JPWO2008105142A1 - マトリックス溶液 - Google Patents

Abstract

マトリックス溶液は、アセトニトリルと水からなる混合液を主たる溶媒成分とし、アセトニトリルと水の体積比が、アセトニトリル６．５に対して水３．５の割合からアセトニトリル８に対して水２の割合の範囲にあり、マトリックスとしてシナピン酸を含む。

Description

本発明は、小口径ノズルを通して吐出させるマトリックス溶液に関する。

近年、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）を用いた質量分析イメージング技術の開発が盛んに行われている。質量分析イメージングは、組織切片や、チップやゲルで分離した試料のそれぞれの位置にレーザーを照射し、照射位置毎に質量分析を行う技術をいう。
この技術においては、レーザーを照射する前に、予めタンパク質等の試料のイオン化を促進するためのマトリックスと呼ばれる試薬を試料に添加し、マトリックスと共に試料が結晶化した状態を作成する必要がある。一般的なイメージング技術同様、この技術においても位置分解能は高ければ高いほど好ましいが、この位置分解能は下記の要因によって制限される。

一つ目の要因は、照射するレーザースポットの径である。一般的なＭＡＬＤＩ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法）ではこのレーザースポット径は１００ミクロンから２００ミクロン程度である。

二つ目の要因は、マトリックス添加時の試料分布の乱れである。マトリックスは、通常、アセトニトリルという揮発性有機溶媒と水の混合溶媒に溶解された溶液の状態で組織切片やチップ基板などに添加され、溶媒の乾燥によってマトリックスが析出、結晶化する際に、その場にあるタンパク質等の試料を取り込む。この際に、マトリックスの液量が多いと、タンパク質等の試料を取り込んだマトリックス溶液が組織切片上、あるいはチップ上やゲル上を広範囲に流れ、タンパク質等の試料の位置情報は乱れてしまう。従って、マトリックス添加技術には、少量の溶液を小面積ごとに添加する技術が必要になる。

そこで、質量分析イメージングにおいては、液滴を小さくするために、小口径ノズル、例えば、インクジェット、ディスペンサ、スプレー、エレクトロスプレー、超音波霧化装置等を用いてマトリックスを添加する。この際の液滴の径、あるいは小口径ノズルの内径は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳのレーザースポット径程度か、あるいはそれよりも小さいことが望まれる。このとき、マトリックス溶液の液滴の液量はｎＬレベルとなる。

一方で、マトリックス溶液の濃度は十分高いことが要求される。マトリックスはｍｏｌ比でタンパク質やペプチド等の試料の１０００倍程度の混合比で結晶を作成することが望ましいとされている。

マトリックスとしては、イメージング技術に用いる場合に限らず、通常の質量分析測定時においても、シナピン酸が汎用的に用いられている。このシナピン酸は、質量分析装置メーカーや試薬メーカーの推奨もあって、過飽和あるいは飽和溶液に近い１０ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解して用いられる。溶媒には、体積比でアセトニトリル３に対して水７の混合液が用いられており、この溶媒は、０．１〜１％のＴＦＡ（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を含有することが多い。

シナピン酸の分子量は２２４．２１であることから、シナピン酸濃度１０ｍｇ／ｍＬのマトリックス溶液１ｎＬに含まれるシナピン酸の物質量は、４４．６ｐｍｏｌとなる。したがって、この千分の一のｍｏｌ比に対応するタンパク質やペプチド等の試料の量は４４．６ｆｍｏｌとなる。通常市販されている質量分析計の感度の下限が１０ｆｍｏｌであることを考慮すると、この試料濃度は、安定的に検出できる下限に近い量となる。

即ち、イメージング技術に適用する際にも、マトリックス溶液濃度を少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ程度にすることが必須となる。実際、質量分析イメージングを研究する多くのグループがこの通常条件のマトリックス溶液を使用している。
例えば、特許文献１には、０．１〜１％のＴＦＡを含有する、体積比でアセトニトリル１に対して水１の溶媒に２０ｍｇ／ｍＬの濃度でシナピン酸を溶解したマトリックス溶液を用いて質量分析イメージングを行った結果が記載されている。
特開２００６−３３７３７１号公報

しかしながら、従来のマトリックス溶液を質量分析イメージングに用いた場合、下記に述べる問題を生じていた。
すなわち、従来のマトリックス溶液は、シナピン酸の飽和溶液であるか、飽和に極めて近い濃度の溶液である。そのため、小口径ノズルからマトリックス溶液を吐出させると、小口径ノズル中、あるいはノズルの吐出口でシナピン酸が析出し、結晶化して、小口径ノズルが詰まってしまうという問題を生じていた。

