JP3023089B2 - インフルエンザ菌用ワクチンおよび診断法 - Google Patents

インフルエンザ菌用ワクチンおよび診断法

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Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】本発明は、インフルエンザ菌
（Haemophilus influenzae）の外膜と結合したタンパク
質およびペプチドの組成物および製造方法に関するもの
である。特に、本発明は、PBOMP-１およびＰＢＯＭＰ−
２を含む約１６００ダルトン分子量のｂ型および分類不
可能な外膜タンパク質のクラスに関連したタンパク質お
よびペプチドの組成物および製造方法を目的とするもの
である。このタンパク質およびペプチドは、能動免疫法
用および受動免疫法において使用される抗体の発生用の
ワクチン配合物中の免疫抗原としておよび診断法におけ
る薬剤として使用される。 【０００２】このタンパク質およびペプチドは、インフ
ルエンザ菌から新規な改良された精製法により得られる
か、あるいは組換えＤＮＡ法または化学的な合成法によ
り製造できる。また、本発明は、タンパク質およびペプ
チドに関連したＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２の
発現用に有用な、新規なＤＮＡ配列およびベクターに関
するものである。ヌクレオチド配列は、核酸ハイブリダ
イゼーション法における試薬として使用される。 【０００３】 【従来の技術】１. 組換えＤＮＡ技術および遺伝子発現 組換えＤＮＡ技術は、特異ＤＮＡ配列のＤＮＡベヒクル
（ベクター）内への挿入を伴い宿主細胞中に複写し得る
組換えＤＮＡ分子を形成する。一般的には、組換えＤＮ
Ａ配列は受領ＤＮＡベヒクルと異質である。すなわち挿
入DNA 配列とＤＮＡベクターは、遺伝子性情報を全く変
換しない生物から誘導されるかあるいはＤＮＡ配列が完
全にあるいは部分的に合成され得る。いくつかの組換え
ＤＮＡ分子の構造を可能にする一般的方法が開発されて
いる。例えば、コーヘンおよびボイヤー（ Cohen and B
oyer）の米国特許第４，２３７，２２４号は、制限酵素
での分裂のプロセスを用い公知の結紮の方法によりリゲ
ージを結合する該組換えプラスミドの産生を記載してい
る。これらの組換えプラスミドをついで転換により導入
し組繊倍地にて生長した原核生物および真核生物細胞を
含む単一細胞培養液に複写する。この特許に記載の技術
の一般的適用性のため米国特許第４，２３７，２２４号
をここに本明細に関連として取り入れる。 【０００４】単一細胞生物中に組換えＤＮＡ分子を導入
する他の方法は、コリンズおよびホーン（Collins and
Hohn）による米国特許第４，３０４，８６３号に記載さ
れておりこれも関連として本明細書に取り入れる。この
方法は、バクテリオファージベクター（コスミド）での
パーケージング／形質導入システムを利用する。組換え
遺伝子をまた、ワクシニアウィルス等のウィルス中にも
導入する。組換えウィルスは、ウィルスで感染された細
胞内へのプラスミドのトランスフェクションにより発生
することができる。 【０００５】組立てに使用する方法に関係なく、組換え
ＤＮＡ分子は、宿主細胞と適合性でなければならない。
すなわち宿主細胞に自律性複写できるかあるいは、宿主
細胞染色体に安定に一体化されることができるかであ
る。組換えＤＮＡ分子またはウィルス（例えばワクシニ
アウィルス組換体）はまた、所望の組換えＤＮＡ分子ま
たはウィルスの選択を許めるマーカー作用を有すべきで
ある。加えて、好ましい複写、転写および翻訳シグナル
のすべてが正確に組換えＤＮＡ上に配列された場合、異
質細胞は、バクテリア発現プラスミドの場合よくあるこ
とだが転換バクテリア細胞においてまたは、複写の真核
源（origin）をもたらす組換えウィルスまたは組換えプ
ラスミドで感染した任意の細胞系において適切に発現す
る。 【０００６】異質遺伝子シグナルおよびプロセスエベン
トは、遺伝子発現の多くのレベル、例えば、ＤＮＡ転写
およびメッセンジャーＲＮＡ（ mＲＮＡ）翻訳をコント
ロールする。DNA の転写は、ＲＮＡポリメラーゼの結合
を導くことによって mＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列
であるプロモーターの存在に依存する。真核プロモータ
ーのＤＮＡ配列は、原核プロモーターのものと異なる。
さらにまた、真核プロモーターおよび付随遺伝子シグナ
ルは、原核システムに認識されないかまたは作用せず、
さらに原核プロモーターは、真核細胞に認識されず作用
しない。 【０００７】同様に原核生物における mＲＮＡの翻訳
は、真核生物のものとは異なる適切な原核シグナルの存
在に依存する。原核生物における効果的な翻訳は、 mＲ
ＮＡ上のシャイン−ダルガルノ（Shine-Dalgarno）（Ｓ
Ｄ）配列と呼ばれるリボソーム結合部位を必要とする。
この配列は、開始コドンの前に配置される、一般にはタ
ンパク質のアミノ末端メチオニンをコード化するＡＵＧ
である、 mＲＮＡの短かいヌクレオチド配列である。こ
のＳＤ配列は、１６Ｓ rＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）の
３’末端に相補性でありまたおそらく rＲＮＡで二重化
する(duplexing）ことによりリボソームに mＲＮＡを結
合するのを促進しリボソームを正確に配置する。遺伝子
発現の最大化に対するレビューに関して、ロバーツおよ
びラウアー（Roberts and Lauer １９７９，Methsds in
Enzymology ６８：４７３）参照のこと。 【０００８】適当なシグナルが挿入され適切に配置され
た後でさえも、多くの他の因子は、原核生物における異
質遺伝子の発現を複雑化する。このような因子の１つと
してエシェリキアコリ（Ｅ．Ｃoli ）および他の微生物
における活性タンパク分解性システムの存在がある。こ
のタンパク質退化システムは、選択的に「異常」または
異質タンパク質を破壊するらしい。従って原核退化から
微生物に発現される原核タンパク質を保護する手段の発
展により多大な利用がもたらされる。ひとつの方策とし
て、異質配列を原核遺伝子で相に（すなわち正確な読取
り枠に）結紮するハイブリッド遺伝子を構成することが
ある。このハイブリッド遺伝子の発現は、融合タンパク
質産生物（原核および異質アミノ酸配列のハイブリッド
であるタンパク質）をもたらす。 【０００９】クローン遺伝子の首尾よい発現は、効率的
なＤＮＡの転写、 mＲＮＡの翻訳および数例においては
タンパク質の翻訳後変性を必要とする。発現ベクターを
好適な宿主における遺伝子を発現するためおよびタンパ
ク質産生を増加するために用いられている。クローン遺
伝子は、転写を必要の際始めることができるようコント
ロール可能な強力なプロモーターの次に配置される。細
胞を高密度に成長することができ、ついでプロモーター
を誘導して多数の転写を増加することができる。これは
効率的に翻訳される場合、高収率のタンパク質をもたら
すであろう。このことは、異質タンパク質が宿主細胞に
有害である場合特に有効なシステムである。 【００１０】１．１ 発現に関する宿主システムとして
のエシェリキアコリ エシェリキアコリに共通に用いるほとんどのプラスミド
クローニングベクターは、ＣolＥ１タイプリプリコンの
誘導体である［付加的情報に関しては、オカら（Oka et
al.，１９７９，Mol.Genet.１７２：１５１−１５９）
を参照のこと］。ＣolＥ１プラスミドは、１染色体につ
き約１５〜２０コピーのコピー数を有する単量性分子と
してエシェキアコリ菌株に安定に保持される。種々のレ
ベルのプラスミド中に挿入された異質遺伝子のヒトおよ
び動物タンパク質産生物の発現を得ている。しかしなが
ら高発現レベルを異質タンパク質産生物の産生を経済的
に実行可能になるためシステムに対して適切に得るべき
である。 【００１１】多量のある遺伝子産生物を得る１つの方法
として細菌細胞中で非常に高いコピー数を有するプラス
ミド上に遺伝子をクローンすることがある。理論上は、
特定遺伝子のコピー数を増加することによって組換えウ
ィルスの増加産生を導く mＲＮＡレベルも増加する。 【００１２】１．２ 発現ベクターとしてのワクシニア
ウィルス ワクシニアウィルスをクローニングまたは発現ベクター
として用いることができる。該ウィルスは、感染細胞の
細胞形質内で転写する１８７kb程度の線状二重線維ゲノ
ムを含有する。これらのウィルスは、ウィルス感染性に
必要なウィルスコア内で完全な転写酵素システム（覆罩
capping)，メチル化およびポリアデニル化酵素を含む）
を含有する。ワクシニアウィルス規制配列は、ワクシニ
アＲＮＡポリマラーゼによる転写の開始に関しては許め
るが真核ＲＮＡポリマラーゼによるものは許めない。 【００１３】組換えウィルスにおける異質遺伝子の発現
は、異質遺伝子をコードするタンパク質へのワクシニア
プロモーターの融合を必要とする。挿入ベクターとも呼
ばれるプラスミドベクターは、ワクシニアウィルス内に
キメラ遺伝子を挿入するように構成されている。１つの
タイプの挿入ベクターは、（１）転写開始部位を含むワ
クシニアウィルスプロモーター；（２）異質ＤＮＡフラ
グメントの挿入に関する転写開始部位から下側のいくつ
かの唯一の制限酵素エンドヌクレアーゼクローニング部
位；（３）ウィルスゲノムの相同性非本質的領域にキメ
ラ遺伝子の挿入を導くプロモーターおよびクローニング
部位の側面にある非本質的ワクシニアウィルスＤＮＡ
（例えばＴＫ遺伝子等）；および（４）エシェリキアコ
リにおける複製および選択に関する複製および抗生レジ
スタンスマーカーの細菌源から構成される。このような
ベクターの例は、マックケット（Mackett) （１９８
４，J.Virol.４９：８５７−８６４）に記載されてい
る。 【００１４】組換えウィルスは、ワクシニアウィルスで
感染された細胞内への異質遺伝子を含む組換え挿入プラ
スミドのトランスフェクションによって産生される。相
同性組換は、感染細胞内で生じウィルスゲノムへの異質
遺伝子の挿入をもたらす。組換えウィルスをスクリーン
することができ続いて免疫学的技術、ＤＮＡプラークハ
イブリダイゼーションまたは遺伝子選択を用いて単離す
ることができる。これらのワクシニア組換体は、その根
本的機能あるいは感染性を保有できかつ３５kd程度の異
質ＤＮＡを受け入れるように構成されることができる。 【００１５】異質遺伝子の発現は、酵素的または免疫学
的検定法［例えば、免疫沈降法、酵素結合免疫吸着剤検
定法（ELISA)、ラジオイムノアッセイまたはイムノブロ
ッティング］により決定される。加えて、組換ワクシニ
ア感染細胞から産生される自然発生的糖タンパク質は、
