KR20120090473A - 말디 이미징용 매트릭스 용액 및 이를 이용한 생체 분자의 말디 이미징의 측정 방법 - Google Patents

말디 이미징용 매트릭스 용액 및 이를 이용한 생체 분자의 말디 이미징의 측정 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20120090473A
KR20120090473A KR1020110010922A KR20110010922A KR20120090473A KR 20120090473 A KR20120090473 A KR 20120090473A KR 1020110010922 A KR1020110010922 A KR 1020110010922A KR 20110010922 A KR20110010922 A KR 20110010922A KR 20120090473 A KR20120090473 A KR 20120090473A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
maldi
matrix solution
matrix
weight
tissue section
Prior art date
Application number
KR1020110010922A
Other languages
English (en)
Inventor
김양선
Original Assignee
주식회사 아스타
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 아스타 filed Critical 주식회사 아스타
Priority to KR1020110010922A priority Critical patent/KR20120090473A/ko
Priority to PCT/KR2011/010356 priority patent/WO2012108624A2/ko
Publication of KR20120090473A publication Critical patent/KR20120090473A/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
    • G01N27/622—Ion mobility spectrometry
    • G01N27/623—Ion mobility spectrometry combined with mass spectrometry
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D59/00—Separation of different isotopes of the same chemical element
    • B01D59/44—Separation by mass spectrography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G01N33/6851—Methods of protein analysis involving laser desorption ionisation mass spectrometry
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/0004—Imaging particle spectrometry
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/02—Details
    • H01J49/04—Arrangements for introducing or extracting samples to be analysed, e.g. vacuum locks; Arrangements for external adjustment of electron- or ion-optical components
    • H01J49/0409—Sample holders or containers
    • H01J49/0418—Sample holders or containers for laser desorption, e.g. matrix-assisted laser desorption/ionisation [MALDI] plates or surface enhanced laser desorption/ionisation [SELDI] plates
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/26—Mass spectrometers or separator tubes

Abstract

본 발명은 말디 이미징용 매트릭스 용액 및 이를 이용한 생체 분자의 말디 이미징의 측정 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 매트릭스 용액은 분석하고자 하는 생체 조직 절편에 존재하는 특정 생체 분자를 용이하게 추출하여 그 생체 분자의 분포와 밀도를 색채감 있는 영상으로 이미지화할 수 있어 생체 분자의 질량을 매우 정확하게 측정할 수 있다.

