CN1033865C - 生产葡糖基转移酶的抗体和含该抗体的预防龋齿组合物的方法 - Google Patents

生产葡糖基转移酶的抗体和含该抗体的预防龋齿组合物的方法 Download PDF

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Abstract

能产生龋齿的S.mutans血清型c、e或f的细胞结合葡糖基转移酶被分离和净化，并揭示了它作为一种酶的特征。此外，抗该种酶的抗体已由用这种酶免疫的母鸡所产的蛋来制备。由于这种抗体能有效地防止上述S.mutans对牙齿表面的粘着，所以它被用作龋齿预防组合物的有效成份。

Description

生产葡糖基转移酶的抗体和含该抗体的预防龋齿组合物的方法
本发明涉及一种细胞结合的葡糖基转移酶，该酶与蔗糖反应并且催化合成水不溶性葡聚糖的反应，本发明还涉及纯化和生产这种酶的方法。
本发明还涉及一种对于Streptococcus mutans具有免疫活性的抗体，该细菌已知是诱发龋齿的病原菌，本发明还涉及含所说抗体作为有效成份的预防龋齿的组合物。
从预防龋齿的角度出发，已经对被认为是引起龋齿的细菌S.mutans进行了大量的研究，还对这种细菌在龋齿形成中有关的机制进行了大量的研究。
至于与形成龋齿有关的S.mutans菌株，现已发现了按血清分类可分为血清a至h的八种菌株。在这些血清型中，根据血清学的类似性，已确定了两个亚组，血清型a和g在一组，而血清型c，e和f在另一组。
早已了解到在S.mutans与形成龋齿有关的机制中，由蔗糖产生粘着的、水不溶性葡聚糖的过程是重要的过程，在这个过程中，由S.mutans产生的葡糖基转移酶(以下称GTF)起了重要作用。
这种由S.mutans产生的GTF既可在培养物上清液中找到，也可在已结合形式的细胞表面上找到。
例如，在血清型d或g株的培养液中，两者在血清学上相类似，在没有蔗糖存在的情况下，GTF几乎全部存在于培养物的上清液中。其中有三种GTF，即GTF-S1，GTF-S2和GTF-I，目前已得到分离和纯化(S代表一种水溶性葡聚糖合成酶，而I代表水不溶性葡聚糖合成酶)。这三种类型的GTF一起配合产生粘着的、水不溶性葡聚糖(如见“Synthesis of glucans byStreptococcus mutans a：d adherencemechanisms”T.Koga，Jap.J.Bacteriol.，41(4)，679，1986)。
此外，在蔗糖存在的情况下，血清型(d)和g株的培养物中，己知上述三种GTF几乎都是通过与葡聚糖连接而与细胞结合，从而得到细胞结合的型式(Hamada，S.and Slade，H.D.，Archs Oral.Biol.，24，399-402，1979)。
另一方面，GTF-S和GTF-I也已从血清学上彼此相似的血清型c，e和f系的培养物上清液中得以分离(Kuramitsu，H.K.and Wondrack，L.，Infect.Immun.，42，763-770，1983)。
然而，现在还没有一份有关不溶性的、粘着的葡聚糖能用这些GTF-S和GTF-I的联合作用来合成的报导。
此外，一直在努力研制防止龋齿的方法，把S.mutans作为靶生物体。一种已知的通过控制口腔中S.mutans的集群化(特别是通过控制与牙齿表面的粘着)来防止龋齿的方法的例子是一种使用对S.mutans有免疫活性的抗体来防止龋齿的方法。也就是通过使用已经用S.mutans细胞而获得免疫力的牛奶来防止口腔中S.mutans的集群化。这一方法已公开在英国专利说明书1505513号中。日本专利公开说明60-38327公开了一种由抗血清和/或用S.mutans培养物口收的组分如细胞壁而获得免疫力的哺乳动物的乳汁，以及选自葡糖基转移酶抑制剂、蛋白酶和葡聚糖酶中的一种或多种增效剂复合而成的龋齿预防剂。
然而，通过对S.mutans具有免疫活性的抗体来防止龋齿的效果，并不总是令人满意的，除此之外，还因为这类抗体通常是用免疫的哺乳类动物的乳汁或抗血清来制备的，在许多情况下，由于不适于成批生产或生产成本过高这样一些缺点，而不能实际生产。
为了建立一些更加有效的龋齿预防技术，本发明人一直将注意力集中于分布于人口腔中并被认为对人的龋齿形成起最重要作用的血清型c株，也对与血清型c在血清学上相似的血清型e和f株进行了研究。在各种用于说明这些菌株与形成龋齿有关的机制的研究过程中，本发明人已分离并纯化了在用这些细菌合成水不溶性葡聚糖的过程中起作用的GTF组分。而且，还从说明GTF的性质是很重要的角度进行了这些研究工作。
结果，本发明人证实了在由这些细菌产生的GTF组分中，存在细胞结合的GTF，它们具有水不溶性葡聚糖的合成酶活性(下文称之为CA-GTF-I)，这种活性在细菌与牙齿表面的粘着中，特别是在与蔗糖有关的粘着中可能起着重要作用。因此，本发明人力求分离和纯化这种CA-GTF-I。
此外，使用一些常规技术，分离血清型c、e或f株的细胞结合型的GTF-I成为纯化的酶蛋白，至今未能成功地实现，以便能彻底地研究它们的性质。
例如，对于由血清型c株产生的细胞结合型GTF-I，有Kuramitsu的一份报告(Kuramitsu，H.K.，Infect.Immun.，10，227-235，1974)。也就是说，Kuramitsu等人通过采用1M的NaCl，从细胞中获得了具有水不溶葡聚糖合成酶活性的提取物，并研究了作为GTF的这种提取物的性质。在该文中，报导了对提取物中的GTF活性来说PH最佳值为6.0，而温度最佳值为37℃。
然而，由于在纯化过程中必须进行的脱盐处理时，Kuramitsu获得的提取物变成不溶于水的，所以从该提取物中获得一个具有GTF活性的提纯的蛋白质组分一直不大成功。因此，Kuramitsu提供的有关细胞结合GTF组份的数据不是以一个纯化的酶蛋白质组分为基础的，因而，这些数据用在描述具有GTF活性的酶上被认为是极不合适的，尤其是由细胞提取的组分中所含有的酶完全不能表征成酶蛋白，即还没有说明任何诸如分子量或等电点这样的特性。
另一方面，Kenney等人或Kuramitsu等人现已证明血清型c株的GTF-I存在于培养物的上清液组分中。
