JPH04243897A - 環状ｈｉｖの主要中和決定基ペプチド - Google Patents

環状ｈｉｖの主要中和決定基ペプチド

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JPH04243897A
JPH04243897A JP3179121A JP17912191A JPH04243897A JP H04243897 A JPH04243897 A JP H04243897A JP 3179121 A JP3179121 A JP 3179121A JP 17912191 A JP17912191 A JP 17912191A JP H04243897 A JPH04243897 A JP H04243897A
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Elizabeth E Sugg
エリザベス　イー．サッグ
Catherine A Dolan
キャサリン　エー．ドラン
Maria A Bednarek
マリア　エー．ベドナレク
Richard L Tolman
リチャード　エル．トルマン
Burton G Christensen
バートン　ジー．クリステンセン
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】ホ乳類の、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ
）に対する免疫反応を高めることができるＨＩＶ主要中
和決定基ペプチドについて説明する。アミノ酸の２９６
と３４１の間にある〔Ｒａｔｎｅｒらのナンバリングに
従がう。　Ｎａ＋ｕｒｅ　３１３，２７７（１９８５）
〕エイズウイルスのエンベロープ糖タンパクｇｐ１２０
の高変異性部位は、今日までに単離し、同定されたほと
んどのＨＩＶに関して、アミノ酸テトラマー−ＧｌｙＰ
ｒｏＧｌｙＡｒｇ−（−ＧＰＧＲ−）を含んでいる。さ
らに、一般に、システィン残基が、このテトラマーの両
側に、アミノ酸約２０個以内に見られる。少なくとも単
離したよく知られたＨＩＶ　　ＩＩＩ　Ｂでは、これら
のシスティンがジスルフィド結合していることが知られ
ている。したがって、本明細書でループ状アミノ酸と呼
ぶ、中間のアミノ酸は、環状構造をとらされており、−
ＧＰＧＲ−はループの突端に露出している〔Ｊａｖａｈ
ｅｒｉａｎら，ＰＮＡＳ　　ＵＳＡ８６，６７６８，（
１９８９）〕。
【０００２】ホ乳類にＨＩＶを中和する免疫反応を誘導
することを目的とする、ペプチドに基づいた努力は、一
般に、鎖状又はジスルフィド結合した環状のペプチドの
使用に限られてきた。鎖状ペプチドには、受容者（ｒｅ
ｃｉｐｉｅｎｔ）　側の免疫システムが、溶液中で絶え
ずその三次元コンホメーションを変化させるエピトープ
に対応しなければならず、又、ジスルフィドが不安定で
あるため、鎖状ＰＮＤにより決定されるコンホメーショ
ンの数を制限するジスルフィド結合の信頼性が完全には
満足でないという限界がある。すなわちジスルフィドが
開裂すれば、上記の付帯する欠点を持つ鎖状ペプチドと
なる。
【０００３】さらに、上記の鎖状又はジスルフィド結合
したペプチドに関連した問題に加えて、ＰＮＤの配列が
多様に異なることが知られる非常に多くの種々のＨＩＶ
が単離・同定されているという問題がある。このような
多様性は、もしＰＮＤを作り出す単離体に特異的な免疫
反応が効果的な抗ＨＩＶ免疫原であるべきならば、多様
な単離体起源のＰＮＤペプチドの混合物が、広範囲の治
療用又は防御免疫原を達成する唯一の解決策である、と
いうことを意味する。効果的なＰＮＤの二次構造をより
よく特性づけるためには、不安定なジスルフィド結合を
用いるのをさけた安定な環状物質が必要である。本発明
で説明する環状ペプチド及びこれら生成物の製造工程は
、この必要を満足させる。
【０００４】鎖状の合成ペプチドは、溶液中又は固体支
持体上のいずれかで行なう多くの方法で製造される。こ
の製造に関わる原理と技術を包括するすぐれた文献とし
ては、“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｐｅｐｔｉｄｅ
　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（「ペプチド合成の原理」）、
Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ．Ｍ．，　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅ
ｒｌａｇ　（１９８４）；“Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　
Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　”　（「固相ペ
プチド合成」）Ｓｔｅｗａｒｔ　Ｊ．　Ｍ．，　Ｙｏｕ
ｎｇ　Ｊ．　Ｄ．，　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ
　Ｃｏｍｐａｎｙ（第２版１９８４）；“Ｔｈｅ　Ｐｅ
ｐｔｉｄｅｓ”（「ペプチド」）、　Ｇｒｏｓｓ　Ｅ．
，　Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ　Ｊ．，　Ａｃａｄｅｎｉｃ
．　Ｐｒｅｓｓ，　Ｉｎｃ．，（１９７９）がある。 一般に、環状ペプチドが必要な場合、少なくとも２個の
スルフヒドリル、たとえば２個のシスティンを有する鎖
状合成ペプチドの酸化によって、ジスルフィド結合した
環状物質を製造する。本発明は、安定した、アミド結合
した環状構造を有するペプチドを提供することにより、
不安定なジスルフィドを用いるのにともなう問題を克服
する。
【０００５】したがって本発明は、安定した環状構造を
有する新規なＨＩＶ　　ＰＮＤペプチド、及びそのよう
な化合物の製造工程と使用方法を説明する。安定した環
状ＨＩＶ　　ＰＮＤペプチドであるｃＰＮＤは、ループ
のアミノ酸のアミノ末端側の遊離アミノ基とループのア
ミノ酸のカルボキシ末端側の遊離カルボキシル基、好ま
しくはペプチドの遊離カルボキシ末端との間にアミド結
合を形成して製造する。このように形成したｃＰＮＤは
、これを含む共有結合抱合免疫原（ｃｏｖａｌｅｎｔ　
ｃｏｎｊｎｇａｔｅ　ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）の製造に有
用な試薬である。このような抱合体（ｃｏｎｊｎｇａｔ
ｅ）　は、ホ乳類の抗ペプチド反応、抗ＨＩＶ反応又は
ＨＩＶ中和免疫反応を高めるのに有用である。このよう
な抱合体を含む混合物は、後天的免疫不全症候群（エイ
ズ）、又はエイズ関連症候群（ＡＲＣ）を含むＨＩＶ疾
患を予防するワクチンとして、あるいは、エイズ又はＡ
ＲＣに苦しむ人を治療するための免疫原として用いるこ
とができる。さらに、この抱合体は、ホ乳類のＨＩＶ中
和免疫反応に関する構造−機能連関を分析するための有
用な実験の道具を提供する。
【０００６】本発明は構造式：
【化１２】 を有する新規で安定な環状ＨＩＶ　　ＰＮＤペプチド、
