ES2343304T3 - Produccion de la forma lipidada de las lipoproteinas asociadas a peptidoglicano de bacterias gram-negativas. - Google Patents
Produccion de la forma lipidada de las lipoproteinas asociadas a peptidoglicano de bacterias gram-negativas. Download PDFInfo
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Abstract
Un plásmido que contiene un promotor estrechamente regulado, en el que dicho promotor está unido operativamente a una secuencia de ADN aislada y purificada que codifica una lipoproteína asociada a un peptidoglicano (LAP) de bacterias gram-negativas, en el que el promotor es un promotor inducible por arabinosa o un promotor T7.
Description
Producción de la forma lipidada de las
lipoproteínas asociadas a peptidoglicano de bacterias
gram-negativas.
La presente invención se refiere a la expresión
de la forma lipidada de la proteína asociada a peptidoglicano de
bacterias gram-negativas y al uso de esta proteína
lipidada recombinante en composiciones antigénicas.
Las paredes celulares de las bacterias
gram-negativas contienen restos reticulados
conocidos como peptidoglicanos. Diversas bacterias
gram-negativas producen proteínas que están unidas
covalentemente a los peptidoglicanos. Dicha proteína se denomina
lipoproteína asociada a peptidoglicano (LAP). Las LAP están
presentes como parte del locus tol en diversas bacterias
gram-negativas,, incluyendo Legionella
pneumophila (entrada a bibliografía 1), Escherichia coli
(2), Haemophilus ducreyi (3), Campylobacter jejuni
(4), Pseudomonas putida (5), Brucella abortus (6),
Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella aerogenes, Serratia
marcescens, Proteus vulgaris, Salmonella typhimurium (7)
Actinobacillus pleuropneumoniae (8), Helicobacter
pylori (9) Chlamydia pneumonia (10), y Chlamydia
trachomatis (11).
Otra bacteria que contiene LAP es la bacteria
Haemophilus influenzae (H. influenzae). La bacteria
H. influenzae se divide en dos grupos. Las cepas que poseen
una cápsula conocida se tipifican en función de la reacción
serológica de la cápsula con el antisuero de referencia. Se han
identificado los tipos a-f. Las cepas que no
reaccionan con ninguno de los antisueros de referencia se conocen
como no tipificables.
H. influenzae de typo b (Hib) es la causa
mas frecuente de la meningitis neonatal y otras infecciones
invasoras en los estados Unidos (12). La mayor incidencia de
meningitis infantil se produce entre uno y cinco años de edad. El
sesenta por ciento de los casos de meningitis causadas por Hib
aparecen en niños menores de dos años de edad (12).
H. influenzae no tipificable (NTHi) es un
organismo gram-negativo que causa varias
enfermedades, incluyendo neumonía, bacteriemia, meningitis, sepsis
posparto y traqueo bronquitis febril aguda en adultos (13). Se ha
indicado que NTHi causa entre el 20 y el 40 por ciento de todos los
casos de otitis media observada en niños pequeños (14, 15, 16). Los
niños pueden experimentar infecciones múltiples del mismo organismo
puesto que la infección no confiere una inmunidad muy duradera. La
terapia actual para las apariciones crónicas o repetitivas de la
otitis media incluye la administración de antibióticos y la
inserción de tubos para drenar el oído interno. Las cepas de NTHi
también se han implicado como una causa primaria de sinusitis (17).
Adicionalmente, NTHi causa sepsis neonatal.
Las actuales composiciones antigénicas basadas
en cápsulas son ineficaces contra NTHi. Se ha observado que la
superficie de estas bacterias es antigénicamente muy variable,
siendo particularmente diversas las proteínas, P1 y P2, (18,19) de
la membrana principal externa. En seres humanos, la presencia de
anticuerpos séricos bactericidas se ha descrito para
correlacionarla con protección de otitis media causada por cepas
NTHi sensibles (20).
Los candidatos para incluir en las composiciones
antigénicas contra NTHi deben conservarse altamente al nivel de
aminoácido, tener la superficie expuesta (en particular, proteínas
externas de membrana), producir anticuerpos bactericidas y estar
presentes en todos los aislados. Investigaciones previas han
demostrado que la proteína P6 (también conocida como
PBOMP-1 e HiPAL) (21) de NTHi cumple todos estos
criterios. Se ha demostrado que las proteínas nativas purificadas
provocan anticuerpos bactericidas (22, 23, 24, 25) y se conservan
antigénicamente (22, 23, 26, 27).
La evaluación de la secuencia genética del gen
P6 ha demostrado que este está muy conservado entre los aislados de
NTHi óticos y por tanto la secuencia de la proteína también está muy
conservada. La P6 nativa es una lipoproteína, más específicamente
una LAP, que se modifica en la cisteína
amino-terminal con lípidos. Esta proteína está
presente en H. influenzae en cantidades relativamente
pequeñas (menos del 1% del total de las proteínas de la membrana
externa), haciendo muy difícil la purificación de cantidades útiles
a partir del organismo nativo. Por tanto, se necesita una versión
de P6 recombinante para el desarrollo adicional como un componente
en las composiciones antigénicas.
Varios laboratorios no podían expresar la rP6
lipidada en grandes cantidades en E. coli (28.29). Como
resultado, construcciones recombinantes iniciales que expresan P6 en
E. coli podían expresar solamente una versión no lipidada de
la proteína. Estos grupos indicaron que, aunque la proteína P6
lipidada purificada de H. influenzae era más inmunogénica
que la rP6 no lipidada purificada de E. coli, era difícil modificar
genéticamente un vector de ADN que expresase la P6 lipidada (28.29);
es decir, no mejor que los bajos niveles de la P6 nativa expresada
por H. influenzae.
Los intentos previos para expresar la rP6
lipidada se basaron en promotores que no estaban bajo estrecha
regulación transcripcional, tal como trc, taq, laca y
P_{L}-C1857. El documento WO 90/02557A desvela un
plásmido que contiene el promotor lac unido operativamente a una
secuencia aislada de ADN que codifica la proteína PBOMP01. Se
planteó la teoría de que esta transcripción algo filtrante conduce a
efectos sutiles sobre E. coli lo que contribuye a niveles bajos de
expresión de la proteína lipidada. La evidencia experimental indica
que la capacidad de la peptidasa II de señal para añadir lípidos al
extremo N de la proteína no era responsable del bajo rendimiento de
la P6 procesada (datos no demostrados).
Aunque la proteína P6 de H. influenzae
han sido un candidato primario para la inclusión en las
composiciones antigénicas contra la enfermedad de
Haemophilus (20, 23, 24, 25, 30, 31), las cantidades
relativamente pequeñas disponibles de H. influenzae han
hecho esencial la expresión recombinante de esta proteína. Los
esfuerzos previos para expresar la proteína P6 lipidada en
cantidades significativas han fracasado (28, 29). Por tanto, los
investigadores se han centrado en la expresión y purificación de
formas múltiples de la P6 no lipidada.
La respuesta del anticuerpo engendrada por la
rP6 no lipidada era biológicamente funcional, capaz de proteger a
ratas recién nacidas de la meningitis (28) y de provocar anticuerpos
bactericidas (28, 29), pero de una magnitud más baja que los
provocados por la P6 nativa no lipidada (28).
Por lo tanto, hay una necesidad de construir
sistemas de vectores de expresión célula-huésped que
expresen LAP lipidadas de bacterias gram-negativas.
