MXPA01013253A - Produccion de la forma lipidica de las lipoproteinas asociadas a los peptidoglicanos de bacterias gram negativas. - Google Patents
Produccion de la forma lipidica de las lipoproteinas asociadas a los peptidoglicanos de bacterias gram negativas.Info
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Abstract
Se logra la expresion de la forma lipidica de la proteina asociada a peptidoglicanos (PAL) de bacterias Gram negativas a traves del uso de un plasmido el cual contiene un promotor estrictamente regulado. Se transforma una celula hospedadora bacteriana, se transduce o transfecta con tal plasmido. La celula hospedadora se cultiva entonces bajo condiciones de tal forma que se expresa la PAL recombinante lipidica. Se incluye la PAL recombinante lipidica en una composicion antigenica administrada a un huesped mamifero para inmunizarlo contra una bacteria Gram negativa.
Description
PRODUCCIÓN DE IA FORMA IPIDICA DE IAS LIPOPROTEINAS ASOCIADAS A LOS PEPTIDOGLICANOS DE BACTERIAS GRAM NEGATIVAS Campo de la invención Esta invención se refiere a la expresión de ia forma lipídica de la proteína asociada a los peptidoglicanos de bacterias Gram negativas y ai uso de ia proteína lipídica recombinante en composiciones antigénicas . Antecedentes de la invención Las paredes celulares de las bacterias Gram negativas contienen porciones reticuladas conocidas corro peptidoglicanos. Una variedad de bacterias Gram negativas producen proteínas las cuales se enlazan covalentemente a los peptidoglicanos. Tal proteína es referida como una lipoproteína asociada a peptidoglicanos (PAL) . Las PAL están presentes como parte del locus tol en una variedad de bacterias Gram negativas, las cuales incluyen Leg. Qnel la pneumophila (entrada de la bibliografía 1), Escherichia coli (2 ) , Haemophilus ducreyi (3), Campylobacter jej uni ( ), Pseudomonas putida (5), Brucella abortus ( 6 ) ,
Pseudomonas aeruginosa , Klebsiella aerogenes, Serra tia marcescens, Proteus vulgaris, Salmonella typhimuri um ( 1 )
Actinobacillus pleuropneumoniae (8), Helicobacter pyl ori
(9) Chlamydia pneumoniae (10), y Chla ydia tracncma tis REF 134740 Otras bacterias que contienen PAL son las bacterias Haemophilus influenzae (H. infl uenzae) . Las bacterias H. influenzae se dividen en dos grupos. Aquellas cepas las cuales poseen una cápsula conocida son tipificadas por la reacción serológica de la cápsula con antisueros de referencia. Se han identificado los tipos a-f. Las cepas las cuales fallan para reaccionar con cualquiera de los antisueros de referencia son conocidas como no tipificables. H. influenzae tipo b (Hib) es la causa más frecuente de la meningitis neonatal y otras infecciones invasivas en los Estados Unidos (12). La mayor incidencia de meningitis en la niñez ocurre entre las edades de uno y cinco años. El sesenta por ciento de aquellos casos de meningitis debido a Hib ocurren en niños por debajo de los dos años de edad (12) . H. influenzae (NTHi) no tipificable es un organismo Gram negativo el cual provoca una variedad de enfermedades, las cuales incluyen neumonía, bacteremia, meningitis, sepsis post parto, y traqueobronquitis febril aguda en adultos (13) . Se ha reportado el NTHi para provocar entre 20 y 40 por ciento de todos las casos de otitis media vista en niños jóvenes (14, 15, 16) . Los niños pueden experimentar múltiples infecciones debido al mismo organismo ya que la infección no confiere inmunidad de gran larga duración. La terapia actual para las ocurrencias crónicas o repetidas de la otitis media incluye la administración de antibióticos y la inserción de tubos para drenar el oído interno. Las cepas de NTHi han sido implicadas también como una causa primaria de la sinusitis (17). Adicionalmente, NTHi provoca la sepsis neonatal. Las composiciones actuales antigénicas en base a cápsulas son ineficaces contra NTHi. Se ha mostrado que la superficie de estas bacterias es extremadamente variable antigénicamente, con las proteínas principales de la membrana externa, Pl y P2, que son particularmente diversas
(18, 19) . En los humanos, se ha reportado la presencia de anticuerpos bactericidas séricos para correlacionarse con la protección de la otitis media provocada por las cepas de NTHi sensibles (20) . Los candidatos para la inclusión en las composiciones antigénicas contra NTHi deben ser conservados en el nivel de aminoácidos, superficie expuesta
(en particular las proteínas de la membrana externa), producir anticuerpos bactericidas, y estar presentes en todos los aislados. La investigación previa ha mostrado que la proteina P6 (también conocida como PBOMP-1 y HiPAL) (21) de NTHi cumple todos estos criterios. Se ha mostrado que las proteínas nativas purificadas producen los anticuerpos bactericidas (22, 23, 24, 25) y se conservan antigénicamente (22, 23, 26, 27) . La evaluación de la secuencia genética del gen de
Pß ha mostrado que está altamente conservada entre los aislados de NTHi óticos y de esta forma la secuencia de proteínas está también altamente conservada. La P6 nativa es una lipoproteína, más específicamente una PAL, la cual se modifica en la cisteína amino terminal con lípidos. Esta proteína está presente en H. influenzae en cantidades relativamente pequeñas (menos de 1% de las proteínas totales de la membrana externa) , lo cual hace muy difícil la purificación a partir del organismo nativo en cantidades útiles. De esta forma, se requiere una versión recombinante de la P6 para el desarrollo adicional como un componente en las composiciones antigénicas. Varios laboratorios son incapaces de expresar la rP6 lipídica en grandes cantidades en E. colx \ 2a , 29) . Como un resultado, las construcciones recombinantes iniciales las cuales expresan P6 en E. coli pueden expresar solamente una versión no lipídica de la proteína. Estos grupos reportan que, mientras que la proteína P6 lipídica purificada a partir de H. infl uenzae es más inmunogénica que la rP6 no lipídica purificada a partir de E. coli , es muy difícil modificar un vector de ADN el cual puede expresar P6 lipídica (28, 29) ; es decir, no mejor que los niveles bajos de P6 nativa expresada por H. infl uenzae . Los intentos previos para expresar rP6 lipídica se basaron en promotores los cuales no estaban bajo regulación estricta transcripcional, tal como trc, taq, lac y PL-C1857. Se teoriza que esta transcripción algo filtrada lleva a efectos sutiles en E. coli lo cual contribuye a los niveles bajos de expresión de la proteína lipídica. La evidencia experimental indica que la capacidad de la peptidasa II de señal para agregar lípidos a la terminal N de la proteína no es responsable para el bajo rendimiento de P6 procesada (datos no mostrados) . Mientras que la proteína P6 de H. infl uenzae ha sido un candidato primario para la inclusión en las composiciones antigénicas contra la enfermedad de Haemophilus (20, 23, 24, 25, 30, 31), las cantidades relativamente pequeñas disponibles a partir de H. influenzae han hecho la expresión recombinante de esta proteína esencial. No han sido exitosos los efectos previos para expresar la proteína P6 lipídica en cantidades significativas (28, 29) . De esta forma, los investigadores se han enfocado en la expresión y purificación de formas múltiples de P6 no lipídica. La respuesta de anticuerpos engendrada por rP6 no lipídica es funcional biológicamente, capaz de proteger a ratas infantes de la meningitis (28), y producir anticuerpos bactericidas (28, 29), pero de una magnitud inferior a aquellas producidas por P6 nativa lipídica (28). Por lo tanto, hay una necesidad para construir sistemas de vectores de expresión de células hospedadoras los cuales expresen PAL lipídicas de bacterias Gram negativas. En particular, hay una necesidad para construir sistemas de vectores de expresión de células hospedadoras los cuales expresen rP6 lipídica, los cuales pueden entonces ser incluidos en las composiciones antigénicas contra H. influenzae. Sumario de la invención De esta forma, es un objeto de esta invención desarrollar construcciones genéticas capaces de expresar PAL lipídicas de bacterias Gram negativas en células hospedadoras bacterianas. Es un objeto particular de esta invención desarrollar construcciones genéticas capaces de expresar rP6 lipídica en células hospedadoras bacterianas, en particular en E. coli . Es un objeto adicional de esta invención incluir aquella rP6 lipídica en composiciones antigénicas para administración a un mamífero para evitar la enfermedad provocada por H. influenzae. Se logran estos y otros objetos de la invención como se discute posteriormente por la clonación y expresión en células bacterianas de las formas lipídicas de las PAL a través del uso de promotores estrictamente regulados en los vectores de expresión. La invención se ejemplifica por la clonación y expresión en células bacterianas de la forma lipídica de la proteína P6 recombinante de H. influenzae a través del uso de tales promotores en el vector de expresión. Específicamente, para la expresión de P6 recombinante lipídica, se construyen plásmidos los cuales contienen un promotor inducible con arabinosa o un promotor T7, en donde el promotor se enlaza operativamente a una secuencia de ADN aislada y purificada la cual comprende una secuencia de ADN la cual codifica la proteína 6, y en donde la secuencia de ADN, bajo el control del promotor, se expresa en la forma lipídica. A su vez, se transforma una célula hospedadora bacteriana, se transduce o transfecta con tal plásmido y después se cultiva bajo condiciones las cuales permiten la expresión de la rP6 lipídica por la célula hospedadora.
