CN1192101C - 革兰阴性菌的肽聚糖结合脂蛋白的脂化形式的制备 - Google Patents

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Abstract

通过使用含有紧密调控启动子的质粒，实现了革兰阴性菌的脂化形式的肽聚糖结合蛋白(PAL)的表达。用该质粒转化、转导或转染细菌宿主细胞。然后在使脂化重组PAL表达的条件下培养该宿主细胞。将该脂化的重组PAL加入抗原性组合物中，将该组合物给予哺乳动物宿主以免疫接种抵抗革兰阴性菌。

Description

革兰阴性菌的肽聚糖结合脂蛋白的脂化形式的制备
                               发明领域
本发明涉及革兰阴性菌的肽聚糖结合蛋白的脂化(lipidated)形式的表达以及该重组脂化蛋白在抗原性组合物中的用途。
                               发明背景
革兰阴性菌的细胞壁含有称为肽聚糖的交联物质。许多革兰阴性菌产生与肽聚糖共价连接的蛋白质。这样的蛋白质称为肽聚糖结合脂蛋白(PAL)。PAL在许多革兰阴性菌中以tol基因座的一部分存在，这些革兰阴性菌包括侵肺军团菌(书目1)、大肠杆菌(2)、杜氏嗜血菌(3)、空肠弯曲杆菌(4)、恶臭假单胞菌(5)、流产布鲁氏菌(6)、绿脓杆菌、产气克雷伯氏菌、粘质沙雷氏菌、普通变形菌、鼠伤寒沙门氏菌(7)、大叶性肺炎放线杆菌(8)、幽门螺杆菌(9)、肺炎衣原体(10)和砂眼衣原体(11)。
其它含PAL的细菌是流感嗜血菌(H.influenzae)。流感嗜血菌分成两组。通过荚膜与参比抗血清的血清学反应，对具有已知荚膜的那些菌株进行分型。已经鉴定到a-f型。不能与任何参比抗血清反应的菌株称为非典型菌株。
b型流感嗜血菌(Hib)是美国新生儿脑膜炎和其它侵入性感染的最常见的病因(12)。儿童脑膜炎主要发病于1-5岁之间。由Hib引起的那些脑膜炎病例中有60％见于2岁以下的儿童(12)。
非典型的流感嗜血菌(NTHi)是一种革兰阴性菌，它引起许多疾病，包括成人急性发热性气管支气管炎、肺炎、菌血症、脑膜炎和产后败血症。已经报道NTHi引起少年儿童中所见所有中耳炎病例的20-40％(14，15，16)。儿童会多次受相同细菌感染，因为对感染不能产生长期持续的免疫力。目前针对中耳炎的慢性或重复发病的治疗包括抗生素给药和插管引流内耳。NTHi菌株还被暗示是副鼻窦炎的主要病因(17)。另外NTHi可引起新生儿败血症。
目前的基于荚膜的抗原性组合物疫苗对NTHi无效。这些细菌的表面显示出有很高的抗原变异，主要的外膜蛋白P1和P2尤其多样(18，19)。据报道，人体中血清杀菌抗体的存在与对敏感型NTHi菌株引起的中耳炎的保护作用相关(20)。
掺入抗原性组合物的针对NTHi的候选物(疫苗)应当在氨基酸水平上是高度保守的，是外露的(尤其是外膜蛋白)，能引发杀菌抗体，应存在于所有分离的细菌中。以前的研究已经表明，NTHi的P6(也称为PBOMP-1和HiPAL)(21)蛋白符合这些标准。其纯化的天然蛋白已经显示能引发杀菌抗体(22，23，24，25)，并且在抗原上是保守的(22，23，26，27)。
评价P6基因的遗传序列，结果表明它在耳NTHi分离菌中是高度保守的，因此其蛋白质序列也是高度保守的。天然的P6是一种脂蛋白，更具体地说是PAL，其在氨基端半胱氨酸处被脂质修饰。该蛋白在流感嗜血菌中的量较少(小于外膜总蛋白的1％)，从而使得很难从天然细菌中纯化得到有用的量。因此，为了开发出作为抗原性组合物的组分，需要重组版的P6。
有几个实验室没有能在大肠杆菌中大量表达脂化的rP6(28，29)。结果，在大肠杆菌中表达P6的初始重组构建物只能表达非脂化的蛋白质。这些研究小组报道说，尽管从流感嗜血菌纯化获得的脂化的P6蛋白比从大肠杆菌中纯化得到的非脂化rP6更具免疫原性，但是却很难工程改造获得能表达脂化P6的DNA载体(28，29)；即，不比流感嗜血菌表达的低水平天然P6更好。
上述表达脂化rP6的尝试依靠未受到紧密转录调控的启动子，例如trc，taq，lac和PL-C1857。其理论是，这种稍有漏洞的转录对大肠杆菌产生了细微的作用，使得脂化蛋白的表达水平较低。试验证据暗示，信号肽酶II将脂质加到该蛋白N端的能力并不是加工后的P6低产率的原因(数据未显示)。
尽管流感嗜血菌的P6蛋白是加入抗原性组合物中用来抵抗嗜血菌疾病的主要候选物(20，23，24，25，30，31)，但是从流感嗜血菌获得的量较少使得必须对该蛋白进行重组表达。以前表达有用量的脂化P6蛋白的尝试没有成功(28，29)。因此，研究者致力于非脂化P6的多种形式的表达和纯化。
非脂化rP6产生的抗体应答有生物学功能，能保护年幼大鼠免患脑膜炎(28)，并引发杀菌抗体(28，29)，但是其量低于脂化的天然P6所引发的量(28)。
因此，需要构建一种表达革兰阴性菌的脂化PAL的宿主细胞表达载体系统。具体地说，需要构建一种表达脂化rP6的宿主细胞表达载体系统，然后可将脂化的rP6加入抗流感嗜血菌的抗原性组合物中。
                              发明概述
因此，本发明的一个目的是开发出能在细菌宿主细胞中表达革兰阴性菌的脂化PAL的基因构建物。
本发明的具体目的是开发出能在细菌宿主细胞(具体是大肠杆菌)中表达脂化rP6的基因构建物。
本发明另一目的是将脂化的rP6加入抗原性组合物中给予哺乳动物以预防流感嗜血菌引起的疾病。
本发明的这些目的和下文讨论的其它目的可这样实现：通过在表达载体中使用受紧密调控的启动子，在细菌细胞中克隆并表达PAL的脂化形式。
本发明列举了通过在表达载体中使用这些启动子来在细菌细胞中克隆和表达重组流感嗜血菌P6蛋白的脂化形式。
具体地说，为了表达脂化的重组P6，构建质粒，该质粒含有阿拉伯糖可诱导的启动子或T7启动子，其中该启动子与包含编码P6蛋白的DNA序列的分离并纯化的DNA序列操作性相连，其中在所述启动子控制下的该DNA序列以脂化形式表达。
进而，用该质粒转化、转导或转染细菌宿主细胞，然后在允许宿主细胞表达脂化rP6的条件下培养该细菌宿主细胞。