En particular, hay una necesidad de construir sistemas de vectores
de expresión célula-huésped que expresen la rP6
lipidada, que se puedan después incluir en composiciones antigénicas
contra H. influenzae.
Por tanto, es un objeto de la invención
desarrollar construcciones genéticas capaces de expresar las LAP de
bacterias gram-negativas en células huéspedes
bacterianas.
Es un objeto particular de esta invención
desarrollar construcciones genéticas capaces de expresarse en E.
coli.
Otro objeto adicional de esta invención es
incluir esta rP6 lipidada en composiciones antigénicas para
administrar a un mamífero para evitar la enfermedad causada por
H. influenzae.
Estos y otros objetos de la invención como se
describe a continuación se consiguen por clonación y expresión en
células bacterianas de las formas lipidadas de las PAL mediante el
uso de promotores estrechamente regulados en los vectores de
expresión. Por consiguiente, la presente invención proporciona un
plásmido como se define en las reivindicaciones.
La invención se ejemplifica por la clonación y
expresión en células bacterianas de la forma lipidada de la
proteína P6 recombinante de H. influenzae mediante el uso de
dichos promotores en el vector de la expresión.
Específicamente, para la expresión de la P6
recombinante lipidada, se construyen plásmidos que contienen un
promotor de arabinosa inducible o un promotor T7, en el que el
promotor está unido operativamente a una secuencia aislada y
purificada de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica la
proteína P6, y en el que la secuencia de ADN, bajo control de dicho
promotor, se expresa en la forma del lipidada.
A su vez, una célula huésped bacteriana se
transforma, se transduce o se transfecta con dicho plásmido y
después se cultiva en condiciones que permitan la expresión de la
rP6 lipidada por la célula huésped.
En otra realización de esta invención, la rP6
lipidada se usa como un inmunógeno en composiciones antigénicas
contra toda H. influenzae patógena, incluyendo tanto
el tipo b como el no tipificable de H. influenzae.
Cuando está purificada, la proteína recombinante
es indicada para ser lipidada por varios criterios y, lo que es más
importante, es mucho más inmunogénica que la forma P6 no lipidada
usada anteriormente.
Se ha demostrado que la modificación lipídica de
la cisteína amino-terminal por la peptidasa II de
señal hace que estas proteínas sean más inmunogénicas que sus
formas no lipidadas (28, 29, 32). Se han evaluado estas formas con
respecto a su inmunogenicidad y su relación con la P6 lipidada.
Todas han demostrado inmunogenicidad disminuida en comparación con
la proteína nativa lipidada.
Esto permite usar dosis mucho mas bajas para
inmunizar a seres humanos y por tanto hace que la rP6 lipidada sea
una candidata comercialmente más viable para incluir en las
composiciones antigénicas. Estos títulos aumentados permiten el uso
de dosis más bajas de proteína P6 en seres humanos, lo que
proporcionaría ahorrar costes en la producción de dicha
proteína.
La proteína rP6 lipidada aislada y purificada se
usa para preparar una composición antigénica que produzca una
respuesta inmune protectora en un huésped mamífero. La composición
antigénica puede comprender adicionalmente uno o más adyuvantes,
diluyentes o portadores. Los ejemplos de dichos adyuvantes incluyen
hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, Stimulon^{TM}
QS-21, MPL^{TM}, IL-12 y la toxina
del cólera. La composición antigénica se administra a un huésped
mamífero en una cantidad inmunogénicamente eficaz para proteger al
huésped contra la enfermedad causada por H. influenzae.
La Figura 1 representa la clonación del gen
pal que codifica la proteína P6 con el péptido de señal de
la lipoproteína nativa por amplificación PCR del cromosoma de la
cepa no tipificable de H. influenzae P860295.
La Figura 2 representa la homogeneidad e
identidad de la rP6 lipidada. Geles SDS-PAGE al
quince por ciento se cargaron con muestras que contenían
aproximadamente 10 \mumg de la rP6 lipidada en el extracto inicial
(carril 1) y el grupo de la rp6 lipidada purificada por intercambio
aniónico (carril 2). Los carriles etiquetados con S contienen
patrones de bajo peso molecular preteñidos de
Bio-Rad.
La Figura 2A es el gel teñido con Coomassie. La
Figura 2B es la inmunotransferencia de western de un gel
similar.
La Figura 3 representa el análisis
SDS-PAGE de fracciones de la purificación de la rP6
lipidada. Se realizó la electroforesis de alícuotas de las etapas
en el proceso de purificación de la rp6 lipidada en un sistema del
gel en gradiente al 4-20%. Carriles: 1, Permeado de
diafiltración con tampón de lisis; 2, Permeado de diafiltración con
Triton^{TM} X-100; 3, Permeado de diafiltración
con tampón Tris^{TM}; 4, Permeado de diafiltración con
Zwittergent^{TM} 3-14; 5, Permeado de
diafiltración con Zwitter-gent^{TM}
3-14/ NaCl 0,5 M; 6, Permeado de diafiltración con
tampón Tris^{TM}; 7, Permeado de diafiltración con sarcosilo; 8,
Mark 12 Convencional; 9, Permeado de diafiltración con tampón
Tris^{TM}; 10, Permeado de diafiltración con Zwittergent^{TM}
3-12 a temperatura ambiente; 11, Permeado de
diafiltración con tampón Tris^{TM}; 12, Permeado de etapa de
concentración; 13, Permeado de diafiltración con Zwittergent^{TM}
3-12 a 55ºC; 14, Permeado de diafiltración con
tampón Tris^{TM} a 55ºC; 15, Permeado de diafiltración con
Zwittergent^{TM} 3-12 a 55ºC.
Para superar la dificultad reconocida para
expresar cantidades útiles de las PAL lipidadas, tal como la rP6
lipidada, se ideó una estrategia implicando el uso de promotores
estrechamente regulados y cepas huéspedes desprovistas de proteasas
citoplasmáticas y periplasmáticas.
Todos los esfuerzos previos no exitosos para
expresar la proteína P6 lipidada en cantidades significativas para
su uso comercial se basaron en el cambio de la secuencia del
promotor y/o en realizar cambios en la secuencia de señal
reconocida por la peptidasa de señal II.
Como se describe más adelante, se construyeron
plásmidos conteniendo el gen pal que codifica P6 bajo el
control del promotor T7 (plásmido pPX4019 - Ejemplo 1) y el promotor
inducible de arabinosa (plásmido pPX4020 - Ejemplo 2). En el
Ejemplo 3 se describen las cepas bacterianas ejemplares y los
medios. Tanto pPX4019 como pPX4020 expresan la proteína P6 lipidada
en las cepas de E. coli ensayadas, como se determina
por el análisis de transferencia de western, con anticuerpos
monoclonales específicos contra P6, clasificando según el tamaño en
los geles SDS-PAGE que indicaron una carencia de una
secuencia de señal y de una observación visual de los niveles de
expresión en los geles teñidos con Coomassie (véase el Ejemplo 4 y
las Figuras).
El plásmido pPX4020 produjo niveles aumentados
de expresión de la proteína rP6 en las cepas de E. coli BL21
y BLR, con niveles más elevados en la cepa BLR. Por lo tanto, el
plásmido pPX4020 se seleccionó para estudios adicionales. El
cultivo de grandes cantidades de E. coli expresando la rP6
lipidada se realizó en la cepa huésped BLR. Todos los experimentos
posteriores utilizaron este sistema de
vector-huésped.