En otra modalidad de la invención, se usa la rP6 lipídica como un inmunogen en composiciones antigénicas contra todas las H. infl uenzae patogénicas, las cuales incluyen H. influenzae del tipo b y no tipificable. Cuando se purifica, se indica la proteína recombinante para ser lipídica por varios criterios y, en forma más importante, es mucho más inmunogénica que la forma no lipídica de la P6 usada previamente. Se ha demostrado que la modificación de lípido de la cisteína amino terminal por la peptidasa II de señal hace proteínas más inmunogénicas que sus formas no lipídicas (28, 29, 32) . Se han evaluado estas formas para relación de inmunogenicidad y capacidad antigénica con P6 lipídica. Todas han mostrado inmunogenecidad disminuida comparadas con la proteína lipídica nativa. Esto permite que se usen dosis mucho menores para inmunizar humanos y de esta forma hace a la rP6 lipídica un candidato más comercialmente viable para inclusión en las composiciones antigénicas. Estos títulos incrementados permiten el uso de dosis de proteínas P6 inferiores en humanos, lo cual puede proporcionar ahorros de costo en la producción de esa proteína. Se usa la proteína rP6 lipídica aislada y purificada para preparar una composición antigénica la cual produce una respuesta inmune protectora en un huésped mamífero. La composición antigénica puede además comprender uno o más de un adyuvante, diluyente o portador. Ejemplos de tales adyuvantes incluyen el hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, StimulonMR QS-21, MPLMR, IL-12 y toxina de cólera. Se administra la composición antigénica a un huésped mamífero en una cantidad inmunogénica suficiente para proteger al huésped contra una enfermedad provocada por H. influenzae. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 representa la clonación del gen pal el cual codifica la proteína P6 con el péptido de señal de lipoproteína nativa por amplificación por PCR a partir del cromosoma de la cepa de H. infl uenzae no tipificable P860295. La Figura 2 representa la homogeneidad e identidad de la rP6 lipídica. Se cargaron quince por ciento de los geles SDS-PAGE con muestras las cuales contienen aproximadamente 10 µg de la rP6 lipídica en el extracto inicial (banda 1) y la reserva de rP6 lipídica purificada por intercambio de aniones (banda 2) . Las bandas etiquetadas con S contienen estándares de peso molecular bajo preteñidos de Bio-Rad. La Figura 2A es el gel teñido con Coomasie. La Figura 2B es el estern inmunoblot de un gel similar. La Figura 3 representa el análisis de SDS-PAGE de las fracciones a partir de la purificación de la rP6 lipídica. Se realiza una electroforesis en las alícuotas de las etapas en el proceso de purificación de la rP6 lipídica en un sistema de gel de 4-20% de gradiente. Bandas: 1, Permeado a partir de la diafiltración con el amortiguador de lisis; 2, Permeado a partir de la diafiltración con Tritón"11 X-100; 3, Permeado a partir de la diafiltración con el amortiguador TrisMR; 4, Permeado a partir de la diafiltración con Z ittergentMR 3-14; 5, Permeado a partir de la diafiltración con ZwitergentMR 3-14/NaCl 0.5 M; 6, Permeado a partir de la diafiltración con el amortiguador TrisMR; 7, Permeado a partir de la diafiltración con sarcosil; 8, Estándar marca 12; 9, Permeado a partir de la diafiltración con el amortiguador TrisMR; 10, Permeado a partir de la diafiltración con ZwittergentMR 3-12 en temperatura ambiente; 11, Permeado a partir de la diafiltración con el amortiguador TrisMP; 12, Permeado a partir de la etapa de concentración; 13, Permeado a partir de la diafiltración con ZwittergentMR 3-12 en 55°C; 14, Permeado a partir de la diafiltración con el amortiguador TrisMR en 55°C; 15, Permeado a partir de la diafiltración con ZwittergentMR 3-12 en 55°C.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Con el fin de solucionar la dificultad reconocida para expresar cantidades usables de PAL lipídicas, tal como rP6 lipídica, se crea una estrategia la cual implica el uso de promotores estrictamente regulados y cepas hospedadoras las cuales carecen de proteasas citoplásmicas y perplásmicas . Los esfuerzos previos no exitosos para expresar la proteína P6 lipídica en cantidades significativas para uso comercial todos se basaron en cambiar la secuencia del promotor y/o hacer cambios en la secuencia de señal reconocida por la peptidasa II de señal. Como se discute posteriormente, se construyen plásmidos los cuales contienen el gen pal el cual codifica P6 bajo el control del promotor T7 (plásmido pPX4019 -Ejemplo 1) y el promotor inducible con arabinosa (plásmido pPX4020 - Ejemplo 2) . Se describen las cepas y medios bacterianos de ejemplo en el Ejemplo 3. Tanto pPX4019 y pPX4020 expresan la proteína P6 lipídica en las cepas de E. coli probadas, como se determina por el análisis Western blot con los anticuerpos monoclonales específicos a P6, dimensionados en los geles SDS-PAGE, lo cual indica una carencia de una secuencia de señal y una observación visual de niveles de expresión en geles teñidos con Coomassie (véase el Ejemplo 4 y las Figuras) . El plásmido pPX4020 produce niveles incrementados de expresión de la proteína rP6 en las cepas de E. coii BL21 y BLR, con los niveles más altos en la cepa BLR. Por lo tanto, se elige el plásmido pPX4020 para estudios adicionales. Se realiza el crecimiento de cantidades mayores de E. coli la cual expresa la rP6 lipídica en la célula hospedadora BLR. Todos los experimentos subsecuentes utilizan este sistema de huésped-vector. La construcción de plásmido descrita en la presente como una modalidad preferida (pPX4020) usa el sistema de promotor inducible con arabinosa el cual tiene varias características únicas: está estrictamente regulado y casi completamente inactivo si no está presente la arabinosa y está presente alguna glucosa. Es modulable también ya que muestra incrementar los. niveles de inducción en cuanto se incrementa la arabinosa que se agrega al medio de cultivo. Estos factores en combinación con la cepa BLR de E. coli, la cual es altamente deficiente en proteasa y deficiente en recombinación, permiten la expresión significativa de la proteína P6 lipídica. La purificación a escala en lote de rP6 lipídica implica la centrifugación diferencial, la extracción diferencial con detergente y la cromatografía de intercambio de aniones (véase el Ejemplo 4). Sin embargo, para llegar a ser un candidato viable para inclusión en una composición antigénica, la rP6 lipídica expresada debe ser purificada por un método el cual es adecuado para llevarlo a gran escala. La diafiltración es un método adecuado para purificación a gran escala. El proceso de diafiltración para extraer la rP6 lipídica es complicado ya que la rP6 lipídica está asociada firmemente con los peptidoglicanos. Como se describe en el Ejemplo 5, se realiza la solubilización de la rP6 lipídica siguiendo la extracción diferencial con detergente como la proteína nativa obtenida a partir de Haemophilus (Hi-P6) (33) , pero con diafiltración de flujo tangencial usada en lugar de la centrifugación. Se prueban todos los detergentes tales como dodecilmaltosida, deoxicolato, ZwíttergentMP 3-08, 3-12, y 3-14 y se encuentra que son aceptables