Description

말디 이미징용 매트릭스 용액 및 이를 이용한 생체 분자의 말디 이미징의 측정 방법{Matrix solution for MALDI imaging and method for measuring MALDI imaging of biomolecule using the same}
본 발명은 말디 이미징용 매트릭스 용액 및 이를 이용한 생체 분자의 말디 이미징의 측정 방법에 관한 것이다.
일반적인 질량분석법(mass spectrometry)은 분석하고자 하는 시료를 이온화시켜 생성된 양이온들이 진공 챔버 내에서 휘어져 이동하도록 할 때 질량과 하전량과의 비에 따라 분리시킴으로써, 본래의 물질 및 이들의 파편들이 이동거리에 따른 시간과 그의 세기(intensity), 즉 질량 스펙트럼의 형태로 나타나도록 하여 스펙트럼을 해석하여 미지 분자의 질량 및 그 구조를 확인하는 방법이다.
질량분석에서 이온화 방법들로는 EI(electron ionization), PI (photoionization), ESI(electrospray ionization) & TSI(thermospray ionization), FI(field ionization), FAB(fast atom bombardment), MALDI(matrix-assisted laser desorion/ionization) 등이 있다.
전자 이온화(EI)는 필라멘트 등의 열이온 방출(thermionic emission)에 의해 방출되는 열전자를 이용한 이온화로서, 이용하기가 매우 간단하고 용이하나 비선택적 이온화 과정에서 단편화되는 경향이 강하다.
광 이온화(PI)는 램프나 레이저 등에서 나오는 빛을 이용한 이온화로서, 선택적으로 들뜬 상태에 대한 정보를 필요로 하며, 많은 장비가 필요하나 단편화가 심하지 않고 다양한 변형이 가능하다.
전기분무 이온화(ESI) & 열분무 이온화(TSI)는 응축상 시료에 대한 전기장 또는 열을 이용한 분무방식의 기화/이온화(vaporization/ionization)로서, 다가 이온(multiply charged ion)이 생성되며, 단편화가 심하지 않고 액체 등의 시료에 매우 적합하다.
화학 이온화(CI)는 이온/분자간 화학반응에 의한 이온화로서, 전자 이온화 (EI) 다음으로 널리 사용되며, 양이온뿐만 아니라 음이온도 생성된다.
장 이온화(FI)는 양자역학적 전자 터널에 의한 이온화로서, 거의 단편화가 없으며, 감도가 매우 낮다.
고속 원자 충격(FAB) 이온화는 전하교환을 통해 얻어진 고속 원자를 액체/고체 시료에 충돌시켜 일어나는 분자의 방출/이온화로서, 비휘발성 물질 및 쉽게 분해되는 분자들의 질량 분석에 적합하다.
말디 이온화(MALDI)는 매트릭스 용액에 레이저를 조사할 때 일어나는 탈착/이온화로서, 휘발성이 작거나 잘 녹지 않는 시료에 적합하며, 단편화가 적다.
상기 열거한 이온화 방법들 중 최근에 가장 많이 사용되고 있는 이온화 방법은 말디 이온화 방법이다. 말디 이온화 방법을 이용하면 이미징 질량분석이 가능하게 되며, 이러한 방법을 말디 이미징 질량분석(matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging; MALDI imaging) 이라고 하는데, 1999년 Richard M. Caprioli에 의해서 개발되었다.
말디 질량분석법은 기체상의 이온으로 생성하기 어려웠던 단백질 등과 같은 생체 고분자 물질(biopolymer)을 매트릭스 물질과 함께 혼합하여 용해시킨 후 시료 플레이트에 적하하고 건조시키면, 상기 매트릭스 물질은 분석대상물과 함께 결정 (crystal)으로 플레이트에 남게 된다. 이렇게 준비된 시료 플레이트에 레이저를 조사하여 고분자 물질들의 깨어짐이 최대한 억제된 어미이온(parent ion) 상태로 이온을 생성시킨 후 이온화된 물질의 질량을 분석하면, 단백질, 펩타이드, DNA 등의 생체 분자에 대해 매우 정확한 분자량 측정이 가능하다. 상기 매트릭스 물질은 UV 레이저에 의해 쉽게 여기(excitation) 되는 구조를 갖는 유기화합물을 일컫으며, 유기화합물을 잘 용해시키면서 분석하고자 하는 대상 시료도 잘 녹일 수 있도록 하기 위해 두 종류 이상의 혼합용매를 사용하는 경우가 대부분이다.