La construcción del plásmido descrita en este
documento como una realización preferida (pPX4020) usa el sistema
promotor inducible de arabinosa que tiene varias características
únicas: Se regula estrechamente y es casi totalmente inactivo si no
hay arabinosa y si hay algo de glucosa. Puede modularse ya que
muestra niveles de inducción en aumento a medida que se añade
arabinosa al medio de cultivo. Estos factores en combinación con la
cepa BLR de E. coli, que es altamente deficitaria en proteasa
y de recombinación deficiente, permiten la expresión significativa
de la proteína P6 lipidada.
La purificación a escala discontinua de la rP6
lipidada implica centrifugación diferencial, extracción diferencial
con detergente y cromatografía de intercambio aniónico (véase el
Ejemplo 4).
Sin embargo, para hacer que un candidato sea
viable para la inclusión en una composición antigénica, la rP6
lipidada expresada debe purificarse por un procedimiento que sea
factible a gran escala. La diafiltración es un procedimiento
adecuado para purificar a gran escala. El proceso de diafiltración
para extraer la rP6 lipidada rP6 es complicado porque la rP6
lipidada se asocia estrechamente a peptidoglicanos.
Como se describe en el Ejemplo 5, la
solubilización de la rP6 lipidada se consiguió siguiendo la
extracción diferencial con detergente como la proteína nativa
obtenida de Haemophilus (Hi-P6) (33), pero se
usó diafiltración de flujo tangencial en lugar de centrifugación.
Todos los detergentes tales como dodecilmaltósido, desoxicolato,
Zwittergent^{TM} 3-08, 3-12, y
3-14 se ensayaron y se observó que eran aceptables
para extraer la rP6 lipidada rP6 cuando se usaban en el intervalo
de 0,2-1%(p/v). La rP6 lipidada también podría
solubilizarse en un tampón de borato sódico, pH 9,5 a 65ºC. La
flexibilidad de la elección del detergente permite el uso de
Zwittergent^{TM} 3-12 para extraer la rP6
lipidada. La elección de Zwittergent^{TM} 3-12
por tanto minimiza el número de componentes necesarios para producir
una composición antigénica multi componente. Aunque la Hi P6 nativa
se obtiene en forma esencialmente pura después de la solubilization,
la proteína recombinante se solubiliza junto con varias proteínas
de E. coli. La cantidad relativa de estas proteínas puede
variarse y en algunos casos casi eliminarse por la elección del
detergente usado en el extracto final. La rP6 lipidada se separa de
cualquier resto de proteínas de E. coli por cromatografía de
intercambio aniónico (véase el Ejemplo 6).
Este procedimiento de extracción de las LAP
combina los procesos de aclarado y extracción en una unidad de
operación. El producto se extrae de las células y se separa de los
residuos celulares tan sólo con un proceso de diafiltración
continuo. Adicionalmente, las LAP se extraen en un estado
semi-purificado lo que simplifica las etapas de
procesamiento aguas abajo. Por último, este proceso es muy escalable
porque el único requisito es que el área superficial de las
membranas esté aumentada de manera proporcional con la cantidad de
células. Este proceso de extracción evita el uso de la
centrifugación, un procedimiento no preferido para usar en la
extracción a gran escala. Después de la extracción, la rP6 lipidada
se purifica por técnicas convencionales.
El análisis de la rP6 lipidada coincidió con la
caracterización de la proteína recombinante como una lipoproteína,
según lo esperado. El tamaño molecular según lo determinado por
espectrometría de masas MALDI-TOF demuestra que la
proteína recombinante purificada es más grande que lo esperado de su
secuencia de aminoácidos solamente (véase el ejemplo 7). El tamaño
de la proteína, combinado con el análisis de aminoácidos detallado
en la tabla 1 (véase el Ejemplo 8), indica que se ha eliminado la
secuencia de la señal y la proteína está en la forma madura. La
existencia de un extremo amino bloqueado, según lo demostrado por el
análisis de aminoácidos amino-terminal (véase el
Ejemplo 9), también demuestra que se ha producido la modificación
del resto cisteína terminal. Considerados en su conjunto, estos
resultados demuestran que la secuencia de señal, que se ha
demostrado que reconoce y procesa E. coli dando como
resultado la P6 lipidada (23), se ha eliminado y que la P6
recombinante purificada aquí está lipidada en su extremo amino.
Investigadores anteriores han demostrado que
después de producirse infecciones por NTHi de origen natural los
niveles de anticuerpos contra la P6 tienen una correlación inversa
con la incidencia de la enfermedad (34, 35, 36), haciendo de la
producción de títulos elevados contra la P6 un objetivo de cualquier
programa de inmunización que usa este antígeno. La proteína P6
nativa lipidada está presente en cantidades muy pequeñas (menos del
1% de las proteínas de la membrana externa) (33), lo que hace que la
purificación de cantidades comercialmente viables sea más
problemática.
Una ventaja crítica de la rP6
modificada-lipidada sobre la rP6 no lipidada
expresada anteriormente es la inmunogenicidad potenciada asociada
con la modificación lipídica. Dos informes han demostrado que,
aunque la rP6 no lipidada es capaz de provocar anticuerpos
biológicamente activos, esta es menos inmunogénica que la proteína
lipidada (28, 29).
A diferencia, los datos de inmunogenicidad en
animales presentados en las Tablas 2-4 más adelante
(véanse los Ejemplos 10 y 11) muestran que la modificación lipídica
de la P6 recombinante también aumenta la inmunogenicidad de este
antígeno en el modelo murino. El aumento de hasta un logaritmo de 2
en los títulos medios geométricos de los anticuerpos (TMG) a las 6
semanas es muy significativo y hace de la forma lipidada de la
proteína rP6 un candidato práctico para incluir en las
composiciones antigénicas. Los resultados en estos experimentos
refuerzan esto ya que la rP6 lipidada no interfiere con la respuesta
inmune generada por los otros antígenos ensayados.
Considerados en su conjunto, estos datos apoyan
la creencia de que la rP6 lipidada es viable para incluir en
composición antigénicas contra H. influenzae. Aunque más
adelante se ha ejemplificado con la rP6 lipidada de NTHi, también
es adecuada la rP6 lipidada de Hib para incluir en las composiciones
antigénicas de esta invención.
Además de los detallados en los ejemplos
1-3 una diversidad de sistemas de vectores de
células huéspedes bacterianos son adecuados para usar para expresar
la proteína rP6 lipidada usada en las composiciones antigénicas de
esta invención.
Estos sistemas de expresión sitúan al gen que
codifica la LAP lipidada recombinante bajo el control de un
promotor estrechamente regulado. En condiciones especificas, estos
promotores operan para regular negativamente la producción del ARNm
de LAP recombinante, y por consiguiente mitiga cualquier efecto
perjudicial en la célula huésped debido a la producción de la LAP
lipidada recombinante (37). Esta regulación estrecha puede
eliminarse después en condiciones específicas para permitir la
expresión de la LAP lipidada recombinante maximizada en la célula
huésped.
Estos promotores regulados estrechamente (que
pueden estar junto con otros elementos de control) incluyen, pero
sin limitación, el promotor inducible por arabinosa (38), el
promotor T7 que puede modificarse para estar bajo control por la
función antiterminación nutL/N (39, 40) o por Mu C (41), el promotor
P_{L} en combinación con el antiterminador (42), la ARN
polimerasa SP6 y los promotores de SP6 (43), el promotor de la
colicina (44) el promotor/operador tetA (45) los promotores de
rhamnosa y fosfato (46), los elementos reguladores LacR/O, tetR/O y
AraCI1-12 (47) y los promotores invertibles
(48).
