgのあいだにある：ＧＦはＯ
    ＭＰＣ１mgあたりのＰＲＰまたはＰＮＰｓ６Ｂの重量比
    で、０．０１と０．３３mgのあいだにある。〕を有する
    ペプチド−ポリサッカライド−蛋白複合体。
14. 【請求項１４】 (a) ＰＥＰペプチドをＰＳＡに共有結
    合で連結し、 (b) ステップ（ａ）の生成物を免疫原性蛋白質ＰＲＯに
    結合させる、ことを特徴とする請求項１記載の複合体を
    作成する方法。
15. 【請求項１５】 以下の工程 （ａ−ｉ）ＰＥＰペプチドをチオール化試薬で誘導体と
    し、（ａ−ii) ＰＳＡをブロモアセチルドナーと反応さ
    せ、（ａ−iii)（ａ−ｉ）の生成物を（ａ−ii) の生成
    物と反応させ、（ｂ−１）ＰＲＯをチオール化剤で誘導
    体とし、（ｂ−ii) （ｂ−ｉ）の生成物を（ａ−iii)の
    生成物と反応させ、（ｂ−iii)（ｂ−ii）の生成物をＮ
    −アセチルシステアミンでキャップしてＰＳＡ上の残余
    のブロモアセチル部分を不活性化し、（ｂ−iv) 反応剤
    を含まない複合体を単離する、ことからなる請求項１４
    記載の方法。
16. 【請求項１６】 以下の工程 （ａ−ｉ）ＰＥＰペプチドをブロモアセチルドナーで誘
    導体とし、（ａ−ii) ＰＳＡをチオールドナーと反応さ
    せてチオール化ＰＳＡを調製し、（ａ−iii)（ａ−ii)
    の生成物と還元してＰＳＡ上に遊離のスルフヒドリル基
    を出現させ、（ａ−iv) （ａ−ｉ）の生成物を（ａ−ii
    i)の生成物と反応させ、（ｂ−１）ＰＲＯをブロモアセ
    チルドナーで誘導体とし、（ｂ−ii) （ｂ−ｉ）の生成
    物を（ａ−iv）の生成物と反応させ、（ｂ−iii)（ｂ−
    ii）の生成物をＮ−アセチルマレイミドでキャップして
    ＰＳＡ上の残余のブロモアセチル部分を不活性化し、
    （ｂ−iv) 反応剤を含まない複合体を単離する、ことか
    らなる請求項１４記載の方法。
17. 【請求項１７】 チオールドナーがＮ−アセチルホモシ
    ステイン−チオラクトンまたはシスタミンであり、ブロ
    モアセチルドナーがｐ−ニトロフェニルブロモアセテー
    トまたはＮ−（ブロモアセチル）−６−アミノカプロン
    酸 ｐ−ニトロフェニルエステルである、請求項１５記
    載の方法。
18. 【請求項１８】 チオールドナーがＮ−アセチルホモシ
    ステイン−チオラクトンまたはシスタミンであり、ブロ
    モアセチルドナーがｐ−ニトロフェニルブロモアセテー
    トまたはＮ−（ブロモアセチル）−６−アミノカプロン
    酸 ｐ−ニトロフェニルエステルである、請求項１６記
    載の方法。
19. 【請求項１９】 請求項１、請求項６、請求項１２また
    は請求項１３記載の複合体と不活性な担体を含む、ほ乳
    類に投与して抗ＰＮＤペプチド、抗ＨＩＶ、ＨＩＶ中和
    性免疫反応を高めるために有用な医薬組成物。
20. 【請求項２０】 請求項１、請求項６、請求項１２また
    は請求項１３記載の複合体のカクテルを含む医薬組成物
    であって、そのカクテルは異なるＰＮＤペプチドを１つ
    またはそのペプチド混合物を有する複合体群を作成し、
    これらの複合体を混合して作成する医薬組成物。
21. 【請求項２１】 請求項１、請求項６、請求項１２また
    は請求項１３記載の複合体のカクテルを含む医薬組成物
    であって、その複合体カクテルが生理的食塩水中水酸化
    アルミニウムゲルに吸着させたものである医薬組成物。
22. 【請求項２２】 請求項１、請求項６、請求項１２また
    は請求項１３記載の複合体からなる組成物の免疫的に有
    効な量を該ほ乳動物に投与し、場合によっては追加の複
    合体を投与して免疫反応を高めることができることを特
    徴とする、ほ乳類に投与して抗ＰＮＤペプチド、抗ＨＩ
    Ｖ、ＨＩＶ中和性免疫反応を高める方法。
23. 【請求項２３】 請求項１、請求項６、請求項１２また
    は請求項１３記載の複合体からなる組成物の免疫的に有
    効な量をそのようなヒトに単独あるいは免疫調節剤、ア
    ジュバント、抗ウイルス剤とともに投与し、場合によっ
    ては追加の複合体を投与して抗ＰＮＤペプチド、抗ＨＩ
    Ｖ、ＨＩＶ中和性免疫反応を高めることを特徴とする、
    ＨＩＶ感染の危険性のあるヒト、すでにＨＩＶ陽性血清
    を有するヒトあるいはエイズに苦しむヒトを治療または
    予防する方法。
24. 【請求項２４】 請求項１、請求項６、請求項１２また
    は請求項１３記載の複合体からなる組成物の免疫的に有
    効な量を該ほ乳動物に投与して抗体価を高めた抗血清あ
    るいはその抗血清から単離した抗体を十分量該ヒトに投
    与することを特徴とするＨＩＶ感染の危険性のあるヒト
    を受動的に保護し、すでにＨＩＶ感染したヒトのＨＩＶ
    増殖からヒトを保護し、エイズに苦しむヒトを治療する
    方法。