又はその薬剤用の塩に関わる。式中：ｒはａ）水素、ｂ
）ベンジルオキシカルボニル、ｃ）Ａｃ−Ｃｙｓ，又は
ｄ）Ａｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）；Ｒ１　はａ）結合、ｂ）
ノルロイシン、オルニチン、β−アラニン及びγ−アミ
ノ酪酸等の標識アミノ酸を任意に含む１ないし５個のア
ミノ酸のペプチド；Ｒ２　はａ）Ｒ３　が少なくとも２
個のアミノ酸のペプチドの場合には結合、又はアミノ酸
１７個までのペプチド、又はｂ）Ｒ３　が結合の場合に
は、２ないし１７個のアミノ酸のペプチド；Ｒ３　はａ
）Ｒ２　が少なくとも２個のアミノ酸のペプチドの場合
は、Ｒ７　への結合、又はアミノ酸１７個までのペプチ
ド、あるいはｂ）Ｒ２　が結合の場合、２ないし１７個
のアミノ酸のペプチド；−ＧＰＧＲ−は−ＧｌｙＰｒｏ
ＧｌｙＡｒｇ−のテトラマー；Ｒ５　はＲ３　が結合の
場合にはループのアミノ酸に結合し、又はＲ３　がアミ
ノ酸がペプチドの場合にはＲ３　に結合し、ａ）１ない
し５個のアミノ酸のペプチド；ｂ）標識アミノ酸、ｃ）
−ＯＨｄ）−ＣＯＯＨｅ）−ＣＯＮＨ２　：又はｆ）な
しより選択する；Ｒ７　はａ）Ｒ３から環のカルボニル
炭素への結合ｂ）低級アルキルｃ）置換した低級アルキ
ルｄ）低級ヘテロアルキルｅ）置換した低級ヘテロアル
キル、又はｆ）−　ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＯＮＨ２）Ｎ
Ｈ−；である；Ｒ８　は結合又は、１ないし８個の炭素
の低級アルキルである。
【０００７】この構造を有するペプチドは、適当な側鎖
保護を含めた既知の固相化学合成法により作られる鎖状
ＨＩＶ　　ＰＮＤペプチドの環化によって製造する。合
成後に、この鎖状ＨＩＶ　　ＰＮＤペプチドを樹脂から
切断し、アミド結合の形成をさせることのできる試薬、
好ましくはジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、
ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチル
アミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＢＯＰ
）、又は同様の試薬と処理して溶液中で環化する。ルー
プのアミノ酸の一端の遊離アミノ基と、ループのアミノ
酸の他端の遊離カルボキシル基が環構造の形成にかかわ
る。 アミノ基は、ペプチドの遊離アミノ末端、好ましくは容
易なペプチド定量ができるノルロイシン、アミノ末端の
イソグルタミン（ｉＱ）の遊離アミノ基、又はループの
アミノ酸のアミノ末端上のリジンのε−又はα−アミノ
基によって、提供することができる。カルボキシル基は
、遊離ペプチドカルボキシル末端、又はグルタミン酸又
はアスパラギン酸等の酸性アミノ酸の側鎖によって提供
することができる。
【０００８】安定な、アミド結合した環状ペプチドは、
分析の道具として、ＥＬＩＳＡアッセイの試薬として、
また多糖又は／及びタンパク質あるいは環状ペプチドに
高い免疫原性を与える他のすべての物質から成る免疫原
キャリアへの抱合試薬として有用である。このような接
合体（抱合体）は、ホ乳類の抗ペプチド、抗ＨＩＶ、又
はＨＩＶ中和免疫反応を誘導したり、エイズ又はＡＲＣ
を含めたＨＩＶ疾患の予防ワクチンを形成したり、また
ＡＲＣやエイズ等のＨＩＶ疾患に苦しむ人を治療するの
に有用である。
【０００９】したがって本発明の目的は、ホ乳類の抗ペ
プチド、抗ＨＩＶ又はＨＩＶ中和免疫反応を誘導するた
めに、あるいは抗ＨＩＶワクチンとして又はエイズやＡ
ＲＣを含むＨＩＶ疾患に苦しむ人の治療のための免疫原
として用いる組成物を製造するために用いる抱合体を製
造する試薬として有用である。本発明の他の目的は、ア
ミド結合した構造によって、ＨＩＶ　　ＰＮＤペプチド
の安定した環化を行なう方法を提供することである。定
義及び略記号ＡＡアッセイ　　　　　　ペプチド又はタ
ンパク質を酸で加水分解して遊離アミノ酸とした後に定
量する、アミノ酸分析法Ａｃｍ　　　　　　　　　　　
　　　アセトアミドメチル；チオール保護基活性化　　
　　　　　　　　　　ペプチド、タンパク質又は糖部分
を、その部分を誘導体化できる試薬と反応させて、その
後に起こる望ましい反応を可能にすることエイズ　　後
天性免疫不全症候群アミノ酸　　　　　　　　　　酸性
官能基とアミノ官能基の両方を有する分子；一般式　Ｈ
２Ｎ−ＣＨＲ−ＣＯＯＨ　のよく知られたα−アミノ酸
が２０種類あるが、式中のＲ基がこのアミノ酸の種類を
決定する；これらのアミノ酸は、立体化学的形態として
Ｄ体又はＬ体のいずれかを有するが、小文字１字の省略
記号又はアミノ酸名の前の接頭辞「Ｄ−」によってとく
に明記されない場合には、アミノ酸は天然あるいはＬ体
である。このよく知られた２０種類のアミノ酸の名称及
びＲ基の式は、本明細書では以下の表に従がって１文字
の符号で表わす、すなわち：
【化１３】 抗体　　　　　　　　　　　　　　ホ乳類のＢ細胞が作
る、特定の抗原と結合することができるタンパク質ＡＲ
Ｃ　　　　　　　　　　　　エイズ関連症候群ＡＺＴ　
　　　　　　　　　　　アジドチミジン；抗エイズ化合
物２種間　　　　　　　　　　　　別々に誘導した部分
を反応させた結果生ずる分子鎖又は抱合スペイサー　　
　　　　体であり、このスペイサーを用いて形成した接
合体を分析のために分解すると、スペイサーが遊離して
それを定量することができるので、共有結合の程度を測
定できるＢＯＰ　　　　　　　　　　　　ベンゾトリア
ゾール−１−イルオキシトリス−（ジメチルアミノ）ホ
スホニウムヘキサフルオロリン酸塩キャッピング　　　
　　　低分子との反応によって接合体上の反応性部位を
なくすことＣｂｚ　　　　　　　　　　　　　　ベンジ
ルオキシカルボニル接（抱）合体　　共有結合したそれ
ぞれ独立した化学物質から成る複合体であり、少なくと
も１つの化学物質は望ましい抗原（たとえばＨＩＶ　　
ＰＮＤ）であり、もう一方の化学物質は担体であるコア
アミノ酸　　　　　　ホニュウ類のＨＩＶ中和免疫反応
を誘導するのに不可欠な、ＨＩＶ　　ＰＮＤのアミノ酸
ＤＰＰＡ　　　　　　　　　　ジフェニルホスホリルア
ジドＥＬＩＳＡ　　　　　　　　酵素免疫吸着アッセイ
Ｆｍｏｃ　　　　　　　　　９−フルオレニルメチルオ
キシカルボニルＨＩＶ　　　　　　　　　　　　ヒトの
免疫不全ウイルス、レンティ・ウイルス群の１種であり
、エイズ及びそれに関連した症候群に関する病因だと言
われている。ＨＩＶは、また、ＨＴＬＶ（ヒトＴ細胞リ
ンパ球性ウイルス）、ＬＡＶ（リンパ節腫張関連ウイル
ス）及びＡＲＶ（エイズ関連ウイルス）としても知られ
ている免疫原　　　　　　　　　　　　ホ乳類の免疫反
応の刺激物質として有用な分子免疫学的に等価　　　　
同じペプチドエピトープを認識することのできる抗体の
ようなペプチド　　　　　　に、ホ乳類のＨＩＶ中和免
疫反応を誘導する働きを共通に有する環状又は鎖状ペプ
チド標識アミノ酸　　　　　　ＡＡアッセイにおいて、
他のペプチド又はタンパク質アミノ酸の作るシグナルの
妨害を受けることのないシグナルを有するアミノ酸、た