グルコシル化され細胞表面に移送され得る。高発現レベ
ルを適当なベクターまたは好適な宿主における強力なプ
ロモーターまたは単一遺伝子のクローニング多発性コピ
ーを用いて得ることができる。 【００１６】１．３ 発現ベクターとしてのバキュロウ
ィルス オートグラフィカカリフォルニカ（Autographi
ca californica) 核発汗症ウィルス（Ａ cＮＰＶ）のよ
うなバキュロウィルス（baculovirus)もまた、クローニ
ングまたは発現ベクターとして用いることができる。Ａ
cＮＰＶからの感染性は、ウィルス閉塞に通常見い出さ
れる。この構造は、ウィルス粒子がぎっしり取り込まれ
たポリヘドリン（polyhedrin）ペプチドより主に構成さ
れる。ポリヘドリン遺伝子発現は、感染サイクルの非常
に後期、成熟ウィルス粒子が形成された後に生じる。従
ってポリヘドリン遺伝子発現は、不要な機能である。す
なわちポリヘドリン遺伝子発現の不存在下産生された未
閉塞ウィルス粒子が十分に活性でありまた培地中の細胞
を感染することができる。スミスら（Smith et al,.)に
よる欧州特許出願シリーズ番号第８４１０５８４１．５
によると、組換えバキュロウィルス発現ベクターは、バ
キュロウィルスＤＮＡを分裂してポリヘドリン遺伝子ま
たはそのタンパク質からなるフラグメントを産生し該フ
ラグメントをクローニングベヒクル内に挿入した後、ポ
リヒドリン遺伝子プロモーターのコントロール下である
ように発現された遺伝子を挿入することによって調製さ
れる。この方法にて形成された組換え転移ベクターをバ
キュロウィルスヘルパーＤＮＡと混合し培養液中の昆虫
細胞をトランスフェクションするのに使用しバキュロウ
ィルスゲノムのポリヒドリン遺伝子位置で選択遺伝子の
組換え並びに取り込みを行う。得られた組換えバキュロ
ウィルスで被感染性昆虫または培養昆虫細胞を感染する
のに用いる。 【００１７】２．ヘモフィルス（Hemophilus）インフル
エンザおよび疾病 ヘモフィルスインフルエンザ（Ｈ．インフルエンザ）
は、２つのグループ分けられる。公知のカプセルを有す
るこれらの菌株を関連抗血清とカプセルの血清学的反応
によって定型化する。タイプａ〜ｆは既に同定されてい
る。いずれの関連抗血清とも反応しない菌株は、分類不
能として知られている。 【００１８】Ｈ．インフルエンザタイプｂ（Ｈi ｂ）
は、アメリカ合衆国において新生児の髄膜炎および他の
侵略的感染の最も多発する症例である。［フレーザーら
（Fraser et al., １９７４，Am.J.Epidemiol．１０
０：２９−３４）］。幼児髄膜炎は、主に１〜５才の間
に発生する。Ｈi ｂによるこれらの髄膜炎の６０％が２
才未満の幼児に発生する（フレーザーら，前述）。 【００１９】分類不能Ｈ．インフルエンザ（Ｈi ）もま
た、成人における肺炎、菌血症、髄膜炎、産後の敗血症
および急性発熱性気管気管支炎等の症病を引き起こすこ
とが現在十分に確立されている［マーフィーら（Murphy
et al.,１９８５，J.Infect．Diseases１５２：１３０
０−１３０７）］。タイプ別け不能Ｈ．インフルエンザ
は、全中耳炎症例の約 ２０〜４０％を引き起こす幼児
および若年成人における中耳炎の頻発病因因子である。
幼児は、感染が長期持続性免疫を与えないので同一生物
による種々の感染を受けるであろう。慢性または反復性
中耳炎に対する現在の治療法として抗生物または内耳を
からにするための管の挿入がある。Ｈi菌株はまた、洞
炎の主要病例として挙げられる［チェリー ジェイ．デ
ィー．およびジェイ．ピー．ダドレイ，（Cherry J.D.a
nd J.P.Dudley,１９８１，in Textbook ofPediatric In
fections Disease,Feigin and Cherry eds.,pp１０３−
１０５）］。加えて、分類不能Ｈi は、新生児の敗血症
を引き起こす。 【００２０】ポリリボシルリビトールホスフェート（Ｐ
ＲＰ）からなる分類ｂＨ．インフルエンザ（Ｈi ｂ）の
カプセル性ポリサッカライドに対して産生する抗血清
は、Ｈi ｂに対して殺菌性または保護性であることが示
されている［スミスら（Smithet al.，１９７３，Pedia
trics５２：６３７− ６４４）；アンダーソンら（And
erson,et al.,１９７２，J.Clin.Inv．５１：３１−３
８）］。抗ＰＲＰ抗体は、分類不能Ｈ．インフルエンザ
に対して有効性でない。 【００２１】３．Ｈ．インフルエンザに対するワクチン ヘモフィルスワクチンへの理想的候補は、３つの性質を
有するであろう。すなわち（ａ）２〜６ヶ月の幼児に免
疫原性であること、（ｂ）分類可能および不能Ｈ．イン
フルエンザによって引き起こされた感染に対して保護す
る抗体を引き出すことおよび（ｃ）Ｈ．インフルエンザ
菌株の表面に見い出される決定因子に対する抗体を引き
出すことである。 【００２２】Ｈi ｂ感染に対して保護する現在利用され
るワクチンは、主にＰＲＰ、分類ｂカプセル性ポリサッ
カライドからなる。精製ＰＲＰポリサッカライドは、年
齢１８ヶ月以上の幼児には免疫原性であるが１８ヶ月未
満の幼児においては保護抗体応答を引き出さない。一般
に、ポリサッカライドは、年齢１８ヶ月未満の幼児には
免疫原性が乏しいことが示されている。 【００２３】この問題に向けると、種々の研究所は、Ｐ
ＲＰをタンパク質キャリヤー分子に化学的に結合させる
［アンダーソンら（Anderson et al.,１９８５，Ped.Re
s.１８：２５２A)］またはタンパク質分子と混合する
［モンジーら（Monji etal,.１９８６，Infect.Immun．
５１：８６５−８６７）］かのいずれかを研究し始めて
おり、動物またはヒトに投与されている。タンパク質へ
のＰＲＰの接合は、６ヶ月程度のヒト幼児におけて抗Ｐ
ＲＰ抗体応答を引き出すことが示されており一方ＰＲＰ
のタン白質との混合は、幼年動物における抗ＰＲＰ抗体
を産生している（モンジーら、前述）。 接合または混
合ワクチン処方がＰＲＰワクチンの１つの困難、すなわ
ち１８ヶ月未満の幼児を保護することが不可能であるこ
とに目を向けられているが、これらは、ＰＲＰワクチン
の他の主要な問題に目を向けていない。抗ＰＲＰ抗体
は、ＰＲＰカプセルの明確さが欠ける分類不能Ｈ．イン
フルエンザに対して有効でない。従って、分類ｂおよび
分類不能Ｈ．インフルエンザを含む両方の分類に対して
１８ヶ月以下の幼児において保護免疫応答を引き出す
ワクチンを確立する必要が望まれていた。 【００２４】 【発明が解決しようとする課題】本発明の１つの目的
は、６ヶ月以下の子供における並びに６ヶ月以上の子供
および成人における分類ｂおよび分類可能Ｈ．インフル
エンザを含むＨ．インフルエンザに対する保護的免疫応
答を引き出すワクチン処方を提供することにある。本発
明のアプローチは、ヘモフィルスの表面上に露出される
タンパク質または、そのフラグメントでワクチン化する
ことである。最適の候補は、Ｈ．インフルエンザの外膜
タンパク質（ＯＭＰ）である。外膜タンパク質は、通常
表面露出分子である。これらは、幼児において通常免疫
原性であるタンパク質より成り、他の細菌系において保
護抗体を引き出すことができることが示されている［ス
ガサワラら（Sugasawara et al.,１９８３，Infect.Imm
un．４２： ９８０−９８５）］。 【００２５】加えてＨi およびＨi ｂ菌株は、同様なＯ
ＭＰ外形を有することが示されている［ロエブおよびス
ミス（Loeb andSmith,１９８０，Infect.Immun．３０：
７０９−７１７)]。ヘモフィルスのＯＭＰへの抗体は、
抗ＰＲＰがＨi ｂに対して殺菌性およびオプソニンであ
ることが示されている［アンダーソンら（Anderson et
al.,１９７２，J.Clin. Invest. ５１：３１−３８）；
キャテスら（Cates et., al.,１９８５，Infect．Immu
n.４８：１８３−１８９）］と同程度に殺菌性ならびに
オプソニンであり得る。外膜タンパク質は、Ｈi および
Ｈi ｂに共通であるという不加的利益を有しかつ両タイ
プの細菌に対して保護し得る。 【００２６】 【課題を解決するための手段】本発明は、出願人により
同定され「プラクシス・バイオロジクス・アウター・メ
ンブラン・プロテイン−１」 （“Praxis Biologics O
uter Membrane Protein −１”）（ＰＢＯＭＰ−１）と
命名した分子量約１６，０００ダルトンのヘモフィルス
インフルエンザの外膜タンパク質に関するおよびこれも
また出願人により同定され「プラクシス・バイロジクス
・アウター・メンブラン・プロテイン２」（ＰＢＯＭＰ
−２）と命名した分子量約１６，０００ダルトンのヘモ
フィルスインフルエンザの外膜タンパク質に抗原的に関
連するペプチドおよびタンパク質並びに該ペプチドおよ
びタンパク質をコード化する分子的にクローンされた遺
伝子または遺伝子フラグメントを導くものである。本発
明はまた、新規の改良された方法を用いてＨ．インフル
エンザから得られる実際的に純粋なＰＢＯＭＰ−１を導
くものである。本発明のペプチドまたはタンパク質は、
Ｈ．インフルエンザ用ワクチン処方における免疫原とし
てまたはＨ．インフルエンザに対する診断的検定におけ
る指薬として用いることができる。 【００２７】本発明はまた、ＰＢＯＭＰ−１およびＰＢ
ＯＭＰ−２関連ペプチドをコード化する遺伝子または遺
伝子フラグメントの分子クローニングする方法を導くも
のである。該分子的クローン配列をついでコード化ペプ
チドに関する発現ベクターを含む組換えＤＮＡ技術によ
り他のベクターの別の構造にまたは核酸ハイブリダイゼ
ーションに基づくＨ．インフルエンザに対する診断的検
定に用いるＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２を得る
のに用いる。 【００２８】本発明のペプチドまたはタンパク質は、
Ｈ．インフルエンザから純化されるか、いずれかのベク
ター宿主系における組換えＤＮＡ技術を用いて産生され
るかあるいは化学的方法により合成される。従って、本
発明はまた、ペプチドおよびタンパク質が純化され得る
適当な宿主細胞におけるＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭ
Ｐ−２関連ペプチドまたはタンパク質を導くのに用いら
れる新規のプラスミドＤＮＡまたはヒトウィルス、動物
ウィルス、昆虫ウィルスまたはバクテリオファージを含
むウィルス性ＤＮＡの構成体を導くものである。ＰＢＯ
ＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２関連ペプチドおよびタン
パク質の化学的合成を記載する。 【００２９】ＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２関連