本発明によれば、小口径ノズルを通して吐出させるマトリックス溶液であって、アセトニトリルと水からなる混合液を主たる溶媒成分とし、アセトニトリルと水との体積比が、アセトニトリル６．５に対して水３．５の割合からアセトニトリル８に対して水２の割合の範囲にあり、マトリックスとしてシナピン酸を含むことを特徴とするマトリックス溶液が提供される。

本発明によれば、シナピン酸を溶解させたマトリックス溶液のアセトニトリルと水の体積比をアセトニトリル６．５に対して水３．５の割合からアセトニトリル８に対して水２の割合の範囲とすることにより、高濃度のシナピン酸を含有するマトリックス溶液を得ることができる。また、本発明によれば、シナピン酸を析出させることなく、小口径ノズルを通してマトリックス溶液を吐出させることができる。したがって、液滴の小さいマトリックス溶液の添加が可能となり、位置分解能の高い質量分析イメージングを実現することができる。

本発明によれば、マトリックスとして多用されるシナピン酸溶液の濃度を必要十分な濃度に維持しながら、小口径ノズルを通して吐出する際においても、小口径ノズルが詰まりにくいマトリックス溶液が提供される。

本実施形態の効果を説明するグラフである。 本実施形態の効果を説明するグラフである。 本実施例の結果を示すグラフである。

本実施形態に係るマトリックス溶液は、小口径ノズルを通して吐出させるマトリックス溶液である。アセトニトリルと水からなる混合液を主たる溶媒成分とし、アセトニトリルと水の体積比が、アセトニトリル６．５に対して水３．５の割合からアセトニトリル８に対して水２の割合の範囲にあり、マトリックスとしてシナピン酸を含む。

本実施形態に係るマトリックス溶液の主たる溶媒成分は、体積比でアセトニトリル６．５、水３．５の割合からアセトニトリル８、水２の割合までの範囲からなるアセトニトリルと水との混合液である。
主たる溶媒成分とは、体積比として溶媒の９０％以上を占める構成成分とすることができるが、９７％以上を占める構成成分とするとより好ましい。

本実施形態に係るマトリックス溶液の主たる溶媒成分は、さらに望ましくはアセトニトリル７、水３の割合からアセトニトリル８、水２の割合までの範囲からなるアセトニトリルと水との混合液とすることができる。

シナピン酸の濃度は、質量分析の感度によって影響されるものであり、質量分析の目的を達成できる量であれば特に限定されるものではないが、好ましくは、４．４８ｍｇ／ｍＬ以上１１．２ｍｇ／ｍＬ以下とすることができる。

本実施形態に係るマトリックス溶液には、アセトニトリル及び水と混合可能な溶媒を含むことができる。この溶媒としては、たとえば、アルコール等の極性溶媒を用いることができる。

本実施形態に係るマトリックス溶液には、酸が添加されていてもよい。
酸としては、例えばＴＦＡを用いることができる。酸の濃度は、特に限定されるものではないが、例えば、ＴＦＡを用いた場合においては、０．１％以上１％以下にすることができる。

本実施形態に係るマトリックス溶液は、小口径ノズルを通して吐出させる。小口径ノズルの型式は特に制限されるものではないが、例示するとすれば、インクジェット、ディスペンサ、スプレー、エレクトロスプレーを用いることができる。

本実施形態に係るマトリックス溶液は、内径が０．１８ｍｍ以下の小口径ノズルであっても、良好に吐出することができる。ノズルの内径の下限値は、マトリックス溶液が添加できる大きさであれば特に制限はないが、実用性、入手容易性、価格を考慮すると、０．１０ｍｍ以上とすることができる。

吐出時の温度は、小口径ノズルの使用温度に適すれば、特に限定されないが、１０〜３０℃の範囲で吐出させることが好ましく、２０〜２５℃の範囲で吐出させるとより好ましい。

以下に本実施形態の効果を説明する。
図１は、アセトニトリルと水の混合比を変えて作成した溶媒に対するシナピン酸の飽和濃度を室温で測定したグラフである。下軸にアセトニトリル濃度、上軸に水の濃度を体積％で示している。また、左軸にシナピン酸の濃度をｍｇ／ｍＬの単位で、右軸に対応するｍｏｌ濃度をμｍｏｌ／ｍＬの単位で示している。