とえばノルロイシン、オルニチン、β−アラニン、γ−
アミノ酪酸。Ｍｔｒ　　　　　　　　　　　　４−メト
キシ−２，３，６−トリメチルフェニルスルホニルＮＥ
Ｍ　　　　　　　　　　　　Ｎ−エチルマレイミドＯＭ
ＰＣ　　　　　　　　　　髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉ
ａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）　の外層膜複合タンパ
ク質、免疫増強剤及びペプチドの担体として用いるペプ
チドアミド（ペプチド）結合でつながったアミノ酸のポ
リマーＰＥＰ　　　　　　　　　　　　ペプチドＰＮＤ
　　　　　　　　　　　　主要中和決定基：ＨＩＶ中和
抗体に結合することができて、ＰＮＤを有する免疫原の
接種に際してホ乳類の受容者のＨＩＶ中和抗体を高める
ことができるペプチジル配列に対する名称；たとえばＨ
ＩＶ　ｇｐ　１２０の２９６〜３４１残基、又はさらに
その一断片ＰｎＰｓ６Ｂ　　　　　　　　　　　　連鎖
球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉ
ａｅ　６Ｂ）の莢膜多糖ＰＲＯ　　　　　　　　　　　
　免疫原タンパク質タンパク質　　　　　　　　分子の
大きなペプチドＰＲＰ　　　　　　　　　　　　リン酸
ポリリボシルリビトールＰＳＡ　　　　　　　　通常、
ポリマーのモノマー単位中にリン酸のくりかえし単位を
持つアニオン性多糖樹脂　　　　　　　　　　　　　　
固相合成用の固体支持体マトリクスＷａｎｇ：４−（ヒ
ドロキシメチル）フェノキシメチルをコポリスチレン−
１％ジビニルベンゼン樹脂に結合させる、これをバッチ
Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成に用いる、最後に９５％ＴＦ
Ａで樹脂より切断をして、同時に酸に反応する側鎖保護
基を脱保護する；Ｓａｓｒｉｎ：４−（ヒドロキシメチ
ル）−３−メトキシフェノキシメチルをコポリスチレン
−１％ジビニルベンゼン樹脂に結合し、これをバッチＦ
ｍｏｃ　固相ペプチド合成に用いて、最後に１％のＴＦ
Ａ／ＣＨ２Ｃｌ２で樹脂より切断して、残っている酸に
不安定な側鎖保護基をとりのぞく；Ｐｅｐｓｙｎ　ＫＡ
　：４−（ヒドロキシメチル）フェノキシメチルを、微
粒珪藻土に吸着させたポリアミド樹脂に結合し、これら
連続フローカラムＦｍｏｃ　固相ペプチド合成に用いる
。ペプチドは前記　Ｗａｎｇ　の樹脂と同様にして樹脂
より切りはなす；Ｐｅｐｓｙｎ　ＫＨ：４−（ヒドロキ
シメチル）−３−メトキシメチルを、微粒珪藻土に吸着
させたポリアミド樹脂に結合し、Ｆｍｏｃ　固相ペプチ
ド合成に用いる、側鎖を保護したペプチドを、Ｓａｓｒ
ｉｎ樹脂について述べたように樹脂から切りはなす；「
足場」　　　　　　　　　　担体上に作られた多数のペ
プチドエピトープを有する免疫原ＳＣＭＨＣ　　　　　
　　　Ｓ−カルボキシメチルホモシステアミン、共有抱
合体免疫原の分解により放出される、ＡＡアッセイで定
量可能な、酸に安定な二種間スペイサー；ＳＣＭＣ　　
　　　　　　　　Ｓ−カルボキシメチルシステアミン、
共有抱合体免疫原の分解により放出されるＡＡアッセイ
で定量可能な、酸に安定な二種間スペイサー；Ｚ　　　
　　　　　　　　　　　　　ベンジルオキシカルボニル
【００１０】本発明はｃＰＮＤの構造式：
【化１４】 を有する新規な環状ＨＩＶ　　ＰＮＤペプチド又はその
製薬上許容し得る塩に関する。式中：ｒはａ）水素ｂ）
ベンジルオキシカルボニルｃ）Ａｃ−Ｃｙｓ，　又はｄ
）Ａｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）　；Ｒ１　はａ）結合、ｂ）
ノルロイシン、オルニチン、β−アラニン、及びγ−ア
ミノ酪酸等の標識アミノ酸を任意に含んだ１ないし５個
のアミノ酸のペプチド；Ｒ２　はａ）Ｒ３　が少なくと
も２個のアミノ酸のペプチドの場合、結合又はアミノ酸
１７個までのペプチド、又はｂ）Ｒ３　が結合の場合、
２ないし１７個のアミノ酸のペプチド；Ｒ３　はａ）Ｒ
２　が少なくとも２個のアミノ酸のペプチドの場合、Ｒ
７　への結合又はアミノ酸１７個までのペプチド、もし
くはｂ）Ｒ２　が結合の場合、２ないし１７個のアミノ
酸のペプチド；−ＧＰＧＲ−は−ＧｌｙＰｒｏＧｌｙＡ
ｒｇ−のテトラマー；Ｒ５　は、Ｒ３　が結合の場合に
はループのアミノ酸に結合し、Ｒ３　がアミノ酸又はペ
プチドの場合はＲ３　に結合し、ａ）１ないし５個のア
ミノ酸のペプチドｂ）標識アミノ酸ｃ）−ＯＨｄ）−Ｃ
ＯＯＨｅ）−ＣＯＮＨ２　、又はｆ）なしより選択する
；Ｒ７　はａ）Ｒ３　から環のカルボニル炭素への結合
ｂ）低級アルキルｃ）置換した低級アルキルｄ）低級ヘ
テロアルキルｅ）置換した低級ヘテロアルキル、又はｆ
）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＯＮＨ２）ＮＨ−　；そして
Ｒ８　は結合、又は１ないし８個の炭素の低級アルキル
である。
【００１１】低級アルキルは、１ないし８個の炭素を有
する直鎖又は分岐状アルキルである。置換した低級アル
キルは、　−ＣＨ２　，　−ＣＯＮＨ２で１価又は２価
置換してよい；ヘテロアルキルは、酸素、窒素又は硫黄
より選択した１ないし２個のヘテロ原子を有する。以後
、環状ペプチドのループの形成まで、アミノ酸−Ｒ２　
−ＧＰＧＲ−Ｒ３　−をループアミノ酸と呼ぶ。「不安
定でない結合」という語は、不安定なジスルフィド結合
以外の、アミド結合やチオエーテル結合等の共有結合を
意味する。適当な架橋構造を用いて、環のループ構造の
コンホメーションを最適にして、免疫システム中に現わ
れるＰＮＤエピトープをうまく調整をすることができる
。たとえば、２個の炭素を有する架橋構造を用いると、
Ｃ５　の架橋を用いた場合より「もっときつい」ループ
が生じる。
【００１２】したがって、本発明の好適な実施例におい
て、構造式：
【化１５】 を有する環状ペプチドは、構造式
【化１６】 を有する鎖状ペプチドの環化によって製造する。式中：
くねくねした線は　−（ＣＨ２）４−　を表わす；−Ｇ
ＰＧＲ−は−ＧｌｙＰｒｏＧｌｙＡｒｇ−のテトラマー
；Ｘ１　はａ）セリンｂ）プロリンｃ）アルギニンｄ）
ヒスチジンｅ）グルタミン、又はｆ）トレオニンから選
択したＲ２　の要素；Ｘ２　はａ）イソロイシンｂ）ア
ルギニンｃ）バリン、又はｄ）メチオニンから選択した
Ｒ２　の要素；ＸｎはＲ２　の要素であり、結合又はア
ミノ酸１５個までのペプチドのいずれかである；Ｘ３　
はａ）アラニンｂ）アルギニン、又はｃ）バリンから選
択したＲ３　の要素；Ｘ４　はＲ３　の要素であり、ａ
）フェニルアラニンｂ）イソロイシンｃ）バリン、又は
ｄ）ロイシンから選択する；そしてＸｍはＲ３　の要素
であり、結合又はアミノ酸１５個までのペプチドである
。
【００１３】本発明の他の好適な実施例においては、構
造式：
【化１７】 を有する環状ペプチドを、構造式：
【化１８】 を有する鎖状ペプチドを環化することにより製造するが
、式中の記号はすべて前記に定義したとおりである。