ペプチドおよびタンパク質を分類ｂおよび分類不能Ｈ．
インフルエンザの両分類を含む全病理学的Ｈ．インフル
エンザに対して用いるサブユニットワクチン処方におけ
る免疫原として用いることができる。サブユニットワク
チン調製用ＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２関連タ
ンパク質またはペプチドを化学的合成、Ｈ．インフルエ
ンザからの純化または組換え発現ベクターからの純化に
より得ることができる。別に、ＰＢＯＭＰ−１またはＰ
ＢＯＭＰ−２関連ペプチドおよびタンパク質自身を産生
する組換えウィルスまたは、該組換えウィルスで感染さ
れた細胞の抽出物をウィルスワクチン処方における免疫
原として用いることができる。このようなＰＢＯＭＰ−
１またはＰＢＯＭＰ−２タンパク質は、宿主動物におい
て「異質」として認定されるであろうからＰＢＯＭＰ−
１またはＰＢＯＭＰ−２に対して導かれる体液のおよび
おそらく細胞媒介免疫応答を導く。適切に調合されたワ
クチンにおいては、連続的Ｈ．インフルエンザ感染に対
して保護すべきである。さらに本サブユニットワクチン
処方は、現在有効なＰＲＰワクチンと適合性である。 【００３０】本発明のＰＢＯＭＰ−１関連および／また
はＰＢＯＭＰ−２関連配列は、ヒト医学的検定に用いる
ことができる。これらは、血液検体、体液および組繊等
におけるＨ．インフルエンザの決定用診断器具として有
効なＥＬＩＳＡ試験およびラジオイムノアッセイ等の免
疫検定における試薬としての本発明のペプチドおよびタ
ンパク質の使用を含む。ＰＢＯＭＰ−１コード化および
／またはＰＢＯＭＰ−２コード化遺伝子配列をＨ．イン
フルエンザの同様な診断的検査に対するＤＮＡ−ＤＮＡ
またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションに用いる
ことができる。加えて、これらの試薬は、Ｈ．インフル
エンザの病因のメカニズムを引き出すのに有効な器具を
提供する。 【００３１】さらに、本発明は、受動免疫摂生および診
断免疫検定に有いる抗ＰＢＯＭＰ−１および／またはＰ
ＢＯＭＰ−２モノクローナル抗体を導く。本発明を以下
の発明の実施の形態および特定の実施態様である実施例
並びに添附図面を参照することにより十分に理解するこ
とができる。 【００３２】 【発明の実施の形態】５．発明の詳細な説明 本発明は、分子量１６，０００ダルトン程度のＨ．イン
フルエンザ外膜タンパク質のエピトープに関連するタン
パク質またはペプチドすなわちＰＢＯＭＰ−１および分
子量１６，０００ダルトン程度のＨ．インフルエンザ外
膜タンパク質関連のものすなわちＰＢＯＭＰ−２を導
く。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて決定されるとおりの明ら
かな分子量は、いずれの翻訳後変質（例えば脂肪アシル
化およびアセチル化等）を含む総分子量の成熟（すなわ
ちタンパク分解性加工された）形態を表わす。本発明の
タンパク質およびペプチドを組換えＤＮＡ方法によりあ
るいは化学的合成により産生することができる。補足的
に、本発明のタンパク質またはペプチドを単離および純
化の新規かつ改良された方法を用いてＨ．インフルエン
ザの培養液から実質的に純粋な形態にて得ることができ
る。Ｈ．インフルエンザのエピトープを特定するＰＢＯ
ＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２のタンパク質並びにペプ
チドをＨ．インフルエンザ細菌性髄膜炎、中耳炎、喉頭
蓋炎、および肺炎等の病因因子での感染に対して保護す
る種々のワクチン処方における免疫原として用いること
ができる。該ワクチン処方は、ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅおよ
びｆ型を含む分類可能Ｈ．インフルエンザ菌株と分類不
能Ｈ．インフルエンザ菌株の両者に対して有効である。 【００３３】さらに、本発明は、ＰＢＯＭＰ−１および
ＰＢＯＭＰ−２をコード化する遺伝子のヌクレオチド配
列並びにPBOMP-１およびＰＢＯＭＰ−２およびそのポリ
ペプチドフラグメントのアミノ酸配列に関する。本発明
のある実施態様によると、組換ＤＮＡ技術を ＰＢＯ
ＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２エピトープをコード化す
るヌクレオチド配列を好適なホスト細胞において該配列
の制限を導く制限ベクター内に挿入するのに用いる。該
制限ベクター宿主細胞系をＰＢＯＭＰ−１およびPBOMP-
２並びに関連タンパク質およびペプチドを産生するのに
用いることができる。遺伝子産生物を培養液中の細胞か
ら純化することができサブユニットワクチン処方におけ
る免疫原として用いることができる。必要により、ＰＢ
ＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２タンパク質およびペプ
チドのアミノ酸配列を（１）本明細書で教示されるとお
りＨ．インフルエンザから単離される実質的に純粋なタ
ンパク質または（２）免疫原性ＰＢＯＭＰ−１またはＰ
ＢＯＭＰ関連タンパク質およびペプチドを発現する組換
体に含まれるＨ．インフルエンザヌクレオチド配列のい
ずれかから推定できる。このれらのタンパク質およびペ
プチドをついで化学的に合成し、合成サブユニットワク
チン処方に用いる。 【００３４】ＰＢＯＭＰ−１および／またはＰＢＯＭＰ
−２配列を発現する発現ベクターが組換えウィルスであ
る際に、ウィルスそれ自身をワクチンとして用いること
ができる。PBOMP-１および／またはＰＢＯＭＰ−２タン
パク質およびペプチドを発現しかつ宿主において疾病を
引き起こさない感染性組換えウィルスを生ウィルスワク
チン調合に用いて実質的免疫性を提供することができ
る。他に、不活性ウィルスワクチンをＰＢＯＭＰ−１お
よび／またはＰＢＯＭＰ−２タンパク質およびペプチド
を発現する「殺された」組換えワクチンを用いて調合す
ることができる。 【００３５】さらに、本発明は、ＰＢＯＭＰ−１および
／またはＰＢＯＭＰ−２に対する多価抗血清およびモノ
クローナル抗体並びに受動免疫用該免疫グロブリンの使
用方法およびＨ．インフルエンザに対する診断的検定を
導く。説明するために、本発明の方法を以下の段階に分
けることができる。（１）ＰＢＯＭＰ−１タンパク質の
単離および純化；（２）ＰＢＯＭＰ−１の部分的アミノ
配列化；（３）制限ベクター内への遺伝子または遺伝子
フラグメントの挿入を含むＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯ
ＭＰ−２をコード化する遺伝子および遺伝子フラグメン
トの分子クローニングおよび組換え遺伝子産生物の純
化；（４）PBOMP-１およびＰＢＯＭＰ−２をコード化す
る遺伝子のヌクレオチド配列化；および（５）純化およ
び組換えタンパク質およびペプチド産生物に対する抗体
の産生によるＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２タン
パク質および関連タンパク質の免疫潜在能の決定。さら
に、該方法は、（６）ワクチンの処方および（７）体液
試料におけるＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２遺伝
子または遺伝子産生物（および従ってＨ．インフルエン
ザ）の検査のための診断的検定を含む。 【００３６】５．１．ＰＢＯＭＰ−１の単離および純化 Ｈ．インフルエンザｂイアガン（Eagan)およびＨ．イン
フルエンザの他の菌株において、外膜タンパク質PBOMP-
１を外膜細胞壁複合体と結合する。ＰＢＯＭＰ−１の純
化における必要段階は、外膜および細胞とかたく結合す
る外膜タンパク質を保持する結合の破壊である。これ
は、次の２段階、すなわち（１）Ｈ．インフルエンザの
物理的に破壊された細胞からＰＢＯＭＰ−１豊富不溶性
細胞膜フラクションを単離し、ついで（２）ヒトへの投
与に好適な洗浄剤の存在下加熱または洗浄剤の存在下ま
たは不存在化のいずれかにてリソチームで細胞壁フラク
ションを消化することにより細胞壁フラクションからＰ
ＢＯＭＰ−１を可溶化する段階からなる本発明の新規か
つ改良された方法により達成される。 【００３７】本発明の新規改良方法は重要なエピトープ
を破壊し得、かつヒトへの投与のためのワクチン用の好
ましくない成分であるドデシル硫酸ナトリウムおよび２
−メルカプトエタノール等の変質剤および還元剤の使用
［マンソンら（Munson et al.,１９８４，Infect.Immu
n．４９：５４４−４９）］を避ける。 【００３８】５．１．１ Ｈ．インフルエンザからのＰ
ＢＯＭＰ−１豊富不溶性細胞膜物質の単離 総細胞膜フラクションをこれに限定されないがフレンチ
プレス他均質化装置からの排除による音波振とう（soni
cation）および紛粋を含むＨ．インフルエンザの破壊に
伴う特異性沈降により得ることができる。さらに、総膜
フラクションを密度勾配沈降法またはトリトンＸ-100
（商標）またはＮ−ラウロイルサルコシン、ナトリウム
塩（サルコシル）等の一定の洗浄剤で内膜の特異的可溶
化により内外膜に分割することができる。外膜は、好ま
しくは、１％（w/v)サルコシル１０mMヘペス（ＨＥＰＥ
Ｓ）NaOH，pH７．４溶液中の内膜の特異的可溶化により
調製される。ＰＢＯＭＰ−１の豊富なサブフラクション
を他の細胞膜の特異的洗浄抽出により調製することがで
きる。この豊富化は、例えば、１％オクチルグルコシド
ノニルグルコシド、シィータージェント（Zwittergent)
３−１４（商標）またはシィータージェント３−１４
（商標）で（前述のごとくトリトンＸ１００（商標）ま
たは、サルコシル抽出後に、残る）外膜−細胞壁複合体
を連続抽出しつづいて１％サルコシルでの不溶性物質の
抽出を行い、ついで遠心分離してＰＢＯＭＰ−１豊富不
溶性物質を単離することにより達成される。 【００３９】５．１．２ ＰＢＯＭＰ−１豊富不溶性細
胞膜物質の可溶化 外膜−細胞壁複合体からのＰＢＯＭＰ−１の可溶化は、
以下のアプローチ、すなわち（１）ＰＢＯＭＰ−１を限
定されないがトリトンＸ−１００（商標）、ツィーン８
０、ＣＨＡＰＳ，ＣＨＡＰＳＯ，ドデシルマルトシド、
シィータージェント３−１４（商標）およびシィーター
ジェント３−１６（商標）を含む洗浄剤の１種またはい
くつかの洗浄剤のいずれかの組合せで１時間５５〜６０
℃でＰＢＯＭ−１豊富フラクションの抽出により可溶化
することができる；（２）ＰＢＯＭ−１を洗浄剤の存在
または不在のいずれかの下、リソチームでＰＢＯＭＰ−
１豊富フラクションにおける細胞壁の破壊により可溶化
することができるということの１つまたはその組合せを
用いていくつかの異なる方で達成され得る。好ましい実
施態様によると洗浄剤は、デオキシコールエートおよび