図１で示されるように、シナピン酸の飽和濃度はアセトニトリルと水の混合比により大幅に変化する。
アセトニトリル７、水３の割合の場合に最大値を取り、５６．４ｍｇ／ｍＬの値を取る。また、アセトニトリル６．５、水３．５の割合からアセトニトリル８、水２の割合までの範囲でほぼ５０ｍｇ／ｍＬ以上の値を取り、通常の濃度１０ｍｇ／ｍＬの５倍の値を取る。したがって、シナピン酸を溶解して１０ｍｇ／ｍＬの溶液を作成しても、飽和濃度まで５倍の間隔があるため、シナピン酸は容易に析出できず、ニードルを詰まりにくくすることができる。

図２は、アセトニトリルと水の温度−蒸気圧曲線である。
この図では、横軸に温度（℃）、左軸に蒸気圧をｍｍＨｇの単位で、右軸に同じく対応する蒸気圧をｋＰａの単位で示している。
この図によれば、２０℃近傍ではアセトニトリルは水の約４倍の蒸気圧を示す。したがって、小口径ノズル先端の気液界面ではこの割合に従って溶媒が蒸発する。
本実施形態に係るマトリックス溶液の主たる溶媒の体積比は、この蒸気圧比に近い値である。したがって、この体積比は、乾燥によりあまり変わらずに安定した条件といえる。

このような条件を総合すると、アセトニトリル７、水３の割合からアセトニトリル８、水２の割合までの範囲で混合して作成した溶媒にマトリックスとしてシナピン酸を溶解したマトリックス溶液を用いると、より安定して、小口径ノズルを詰まらせることなく従来と同濃度のシナピン酸溶液を滴下することが出来る。

また、シナピン酸濃度としては、通常市販されている質量分析計の感度下限１０ｆｍｏｌの２倍のサンプル量に対応し、安定的に測定できる４．４８ｍｇ／ｍＬ、即ち、２０ｐｍｏｌ／μＬ以上とすることができる。また、飽和濃度の５倍以下となる１１．２ｍｇ／ｍＬ以下とすることができる。これにより、質量分析の目的となる試料に対し、十分な濃度のシナピン酸を添加でき、且つニードルを詰まりにくくすることができる。

＜マトリックス溶液の調製＞
アセトニトリルと水の体積比をアセトニトリル／水＝３：７、６：４、６．５：３．５、７：３、８：２、８．５：１．５の条件でシナピン酸を溶解する溶媒を作成した。
各々の溶媒に、０．１〜１％のＴＦＡを混合し、シナピン酸を１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。

＜吐出能に関する実験＞
室温にて、２８Ｇ（内径０．１８ｍｍ、外径０．３６ｍｍ）のディスペンサ用金属ニードルを用いて上記調製したマトリックス溶液をそれぞれ滴下し、吐出能を調べた。また、時間を置いてマトリックス溶液を滴下し、マトリックス溶液の再吐出能についてそれぞれ調べた。

＜タンパク質の溶解性に関する実験＞
上記調製したマトリックス溶液に、タンパク質としてアポミオグロビンをシナピン酸の濃度に対し、ｍｏｌ比で１０００分の１になるように加え、アポミオグロビンの溶解性を調べた。

＜信号検出強度の均一性に関する実験＞
上記調製したアポミオグロビンを含有するマトリックス溶液を３２Ｇ（内径０．１０ｍｍ、外径０．２３ｍｍ）のディスペンサ用金属ニードルを用い、室温にて直線状流路を有するチップ基板の流路に沿ってそれぞれ滴下した。質量分析計に掛けてアポミオグロビンの信号検出強度を測定して、信号検出強度の均一性を評価した。

＜結果＞
表１に結果を示す。○は良好、×は不良、△は良好な場合（○の場合）と不良な場合（×の場合）があり、結果で不安定であったことを示す。

吐出能に関する実験においては、アセトニトリル/水が３：７のマトリックス溶液を滴下しようとした場合、ニードル先の結晶を取り除いて1分もたたないうちに結晶が析出してニードルが詰まってしまった。また、滴下中にニードルが詰まってしまうという現象も見られた。一方、その他の体積比においては、特にニードルが詰まることなく滴下することが出来た。