para extraer la rP6 lipídica cuando se usan en el intervalo de 0.2-1% (p/v). La rP6 lipídica puede ser solubilizada también en un amortiguador de borato de sodio, pH 9.5 en 64 °C. La flexibilidad de elección del detergente permite el uso del ZwittergentR 3-12 para extraer la rP6 lipídica. La elección del Zwittergent^ minimiza de esta forma el número de componentes requeridos para producir una composición antigénica multicomponente. Mientras que se obtiene la Hi P6 nativa en esencialmente una forma pura después de la solubilización, se solubiliza la proteína recombinante junto con varias proteínas de E. coli . La cantidad relativa de estas proteínas puede ser variada y en algunos casos casi eliminada por la elección del detergente usado en el extracto final. Se separa la rP6 lipídica de cualesquiera proteínas restantes de E. coli por cromatografía de intercambio de aniones (véase el ejemplo 6) . Este método para extraer las PAL combina los procesos de clarificación y extracción en una operación de unidad. Se extrae el producto a partir de las células y se separa de los residuos celulares con solamente un proceso de diafiltración continuo. Además, se extraen las PAL en un estado semipurificado el cual simplifica las etapas de procesamiento corriente abajo. Finalmente, este proceso es muy escalable, ya que el único requerimiento es que el área superficial de las membranas se incremente proporcionalmente con la cantidad de las células. Este proceso de extracción evita el uso de la centrifugación, un método el cual no es preferido para uso en una extracción a gran escala. Después de la extracción, se purifica la rp6 lipídica por técnicas convencionales. El análisis de la rP6 lipídica es consistente con la caracterización de la proteína recombinante como una lipoproteína, como se esperaba. El tamaño molecular como se determina por espectrometría de masa MALDI-TOF muestra que la proteína recombinante purificada es mucho mayor que la esperada a partir de su secuencia de aminoácidos sola (véase el Ejemplo 7) . El tamaño de la proteína, combinado con el análisis de aminoácidos detallado en la Tabla 1 (véase el Ejemplo 8), indica que se ha eliminado la secuencia de señal y que la proteína está en la forma madura. La existencia de una terminación amino bloqueada, como se demuestra por el análisis de aminoácidos amino terminal (véase el Ejemplo 9) , también muestra que toma lugar la modificación del residuo cisteína terminal. Tomados juntos, estos resultados muestran que la secuencia de señal, la cual ha sido mostrada para ser reconocida y procesada por E. coli resultando en P6 lipídica (23), ha sido eliminada y que la P6 recombinante purificada en la presente es lipídica en su terminación amino. Las investigaciones previas han demostrado que los niveles de anticuerpos contra P6 después de las infecciones con NTHi que ocurren naturalmente tienen una correlación inversa con la incidencia de la enfermedad (34, 35, 36) , haciendo la producción de altos títulos contra P6 una meta de cualquier programa de inmunización que usa este antígeno. La proteína P6 lipídica nativa está presence en muy pequeñas cantidades (menos de 1% de las proteínas de la membrana externa) (33) , lo cual hace muy problemática la purificación de cantidades comercialmente viables. Una ventaja crítica de la rP6 modificada con lípido sobre la rP6 no lipídica expresada previamente es la inmunogenecidad mejorada asociada con la modificación con lípidos. Dos reportes han mostrado que, mientras la rP6 no lipídica es capaz de producir anticuerpos biológicamente activos, es menos inmunogénica que la proteína lipídica nativa. (28, 29) . En contraste, los datos de inmunogenicidad animal presentados en las Tablas 2-4 posteriores (véase los Ejemplos 10 y 11) muestran que la modificación lipídica de la P6 recombinante también incrementa la inmunogenicidad de este antígeno en el modelo de ratón. Un incremento de hasta 2-log en títulos de anticuerpos medios geométricos (GMT) en la semana 6 es muy significativo y hace a la forma lipídica de la proteína rP6 un candidato práctico para la inclusión en las composiciones antigénicas. Esto es reforzado por los resultados en estos experimentos de que la rP6 lipídica no interfiere con la respuesta inmune generada por los otros antígenos probados. Tomados juntos, estos datos soportan la observación de que la rP6 lipídica es viable para inclusión en composiciones antigénicas contra la H. infl uenzae . Aunque se ejemplifica posteriormente con la rP6 lipídica a partir de NTHi, la rP6 lipídica a partir de Hib es también adecuada para inclusión en las composiciones antigénicas de esta invención. Son adecuadas una variedad de sistemas de vectores-células hospedadoras bacterianas para uso para expresar la proteína rP6 lipídica usada en las composiciones antigénicas de esta invención además de aquellas detalladas en los Ejemplos 1-3. Estos sistemas de expresión colocan al gen que codifica la PAL lipídica recombinante bajo el control de un promotor estrictamente regulado. Bajo condiciones específicas, estos promotores operan para regular en forma descendente la producción del ARNm de PAL recombinante, y mitigar consecuentemente cualesquiera efectos dañinos en la célula hospedadora debido a la producción de la PAL lipídica recombinante (37) . Esta regulación estricta puede entonces ser eliminada bajo condiciones específicas para permitir la expresión máxima de PAL lipídica recombinante en la célula hospedadora. Estos promotores estrictamente regulados (los cuales pueden estar junto con otros elementos de control) incluyen, pero no se limitan a, el promotor inducible con arabinosa (38), el promotor T7 el cual puede ser modificado para estar bajo el control por la función antiterminación nutL/N (39, 40) o por Mu C (41), el promotor PL en combinación con el antiterminador (42), la ARN polimerasa SP6 y los promotores SP6 (43), el promotor de colicina (44), el promotor/operador tetA (45), los promotores ramnosa y fosfato (46), los elementos regulatorios LacR/O, tetR/O y AraCIl-12 (47), y promotores invertibles (48) . El sistema de vector es compatible con la célula hospedadora. Las células hospedadoras adecuadas incluyen bacterias transformadas, transfectadas o transducidas por técnicas convencionales con ADN de plásmido, ADN de cósmido o ADN de bacteriófago. Ejemplos de huéspedes bacterianos incluyen E. coli , B. Subtilis, Salmonella y Shigel la . Para construir tal vector, se inserta el ADN de pal en un vector de plásmido el cual contiene un promotor bajo control transcripcional estricto, y se ligan otros elementos de control en sitios específicos dentro del vector, de tal forma que cuando se inserta el vector de plásmido en una célula hospedadora bacteriana, puede ser expresado el ADN de pal por la célula hospedadora. Se introduce el plásmido en la célula hospedadora por transformación, transducción o transfección, dependiendo del sistema vector-célula hospedadora usado. La célula hospedadora es cultivada entonces bajo condiciones las cuales permiten la expresión de la proteína rP6 lipídica por la célula hospedadora. Se induce una célula hospedadora la cual contiene un plásmido con el promotor inducible con arabinosa con