ポリエトキシレートソルビタンモノオレエート（ツィー
ン８０）から選ばれる。 【００４０】代わりに、ＰＢＯＭＰ−１をこれに限定す
るものではないがトリトンＸ−１００（商標）、サルコ
シル、オクチルグルコシド、ノニルグルコシド、シィー
タージェント３−１４（商標）またはシィータージェン
ト３−１６（商標）等の洗浄剤の１種あるいは組合せで
全Ｈ．インフルエンザ細胞、外膜またはそのサブフラク
ションを抽出することによって単離することができる。
この抽出を好適な緩衝系内にて５５〜６０℃または室温
で行うことができる。 【００４１】可溶化の後、さらにＰＢＯＭＰ−１の純化
を限定するものではないがイオン交換、分子ふるい、疎
水性または逆相クロマトグラフィー、アフィーニティー
クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、等電
点電気泳動および調製的電気泳動等の当該技術分野に公
知の標準方法により達成することができる。 【００４２】５．２．アミノ酸検定およびＰＢＯＭＰペ
プチドの配列化によるＰＢＯＭＰ−１の特性づけ Ｈ．インフルエンザから得られたＰＢＯＭＰ−１をペプ
チドフラグメントの部分的アミノ酸配列化とともにアミ
ノ酸検定で特定づけすることができる。純化タンパク質
におけるアミノ酸の破壊および／または変性を最小化す
るために、トリプタミン含有メタンスルホン酸中のＰＢ
ＯＭＰ−１を加水分解することが好ましい［シンプソン
ら（Simpson etal.,１９７０，J.Biol.Clem.２５１：１
９３６−４０）］。本発明の１つの実験的実施例におい
て、このようなアミノ酸検定を記載（第６．１．１節参
照）のとおり単離した新規ペプチドを特徴づけるために
ＰＢＯＭＰ−１のトリプシンペプチドフラグメントのア
ミノ酸配列化と組み合せた。ヘモフィルス外膜タンパク
質のＮ末端をブロックすることを提案したエドマンケミ
ストリー（Edman Chemistery）によりPBOMP-１を配列す
る初期企みの間困難を経験した。ブラウン（Braun)（１
９７０，Eur.J. Biochem１４：３８７−３９１）による
研究は、脂肪酸がエシェリキアコリのブラウンのリポタ
ンパク質のＮ末端システイン残基と結合することを示し
ている。パルミチル部位をＮ末端システインにアミノ結
合する。すなわち２つの付加的脂肪酸もまた、エシェリ
キアコリブラウンリポタンパク質におけるチオエーテル
結合を形成するグリセリル基をを介して同一システイン
残基に付着する（同上）。従って、Ｈ．インフルエンザ
から得られたＰＢＯＭＰ−１は、さらに、脂肪酸検定に
よっても特性づけされた。このような研究は、本発明の
外膜タンパク質およびＮ末端残基が脂肪酸残基を共有結
合していることを示した。本発明の１実験的実施例にお
いて、このような脂肪酸検定は、３つの主要脂肪酸すな
わちラウリン酸、パルミチン酸およびパルミチン酸誘導
体の存在を明らかにした。共有的に結合する脂肪酸部位
を有する本発明のアセチル化タンパク質およびペプチド
は、Ｈ．インフルエンザに対するワクチン処方に特別有
効であり得る。 【００４３】５．３．ＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ
−２をコード化する遺伝子または遺伝子フラグメントの
分子クローニング ５．３．１ ＰＢＯＭＰ−１および関連ＰＢＯＭＰ類を
コード化する遺伝子の単離 分子量（MW）１６，０００ダルトンのＯＭＰを全試験さ
れたＨ．インフルエンザ菌株（現在数百）においてドデ
シル硫酸ナトリウム電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およ
びウエスタンブロット検定の両方で検定した。モノクロ
ーナル抗体データは、このタンパク質が非常に保護され
ることを示す［マーフィーら（Murphy et al.,１９８
６，Infect．Immun.５４．７７４−４９）］。従って、
いずれのＨ．インフルエンザ菌株もＰＢＯＭＰ遺伝子源
として提供する。多くのＨ．インフルエンザが検出可能
プラスミドまたは誘導可能前期染色体を含有しないので
ＰＢＯＭＰ遺伝子は、おそらく染色体である。従って、
ＰＢＯＭＰ類をコード化するＤＮＡ配列のクローニング
における第１段階は、Ｈ．インフルエンザ染色体ＤＮＡ
からの該配列の単離である。以下、Ｈ．インフルエンザ
遺伝子をコード化するＤＮＡを「Ｈi ＤＮＡ」と呼びま
たＰＢＯＭＰ類をコード化するＤＮＡを「ＰＢＯＭＰ
ＤＮＡ」と呼ぶ。 【００４４】Ｈi ＤＮＡフラグメントを発生するため、
Ｈi ＤＮＡを種々の制限酵素を用いて特異部位で分裂す
ることができる。代わりに、ＤＮＡをフラグメント化す
るため低濃度のDNA アーゼＩを用いることができあるい
はＤＮＡを例えば音波振とうで物理的に分けることがで
きる。線状ＤＮＡをついで、これに限定されないがアガ
ロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動、カラム
クロマトグラフィー（例えば分子ふるいまたはイオン交
換クロマトグラフィー）またはショ糖勾配の速度沈降等
の標準技術により寸法に従って分離する。 【００４５】いずれかの制限酵素または制限酵素の組合
せを用いて ＤＮＡがＰＢＯＭＰ遺伝子産生物の免疫潜
在能を破壊しない条件でＰＢＯＭＰ含有Ｈi ＤＮＡフラ
グメントを発生する。例えば、タンパク質の抗原部位は
約７〜１４のアミノ酸からなることができる。従ってＰ
ＢＯＭＰペプチドの寸法のタンパク質は、分泌抗体部位
を有することができ従って多くの部分的ＰＢＯＭＰポリ
ペプチド遺伝子配列は、抗原部位に関してコードするこ
とができる。その結果、多くの制限酵素組合せは、好適
なベクター内に挿入された際、異なる抗原決定子からな
るＰＢＯＭＰ特定アミノ酸配列の産生を誘導することの
できるＤＮＡフラグメントを発生するのに用いられる。 【００４６】ひとたびＤＮＡフラグメントを発生する
と、ＰＢＯＭＰ遺伝子含有特定ＤＮＡフラグメントの同
定を数多くの方法で達成することができる。ＰＢＯＭＰ
遺伝子含有ＤＮＡ配列を合成オリゴヌクレオチドプロー
ブとのＨiＤＮＡフラグメントのハイブリダイゼーショ
ンにより同定することができる。余剰合成オリゴヌクレ
オチドプローブは、ＰＢＯＭＰタンパク質のペプチドフ
ラグメントのアミノ酸配列に基づいて抗生される。例え
ば、合成オリゴヌクレオチドプローブを第５．１節に記
載のＨ．インフルエンザから単離された実質的に純粋な
ＰＢＯＭＰ−１タンパク質のアミノ酸配列に基づいて
合成される。これらの合成プローブを32Ｐ−アデノシン
トリホスフェートで放射線標識することができＰＢＯＭ
Ｐ特異遺伝子配列含有クローンに関するＨi ＤＮＡライ
ブラリーをスクリーンするのに用いることができる［ア
ンダーソンら（Anderson et al.,１９８３，Proc.Nat’
l Acad.Sci.USA８０：６８３８−４２）を参照のこ
と］。 【００４７】別にＰＢＯＭＰ遺伝子を「ショットガン」
アプローチでクローニングベクター内に挿入後同定およ
び単離することができる。当該技術分野に公知の数多く
のベクター−宿主系を用いることができる。ベクター系
は、プラスミドまたは変性ウィルスのいずれかであり得
る。好適なクローニングベクターとしては、これに限定
されないがラムダベクターシステムｇｔｌｌ，ｇｔＷＥ
Ｓ．ｔＢおよびカーロン（Charon）４等のウィルスベク
ター類および pＢＲ３２２， pＢＲ３２５， pＡＣＹＣ
１７７， pＡＣＹＣ１８４， pＵＣ８， pＵＣ９， pＵ
Ｃ１８， pＵＣ１９， pＬＧ３３９， pＲ２９０， p
ＫＣ３７および pＫＣ１０１等のプラスミドベクター類
および他の同様の系がある。ベクター系は、用いる宿主
細胞と適合性でなければならない。組換え分子を変換、
トランスフェクションまたは接種を経て細胞内に取り込
むことができる。 【００４８】ＰＢＯＭＰ遺伝子または遺伝子フラグメン
ト含有Ｈi ＤＮＡをクローニングベクター内に挿入し
かつ好適宿主細胞を転換するのに用いる際ＰＢＯＭＰ遺
伝子または遺伝子フラグメントの多数のコピーを発生す
ることができる。これは、相補性末端を有するクローニ
ングベクター内にＨi ＤＮＡフラグメントを結紮するこ
とによって達成される。しかしながら、相補性制限部位
が存在しない場合、ＤＮＡ分子の終点を変性する。この
ような変性として終点をブラントエンド結紮できるので
単線維ＤＮＡ末端を消化するかあるいは単線維ＤＮＡ末
端を満たすことによってブラントエンドを産生すること
を含む。代って、いずれかの所望部位をＤＮＡ末端上に
ヌクレオチド配列（リンカー）を結紮することによって
産生することができる。これらの結紮リンカーは、制限
部位認定配列をコード化する特定の化学的合成オリゴヌ
クレオチドから成ることができる。例えば、マニエーテ
ィス（Maniatis）のＤＮＡ変性方法（Maniatiset al.，
１９８２，Molecular Cloning,Cold Spring Harbor
Laboratory, pp.１０７−１１４を参照のこと）による
と、分割ＤＮＡを制限メチラーゼ（例えば、M.Eco RI）
で処置し、該酵素に関する制限部位をコード化する合成
ＤＮＡリンカーに結紮する。ＤＮＡを末端リンカーを
分裂する（しかしながら変性内部制限部位を分裂しな
い）制限エンドヌクレアーゼで処置し、好適なベクター
アームに結紮する。別法において、分裂ベクターおよび
ＰＢＯＮＰ ＤＮＡフラグメントをホモポリマー性後尾
づけ（tailing)で変性することができる。 【００４９】クローンＰＢＯＭＰ遺伝子の同定をベクタ
ーシステムにおけるＨi の染色体遺伝子バンクを確立し
これに限定されないがＰＢＯＭＰ類に対するポリクロー
ナルまたはモノクローナル抗体での特異反応等の本明細
書に記載のいずれかの方法のよりＰＢＯＭＰ−１または
ＰＢＯＭＰ−１関連タンパク質に関する個々のクローン
をスクリーニングすることによって達成することができ
る。 【００５０】５．３．２ 発現ベクター内へのＰＢＯＭ
Ｐ遺伝子の挿入 ＰＢＯＭＰ類またはそのタンパク質に関してコードする
ヌクレオチド配列を好適な発現ベクター、すなわち挿入
タンパク質コード配列の転写および翻訳に関する必須要
素を含有するベクター内に挿入する。種々の宿主−ベク
ター系をタンパク質コード化配列を発現するのに利用す
ることができる。主として、ベクター系は、使用宿主細
胞に適合性でなければならない。宿主−ベクター系とし
ては限定されないが次のものを含む。バクテリオファー
ジＤＮＡで転換した細菌；プラスミドＤＮＡまたはコス
ミドＤＮＡ；酵母ベクター含有酵母等の微生物；ウィル
ス（例えば、ワクシニアウィルスおよびアデノウィルス
等）で感染された哺乳類細胞系；およびウィルス（例え
ば、バキュロウィルス）で感染された昆虫細胞系があ
る。これらのベクターの発現要素は、その強さおよび特