在本发明的另一实施方案中，脂化的rP6可用作免疫原用于针对所有病原性流感嗜血菌(包括b型和非典型流感嗜血菌)的抗原性组合物中。
纯化后，重组蛋白通过几个标准表明是脂化的，最重要的是，它的免疫原性比以前所用的非脂化形式的P6高得多。
用信号肽酶II对氨基端半胱氨酸进行脂质修饰已显示能使蛋白质比其非脂化形式更具免疫原性(28，29，32)。评价了这些形式的免疫原性和与脂化P6的抗原性相关性。所有均显示免疫原性比天然脂化蛋白低。
这就使得其用来免疫人的剂量要低得多，从而使脂化rP6成为商业上更可行的加入抗原性组合物的候选物。这些增加的滴度使得P6蛋白在人体中使用的剂量较低，从而为生产该蛋白节省了成本。
分离和纯化的脂化rP6蛋白可用来制备引发哺乳动物宿主保护性免疫应答的抗原性组合物。该抗原性组合物还可包含一种或多种佐剂、稀释剂或载体。这些佐剂的例子包括氢氧化铝、磷酸铝、StimulonTMQS-21、MPLTM、IL-12和霍乱毒素。将该抗原性组合物给予哺乳动物宿主，其免疫原量应足以保护宿主免患流感嗜血菌所引起的疾病。
                            附图简述
图1显示了通过PCR扩增非典型流感嗜血菌P860295菌株的染色体将编码P6蛋白的pal基因与天然脂蛋白信号肽克隆在一起。
图2显示了脂化rP6的均一性和性质。15％SDS-PAGE凝胶中加有含有最初抽提中大约10微克脂化rP6样品(泳道1)，和阴离子交换纯化的脂化rP6的合并物(泳道2)。标有S的泳道含有预先染色的低分子量标准品(Bio-Rad)。图2A是考马斯染色凝胶。图2B是类似凝胶的Western免疫印迹。
图3显示了脂化rP6纯化过程中各组分的SDS-PAGE分析。使脂化rP6纯化过程中各步骤的等份在4-20％梯度凝胶系统上电泳。泳道：1，用裂解缓冲液进行渗滤的渗透液；2，用TritonTM X-100进行渗滤的渗透液；3，用TrisTM缓冲液进行渗滤的渗透液；4，用ZwittergentTM 3-14进行渗滤的渗透液；5，用ZwittergentTM 3-14/0.5M NaCl进行渗滤的渗透液；6，用TrisTM缓冲液进行渗滤的渗透液；7，用十二烷基肌氨酸钠进行渗滤的渗透液；8，标记物12标准品；9，用TrisTM缓冲液进行渗滤的渗透液；10，用ZwittergentTM 3-12在室温下进行渗滤的渗透液；11，用TrisTM缓冲液进行渗滤的渗透液；12，浓缩步骤的渗透液；13，用ZwittergentTM 3-12在55℃下进行渗滤的渗透液；14，用TrisTM缓冲液在55℃下进行渗滤的渗透液；15，用ZwittergentTM 3-12在55℃下进行渗滤的渗透液。
                              发明详述
为了克服表达有用量脂化PAL(如脂化rP6)所遇到的困难，设计了一种策略，该策略涉及使用紧密(tightly)调控启动子和缺少胞质和周质蛋白酶的宿主菌株。
以前表达有用量的脂化P6蛋白质用于商业用途的未成功尝试均是依靠改变启动子序列和/或改变信号肽酶II识别的信号序列。
如下所述，构建含有编码P6的pal基因的质粒，其中pal基因在T7启动子(质粒pPX4019-实施例1)和阿拉伯糖可诱导启动子(质粒pPX4020-实施例2)的控制下。典型的细菌菌株和培养基在实施例3中有所描述。pPX4019和pPX4020均在测试的大肠杆菌菌株中表达脂化的P6蛋白，这可通过用P6特异性单克隆抗体的Western印迹分析，SDS-PAGE凝胶上分级表明其缺少信号序列，在考马斯染色凝胶中肉眼观察表达水平来确定(见实施例4和附图)。
质粒pPX4020在大肠杆菌菌株BL21和BLR中产生了表达水平增高的rP6蛋白，在菌株BLR中的水平最高。因此，选择pPX4020用于进一步的研究。培养表达较大量的脂化rP6的大肠杆菌在宿主菌株BLR中进行。随后的所有实验采用该宿主-载体系统。
本文描述的作为较佳实施方案的质粒构建物(pPX4020)采用了阿拉伯糖可诱导的启动子系统，该系统有几个独特的特点：它是紧密调控的，如果不存在阿拉伯糖和存在一些葡萄糖，它几乎完全没有活性。它也是可以调控的，因为随着加入培养基的阿拉伯糖的增加，它显示出增加的诱导水平。这些因素与大肠杆菌BLR菌株(该菌株是高度蛋白酶缺陷和重组缺陷的)结合，使得脂化P6蛋白有明显的表达。
脂化rP6的分批规模纯化包括差速离心、差异性洗涤剂抽提和阴离子交换层析(见
实施例4)。
然而，为了成为加入抗原性组合物中的可行候选物，表达的脂化rP6必须用适合大规模的方法来纯化。渗滤是一种适合大规模纯化的方法。抽提脂化rP6的渗滤方法是复杂的，因为脂化rP6与肽聚糖紧密结合。
如实施例5所述，用不同洗涤剂抽提后使脂化rP6溶解，与从嗜血菌获得的天然蛋白(Hi-P6)非常相似(33)，只是用切向流渗滤代替离心。对诸如十二烷基麦芽糖苷、脱氧胆酸、ZwittergentTM 3-08、3-12和3-14等洗涤剂均作了测试，发现当在0.2-1％(w/v)范围内使用时，可用来抽提脂化rP6。在65℃脂化的rP6也可溶解于pH9.5的硼酸钠缓冲液中。选择洗涤剂的灵活性允许用ZwittergentTM 3-12来抽提脂化rP6。因此，选择ZwittergentTM 3-12来最大程度地减少生产多组分抗原性组合物所需的组分数。尽管在溶解后获得了基本纯形式的天然Hi P6，但是其重组蛋白和几种大肠杆菌蛋白一起溶解。通过选择最终抽提中所用的洗涤剂，可以改变这些蛋白质的相对量，在一些情况下，可几乎除去。利用阴离子交换层析将脂化rP6与其余的大肠杆菌蛋白分离(见
实施例6)。
这种抽提PAL的方法将澄清和抽提过程合并成一步操作。只用一个连续的渗滤过程就可将产物从细胞中抽提出来并与细胞碎片分离。另外，PAL以半纯化的状态被抽提，从而简化了下游的加工步骤。最后，该过程易于规模化，因为唯一的要求是膜表面积随细胞量按比例增加。该抽提过程避免使用离心，因为离心不适合用于大规模的抽提。抽提后，用常规技术纯化脂化的rP6。