Kenney等人还证明了具分子量为153K道尔顿，具有合成水不溶性的多糖类活性的GTF-Ic存在于血清型c株的培养物上清液中(A.C.Kenney and J.A.Cole，FEMSMicrobiol.Lett.，16，159-162，1983)。
然而，Kenney等人只是证明了GTF-Ic在培养物上清液中的存在，他们既没有提供分离和纯化该酶的资料，也没有提供以一个蛋白质形式来描述该酶所必须的数据。
在另一方面，Kuramitsu等人已从c型株的培养物上清液中分离出包含具有合成水溶性葡聚糖活性的葡聚糖蔗糖酶(DS，GTF-Sc)组分，以及包含具有合成水不溶性葡聚糖活性的mutansynthetase(MS，GTF-Ic)组分，然后对这些组分进行各种分析例如进行GTF活性分析以证明DS和MS是两种不同的酶。所获得的MS具有与DS不同的免疫性，且分子量为155K道尔顿，等电点(pl)为4-5(Kuramitsu，H.K.andWondrack.L.，Infect.Immun.，42，763-770，1983)。
在这些情况下，本发明人为证实这种酶的存在，在研究分离和纯化CA-GTF-I的工艺过程中做出了许多努力。结果，本发明人首次由血清型c细菌的细胞成功地分离并纯化出CA-GTF-I，并且获得了有关其特征的新的资料，从而完成了本发明。
此外，本发明人还获得了这样分离和纯化得到的抗CA-GTF-I的抗体，在防止与牙齿表面的粘着上具有显著效果的新的信息，以及可以通过用这种纯化的CA-GTF-I作为抗原而获得免疫的母鸡，以很低的费用大规模地生产这种抗体，以至于完成了本发明。
本发明的一个目的是提供水不溶性葡聚糖合成酶形式的CA-GTF-I，它可用于开发说明龋齿形成的详尽机制或对龋齿预防所必须的更有效的技术和各种药剂中。
本发明另一个目的是提供对S.mutans具有免疫活性的抗体，该抗体在防止S.mutans粘着在牙齿表面有着足够的效果，并且适于作龋齿预防组合物的有效成份。
本发明还有一个目的是提供以低成本大规模生产这种抗体的方法。
本发明再有一个目的是提供一种含该抗体作为有效成分的龋齿预防组合物。
图1表示从例3的DEAE-Sephacel上洗提出的组分中的蛋白质浓度(A280)，GTF活性和FT酶(D—果糖基转移酶)活性。
图2表示由例3的羟基磷灰石(hydroxylapatite)上洗提出的组分中的蛋白质浓度(A280)、GTF活性和FT酶活性。
图3表示例3免疫母鸡抗体滴定度的变化。
本发明的分离出的细胞结合葡糖基转移酶(CA-GTF-I)至少具有下列物理化学特性：
(1)反应和底物特性：
与蔗糖反应产生水不溶性葡聚糖。
(2)PH最佳值：PH6.7-7.0。
(3)最佳温度范围：15-50℃。
(4)失活条件：
于80℃下加热5分钟失活。
(5)分子量：
用SDS-聚丙烯酰凝胶电泳测定为150K-165K道尔顿。
(6)免疫性：
是动物体的免疫原，因为诱发产生抗该酶的特异抗体。
还鉴于CA-GTF-I的GTF活性的最佳PH值如前所述与口腔中的PH值大致相同这一事实，很容易理解CA-GTF-I可能会对口腔中S.mutans的特性上起重要的作用。
如上所述，由于CA-GTF-I能够是动物体的免疫原，所以通过向动物体施用这种酶就能产生该酶的特异抗体。用这种方法所获得的抗体如前所述，在防止龋齿的领域中是有用的。
此外，CA-GTF-I能有效地应用于由蔗糖生产葡聚糖。
例如通过测量进入到该酶与作为底物的〔14C-葡萄糖〕蔗糖反应而产生的葡聚糖中的放射活性量可以测定出CA-GTF-I的酶活性。
规定一个单位(U)的GT酶活性为：每分钟有1.0毫摩尔的葡萄糖残基从蔗糖分子进入葡聚糖中所需要的酶的量。
例如通过分离和纯化以细胞结合型式产生的GTF-I可以从这些细胞获得CA-GTF-I。
很明显，正如下文各实例中所描述的那样，CA-GTF-I与存在于血清型c细菌培养物上清液中的GTF-S(CF-GTF-S有显著的区别，并具有合成水溶性葡聚糖的活性。
本发明的CA-GTF-I能按下述方式自血清型c、e或f株的细菌中分离并纯化出来。
首先，血清型c、e或f的细胞在一合适的培养基中培养，然后收集所得到的细胞，需要时可以洗涤。
用于本发明的血清型c菌株是如S.mutans MT8148株，Ingbritt株和NCTC10449株。
而且，这些菌株都为公知，并易获取。
例如S.mutans MT8148株和Ingbritt株可以从大板大学牙科系得到，而NCTC10449株则从美国典型培养物收集中心以ATCC25175菌株得到。此外，对于血清型e和f株，可以使用任何一种公知的可取得的菌株。
至于培养基，任何一种至少含果糖的培养基都可使用。例如，TTy培养基〔由胰蛋白酶(Trypticase)、类胰蛋白酶(Tryptose)和酵母提取物组成的复合培养基〕、BHI(脑心浸剂Brain.Heart Infusion)培养基和FMC培养基都可使用。
除此之外，预期对适宜的细菌会生长和CA-GTF-I会产生的任何温度范围都可用于进行培养。然而，就充分的细菌生长和CA-GTF-I的产生而言，通常采用接近37℃的温度。
培养所需要的时间随培养条件，例如培养温度和使用的培养基种类的不同而不同。使CA-GTF-I的产率达到最佳值的培养时间可以很方便地被选择：通常可采用18-20小时。
此外，其他培养条件也可根据上述的观点加以选择。
接着从这些细胞中提取CA-GTF-I。
从细胞中提取CA-GTF-I，例如可以通过将细胞与诸如脲溶液和胍-HCl溶液这样的提取溶液接触的方法来进行。
提取条件如悬浮于提取溶液中细胞的浓度、提取溶液的浓度、提取的温度和时间都可根据提取溶液的种类适当地选择，使所需要的酶尽可能充分地被提取。
此外，为了以高产率获得具有高特异活性的提取物，用6-10M的脲溶液为好，最好是8M，提取在20-30℃下进行为好，最好是25℃，时间大约在15分钟到2小时。
提取之后，固体组分如细胞通过例如离心法从提取物中被除去，所得到的上清液再通过诸如透析、超滤或凝胶过滤这样的一些程序加以处理，以便从提取物中除去脲、低分子量杂质等物，便可得到粗制CA-GTF-I提取物。