말디 이미징은 분석하고자 하는 시료의 표면, 즉 세포/조직 등의 표면에 매트릭스를 도포하여 말디 이온화 방법을 적용하고 작은 크기로 잘 집광된 말디 레이저를 시료 표면에 스캔함으로써, 해상도가 높은 질량 분석 이미지를 얻는 것이다. 레이저 형광 혹은 공초점 현미경과 같은 광학적인 영상이나, bio-SEM/TEM 및 MRI 등의 기타 영상들은 컨트라스트에 주로 의존하는 반면, 말디 이미징은 생체 조직에서 직접적으로 이온화된 생체 분자, 즉 단백질, 펩타이드, 지질, 소분자(small molecules)에 대한 질량분석 정보를 포함하는 화학 맵핑(chemical mapping)을 표지 물질을 사용하지 않고, 기존의 시간 소모가 많고 지루한 반복적인 과정인 분리와 추출 과정을 사용하지 않으며, 실제 세포나 조직 사이에서 생체 분자의 분포 및 이동 등에 관한 정보를 제공하는 분석방법이다.
일반적인 말디 이미징 질량분석에서는 전도성이 우수한 스태인레스 스틸 (stainless steel; SUS)의 시료 플레이트가 주로 사용되나, 생체 조직 내에서 분석하고자 하는 단백질이나 또는 지질 등에 대한 말디 이미징 질량분석에 사용되는 시료 플레이트는 광학적인 관찰이 가능한 빛의 투과성이 높고, 전기학상 전도성이 있는 표면을 갖는 ITO(indium-tin-oxide) 슬라이드 글라스가 주로 사용된다. 즉, 전도성 물질인 ITO가 도포된 유리표면에 분석하고자 하는 조직 절편(tissue section)을 올려 놓고 생체 조직 내의 특정 생체 분자의 질량을 분석한다.
한편, 분석하고자 하는 조직 절편 그 자체는 대부분 유기용매에 불용성이므로, 분석하고자 하는 대상 물질만을 용해하고 추출하여 생체 조직 표면 위로 떠오르게 하여 매트릭스 물질과 고르게 혼합되도록 하는 용매를 선택한다. 이렇게 선택된 용매 또는 혼합용매에 매트릭스 물질을 녹여 혼합용액을 만들고, 이 매트릭스 용액을 조직 절단면 위에 고르게 그리고 얇게 뿌려서 조직 절편 표면에 매트릭스 물질이 추출 이동된 분석대상 물질과 혼합된 결정층이 형성되도록 하는 과정이 필요하다.
실제로, 분석하고자 하는 조직 절편에 따라 어떤 매트릭스 물질을 선택하고, 이를 어떤 용매에 얼마만큼의 농도로 용해시켜 매트릭스 용액을 만들고, 이것을 어떤 방법으로 시료가 올려진 슬라이드 글라스 위에 균일하게 꼭 필요한 면적만큼 시료를 충분히 덮을 정도의 적절한 양의 매트릭스 용액을 분사하여 매트릭스층을 형성하는 것이 분석가치가 있는 말디 이미징 질량분석을 얻는데 매우 중요한 변수가 될 수 있다.
따라서, 분석하고자 하는 생체 조직 내에 존재하는 특정 분자의 분포와 밀도를 색채감 있는 영상으로 말디 이미징 영상을 얻기 위하여, 생체 조직 내에 있는 단백질 등의 분석대상 물질을 잘 추출해 내어 표면에 적하된 매트릭스 물질과 잘 혼합되도록 한 후 휘발하면서 분석대상 물질과 매트릭스 물질의 공-결정(co-crystal) 구조를 이루도록 하는 용매, 또는 혼합 용매의 개발의 필요성이 절실히 요구되고 있다.
본 발명자들은 생체 조직 내에 존재하는 특정 단백질 등의 분석대상 물질을 잘 추출해 낼 수 있는 매트릭스 용액에 대하여 연구하던 중, 특정 함량의 아세토니트릴(ACN), 트리플루오로아세트산(TFA), 디메틸설폭시드(DMSO), 및 잔량의 이온 정제수를 포함하는 혼합용매에 시나핀산을 특정 농도로 함유하는 매트릭스 용액을 제조하였으며, 상기 매트릭스 용액이 분석하고자 하는 생체 조직 절편에 존재하는 특정 생체 분자를 용이하게 추출하여 추출된 특정 생체 분자와 매트릭스 물질이 공-결정을 형성하여 말디 이미징 측정을 용이하게 함으로써 특정 생체 분자의 분포와 밀도를 색채감 있는 영상으로 이미지화할 수 있어 특정 생체 분자의 질량을 매우 정확하게 측정할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 말디 이미징용 매트릭스 용액 및 이를 이용한 생체 분자의 말디 이미징의 측정 방법을 제공하고자 한다.