脂化rP6的分析如预计的那样与该重组蛋白的特征是脂蛋白相一致。MALDI-TOF质谱测得的分子大小表明，该纯化的重组蛋白比单从其氨基酸序列所预计的大(见实施例7)。此蛋白质的大小以及表1中详细描述的氨基酸分析(见实施例8)表明，信号序列已被除去，蛋白质是成熟形式。氨基端氨基酸分析(见实施例9)证实存在封闭的氨基端，这也表明末端半胱氨酸残基已经发生修饰。总之，这些结果表明，通过大肠杆菌的识别和加工而产生脂化P6的信号序列(23)已被除去，而本文纯化的重组P6其氨基端已脂化。
以前的研究证实，自然发生NTHi感染后抗P6抗体水平与发病率呈相反的关系(34，35，36)，从而使产生抗P6高滴度抗体成为用该抗原免疫接种的目标。天然的脂化P6蛋白的存在量非常少(小于外膜蛋白的1％)(33)，这使得商业上有用量的纯化成为最大的问题。
脂质修饰的rP6优于以前所表达的非脂化rP6的关键优点是与脂质修饰有关的免疫原性的增强。两份报道表明，尽管非脂化的rP6能引发生物活性抗体，但其免疫原性低于天然的脂化蛋白(28，29)。
相反，下表2-4中显示的动物免疫原性数据(见实施例10和11)表明，在小鼠模型中，重组P6的脂质修饰也提高了该抗原的免疫原性。在第6周抗体滴度几何平均值(GMT)增加高达2个对数是非常显著的，这使得rP6蛋白的脂化形式成为加入抗原性组合物的实用性候选物。这些实验中脂化rP6不干扰其它测试抗原产生的免疫应答的结果支持了这一结论。
总之，这些数据支持了这样一个观点，即，脂化rP6适合加入抗流感嗜血菌的抗原性组合物中。尽管下文列举了NTHi的脂化rP6，但是Hib的脂化rP6也适合加入本发明的抗原性组合物中。
除了实施例1-3中详细描述的那些，各种细菌宿主细胞-载体系统均适合用来表达用于本发明抗原性组合物的脂化rP6蛋白。
这些表达系统将编码重组脂化PAL的基因置于紧密调控的启动子的控制下。在特定的条件下，这些启动子下调重组PAL mRNA的产生，随之减轻了由于重组脂化PAL的产生给宿主细胞带来的不利影响(37)。然后可在特定条件下除去这种紧密调控，使重组脂化PAL在宿主细胞中的表达最大化。
这些紧密调控的启动子(可能和其它控制元件在一起)包括，但不局限于，阿拉伯糖可诱导启动子(38)、可经修饰而受nutL/N抗终止功能(39，40)或Mu C(41)控制的T7启动子、与抗终止子结合的PL启动子(42)、SP6 RNA聚合酶和SP6启动子(43)、大肠菌素启动子(44)、tetA启动子/操纵子(45)、鼠李糖和磷酸盐启动子(46)、LacR/O，tetR/O和AraCI1-12调控元件(47)和可逆启动子(48)。
载体系统须与所用宿主细胞相容。合适的宿主细胞包括用质粒DNA、粘粒DNA或噬菌体DNA通过常规技术转化、转染或转导的细菌。细菌宿主的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌。
为了构建这样一个质粒，将pal DNA插入含有启动子的质粒载体中使启动子在紧密转录控制下，将其它控制元件连接到载体内的特定位点，这样，当此质粒载体插入细菌宿主细胞时，宿主细胞可表达pal DNA。
质粒可通过转化、转导或转染导入宿主细胞中，这取决于所用的宿主细胞-载体系统。然后在允许该宿主细胞表达脂化rP6蛋白的条件下培育该宿主细胞。含有阿拉伯糖可诱导启动子的质粒的宿主细胞可用L-阿拉伯糖诱导，而含有T7启动子的质粒的宿主细胞可用IPTG诱导。
脂化PAL可用于制备抗原性组合物，以赋予哺乳动物抵抗由相应细菌引起的疾病的保护作用。例如，脂化rP6蛋白可用于制备这样一种抗原性组合物，该组合物能赋予哺乳动物抵抗流感嗜血菌引起的疾病的保护作用。
这些抗原性组合物包含分离和纯化的脂化PAL(如脂化的rP6蛋白)，其中抗原性组合物在哺乳动物宿主中引发了保护性免疫应答。通过加入其它蛋白，例如将脂化rP6与粘膜炎莫拉氏菌的UspA2蛋白(细菌性中耳炎的一种病原体，它在PCT专利申请WO 98/28333(49)中有描述，该文纳入本文作为参考)、流感嗜血菌的重组脂化rP4蛋白(也称为蛋白″e″，它在美国专利5,601,831(50)中有描述，该文纳入本文作为参考)联合可得到多价抗原性组合物。
含有脂化PAL(如脂化rP6蛋白)的抗原性组合物可用常规方式与免疫学上可接受的稀释剂或载体混合，制得可注射的液体溶液或悬浮液。这些稀释剂或载体包括，但不局限于，PBS、生理盐水、等渗缓冲溶液、脂质体和ISCOMS。该抗原性组合物引发的抗体水平可用某些佐剂来提高，这些佐剂例如是氢氧化铝、磷酸铝、StimulonTMQS-21(Aquila Biopharmaceuticals，Inc.，Framingham，MA)、MPLTM(3-O-脱酰基单磷酸脂质A；RIBI Immunochem Research，Inc.，Hamilton，MT)、IL-12(Genetics Institute，Cambridge，MA)、大肠杆菌的热不稳定毒素和霍乱毒素(野生型或突变型，例如其中氨基酸29位的谷氨酸被另一氨基酸(最好是组氨酸)代替，见PCT国际申请WO00/18434)(51)。
本发明抗原性组合物可通过常规方式注射给药，例如皮下、真皮内或肌内注射给予人，以及通过口服、粘膜、鼻内或鞘给药，以诱导主动免疫应答抵抗由革兰阴性菌(如流感嗜血菌)引起的疾病。给药量可用本领域技术人员已知的方式来确定。保护作用可通过单剂抗原性组合物来提供，或可能需要给予多剂，另外在晚些时候需要加强剂量以维持保护作用。
为了能更好地了解本发明，列出了下列实施例。这些实施例仅仅是为了描述的目的，并不能理解成限制了本发明的范围。
                              实施例
按照Sambrook等人(52)中描述的程序，使用标准的分子生物学技术。
                             实施例1
              含有pal基因和T7启动子的质粒pPX4019的构建