異性で変化する。利用宿主−ベクターシステムにより、
数多くの好適な転写および翻訳要素のいずれか１つを用
いることができる。 【００５１】遺伝子（または遺伝子のタンパク質）の効
率的発現を得るために、プロモーターは発現ベクター内
に存在しなければならない。ＲＮＡポリマラーゼは、通
常プロモーターに結合し、遺伝子または遺伝子および規
制要素群（オペロンと呼ぶ）の転写を開始する。プロモ
ーターは、その「強さ」すなわち転写を促進する能力で
変化する。クローン遺伝子を発現するため高レベルの転
写を得るため、従って、遺伝子の発現を得るための強力
プロモーターを用いるのが望ましい。利用宿主細胞系に
もよるが、数多くの好適なプロモーターのいずれか１つ
を用いることができる。例えば、エシェリキアコリ、そ
のバクテリオファージまたはプラスミドにおいてクロー
ニングする際、 lacプロモーター、 trpプロモーター、
recＡプロモーター、リボソームＲＮＡプロモーター、
コリファージのＰR およびＰL プロモーターおよびこれ
に限定されないが lacＵＶ５， ompＦ， bla，lpp 等の
他のプロモーター等のプロモーターを高レベルの近接Ｄ
ＮＡ区域の転写を導くのに用いることができる。加え
て、組換えＤＮＡあるいは他の合成ＤＮＡ技術により産
生したハイブリッド trp− lacＵＶ５（ tac）プロモー
ターまたは他のエシェリキアコリプロモーターを挿入遺
伝子の転写を与えるのに用いることができる。 【００５２】特に誘導されない限りプロモーターの使用
を禁止する細菌宿主菌株および発現ベクターを選択する
ことができる。一定のオペロンにおいて特定のインデュ
ーサーの添加は、挿入ＤＮＡの効率的転写に必要であ
る。すなわち、例えば、 lacオペロンは、ラクトースま
たはＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−ベーター−Ｄ−ガラ
クトシド）により誘導される。 trp， pro等の種々のオ
ペロンは、異なる制御下である。 trpオペロンは、トリ
プトファンが生長倍地中不存在である際導かれ；またラ
ムダのＰL プロモーターは、感温ラムダリプレサー、例
えば、ｃＩ８５７含有宿主細胞における温度の上昇によ
り誘導される。この方法で９５％以上のプロモーター誘
導転写を未誘導細胞において禁止し得る。従って遺伝子
操作ＰＢＯＭＰタンパク質またはそのペプチドの発現を
制御することができる。これは、クローン遺伝子のタン
パク質産生物が宿主細胞に対して致命的または有害であ
る場合、重要である。このような場合、転移体は、プロ
モーターを誘導しない条件下培養され、また細胞が生長
培地において好適密度に達した際、プロモーターをタン
パク質の産生に関して導くことができる。 【００５３】このようなプロモーター／オペレータ系の
１つは、言わゆる「 tac」または trp− lacプロモータ
ー／オペレータシステムである［ラッセルおよびベネッ
ト（Russel and Bennet，１９８２，Gene２０：２３１
−２３４）；デボアー（DeBoer），１９８２年５月１８
日出願欧州特許願第 ６７，５４０号］。このハイブリ
ッドプロモーターは、 −３５b.p.（−３５領域）の t
rpプロモーターおよび−10b.p.（−１０領域またはプリ
ブナウボックス（Pribnow box)）の lacプロモーター
を結合することにより構成される（ＲＮＡポリマーラー
ゼ結合部位であるＤＮＡの配列。）トリプトファンプロ
モーターの強いプロモーター特性の維持に加えて、 tac
もまたlac レプレッサーで制御する。 【００５４】真核生物宿主細胞におけるクローニングの
際、強化配列（例えば、７２bpタンデン繰返しのＳＶ４
０ＤＮＡまたはレトロウィルス長末端繰り返しまたはＬ
ＴＲ等）を挿入して転写効率を増加することができる。
強化配列は、隣接遺伝子に関するその位置および方向に
比較的無関係な方法で転写効率を増加するらしい真核生
物ＤＮＡ要素の一組である。すぐに遺伝子に５’を配置
しなければならない古典的プロモーター要素（例えば、
ポリマラーゼ結合部位およびゴールドバーグ−オネス
（Goldberg Hogness）「ＴＡＴＡ」ボックス）とは違
い、強化配列は、真核生物遺伝子から上側、内部または
下側から作用する著しい能力を有しており、従って、挿
入遺伝子に関する強化配列の位置は、危険性が少ない。 【００５５】特定開始シグナルもまた、真核生物細胞に
おける効率的遺伝子転写および翻訳に必要である。これ
らの転写および翻訳開始シグナルは、遺伝子特異性メッ
センジャーＲＮＡおよび合成タンパク質の各々の量によ
り測定された「強さ」で変化する。プロモーターを含む
ＤＮＡ発現ベクターもまた種々の「強力な」転写および
／または翻訳シグナルのいずれの組合せを含む。例え
ば、エシェリキアコリにおける効率的翻訳は、リボソー
ム結合部位を与えるため開始コドン（ＡＴＧ）にシャイ
ン−ダルガルノ（Shine-Dalgarno）（ＳＤ）配列約７〜
９塩基５’を必要とする。従って、宿主細胞リボソーム
により利用し得るいずれかのＳＤ−ATG 組合せを利用で
きる。このような組合せとしてこれに限定されないがコ
リファージラムダの cro遺伝子またはＮ遺伝子からのま
たはエシェリキアコリトリプトファンＥ，Ｄ，Ｃ，Ｂま
たはＡ遺伝子からのＳＤ−ＡＴＧ組合せがある。付加的
に、組換えＤＮＡ技術または、合成ヌクレオチドの取り
込みに関与する他の技術により産生したいずれのＳＤ−
ＡＴＧ組合せも用いることができる。 【００５６】ベクター内へのＤＮＡフラグメントの挿入
に関して先に記載のいずれの方法もベクター内の特異部
位内へのプロモーターまたは他のコントロール要素を結
紮するのに利用できる。従ってＰＢＯＭＰタンパク質ま
たはペプチドに関してコードするＨ．インフルエンザ遺
伝子配列領域を含むＨ．インフルエンザ遺伝子配列を組
換えＤＮＡ分子が宿主細胞内に取り込まれた際に異質遺
伝子を宿主細胞で発現（すなわち転写または翻訳）でき
るためのベンタープロモーターおよびコントロール要素
に関して特異部位で制限ベクター内へ結紮することがで
きる。組換えＤＮＡ分子を転換、導入またはトランスフ
ェクション（ベクター／宿主細胞系による）により好適
な宿主細胞（これに限定されないが細菌、ウィルス、哺
乳類細胞等を含む）に取り込むことができる。転移体を
pＢＲ３２２における抗アンピシリン性または抗トラン
スシクリン性または真核生物宿主系におけるチミジンキ
ナーゼ活性等のベクターに通常存在する１種以上の好適
な遺伝子マーカーの発現に基づいて選択する。このよう
なマーカー遺伝子の発現は組換えＤＮＡが損われずかつ
複写することを示さなければならない。発現ベクター
は、マーカー機能を通常含むクローニングベクターから
誘導し得る。このようなクローニングベクターとしてこ
れに限定されないが以下のものがある。ＳＶ４０および
アデノウィルス、ワクシニアウィルス、バキュロウィル
ス等の昆虫ウィルス、酵母ベクター，ラムダgt−ＷＥＳ
−ラムダＢ，カーロン（Charon）２８，カーロン４Ａ，
ラムダgt−１−ラムダ ＢＣ，ラムダgt−１−ラムダ
Ｂ，Ｍ１３mp７，Ｍ１３mp８，Ｍ１３mp９等のバクテリ
オファージベクター、または pＢＲ３２２， pＡＣ１０
５， pＶＡ５１， pＡＣＹ 177， pＫＨ４７， pＡＣＹ
Ｃ１８４， pＵＢ１１０， pＭＢ９， pＢＲ３２５，Ｃ
olＥ１， pＳＣ１０１， pＢＲ３１３， pＭＬ２１，Ｒ
ＳＦ２１２４，pＣＲ１，ＲＰ４， pＢＲ３２８等のプ
ラスミドＤＮＡベクター等。 【００５７】接合を介してＨ．インフルエンザとエシェ
リキアコリの間の耐薬剤因子の転移［スタイ（Study,１
９７９，J.Bact．１３９：５２０−５２９）］；および
エシェリキアコリにおけるヘモフィルス染色体遺伝子の
翻訳［マン（Mann， １９７９，Plasmid ２：５０３−
５０５）］およびクローニング［マンら（Mann et al.,
１９８０,Gene ３：９７−１１２）］は、少なくともい
くつかの遺伝子が両生物において効率的に発現し得るこ
とを示し；また転写または翻訳コントロールの基礎メカ
ニズムが同様であり得ることを示す。 【００５８】本発明の実施例における特定の実施態様に
おいて、エシェリキアコリプラスミド系を発現ベクター
として選択した。しかしながら本発明は、このようなエ
シェリキアコリ発現ベクターの使用に限定されるもので
はない。遺伝子操作技術もまた、クローン遺伝子をさら
に特性づけおよび／または適合するのに使用し得た。例
えば、ＰＢＯＭＰタンパク質をコード化する遺伝子の変
異誘発を導く部位は、保護抗体応答の発生に応答性のタ
ンパク質の部位を同定するのに使用し得た。また、これ
は、例えば、タンパク質の可溶性を高めより容易に純化
するために保護領域外領域におけるタンパク質を変性す
るのに用いることができた。 【００５９】５．３．３．発現遺伝子産生物の同定およ
び純化異質遺伝子挿入物含有発現ベクターを以下の３つ
の一般的アプローチで同定し得る。（１）異質挿入遺伝
子と相同性である配列からなるプローブを用いるＤＮＡ
−ＤＮＡハイブリダイゼーション、（２）「マーカー」
遺伝子機能（例えば、耐抗生物質性、転換表現型、およ
びチミジンキナーゼ活性等）の存在または不存在；およ
び（３）遺伝子産生物の物理的、免疫学的または機能的
性質に基づく挿入配列の発現。 【００６０】ＰＢＯＭＰ遺伝子を発現する組換体を同定
すると、遺伝子産生物を検定すべきである。究極の目標
がワクチン処方におけるこのような産生物を発現するお
よび／または診断的免疫検定における抗原として遺伝子
産生物または組換えウィルスを使用することであるので
免疫学的検定は、とりわけ重要である。種々の抗血清、
例えばこれに限定されないが後述の第 ６．２節に記載
の多価抗血清およびモノクローナル抗体は、産生物の免
疫反応性を検定するのに有効である。 【００６１】本発明のタンパク質およびペプチドの同定
は、 PBOMP関連タンパク質またはペプチドがＰＢＯＭＰ
またはその類縁体および誘導体に対して誘導される種々
の抗体に免疫反応性であることを必要とする。タンパク
質またはペプチドが遺伝子配列の部分である全ＰＢＯＭ
遺伝子配列の発現から生じようと融合タンパク質の産生
のため結紮される２以上の遺伝子配列から生じようとタ
ンパク質またはペプチドは、免疫反応性であるべきであ
る。この反応性は、放射線免疫沈降、放射線競合、ＥＬ
ＩＳＡまたはイムノブロット等の標準免疫学的技術で示
し得る。 【００６２】Ｈ．インフルエンザ関連タンパク質を同定
すると、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、ア
フィーニティーおよびサイジングカラムクロマトグラフ
ィー）、沈降および溶解度差等の標準方法でまたはタン
パク質の純化用の他の標準技術で単離および純化し得
る。別に、組換体により産生した免疫反応性Ｈ．インフ