在用如透析法处理的过程中，如有沉淀形成，沉淀要用离心法除去。
除此之外，粗的提取制剂可以被纯化，以得到纯化的CA-GTF-I制剂。
为了纯化，通常用于酶纯化的各种方法都可使用，例如，像在下文所要说明的那样，一种由两个吸附程序组合的方法，一个用阴离子交换剂而另一个用羟基磷灰石是很方便的。
用于纯化粗提取物制剂的阴离子交换剂的例子是具有诸如二乙氨基乙基(DEAE)功能基团的阴离子交换剂，具体地说，可以使用DEAE-Sephacel(Pharmacia公司)。
要被使用的羟基磷灰石的例子是生物—凝胶HTP(Bio-Red实验室)。
在使用阴离子交换剂进行纯化的程序中，含在粗提取制剂中的被提取成分(粗蛋白质成分)被加至阴离子交换柱上，然后选择性地从吸附于阴离子交换剂上的组份中选择性地把含所需酶的组份洗脱下来。
例如，通过控制洗脱液的盐浓度，可获得含所需酶的组分。
这种盐的浓度依阴离子交换剂的种类或洗脱条件而变化。通过选择一个范围来确定盐的浓度，在该范围内含GTF(I)的组份可选择性地被分级分离。
例如在使用DEAE-Sephacel的情况下，可用在磷酸盐缓冲液中的浓度范围在C.45-1.0 M的NaCl来获取GTF-I。
要与阴离子交换剂接触的样品可由粗的提取制剂按一种方式来制备。以这种方式，粗的蛋白质组份是通过用如硫酸铵这样的盐的溶液或诸如乙醇这样的有机溶剂去沉淀该粗提取制剂，然后采用离心等步骤回收所得到的沉淀，再将该沉淀悬浮于一种合适的溶剂中，需要时再采用如渗析这样的方法从沉淀中除去低分子量的杂质而获得的。
在用阴离子交换剂处理之后，合并具有GTF(-I)活性的各组份。采用例如渗析法脱盐，然后加到羟基磷灰石柱上。
其后，CA-GTF-I组份被选择性地从已吸附于羟磷灰石上的组份中洗脱下来，合并，需要时可再经渗析等步骤处理，以便得到纯化的CA-GTF-I制剂。
如此得到的纯化CA-GTF-I制剂在SDS-PAGE凝胶上能给出相应于分子量为150K-160K道尔顿的单一谱带。
而且，根据上述步骤，例如如同在下面实例中要说明的那样，这样的纯化应当达到具有比活性为6.96U/mg蛋白质的酶。
此外，本研究中的CA-GTF-I能通过前述的细菌培养和提取步骤生产。所得到的提取物能被纯化至所要求的纯度。
本发明的具有抗S.mutans免疫活性的抗体(抗-CA-GTF-I抗体)能以免疫球蛋白的形式而被制取，这种免疫球蛋白是由用上述CA-GTF-I而获免疫力的母鸡所产的蛋来制备的。
为了制备母鸡免疫用的抗原体液，能使用的CA-GTF-I的例子是含在细胞提取物中或由上述分离CA-GTF-I步骤所得的粗制剂中的，或以纯化制剂形式获得的CA-GTF-I。
这种抗CA-GTF-I抗体可由用上述CA-GTF-I免疫的母鸡的蛋来制备。
至于用来免疫的母鸡，任何种类的母鸡都可使用，但从大批量生产的观点来看，最好使用产蛋鸡，如白来享鸡(White Leghorns)。
而且，用CA-GTF-I进行免疫的方法是一些普通的方法，如皮下注射、腹腔注射、肌肉注射、鼻内注射和滴入眼睛。此外，剂量要适当地加以选择，以便获得所要求的抗体滴定度，而对鸡不会带来危害性的影响。
通常，在首次免疫作用后的数周内，在鸡蛋中(蛋黄)会产生与抗原特别反应的抗体，如果需要，佐剂如FCA(Freund完全佐剂)或FlA(Freund不完全佐剂)可以与CA-GTF-I结合使用。
本发明的抗CA-GTF-I抗体是由免疫作用后约一个月或更久的产蛋鸡所生的蛋来制备。
而且，例如可以采用酶连接的免疫溶剂测定法(ELISA)或放射免疫测定法来测定抗体滴定度。而抗体滴定度的变化可在免疫作用后以约2周的时间间隔内，通过测量抗体滴定度加以跟踪。
在下文将要提到的各实施中，抗体滴定度的变化是通过使用ELISA法监测的。而鸡蛋是在抗体滴定度提高到足以制备本发明的抗CA-GTF-I抗体时，再收集的。
通常高的抗体滴定度能维持3个月以上。
免疫作用后，当抗体滴定度下降时，抗体滴定度可通过以适当的时间间隔适当地给予补充的免疫作用而增加。
本发明的抗CA-GTF-I抗体可以例如通过提取和分离含在如上所述的免疫母鸡的蛋黄中的免疫球蛋白来制备。
用于提取和分离的方法的例子包含各种通常用于提取和分离免疫球蛋白的方法，例如使用葡聚糖硫酸盐或聚乙烯醇(PEG)沉淀并用丙醇或氯仿萃取。
如上所述获取的抗CA-GTF-I抗体，作为抗体能和以与S.mutans细胞结合形式存在的CA-GTF-I发生特异反应。换句话说，它具有抗S.mutans的免疫活性。
具有抗S.mutans免疫活性的抗CA-GTF-I抗体具有抑制S.mutans与牙齿表面粘着的作用，因此，通过向口腔施用该抗体，能够控制口腔中S.mutans的活性，从而防止了龋齿的形成。
本发明龋齿预防组合物含有上述抗CA-GTF-I抗体作为有效成份，并且可按照向口腔给药的方式制成各种剂型。
例如，当以漱口剂或牙膏形式使用时，可以以一个有效的量将抗CA-GTF-I抗体加到该制备方法中的各种组分中。
加入龋齿预防组合物中抗CA-GTF-I抗体的量，要按照适合于每种给药方式的剂量，适当地选择。例如，当抗体滴定度超过103时，可使用重量计约0.0001-10％的量抗体。
本发明的龋齿预防组合物可按多种制品形式提供，包括例如牙粉、漱口剂、口腔凉爽液糖锭剂、口香糖等。龋齿预防组合物还可通过将上述抗CA-GTF-I抗体与各种载体和/或一般用于制备该制品的多种添加剂组合起来制备。对于它们的制备，可以采用用于该制品制备的任何一种众所周知的方法。
普遍用于制备该制品的载体和添加剂的混合比例也可用于制备本发明的组合物。
一般来说牙膏可以由磨擦剂、粘合剂、水份保留剂、发泡剂和香料组成。
磨擦剂的例子包括磷酸氢钙、碳酸钙、焦磷酸钙、不溶性偏磷酸钠、硅胶水合物等。牙膏通常含有10-95％(重量计)的磨擦剂。
粘合剂的例子包括羧甲基纤维素、藻酸钠、角叉菜胶(Carrageenan)等。牙膏一般含0.5-4％的粘合剂。
水份保留剂的例子包括山梨糖醇、甘油、丙二醇等。牙膏一般含有5-30％的水份保留剂。
发泡剂的例子可包括阴离子活性剂，如月桂基硫酸二钠盐、月桂酰肌氨酸酯和甘油—月桂酸酯。非离子活性剂如蔗糖脂肪酸脂、月桂基二乙醇胺和硬脂酸单酸甘油酯等。牙膏一般含发泡剂为0.5-2％。