如图1所示，通过非典型流感嗜血菌P860295菌株染色体的PCR扩增，将编码P6蛋白的pal基因与天然脂蛋白信号肽一起克隆。利用能在该基因5′端产生包含起始密码子的NdeI限制性位点的诱变引物(GGAGAAAT CATATGAACAAATTTG)(SEQ IDNO：1)和在终止密码子的3′区域中产生Hind III位点的诱变引物(GGATCCTGTTTTTC AAGCTTAGAAATACTAAG)(SEQ ID NO：2)，将含有pal基因的PCR片段克隆到pCRII表达载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，用限制性分析筛选。将所得质粒用作含有P6的pal基因的NdeI/HindIII片段来源，将其克隆到表达载体pET27b(Novagen，Madison，WI)的NdeI和HindIII位点中。该构建物设计将P6基因置于T7启动子控制下，并利用了该载体中的共有核糖体结合位点。通过限制性分析，在非容许的大肠杆菌宿主(DH5α)中鉴定到此初始克隆。选出单个质粒分离物，保存为pPX4019。用该质粒转化容许的宿主菌株BL21(DE3，pLysS)(Novagen)，进行表达研究。
                             实施例2
        含有pal基因和阿拉伯糖可诱导启动子的质粒pPX4020的构建
构建第二个P6蛋白质表达质粒，将pal基因置于紧密调控的阿拉伯糖可诱导启动子控制下(38)。该质粒这样产生：将质粒pPX4019中含有pal基因的XbaI/HindIII片段和pET27b的共有核糖体结合位点亚克隆到用相似方法消化的质粒pBAD18-Cm(见图1)中。用限制性分析筛选克隆，然后在所选候选物上进行表达研究。将一个表达P6蛋白的pBAD18-Cm分离株命名为pPX4020。
                             实施例3
                  从pPX4019和pPX4020表达脂化rP6
以相似的方法进行大量表达研究，比较不同的分离株、质粒构建物、大肠杆菌宿主和诱导物(pPX4019为IPTG，pPX4020为L-阿拉伯糖(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO))的浓度，以提供用于比较的一致的本底。使单菌落分离株在37℃、HySoyTM培养基、1％葡萄糖和用于选择质粒的合适抗生素(pPX4019是15微克/毫升卡那霉素；pPX4020是15微克/毫升氯霉素)中生长过夜。用HySoyTM 1％甘油和抗生素将这些培养物稀释至OD600＝0.5，37℃培养至OD600＝2-4，然后诱导。在诱导前、诱导后2小时和18小时，取出相当于OD600＝1.0的样品。离心这些样品，将细胞沉淀重悬于150微升SDS-PAGE上样缓冲液(ISS，Natick，MA)中。比较考马斯蓝染色的15％SDS-PAGE凝胶上各泳道中加载的15微升样品。
用于表达质粒pPX4019的脂化rP6的大肠杆菌宿主细胞菌株：
DH5α-φ80dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169 deoR recA1endA1 hsdR17(rk -，mk +)phoA supE44λ-thi-1 gyrA96 relA1(Life technologies，Rockville，MD)
BL21(DE3)- ompT  lon hsdSB(rB - mB -)gal dcm(DE3)(Novagen)
用于表达质粒pPX4020的脂化rP6的大肠杆菌宿主细胞菌株：
DH5α-φ80dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169 deoR recA1endA1 hsdR17(rk -，mk +)phoA supE44λ-thi-1 gyrA96 relA1(Life technologies)
BLR- ompT  lon hsdSB(rB - mB -)gal dcmΔ(srl-recA)306∷Tn10(tetГ)(Novagen)
BL21(DE3)- ompT  lon hsdSB(rB - mB -)gal dcm(DE3)(Novagen)
培养表达L-rP6的大肠杆菌BLR(pPX4020)：
如下所述，使表达脂化rP6的重组大肠杆菌细胞在发酵罐中生长。制备含有下列物质的生长培养基，发酵罐作原位灭菌，摇瓶生长用高压蒸汽灭菌。
溶液A
材料   克/升*
磷酸钾，一碱价   3.0
磷酸钾，二碱价   7.0
硫酸铵   1.0
柠檬酸钠二水合物   1.0
硫酸亚铁七水合物   0.09
甘油(在加入前除去摇瓶培养基)   5毫升/升
硫酸钠   0.58
1000X微量矿物质溶液(见下文)   1毫升/升
不调节pH-高压蒸汽灭菌
*除非另有描述
1000X微量矿物质溶液   克/100毫升
硫酸锌七水合物     3.0
硫酸铜五水合物     0.9
硫酸锰一水合物     0.42
氯化钴六水合物     0.06
钼酸     0.15
接种前原料溶液：MCG
组分 克/升
葡萄糖 500
硫酸镁七水合物 11
氯化钙 0.83
EDTA溶液
组分 克/升
EDTA 186.15
将含有溶液A和矿物质溶液的无菌培养基等份加入摇瓶中，每升培养基中加入20毫升MCG。加入氯霉素至50微克/毫升。初始培养物用200-300微升大肠杆菌BLR(pPX4020)冷冻原种接种。使细胞于30℃通气生长16小时。将上述培养物接种入含有如上所述添加的生长培养基的10升发酵罐中，至OD600约为0.2。
发酵罐控制参数如下：
温度 36℃
pH＝ 7.0+/-0.1
D.O.＝ 通过搅拌和通入纯氧为20-50％
空气和氧气流＝ 转子流量计上为20％
消泡剂 如果需要，加一滴
背压 0.5巴