L-arabinosa, mientras que se induce una célula hospedadora la cual contiene un plásmido con el promotor T7 con IPTG. Las PAL lipídicas son útiles en la preparación de composiciones antigénicas para conferir protección a mamíferos contra las enfermedades provocadas por las bacterias correspondientes. Por ejemplo, la proteína rP6 lipídica es útil en la preparación de composiciones antigénicas para conferir protección a mamíferos contra las enfermedades provocadas por H. infl uenzae . Estas composiciones antigénícas comprenden unas PAL lípídicas aisladas y purificadas, tales como la proteína rP6 lipídica, en donde la composición antigénica produce una respuesta inmune protectora en un huésped mamífero. Se proporcionan las composiciones antigénicas multivalentes al incluir otras proteínas, tales como al combinar la rP6 lipídica con la proteína UspA2 de Moray.el la ca tarrhalis (la cual está descrita en la Solicitud Internacional del PCT No. WO 98/28333 (49), la cual se incorpora en la presente para referencia) , un agente causativo de la otitis media bacteriana, y la proteína rP4 lipídica recombinante de H. influenzae (también conocida como la proteína "e") (la cual está descrita en la Patente de los Estados Unidos Número 5,601,831 (50), que se incorpora en la presente para referencia) . Pueden ser mezcladas las composiciones antigénicas las cuales contienen una PAL lipídica, tal como la proteína rP6 lipídica, con diluyentes o portadores inmunológicamente aceptables en una forma convencional para preparar soluciones o suspensiones líquidas inyectables. Tales diluyentes o portadores incluyen, pero no se limitan a, PBS, solución salina fisiológica, soluciones isotónicas amortiguadas, liposomas e ISCOMS. El nivel de" anticuerpos producidos por las composiciones antigénicas puede ser mejorado al usar ciertos adyuvantes tales como el hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, StimulonMR QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, MA) , MPLMR (lípido A monofosforilo 3-O-deacilado; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT) , IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA) , la toxina de E. coli lábil al calor y la toxina de cólera (tanto en un tipo silvestre o forma mutante, por ejemplo en donde se reemplaza el ácido glutámico en la posición 29 de aminoácidos por otro aminoácido, preferentemente una histidina, de acuerdo con la Solicitud Internacional del PCT Número WO 00/18434) (51) . Las composiciones antigénicas de esta invención se administran por inyección en una forma convencional, tal como una inyección subcutánea, intradérmica o intramuscular en humanos, así como también por administración oral, mucosal, intranasal o vaginal, para inducir una respuesta inmune activa para protección contra la enfermedad provocada por una bacteria Gram negativa, tal como H. influenzae. Se determina la dosis a ser administrada por medios conocidos por aquellos expertos en la técnica. Puede ser conferida protección por una sola dosis de las composiciones antigénicas, o puede requerir la administración de varias dosis, además de dosis de refuerzo en tiempos posteriores para mantener la protección. Con el fin de que pueda ser entendida mejor esta invención, se indican los siguientes ejemplos. Los ejem??;r? son para el propósito de ilustración solamente y no deben interpretarse- como limitantes del alcance de la presente invención. Ejemplos Se utilizan técnicas de biología molecular estándar de acuerdo a los protocolos descritos en Sambrook et al. (52) . Ejemplo 1 Construcción del plásmido pPX4019 el cual contiene el gen pal y el promotor T7 Como se representa en la Figura 1, se clona el gen pal el cual codifica la proteína P6 con el péptido ae señal de lipoproteína nativa por amplificación con PCR a partir del cromosoma de la cepa de H. infl uenzae no tipificable P860295. Al usar los cebadores mutagénicos los cuales crean un sitio de restricción Ndel el cual comprende el codón de inicio en el extremo 5' del gen (GGAGAAATCATATGAACAAATTTG) (SEQ ID NO: 1) y un sitio HindIII en la región 3' del codón de terminación (GGATCCTGTTTTTCAAGCTTAGAAATACTAAG) (SEQ ID N0:2), se clona el fragmento de PCR el cual contiene el gen pal en el vector de expresión pCRII (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se tamiza por el análisis de restricción. Se usa el plásmido resultante como la fuente para el fragmento Ndel/HindIII el cual contiene el gen pal para P6 el cual se clona en los sitios Ndel y HindIII del vector de expresión pET27b
(Novagen, Madison, Wl). El diseño de esta construcción coloca al gen para P6 bajo el control del promotor T7 y toma ventaja de un sitio de enlace del ribosoma de consenso en el vector. Se identifican los clones iniciales en un huésped de E. coli no permisivo (DH5a) por análisis de restricción. Se elige un aislado de plásmido simple y se guarda como pPX4019. Se usa este plásmido para transformar la cepa huésped permisiva BL21 (DE3, pLysS) (Novagen) para estudios de expresión. Ejemplo 2 Construcción del plásmido pPX4020 la cual contiene el gen pal y el promotor inducible con arabinosa Se construye un segundo plásmido de expresión de la proteína P6 colocando el gen pal bajo el control del promotor inducible con arabinosa estrictamente ÍC^-^J. (38). Este plásmido es generado al subclonar el fragmento Xbal/HindIII a partir del plásmido pPX4019 el cual contiene el gen pal y el sitio de enlace del ribosoma de consenso a partir de pET27b en el plásmido digerido similarmente pBAD18-Cm (véase la Figura 1) . Se tamizan los clones por análisis de restricción seguido por estudios de expresión en candidatos seleccionados. Uno de los aislados de pBAD18-Cm el cual expresa la proteína P6 se designa pPX4020. Ejemplo 3 Expresión de rP6 lipídica a partir de pPX4019 y pPX4020 Se realizan todos los estudios de expresión cualitativa los cuales comparan los aislados diferentes, las construcciones de plásmidos, las cepas hospedadoras de E. coli y la concentración del inductor (IPTG por pPX4019, L-arabinosa (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) para pPX4020) en una forma similar para proporcionar un antecedente consistente para comparación. Se hacen crecer los aislados simples de colonias durante la noche en 37 °C en medio HySoyMR, 1% de glucosa y el antibiótico apropiado para selección de plásmidos (pPX4019, 15 µg/ml Je kanamicina; y pPX4020, 15 µg/ml de cloranfenicol) . Se diluyen estos cultivos a una OD6oa=0.5 en HySoyMR al 1% de glicerol y antibiótico, se hacen crecer en 37 °C a una OD6oo=2-4 y se inducen. Se toman muestras equivalentes a una 00600=1-0 en puntos de tiempo justo antes a la inducción, en dos horas y 18 horas post inducción. Se centrifugan estas muestras y se vuelven a suspender los granulos celulares en 150 µg de amortiguador de carga de SDS-PAGE (ISS, Natick, MA) . Se hacen las comparaciones a partir de los geles SDS-PAGE al 15% teñidos con azul de Coomassie con 15 µl de muestra carga por banda. Cepas de células hospedadoras de E. coli usadas para expresar rP6 lipídica a partir del plásmido pPX4019: DH5 - f80dlacZ?M15 ? (lacZYA-argF) Ul 69 deoR recAlendAlhsdR17 (r~, mk+) phoA supE44?" thi-1 gyrA96 relAl (Life Technologies, Rockville, MD) . BL21 (DE3) - ompT Ion hsdSB (rB~ mB~) gal dem (DE3) (Novagen) Cepas de células hospedadoras de E. col z usadas para expresar rP6 lipídica a partir del plásmido pFX402J: DH5a - f80dlacZ?M15 ? (lacZYA-argF) U 69 deoR recAlendAlhsdR17 (rk~, mk+) phoA supE44?" thi-1 gyrA96 relAl (Life Technologies) . BLR - ompT Ion hsdSB (rB~ mB~) gal dem ?(srl-recA) 306:: TnlO (tet3) (Novagen) BL21 (DE3) - ompT Ion hsdSB (rB" mB~) gal dem (DE3) (Novagen) Crecimiento de E. coli BLR (pPX4020) el cual expresa L-rP6 Se hacen crecer células E. coli recombinantes las cuales expresan rP6 lipídicas en un termentador como se describe posteriormente. Se prepara el medio de crecimiento el cual contiene los siguientes materiales y se esteriliza in situ por termentadores 'y por autoclave para crecimiento en matraz. Solución A. Material g ' 1 *