另外，利用母鸡采用上述的方法获得的本发明的抗CA-GTF-I抗体，与用常规哺乳类动物免疫法所获得的抗体相比较，具有下列优点：
(1)本发明的抗体能在免疫母鸡的蛋中生产，这样在收集或处理鸡蛋以及由鸡蛋制取抗体中，不需要专门的或熟练的技术。然而，在免疫球蛋白中，只有IgG抗体被转移到蛋黄中，以至于只有IgG易于取得。
相反，在抗体是由抽取免疫哺乳类动物血液制取的情况下，抽血必须熟练的技术，此外，由血浆分离和纯化大量的IgG也是很困难的。
(2)用于制备本发明抗体的母鸡易于饲养，以至于饲养费用与例如饲养大鼠相比还要便宜。
况且，采用哺乳类动物法不适于大量生产抗体，因为由哺乳类动物连续获取大量的血液或乳汁是很困难的。相反，本发明的方法有可能大批量低费用地生产抗体，因为母鸡能在一很长的时间内连续不断地产蛋。
(3)在许多情况下，由免疫哺乳类动物的血浆或乳汁制备的抗体稳定性并不总是令人满意的，以至于在血浆或其纯化形式下必需在-80℃左右储存。
相反，本发明的抗体显示了优良的稳定性并且以鸡蛋的形式例如在4℃下贮存就能很好地保存。
此外，使用母鸡制备抗体，在某些类型的抗原情况下，并不总是获得足够的抗体滴度，例如，当使用病毒作为抗原时，就不能得到足够的滴度。
因此，本发明人首次发现，通过用细胞结合葡糖基转移酶免疫的母鸡能够获得具有足够高抗体滴度的抗体。
本发明将通过下列实例予以更详细地说明例1〔研究GTF在S.mutans不同的血清型中的定位〕
表1(由大板大学牙科系得到)举出每种不同血清型的S.mutans分别于50ml BHI培养基和TH(Todd-Hewitt)培养基中于37℃下被保温18小时。
保温后，细胞和培养物上清液用离心法分离，并用盐水洗涤所得到的细胞。
之后，细胞和培养物上清液每种的GTF活性按下法测定。所得结果列于表1。测定GTF活性的方法：1)用于测定的样品：细胞场合下：
培养的细胞经收获，用盐水洗涤，悬浮于5ml 10mM磷酸盐缓冲液中(PH6.0)，然后采用超声破坏处理以获取用于测定的细胞悬浮液样品。上清液场合下：
培养物上清液作为样品无须任何处理即可使用。2)GTF活性的测定：
每种样品10微升与含有20mM〔14C-葡萄糖〕蔗糖0.05Ci/mol)作为底物的10微升0.2M磷酸盐缓冲液(PH6.0)混合，并于37℃下反应1小时。反应后，将所有的反应混合物都置于矩形滤纸上(1.0×2.0cm)，并用甲醇洗涤。测量滤纸上保留的结合到甲醇不溶性葡聚糖中的放射性，以计算出GTF活性。
                    表1菌株            培养基  GTF活性(mV/ml)
     培养基                        EX/CA(血清型)        最终PH  胞外  细胞结合
                    (EX)   (CA)MT8148    BHI    5.6    10.1    2.4     4.2(c)       TH     5.6    14.5    3.6     4.0MT4245    BHI    5.5    17.5    1.4     12.5(e)       TH     5.5    19.5    2.1     9.3MT4251    BHI    5.4    16.7    1.5     11.1(f)       TH     5.5    12.0    3.3     3.6OMZ176    BHI    5.8    13.1    0.5     26.2(d)       TH     5.7    3.1     11.2    0.286715      BHI    5.9    11.8    0.2     59.0(g)       HI     6.0    1.9     3.2     0.59
根据表1所给出的结果，很明显的，对于血清型d和g的细菌，在BHI培养基的培养物中，即无蔗糖的情况下，发现大多数的GTF活性是在上清液中，而在TH培养基的培养物中，即有蔗糖的情况下，大多数GTF活性发现在细胞里(细胞结合型)。
另一方面，对血清型c、e和f细菌来说，未观察到在血清型d和g中观察到的那么大的差异。例2
〔从细胞提取CA-GTF-I〕
将S.mutans菌株MT8148(血清型c)在1升TTY培养基中于37℃下培养18小时。采用离心法收获细胞，并进一步用盐水洗涤两次。
然后，将几份细胞悬浮于不同的提取液中，搅拌下提取所得到的悬浮液。
在完成提取程序之后，用离心法使细胞与提取液分离，并以10mM磷酸盐缓冲液(PH6.0)对所得到的上清液进行渗析处理。
透析后，各个上清液中产生的杂质用离心法除去，再测量各个上清液中的GTF活性及蛋白质浓度。
为此，用例1所述的方法测量GTF活性，并以牛科血清清蛋白(BSA)作标准，按照Lowry等人的方法测量蛋白质的浓度，从而计算出比活性。
表2示出用于提取程序中的提取溶液和提取条件以及提取物中GTF活性的一些代表性的例子。
此外，将按上述方法得到的细胞悬浮于1mM磷酸盐缓冲液(PH6.0)中，并用20KHz和200W的超声振荡3分钟，以破裂所得到的悬浮液，制成细胞碎裂混合物。在离心脱除不溶部分后同样地测量生成的上清体液GTF活性。所得结果也列在表2中。
                表2提取方法    条件      比活性    回收率
                  (U/mg)    (％)8M脲      25℃，1小时 0.98      95.1
      4℃，1小时  0.29      28.86M胍-HCl  4℃，1小时  0.44      52.8
                            (49.2)*1M NaCl   4℃，1小时  0.45      7.3
                            (19.7)*超声振荡  4℃，3分钟  0.09      20.0*透析过程中产生的不溶化合物回收率。