도 1은 마우스의 뇌세포 조직 절편에 비교예 1~2에서 제조한 매트릭스 용액을 분사한 후 뇌세포 조직 절편을 광학현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 마우스의 뇌세포 조직 절편에 비교예 3에서 제조한 매트릭스 용액을 분사한 후 뇌세포 조직 절편을 광학현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 마우스의 뇌세포 조직 절편에 실시예 1에서 제조한 매트릭스 용액을 분사한 후 뇌세포 조직 절편을 광학현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 비교예 3 및 실시예 1에서 제조한 매트릭스 용액을 이용하여 얻은 뇌세포 조직 절편의 말디-토프 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 5는 도 4에서 얻은 비교예 3의 말디-토프 스펙트럼을 기초로 하여 특정 위치의 분자량을 갖는 분자의 분포와 세기를 나타낸 말디 이미징 영상을 나타낸 도이다.
도 6은 도 4에서 얻은 실시예 1의 말디-토프 스펙트럼을 기초로 하여 특정 위치의 분자량을 갖는 분자의 분포와 세기를 나타낸 말디 이미징 영상을 나타낸 도이다.
본 발명은 아세토니트릴(ACN) 70~90 중량%, 트리플루오로아세트산(TFA) 0.1~0.5 중량%, 디메틸설폭시드(DMSO) 0.1~5.0 중량%, 및 잔량의 이온 정제수를 포함하는 혼합용매에 시나핀산(sinapinic acid; 3,5-dimethoxy-4-hydroxy cinnamic acid)을 0.1~6.0㎎/㎖의 농도로 함유하는 매트릭스 용액을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 생체 조직 절편을 전도성 투명 유리판 위에 올려 놓고, 유리판을 슬라이드 홀더에 끼워 넣어 고정하는 단계,
2) 상기 고정된 유리판 위에 투명 격자 템플레이트를 올려 놓아 눈금대조법으로 분사하고자 하는 생체 조직 절편의 위치와 분사 영역을 결정하는 단계,
3) 상기 분사 영역에 상기 매트릭스 용액을 분사하고 건조하는 단계, 및
4) 상기 매트릭스 결정층이 형성된 생체 조직 절편의 표면을 말디 이미징 측정하여 말디-토프 스펙트럼(MALDI-TOF spectrum)과 말디 이미징(MALDI imaging) 영상을 얻는 단계를 포함하는, 매트릭스 용액을 이용한 생체 분자의 말디 이미징의 측정 방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 매트릭스 용액은 아세토니트릴(ACN) 70~90 중량%, 트리플루오로아세트산(TFA) 0.1~0.5 중량%, 디메틸설폭시드(DMSO) 0.1~5.0 중량%, 및 잔량의 이온 정제수를 포함하는 혼합용매에 시나핀산(sinapinic acid; 3,5-dimethoxy-4-hydroxy cinnamic acid)을 0.1~6.0㎎/㎖의 농도로 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 매트릭스 용액을 이용한 생체 분자의 말디 이미징의 측정 방법을 단계별로 상세히 설명한다. 상기 방법은 노트북 컴퓨터와 매트릭스 스포터 (matrix spotter)로 이루어진 아스타 시스템(ASTA SYSTEM, (주) 아스타)을 이용한다.
상기 1)단계는 생체 조직 절편을 전도성 투명 유리판 위에 올려 놓고 유리판을 슬라이드 홀더에 끼워 넣어 고정하는 단계이다. 먼저, 생체 조직을 적출한 후 이온 정제수로 세척하고 진공 건조한다. 건조된 생체 조직을 70% 에탄올 용액으로 세척하고 진공 건조한 다음, 건조된 생체 조직을 다시 95% 에탄올 용액으로 세척하고 진공 건조한다. 건조된 생체 조직을 1~20㎛ 두께로 자른 후, 생체 조직 절편을 ITO 유리판 위에 올려 놓고 유리판을 슬라이드 홀더에 끼워 넣어 고정시킨다.
상기 2)단계는 분사하고자 하는 생체 조직 절편의 위치와 분사 영역을 결정하는 단계로, 생체 조직 절편이 고정된 유리판 위에 투명 격자 템플레이트 (template)를 올려 놓아 눈금대조법으로 분사하고자 하는 생체 조직 절편이 어느 위치에 있고, 분사 영역이 어느 영역인지를 파악한다. 즉, 컴퓨터에 미리 설치한 소프트웨어를 구동하면 컴퓨터 화면에 유리판이 고정된 슬라이드 홀더와 같은 크기의 화면이 제공된다. 이때, 소프트웨어를 이용하여 슬라이드 글라스에 분사 영역을 원형, 타원형, 사각형으로 지정하되, 원하는 매트릭스 용액에 따라 색상을 검정, 빨강, 파랑 등으로 변경하여 지정할 수 있다. 소프트웨어를 이용하여 생체 조직 절편에 분사할 영역을 원하는 매트릭스 용액으로 지정하여 컴퓨터 화면에 구현한 것은 하기에 그림으로 나타내었다. 하기 그림에서 3가지 다른 색상(검정, 빨강, 파랑)은 생체 조직 절편을 각기 다른 매트릭스 용액으로 도포한 것을 표시한 것이고, 그 주위를 둘러싼 황색의 원형, 타원형, 사각형들은 매트릭스 용액의 분사 영역을 가리키는 것이다. 이러한 투명 격자 템플레이트를 사용함으로써, 분사 영역의 지정을 용이하게 할 수 있고 매트릭스 용액의 불필요한 손실을 막을 수 있다.