ルエンザＰＢＯＭＰ関連タンパク質をひとたび同定する
と、免疫反応性タンパク質のアミノ酸配列を組換体中に
含有されるキメラ遺伝子のヌクレオチド配列から推定で
きる。その結果、タンパク質を当該技術分野に公知の標
準化学方法で合成できる［例えばハンカピラーら（Hunk
apiller et al.，１９８４，Nature３１０：１０５−１
１１）参照のこと］。 本発明の特定の実施態様におい
て、組換ＤＮＡ技術あるいは化学的合成法のいずれかに
より産生した該ペプチドとしてこれに限定されないが機
能的に等しいアミノ酸残基をわずかな変化を生じる配列
内の残基に置き換えた改良配列を含む第１１図および／
または第１５図に実質的に表わされた全または部分的ア
ミノ酸配列がある。例えば、配列内の１以上のアミノ酸
を機能的に等しく作用する同様の極性の別のアミノ酸で
置き換える結果わずかに変更する。配列内でのアミノ酸
の置き換えは、アミノ酸の属する類の他のメンバーから
選択され得る。例えば、無極性（疎水性）アミノ酸とし
て、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バ
リン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンお
よびメチオニンがある。極性天然アミノ酸としてセリ
ン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン
およびグルタミンがある。陽性帯電（塩基性）アミノ酸
としてアルギニン、リシンおよびヒスチジンがある。陰
性帯電（酸性）アミノ酸としてアスパラギン酸およびグ
ルタミン酸がある。 【００６３】５．４．ＰＢＯＭＰ遺伝子のヌクレオチド
配列化 ＰＢＯＭＰ遺伝子含有ＤＮＡのフラグメントをひとたび
同定したら、これらの遺伝子の実際のヌクレオチド配列
をＤＮＡの配列検定により確認できる。塩基対の配列順
序をマクサムおよびギルバート（Maxam and Gilbert,１
９８０，Methods in Enzymology,６５：４９）の方法ま
たはデオキシ法［サンガーら（Sanger et al.,１９７
７，Proc． Nat’l Acad.Sci.USA７４：５４６３）］の
いずれかの方法で決定できる。ＰＢＯＭＰ遺伝子の実際
の開始および停止シグナルを読み取り枠のヌクレオチド
配列の検定により確認できる。［ローゼンバーグら（Ro
senberg et al.， １９７９，Ann.Rev.Gent．１３：３
１９）］。より多くの読み取り枠を特定ＤＮＡフラグメ
ントに見い出した際、実際の遺伝子の同一性をＰＢＯＭ
Ｐのアミノ酸配列に遺伝子産生物の予想アミノ酸配列を
比較することにより確認できた。好適な読み取枠の配置
もまた遺伝子融合の使用により確認できる。 【００６４】５．５．ＰＢＯＭＰの免疫潜在能の決定 ｂ型ヘモフィルスインフルエンザのポリサッカライド、
すなわちＰＲＰへの抗体での実験は、インビトロ検定に
おいて細菌を殺しかつ動物モデル系におけるＨi ｂでの
免疫テストに対して保護する抗体の能力は、ヒト幼児に
おいて保護免疫応答を引き出す能力とほぼ相関すること
を示している。 【００６５】本発明のＰＢＯＭＰタンパク質およびペプ
チドへの応答において引き出される抗ＢＯＭＰ抗体は、
Ｈi およびＨi ｂの両方を殺しＨi ｂでの免疫テストか
らの動物モデル系において保護する能力を示すため同様
のインビトロ検定システムおよび動物モデル系を用いて
試験し得る。これらのシステムからの結果は、保護免疫
応答を引き出しヒト幼児、小児および成人用ワクチンと
して利用するため各 PBOMPの潜在能と同様な相関を示す
べきである。 【００６６】Ｈ．インフルエンザに対するＰＲＰおよび
リポポリサッカライド（ＬＰＳ）の抗体の細菌活性を予
め用いられているインビトロ補体媒介細菌検定システム
［マッシャーら（Musher et al.,１９７２，J.Clin.Inv
est.５１：３１−３８）］は、特定ＰＢＯＭＰペプチド
またはそのフラグメントに対して誘導される抗体がｂ型
Ｈ．インフルエンザおよび分類不能Ｈ．インフルエンザ
に対する細菌活性を有するか否かを決定するのに用いら
れた。これらの検定を広範囲の菌株を殺すかどうかを決
定するために比較的多数の両タイプ細菌の臨床単離体に
対して実施できる。このようなインビトロ細菌を説明す
る実施例については後述の第7.1.節を参照のこと。 【００６７】さらに保護抗体応答を引き出すＰＢＯＭＰ
の能力に対するデータを幼年ラット髄膜炎モデル系の使
用によりもたらすことができる［スミスら（Smith et a
l.，１９７３， Infect.Immun．８：２７８−２９
０）］。生後６日前に対抗した幼年ラットは、好適服用
量のＨ．インフルエンザｂ型を受けたものであり、ヒト
幼児に見られるのと同様な菌血症および致命的髄膜炎を
成長させる。対抗菌株に対して細菌性である抗体を対抗
前に幼年ラットを受動的に免疫化するのに用いる場合、
ついでこれらを髄膜炎および死亡から保護する。ｂ型ヘ
モフィルス用最新ワクチンに対して誘導される抗体、Ｐ
ＲＰは、この幼年ラットモデル系において保護的であ
る。ｂ型ヘモフィルス髄膜炎に対する受動的保護をラビ
ットポリクローナル抗ＰＢＯＭＰ抗体で幼年ラットを免
疫化し、ひきつづきラットを致死量のＨ．インフルエン
ザｂ型で対抗することによって示すことができた。本発
明のタンパク質およびペプチドにより引き出されたこの
ようなインビボ保護抗体を説明する実施例に関しては、
後述の第７．２節を参照のこと。 【００６８】Ｈi に対して保護する特定ＰＢＯＭＰへの
抗体の能力に対するデータをチンチラ（chinchilla）中
耳炎動物モデルシステムを用いて得ることができた。
［バーレンカンプら（Barenkamp et al.，１９８６，In
fect Immun．５２： ５７２−７８）］。この動物モデ
ルにおいて、チンチラをＨi で内耳管の接種により対抗
する。ヒトに見られるのと非常によく似た中耳炎が発達
する。Ｈi ＯＭＰで活性的またはＨi ＯＭＰに対して導
かれた抗体で受動的にのいずれかで免疫化されたチンチ
ラをＨi での聴覚対抗に対して保護する（バーレンカン
プら前述）。この動物モデル系をＨi に対して保護する
ＰＢＯＭＰへの抗体の能力を示すのに用いることができ
た。 【００６９】抗ＰＢＯＭ抗体が幼年動物モデルの使用に
より抗ＰＲＰ抗体に加えて付加的保護が可能であること
を示すことは、可能である。抗ＰＢＯＭＰ１がもはやＨ
i ｂでの対抗に対して幼年ラットを保護することができ
ない点まで稀釈し、同様の稀釈の抗ＰＲＰ抗体と混合し
た抗ＰＢＯＭＰ１抗体は、付加的保護を示すことがで
き、そしてそれ故に幼年ラットの死亡を防ぐことができ
る。この付加的保護は、PRP またはそのフラグメントま
たは接合体とＰＢＯＭＰまたはそのフラグメントから構
成される可能混合ワクチンに有効である。 【００７０】５．６．ワクチンの処方 ヒトまたは動物内に後述のワクチン処方を導入するため
に多くの方法を用いることができる。例えばこれに限定
されないが皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下および
鼻腔内の投与の経路がある。 【００７１】５．６．１ サブユニットワクチン処方 本発明の一つの目的は、Ｈ．インフルエンザ感染の髄膜
炎および他の疾病症状に対して保護するワクチン処方に
おける免疫原として用いられるＰＢＯＭＰ−１，ＰＢＯ
ＭＰ−２および関連タンパク質およびペプチドを含む
Ｈ．インフルエンザの外膜タンパク質に関連するタンパ
ク質またはペプチドを提供することである。サブユニッ
トワクチンは、単に宿主を免疫化するのに必要な適切な
免疫原性物質からなる。免疫遺伝子学的処理免疫原、化
学合成免疫原および／または本明細書に記載のごとく単
離された確かな実質的に純粋なＨ．インフルエンザＰＢ
ＯＭからなる免疫原から処方され、保護免疫応答を引き
出すことのできるワクチンは、受領者の感染の危険がな
いので特に有効である。従ってＰＢＯＭＰ関連タンパク
質またはそのフラグメントを ＰＢＯＭＰを発現する組
換体から純化できる。このような組換としては、細菌転
移体、酵母転移体またはＰＢＯＭＰエピトープを発現す
る組換体で感染された培養細胞がある（前述の第５．３
節および第５．４節を参照のこと）。他にＰＢＯＭＰ関
連タンパク質またはペプチドを化学的に合成できる。こ
のため、このようなタンパク質またはペプチドをその発
現を誘く遺伝子のヌクレオチド配列から推定できる（前
述の第５．４節を参照のこと）。さらに別の実施態様に
おいて、ＰＢＯＭＰ関連タンパク質またはペプチドを
Ｈ．インフルエンザ培養液から実質的に純粋な形態で単
離できる（例えば、前述の第５．１節を参照のこと）。 【００７２】免疫原が組換体から純化されようと化学的
に合成されようと、最終産生物を好適濃度に調節しいず
れかの好適なワクチンアジュバンドで処方する。好適な
アジュバンドとしては、これに限定されるものではない
が、界面活性剤、例えば、ヘキサデシルアミン、オクタ
デシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、リゾレ
シチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミ
ド、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒド
ロキシプロパンジアミン）、メトキシヘキサデシルグリ
セロールおよびプルロニックポリオール；ポリアミン類
（plyamines)例えば、ピラン、デキストランスルフェー
ト、ポリＩＣ、ポリアクリル酸、カーボポール；ペプチ
ド類、例えばムラミルジペプチド、ジトチルグリシン、
ツフトシン（tuftsin)；オイルエマルジョン；および鉱
物ゲル例えばアルミニウムヒドロキシド、アルミニウム
ホスフェート等がある。免疫原もまたワクチン処方に用
いるためリポソーム内に導入またはポリサッカライドお
よび／または他のポリマーに接合することができる。 【００７３】本発明のこの態様のさらに別の実施態様に
おいて、ＰＢＯＭＰ関連タンパク質またはペプチドは、
ハプテン、すなわち同形の抗体と特異的または選択的に
反応するものに抗原性であるが免疫応答を引き出せない
ものに免疫原性でない分子である。このような場合、ハ
プテンをキャリーヤーまたは免疫原性分子に共有結合で
きる。すなわち、例えば、タンパク質血清アルブミン等
の巨大タンパク質は、免疫原性をそれと結合するハプテ
ンに与える。ハプテン−キャリヤーをサブユニットワク
チンとして使用するために処方できる。 【００７４】５．６．２ ウィルス性ワクチン処方 本発明の別の目的は、Ｈ．インフルエンザの髄膜炎また
は他の疾病症状に対して保護するのに用いられる生組換
ウィルス性ワクチンまたは不滑性組換ウィルス性ワクチ
ンのいずれかを提供することである。このため、組換え