根据表2所示结果明显的是它揭示出具有GTF活性的蛋白质组分能分别使用各种提取程序从细胞中提取出来，还指出为了获得高产率、高比活性的提取物，用8M脲溶液25℃提取1小时是最为合适的。例3
〔制备CA-GTF-I纯化制剂〕
因为已揭示了用8M脲于25℃下提取1小时的提取程序是最为合适的，所以，用例2介绍的同样方式在TTy培养基中(8升)培养S.mutansMT8148，收获所得到的细胞，洗涤，然后将其悬浮于300ml的8M脲溶液中。培养的细胞量干重为9.7克。
接着，将悬浮液在搅拌下于25℃提取1小时。
提取后，为了从提取液中分离出细胞，用离心法得到上清液，然后以10mM磷酸盐缓冲液(PH6.0)对它进行透析处理。
透析后，上清液中产生的不溶性物质通过离心法除去，从而制得CA-GTF-I粗提取物。
接着，向CA-GTF-I粗提取物中添加硫酸铵以达到60％饱和度，产生沉淀。将沉淀进一步溶于20ml 50mM磷酸盐缓冲液(PH7.5)中，再将所得到的溶液在50ml磷酸盐缓冲液中(PH7.5)进行透析处理。
透析后，从溶液中将透析过程产生的不溶性物质用离心法除去，并将所得到的上清液加于DEAE-Sephacel(Pharmacia公司)柱(2.5×13cm)上。
桂上吸附的组份用线性浓度梯度的NaCl磷酸盐缓冲液(PH7.5)选择性地洗脱。
用例1所述的方法测量每个组份的GTF活性，并通过在280nm处测量UV吸收值以测定蛋白质的浓度。如图1所示，发现用浓度为0.45-1.0M的NaCl所得到的组份中有明显的GTF活性。
将浓度为0.45-1.0M的NaCl洗脱的各组份合并，以10mM磷酸盐缓冲液(PH6.0)对它进行透析，然后加到预先用10mM磷酸盐缓冲液(PH6.0)平衡过的羟基磷灰石(BioGel HTP，Bio-Rad实验室)柱(1.0×13cm)上。
柱上吸附的组份用0.01、0.2、0.26和0.5M磷酸盐缓冲液(PH6.0)分步洗脱。
如上所述对每一组份都要测定其GTF活性和蛋白质的浓度。如图2所示，在0.5M磷酸盐缓冲液洗脱的组份里发现了GTF活性。
接着，合并用0.5M磷酸盐缓冲液洗脱的高活性组份，并以10mM磷酸盐缓冲液(PH6.0)对它进行透析，以制备纯化的酶制剂。
此对，表3给出了GTF活性，蛋白质含量，(TF比活性以及按上述提取和纯化程序各步骤中所得到的GTF活性组份的得率。
                   表3纯化步骤    总蛋白质  总活性 比活性   回收率  纯化
         (mg)      (U)   (U/mg)   (％)  (一倍数)SM脲提       207       471    2.01     100      1取物硫酸铵(60％  119       260    2.18      62     1.1饱和度)PEAE-
         37.4      85.9   2.30      21     1.1Sephacel羟磷灰石     4.71      32.8   6.96       8     3.5
当在下述条件下将该纯化的酶制剂加至SDS-PAGE(其中，蛋白质用Coomassie Billiant兰染色)时，可在分子量156K道尔顿的蛋白质位置上观察到单一谱带，这就证实了纯化的酶剂是一种分子量为156K道尔顿的酶蛋白。SDS-PAGE程序的条件：
按Laemmli等人的方法进行SDS-PAGE。
即粗的提取物和纯化过的酶制剂(0.2-35mg)分别用含2％SDS，5％2-巯基乙醇和20％甘油的62.5mMTris-HCl缓冲液(PH6.8)于100℃下处理3分钟。
在含0.1％SDS和4％丙烯酰胺积层凝胶的7.5％丙烯酰胺分离凝胶上，在室温下用10mA电泳2小时。
此外，用作分子量标准的是铁蛋白(220K道尔顿)、磷酸化酶(94K道尔顿)、中血清清蛋白(67K道尔顿)、过氧化氢酶(60K道尔顿)、卵清蛋白(43K道尔顿)和乳酸脱氢酶(36K道尔顿)(均从Pharmacia公司得到)。
把相当于50mU酶活性量的纯化酶制剂加至含有1％蔗糖和0.1％叠氮化钠(每个均为最终浓度)的0.1M磷酸盐缓冲液(PH6.0)中。然后用蒸馏水将该混合物的总体积调至3ml，混合并于37℃下反应18小时，再用冰冷却反应溶液至4℃终止酶反应。
在酶反应完成后，反应产物于1600×g下离心，使水不溶性沉淀部份和上清液分离。
用蒸馏水将水不溶性部份洗涤两次，然后使其悬浮于3ml的蒸馏水中，以制取水不溶性的葡聚糖制剂)。
把2.5体积的乙醇加至上清液中，并在混合完全后于4℃下放置1小时，于1600×g下离心回收所产生的沉淀，再将沉淀溶于3ml蒸馏水中，相似地重复沉淀程序，并将回收的沉淀再次溶于3ml蒸馏水中，以得到水不溶性葡聚糖制剂。
上述各制剂中所含的葡聚糖采用蒽酮法进行定量分析，并对用纯化酶制剂合成的葡聚糖的种类进行研究，结果揭示了纯化酶制剂是具有合成水不溶性葡聚糖能力的CA-GTF-I。
分别地重复上述的酶反应，并且用离心法分离出生成的水不溶性葡聚糖沉淀。沉淀(2mg)经洗涤后，采用Hakomori(Hakomori，S.，J.Biochem.，55，205，1964)法使其全部甲基化，并用90％(V/V)甲酸，接着用2M三氟乙酸使其水解。生成的水解物在有硼氢化钠存在的情况下进行还原，并在吡啶—乙酐混合物(1∶1V/V)中乙酰化，以获得部份甲基化的乙酸甘露糖醇酯(alditol acetate)衍生物。然后用带有涂以硅SPB-5(Shimadgu生产)的毛细管柱(0.25mm×30m)气相色谱分析仪(型号：GC-14A，Shimadgu生产)分析得到的衍生物。葡聚糖T10(Pha rmacia)的乙酸甘露糖醇酯也可按上述同样方法制备并用作标准样品。
分析结果表明在上述程序中得到的水不溶性葡聚糖含有62摩尔％α-1，3连接的，28％α-1，6连接的和5％α-1，3，6-连接的葡萄糖残基。
而且，通过改变如例1所述测定GTF活性中心温度和PH，对于水不溶葡聚糖合成酶活性中的纯化酶制剂的最佳温度和最佳PH值进行了研究。
还通过普通的方法测定它的Km值。