Figure pat00001
상기 3)단계는 분사 영역에 본 발명의 매트릭스 용액을 분사하고 건조하는 단계로, 잉크젯 프린터와 같은 원리로 분사 영역에 상기 매트릭스 용액을 분사하여 균일한 매트릭스 결정층을 형성한다. 이때, 매트릭스 용액을 생체 조직 절편 위에 여러번 도포시킬 수 있다. 그 다음, 매트릭스 결정층이 형성된 생체 조직 절편을 건조시킨다. 이때, 생체 조직 절편의 건조상태에 따라 필요한 경우 열 발생 램프의 세기(H1<H2<H3<H4 순서로 램프의 강도 증가)를 조절하거나 핫 플레이트를 가동하여 생체 조직 절편에 분사된 매트릭스 용액을 건조시켜 생체 조직 절편 위에 형성된 매트릭스 결정이 최적의 결정 형상을 갖도록 한다. 상기 핫 플레이트는 유리판이 고정된 슬라이드 홀더 바로 아래에 접촉되어 있어, 핫 플레이트에서 열선으로 접속되어 열을 복사 발산하여 슬라이드 홀더를 가열하고 그 열로 유리판이 가열됨으로 분사된 매트릭스 용액이 균일하게 휘발하여 매트릭스가 결정화되는 것이다.
또한, 매트릭스 결정화는 얇은 막을 여러 번 분사하듯이 반복해서 분사하여야 용매가 증발하면서 균일하게 이루어지므로, 자동 반복 분사 횟수가 중요하다. 따라서, 본 발명에서는 생체 조직 절편의 표면에 충분한 양의 매트릭스 결정층이 형성되도록 분사 횟수를 설정한다. 이때, 분사 횟수는 120~200회 정도가 바람직하나, 원하는 만큼의 분사 횟수를 임의로 지정하는 것도 가능하다.
본 발명에 사용된 매트릭스 스포터는 첫 번째 분사와 다음 번 분사와의 간격을 지정하는 것이 가능하도록 설계되어 있다. 따라서, 총 분사 간격(interval)을 초(second) 단위로 최소 60초에서 600초까지 건조시간을 선택하여 프로그램에 입력하면, 매트릭스 스포터가 이 수치를 기억하고, 1회 분사 후 다음 분사까지 남는 시간을 쉬었다가 다음 분사를 시작하도록 작동하게 함으로써 매트릭스의 결정화를 조절해 준다.
상기 4)단계는 매트릭스 결정층이 형성된 생체 조직 절편의 말디 이미징을 측정하여 말디-토프 스펙트럼(MALDI-TOF spectrum)과 말디 이미징(MALDI imaging) 영상을 얻는 단계이다.
상기 얻어진 생체 조직 절편의 말디 이미징 영상을 살펴보면, 생체 조직 절편 표면에 본 발명의 매트릭스 용액을 분사한 경우 매트릭스 결정층이 균일하게 얻어지며, 다양한 단백질이 분석되고, 생체 조직 절편의 말디-토프 스펙트럼에서 특정 분자량(즉, 7766Da)의 세기가 매우 높게 나타난다. 즉, 생체 조직 절편의 말디 이미징 영상에서 붉은색이 훨씬 밝고 선명하게 넓은 범위에 걸쳐 보임으로써, 분자량 7766Da의 분자 분포가 보다 효과적으로 이미지화되어 나타난다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 매트릭스 용액은 분석하고자 하는 생체 조직 절편에 존재하는 특정 생체 분자를 용이하게 추출하여 그 생체 분자의 분포와 밀도를 색채감 있는 영상으로 이미지화할 수 있어 생체 분자의 질량을 매우 정확하게 측정할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 및 비교예 1~3 : 말디 이미지용 매트릭스 용액
아세토니트릴(ACN), 트리플루오로아세트산(TFA), 디메틸설폭시드(DMSO), 및 이온 정제수를 혼합하여 혼합용매를 제조하였다. 상기 혼합용매에 시나핀산 (sinapinic acid; 3,5-dimethoxy-4-hydroxy cinnamic acid)을 가하여 매트릭스 용액을 제조하였다.
실시예 1 및 비교예 1~3의 매트릭스 용액의 조성과 조성비는 표 1에 나타내었다.
실시예 1 비교예 1 비교예 2 비교예 3
혼합
용매