用下列溶液控制发酵参数，并在使用前灭菌：PPG-2000-200毫升用于消泡(如果需要)；40％氢氧化铵-1升，用于控制生长时的pH；50％葡萄糖-1升，用于因葡萄糖耗尽pH开始升高时补料以便继续生长；4N乙酸-500毫升，用于控制诱导时的pH；25％阿拉伯糖溶液，(250克/升)无菌过滤+1％甘油-250毫升(预先经过高压蒸汽灭菌)。阿拉伯糖/甘油溶液用于在最终葡萄糖加完后pH因葡萄糖耗尽而升高时补料，以便诱导蛋白质的产生。阿拉伯糖溶液在加入经高压蒸汽灭菌的甘油原液之前经过过滤除菌。对于10升发酵罐，加入100毫升甘油和400毫升25％的阿拉伯糖溶液，制得该溶液。最终的发酵罐浓度含有10克/升阿拉伯糖和10毫升/升甘油。
接种发酵罐后，按照pH控制的需要加入碱(氢氧化钠)，并按需加入消泡剂(PPG-2000)。纯氧以800rpms通入。当pH升高超过7.0时，在培养液中补入900毫升50％葡萄糖。当pH高于或等于7.1时，再加入200毫升50％的葡萄糖溶液。维持这些条件，直至OD600约为50。
OD600达到约50后，当pH再次升高超过7.0时，加入500毫升阿拉伯糖/甘油溶液，以诱导LrP6的表达。此时，用酸作进一步pH控制。诱导后，继续培育3小时，然后在加入10毫升/升的500mM EDTA(pH8)后，收获培养液。将培养肉汤保藏于4℃，直至纯化脂化rP6。
                                实施例4
        通过不同洗涤剂膜抽提对脂化rP6进行分批规模的分析性纯化
在随后的实验中采用pPX4020表达的脂化rP6批料，如下所述，用不同洗涤剂膜抽提纯化：
1)大肠杆菌膜组分的分离：将发酵获得的冷冻的细菌细胞沉淀融化，悬于10mMHEPES-NaOH(pH7.4)，1mM Na2EDTA中，缓冲液体积等于冷冻细胞沉淀重量的5倍。使细胞悬液在Microfluidics(Newton，MA)110-Y微流化仪中匀浆化，使细胞裂解。用差速离心(300,000×g 1小时)从细胞裂解液中获得膜。该膜用相同体积的裂解用缓冲液洗涤两次，然后冷冻成沉淀。
2)使大肠杆菌膜中的脂化rP6溶解：用类似Zlotnick等人(33)和Green等人(22)描述的方法以不同洗涤剂抽提使脂化P6从大肠杆菌中溶解出来。所有抽提在室温下进行30分钟，除非另有所述。所有离心用Beckman 45Ti转子以42000rpm进行1小时，转子温度控制在10℃，除非有不同的描述。将大肠杆菌膜悬浮在10mMHEPES-NaOH，pH7.4，1mM MgCl2中，用TritonTM X-100(Calbiochem-NovabiochemInternational，San Diego，CA)在1％(w/v)的最终浓度下抽提两次，取得内膜组分。将所得外膜沉淀悬于50mM TrisTM HCl(pH8)，5mM Na2EDTA(它也用于在脂化rP6溶解前悬浮随后的沉淀)中。然后，用下列物质依次抽提外膜：1％ZwittergentTM3-14两次；1％ZwittergentTM3-14和0.5M NaCl两次；1％N-月桂酰肌苷酸钠两次；1％ZwittergentTM3-14。这些抽提后获得的最终沉淀用含0.2％ZwittergentTM3-12的10mMTrisTM HCl(pH8)，1mM Na2EDTA于55℃抽提45分钟，间歇搅拌，然后离心至少1小时。该最终抽提的上清液含有脂化的rP6。
3)脂化rP6的纯化：用DEAE快流树脂(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)和与抽提用缓冲液相同的低离子强度缓冲液进行阴离子交换层析，对上述获得的含有脂化rP6的抽提物作进一步纯化。溶解的脂化rP6被吸附到床体积约为20毫升的DEAE快流柱上。用0-0.2M NaCl梯度液使该柱展开40分钟以上，然后用0.2M NaCl作无梯度洗脱。脂化rP6在展开的无梯度期间被洗脱。其它蛋白大多数仍然吸附在柱上，随后用1M NaCl解吸。从200克细胞纯化获得大约100毫克。
4)用SDS-PAGE和Western印迹对纯化的脂化rP6作特性鉴定：在Laemmli缓冲系统中进行SDS-PAGE，然后对染色凝胶进行激光密度计测定，以评价纯化的脂化rP6的均一性。在15％SDS-PAGE凝胶上分析粗提物和阴离子交换纯化的合并物的大约10微克LrP6(53)。凝胶用考马斯蓝染色，在激光密度计中扫描。考马斯染色的凝胶(图2A，泳道2)的激光密度计揭示，在合并的阴离子交换组分中有一个均一度高于98％的峰，这表明脂化的rP6已经被纯化至接近均一。用对流感嗜血菌P6有特异性且不与大肠杆菌有关蛋白反应的单克隆抗体进行反应对这些样品作Western印迹，测定均一性以验证这些样品中脂化rP6的身份(数据未显示)。Western印迹分析结果显示在图2B中。无论在粗提物(泳道1)还是合并的组分(泳道2)中，脂化的rP6条带均是唯一与P6特异性单克隆抗体反应的条带。这表明纯化的蛋白质确实是P6。没有观察到降解产物。
                                 实施例5
                  用不同洗涤剂膜抽提大规模纯化脂化的rP6
在匀浆前，将表达脂化rP6的大肠杆菌细胞发酵肉汤调节至10mM EDTA，并稀释至小于或等于10％(细胞湿重/体积)。然后，用高压微流化仪使细胞裂解，在室温下采用错流膜过滤装置按一定次序加入缓冲液进行渗滤。测得使有效质量的溶解蛋白质转运通过膜的最小膜面积约为0.002平方米/克湿重细胞。大小小于此膜的1000kD截留分子量的溶解蛋白与渗透液一起通过，而较大的分子和未溶解的蛋白被保留。渗滤步骤顺序如下：
(1)用体积等于保留物体积三倍的10mM Hepes/1mM EDTA/pH8.0(裂解缓冲液)对裂解的发酵肉汤进行渗滤，以便通过渗透除去胞内和胞外性污染物。
(2)裂解液用10mM Hepes/1mM MgCl2/0.2％TritonTM X-100渗滤三次，溶解并除去内膜蛋白。Mg++离子使外膜稳定，因此，外膜蛋白不溶解在TritonTM X-100中。
(3)裂解液用50mM TrisTM/5mM EDTA/0.2％ZwittergentTM3-14渗滤三次，溶解并除去外膜蛋白(而不是脂化rP6)。EDTA起螯合步骤(2)中Mg++和防止蛋白水解的作用。