再吐出能に関する実験を繰り返し行ったところ、アセトニトリルと水の体積比を７：３と８：２としたものは安定した吐出を示した。

タンパク質の溶解性に関する実験においては、アセトニトリルと水の体積比を８．５：１．５とした溶媒では、有機溶媒の比が高すぎてアポミオグロビンがきれいに溶解しなかったが、その他の体積比からなるマトリックス溶液には、アポミオグロビンは、良好に溶解した。

信号検出強度の均一性に関する実験においては、アセトニトリルと水の体積比を６：４とした条件では、均一性が明らかに他の条件より劣っていた。そこで、シナピン酸濃度を約８．５ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう薄めて実験を行ったところ、信号検出強度について良好な均一性が得られた。したがって、アセトニトリルと水の体積比を６：４とした条件では、他の条件と比較してニードル中に結晶が析出しやすいため、液の吐出量が不安定になりやすいことが判明した。
また、アセトニトリルと水の体積比を６：４とする条件では他の場合と比較して乾燥速度も遅く、液が流れやすいため、質量分析イメージングへの適用は難しいことがわかった。

アセトニトリルと水の体積比を６：４とした条件では、図１のグラフからシナピン酸の飽和濃度は、４３ｍｇ／ｍＬである。この条件においては、シナピン酸濃度を約８．５ｍｇ／ｍＬとすれば、上記のように良好な信号強度が得られることから、シナピン酸濃度は飽和濃度の１／５以下にすべきであると考えられた。
そこで、シナピン酸をｍｏｌ濃度で計算して溶液を作成し、アセトニトリルと水の体積比を７：３及び８：２からなるマトリックス溶液を用いて、質量分析計のアポミオグロビン検出感度実験を行ったところ、シナピン酸濃度を４．４８ｍｇ／ｍＬ（２０ｐｍｏｌ／μＬ）以上にすると、きれいな信号が検出できることがわかった。

このような実験により、マトリックス溶液の組成を最適化した結果、アセトニトリルと水の体積比を７：３と８：２とした条件の両方で、チップ中の流路に沿って滴下した場合のアポミオグロビンの信号検出強度のばらつきがほぼ±３０％以下になる結果を得た。また、チップ中の流路で等電点分離したタンパク質のパターンを乱すことなく検出できることも確認した。

図３は、流路０．５ｍｍ単位で質量分析スペクトルを取り、並べたグラフである。横軸は分子量を示し、縦軸は信号強度を示す。
等電点電気泳動により、予めチップ中の流路内で分離されたトリプシンインヒビター（Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）とカルボニックアンヒドラーセＩＩ（Ｃａｒｂｏｎｉｃ Ａｎｈｙｄｏｒａｓｅ ＩＩ）、クレアチンフォスフォキナーゼ（Ｃｒｅａｔｉｎ Ｐｈｏｓｐｈｏｋｉｎａｓｅ）が特に流路中を広がらずに検出されていることがわかる。

以上、記したとおり、マトリックスとして多用されるシナピン酸溶液の濃度を必要十分な濃度に維持しながら、小口径ノズルを通して滴下する際においても、ノズルが詰まりにくいマトリックス溶液が提供される。

なお、本実施例においては、ディスペンサを用いて実験を行った結果を示したが、ディスペンサに限られるものではなく、小口径ノズルを使用したマトリックス溶液添加技術に一般的に適用できることはその構成上言うまでもない。

以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。

この出願は、２００７年２月２８日に出願された日本出願特願２００７−５０４２９を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。

Claims (4)

1. 小口径ノズルを通して吐出させるマトリックス溶液であって、
   アセトニトリル及び水からなる混合液を主たる溶媒成分とし、
   前記アセトニトリルと前記水との体積比が、アセトニトリル６．５に対して水３．５の割合からアセトニトリル８に対して水２の割合の範囲にあり、
   マトリックスとしてシナピン酸を含むことを特徴とするマトリックス溶液。
2. 請求項１に記載のマトリックス溶液において、
   前記体積比が、アセトニトリル７に対して水３の割合からアセトニトリル８に対して水２の割合の範囲にあることを特徴とするマトリックス溶液。
3. 請求項１又は２に記載のマトリックス溶液において、
   前記シナピン酸の濃度が４．４８ｍｇ／ｍＬ以上１１．２ｍｇ／ｍＬ以下であることを特徴とするマトリックス溶液。
4. 請求項１乃至３いずれかに記載のマトリックス溶液において、
   前記小口径ノズルの内径が０．１８ｍｍ以下であることを特徴とするマトリックス溶液。

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