El sistema de vectores es compatible con la
célula huésped usada. Las células huéspedes adecuadas incluyen
bacterias transformadas, transfectadas o transducidas por técnicas
convencionales con ADN de plásmidos, ADN de cósmidos o ADN de
bacteriófagos. Los ejemplos de huéspedes bacterianos incluyen E.
coli, B. subtilis, Salmonella y Shigella.
Para construir un vector de este tipo, se
inserta ADN de lap en un vector plasmídico que contiene un
promotor bajo estrecho control transcripcional, y otros elementos
de control y se liga a sitios específicos dentro del vector, de
manera que cuando el vector plasmídico se inserta en una célula
huésped bacteriana, la célula huésped puede expresar el ADN de
lap.
El plásmido se introduce en la célula huésped
por transformación, transducción o transfección dependiendo del
sistema vector célula huésped usado. La célula huésped después se
cultiva en condiciones que permiten que la célula huésped exprese
la proteína rP6 lipidada. Una célula huésped que contiene un
plásmido con el promotor inducible por arabinosa se induce con
L-arabinosa, mientras que una célula huésped que
contiene un plásmido con el promotor T7 se induce con IPTG.
La LAP lipidada es útil en la preparación de
composiciones antigénicas para conferir protección a mamíferos
contra enfermedades causadas por las bacterias correspondientes. Por
ejemplo, la proteína rP6 lipidada es útil en la preparación de
composiciones antigénicas para conferir protección a mamíferos
contra enfermedades causadas por H. influenzae.
Estas composiciones antigénicas comprenden las
LAP lipidadas purificadas y aisladas, tales como la proteína rP6
lipidada, en la que en la composición antigénica provoca una
respuesta inmune protectora en un huésped de mamífero. Las
composiciones antigénicas multivalentes se proporcionan incluyendo
otras proteínas, tales como combinando la rP6 lipidada con la
proteína UspA2 de Moraxella catarrhalis (que se describe en
la Solicitud Internacional PCT Nº WO 98/28333 (49), que se
incorpora en este documento por referencia), un agente causante de
otitis media bacteriana y diluyentes o portadores inmunológicamente
aceptables lipidados recombinantes de una manera convencional para
preparar soluciones o suspensiones líquidas inyectables. Dichos
diluyentes o portadores incluyen, pero sin limitación, PBS,
solución salina fisiológica, soluciones isotónicas tamponadas,
liposomas e ISCOMS. El nivel de anticuerpos provocado por las
composiciones antigénicas pueden mejorarse usando determinados
adyuvantes tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio,
Stimulon^{TM} QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals,
Inc., Framingham, MA), MPL^{TM} (monofosforil lipido A
3-O-desacetilado; RIBI ImmunoChem
Research, Inc., Hamilton, MT), IL-12 (Genetics
Institute, Cambridge, MA), la toxina termolábil de E. coli y
la toxina del cólera (tanto en una forma de tipo silvestre como
mutante, por ejemplo en la que el ácido glutámico en la posición 29
del aminoácido se sustituye por otro aminoácido, preferiblemente una
histidina, de acuerdo con la Solicitud Internacional PCT Nº WO
00/18434) (51).
Las composiciones antigénicas de esta invención
se administran por inyección de una manera convencional, tal como
inyección subcutánea, intradérmica o intramuscular en seres humanos,
así como por administración oral, mucosa, intranasal o vaginal para
inducir una respuesta inmune activa para proteger frente a
enfermedades causadas por una bacteria gram- negativa tal como
H. influenzae. La dosificación a administrarse se determina
por medios conocidos por los expertos en la materia. La protección
puede conferirse por una dosis única de las composiciones
antigénicas o puede necesitarse la administración de varias dosis,
además de dosis de refuerzo posteriormente para mantener la
protección.
Para entender mejor esta invención, se exponen
los siguientes ejemplos a continuación.
Se utilizan técnicas de biología molecular
convencionales de acuerdo con los protocolos descritos en Sambrook
y col. (52).
Como se presenta en la Figura 1, el gen
lap que codifica la proteína P6 se clonó con el péptido de
señal de la lipoproteína nativa por amplificación PCR del cromosoma
de la cepa H. influenzae no tipificable P860295. Usando
cebadores mutagénicos que crean un sitio de restricción Ndel
abarcando el codón de inicio en el extremo 5' del gen
(GGAGAAATCATATGAACAAATTTG) (SEC ID Nº: 1) y un sitio
HindIII en la región 3' del codón de terminación
(GGATCCTGTTTTTCAAGCTTAGAAATACTAAG) (SEC ID Nº: 2), el
fragmento de PCR conteniendo el gen lap se clonó en el
vector de expresión pCRII (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se exploró
mediante análisis de restricción. El plásmido resultante se usó
como la fuente para el fragmento NdeI/HindIII
conteniendo el gen lap para P6 que se clonó en los sitios
NdeI y HindIII del vector de expresión pET27b
(Novagen, Madison, WI). El diseño de esta construcción coloca al
gen para P6 bajo el control del promotor T7 y se aprovecha de un
sitio de unión al ribosoma consenso en el vector. Los clones
iniciales se identificaron en un huésped de E. coli no
permisivo (DH5\alpha) por análisis de restricción. Se seleccionó
un aislado de plásmido único y se conservó como pPX4019. Este
plásmido se usó para transformar el control del huésped permisivo
del promotor T7 y se aprovecha de un sitio de unión al ribosoma
consenso en el vector. Los clones iniciales se identificaron en un
huésped de E. coli no permisivo (DH5\alpha) por análisis de
restricción. Se seleccionó un aislado de plásmido único y se
conservó como pPX4019. Este plásmido se usó para transformar la cepa
huésped permisiva BL21 (DE3, pLysS) (Novagen) para estudios de
expresión.
Se construyó un segundo plásmido de expresión de
la proteína P6 colocando al gen lap bajo el control del
promotor inducible por arabinosa estrechamente regulado (38). Este
plásmido se generó subclonando el fragmento
Xbal/HindIII del plásmido pPX4019 conteniendo el gen
lap y el sitio de unión al ribosoma consenso de pET27b en el
plásmido pBAD18-Cm digerido de manera similar (véase
la Figura 1). Los clones se exploraron por análisis de restricción
seguido de estudios de expresión en candidatos seleccionados. Unos
de los aislados pBAD18-Cm que expresa la proteína
P6 se denominó pPX4020.
Todos los estudios de expresión cualitativa
comparando diferentes aislados, construcciones plasmídicas, cepas
huéspedes de E. coli y concentración del inductor (IPTG para
pPX4019, L-arabinosa (Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO) para pPX4020) se realizaron de una manera similar para
proporcionar un fondo consistente para la comparación. Se
cultivaron aislados de colonias simples durante una noche a 37ºC en
medio HySoy^{TM}, glucosa al 1% y el antibiótico apropiado para
la selección del plásmido (pPX4019, 15 \mug/ml de Kanamicina; y
pPX4020, 15 \mug/ml de Cloramfenicol). Estos cultivos se diluyeron
hasta una DO_{600} = 0,5 en HySoy^{TM}, glicerol al 1% y
antibiótico, se cultivaron a 37ºC hasta una DO_{600} =
2-4 y se indujeron. Se tomaron muestras
equivalentes hasta una DO_{600} = 1,0 a intervalos justo antes de
la inducción, a las dos horas y a las 18 horas después de la
inducción. Estas muestras se centrifugaron y el sedimento celular se
resuspendió en un tampón de carga de SDS-PAGE de
150 \mul (ISS, Natick, MA). Se realizaron comparaciones de geles
por SDS-PAGE al 15% teñidos con azul de Coomassie
con 15 \mul de carga cargada por carril.