Fosfato de potasio, monobásico 3.0
Fosfato de potasio, dibásico 7.0
Sulfato de amonio 1.0
Citrato de sodio dihidratado 1.0 a menos que se establezca otra cosa
Solución de alimentación preinoculada : MCG Ingrediente g/L
Glucosa 500
Sulfato de magnesio, heptahidratado 11
Cloruro de calcio 0.83
Solución de EDTA Ingrediente g/L
EDTA 186.15
Se toma una alícuota del medio estéril que contiene la Solución A y la solución mineral en matraces de agitación y se agregan 20 ml de MCG por litro de medie. Se agrega cloranfenicol a 50 µg/ml. Se inoculan los cultivos iniciadores con 200-300 µg/ml de E. coli BLR (pPX4020) a partir de una provisión congelada. Se hacen crecer las células en 30°C con aireación por 16 horas. Se inocula un fermentador de 10 litros el cual contiene medio de crecimiento, complementado como anteriormente, con el cultivo anterior a una ODßoo de aproximadamente 0.2. Se fijan los parámetros de control d~-l fermentador como sigue:
Se usan las siguientes soluciones para control de los parámetros de corrida y se esterilizan antes al use: PPG-2000-200 ml para control de espuma si es necesario, hidróxido de amonio al 40% 1 litro para control del pH durante el crecimiento, glucosa al 50% 1 litro para alimentar cuando el pH empieza a elevarse debido al agotamiento de la glucosa - para crecimiento continuo, ácido acético 4 N 500 ml para control del pH durante la inducción, solución de arabinosa al 25%, (250 g/L) esterilizada por filtración + glicerol al 1% - 250 ml (previamente en autoclave) . Se usa la solución ae arabinosa/glicerol para alimentar después de la adición final de glucosa cuando el pH empieza a elevarse debido al agotamiento de glucosa para inducir la producción de ia proteína. La solución de arabinosa se esteriliza por filtración antes a la adición de la provisión de glicerol que se sometió al autoclave. Se forma la solución por agregar 100 ml de glicerol y 400 ml de una solución de arabinosa al 25% para una fermentación de 10 litros. La concentración final del fermentador contiene 10 gramos/litro de arabinosa y 10 ml/litro de glicero] . Después de la inoculación del fermentador, se agrega una base (hidróxido de sodio) como sea necesario para controlar el pH, junto con el antiespumante (PPG-200^ . Se alimenta oxígeno puro en 800 rpms . Cuando el pH se incrementa arriba de 7.0, se alimentan 900 ml de glucosa al 50% al cultivo. Cuando el pH es mayor que o igual a 7.1, se agregan unos 200 ml adicionales de la solución de glucosa al 50%. Se continúan estas condiciones hasta que se alcanza la OD6oo de aproximadamente 50. Después de que se alcanza una OD600 de aproximadamente 50, cuando se incrementa el pH arriba de 7.0 otra vez, se agregan 500 ml de la solución de arabinosa/glicerol para inducir la expresión de la LrP6. En este momento, se usa ácido para controlar además el pH. Se continúa la incubación por tres horas post inducción, y después se cosecha el cultivo después de la adición de 10 ml por litro de una solución de EDTA 500 mM, pH 8. Se almacena el caldo de cultivo en 4°C hasta la purificación de la rP6 lipídica Ejemplo 4 Purificación analítica a escala de lote de rP6 lipídica por extracción diferencial de membrana por detergente Se utilizan lotes de rP6 lipídica expresada a partir de pPX4020 en experimentos subsecuentes, y se purifican por la extracción diferencial de membrana por detergente como a continuación: 1) Aislamiento de la fracción de membrana de E. coli: Se descongelan granulos celulares bacterianos congelados obtenidos a partir de la fermentación y se suspenden en HEPES-NaOH 10 mM, pH 7.4, Na2EDTA 1 mM con un volumen de amortiguador igual a cinco veces el peso del granulo celular congelado. Se homogeniza la- suspensión celular en un microfluidizador 100-Y de Microfluidics (Newton, MA) para lisar las células. Se obtienen ias membranas a partir del lisado celular por centrifugación diferencial (300,000 x g por 1 hora). Se lavan las membranas dos veces con el mismo volumen de amortiguador usado para lisis, y después se congela como un granulo. 2) Solubilización de rP6 iipídica a pai'.-i --•. membranas de E. coli : Se solubiliza la P6 lipídica a partir de E. coli usando extracción diferencial con detergente similar a aquella descrita por Zlotnick et al (33) y Green et al (22) . Se realizan todas las extracciones por 30 minutos a temperatura ambiente a menos que se establezca otra cosa. Se realizan todas las centrifugaciones usando un rotor Beckman 45Ti en 42,000 rpm por una hora con la temperatura del rotor controlada a 10 °C a menos que se establezca en forma diferente. Se suspenden las membranas de E. coli en HEPES-NaOH 10 mM, pH 7..4, MgCl2 1 mM y se extrae dos veces con TritonMR X-1000 (Cálbioche . Novabiochem International, San Diego, CA) en una concentración final de 1% (p/v) para eliminar los componentes de la membrana interna. Se suspende el granulo resultante de la membrana externa en HCl Tris"11 50 mM, pH 8, Na2EDTA 5 mM, el cual se usa también para suspender los granulos subsecuentes antes a la solubilización de la rP6 lipídica. Se extraen entonces secuencialmente las membranas internas dos ve_-es con ZwittergentMR 3-14 al 1%; dos veces con ZwittergentMR 3-14 al 1% y NaCl 0.5 M; dos veces con N-laurilsarcosina al 1%, sal de Na; ZwittergentMR 3-14 al 1%. Se extrae el granulo final obtenido después de estas extracciones con ZwittergentMR al 3-12 0.2% en HCl TrisMR 10 mM, pH 8, Na2EDTA 1 mM por 45 minutos en 55°C con mezclado intermitente seguido por centrifugación por al menos _-:. -hora. El sobrenadante de esta extracción final contiene la rP6 lipídica. 3) Purificación de rP6 lipídica: El extracto que contiene rP6 lipídica obtenido como se describe anteriormente se purifica además por cromatografía de intercambio de aniones la cual utiliza una resina de flujo rápido DEAE (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) y el mismo amortiguador de concentración iónica baja utilizado para la extracción. Se adsorbe la rP6 lipídica solubilizada en la columna de flujo 'rápido DEAE con un volumen de lecho de aproximadamente 20 ml . Se desarrolla la columna con un gradiente de NaCl 0-0.2 M durante 40 minutos, seguido por 20 minutos de una elusión isocrática con NaCl 0.2 M. La rP6 lipídica eluye durante la fase isocrática del desarrollo. La mayoría de las otras proteínas permanece adsorbida a la columna y son desorbidas posteriormente con NaCl 1M.