(4)裂解液用50mM TrisTM/5mM EDTA/0.5M NaCl/0.2％ZwittergentTM3-14渗滤三次，以溶解并除去其它的蛋白质。在此步骤中，缓冲液中加入氯化钠以破坏膜蛋白和膜之间的离子相互作用。进行该步骤是因为脂化rP6是PAL，盐起着从膜/外膜蛋白复合物中去除膜结合蛋白质(而不是脂化rP6)的作用。用三倍于保留物体积的50mMTrisTM/5mM EDTA继续进行渗滤，以降低保留物中的ZwittergentTM浓度。
(5)裂解液用50mM TrisTM/5mM EDTA/0.2％十二烷基肌氨酸钠渗滤三次除去其它膜结合蛋白质(而不是脂化的rP6)。然后用50mM TrisTM/5mM EDTA渗滤三次，以降低保留物中十二烷基肌氨酸钠的浓度。
(6)裂解液用10mM磷酸盐/0.2％ZwittergentTM 3-12渗滤三次，以除去其它膜结合蛋白(而不是脂化rP6)，然后用10mM硫酸钠渗滤三次，以降低保留物中ZwittergentTM3-12的浓度。
(7)将裂解液浓缩至其最初体积的20％，然后用10mM磷酸钠/0.2％ZwittergentTM3-12在55℃下渗滤三次使脂化rP6溶解，并通过渗透液收集。浓缩步骤在渗滤前进行，以提高渗透液中脂化rP6的浓度。再用三倍保留物体积的10mM磷酸钠55℃继续渗滤，以降低保留物中的ZwittergentTM 3-12浓度。进行该加热步骤是因为(如上述步骤(4))脂化rP6是PAL，加热起着从膜/膜蛋白复合物中取出脂化rP6的作用。最后，用三倍保留物体积的10mM磷酸钠55℃进行最终渗滤。
在渗滤步骤期间，跨膜压力维持在大约10psi，错流量维持在大约120-180lmh。所有渗滤在室温下进行(除最后的55℃抽提步骤外，它在较高温度下进行以使脂化rP6溶解)。渗透液流通量范围为30-50lmh，该通量高得足以使抽提过程适合实用和扩大规模。
抽提期间，在不同时间取样作SDS-PAGE分析，以评价各渗滤步骤对蛋白质抽提的影响。加入乙醇使样品沉淀，离心，然后重新溶解在最初体积的20％的SDS样品制备缓冲液中。这种制备样品的方法浓缩了样品，并降低了样品中TritonTM X-100或ZwittergentTM3-12的浓度。TritonTM X-100或ZwittergentTM 3-12会干扰SDS与样品的结合，并降低对凝胶条带的分辨率。将10微升各样品加样于Novex 10％丙烯酰胺凝胶上，使凝胶在125伏下电泳60-90分钟。
图2和3中显示了在脂化rP6的抽提过程中从渗透液中取得的样品的典型SDS-PAGE分析结果。脂化rP6在这些凝胶上以15千道尔顿(kD)运行。凝胶显示，在用裂解缓冲液和含有各种不同洗涤剂的缓冲液进行渗滤期间，除去了一些污染性蛋白。在这些渗滤步骤期间，脂化rP6的损失非常少。在最后55℃ZwittergentTM3-12渗滤步骤中，脂化rP6被抽提到部分纯化的状态。55℃下第二次ZwittergentTM3-12渗滤步骤结束时，渗透液中存在非常少的脂化rP6。这暗示大多数溶解的脂化rP6已经通过渗透液被回收。其它实验表明，在渗滤过程结束后，非常少的脂化rP6以不溶形式保留在保留物中。ZwittergentTM3-12/55℃抽提物的15kD条带经western分析表明是脂化rP6(数据未显示)。
在用ZwittergentTM3-12使脂化rP6溶解时，产生了除脂化rP6外还有几种蛋白的抽提物。测得该抽提物的均一性约为78％脂化rP6(图2A，泳道1)。尽管这对于初始溶解来说已是高均一度，但是仍希望将LrP6与这些大肠杆菌蛋白分离(如果可能的话)。这如实施例6所述那样进行。
                                实施例6
              用阴离子交换层析进一步纯化已纯化的脂化rP6
用阴离子交换层析进一步纯化实施例5中所述的脂化rP6，因为该方法已被成功用来纯化非脂化的rP6。脂化的rP6比rP6(通常用0.1M氯化钠洗脱)更牢固地吸附在DEAE树脂上。0.2％ZwittergentTM中的脂化rP6解吸发生前需要缓冲液中有0.2M氯化钠。大肠杆菌蛋白维持吸附在阴离子交换树脂(DEAE)上，直到脂化rP6被洗脱之后。
用0.2％ZwittergentTM3-12抽提和纯化的脂化rP6的均一性和鉴定见图2。测得纯化的脂化rP6的均一性大于98％(图2A，泳道2)。
                                实施例7
                    用MALDI-TOF质谱分析确定分子量：
采用Finnigan Mat LasermatTM 2000线性质量分析仪(Finnigan Mat，Ltd.，San Jose，CA)，通过基质辅助型激光解吸/离子化飞行时间(Matrix Assisted LaserDesorption/Ionization Time-of-flight，MALDI-TOF)质谱法准确地测定了含有阿拉伯糖可诱导启动子的pPX4020所表达的脂化rP6的分子量。LasermatTM采用基质辅助的激光解吸的技术(54)使样品电离，用飞行时间来分析产生的离子。将样品包埋在3，5-二甲氧基-4-羟基-肉桂酸(芥子酸)基质中，以增强样品的电离。将含有5-10皮摩尔纯化蛋白的1微升样品与溶解在含0.1％(v/v)三氟乙酸的70％(v/v)乙腈水溶液中的1微升基质(10毫克/毫升)混合。将1微升该样品和基质混合物加样于样品载玻片上，使其干燥，用激光仪的短脉冲UV光照射。在该方法中，蛋白样品通常产生相对简单的谱，因为所产生的与蛋白有关的离子的主要电荷状态是Z＝+1[M+H]+和Z＝+2[M+2H]2+。用分子量为12,230.9的牛心脏细胞色素C(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)作为外部标定。
测得所用样品中的脂化rP6的分子量为15078。除了预计的[M+H]+分子离子外，还观察到了脂化rP6的[M+2H]2+分子离子。N端含有三棕榈酰半胱氨酸残基的P6的理论分子量为15024，未经信号肽酶II加工的P6的预计分子量为16016.66，而经信号肽酶II酶切的非脂化的P6的预计分子量为14234.66。因此，这些结果与大肠杆菌表达的脂化形式的P6一致。