通过上述测量和试验所得到的数据列于表4。
此外，为了进行比较，表4还包括了用Baba等人的方法(Carbohydr.Res.，158，147-155，1986)，从含有渗析BHI的培养基中培养的S.mutans MT8148的培养物上清液，获得的CF-GTF-S的相应数据。
                      表4
性质                  CF-GTF-S    CA-GTF-I分子量                    156K         156KpI                       7.4          未测*最佳PH                    5.5-6.5      6.7-7.0蔗糖(mM)的Km值            17.3         11.1产品葡聚糖在水中溶解度    水可溶       水不溶*因为凝胶中形成了大范围的聚集，所以不可能进行测量。
通过使用由本发明CA-GTF-I免疫的鼠制备的抗血清的免疫斑法，证实了能与本发明CA-GTF-I反应的抗体在抗血清中被得到。
另一方面，按上述方法得到的CA-GTF-I和CF-GTF-S的抗原性质通过ELISA法来进行研究。为此目的，从皮下注射有Freund完全佐剂(FCA)的CA-GTF-I(由菌株MT8148获得)和与水溶性葡聚糖合成酶反应的单克隆抗体而被免疫的小鼠制取抗CA-GTF-I的鼠抗血清，该合成酶是采用Sato等人(Sato，S.，Koga，T.，和Inoue，M.，Carbohydr.Res.，134，293-304，1984)的方法由菌株MT8148培养物的上清液制备的。此外，碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠IgA＋IgG＋IgM抗体被用作第二代抗体，而P-硝基苯基磷酸二钠被用作为底物。所得结果列于表5。也就是说，表5显示了抗-CA-GTF-I的鼠抗血清不能与CF-GTF-S反应，而抗CF-GTF-S的单克隆抗体不能与CA-GTF-I反应，这就证明了这些酶具有不同的抗原性。
               表5涂布的抗原         在405nm处的吸收率
           抗-CF-GTF-S   抗-CA-GTF-I
           的单克隆抗体    的抗血清CF-GTF-S粗的               0.336        0.066纯化的             0.890        0.045CA-GTF-I粗的               0.125        0.356纯化的             0.054        0.666例4
〔制备抗原〕
S.mutans株Ingbritt(血清型C，取自大板大学牙科系)在15升TTy培养基中于37℃下培养18小时，培养出来的细胞用盐水洗两次。
然后，将洗涤过的细胞悬浮于400ml8M脲溶液中，并将该细胞悬浮液在25℃下搅拌1小时。离心细胞悬浮液以去除细胞，所得到的上清液用10mM磷酸盐缓冲液(PH6.0)进行透析。
透析后，离心除去上清液中产生的沉淀，并把所得到的上清液用硫酸铵以60％的饱和度进行沉淀。用离心法回收所得到的沉淀。然后再把沉淀溶于10mM磷酸盐缓冲液(PH6.0)中。得到的溶液再以同样的缓冲液进行渗透，而且用离心法脱除该溶液中出现的沉淀以得到上清液。所得到的上清液用作(免疫抗原)粗制剂。
该制剂的蛋白质浓度和总蛋白质用CBB-G法(Branford，M.M.，Anal.Biochem.，72，248，1976)测量，结果表明蛋白质浓度为5.1mg/ml，而总蛋白质为141mg。
而且，在例3中所述的条件下，对制剂进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，并用Coomassie Brilliant当(CBB)染色。结果鉴定了一些谱带。包括对应于155K道尔顿位置的谱带。
制剂分别在Tris-HCl缓冲液中于37℃下处理30分钟，并按上述同样的方式进行SDS-PAGE，只是电泳温度是4℃，生成的凝胶浸入含有1％蔗糖和0.05％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液中(PH6.0)，于37℃下处理18小时。然后，取出浸过的凝胶并用PAS(Periodicacid Schiff)试剂染色，结果在155K道尔顿的位置上检测出显示产生葡聚糖的明显着色带。
从上述SDS-PAGE的结果计算出制剂中CA-GTF-I含量是40％(以重量计)例5
〔制备纯化的CA-GTF-I制剂〕
菌株Ingbritt在与例4所述同样的条件下，在TTy培养基(8升)中培养。收获所生成的细胞洗涤，然后将细胞悬浮于300ml8M的脲溶液中。
所述悬浮液于25℃下搅拌提取1小时。
提取后，将提取溶液离心以脱除细胞，并以10mM磷酸盐缓冲液(PH6.0)对得到的上清液进行渗析。
渗析后，除去上清液中产生的沉淀，得到CA-GTF-I粗的提取制剂。
然后，加硫酸铵于粗的提取制剂中，至60％饱和度，产生沉淀，生成的沉淀进一步溶解于20ml 50mM的磷酸盐缓冲液(PH7.5)中，并以同样的缓冲液对它进行渗析。
渗析后，用离心法除去渗析过程中产生的沉淀，把得到的上清液加到DEAE-Sephacel(Pharmacia公司)柱上(2.5×13cm)。
用线性浓度梯度NaCl的磷酸盐缓冲液(PH7.5)选择性地洗脱吸附于柱上的组分。
洗脱后的每一个组份GTF活性皆按例1所述的方法测量，蛋白质浓度通过测量280nm处的UV吸收率来测定。结果观察到了在用浓度为0.45-1.0M的NaCl洗脱的组份活性明显的高。
合并用NaCl浓度为0.45-1.0M洗脱的各组份，以10mM磷酸盐缓冲液(PH6.0)对它进行渗析，然后加到已用10mM磷酸盐缓冲液(PH6.0)平衡过的羟基磷灰石(Bio GelHTP，Bio-Rad实验室)柱(1.0×13cm)上
吸附于柱上的组份用0.01M、0.2M、0.26M和0.5M磷酸盐缓冲液(PH6.0)分步洗脱.