【００１４】本発明の新規な環状ペプチドは、本質的に
２段階で製造する。すなわち、まず、鎖状ペプチドを、
たとえばＡＢＩ−４３１Ａペプチドシンセサイザー上で
、たとえばＦｍｏｃ　化学及び試薬として適当に側鎖を
保護したＦｍｏｃ　−アミノ酸を用いた既知の固相ペプ
チド合成化学によって、製造する。
【００１５】次に、この鎖状ペプチドを樹脂から切りは
なして、ペプチドの遊離アミノ末端、アミノ末端のイソ
グルタミンの遊離アミノ基、又はループアミノ酸の一端
のリジンの遊離ε−又はα−アミノ基を、ＤＰＰＡ、Ｂ
ＯＰ又は類似のペプチド結合形成させる試薬によって、
ループアミノ酸のカルボキシ末端の遊離カルボキシル基
にアミド結合させて、溶液中で環化する。
【００１６】得られた生成物は、高速原子衝撃質量分析
〔ＦＡＢ−ＭＳ〕、逆相ＨＰＬＣ、アミノ酸分析、又は
核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）によって特徴づけすること
ができる。
【００１７】実施例１〜２５は本発明の物質の合成を示
す。
【００１８】本発明の環状ペプチドは、ＥＬＩＳＡアッ
セイの試薬として用いることができ、ＨＩＶ中和抗体を
アッセイに用いる場合の、ペプチドの構造機能連関の分
析の道具を提供できる。あるいは、本発明の環状ペプチ
ドは担体たとえば多糖、抗原タンパク質、又はペプチド
の免疫原性を高めることのできるあらゆる物質の組み合
わせに接合することができる。たとえば、本出願と同時
に提出した米国特許出願においては、本発明のペプチド
を、インフルエンザｂウイルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕ
ｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ　ｂ）　の莢膜多糖からとった
リン酸ポリリボシルリビトール（ＰＲＰ）、及び髄膜炎
菌ｂ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ
　ｂ）　の外層膜複合タンパク質（ＯＭＰＣ）から成る
担体に接合した。このような接合体を製造する実施例を
以下に述べる。
【００１９】以下の実施例は、本発明の環状ペプチドの
作り方と用い方をより具体的に示すためのものである。 しかし、ここに与えた実施例は、本発明の範囲を制限す
るものと考えてはならない。
【００２０】Ａ．本発明により製造したペプチドの例実
施例１ペプチド結合したｃＰＮＤ７の溶液合成鎖状ペプ
チドＣｂｚ−Ｎｌｅ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｈｉｓ（Ｔｒ
ｔ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｍｔ
ｒ）−Ａｌａ−Ｐｈｅを、３７３ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ
）の市販のＦｍｏｃ−フェニルアラニル−ｐ−アルコキ
シベンジルアルコール樹脂を用いて、ＡＢＩ４３１Ａペ
プチドシンセサイザー上で、固相法によって製造した。 ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）で保護した形態で
入手したノルロイシンをのぞいて、用いたＬ−アミノ酸
は、適当な酸不安定な側鎖保護基を有するトルオレニル
メトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ　）誘導体であった。ポ
リペプチド誘導樹脂生成物を焼結ガラスろうとに移し、
ジクロロメタンで洗浄して、乾燥すると、０．６ｇのポ
リペプチド樹脂生成物を得た。ＴＦＡ：１，２−エタン
ジオール：アニソールの９５：２：３混合液６ｍｌで１
６時間処理して、ペプチドを樹脂から切りはなした。反
応混合物を焼結ガラスろうとで濾過して、樹脂を１０ｍ
ｌのＴＦＡで洗浄して、濾液をまとめた。１ないし２ｍ
ｌの黄色油状になるまで濃縮した後、５０ｍｌずつ、４
００ｍｌのジエチルエーテルで摩砕して、焼結ガラスろ
うとで濾過して、この鎖状ペプチドを回収した。１００
ｍｌの１％ＴＦＡに溶解後、凍結乾燥して２９８ｍｇの
鎖状ペプチドを得た。ペプチドの粉末を８００ｍｌのＤ
ＭＦに溶解し、０．４２ｍｌのジイソプロピルエチルア
ミンで中和し、０．０７７ｍｌのジフェニルホスホリラ
ジドで処理した。溶液を暗所で７０時間、４℃でかくは
んして、環状ラクタムを形成させた。３ｍｌの氷酢酸を
加えて後処理したのち、反応混合物を１ないし２ｍｌの
油状になるまで濃縮し、１０％の酢酸水溶液に溶解して
、凍結乾燥した。環状ペプチドを５％酢酸を移動相に用
いたＧ−１５サイズの排除クロマトグラフィーで精製し
た。ＵＶで検知したペプチドを含む分画をあつめて凍結
乾燥すると、無水環状ペプチド１３５ｍｇを得た。得ら
れた全量がｃＰＮＤ７の構造式：
【化１９】 の物質と一致した。これは
【化２０】 のように表わすこともできる。
【００２１】実施例２水素形のｃＰＮＤ８を産するため
のｃＰＮＤ７の脱保護ｃＰＮＤ７の脱保護は、３０％酢
酸水溶液２０ｍｌ中に環状ペプチドを溶解して、炭素上
の１０％パラジウム１００ｍｇの上で４０ｐｓｉ　で１
６時間水素添加して行った。反応混合物をセライトで濾
過して触媒をとりのぞき、濾過を凍結乾燥した。Ｖｙｄ
ａｃ　　Ｃ１８セミプレップカラムを用いた逆相ＨＰＬ
Ｃを利用して８．５ｍｇの純粋な脱保護した環状ペプチ
ドを得た。この脱保護の方法は、ベンジルオキシカルボ
ニルでＮ保護したペプチドとして合成したすべてのペプ
チドに適用でき、遊離した水素の形態のペプチドが得ら
れる。生成物の構造をＦＡＢ−ＭＳ、分析ＨＰＬＣ、及
びアミノ酸分析で確認するとすべての結果はｃＰＮＤ８
の構造：
【化２１】 と一致した。これは
【化２２】 のように表わすこともできる。
【００２２】実施例３ｃＰＮＤ１０の合成ペプチドのア
ミノ末端にＡｃｍ保護したＡｃ−システインを持つｃＰ
ＮＤ１０の合成は、Ｚ−ＮｌｅでなくＦｍｏｃ　−ノル
ロイシンを用いることと、Ｎ末端アミノ酸としてさらに
Ａｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）を用いることをのぞけば、実施
例１で用いた方法と同じである。すなわち、市販のＦｍ
ｏｃ　−Ｎｌｅ及びＦｍｏｃ　−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）　を
用いて鎖状ペプチドＡｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｎｌｅ−
Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｍ＋ｒ）　−Ａｌａ−Ｐｈ
ｅを合成した。実施例１の方法を一部変えたこの方法は
、Ｎ末端にＡｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）が望ましい他のｃＰ
ＮＤペプチド合成に適用できる。
【００２３】実施例４ｃＰＮＤ１０の脱保護によるｃＰ
ＮＤ９の製造Ａｔｈｅｒｔｏｎ．　Ｅ　ら（Ｃｈｅｍ．