                               实施例8
                            氨基酸组成分析
将氨基酸分析用的脂化rP6样品在玻璃管中干燥，然后在真空、110℃下用含有5％苯酚和1％2-巯基乙醇的100微升6N HCl水解22小时。随后使样品在真空下干燥，然后重新溶解在样品稀释缓冲液Na-S(Beckman Instruments，Inc.，Fullerton，CA)中。根据生产商说明书，用三步柠檬酸钠梯度法在Beckman 6300型氨基酸分析仪(55)上测定氨基酸组成。苏氨酸和丝氨酸残基没有校正破坏。由于所用方法没能测定半胱氨酸和色氨酸残基，因此结果表示成根据非脂化rP6减去半胱氨酸的理论分子量(等于14132.4，脂化rP6不含Trp)的每摩尔脂化rP6残基摩尔数。结果显示在表1中，其表示两次测定的平均值。结果与pal基因信号序列已被大肠杆菌除去的结果一致。
                              表1
                      脂化rP6的氨基酸分析
  氨基酸     实验摩尔残基/摩尔 理论上成熟的摩尔残基/摩尔 理论上前肽的摩尔残基/摩尔
  Asp+Asn     16.6     17     18
  Thr     6.6     7     7
  Ser     7.0     6     8
  Glu+Gln     12.5     12     12
  Pro     2.8     3     3
  Gly     16.9     16     17
  Ala     18.9     21     26
  Val     10.5     10     13
  Met     0.2     0     1
  Ile     2.9     3     3
  Leu     8.4     9     12
  Tyr     10.1     11     11
  Phe     3.1     3     4
  His     3.1     2     2
  Lys     6.6     7     9
  Arg     6.5     6     6
  Cys     ND     1     1
  Trp     ND     0     0
ND＝未测定
                            实施例9
                      氨基端氨基酸序列分析
用装有在线120A型PTH分析仪的Applied Biosystems 477A型蛋白质/肽测序仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)分析了氨基端蛋白质序列。在依次切割氨基端后，通过64℃用25％三氟乙酸处理20分钟，将形成的苯胺噻唑啉酮衍生物转变成更稳定的苯硫基乙内酰脲(PTH)衍生物。在PTH分析仪上分离并鉴定PTH衍生物，方法是用Brownlee PTH C-18柱(粒径为5微米，2.1毫米内径×22厘米长度；AppliedBiosystems)和改良的生产商开发的双溶剂梯度系统(56)进行反相HPLC。
当对脂化rP6(400皮摩尔)进行氨基端氨基酸序列分析时，没有获得序列数据。这暗示氨基端氨基酸的伯氨基(或仲氨基)不能用该测序化学方法来测定，即，LrP6的氨基端残基被封闭。为了证实不能产生序列数据并不是由于仪器故障引起的，随后进行了对照实验，对400皮摩尔的脂化rP6和200皮摩尔的β-乳球蛋白混合物进行氨基端序列分析。结果获得了代表β-乳球蛋白氨基端序列的一条序列，从而证实脂化rP6的氨基端残基基本上被封闭。
                            实施例10
                与非脂化rP6相比的脂化rP6的免疫原性
在Swiss-Webster小鼠中比较纯化的脂化重组P6与非脂化的重组P6(28)的相对免疫原性。将5微克剂量的各蛋白质与100微克磷酸铝以及50微克3-O-脱酰基单磷酸脂质A(MPLTM)(Ribi Immunochemicals，Hamilton，MT)混合，在第0、4和6周对小鼠作皮下免疫。在第0、4、6和8周取血样。其它组小鼠用非脂化rP6或脂化rP6与粘膜炎莫拉氏菌的UspA2蛋白(细菌性中耳炎的病原体，49)以及重组脂化rP4(50)的混合物免疫。这些混合物也用上述的磷酸铝和MPLTM作为佐剂。
分析从小鼠获得的抗血清，用ELISA测定抗P6、P4或UspA2蛋白的抗体。测定合并血清或单个动物的ELISA滴度(22，28)，然后获得滴度的几何平均值(GMT)。结果显示在表2和3中。
                              表2
                        抗P6 ELISA滴度
免疫原                                         抗P6 ELISA滴度：
                                         第0周     第6周       第8周
5微克rP6(非脂化)               GMT                 1369        17686
                               合并物    ＜50      40715       147985
5微克rP6(脂化)                 GMT                 341987      780179
                               合并物    ＜50      706826      786917
rP6(非脂化)、rP4、UspA各5      GMT                 425         15015