\vskip1.000000\baselineskip
DH5\alpha - \phi80dlacZ\DeltaM15
\Delta(lacZYA-argF)U169 deoR
recA1endA1 hsdR17 (r_{k}^{-},m^{+}_{k})
phoA supE44\lambda- thi-1 gyrA96
relA1 (Life Technologies, Rockville, MD)
BL21(DE3) - ompT lon
hsdS_{B} (r_{B}^{-} m_{B}^{-}) gal
dcm (DE3) (Novagen)
\vskip1.000000\baselineskip
DH5\alpha - \phi80dlacZ\DeltaM15
\Delta(lacZYA-argF)U169 deoR
recA1endA1 hsdR17 (r_{k}^{-},m^{+}_{k})
phoA supE44\lambda- thi-1 gyrA96
relA1(Life Technologies)
BLR - ompT lon
hsdS_{B} (r_{B}^{-} m_{B}^{-}) gal dcm
\Delta
(srl-recA)306::Tn10(tet^{r})
(Novagen)
BL21 (DE3) - ompT lon
hsdSB (r_{B}^{-} m_{B}^{-}) gal dcm (DE3)
(Novagen)
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron células de E. coli
recombinantes expresando la rP6 lipidada en un fermentador como se
describe a continuación. Se preparó el medio de cultivo conteniendo
los siguientes materiales y se esterilizó in situ para
fermentadores y mediante autoclave para el cultivo en matraz.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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Se realizaron alícuotas de medio estéril
conteniendo la Solución A y la solución Mineral en matraces
agitadores y se añadieron 20 ml de MCG por litro de medio. Se
añadió cloramfenicol a 50 \mul Cg/ml. Los cultivos iniciadores se
inocularon con 200-300 \mul de BLR de E.
coli (pPX4020) de una reserva congelada. Las células se
cultivaron a 30ºC con aireación durante 16 horas. Se inoculó con el
medio de cultivo un fermentador de 10 litros conteniendo medio de
cultivo, complementado como se ha indicado anteriormente, hasta una
de DO_{600} de aproximadamente 0,2.
Los parámetros de control del fermentador se
ajustaron de la siguiente manera:
Para controlar los parámetros del proceso se
usaron las siguientes soluciones y se esterilizaron antes del uso:
PPG-2000-200 ml para el control de
espuma si es necesario, 1 l de hidróxido de amonio al 40% para el
control del pH durante el cultivo, 1 l de glucosa al 50% para
suministrar cuando el pH comienza a elevarse debido al
empobrecimiento de glucosa - para el cultivo continuado, 500 ml de
ácido acético 4 N para el control del pH durante la inducción,
solución de arabinosa al 25%, filtrado estéril (250 g/l) + glicerol
al 1% - 250 ml (antes de esterilizar en autoclave). Se usó solución
arabinosa/glicerol para suministrar después de la adición de
glucosa final cuando el pH comienza a elevarse debido al
empobrecimiento de glucosa para inducir la producción de proteína.
La solución de arabinosa se filtró esterilizada antes de la adición
de la reserva de glicerol esterilizada en autoclave. La solución se
realizó añadiendo 100 ml de glicerol y 400 ml de solución de
arabinosa al 25% para un fermentador de 10 l. La concentración final
del fermentador contenía 10 gramos/litro de arabinosa y 10 ml/litro
de glicerol.
Después de la inoculación del fermentador, se
añadió base (hidróxido de sodio) en función de la necesidad para el
control del pH, junto con antiespuma (PPG-200) en
función de la necesidad. Se suministró oxígeno puro a 800 rpms.
Cuando el pH se elevó por encima de 7,0, se suministraron al cultivo
900 ml de glucosa al 50%. Cuando el pH era superior o igual a 7,1,
se añadió una solución adicional de 200 ml de glucosa al 50%. Estas
condiciones continuaron hasta alcanzar una DO_{600} de
aproximadamente 50.
Después de alcanzar una DO_{600} de
aproximadamente 50, cuando el pH se elevó de nuevo por encima de 7,0
de nuevo, se añadió una solución de arabinosa/glicero de 50 ml para
inducir la expresión de la rP6 lipidada. En este momento, se usó
ácido para controlar adicionalmente el pH. La incubación prosiguió
durante tres horas post-inducción y después el
cultivo se recogió tras la adición de 10 ml por litro de solución
EDTA 500 mM, pH 8. El caldo de cultivo se almacenó a 4ºC hasta la
purificación de la rP6 lipidada.
Se utilizaron lotes de la rP6 lipidada expresada
de pPX4020 en experimentos posteriores y se purificaron por
extracción diferencial de la membrana con detergente como se indica
a continuación:
- 1)
- aislamiento de la fracción de la membrana de E. coli: sedimentos celulares bacterianos congelados obtenidos del fermentador se congelaron y se suspendieron en HEPES-NaOH 10 mM, pH 7,4, Na_{2} EDTA 1 mM con un volumen de tampón igual a cinco veces el peso del sedimento celular congelado. La suspensión celular se homogeneizó en un microfluidificador Microfluidics (Newton, MA) 110-Y para lisar las células. Las membranas se obtuvieron del lisado celular por centrifugación diferencial (300.000 x g durante 1 una hora). Las membranas se lavaron dos veces con el mismo volumen de tampón usado para la lisis y después se congelaron como un sedimento.
- 2)
- Solubilización de la rP6 lipidada de membranas de E. coli: la P6 lipidada se solubilizó de E. coli usando extracción diferencial con detergente similar a la descrita por Zlotnick y col (33) y Green y col (22). Todas las extracciones se realizaron durante 30 minutos a temperatura ambiente a menos que se indique otra cosa. Todas las centrifugaciones se realizaron usando un rotor Beckman 45 Ti a 42.000 rpm durante 1 hora con la temperatura del rotor controlada a 10ºC a menos que se indique otra cosa. Las membranas de E. coli se suspendieron en HEPES-NaOH 10 mM, pH 7,4, MgCl_{2} 1 mM y se extrajeron dos veces con Tritón^{TM} X-100 (Calbiochem-Novabiochem International, San Diego, CA) hasta una concentración final del 1% (p/v) para eliminar los componentes de la membrana interna. El sedimento de la membrana externa resultante se suspendió en Tris^{TM} 50 mM HCl pH 8,5 Na_{2} EDTA 5 mM, que también se usó para suspender los sedimentos posteriores antes de la solubilización de la rP6 lipidada. Las membranas externas se extrajeron después secuencialmente dos veces con Zwittergent^{TM} 3-14 al 1%; dos veces con Zwittergent^{TM} 3-14 al 1%; y NaCl 0,5 M; dos veces con N-lauril sarcosina al 1%, sal sódica; Zwittergent^{TM} 3-14 al 1%. El sedimento final obtenido después de estas extracciones se extrajo con Zwittergent^{TM} 3-12 al 2%; en Tris^{TM} HCl 10 mM, pH 8, Na_{2} EDTA 1 mM durante con 45 minutos a 55ºC con mezcla intermitente seguido por centrifugación durante al menos una hora. El sobrenadante de esta extracción final contenía la rP6 lipidada.