ウィルスをＰＢＯＭＰ関連エピトープを発現するように
調合する（前述の第５．３節および第５．４節を参照の
こと）。組換ウィルスが免疫化されるが疾病を引き起こ
されない宿主に感染症である場合、宿主における増殖が
長期刺激を導き、従って、実質的に長期持続免疫性を与
えるので生ワクチンが好ましい。宿主内に導入した際感
染性組換えウィルスは、そのキメラ遺伝子からＰＢＯＭ
Ｐ関連タンパク質またはペプチドフラグメントを発現で
きそしてそれによりＨ．インフルエンザ抗原に対する免
疫応答を引き出せる。このような免疫応答が連続Ｈ．イ
ンフルエンザ感染に対して保護的である場合には、生組
換ウィルス自身をＨ．インフルエンザ感染に対する抑制
ワクチンに用いることができる。このような組換えウィ
ルスの産生は、インビトロ（例えば、組繊培養細胞）と
インビボ（例えば、未処理宿主動物）系のいずれも含
む。例えば痘瘡ワクチンを調製し処方する従来の方法を
ＰＢＯＭＰ関連タンパク質またはポリペプチドを発現す
る生組換えワクチンに適応できる。 【００７５】多価生ウィルスワクチンをＨ．インフルエ
ンザPBOMP のエピトープに加えて疾症を引き起こす生物
のエピトープを発現する単一またはいくつかの感染性組
換ウィルスから調合できる。例えば、ワクシニアウィル
スをＨ．インフルエンザＰＢＯＭＰのものに加えて他の
エピトープに関するコード配列を含むよう処理できる。
このような組換ウィルス自身を多価ワクチンにおける免
疫原として使用できる。別に、各々ＰＢＯＭＰの異なる
エピトープおよび／または他の疾病を起こす生物のエピ
トープに関してコード化する異なる遺伝子を発現するワ
クシニアまたは他のウィルスの混合物を多価ワクチンに
処方できる。 【００７６】組換えウィルスが免疫化される宿主に感染
性があるか否かにかかわらず不活性ワクチンを処方でき
る。不活性ワクチンは、その感染性が通常は化学的処理
（例えばホルムアルデヒド）により破壊されているとい
う意味では「死」である。理想的には、ウィルスの感染
性をウィルスの免疫原性をもたらすタンパク質を影響す
ることなく破壊する。不活性ワクチンを調合するため
に、ＰＢＯＭＰ関連タンパク質またはペプチドを発現す
る多量の組換えウィルスを必要量の適切抗原を与えるた
め培養液中生長させなければならない。異なるエピトー
プを発現する不活性化ワクチンの混合物を「多価」ワク
チンの処方に用いることができる。 【００７７】明らかな例として、これらの「多価」不活
性化ワクチンは、互いに投与された生ワクチンの相互干
渉による潜在的困難のため生ワクチン処方より好まし
い。いずれかの場合において、不活性化組換えワクチン
またはウィルスの混合物は、抗原に対する免疫学的応答
を高めるため好適なアジュバンドで処方されるべきであ
る。好適なアジュバンドとして、これに限定されるもの
ではないが、界面活性剤、例えばヘキサデシルアミン、
オクタデシルアミノ酸エステル、オクタデシルアミン、
リゾレチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロ
ミド、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ−ビス（２−
ヒドロキシエチルプロパンジアミン）、メトキシヘキサ
ドデシルグリセロールおよびプルロニックポリオール；
ポリアミン類、例えば、ピラン、デキストランスルフェ
ート、ポリＩＣ、ポリアクリル酸、カーボポール；ペプ
チド類、例えばムラミルジペプチド、ジメチルグリシ
ン、ツフトシン；オイルエマルジョン；および鉱物ゲ
ル、例えばアルミニウムヒドロキシド、アルミニウムホ
スフェート等がある。 【００７８】５．６．３ 受動免疫および抗イデオタイ
プ抗体 ウィルスまたはサブユニットワクチンで能動的に免疫化
するのに代えて、Ｈ．インフルエンザのエピトープに対
する予備形成抗体の投与により宿主に対する短期間保護
を与えることも可能である。従って、ワクチン処方を受
動免疫治療に用いる抗体を産生するために用いることが
できる。ヒト免疫グロブリンは、異質免疫グロブリンが
その異質免疫性成分に対する免疫応答を拒絶するのでヒ
ト医薬に好ましい。このような受動免疫化は、特別の危
険にさらされる免疫化されない個体、例えば細菌性髄膜
炎患者との接触にさらされる若年幼児の速やかな保護の
ための緊急の理由において用いられる。他に、これらの
抗体をＨ．インフルエンザＰＢＯＭＰエピトープに対す
る免疫応答を刺激する抗体として交替で使用し得る抗イ
デオタイプ抗体の保護に使用し得る。 【００７９】５．７．診断的検定 本発明のさらに別の目的は、Ｈ．インフルエンザ感染を
推測される個体の種々の体液においてＰＢＯＭＰ抗原
（および従って、Ｈ．インフルエンザ）の検査に対する
診断的検定に用いる指薬を提供することである。 【００８０】５．７．１ 免疫検定 この実施態様の１つの態様において、本発明の PBOMP関
連タンパク質およびペプチドを種々の患者組繊およびこ
れに限定されるものではないが血液、脊髄液および痰等
を含む体液におけるＨ．インフルエンザの検査用免疫検
定における抗原として使用できる。 【００８１】本発明の抗原は、当該技術分野に公知のい
ずれの免疫検定、すなわちこれに限定されるものではな
いがラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ検定、“サンド
イッチ”検定沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散検
定、凝集検定、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイム
ノアッセイおよび免疫電気泳動検定が少ないが挙げられ
る、に使用できる。 【００８２】５．７．２ 核酸ハイブリダイゼーション
検定 この実施態様の別の態様において、本発明のＰＢＯＭＰ
関連タンパク質およびペプチドをコード化する遺伝子の
新規ヌクレオチド配列を種々の患者組織およびこれに限
定されるものではないが血液、脊髄液、および痰等を含
む体液におけるＨ．インフルエンザの検査用核酸ハイブ
リダイゼーションにおけるプローブとして使用できる。 【００８３】本発明のヌクレオチド配列をこれに限定さ
れるものではないがサザンブロット［サザン（Souther
n，１９７５，J.Mol.Biol．９８：５０８）］；ノーザ
ンブロット［トーマスら（Thomas et al.,１９８０，Pr
oc． Nat’l Acad.Sci．USA ７７：５２０１−０
５）］；およびコロニーブロット［グルンステインら
（Grunstein et al.，１９７５，Proc． Nat’l Acad.S
ci.USA７２：３９６１−６５）］等を含む当該技術分野
において公知のいずれの核酸ハイブリダイゼーション検
定にも使用できる。 【００８４】以下の一連の実施例は、説明の目的で記載
したものであり本発明の範囲の限定するためではない。 【００８５】 【実施例】６．ネィティブおよび組換ＤＮＡ−誘導ＰＢ
ＯＭＰの単離および特徴 ６．１．ＰＢＯＭＰ−１の単離・精製および分析 一連の実験において、他の細胞壁成分が実質的にない
ＰＢＯＭＰ−１は、次のようにＨ．インフルエンザ（H.
influenzae）から得られた。 【００８６】Ｈ．インフルエンザイーガン（H.influenz
ae Eagan）は、一夜、１０μｇ／mlのヘミンおよび１μ
ｇ／mlＮＡＤ （ＢＨＩ−ＸＶ）を含む脳心輸液媒地か
または mＭＩＣ（ヘリオット等の修正、Herriot et a
l.，１９７０，J. Bacteriol.１０１：５１３−１６）
媒地で育てた。４℃において１０，０００xgで１５分間
遠心分離した後、上澄液をローカル（Rocal)IITM消毒薬
中に棄てた。沈降物（ペレット）は、重量を測定し、細
胞の湿式重量の約５倍量に等しいバッファーを有する１
０mMヘペス−ＮａＯＨ（pH7.4)、１mMＥＤＴＡに懸濁し
た。その後、細胞懸濁液をブランソンモデル３５０ソニ
ケーターセルディスラプター(BransonSonic Power,コネ
ティカット州 ダンバリー）で６０％出力のパルス設定
で氷浴中１００mlアリコートで５分間音波破砕した。音
波破砕後、粉砕した細胞懸濁液を４℃で５分間かけて１
０，０００xgで遠心分離にかけて未破砕細胞を除いた。
その後、沈降未破砕細胞を計量し、前記の如く未破砕細
胞の湿式重量の約５倍に等しい１０mMのヘペス− Ｎａ
ＯＨ（pH７．４）１mMＥＤＴＡ中で再び音波破砕した。
全メンブランフラクションは、最終０．５M ＮａＣｌを
得るように十分なＮａＣｌの添加および約１時間の破砕
細胞物質の 100,000xgの超遠心分離後、沈降物として得
た。 【００８７】その後外部メンブラン細胞壁複合体は、全
メンブランフラクションの１０mMヘペスＮａＯＨ，pH
７．４，中の１％サルコシル（sarcosyl）で再抽出によ
る、全メンブランフラクションから内部メンブラン成分
を除去して得た。外部メンブラン細胞壁フラクション含
有不溶性残留物は、350,000xg で３０分間遠心分離にか
けて単離し、５０mMトリスpH８．０，５mMＥＤＴＡに懸
濁させて４℃で一夜貯蔵した。 【００８８】ＰＢＯＭＰ−１細胞壁複合体は、外部メン
ブランフラクション中の他のタンパク質の残りのものか
ら、オクチルグルコシドで外部メンブラン細胞壁フラク
ションを逐次抽出し（２度）、その後サルコシル（２
度）によって抽出して得た。両洗浄剤は、５０mMトリス
中の１％(w/v）５mM EDTA pH８．０で使用した。抽出
は、室温（２０℃）で３０分間、それぞれ行なった。そ
の後、混合物を 100,000xgで１時間かけて遠心分離し
た。オクチルグルコシドおよびサルコシルの抽出後、残
留する不溶性沈降物質は、ＰＢＯＭＰ−１細胞壁複合体
である。 【００８９】ＰＢＯＭＰ−１は、二法によって可溶化し
た。すなわち（１）種々の洗浄剤のなかの１種の存在下
で１時間かけて６０℃に加熱する方法または（２）洗浄
剤の存在化または不存在下で３７℃で１時間リゾチーム
消化により細胞壁を破壊する方法である。（１）かまた
は（２）の後、可溶性 ＰＢＯＭＰ−１を不溶性物質か
ら１５℃で１時間かけて 100,000 xgで遠心分離にかけ
て分離した。（１）かまたは（２）のいずれの方法にお
いても、可溶化の臨界的に特別な洗浄剤は選択されなか
った。事実、今日迄に試験した洗浄剤の全ては（デオキ
シコール酸塩、トリトンX-１００TM、トウーン−８０、
チャプス（ＣＨＡＰＳ）、チャプソー（ＣＨＡＰＳ
Ｏ）、ドデシルマルトサイド、トウィッテルジェント３
−１４TMおよびトウィッテルジェント3-１６TMを含
む）、リゾチーム誘導可溶化と同様に加熱依存可溶化に
効果的である。加えて、オクチルグルコシドは、リゾチ
ーム誘導可溶化にきわめて有効であり、１％（w/v)最終
濃度で定型的に使用されていた。４０ｇの湿式重量の細