微克                           合并物    ＜50      692         64913
rP6(脂化)、rP4、UspA各5        GMT                 251731      1052527
微克                           合并物    ＜50      739896      1268527
                                 表3
                         抗P4和UspA2 ELISA滴度
免疫原   抗P4 ELISA滴度： 抗UspA2 ELISA滴度：
    第0周  第4周     第0周   第4周
rP6(非脂化)、rP4、UspA各5微克   GMT合并物            84677＜50   189980             143285＜50    247003
rP6(脂化)、rP4、UspA各5微克   GMT合并物            136412＜50   197361             257751＜50    335548
当只与MPLTM和磷酸铝佐剂一起给予时，脂化rP6的免疫原性比非脂化rP6至少多一个对数。当与rP4和UspA2联合时，没有观察到抗原性竞争。实际上，对于脂化rP6的应答比对于非脂化rP6的应答高大约1.5个对数。
对UspA2和rP4抗原的免疫应答的分析表明，与加入非脂化rP6相比，加入脂化rP6没有改变对这些抗原的免疫应答。当脂化的rP4和UspA2混合在一起时，没有发现抗原对正常的免疫应答有影响。这证实了这些抗原的相容性。
                              实施例11
                        小鼠抗血清的杀菌活性
用体外杀菌试验来显示针对脂化rP6和脂化rP6/rP4混合好的抗血清的生物活性。该试验如前(22，28)所述，采用非典型的流感嗜血菌P861454菌株作为靶标。结果显示在表4中：
                                表4
                         表2和3的抗血清的体外杀菌活性
                         第6周血清                     第8周血清
免疫原：             BC滴度      本底倍数(X)      BC滴度      本底倍数(X)
rP6                  3200        8X               12800       16X
L-rP6                3200        4X               12800       16X
rP6，rP4，UspA2      3200        4X               6400        8X
L-rP6，rP4，UspA2    3200        4X               12800       16X
结果证实，非脂化的rP6在该试验中引发生物活性抗体。尽管脂化和非脂化抗血清之间的绝对滴度没有差别，这可能是由于在该试验系统中抗血清是最大程度杀菌的，尤其是因为免疫前的血清和本试验中所用的补体来源显示有高度的非特异性杀伤所用。脂化的rP6/rP4混合物也引发了杀菌抗体，其滴度等于非脂化rP6/rP4混合物所获得的滴度。该试验不能区分抗rP4抗体和抗rP6抗体的杀菌活性，但是显然该嗜血菌抗原的混合物引发了较高的抗非典型流感嗜血菌的杀菌抗血清。
                              参考书目
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                               序列表
<110>美国氰胺公司
<120>革兰阴性菌的肽聚糖结合脂蛋白的脂化形式的制备
<130>33484-00PCT
<140>
<141>
<160>2
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)
<400>1
ggagaaatca tatgaacaaa tttg                                          24
<210>2
<211>32
<212>DNA
<213>流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)
<400>2
ggatcctgtt tttcaagctt agaaatacta ag                                 32

Claims (10)

1.一种质粒，它含有受到紧密调控的启动子，其中所述启动子与一分离纯化的DNA序列操作性相连，该DNA序列包含编码革兰阴性菌肽聚糖结合脂蛋白PAL的DNA序列，该序列在所述启动子控制下以脂化形式表达。
2.根据权利要求1所述的质粒，其中PAL是流感嗜血菌的P6蛋白。
3.根据权利要求2所述的质粒，其中启动子是阿拉伯糖可诱导启动子或T7启动子。
4.根据权利要求3所述的质粒，其中启动子是阿拉伯糖可诱导启动子。
5.根据权利要求4所述的质粒，其中质粒是如图1所示的pPX4020。
6.根据权利要求3所述的质粒，其中启动子是T7启动子。
7.根据权利要求6所述的质粒，其中质粒是如图1所示的pPX4019。
8.一种细菌宿主细胞，它用权利要求1所述的质粒来转化、转导或转染。
9.一种生产重组脂化PAL的方法，该方法包括用权利要求1所述的质粒转化、转导或转染细菌宿主细胞，并在允许该宿主细胞表达所述脂化重组PAL的条件下培养该宿主细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其中PAL是流感嗜血菌的P6蛋白。
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