Se purifican aproximadamente 100 mg a part-r y 200 g. de células 4) Caracterización de la rP6 lipídica purificada por SDS-PAGE y Western blot: Se evalúa la homogeneidad CÍP la rP6 lipídica purificada por SDS-PAGE en el sistema amortiguador Laem li, seguido por densitometría de láser del gel teñido. Se analizan aproximadamente 10 µg de la LrP6 a partir de tanto el extracto sin purificar y la reserva purificada por intercambio de aniones en un gel de SDS-PAGE al 15% (53) . Se tiñe el gel con azul de Coomassie y se somete a barrido en densitómetro de láser. La densitometría láser del gel teñido de Coomassie (Figura 2A, banda) revela un solo pico de más del 98% de homogeneidaa en las fracciones de intercambio de aniones agrupadas, lo cual indica que la rP6 lipídica ha sido purificada a casi la homogeneidad. Se verifica la identidad de la rP6 lipídica en estas muestras al reaccionar un western blot de las mismas muestras usadas para determinar la homogeneidad con los anticuerpos monoclonales específicos para la P6 de Haemophilus influenzae, los cuales no reaccionan con la proteína relacionada de E. coli (datos no mostrados) . Se muestran los resultados del análisis de wester blot en la Figura 2B. La banda de rP6 lipídica es la única banda reactiva con el anticuerpo monoclonal específico a P6 en tanto el extracto sin purificar (banda 1) o las fracciones agrupadas (banda 2) . Esto indica que la proteína purificada es, de hecho, P6. No se observan productos de degradación. Ejemplo 5 Purificación a gran escala de rP6 lipídica usando extracción diferencial de membrana con detergente Se ajusta el caldo de fermentación de las células de E. coli las cuales expresan la rP6 lípidica a EDTA 10 mM y se diluye a menos de o igual a 10% peso húmedo células/volumen antes a la homogenización. Se lisan entonces las células con un microfluidizador de alta presión y se diafiltra a temperatura ambiente con una secuencia de amortiguadores usando un dispositivo de filtración de membrana de flujo cruzado. Se determina que el área mínima de la membrana para permitir el transporte eficiente de masa de las proteínas solubilizadas a través de la membrana es aproximadamente 0.002 m2/g de las células en peso húmedo. Las proteínas solubilizadas de tamaño aproximado menor a una clasificación de corte de peso molecular de 1000 kD de la membrana pasan al través con el permeado, mientras que las moléculas más grandes y las proteínas insolubilizadas se retienen. Las etapas de la secuencia de diafiltración es como sigue: (1) Se diafiltra el caldo de fermentación lisado con Hepes 10 mM/EDTA lmM/pH8.0 (amortiguador de iisis) en un volumen igual a tres veces el volumen del producto retenedor para eliminar los contaminados intraceiulares y extracelulares a través del permeado. (2) Se diafiltra el lisado tres veces con Hepes 10 mM/MgCl2 1 mM/TritonMR X-100 al 0.2% para solubilizar y eliminar las proteínas de la membrana interna. Los iones Mg++ solubilizan la membrana externa, por lo tanto, no se solubilizan las proteínas de la membrana externa en la presencia de TritonMR X-100. (3) Se diafiltra el lisado tres veces con TrisMR 50 mM/EDTA 5mM/ZwittergentMR 3-14 al 0.2% para solubilizar y remover las proteínas de la membrana externa (pero no la rP6 lipídica) . El EDTA sirve para secuestrar los iones Mg++ a partir de la etapa (2), así como también para evitar la proteólisis . (4) Se diafiltra el lisado tres veces con TrisMR 50 mM/EDTA 5 mM/NaCl 0.5 M/Zwittergent^ 3-14 al 0.2% para solubilizar y remover las proteínas adicionales. Se agrega el NaCl al amortiguador en esta etapa para alterar cualesquiera interacciones iónicas entre las proteínas de la membrana y las membranas. Se realiza esta etapa ya que la rP6 lipídica es una PAL, y la sal sirve para remover las proteínas enlazadas a la membrana (pero no rP6 lipídica) a partir del complejo de membrana/proteína de la membrana externa. Se continúa la diafiltración con tres volúmenes de producto retenedor de TrisMR 50 mM/EDTA 5 mM para reducir la concentración de ZwittergentMR en el producto retenedor. (5) Se diafiltra el lisado tres veces con TrisMP 50 mM/EDTA 5 mM/sarcosil al 0.2% para eliminar las proteínas enlazadas a la membrana adicionales (pero no la rP6 lipídica) y después se diafiltra tres veces con TrisMR 50 mM/EDTA 5 mM para reducir la concentración del sarcosilo en el producto retenedor. (6) Se diafiltra el lisado tres veces con fosfato 10 mM/ZwittergentMR 3-12 al 0.2% para eliminar las proteínas enlazadas a la membrana adicionales (pero no la rP6 lipídica) , y después se diafiltra tres veces con fosfato de sodio 10 mM para reducir la concentración del Zw?ttergentMF 3-12 en el producto retenedor. (7) Se concentra el lisado a 20% de su volumen original y después se diafiltra tres veces con fosfato de sodio 10 mM/ZwittergentMR 3-12 al 0.2% en 55°C para solubilizar la rP6 lipídica, la cual se recolecta a través del permeado. Se realiza la etapa de concentración antes a la diafiltración para incrementar la concentración de la rP6 lipídica en el permeado. Se continua la diafiltración por tres volúmenes de producto retenedor adicionales con fosfato de sodio 10 mM al 55°C para reducir la concentración del ZwittergentMR 3-12 en el producto retenedor. Se realiza esta etapa de calentamiento ya que (como en la etapa (4) anterior)) la rP6 lipídica es una PAL, y el calentar sirve para eliminar la rP6 lipídica a partir del complejo de membrana/proteína de la membrana. Finalmente, se concluye la diafiltración con tres volúmenes de producto retenedor de fosfato de sodio 10 mM a 55 °C. Durante las etapas de la diafiltración, se mantiene la presión transmembranal en aproximadamente 10 psi y se mantiene la velocidad del flujo cruzado en aproximadamente 120-180 1 mH . Se corren todos los procesos de diafiltración en temperatura ambiente, excepto la etapa de extracción final a 55°C, la cual se corre en una temperatura superior para solubilizar la rP6 lipídica. El flujo de permeado está en el intervalo de 30 a 50 lmh, el cual es suficientemente alto para que el proceso de extracción sea práctico y escalable. Durante la extracción, se toman las muestras en varios puntos para el análisis por SDS-PAGE para evaluar el efecto de varias etapas de diafiltración en la extracción de las proteínas. Se precipitan las muestras por adición de alcohol, se centrifugan, y después se vuelven a solubilizar a 20% del volumen original en amortiguador para preparación de la muestra de SDS. Este método para preparar ias muestras concentra la muestra y reduce la concentración del Tritón™ X-100 o ZwittergentMR 3-12 de las muestras. El TritonMR X-100 o ZwittergentMR 3-12 interfieren con el enlace de SDS a la muestra y reducen la resolución de las bandas en los geles. Se cargan 10 µl de cada muestra en geles de acrilamida Novex al 10% y se corren los geles por 60-90 minutos en 125 voltios. Se muestra en las Figuras 2 y 3 el análisis de SDS-PAGE típico de las muestras tomadas a partir de las corrientes de permeado durante el proceso de extracción de rP6 lipídica. La rP6 lipídica corre en 15 kilodaltones (kD) en estos geles. Los geles muestran que se eliminan algunas proteínas contaminantes durante la diafiltración con el amortiguador de lisis y el amortiguador que contiene varios detergentes. Hay muy poca pérdida de la rP6 lipídica durante estas etapas de diafiltración. Durante la etapa final de diafiltración con ZwittergentMR 3-12 en 55°C, se extrae la rP6 lipídica en un estado parcialmente purificado. En el final de la segunda etapa de diafiltración con ZwittergentMR 3-12 en 55°C, está presente muy poca rP6 lipídica en la corriente del permeado. Esto sugiere que se ha removido la mayoría de la rP6 lipídica solubilizada a través del permeado. Otros experimentos han mostrado que muy poca rP6 lipídica permanece insolubilizada en el producto retenedor después de la completación ae! proceso de diafiltración. Se muestra que la banda de 15kD del ZwittergentMR 3-12/extracto a 55°C es rP6 lipídica por el análisis western (datos no mostrados) . El uso del Zwittergent™ 3-12 en la solubilización de la rP6 lipídica resulta en un extracto que contiene varias proteínas además de la rP6 lipídica. Se determina la homogeneidad de este extracto para ser aproximadamente rP6 lipídica al 78% (Figura 2, Panel A, banda 1) . Mientras que este es un alto grado de homogeneidad para una solubilización inicial, se desea separar la LrP6 a partir de estas proteínas de E. coli si es posible. Esto se realiza como se describe en el Ejemplo 6. Ejemplo 6 Purificación adicional de la rP6 lipídica purificada por cromatografía de Intercambio de aniones Se usa la cromatografía de intercambio de aniones para purificar además la rP6 lipídica descrita en el