　Ｓｏｃ．　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｔｒａｎｓ．，Ｉ２０５７
（１９８５））の記述する方法に従がって、Ａｃｍを保
護したＡｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）を遊離Ａｃ−Ｃｙｓ−Ｓ
Ｈ（遊離スルフヒドリル）の形態に変えることができる
。この工程は、ブロモ酢酸化又はマレイミド化したタン
パク質あるいは多糖などの親硫剤との抱合体を製造する
際のペプチドのＡｃｍチオール保護をとりのぞくのに適
用できる。ｃＰＮＤ１０の一部を１０％酢酸水溶液に溶
解して、トリフルオロ酢酸水銀（１０倍量）で処理した
。ｐＨを４に再調整して、逆相ＨＰＬＣでＳ−Ａｃｍ基
の切断をモニターしながら、溶液を室温でかくはんした
。反応が完了したと判断した時、溶液を硫化水素ガスで
飽和した。硫化水銀（ＩＩ）の沈殿を遠心分離してとり
のぞき、ｃＰＮＤ９をＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。ｃＰ
ＮＤ９の構造と純度をＦＡＢ−ＭＳ、分析ＨＰＬＣ及び
アミノ酸分析で確認した。
【００２４】実施例２〜２１実施例１〜４及び２０〜２
１の方法に従がって合成したｃＰＮＤペプチド上記の諸
実施例及び以下の実施例２０〜２１で定める、ｃＰＮＤ
７、ｃＰＮＤ８、ｃＰＮＤ９、ｃＰＮＤ１０、ｃＰＮＤ
３１及びｃＰＮＤ３２の合成工程は一般に、ペプチドの
１次配列が変わることと適当な保護基を用いることをの
ぞけば、本質的に修正することなしに、多くの異なった
単離体由来の合成ＰＮＤペプチドの環構造の合成に適用
できる。したがって以下のすべてのペプチドは、それら
の方法によって合成された。
【化２３】
【化２４】
【化２５】
【００２５】実施例２０ｃＰＮＤ３１の合成２グラム（
０．６ｍｅｑ／ｇ）　のＦｍｏｃ　−Ｐｈｅ−Ｗａｎｇ
　樹脂をＡＢＩ４３１Ａシンセサイザーにのせた。Ｆｍ
ｏｃ　の単連結プロトコールを用いてＦｍｏｃ　−Ａｌ
ａ、Ｆｍｏｃ　−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ｆｍｏｃ　−Ｐｒ
ｏ、Ｆｍｏｃ　−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ　−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ
）、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ　）及びＣｂｚ−Ｎｌｅ
をつけ加えて、配列Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｎε−Ｚ−Ｎｌｅ
）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌ
ｙ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ａｌａ−Ｐｈｅを有する３．７
ｇの鎖状ペプチド樹脂を生成した。このペプチドを、９
５％ＴＦＡ／５％水で２時間処理して樹脂から切りはな
した。樹脂を濾過してとりのぞき、ＴＦＡを濾過から減
圧下に蒸発させてとりのぞいて、残渣をジエチルエーテ
ルで摩砕した。沈殿を濾過して回収し、乾燥すると、配
列Ｈ−Ｌｙｓ（Ｎε−Ｚ−Ｎｌｅ）−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ａｌａ−
Ｐｈｅを有する１．７ｇの鎖状ペプチドを得た。このペ
プチドを、ＤＭＦ（１０ｍｌ）中のＢｏｃ−イソグルタ
ミン−ＯＮｐ（０．７１ｇ，２ｎｍｏｌ）及びＤＩＥＡ
（０．３５ｍｌ，２ｍｍｏｌ）でひと晩室温で処理した
。ＤＭＦを蒸発させて、残渣をジエチルエーテルで処理
した。沈殿を濾過して回収し、酢酸エチルで洗浄した。 乾燥させたペプチド（１．９ｇ）をＴＦＡ（１００ｍｌ
）で０．５時間処理した。ＴＦＡを減圧下に蒸発させて
、残渣をジエチルエーテルで摩砕し、沈殿を濾過して回
収し、乾燥した。ペプチドは、１０％酢酸水溶液を溶離
液に用いて、　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１０で脱塩した
。ペプチドを含む分画を凍結乾燥して１．２ｇ（０．７
９ｍｍｏｌ）のＨ−ｉｓｏＧｌｕ−Ｌｙｓ（Ｎε−Ｚ−
Ｎｌｅ）−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−
Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ａｌａ−Ｐｈｅを得た。２バッチ（
０．５５ｇ，０．３６ｍｍｏｌ）のペプチドを別々に氷
冷した１０００ｍｌのＤＭＦに溶解し、ＤＩＥＡ（０．
６ｍｌ，０．９ｍｍｏｌ）とＤＰＰＡ（０．１２ｍｌ）
を加えて、この溶液をひと晩室温でかくはんした。ＤＭ
Ｆを減圧下に蒸発させて、残渣をまとめて　ＣＨＣｌ３
に可溶化した。有機フラクションを５％クエン酸水溶液
で洗浄した後、　ＭｇＳＯ４上で乾燥し、蒸発させると
、０．７８ｇの未精製環状ペプチドを得た。この物質を
、アニソール（１ｍｌ）を含む液体ＨＦ（１０ｍｌ）で
２時間０℃で処理した。ＨＦを蒸発させて残渣を逆相Ｈ
ＰＬＣ上で勾配溶離して（Ｖｙｄａｃ　Ｃ−１８，０〜
５０％　ＣＨ３ＣＮで５０分にわたって、バッファーと
して０．１％ＴＦＡ水溶液を用いた）、２５０ｍｇの純
粋なｃＰＮＤ３１（Ｍ＋Ｈ＝１２０４）を得た。
【００２６】実施例２１ｃＰＮＤ３２の合成環化する鎖
状ペプチドの配列がＨ−ｉｓｏ　Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（Ｎε
−Ｚ−Ｎｌｅ）−Ｇｌｕ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ｇｌｙ−
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ａｌａ−Ｐｈｅで
あることをのぞけば、実施例２０のｃＰＮＤ３１の合成
に用いたのと本質的に同じ工程を本実施例で用いた。Ｂ
．本発明のペプチドを用いて製造した抱合体の例
【００２７】実施例２２ＯＭＰＣのＮ−（ブロモアセチ
ル）−６−アミノカプロン酸誘導体（ＢｒＡｃ−６−Ａ
ＣＡ−ＯＭＰＣ）の製造ＯＭＰＣ溶液（１０ｍｌ）（５
９ｍｇ／ｍｌ）を、４℃で２時間、４３Ｋｒｐｍで遠心
分離した。 ペレットを、　Ｄｏｕｎｃｅ　ホモジナイザーを使って
６ｍｌ、ｐＨ９（Ｋｏｌｔｈｏｆｆ）バッファーに再び
懸濁させて、１ｍｌのＮ−（ブロモアセチル）−６−ア
ミノカプロン酸ｐ−ニトロフェニルエステル溶液（アセ
トニトリル８５ｍｇ／ｍｌ）を加えた。こうして得た混
合物を４５時間振とうした。 不溶物質を低速で遠心分離してペレットにした後、上澄
みを４℃で２時間４３Ｋｒｐｍで遠心分離した。ペレッ
トを再び１０ｍｌの水に懸濁させて、４℃で２時間、再
び遠心分離した。このペレットを１０ｍｌの水に再び懸
濁させて、ＢｒＡｃ−６−ＡＣＡ−ＯＭＰＣを得た。ア
ミノ酸分析は、２６８ｎｍｏｌ／ｍｌの６−アミノカプ
ロン酸及び１９６ｎｍｏｌ／ｍｌのリジンを示した。タ