- 3)
- Purificación de la rP6 lipidada: la rP6 lipidada conteniendo el extracto obtenido como se describe anteriormente se purificó además por cromatografía de intercambio aniónico utilizando una resina de flujo rápido de DEAE (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) y el mismo tampón de fuerza iónica baja utilizado para la extracción. La rP6 lipidada solubilizada se absorbió a una columna de flujo rápido de DEAE con un volumen de lecho de aproximadamente 20 ml. La columna se desarrolló con un gradiente NaCl 0-0,2 M durante 40 minutos, seguido de 20 minutos de una elución isocrática con NaCl 0,2 M. La rP6 lipidada se eluyó durante la fase isocrática del desarrollo. La mayor parte de las otras proteínas permanecieron absorbidas a la columna y se desorbieron más tarde con NaCl 1M. De 200 g de células, se purificaron aproximadamente 100 mg.
- 4)
- Caracterización de la rP6 lipidada purificada por SDS-PAGE y transferencia de Western. La homogeneidad de la rP6 purificada se ensayó por SDS-PAGE en el sistema de tampón Laemmli, seguido por densitometría láser del gel teñido. Aproximadamente se analizaron 10 \mug de la rP6 lipidada tanto del extracto bruto como del grupo purificado por intercambio aniónico en un gel SDS-PAGE al 15% (53). El gel se tiñó con azul de Coomassie y se escaneó en un densitómetro láser. La densitometría por láser del gel teñido con Coomassie (Figura 2A, carril 2), reveló un solo pico sencillo de más del 98% de homogeneidad en las fracciones agrupadas del intercambio aniónico, indicando que la rP6 lipidada se había purificado casi homogéneamente. La identidad de la rP6 lipidada de estas muestras se verificó por una reacción de transferencia de western de las mismas muestras usadas para determinar la homogeneidad con anticuerpos monoclonales específicos para la P6 de Haemophilus influenzae, que no reacciona con la proteína afín de E. coli (datos no mostrados). Los resultados del análisis de transferencia de western se muestran en la Figura 2B. La banda de la rP6 lipidada era la única banda reactiva con el anticuerpo monoclonal específico para P6 tanto en el extracto bruto (carril 1) como en las fracciones agrupadas (carril 2). Esto indica que la proteína purificada es de hecho, la P6. No se observaron productos de degradación.
El caldo de fermentación de las células de
E.coli expresando la rP6 lipidada se ajustó con EDTA 10 mM y
se diluyó a menos o igual del 10% en peso húmedo de células/volumen
antes de la homogenización. Después las células se lisaron con un
microfluidizador de alta presión y se diafiltraron a temperatura
ambiente con una secuencia de tampones usando un dispositivo de
filtración por membrana de flujo cruzado. Se determinó que el área
mínima de la membrana para permitir el transporte en masa eficaz de
las proteínas solubilizadas a través de la membrana era
aproximadamente de 0,002 m^{2}/g peso en húmedo de células Las
proteínas solubilizadas de tamaño aproximado menor que el límite de
peso molecular de 1000 kD de la membrana pasaron a través con el
infiltrado, mientras que las moléculas y las proteínas no
solubilizadas mas grandes quedaron retenidas. La secuencia de las
etapas de diafiltración era la siguiente:
- (1)
- El caldo de fermentación lisado se diafiltró con HEPES 10 mM/EDTA 1 mM/pH 8,0 (tampón de lisis) a un volumen igual a tres veces el volumen del concentrado para eliminar los contaminantes intracelulares y extracelulares a través del infiltrado.
- (2)
- El lisado se diafiltró tres veces con HEPES 10 mM/MgCl_{2} 1 mM/Tritón^{TM} X-100 al 0,02% para solubilizar y eliminar las proteínas de la membrana interna. Los iones Mg^{++} estabilizan la membrana externa, por lo tanto, las proteínas de la membrana externa no se solubilizaron en presencia de Tritón^{TM} X-100.
- (3)
- El lisado se diafiltró tres veces con Tris^{TM} 50 mM/EDTA 5 mM/Zwittergent^{TM} 3-14 al 0,2% para solubilizar y eliminar las proteínas de la membrana externa (pero no la rP6 lipidada). El EDTA sirve para secuestrar los iones Mg^{++} de la etapa (2) así como para evitar la proteolisis.
- (4)
- El lisado se diafiltró tres veces con Tris^{TM} 50 mM/EDTA 0,5 mM/Zwittergent^{TM} 3-14 al 0,2% para solubilizar y eliminar las proteínas adicionales. Se añadió NaCl al tampón en esta etapa para interrumpir cualquier interacción iónica entre las proteínas de la membrana y las membranas. Esta etapa se realizó porque la rP6 lipidada es una LAP y la sal sirve para eliminar las proteínas unidas a la membrana (pero no la rP6 lipidada) del complejo proteína de membrana/membrana externa. La diafiltración continuó con tres volúmenes del concentrado de Tris^{TM} 50 mM/EDTA 5 mM para reducir la concentración Zwittergent^{TM} en el concentrado.
- (5)
- El lisado se diafiltró tres veces con Tris^{TM} 50 mM/EDTA 5 mM/sacorsilo al 0,2% para eliminar las proteínas adicionales unidas a las membranas (pero no la rP6 lipidada) y después se diafiltró tres veces con Tris^{TM} 50 mM/EDTA 5 mM para reducir la concentración de sarcosilo en el concentrado.
- (6)
- El lisado se diafiltró tres veces con fosfato 10 mM/Zwittergent^{TM} 3-12 al 0,2% para eliminar las proteínas adicionales unidas a las membranas (pero no la rP6 lipidada) y después se diafiltró tres veces con fosfato sódico 10 mM para reducir la concentración de Zwittergent^{TM} 3-12 en el concentrado.
- (7)
- El lisado se concentró al 20% de su volumen original y después se diafiltró tres veces con fosfato de sodio 10 mM, Zwittergent^{TM} 3-12 al 0,2% a 55ºC para solubilizar la rP6 lipidada, que se recogió a través del infiltrado. La etapa de concentración se realizó antes de la diafiltración para aumentar la concentración de la rP6 lipidada en el infiltrado. La diafiltración continuó con tres volúmenes adicionales de concentrado con fosfato de sodio 10 mM a 55ºC para reducir la concentración de Zwittergent^{TM} 3-12 en el concentrado. Esta etapa de calentamiento se realizó porque (al igual que en la etapa (4) anterior) la rP6 es una LAP y el calentamiento sirve para eliminar la rP6 lipidada del complejo proteína membrana/membrana. Finalmente, la diafiltración concluyó con tres volúmenes de concentrado de fosfato de sodio 10 mM a 55ºC.
Durante las etapas de diafiltración, la presión
transmembrana se mantuvo aproximadamente a 0,68 atm (10 psi) y la
velocidad de flujo cruzado se mantuvo a aproximadamente
120-180 lmh. Todos los procesos de diafiltración se
ejecutaron a temperatura ambiente excepto la etapa final de
extracción a 55ºC, que se ejecutó a la temperatura más elevada para
solubilizar la rP6 lipidada. El flujo del infiltrado variaba de 30 a
50 lmh, que era lo suficientemente alto para que el proceso de
extracción fuera práctico y graduable.