 아세토니트릴
(ACN)		 80 중량% 80 중량% 80 중량% 80 중량%
트리플루오로아세트산
(TFA)		 0.2 중량% - - 0.2 중량%
디메틸설폭시드
(DMSO)		 1 중량% - 1 중량% -
이온 정제수 잔량(to 100 중량%) 잔량(to 100 중량%) 잔량(to 100 중량%) 잔량(to 100 중량%)
매트릭스 시나핀산(SA) 5㎎/㎖ 5㎎/㎖ 5㎎/㎖ 5㎎/㎖
실험예 1 : 말디 이미징 분석
마우스의 뇌세포 조직을 적출한 후, 4℃ 이온 정제수에서 10분 동안 세척하고 5분 동안 진공 건조하였다. 건조된 뇌세포 조직을 70% 에탄올 용액에서 50초 동안 세척하고 5분 동안 진공 건조하였다. 건조된 뇌세포 조직을 다시 95% 에탄올 용액에서 20초 동안 세척하고 5분 동안 진공 건조하였다. 건조된 마우스의 뇌세포 조직을 6㎛ 두께로 자른 후, 뇌세포 조직 절편을 ITO 유리판 위에 올려 놓았다. 그 다음, 유리판을 슬라이드 홀더에 끼워 넣어 고정시킨 다음, 그 위에 투명 격자 템플레이트를 올려 놓아 눈금대조법으로 분사하고자 하는 뇌세포 조직 절편이 어느 위치에 있고, 분사 영역이 어느 영역인지를 파악하였다. 컴퓨터 화면 상에 소프트웨어를 가동하여 슬라이드 글라스와 같은 모양의 홀더를 선택하여 화면에 보이도록 하였다. 소프트웨어를 이용하여 슬라이드 글라스에 분사 영역을 원, 타원, 사각형을 이용하여 결정하였다. 정해진 위치에 홀더와 슬라이드 글라스가 놓여져 있는가를 확인하고 상기 실시예 1 및 비교예 1~3에서 제조한 매트릭스 용액 0.5㎕를 분사하였다. 뇌세포 조직 절편의 건조상태에 따라 필요한 경우 열 발생 램프의 세기(H1→H2→H3→H4)를 조절하거나 핫 플레이트를 가동하여 뇌세포 조직 절편에 분사된 매트릭스 용액을 건조하였다. 뇌세포 조직 절편의 표면에 충분한 양의 매트릭스층이 형성되도록 분사 횟수를 설정하였다(120회, 200회). 그 다음, Bruker사의 Ultraflex3 장비를 사용하여 하기와 같은 조건으로 뇌세포 조직 절편의 말디 이미징을 측정하여 말디-토프 스펙트럼(MALDI-TOF spectrum)을 얻었다. 또한, 상기 얻어진 말디-토프 스펙트럼을 기초로 하여 특정 위치의 분자량을 갖는 분자의 분포와 세기를 나타낸 말디 이미징(MALDI imaging) 영상을 얻었다.
<말디 이미징 실험 조건>
Lp_12kDa mix_Protein Imaging ha20100129 38x, 3000~20,000Da, 5_ularge, 15%/62%, Matrix Gating Low, 500 Shots, Laser: 86% ~, Diameter: 200㎛
마우스의 뇌세포 조직 절편에 비교예 1~3 및 실시예 1에서 제조한 매트릭스 용액을 분사한 후 뇌세포 조직 절편을 광학현미경으로 관찰한 결과는 도 1 내지 도 3에 나타내었다. 또한, 비교예 3 및 실시예 1에서 제조한 매트릭스 용액을 이용하여 얻은 뇌세포 조직 절편의 말디-토프 스펙트럼은 도 4에 나타내었으며, 상기 말디-토프 스펙트럼을 기초로 하여 특정 위치의 분자량을 갖는 분자의 분포와 세기를 나타낸 말디 이미징 영상은 각각 도 5 및 도 6에 나타내었다.
도 1 내지 도 3에 나타난 바와 같이, 마우스의 뇌세포 조직 절편에 비교예 1~3의 매트릭스 용액을 분사한 경우 결정층이 균일하지 않게 형성되었으나, 마우스의 뇌세포 조직 절편에 실시예 1의 매트릭스 용액을 분사한 경우 결정층이 균일하게 얻어졌으며, 분사 횟수가 증가할수록 결정층이 더 두꺼워졌다. 200회 분사하였을 경우, 주름진 것 같은 현상은 매트릭스 용액이 충분히 건조되지 않아서 생기는 것으로, 분사 후 완전 건조하여 분석한 결과 특별한 영향은 주지 않았다.
또한 도 4에 나타난 바와 같이, 비교예 3의 매트릭스 용액을 이용하여 얻은 마우스의 뇌세포 조직 절편의 말디-토프 스펙트럼에서 분자량 7766Da의 세기는 약 400 a.u.로서 매우 낮았으며, 실시예 1의 매트릭스 용액을 이용하여 얻은 마우스의 뇌세포 조직 절편의 말디-토프 스펙트럼에서 분자량 7767Da의 세기는 약 2000 a.u.로 매우 높게 나타났다. 따라서, 본 발명의 매트릭스 용액을 이용하여 얻은 마우스의 뇌세포 조직 절편에서 단백질 피크가 더 많이 검출됨을 확인하였다.
또한 도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, 비교예 3 및 실시예 1의 매트릭스 용액을 이용하여 얻은 마우스의 뇌세포 조직 절편의 말디 이미징 영상에서 다양한 단백질이 분석되었고, 이들 중 7766Da의 분자량을 갖는 단백질에 대한 분포를 이미지로 얻을 수 있었다. 구체적으로는, 비교예 3의 매트릭스 용액보다 실시예 1의 매트릭스 용액을 이용하여 얻은 마우스의 뇌세포 조직 절편의 말디 이미징 영상에서 붉은색이 훨씬 밝고 선명하게 넓은 범위에 걸쳐 보였다. 즉, 분자량 7766Da의 분자 분포가 보다 효과적으로 이미지화되어 나타남을 볼 수 있었다.
본 발명에 따른 매트릭스 용액은 분석하고자 하는 생체 조직 절편에 존재하는 특정 생체 분자를 용이하게 추출하여 그 생체 분자의 분포와 밀도를 색채감 있는 영상으로 이미지화할 수 있어 생체 분자의 질량을 매우 정확하게 측정할 수 있다