每一组份的GTF活性及蛋白质浓度均用上述方法进行测定。结果在0.5M磷酸盐缓冲液(PH6.0)洗脱的组份中发现GTF活性。
合并用0.5M磷酸盐缓冲液(PH6.0)洗脱的高活性组份，并以10mM磷酸盐缓冲液(PH6.0)对它进行渗析，得到纯化的酶制剂。
纯化的酶制剂再在前面所述条件下进行SDS-PAGE，并用CBB使蛋白质着色，其结果是在相应于分子量155K道尔顿的位置上检测出单一谱带，它证实了纯化的酶制剂是分子量为155K道尔顿的酶蛋白。
改进例1介绍的GTF测足条件，以便研究GTF活性的PH最佳值、反应的最佳温度范围以及失活条件，其结果证明了所得到的纯化酶制剂具有前述(2)至(4)的物理化学性质。
按照例3介绍的方法，对通过纯化酶制剂的作用而合成的这种葡聚糖进行了研究，纯化酶制剂的用量相当于50mU的酶活性，其结果指出纯化酶制剂是具有合成水不溶性葡聚糖活性的CA-GTF-I。
按上述方法对得到的纯化酶制剂的蛋白质进行测量，其量为9.7mg。例6
〔抗体的制备〕
以1∶1的比例混合0.5ml按例4获得的粗CA-GTF-I制剂(按CBB-B法测量，其蛋白质含量为1mg)和0.5mlFCA(弗氏完全佐剂)制成W/O型乳剂。
第一次免疫作用是通过对母鸡左、右侧胸肌各注射0.5ml上述乳剂，然后，采用下述方法测量由鸡蛋获得的WSF(下面详述)的抗体滴定度，并观察其变化。(1)从鸡蛋中分离抗体的方法：
把从蛋中分离出来的蛋黄与等体积的PBS(磷酸盐—缓冲的盐水，PH7.4)和两倍体积的氯仿相混合。
该混合物于室温下培养30分钟，以3,000rpm离心20分钟，取其上层作为WSF(水溶性组份)。(2)测量抗体滴定度的方法。
用ELISA法测量抗体滴定度。
首先，把例1中得到的粗免疫抗原制剂加到SDS-PAGE上，以便采用电洗脱法，在SDS-PAGE上从相应于分子量为155K道尔顿的部份中分离出含蛋白质的组分。再将这一组份加到SDS-PAGE上，用CBB-R250使凝胶着色。在相应于分子量为155K道尔顿的位置上检测到一条单一谱带。
将得到的组份溶解于50mM碳酸钠缓冲液(PH9.6)中，以得出1.25mg/ml的蛋白质浓度。将所得到的每份为100μl的等分试样加到96孔微量滴定板(Immulon2，Dynateck)的每一孔二，并于4℃下培养过夜，使含在组份中的纯化抗原能被涂在该板上。
所述板用PBS-T(含0.05％吐温20的PBS)(PH7.4)洗五次。
洗涤后，用含3％BSA(牛科血清清蛋白)的PBS(PH7.4)于37℃把孔封闭1小时，然后用PBS-T洗板5次。
将以前得到的己用PBS-T分两步稀释的WSF的每份100μl的等分试样加到各孔中，然后于37℃反应1小时。
反应完成后，用PBS-T洗板5次，并将每份为100μl的结合3抗—鸡IgG抗体的(蛋白质含量为1.67μg/ml)过氧化物酶，分送至滴定板上的各孔中，该板于25℃培养30分钟，然后用PBS-T洗5次。
将20mg邻苯二胺和10μl的过氧化物(作底物)溶于50ml0.2mM磷酸二钠和0.1M柠檬酸缓冲液(PH5.0)中，取该溶液100μl加至滴定板上的各孔内。于25℃培养20分钟进行反应，然后加入100μl3N的硫酸溶液使反应终止。
反应后，由每个孔内的光密度(OD492)测量抗体滴定度。通过在稀释后得到0.2光密度时的终点滴定度法来确定抗体滴定度。
然后如图1所示，在证实第一次免疫作用后8周，蛋黄内的抗体滴定度开始下降，则按照前述同样的方法进行第二级免疫。
在第二次免疫后大约1个月收集鸡蛋，用上述方法测定抗体滴定度。
其结果是在第一次免疫后12周(2次免疫后4周)获得具有抗体滴定度为8.4×103的WSF。
而且，用Biured法测量了具有抗体滴定度为8.4×103(13ml，从13ml蛋黄中制备的)的WSF的蛋白质浓度。结果WSF中的总蛋白量约为26mg(约2.0mg/ml×13ml)。例7
〔证实抗体可抑制S.mutans与平滑表面的粘着〕
作为S.mutans与牙齿表面粘着的模型试验；进行了在玻璃表面粘着的试验。
这个实验是用于评价加入例6得到的抗体后对S.mutans与玻璃表面粘着的抑制程度，下面说明此方法。
首先，把例6中获得的具有抗体滴定度8.4×103的WSF，稀释10倍后的溶液作为试验溶液。
第二，按照例6介绍的方法，从未经免疫的母鸡(与例5所用的同一种类)的鸡蛋制备WSF作为试验溶液待用。证实这种WSF与CA-GTF-I无特异反应。
然后，把每份1ml的这些试验溶液分送至试管内(13mm×100mm)，然后再将每份2ml含1.5％蔗糖的浓缩1.5倍的BHI培养基加入试管。
接着，在每个试管内添加0.1ml在BHI培养基中预培养的S.mutans菌株Ingbritt的悬浮液，使试管倾斜30°，于37℃下静置培养18小时。
每个试管制备的制剂组合物列于表6。
在完成静止培养后，每个试管按下述方法进行处理，测定细胞对试管壁的粘着率。
在静止培养完成后，使每个试管(下文称为第1组试管)缓慢旋转，把含有细胞的、与试管壁不粘着的全部液体转移至第二组每个试管内。将每份为3ml50mM磷酸盐缓冲液(PH6.8)加到壁上粘着了细胞的第一组试管中，并再次使试管旋转，在向每个第三组试管转移含有释放出细胞的全部缓冲液后，再向每个这样得到的第一组试管添加3ml50mM磷酸盐缓冲液(PH6.8)。