Ejemplo 5, ya que se ha usado exitosamente para purificar la rP6 no lipídica. La rP6 lipídica adsorbe más fuertemente a la resina DEAE que la rP6, la cual eluye típicamente con
NaCl 0.1 M. La rP6 lipídica en Zwittergent™ al 0.2% requiere NaCl 0.2 M en el amortiguador antes de que ocurra la desorbción. Las proteínas de E. coli permanecen adsorbidas a la resina de intercambio de aniones (DEAE) hasta después de que eluye la rP6 lipídica. Se muestran en la Figura 2 la homogeneidad y la identidad de la rP6 lipídica extraída y purificada con Zwittergent™ 3-12 al 0.2%. Se determina la homogeneidad de la rP6 lipídica purificada para ser mayor al 98% (Figura 2, Panel A, banda 2) . Ejemplo 7 Determinación del peso molecular por análisis de espectro de masa MALDI-TOP Se realiza la medición exacta del peso molecular de la rP6 lipídica expresada a partir de pPX4020 con el promotor inducible con arabinosa por la desorción asistida con láser/espectrometría de masa por tiempo de vuelo de ionización usando un analizador de masa lineal Finnigan Mat Lasermat™ 2000 (Finnigan Mat, Ltd., San José , CA) . El Lasermat™ usa la técnica de desorbción asistida con láser de matriz (54) para ionizar la muestra y el tiempo de vuelo para analizar los iones producidos. Se embebe la muestra en una matriz de ácido 3, 5-dimetoxi-4-hidroxi-cinámico (ácido sinapínico) para incrementar la ionización de la muestra. Se mezcla un microlitro de la muestra la cual contiene 5-10 pmoles de la proteína purificada con 1 µl de la matriz ?u mg/ml) disuelta en acetonitrilo acuoso al 70% (v/v) el cual contiene ácido trifluoroacético al 0.1% (v/v). Se carga un microlitro de esta muestra y la mezcla de matriz en *_.n portaobjetos de muestras, se permite secar y se irradia por impulso corto de la luz UV a partir del láser. Las muestras de proteínas usualmente generan un espectro relativamente simple en este método, ya que los iones relacionados a proteínas producidos son predominantemente de estados de carga z=+l [M+H]+ y z=+2 [M+2H]2+. Se usa el citocromo C de corazón bovino (Sigma Chemical Co., St . Louis, MO) de peso molecular 12,230.9 para calibración externa. Se determina el peso molecular de la rP6 lipídica en la muestra usada para ser 15,078. Además al ion molecular esperado [M+H] , se observa también el ion molecular [M+2H]2+ de la rP6 lipídica. El peso molecular teórico de P6 la cual contiene un residuo de tripalmitoil cisteína en su terminal N es 15,024 y el peso molecular predicho de P6 sin ser procesada por la peptidasa II de señal es 16,016, mientras que el peso molecular predicho de la P6 no lipídica escindida por la peptidasa II de señal es 14,234.66. De esta forma, estos resultados son consistentes con la expresión de la forma lipídica de rP6 por E. coli . Ejemplo 8 Análisis de composición de aminoácidos Se seca una muestra de rP6 lipídica para el análisis de aminoácidos en tubos de vidrio, seguido por la hidrólisis usando 100 µl de HCl 6 N el cual contiene fenol al 5% y 2-mercaptoetanol al 1% bajo vacío por 22 horas en 110°C. Se secan subsecuentemente las muestras bajo vacío, seguido por la resolubilización en el amortiguador de dilución de la muestra Na-S (Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA) . Se determina la composición de aminoácidos en un Analizador de aminoácidos Beckman Modelo 6300 (55) usando un gradiente de citrato de Na de tres etapas de acuerdo a las instrucciones del fabricante. No se corrigen para destrucción los residuos treonina y serina. Ya que los residuos cisteína y triptófano no son determinados por el método usado, los resultados se expresan como moles de residuos por mol de rP6 lipídica en base al peso molecular teórico de la rP6 no lipídica menos las cisteínas, lo cual iguala 14,132.4 (la rP6 lipídica no contiene el Trp). Se muestran los resultados en la Tabla 1 y representan la media de las determinaciones duplicadas. Los resultados son consistentes con la secuencia de la señal del gen pal el cual se ha removido por E. coli .
Tabla 1 Análisis de aminoácidos de la rP6 lipídica ND= no determinado Ejemplo 9 Análisis de la secuencia de aminoácidos amino terminales Se realiza el análisis de la secuencia de proteínas amino terminales usando un secuenciador de proteínas/péptidos de Applied Biosystems Modelo 477A equipado con un analizador de PTH on-line Modelo 120A (Applied Biosystems, Foster City, CA) . Después de la escisión de cada terminal amino sucesiva, se convierte el derivado anilinotiazolinona formado al derivado feniltiohidantoína (PTH) más estable por tratamiento con ácido trifluoroacético al 25% en 64 °C por 20 minutos. Se separan los derivados PTH y se identifican en el analizador de PTH por HPLC de fase inversa usando una columna Brownlee PTH C-18 (tamaño de partícula 5 µm, 2.1 mm i.d. x 22 cm 1.; Applied Biosystems) con un sistema de gradiente modificado de dos solventes desarrollado por el fabricante (56). Cuando la rP6 lipídica (400 pmoles) se somete al análisis de secuencia de aminoácidos amino terminal, no se pueden obtener datos de la secuencia. Esto sugiere que no está disponible el grupo amino primario (o secundario) del aminoácido amino terminal para la química de secuenciación, es decir, está bloqueado el residuo amino terminal de la LrP6. Con el fin de confirmar que la incapacidad para generar los datos de secuencia no es debido a cualquier malfuncionamiento del instrumento, se corre subsecuentemente un experimento de control en el cual se somete una mezcla de 400 pmoles de la rP6 lipídica y 200 pmoles de la beta-lactoglobulina al análisis de secuencia amino terminal. Se obtiene una sola secuencia la cual representa la secuencia amino terminal de la beta-lactoglobulina, lo cual confirma que el residuo amino terminal de la rP6 lipídica está esencialmente bloqueado. Ejemplo 10 Inmunogenicidad de la rP6 lipídica comparada con la rP6 no lipídica Se compara la inmunogenicidad relativa de la P6 recombinante lipídica purificada y la P6 recombinante no lipídica (28) en ratones Swiss-Webster . Cada dosis de cinco µg de cada proteína se mezcla con 100 µg de A1PO-. y se usan 50 µg del lipido A monofosforilo 3-O-deacilado (MLPMF) (Ribi Immunochemicals, Hamilton, MT) para inmunizar a los ratones subcutáneamente en las semanas 0, 4 y 6. Se toman las muestras sanguíneas en las semanas 0, 4, 6, y 8. Se inmunizan otros grupos de ratones con las mezclas tanto de rP6 no lipídica o rP6 lipídica y la proteína UspA2 de
Moraxella ca tarrhalis (49), un agente causativo de la otitis media bacteriana, y la rP4 lipídica recombinante.