Claims (4)

  1. 아세토니트릴(ACN) 70~90 중량%, 트리플루오로아세트산(TFA) 0.1~0.5 중량%, 디메틸설폭시드(DMSO) 0.1~5.0 중량%, 및 잔량의 이온 정제수를 포함하는 혼합용매에 시나핀산(sinapinic acid; 3,5-dimethoxy-4-hydroxy cinnamic acid)을 0.1~6.0㎎/㎖의 농도로 함유하는 매트릭스 용액.
  2. 제 1항에 있어서, 아세토니트릴(ACN) 80 중량%, 트리플루오로아세트산(TFA) 0.2 중량%, 디메틸설폭시드(DMSO) 1.0 중량%, 및 잔량의 이온 정제수를 포함하는 혼합용매에 시나핀산을 5.0㎎/㎖의 농도로 함유하는 매트릭스 용액.
  3. 1) 생체 조직 절편을 전도성 투명 유리판 위에 올려 놓고, 유리판을 슬라이드 홀더에 끼워 넣어 고정하는 단계,
    2) 상기 고정된 유리판 위에 투명 격자 템플레이트를 올려 놓아 눈금대조법으로 분사하고자 하는 생체 조직 절편의 위치와 분사 영역을 결정하는 단계,
    3) 상기 분사 영역에 제 1항의 매트릭스 용액을 분사하고 건조하는 단계, 및
    4) 상기 매트릭스 결정층이 형성된 생체 조직 절편의 표면을 말디 이미징 측정하여 말디-토프 스펙트럼(MALDI-TOF spectrum)과 말디 이미징(MALDI imaging) 영상을 얻는 단계를 포함하는, 매트릭스 용액을 이용한 생체 분자의 말디 이미징의 측정 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 3)단계에서 분사 횟수는 120~200회인 것을 특징으로 하는 매트릭스 용액을 이용한 생체 분자의 말디 이미징의 측정 방법.
KR1020110010922A 2011-02-08 2011-02-08 말디 이미징용 매트릭스 용액 및 이를 이용한 생체 분자의 말디 이미징의 측정 방법 KR20120090473A (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110010922A KR20120090473A (ko) 2011-02-08 2011-02-08 말디 이미징용 매트릭스 용액 및 이를 이용한 생체 분자의 말디 이미징의 측정 방법
PCT/KR2011/010356 WO2012108624A2 (ko) 2011-02-08 2011-12-30 말디 이미징용 매트릭스 용액 및 이를 이용한 생체 분자의 말디 이미징의 측정 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110010922A KR20120090473A (ko) 2011-02-08 2011-02-08 말디 이미징용 매트릭스 용액 및 이를 이용한 생체 분자의 말디 이미징의 측정 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20120090473A true KR20120090473A (ko) 2012-08-17