Durante la extracción, se tomaron muestras en
diferentes puntos para análisis por SDS-PAGE para
evaluar el efecto de diversas etapas de diafiltración en la
extracción de proteínas. Las muestras se precipitaron añadiendo
alcohol, se centrifugaron y se resolubilizaron al 20% del volumen
original en el tampón prep de muestra SDS. Este procedimiento de
preparación de muestras concentra la muestra y reduce la
concentración de Tritón^{TM} X-100 o la de
Zwittergent^{TM} 3-12 de las muestras. El
Tritón^{TM} X-100 o el Zwittergent^{TM}
3-12 interfieren con la unión de SDS con respecto a
la muestra y reduce la resolución de las bandas en los geles. Se
cargaron diez \mul de cada muestra en geles de acrilamida Novex al
10% y los geles se ejecutaron durante 60-90 minutos
a 125 Voltios.
En las Figuras 2 y 3 se muestra un análisis
SDS-PAGE típico de las muestras tomadas de las
corrientes del infiltrado durante los procesos de extracción de la
rP6 lipidada. La rP6 lipidada se ejecuta a 15 kilodaltons (kD) en
estos geles. Los geles muestran que algunas proteínas contaminantes
se eliminaron durante la diafiltración con tampón de lisis y tampón
que contenía diversos detergentes. Había muy pocas pérdidas de rP6
lipidada durante estas etapas de diafiltración. Durante la etapa de
diafiltración final con Zwittergent^{TM} 3-12 a
55ºC, la rP6 lipidada se extrajo en un estado parcialmente
purificado. Al final de la segunda etapa de diafiltración con
Zwittergent^{TM} 3-12 a 55ºC, había muy poca rP6
lipidada en la corriente del infiltrado. Esto sugiere que la
mayoría de las rP6 lipidadas solubilizadas se habían recuperado a
través del infiltrado. Otros experimentos han demostrado que muy
pocas rP6 lipidadas permanecían insolubilizadas en el concentrado
después de completar los procesos de diafiltración. La banda de 15
kD del extracto Zwittergent^{TM} 3-12 /55ºC
demostró ser la rP6 lipidada por análisis de western (datos no
mostrados).
El uso de Zwittergent^{TM}
3-12 en la solubilización de la rP6 lipidada dio
como resultado un extracto que contenía varias proteínas además de
la rP6 lipidada. Se determinó que la homogeneidad de este extracto
era aproximadamente del 78% de la rP6 lipidada (Figura 2, Panel A,
carril 1). Aunque éste es un elevado grado de homogeneidad para una
solubilización inicial, se deseaba separar, si posible, la rP6
lipidada de estas proteínas de E. coli. Esto se realizó como
se describe en el Ejemplo 6.
Se usó cromatografía de intercambio aniónico
para purificar adicionalmente la rP6 lipidada descrita en el
Ejemplo 5, porque se había usado con éxito para purificar la rP6 no
lipidada. La rP6 lipidada se absorbe más estrechamente en la resina
DEAE que la rP6, que típicamente se eluye con NaCl 0,1 M. La rP6
lipidada en Zwittergent^{TM} 3-12 al 0,2%
requiere NaCl al 0,2 M en el tampón antes de producirse la
desorción. Las proteínas de E. coli permanecieron absorbidas
a la resina de intercambio aniónico (DEAE) hasta después de que la
rP6 lipidada se eluyese.
En la Figura 2 se muestra la homogeneidad e
identidad de la rP6 lipidada extraída y purificada con
Zwittergent^{TM} 3-12 al 0,2%. Se determinó que
la homogeneidad de la rP6 lipidada purificada era superior al 98%
(Figura 2, Panel A, carril 2).
La medición exacta de peso molecular de la rP6
lipidada expresada de pPX4020 con el promotor inducible de
arabinosa se realizó por espectrometría de masas por
Desorción/Ionización por Láser Asistida por
Matriz-Tiempo de vuelo (MALDI-TOF)
usando un analizador de masa lineal Finnigan Mat Lasermat^{TM}
2000 (Finnigan Mat, Ltd., San Jose, CA). El Lasermat^{TM} usa la
técnica de deserción por láser asistida por matriz (54) para
ionizar la muestra y el Tiempo de vuelo para analizar los iones
producidos. La muestra se embebió en una matriz de ácido
3,5-dimetoxi-4-hidroxi-cinámico
(ácido sinapínico) para potenciar la ionización de la muestra. Un
microlitro de la muestra conteniendo 5-10 pmol de la
proteína purificada se mezcló con 1 \mul de la matriz (10 mg/ml)
disuelto en acetonitrilo acuoso al 70% (v/v) conteniendo ácido
trifluoroacético al 0,1% (v/v). Un microlitro de esta muestra y de
la mezcla de matriz se cargó en un portamuestras, se dejó secar y se
irradió mediante un impulso corto de luz ultravioleta de un láser.
Las muestras de la proteína usualmente generan un espectro
relativamente simple en este procedimiento, ya que los iones
producidos relacionados con la proteína son predominantemente de
estados de carga z=+1 [M+H]^{+} y z=+2
[M+2H]^{2+}. Se usó citocromo C de corazón bovino (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) de peso molecular 12.230,9 para el calibrado externa.
[M+2H]^{2+}. Se usó citocromo C de corazón bovino (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) de peso molecular 12.230,9 para el calibrado externa.
Se determinó que el peso molecular de la rP6
lipidada en la muestra usada era de 15.078. Además del ión molecular
[M+H]^{+} esperado, se observó también el ión molecular
[M+2H]^{2+} de la rP6 lipidada. El peso molecular teórico
de la P6 conteniendo un resto de tripalmitoíl cisteína en su extremo
N es de 15.024 y el peso molecular predicho de la P6 sin procesar
por la peptidasa de señal II es de 16.016,66, mientras que el peso
molecular predicho de la P6 no lipidada escindida por la peptidasa
de señal II es 14.234,66. Por tanto, estos resultados son
coherentes con la expresión de la forma lipidada de la rP6 por E.
coli.
Se secó hacia abajo una muestra de la rP6
lipidada para análisis de aminoácidos en tubos de vidrio, seguido
de hidrólisis usando 100 \mul de HCl 6 N conteniendo fenol al 5% y
2-mercaptoetanol al 1% al vacío durante 22 horas a
110ºC. Posteriormente las muestras se secaron al vacío, seguido de
la resolubilización en el tampón de dilución de muestra
Na-S (Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA). La
composición de aminoácidos se determinó en un Analizador de
Aminoácidos Beckman modelo 6300 (55) usando un gradiente de
Na-citrato de tres etapas de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Los restos de treonina y serina no se
corrigieron para la destrucción. Como el procedimiento usado no
determinó los restos de cisteína y triptófano, los resultados se
expresaron como moles de restos por mol de rP6 lipidada basándose en
el peso molecular teórico de las cisteínas menos la rP6 no
lipidada, que es igual a 14.132,4 (la rP6 no lipidada no contiene
Trp). Estos resultados se muestran en la Tabla 1 y representan la
media de las determinaciones por duplicado. Los resultados son
coherentes con la secuencia de señal del gen lap que se ha
eliminado por E. coli.
Se realizó un análisis de secuencia de la
proteína amino-terminal usando un Secuenciador
Proteína/Péptido Applied Biosystems Modelo 477A equipado con un
Analizador on-line Modelo 120A PTH (Applied
Biosystems, Foster City, CA). Después de la escisión de cada
extremo amino sucesivo, el derivado anilinotiazolinona formado se
transformó al derivado más estable feniltiohidantoína (PTH) por
tratamiento con ácido trifluoroacético al 25% a 64ºC durante 20
minutos. Los derivados de PTH se separaron y se identificaron en el
analizador de PTH por HPLC de fase inversa usando una columna
Brownlee PTH C-18 (tamaño de partícula 5 \mul, 2,1
mm i.d. x 22 cm 1.; Applied Biosystems) con un sistema de gradiente
de dos disolventes modificado desarrollado por el fabricante
(56).