(50) . Estas mezclas tienen también adyuvantes tales como A1P0 y MPL™ como anteriormente. Se analizan los antisueros obtenidos de estos ratones por ELISA para anticuerpos contra tanto las proteínas P6, P4, o UspA2. Se determinan los títulos de ELISA (22, 28) para tanto sueros agrupados o animales individuales y después se deriva el título medio geométrico (GMT) . Se muestran en las tablas 2 y 3 los resultados.
Tabla 2 Títulos ELISA anti-P6 Inmunogen Título ELISA ant?-P6 Semana 0 Semana 6 Semana 8
µg de rP6 (no GMT 1,369 17, 686 lipídica) agrupado <50 40,715 147, 985
µg de rP6 (lipídica) GMT 341,987 780,179 agrupado <50 706,826 "786, 91"7
µg de cada rP6 (no GMT 425 15, 015 lipídica), rP4, UspA agrupado <50 692 64, 913
µg de cada rP6 GMT 251, 731 1 , 0 ^ ? , =. ? (lipídica), rP4, UspA agrupado <50 739, 896 1, 269, 52?
Tabla 2 Títulos ELISA anti-P6 Inmunogen Título ELISA anti-P4 Título ELISa anti UspA2 Semana 4 Semana C Semana 4 Semana 0 5 µg de cada rP6 GMT 84,677 143,285 (no lipídica) , agrupado <50 189, 980 <50 :47,0üj rP4, UspA 5 µg de cada rP6 GMT 136,412 257,751 (lipídica), rP4, agrupado <50 197,361 <50 335, 548 UspA La rP6 lipídica es por lo menos un log más inmunogénica que la rP6 no lipídica cuando se administra sola con los adyuvantes MPL™ y A1P04. Cuando se combina con rP4 y UspA2, no se observa competición antigénica. De hecho, la respuesta a la rP6 lipídica se incrementa a aproximadamente 1.5 logs más que la respuesta a la rP6 no lipídica. El análisis de la respuesta inmune a los antígenos UspA2 y rP4 muestra que la adición de la rP6 lipídica no altera la respuesta inmune a estos antígenos comparada con la adición de la rP6 no lipídica. Ni el antígeno tiene algún efecto en la respuesta inmune normal observada cuando se mezclan la rP4 y la UspA2 entre sí.
Esto demuestra la compatibilidad de estos antígenos. Ejemplo 11 Actividad bactericida del antisuero de ratón Se demuestra la actividad biológica del antisuero dirigido contra la rP6 lipídica y las mezclas de rP6/rP4 lipídica por usar un ensayo bactericida in vitro. Se realiza este ensayo como se describe previamente (22, 28) usando la cepa de H. influenzae no tipificable P861454 como el objetivo. Se muestran los resultados en la Tabla 4: Tabla 4 Actividad bactericida in vitro de los antisueros de las Tablas 2 y 3 Inmunogen Sueros de la semana 6 Sueros de la semana 8 Título BC Veces (X) el Título BC Veces (X) el antecedente antecedente
RP6 3,200 8X 12,800 16X L-rP6 3,200 4X 12,800 16X RP6, rP4, 3,200 4X 6,400 8X üspA2 L-rP6, rP4 3,200 4X 12,800 16X UspA2 Los resultados demuestran que los anticuerpos biológicamente activos producen rP6 lipídica en este ensayo. Mientras que los títulos absolutos no difieren entre los antisueros lipidíeos y no lipidíeos, esto puede ser debido al antisuero que es máximamente bactericida en este sistema de ensayo, específicamente ya que el suero preinmune demuestra un alto grado de muerte no específica con la fuente de complemento en este ensayo. La mezcla de rP6/rP4 lipídica también produce anticuerpos bactericidas en títulos equivalentes a aquellos obtenidos con la mezcla rP6/rP4 no lipídica. No es posible distinguir entre la actividad bactericida de los anticuerpos anti-rP4 y los anticuerpos anti-rP6 en este ensayo, pero es claro que la mezcla de los antígenos de Haemophilus produce antisuero altamente bactericida contra la H. Influenzae no tipificable . Bibliografía 1. Ludwig, B., et al., Infect . Immun . , 59, 2515- 2521 (1991) . 2. Lazzaroni, J.C., et al., Mol . Microbiol . , 6, 735-742 (1992) . 3. Spinola, S.M., et al., Infect . I mun . , 64, 1950-1955 (1996) . 4. Burnens, A., et al., J^_ Clin. Microbiol . , 33, 2826-2832 (1995) . 5. Rodriguez-Herva, J.J., et al., J^_ Bacteriol. , 178, 1699-1706 (1996) .
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Claims (17)
- REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama, como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un plásmid?¡ el cual contiene un promotor estrictamente regulado, está caracterizado porque el promotor está enlazado operativamente a una secuencia de ADN aislada y purificada la cual comprende una secuencia de ADNj la cual codifica una lipoproteína asociada a peptidoglicanos (PAL) de bacterias Gram negativas y en donde la secuencia del ADN, bajo el control del promotor, se expresa en la forma lipídica.
- 2. El plásmido de conformidad con la reivindicación 1, está caracterizado porque la PAL es la proteína P6 de Haemophilus influenzae ( H. infl uenzae) .
- 3 . El plásmido de conformidad con la reivindicación 2, está caracterizado porque el promotor es un promotor inducible con arabinosa o un promotor T7.
- 4. El plásmido de conformidad con la reivindicación 3, está caracterizado porque el promotor es un promotor inducible con arabinosa.
- 5. El plásmido de conformidad con la reivindicación 4, está caracterizado porque el plásmido se designa pPX4020.
- 6. El plásmido de conformidad con la reivindicación 3, está caracterizado porque el promotor es un promotor T
- 7. 7. El plásmido de conformidad con la reivindicación 6, está caracterizado porque el plásmido se designa pPX4019.
- 8. Una célula hospedadora bacteriana está caracterizada porque se transforma, transduce o transfecta con el plásmido de conformidad con la reivindicación 1.
- 9. Un método para producir una PAL lipídica recombinante, está caracterizado porque comprende transformar, transducir o transfectar una célula hospedadora bacteriana con el plásmido de conformidad con la reivindicación 1 y cultivar la célula hospedadora bajo condiciones las cuales permiten la expresión de la PAL recombinante lipídica por la célula hospedadora.
- 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, está caracterizado porque la PAL es la proteína P6 de H. influenzae.
- 11. Una composición antigénica está caracterizada porque comprende PAL recombinante lipídica, en donde la composición antigénica produce una respuesta inmune protectora en un huésped mamífero.
- 12. La composición antigénica de conformidad con la reivindicación 11, está caracterizada porque la PAL es la proteína P6 de H. influenzae .
- 13. La composición antigénica de conformidad con la reivindicación 11, está caracterizada porque además comprende uno o más de un diluyente o portador.
- 14. La composición antigénica de conformidad con la reivindicación 11, la cual está caracterizada porque además comprende por lo menos un adyuvante.
- 15. La composición antigénica de conformidad con la reivindicación 14, está caracterizada porque el adyuvante se selecciona del grupo que consiste de por lo menos uno de hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, StimulonMR QS-21, lípido A monofosforilo 3-O-deacilado, IL-12, la toxina lábil al calor de E. coli, y toxina de cólera del tipo silvestre o mutante.
- 16. Un método para inmunizar contra una bacteria Gram negativa está caracterizado porque comprende administrar a un huésped mamífero una cantidad inmunogénica de la composición antigénica de conformidad con la reivindicación 11.
- 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, está caracterizado porque la bacteria Gram negativa es H. influenzae y la composición antigénica incluye rP6 lipídica.
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