第一组、第二组和第三组试管要经超声振荡处理，为的是在每根试管内制备均匀的细胞悬浮液。测量每根试管悬浮液的光密度(OD550)，按下式计算各自的粘着率：
Figure C8910142000321
计算结果列于表6。
                       表6
                          细胞悬浮液号数
                          1      2        3含1.5％蔗糖的BHI培养基浓缩3/2倍                     2ml    2ml      2mlWSF                           1ml    -WSF稀释10倍                    -     1ml      -由未经免疫母鸡的蛋得到的WSF                            -     -        1ml细菌细胞(在BHI中S.mutans株Ingbritt            0.1ml  0.1ml    0.1ml的预培养物)粘着率(％)                    26.0   65.3     89.6例8
按照例6所述的同样方法制备抗体，不同的是用例5获得的纯化CA-GTF-I制剂作为抗原。结果所获得的抗体同样能与CA-GTF-I特异反应。
接着，按照例7介绍的同样方式检查所得到的抗体对防止细菌粘着的效果，证明所得到的抗体同样具有优良的防止效果。例9
将例6所获得的具有抗体滴定度为8.4×103的WSF加至〔按重量计0.5％〕具有表7给出的组合物成份中，以制备牙膏和加至具有表8所列组合物的溶液中，以制备漱口剂。
更具体地说，在蒸馏水中溶解1.2％(重量)羧甲基纤维素和0.1％(重量)糖精钠以制成溶液，将其加至42％(重量)的焦磷酸钙中，以得到一混合物。再进一步向该混合物添加15％(重量)甘油，10％(重量)山梨醇(Sorbit)、2.0％(重量)十二烷基硫酸钠、1.0％(重量)香料和0.5％(重量)WSP。用一台捏合机或一台混合搅拌器使得到的混合物充份混合，再辊压，以制得表7所示牙膏组合物。在从该组合物脱除气泡以后，将该组合物装入管内。
另外，1.0％(重量)香料和0.3％(重量)月桂基二乙醇酰胺溶于22.5％(重量)的乙醇中，得到一溶液，再溶解0.05％(重量)糖精钠和0.5％(重量)的WSF于蒸馏水中，将该溶液加到上述溶液中，从而得到一混合物，进一步向该混合物添加蒸馏水，以便获得具有表8所示组合物的漱口剂。
          表7组份           浓度(％以重量计)焦磷酸钙            42甘油                15山梨醇              10羧甲基纤维素        1.2糖精钠              0.1十二烷基硫酸钠      2.0香料                1.0水                  其余
                100％
         表8组份          浓度(％以重量计)乙醇               22.5糖精钠             0.05月桂基二乙醇酰胺   0.3香料               1.0水                 其余量
               100％

Claims (8)

1.一种生产抗体的方法，该抗体对于产生龋齿的牙Streptococus mutans血清型c，e或f表现出免疫活性，该方法包括以下步骤：
(A)在含养份的培养基中培养血清型c，e或f的S mutans以得到含有所培养的细胞的培养物；
(B)从培养物中除去上清液以回收所培养的细胞；
(C)用萃取溶剂与所培养的细胞接触，从该培养的细胞中萃取葡糖基转移酶，从而形成含葡糖基转移酶的萃取物；
(D)从该萃取物中除去萃取溶剂以得到含有葡糖基转移酶的葡糖基转移酶的制剂，该制剂具有如下的生理化学特性：
(a)有能力催化从蔗糖合成水溶性的葡聚糖；
(b)具有适于从蔗糖合成水溶性葡聚糖的最适pH值6.7至7.0；
(c)具有最适温度15至50℃；
(d)通过80℃热处理5分钟而失去酶活性
(e)具有由聚丙烯酰胺凝胶测定的分子量为150至165千道尔顿；以及
(f)具有在动物体的免疫原性以便让所述葡糖基转移酶的特异抗体产生；
(E)用所述葡糖基转移酶制剂使母鸡免疫；以及；
(F)从该免疫的鸡蛋分离出可特异地结合到葡糖基转移酶上的蛋黄抗体。
2.根据权利要求1的生产抗体的方法，其中的萃取溶剂是一种尿素水溶液或盐酸胍水溶液。
3.根据要得要求2的生产抗体的方法，其中的尿素水溶液是6-10M的尿素水溶液。
4.根据要得要求3的生产抗体的方法，其中的尿素水溶液是8M的尿素水溶液。
5.根据要得要求2的生产抗体的方法，其中的尿素水溶液是6M的盐酸胍水溶液。
6.根据要得要求1-5中任一项权利要求的生产抗体的方法，其中的葡糖基转移酶是从葡糖基转移酶制剂进一步转化的葡糖基转移酶。
7.根据要得要求6的生产抗体的方法，其中的葡糖基转移酶是用阴离子交换树脂和羟磷灰石纯化的。
8.一种制备预防龋齿的组合物的方法，该方法包括先根据权利要求1至7的任一项权利要求的方法生产出蛋黄抗体，再将这种抗体与至少一种载体相混合。
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