ンパク質濃度は２．４ｍｇ／ｍｌ（回収率４１％）であ
った。ブロモ酢酸化能力を判定するために、この溶液１
ｍｌをｐＨ８の３０μｌ　のＮ−アセチルシステアミン
中でインキュベートした。透析して過剰の試薬をとりの
ぞいた後、溶媒を蒸発すると、当該化合物を得た。サン
プルのアリコートを酸で加水分解して　Ｓｐｉｎｃｏ　
でアッセイすると５４ｎｍｏｌ／ｍｌのＳ−カルボキシ
メチルシステアミン及び１４０ｎｍｏｌ／ｍｌのリジン
を示した（ＳＣＭＣ／ｌｙｓ　＝０．３８）。これは、
存在するリジンの３８％がブロモ酢酸化部分であること
を示す。
【００２８】実施例２３ＰＲＰのシステアミン（ビス−
２−アミノエチルジスルフィド）誘導体（ＰＲＰ−ｃｙ
ｓ　−ＮＨ２　）の製造ＰＲＰのテトラブチルアンモニ
ウム塩（３００ｍｇ）を１１ｍｌのジメチルホルムアミ
ド（ＤＭＦ）に溶解した。つづいて３０ｍｇのカルボニ
ルジイミダゾールを加えて、溶液を室温（ｒ．ｔ．）　
で１時間かくはんした。その後このＤＭＦ溶液をかくは
んしながら、（氷冷で）冷却したシスタミン二塩酸塩（
４５０ｍｇ／１０ｍｌ　Ｈ２Ｏ；　ＮａＯＨ　でｐＨを
１０．３に調整）　に加え、氷浴で１５分間かくはんを
つづけた。その後溶液を氷浴からはずし、透析チューブ
に移した後、室温で４５分間放置した。その後透析は、
以下のように順次バッファーを変えて行なった。（ａ）
　４リットル，ｐＨ７，０．１Ｍ　　ＰＯ４　で４．２
時間（ｂ）　４リットル，ｐＨ７，０．０１Ｍ　　ＰＯ
４　で８時間（ｃ）　４リットル，ｐＨ７，０．０１Ｍ
　　ＰＯ４　で１６時間、そして（ｄ）　１６リットル
，　Ｈ２Ｏ　　で８時間。凍結乾燥すると、当該化合物
であるＰＲＰのシスタミン誘導体１５０ｍｇを得た。こ
の物質のＮＭＲで、ＰＲＰのシスタミン誘導を確認した
。３ｐｐｍ　（ＣＨ２−Ｓ）に位置する２個のメチレン
の共鳴を、グリコシド部分（５．１ｐｐｍ　）又は全Ｐ
ＲＰ部分積分と比較したところ、１００個のリボシル−
リビトールリン酸塩部分（すなわちＰＲＰのモノマー単
位）につき、平均４８個のシスタミン部分を算定した。
【００２９】実施例２４ＰＲＰ−ｃｙｓ　−ＮＨ２　の
還元によるＰＲＰ−ＳＨの生成９ｍｌのｐＨ８．０のバ
ッファー（ＰＯ４　０．０１Ｍ，ＥＤＴＡ０．００５Ｍ
のバッファーＡ）に、４０ｍｇのＰＲＰ−ｃｙｓ　−Ｎ
Ｈ２　（製造は実施例２３を参照）を加えた。完全に溶
解した後（１５分間）、４２ｍｇの固体のジチオトレイ
トール（ＤＴＴ）を加えた。混合物を脱気して窒化し、
室温で４．５時間放置した。その後、溶液を透析チュー
ブにうつし以下のようにバッファーを変えて透析した。 １）　　４リットルのバッファーＡで１６時間２）　　
４リットルのバッファーＡで７．２５時間３）　　１リ
ットルのｐＨ８の０．１ＭＰＯ４　バッファー、０．０
０５ＭＥＤＴＡ（バッファーＢ）で１７時間この時点で
の溶液のＥ１１ｍａｎ　アッセイは、チオールのタイタ
ー２．０４ｍｍｏｌＳＨ／ｍｌを示し、すなわち、体積
７．５ｍｌに対し当該ＰＲＰ−ＳＨの全量１５．３ｍｍ
ｏｌを示した。
【００３０】実施例２５ｃＰＮＤ９−ＰｕＰｓ６Ｂ−Ｏ
ＭＰＣの製造（ここにｃＰＮＤ９の構造式は以下のもの
である）
【化２６】 ＰｕＰｓ６Ｂ（ｎ−Ｂｕ４　Ｎ＋　）ＰｕＰｓ６Ｂ（４
８４ｍｇ）を蒸留水（４８ｍｌ）に溶解し、溶液をメカ
ニカルスターラーで固体がすべて溶けるまでかくはんし
た（１．５時間）。多糖が溶解している間に、カラム（
２０ｍｍ）に　Ｄｏｗｅｘ５０×２（ｎ−Ｂｕ４　Ｎ＋
　）イオン交換樹脂（３０ｍｌ）をつめて、樹脂床を水
で１．５時間洗浄する。粘性多糖溶液を洗浄した樹脂に
そそいで重力で床（ベッド）を通過させた（１６時間）
。カラムを水（８ｍｌ）で洗浄し、まとめた溶離液を凍
結乾燥すると８００ｍｇの淡黄色固体が得られ、これを
真空デシケーター内（５０ｍｍＨｇ）の　Ｐ２Ｏ５　上
で乾燥した（６０時間）。この方法により、５６４ｍｇ
の無水ＰｕＰｓ６Ｂテトラ−ｎ−ブチルアンモニウム塩
、ＰｕＰｓ−６Ｂ（ｎ−Ｂｕ４　Ｎ＋　）を得た。Ｐｕ
Ｐｓ６Ｂ−ＢｕＡ２　ＰｕＰｓ６Ｂ（ｎ−Ｂｕ４Ｎ＋　
）（１４０ｍｇ）をジメチルスルホキシド（５ｍｌ）に
溶解して、メカニカルスターラーで１５分間かくはんす
ると、すべての固体は溶解していた。この混合物に、１
，１′−カルボニルジイミダゾール（１５ｍｇ）を、一
度に加えて、反応物を室温でかくはんした（８０分間）
。分液フラスコ内の水（５ｍｌ）中のブタンジアミン二
塩酸塩溶液に２．５Ｎの　ＮａＯＨ　を加えて塩基性（
ｐＨ１０．２）とした後、０℃に冷却した。このつめた
い混合物に、ゆっくりと一定の割合で活性多糖をそそぎ
、得られた溶液を０℃で（３０分間）かくはんした。反
応混合物を室温になるまで放置して、さらに１時間かく
はんした後、透析チューブ（２ｍｌ／ｃｍに移して以下
のように（４℃で）透析した、すなわち：４リットル、
０．１ＭｐＨ７．０　ＨＰＯ４　バッファーで５時間；
４リットル０．０１ＭｐＨ７．０　ＨＰＯ４　バッファ
ーで１５時間；４リットル０．０１ＭｐＨ７．０　ＨＰ
Ｏ４　バッファーで９時間；そして４リットル蒸留水で
１５時間。透析チューブの内容物を凍結乾燥すると白色
固体を生じ、これをデシケーター内の　Ｐ２Ｏ５　上で
ひと晩（１６時間）乾燥すると、９４ｍｇのＰｕＰｓ６
Ｂ−ブタンジアミン（ＰｕＰｓ６Ｂ−ＢｕＮ２）が得ら
れた。この物質のＮＭＲは、５０％ローディング（６Ｂ
モノマー単位１００につきＢｕＡ２　単位５０）のブタ
ンジアミンが得られたことを示した。このローディング
パーセントは、ブタンジアミンメチレン部分の積分をラ
ムノースメチル部分と比較して決定した。ＰｕＰｓ６Ｂ
−ＢｕＡ２−ＢｒＡｃ６Ｂ−ＢｕＡ２　（９４ｍｇ）を
ｐＨ９．０４の　Ｋｏｌｔｈｏｆｆ　バッファー（１０
ｍｌ）に溶解して、混合物をメカニカルスターラーで３
０分間かくはんして溶液にした。この水溶液に、アセト
ニトリル（１ｍｌ）中のｐ−ニトロフェニルブロモ酢酸
から或る混合物を加えて、この反応物を冷蔵室（４℃）
でひと晩（２２時間）かくはんした。得られた粘性黄色
溶液を透析チューブ（２ｍｌ／ｃｍ）に移し、以下のよ
うに（４℃で）透析した、すなわち：１５リットル蒸留
水で２３時間；そして４リットル蒸留水で２３時間。透
析チューブの内容物は溶液としてとっておいた。この溶
液の１ｍｌを凍結乾燥すると白色固体の３．５ｍｇのＰ
ｕＰｓ６Ｂ−ＢｕＡ２　−ＢｒＡｃを得た。この物質の
ＮＭＲ（３００　ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）はブタンジアミンの
ローディングパーセントが２８％であることを示した。 この値と、以前に（ＰｕＰｓ６Ｂ−ＢｕＡ２　に関して
）得た値の差は、凍結乾燥した物質の必ずしも全量が溶
液として溶解しないことによる溶解度の問題から生ずる
と思われる。ＰｕＰｓ６Ｂ−ｃＰＮＤ９ＰｕＰｓ６Ｂ−
ＢｕＡ２　−ＢｒＡｃ水溶液（１１ｍｌ，約３８．５ｍ
ｇ）を構造式：
【化２７】 の環状ペプチド（８．５ｍｇ，６．９μｍｏｌ　，分子
量１２２１）を入れたバイアルびんに加えた。得られた
溶液（２００μｌ　のサンプル）にただちに　Ｅｌｌｉ
ｍａｎテストを行なうと、３．３μｍｏｌ　のＳＨタイ