Cuando la rP6 lipidada (400 pmoles) se sometió
al análisis de secuencia de aminoácidos
amino-terminal, no se pudieron obtener datos de la
secuencia. Esto sugiere que en el grupo amino primario (o un
secundario) del aminoácido amino-terminal no estaba
disponible para la química de secuenciación, es decir, el resto
terminal-amino de la rP6 estaba bloqueado. Para
justificar que la incapacidad de generar datos de la secuencia no se
debía a ningún mal funcionamiento de los instrumentos, se ejecutó
posteriormente un experimento de control en el que una mezcla de
400 pmoles de la rP6 lipidada y 200 pmoles de
beta-lactoglobulina se sometió al análisis de la
secuencia amino-terminal. Se obtuvo una sola
secuencia representando la secuencia amino-terminal
de la beta-lactoglobulina, lo que confirmó que el
resto amino-terminal de la rP6 lipidada estaba
esencialmente bloqueado.
La relativa inmunogenicidad de la P6
recombinante purificada lipidada y la P6 recombinante no lipidada
(28) se comparó en ratones Swiss-Webster. Cada
dosis de cinco \mug de de cada proteína se mezcló con AIPO_{4}
100 \mug y 50 \mug de monofosforil lipido A
3-O-desacetilado (MPL^{TM}) (Ribi
Immunochemicals, Hamilton, MT) que se usó para inmunizar ratones
por vía subcutánea en las semanas 0, 4 y 6. Se tomaron muestras de
sangre en las semanas 0, 4, 6 y 8. Otros grupos de ratones se
inmunizaron con mezclas de rP6 no lipidada o rP6 lipidada y la
proteína UspA2 de Moraxella catarrhalis (49), un agente
causante de otitis media bacteriana, y la rP4 recombinante y
lipidada (50). A estas mezclas se les añadieron también los
adyuvantes IPO_{4} y MPL^{TM} como anteriormente.
El antisuero obtenido de los ratones se analizó
por ELISA para detectar anticuerpos contra las proteínas P6, P4 o
IspA2. Los títulos ELISA se determinaron (22,28) tanto para el suero
del grupo como para animales individuales y después se obtuvo el
resultado del título medio geométrico (TMG). Los resultados se
muestran en las Tablas 2 y 3.
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La rP6 lipidada es al menos un logaritmo más
inmunogénica que la rP6 no lipidada cuando se administra en
solitario con adyuvantes MPL^{TM} y AIPO_{4}. Cuando se combina
con rP4 y UspA2, no se observó competición antigénica. De hecho, la
respuesta de la rP6 lipidada aumentó a aproximadamente 1,5 logs
mayor que la respuesta de la rP6 no lipidada.
El análisis de la respuesta inmune de los
antígenos UspA2 y rP4 muestra que la adición de la rP6 lipidada no
modifica la respuesta inmune contra estos antígenos en comparación
con la adición de la rp6 lipidada. Se observó que ningún antígeno
tuvo ningún efecto sobre la respuesta inmune normal cuando la rP4
lipidada y la UspA2 se mezclaron entre sí. Esto demuestra la
compatibilidad de estos antígenos.
La actividad biológica del antisuero dirigida
contra la rP6 lipidada y las mezclas rP6/rP4 lipidadas se demostró
usando un ensayo bactericida in vitro. Este ensayo se realizó
como se describe anteriormente (22,28) usando la cepa H.
influenzae no tipificable P861454 como la diana. Los resultados
se muestran en la Tabla 4.
Los resultados demuestran que la rP6 lipidada
provoca anticuerpos biológicamente activos en este ensayo. Aunque
los títulos absolutos no son diferentes entre el antisuero lipidado
y no lipidado, esto puede deberse a que los antisueros son
máximamente bactericidas en este sistema de ensayo, especialmente
dado que el suero preinmune demostró un elevado grado de
eliminación no específica con la fuente del complemento usada en
este ensayo. La mezcla de rP6/rP4 lipidadas también provoca
anticuerpos bactericidas a títulos equivalentes a los obtenidos con
la mezcla de rP6/rP4 no lipidadas. No era posible distinguir entre
la actividad bactericida de los anticuerpos
anti-rP4 y los anticuerpos anti-rP6
en este ensayo, pero está claro que la mezcla de los antígenos de
Haemophilus provoca antisueros altamente bactericidas contra
H. influenzae no tipificable.
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<120> PRODUCCIÓN DE LA FORMA LIPIDADA DE
LAS LIPOPROTEÍNAS ASOCIADAS A PEPTIDOGLICANO DE BACTERIAS
GRAM-NEGATIVAS
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<141>
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<160> 2
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 24
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<212> ADN -
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<213> Haemophilus influenzae
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<400> 1
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<213> Haemophilus influenzae
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<400> 2
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Claims (13)
1. Un plásmido que contiene un promotor
estrechamente regulado, en el que dicho promotor está unido
operativamente a una secuencia de ADN aislada y purificada que
codifica una lipoproteína asociada a un peptidoglicano (LAP) de
bacterias gram-negativas, en el que el promotor es
un promotor inducible por arabinosa o un promotor T7.
2. El plásmido de la Reivindicación 1 en el que
la LAP es la proteína P6 de Haemophilus influenzae (H.
influenzae).
3. El plásmido de la Reivindicación 2 en el que
el plásmido se denomina pPX4020 o pPX4019 como se especifica en la
Fig. 1.
4. Una célula huésped bacteriana transformada,
transducida o transfectada con el plásmido de la Reivindicación
1.
5. Un procedimiento para producir una LAP
lipidada recombinante, que comprende transformar, transducir o
transfectar una célula huésped bacteriana con el plásmido de la
Reivindicación 1 y cultivar la célula huésped en condiciones que
permitan la expresión de dicha LAP recombinante en forma lipidada
por la célula huésped.
6. El procedimiento de la Reivindicación 5 en el
que la LAP es proteína P6 de H. influenzae.
7. El procedimiento de la Reivindicación 5 en el
que la LAP se usa en la preparación de composiciones antigénicas
para conferir protección a mamíferos contra enfermedades causadas
por las bacterias correspondientes
8. El procedimiento de la Reivindicación 7 en el
que la enfermedad está causada por H. influenzae.
9. El uso un plásmido de acuerdo con una
cualquiera de las Reivindicaciones 1-3 en la
fabricación de una composición antigénica que comprende una LAP
lipidada recombinante, en la que dicha composición antigénica
provoca una respuesta inmune protectora en un huésped mamífero.
10. El uso de la Reivindicación 9 en que la LAP
es la proteína P6 de H. influenzae.
11. El uso de la Reivindicación 9 que
adicionalmente comprende uno o más de un diluyente o portador.
12. El uso de la Reivindicación 9 que
adicionalmente comprende al menos un adyuvante.
13. El uso de la Reivindicación 12, en la que el
adyuvante se selecciona del grupo constituido al menos por
hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, Stimulon TM
QS-21, monofosforil lipido A
3-O-desacetilado,
IL-12, toxina termoestable de E.coli, y la
toxina del cólera de tipo silvestre o mutante.
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