Family

ID=46639015

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020110010922A KR20120090473A (ko) 2011-02-08 2011-02-08 말디 이미징용 매트릭스 용액 및 이를 이용한 생체 분자의 말디 이미징의 측정 방법

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR20120090473A (ko)
WO (1) WO2012108624A2 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190054918A (ko) * 2017-11-13 2019-05-22 주식회사 아스타 말디토프 질량 스펙트럼 분석을 위한 시료 전처리 장치 및 그 동작 방법

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE217028T1 (de) * 1997-12-05 2002-05-15 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur identifikation von nucleinsäuren durch matrix-assistierte laser desorptions/ionisations massenspektrometrie
WO2003040715A1 (en) * 2001-11-05 2003-05-15 Irm, Llc. Sample preparation methods for maldi mass spectrometry
DE10238069A1 (de) * 2002-08-19 2004-03-04 N.V. Nutricia MALDI-Matrix
JPWO2008105142A1 (ja) * 2007-02-28 2010-06-03 日本電気株式会社 マトリックス溶液
EP2317323A1 (en) * 2009-10-29 2011-05-04 Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) MALDI Mass Spectrometry (MALDI-MS) for proteins of high molecular weight

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190054918A (ko) * 2017-11-13 2019-05-22 주식회사 아스타 말디토프 질량 스펙트럼 분석을 위한 시료 전처리 장치 및 그 동작 방법

Also Published As

Publication number Publication date
WO2012108624A2 (ko) 2012-08-16
WO2012108624A3 (ko) 2012-10-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Guenther et al. AP-MALDI imaging of neuropeptides in mouse pituitary gland with 5 μm spatial resolution and high mass accuracy
Todd et al. Organic ion imaging of biological tissue with secondary ion mass spectrometry and matrix‐assisted laser desorption/ionization
Wu et al. Mass spectrometry imaging under ambient conditions
Harada et al. Visualization of volatile substances in different organelles with an atmospheric-pressure mass microscope
US7335897B2 (en) Method and system for desorption electrospray ionization
Chen et al. Ambient imaging mass spectrometry by electrospray ionization using solid needle as sampling probe
Yao Characterization of proteins by ambient mass spectrometry
Kiss et al. Top‐down mass spectrometry imaging of intact proteins by laser ablation ESI FT‐ICR MS
Bodzon‐Kulakowska et al. Desorption electrospray ionisation (DESI) for beginners–how to adjust settings for tissue imaging
Wang et al. N-Alkylpyridinium isotope quaternization for matrix-assisted laser desorption/ionization Fourier transform mass spectrometric analysis of cholesterol and fatty alcohols in human hair
Chen et al. A high resolution atmospheric pressure matrix-assisted laser desorption/ionization-quadrupole-orbitrap MS platform enables in situ analysis of biomolecules by multi-mode ionization and acquisition
Tsuyama et al. Mass spectrometry for cellular and tissue analyses in a very small region
GB2387653A (en) Mass spectroscopy analysis of protein mixtures
Schröter et al. The combination of 2, 5-dihydroxybenzoic acid and 2, 5-dihydroxyacetophenone matrices for unequivocal assignment of phosphatidylethanolamine species in complex mixtures
Zubair et al. Trypsin and MALDI matrix pre‐coated targets simplify sample preparation for mapping proteomic distributions within biological tissues by imaging mass spectrometry
Chen et al. Matrix-assisted ionization vacuum for protein detection, fragmentation and PTM analysis on a high resolution linear ion trap-orbitrap platform
Lee et al. Toward understanding the ionization mechanism of matrix‐assisted ionization using mass spectrometry experiment and theory
Kratochvíl et al. Gas aggregated Ag nanoparticles as the inorganic matrix for laser desorption/ionization mass spectrometry
TWI243901B (en) Analysis method of macromolecule using laser ablation and system of the same
Martins et al. Orbitrap mass spectrometry: Evolution and Applicability
Lanekoff et al. Quantitative mass spectrometry imaging of molecules in biological systems
Trimpin et al. An overview of biological applications and fundamentals of new inlet and vacuum ionization technologies
Guo et al. Development of mass spectrometry imaging techniques and its latest applications
Warren et al. Investigation of colloidal graphite as a matrix for matrix‐assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry of low molecular weight analytes
JP3548769B2 (ja) 微細で均一な結晶を形成するためのカーボン製支持板及びその応用

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application