ター（ＯＤ４１２　＝０．２７０）を示した。反応混合
物を１５ｍｌ遠心分離管に移して脱気し、窒素を充填し
た後、室温で（５時間）遠心した。反応混合物を透析チ
ューブ（２ｍｌ／ｃｍ）に移し、４リットルの蒸留水で
（４℃で２３時間）透析した。透析チューブ内にある溶
液１ｍｌをとり出して凍結乾燥した。残った溶液（１３
．５ｍｌ）に無水のｐＨ８．０　ＨＰＯ４　バッファー
の塩（１８０ｍｇ）及び数滴の５　ＮＮａＯＨを加えて
、ｐＨを８．３に調整した。こうしてｐＨを調整した溶
液を、チオール化したＯＭＰＣとの抱合に用いた。ｃＰ
ＮＤ９−ＰｕＰｓ６Ｂ−ＯＭＰＣ滅菌したＯＭＰＣ（１
０ｍｌ，約４５ｍｇ）を超遠心分離し（４℃ないし２０
℃、４３Ｋｒｐｍ　１．５時間）、ペレットにした。こ
のペレットを、（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｍｉｌｌｅｘ−
ＧＶ　０．２２μｍ　滅菌フィルターで）滅菌濾過した
ｐＨ１１のホウ酸バッファー（１０ｍｌ）中の塩酸ホモ
システィンチオラクトン（８６ｍｇ）、エチレンジアミ
ンテトラ酢酸二ナトリウム塩（８６ｍｇ）及びジチオト
レイトール（１７ｍｇ）から成るチオール化混合物に再
び懸濁させた。このペレットをホモジナイズして（Ｄｏ
ｕｎｃｅ）　、滅菌した１５ｍｌ遠心分離管に移し、脱
気して窒素を充填した。反応混合物をひと晩（２０．５
時間）室温で遠心した後に、超遠心分離管に移し、１Ｍ
　ＫＨ２ＰＯ４　でドーピングした。タンパク質を（４
℃，４３Ｋｒｐｍ　で２時間）ペレットにし、０．１Ｍ
Ｈ２ＰＯ４　バッファー（１０ｍｌ）に再懸濁し、ホモ
ジナイズして（Ｄｏｕｎｃｅ）　、再び（４℃，４３Ｋ
ｒｐｍ　で２時間）ペレットにした。この滅菌タンパク
質ペレットを、そのままペプチド−多糖溶液との抱合に
用いた。滅菌タンパク質ペレットを、（Ｍｉｌｌｉｐｏ
ｒｅ　Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ　０．２２μｍ　滅菌フィル
ターで）滅菌濾過した多糖−ペプチド溶液に再懸濁して
、ホモジナイズした（Ｄｏｕｎｃｅ）　。ただちに　Ｅ
ｌｌｍａｎ　テストを行なうと、１５．３μｍｏｌ　の
ＳＨタイター（ＯＤ４１２　＝０．７３０）を示した。 反応混合物を滅菌した１５ｍｌ遠心分離管に移し、脱気
して窒素を充填し、ひと晩（２１時間）ねかせた。　Ｅ
ｌｌｍａｎ　テストは８．２μｍｏｌ　のＳＨタイター
を示した（ＯＤ４１２　＝０．３９０）。 タンパク質は、ｐＨ８．０　ＨＰＯ４　バッファー（５
ｍｌ）中のＮ−エチルマレイミド（７５ｍｇ）から成る
（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ　０．２２
μｍ　滅菌フィルターで）滅菌した溶液１ｍｌを加えて
キャッピングした。この混合物を室温でひと晩（１６時
間）ねかせた。　Ｅｌｌｍａｎ　テストは今度ははっき
りとネガティブであった（ＯＤ４１２＝０．０６６，Ｓ
Ｈタイター＝１．３８μｍｏｌ　）。キャッピングした
滅菌抱合体を（４℃，４３Ｋｒｐｍ　で２時間）超遠心
分離してペレットにした後に、滅菌水（１０ｍｌ）に再
懸濁してホモジナイズして（Ｄｏｕｎｃｅ）　、滅菌し
たプラスチック１５ｍｌ遠心分離管に保存した。アッセ
イを（１００μｌ　の溶液をそれぞれ用いて）行なうと
、Ｌｏｗｒｙ法ではタンパク質１．５０ｍｇ／ｍｌ、Ｓ
ｐｉｃｏ　アミノ酸分析ではＮｌｅ＝２ｎｍｏｌ／１０
０μｌ　であった。Ｎｌｅの濃度は、変換に用いた分子
量１２２１のペプチドの濃度と同じであるので、ペプチ
ドローディングは直接に上記の値から計算できる。した
がって、ペプチド濃度は０．０２４２ｍｇ／ｍｌと計算
され、当該抱合体として０．０１６１ｍｇ　ＰＥＰ／ｍ
ｇＯＭＰＣのペプチドローディングを得た。
【００３１】実施例２６ｃＰＮＤ９−ＰＲＰ−ＯＭＰＣ
の製造（ただしｃＰＮＤ９は構造式：
【化２８】 を有する）実施例２５のＰｕＰｓ６Ｂ−ＢｕＡ２　−Ｂ
ｒＡｃと同じ方法で製造した３３ｍｇのＰＲＰ−ＢｕＡ
２　−ＢｒＡｃ（１７ＢｕＡ２　−ＢｒＡｃ／１００Ｐ
ＲＰモノマー単位）を３．５ｍｌｐＨ８の（０．１Ｍ　
ＰＯ４）バッファーに溶解した。この溶液を脱気して、
大気をＮ２　と交換し、６．９ｍｇのｃＰＮＤ９を加え
た。純粋なものである場合、これは５．６５ｍｍｏｌの
環状ペプチド（分子量１２２１）にあたる。しかし、　
Ｅｌｌｍａｎ　アッセイは、ただ１．５μｍｏｌ　のＳ
Ｈの存在を示した。ペプチド−ＰＲＰ溶液を７時間ねか
せて（Ｅｌｌｍａｎ＝０）、その後４リットルの水で１
６時間透析した。アリコートを凍結乾燥すると、ＮＭＲ
スペクトルはフェニル共鳴（７．２８及び７．４３ｐｐ
ｍ　）があり、ＰＲＰと抱合したペプチドが存在すると
思われた。ＯＭＰＣを通常通りＮ−アセチルホモシステ
ィンチオラクトンで官能基化すると、チオール化したＯ
ＭＰＣ（７．３５μｍｏｌ　ＳＨ／４５ｍｇＯＭＰＣ出
発ＯＭＰＣ＝０．１６３μｍｏｌ　ＳＨ／ｍｇ）を得た
。まずリン酸塩でｐＨ８に緩衝した後に０．２２μ滅菌
　ｍｉｌｌｅｘ　ＧＶフィルターで濾過した３ｍｌのペ
プチジル化したＰＲＰに、チオール化したタンパク質を
再懸濁させた。このＯＭＰＣ−ペプチジル化ＰＲＰ混合
物を脱気して、４１時間ねかせた。この時点で５５％の
チオールタイターが残っていた。ｐＨ８のバッファー中
の（３１ｍｇ／３．５ｍｌ）のＮ−エチルマレイミドを
滅菌濾過した溶液（０．６ｍｌ）を加えて、反応混合物
を２．５時間ねかせた。このときチオールは存在しなか
った。溶液を水で１０ｍｌに希釈し、４３，０００ｒｐ
ｍ　で２時間、４℃で遠心分離した。ペレットを１０ｍ
ｌの水に再懸濁して、上記と同様に遠心分離した。２回
目の遠心分離で得たペレットを７ｍｌの　Ｈ２Ｏに再懸
濁して、４℃で６０時間ねかせた。低速で　ｃｌｉｎｉ
ｃａｌ　遠心すると、少量の沈殿がペレット状になった
。上澄みを　Ｓｐｉｃｏでアッセイすると、ＳＣＭＨＣ
／ｌｙｓ　＝０．０５５、ノルロイシン（Ｎｌｅ）濃度
は４．８ｎｍｏｌ／ｍｌであり、これはペプチド濃度に
して０．００５６ｍｇＰＥＰ／ｍｌであった（ペプチド
の分子量を１２２１とした）。タンパク質アッセイ（Ｌ
ｏｗｒｙ　法）は、０．８１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質
の存在を示した。つまり、当該抱合体のペプチドローデ
ィングは０．００７２であった。
【００３２】以上の、説明を目的とした実施例を揚げこ
の詳細は、本発明の原理を教えるものであるが、本発明
の実施は、前記の請求項及び請求項と同主旨のものの範
囲内にある、あらゆる通常の変更、適用、修正又は削除
を含むと考えるべきである。

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　構造式： 【化１】 を有する環状ＨＩＶ　　ＰＮＤペプチド又はその製薬上
    許容し得る塩。〔式中：ｒはａ）水素ｂ）ベンジルオキ
    シカルボニルｃ）Ａｃ−Ｃｙｓ、又はｄ）Ａｃ−Ｃｙｓ
    （Ａｃｍ）　；Ｒ１　はａ）結合、又はｂ）任意に標識
    アミノ酸を含む１ないし５個のアミノ酸のペプチド；Ｒ
    ２　はａ）Ｒ３　が少なくとも２個のアミノ酸のペプチ
    ドの場合には、結合又はアミノ酸１７個までのペプチド
    、又はｂ）Ｒ３　が結合の場合には、２ないし１７個の
    アミノ酸のペプチド；Ｒ３　はａ）Ｒ２　が少なくとも
    ２個のアミノ酸のペプチドの場合には、Ｒ７　との結合
    又はアミノ酸１７個までのペプチド、又はｂ）Ｒ２　が
    結合の場合には２ないし１７個のアミノ酸のペプチド；
    −ＧＰＧＲ−は−ＧｌｙＰｒｏＧｌｙＡｒｇ−のテトラ
    マー；Ｒ５　は、Ｒ３　が結合の場合にはループのアミ
    ノ酸へ結合し、あるいはＲ３　がアミノ酸又はペプチド
    の場合にはＲ３　に結合するが、ａ）１ないし５個のア
    ミノ酸のペプチドｂ）標識アミノ酸ｃ）−ＯＨｄ）−Ｃ
    ＯＯＨｅ）−ＣＯＮＨ２　、又はｆ）なしより選択する
    ；Ｒ７　はａ）Ｒ３　から環のカルボニルの炭素への結
    合ｂ）低級アルキルｃ）置換した低級アルキルｄ）低級
    ヘテロアルキルｅ）置換した低級ヘテロアルキル、又は
    ｆ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＯＮＨ２）ＮＨ−　；Ｒ８
    は結合、又は１ないし８個の炭素からなる低級アルキル
    である。〕
  2. 【請求項２】　　構造式： 【化２】 を有する請求項１の環状ペプチド、又はその製薬上許容
    し得る塩。〔式中：−ＧＰＧＲ−は−ＧｌｙＰｒｏＧｌ
    ｙＡｒｇ−のテトラマー；Ｘ１　はａ）セリンｂ）プロ
    リンｃ）アルギニンｄ）ヒスチジンｅ）グルタミン、又
    はｆ）トレオニンから選択したＲ２　の構成要素；Ｘ２
    はａ）イソロイシンｂ）アルギニンｃ）バリン、又はｄ
    ）メチオニンから選択したＲ２　の構成要素；ＸｎはＲ
    ２　の構成要素であり、結合又はアミノ酸１５個までの
    ペプチドのいずれかである；Ｘ３　はａ）アラニンｂ）
    アルギニン、又はｃ）バリンから選択したＲ３　の構成
    要素；Ｘ４　はａ）フェニルアラニンｂ）イソロイシン
    ｃ）バリン、又はｄ）ロイシンから選択したＲ３　の構
    成要素；そしてＸｍはＲ３　の構成要素であり、結合又
    はアミノ酸１５個までのペプチドである。〕
  3. 【請求項３】　　構造式： 【化３】 を有する請求項１の環状ペプチド又はその製薬上許容し
    得る塩。〔式中、−ＧＰＧＲ−は−ＧｌｙＰｒｏＧｌｙ
    Ａｒｇ−のテトラマー；Ｘ１　はａ）セリンｂ）プロリ
    ンｃ）アルギニンｄ）ヒスチジンｅ）グルタミン、又は
    ｆ）トレオニンから選択したＲ２　の構成要素；Ｘ２　
    はａ）イソロイシンｂ）アルギニンｃ）バリン、又はｄ
    ）メチオニンから選択したＲ２　の構成要素；ＸｎはＲ
    ２　の構成要素であり、結合又はアミノ酸１５個までの
    ペプチドのいずれかである；Ｘ３　はａ）アラニンｂ）
    アルギニン、又はｃ）バリンから選択したＲ３　の構成
    要素；Ｘ４　はａ）フェニルアラニンｂ）イソロイシン
    ｃ）バリン又はｄ）ロイシンから選択したＲ３　の構成
    要素；そしてＸｍはＲ３　の構成要素であり、結合又は
    アミノ酸１５個までのペプチドいずれかである。〕
  4. 【請求項４】　　以下の構造式を有する請求項１のペプ
    チド。 【化４】 【化５】 【化６】
  5. 【請求項５】　　以下の構造式を有する請求項４の環状
    ペプチド。 【化７】
  6. 【請求項６】　　請求項１のペプチドの製造工程におい
    て、（ａ）　適当に保護したアミノ酸を有する鎖状ペプ
    チドの合成；（ｂ）　固相合成によりこのペプチドを製
    造した後にペプチドを固体支持体より切りはなすこと；
    （ｃ）　切断したペプチド溶液の中和と脱塩；（ｄ）　
    ＤＭＦ又はＣＨ２Ｃｌ２から選択した有機溶媒中への、
    ステップ（ｃ）　の生成物の可溶化；及び（ｅ）　ルー
    プ状アミノ酸の一端の保護しないアミノ基とループ状ア
    ミノ酸の他端の遊離カルボキシル基の間にペプチド結合
    を形成させる媒体となるＤＰＰＡ及びＢＯＰのうちから
    選択した試薬に、ステップ（ｄ）　の生成物を接触させ
    ることからなることを特徴とする方法。
  7. 【請求項７】　　遊離アミノ基がリジンのε−アミノ基
    、リジンのα−アミノ基又はペプチドの遊離アミノ末端
    から選択され、遊離カルボキシル基がペプチドの遊離カ
    ルボキシ末端あるいは、グルタミン酸、アスパラギン酸
    およびイソグルタミン酸から選択した酸性アミノ酸の側
    鎖である、請求項６の方法。
  8. 【請求項８】　　ペプチドをＤＭＦ中のＤＰＰＡとの処
    理で環化する請求項７の方法。
  9. 【請求項９】　　構造式： 【化８】 を有するペプチドを製造するために、構造式：【化９】 を有する鎖状ペプチドの環化を含む請求項８の方法。 〔式中：くねくねした線は　−（ＣＨ２）４−　を表わ
    す；−ＧＰＧＲ−は−ＧｌｙＰｒｏＧｌｙＡｒｇ−のテ
    トラマー；Ｘ１　はａ）セリンｂ）プロリンｃ）アルギ
    ニンｄ）ヒスチジンｅ）グルタミン、又はｆ）トレオニ
    ンから選択したＲ２　の構成要素；Ｘ２　はａ）イソロ
    イシンｂ）アルギニンｃ）バリン、又はｄ）メチオニン
    から選択したＲ２　の構成要素；ＸｎはＲ２　の構成要
    素であり、結合又はアミノ酸１５個までのペプチド；Ｘ
    ３　はａ）アラニンｂ）アルギニン、又はｃ）バリンか
    ら選択したＲ３　の構成要素；Ｘ４　はａ）フェニルア
    ラニンｂ）イソロイシンｃ）バリン、又はｄ）ロイシン
    から選択したＲ３の構成要素；そしてＸｍはＲ３　の構
    成要素であり、結合又はアミノ酸１５個までのペプチド
    である。〕
  10. 【請求項１０】　　構造式： 【化１０】 を有するペプチドを製造するために、構造式：【化１１
    】 を有する鎖状ペプチドの環化を含む請求項８の方法。 〔式中：くねくねした線は　−（ＣＨ２）４−　を表わ
    す；−ＧＰＧＲ−は−ＧｌｙＰｒｏＧｌｙＡｒｇ−のテ
    トラマー；Ｘ１　はａ）セリンｂ）プロリンｃ）アルギ
    ニンｄ）ヒスチジンｅ）グルタミン、又はｆ）トレオニ
    ンから選択したＲ２　の構成要素；Ｘ２　はａ）イソロ
    イシンｂ）アルギニンｃ）バリン、又はｄ）メチオニン
    から選択したＲ２　の構成要素；ＸｎはＲ２　の構成要
    素であり、結合又はアミノ酸１５個までのペプチドのい
    ずれかである；Ｘ３　はａ）アラニンｂ）アルギニン、
    又はｃ）バリンから選択したＲ３　の構成要素；Ｘ４　
    はａ）フェニルアラニンｂ）イソロイシンｃ）バリン、
    又はｄ）ロイシンから選択したＲ３　の構成要素である
    ；そしてＸｍはＲ３　の構成要素であり、結合、又はア
    ミノ酸１５個までのペプチドのいずれかである。〕
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