胞から、８mgの実質的に他の細胞壁成分のないＰＢＯＭ
Ｐ−１を単離することが典型的に可能であった。この実
質的に純粋なＰＢＯＭＰ−１製剤は、ＳＤＳ ＰＡＧＥ
システムで分析してこのタンパク質の減少変成形態の相
対分子量を決定し、そしてその純度を評価した（第１
図）。 【００９０】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のため、５×濃縮サ
ンプルバッファーで０．１Ｍ TrisＨＣｌ，pH７．０，
２５mMジチオスレイトールおよび２％ＳＤＳに調節し、
そして１００℃で５分間加熱してサンプルを調製した。
電気泳動法前に、サンプルの全てを調節して６％（w/v)
ショ糖および 0.001％ブロモフェノールブルーにした。
大部分の定型分析は、バイオ−ラド ミニプロテアンゲ
ルシステム（カリフォルニア州 レッドモンド）を使用
して行なった。ゲルは、１．５mm厚であり、アクリルア
ミドは、２倍比の３０：０．８まで有する１５％アクリ
ルアミド、０．３７５ＭトリスHCl （pH８．８）および
０．１％ＳＤＳを含んでいた。積み重ねたゲルは、ゲル
当りアクリルアミドの同じ比率、２倍、まで有する４．
８％アクリルアミド、１２５mMトリスHCl （pH７．０）
および０．１％ＳＤＳを含んでいた。電気泳動後、ゲル
を少なくとも１時間、エタノール：酢酸：水（５：１：
５）中で０．１２５％クマーシーブルーで染色し、その
後青色染料なしで同一溶媒系で脱染色した。オボアルブ
ミン４３，０００；α−キモトリプシノーゲン、２５，
７００；β−ラクトグロブリン、１８，４００；リゾチ
ーム、１４，３００；ボビントリプシンインヒビター、
６，２００；インスリン（ＡとＢ鎖）、２，３００およ
び３，４００（ＢＲＬ，Bethesda，ＭＤ）を含む前染色
低分子重量基準物質を用いてＰＢＯＭＰ−１の相対分子
量の測定を補助した。 【００９１】さらに、ＰＢＯＭＰ−１の精製は、イオン
交換クロマトグラフィーモレキュラーシーブ、疎水性ま
たは逆相クロマトグラフィー、クロマトフォーカシン
グ、ゲル電気泳動等の標準的な方法で達成し得る。 【００９２】６．１．１ ＰＢＯＭＰ−１のアミノ酸組
成および配列の特徴 アミノ酸分析は、シンプソン等の方法によって行なった
（Simpson et al.，１９７６，J.Biol.Clem.２５１：19
36−１９４０）。加水分解は、１００℃で３３時間厚い
壁で被覆されたガラス試験管中で、真空下０．１ｍｌの
４Ｎメタンスルホン酸中において０．５〜１mgのタンパ
ク質を加熱して行なった。各アミノ酸量は、既知量の基
準アミノ酸を使用して得られた面積を有する各種のピー
クのもとで、面積の比較によって得られる。得られた結
果を第１表に示す。 【００９３】 【表１】（第１表） ─────────────────── ＰＢＯＭＰ−１a のアミノ酸組成 ─────────────────── アミノ酸残基 数 ─────────────────── アスパラギン酸 １５ （Ａsp＋Ａsn） トレオニン ６ セリン ７ グルタミン酸 １２ （Ｇlu＋Ｇln） プロリン ３ グリシン １８ アラニン １９ システイン １ バリン １０ メチオニン ０ イソロイシン ４ ロイシン １１ チロシン １３ フェニルアラニン ４ リシン（Lysine） ８ ヒスチジン ２ アルギニン ７ トリプトファン ０ ───────────────────a ＰＢＯＭＰ−１の見掛け分子量は、15.057ダルトンで
あった。アミノ酸残基の全数は、140 であった。エドマ
ン化学を使用するＰＢＯＭＰ−１の配列化の最初の試み
は、遮断Ｎ−末端残基のために満足な結果を与えなかっ
た。部分アミノ酸配列情報を得るために、１６０００ダ
ルトン分子量のＰＢＯＭＰをタンパク分解性酵素で酵素
的に消化して配列分析し安いペプチドフラグメントを得
ることが必要になっている。 【００９４】トリプシンを使用して２７℃で１時間かけ
て得られる１６０００ダルトンのＰＢＯＭＰ−１のタン
パク分解性消化品は、Ｃ１８カラムを用いる逆相高速液
体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で分離した。
多数の疎水性ペプチドピーク（Ｔ９）は、単離し、その
後アミノ酸配列化開始前にポリブレン（polybrene)被覆
グラスファイバー紙上に固定した。 【００９５】Ｔ９ペプチドは、エドマン分解法により配
列化した（ Edman et al.,１９６７, Eur. J. Biochem.
１：８０−９１）。配列化器からの各サイクルは、アニ
リノチアゾリンフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）ア
ミノ酸を生成した。分析は、液体クロマトグラフィーシ
ステムの逆相 Ｃ１８ＨＰＬＣカートリッジカラムで行
なった。 【００９６】ＰＴＨは、ソディウムアセテート−アセト
ニトリルグラジェントを用いて室温で溶出し、そして可
変ＵＶ波長検出器を用いて２７０ナノメーターで検出し
た。Ｔ９ペプチドの配列分析の結果は次のようである。 Ｔyr−Ａsn−Ｔhr−Ｖal−Ｔyr−Ｐhe−Ｇly−Ｐhe−Ａ
sp−Ｌys−Ｔyr−Ａsp−Ｉle−Ｔhr−Ｇly−Ｐhe−Ｔyr
−Ｖal−Ｔhr−Ｉle−Ａsp−Ａla−Ａsp−Ａla−Ａla−
Ｔyr−Ｌeu−Ａsn−Ａla−Ｔhr−Ｐro−Ａla−Ａla ８の芳香族アミノ酸（５Ｔyr，３phe)および５の脂肪族
側鎖アミノ酸（１Ｌeu，２Ｖal，２Ｉle）を含むＴ９ペ
プチドは、極めて疎水性である。このペプチドのチロシ
ン含量は高いが、ＰＢＯＭＰ−１の全アミノ酸組成に対
して一定である（第１表）。加えて、ＰＢＯＭＰ−１
が、１３のチロシンを含むがメチオニンまたはトリプト
ファンを含まないことは一般的である。 【００９７】６．１．２ 脂肪酸分析によるＰＢＯＭＰ
−１の特徴 第６．１．１節に示すように、エドマン分解法による
ＰＢＯＭＰ−１の配列化の最初の試みは、遮断Ｎ−末端
残基のために満足すべき結果を生じなかった。精製Ｈ．
インフルエンザ（Ｈ．influenzae）ＰＢＯＭＰ−１の脂
肪酸分析は、共有結合性結合脂肪族アシル基がＰＢＯＭ
Ｐ−１ペプチド上で同定できるか否かを調査するために
行なった。 脂肪酸分析に先立ち、前記第６．１節の記
載のように、単離ＰＢＯＭＰ−１タンパク質を有機溶媒
混合物、例えばクロロホルム：メタノール（２：１）お
よびデオキシコール酸塩洗浄剤で充分に抽出していかな
る微量不純物の内因性脂質，ホスホリピト等を除いた。
裸のタンパク質は、アセトン沈降法かまたは充分な透析
で得て、凍結乾燥法で乾燥した。既知量のノナデカン酸
を内部標準物質として乾燥精製ＰＢＯＭＰ−１（１〜３
mg）に加え、その混合物を窒素雰囲気下１１０℃で４時
間かけて 200μｌの４ＮＨＣｌで加水分解した。かかる
酸加水分解は、アミドまたはエステル結合脂肪酸を放出
する。加水分解物質は、水で２mlに希釈し、同容量のヘ
キサンで３回抽出した。結合したヘキサン相を同容量の
食塩水で２回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。脂肪
酸は、パーキンエレマー モデル８５００ガスクロマト
グラフに注入する前に、ジアゾメタン(Schlenk，１９６
０, Anal, Chem, ３２：１４１２−１４１４）で対応す
るメチルエステルに変化させた。脂肪酸メチルエステル
の分離は、ＳＰＢ−１溶融シリカキャピラリーカラム
（Supelco 会社製，ペンシルバニア州ベルフォンテ）で
行なった。得られたピークは、既知標準物質と比較して
同定した。得られた結果を第１６図に示す。 【００９８】第１６図に示すように、３種類の主要な脂
肪酸、即ち、ラウリン酸（Ｃ１２），パルミチン酸（１
６）およびまだ明確に同定されるパルミチン酸誘導体
（Ｃ１６’）は、 ＰＢＯＭＰ−１と結合している。Ｃ
１６’は、恐らく１６個の炭素数を有する分岐脂肪酸で
ある。 【００９９】６．２． 抗−ＰＢＯＭＰ−１抗体の調製 ６．２．１ ポリクローナル抗−ＰＢＯＭＰ−１抗血清
の調製 実質的に純粋なＰＢＯＭＰ−１は、イムノゲンとして抗
−ＰＢＯＭＰ−１抗体の調製に使用した。部分的に純粋
なＰＢＯＭＰ−１の豊富なフラクションは、第６．１節
で記載したように調製し、１０℃において３５mAの一定
電流のもとで１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し
た。タンパク質バンドを第６．１．１節で記載したよう
に固定し染色した。ＰＢＯＭＰ−１バンドは、ゲルから
切除し、平衡になるまでリン酸塩バッファード食塩水
（ＰＢＳ）（２０mMリン酸ナトリウム，１５０mMＮａＣ
ｌ，pH７．４）で透析した。ＰＢＯＭＰ−１含有アクリ
ルアミドゲルフラグメントをＰＢＳ中で２５ゲージニー
ドルで切りきざんだ。そのフラグメントをニュージーラ
ンド ホワイトラビットの多部位に筋肉注射した。各々
のラビットは、全量で約２０μｇのＰＢＯＭＰ−１を受
けた。ラビットは、最初の免疫化の後に、２週間および
３週間に再免疫化した。最終免疫化後１週間で動物の血
を流し、その血清を回収した。動物にアクリルアミド中
２０μｇのＰＢＯＭＰ−１を２ケ月毎に投与して抗−Ｐ
ＢＯＭＰ−１抗体の高力価を維持した。 【０１００】またＰＢＯＭＰ−１は、第５．１節で記載
したように単離したものであり、不完全フロイントアジ
ュバント（Freund’s adjuvant) と混合して乳化した。
ラビットにフロイントアジュバント中の約２０μｇのＰ
ＢＯＭＰ−１を筋肉注射した。動物は、最初の免疫化後
２週間および３週間に再免疫化し、最終免疫化の１週間
に採血した。 【０１０１】６．２．２ 抗−ＰＢＯＭＰ−１モノクロ
−ナル抗体の産生 ＰＢＯＭＰ−１に対する抗体を排泄するハイブリドーマ
細胞系は、マウス骨髄腫細胞系，Ｘ６３，Ａｇ８，6543
とＨ．インフルエンザに対して免疫化したＣ５７／Ｂ１
マウスから得た脾蔵細胞系との融合によって、次のよう
にして得た。即ち、雌Ｃ５７／Ｂ１マウスに１×１０6
Ｈ．インフルエンザ菌株Ｓ２細胞を、２ケ月間に４回、
腹腔内注射した。３ケ月後、そのマウスは、第６．２．
１節に記載したように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドから単
離した実質的に純粋なＰＢＯＭＰ−１で免疫化した。１
ケ月後、そのマウスは、Ｓ２から全外部メンブランの静
脈注射を受けた。細胞融合は、静脈注射後第４日に、当
業者に一般的な標準的な方法で行なった［ゲフター等
（Gefter et al.,１９７７，Somat, Cell. Gemet ３：
２３１−３６）を参照のこと］。 ハイブリドーマ細胞
培養上澄液は、抗体としてＨ．インフルエンザ外部メン
ブランタンパク質を使用する、標準的なエリサ（ＥＬＩ
ＳＡ）でスクリ―ニングした。検定は、４℃で一夜ＯＭ
Ｐ被覆した９６ウエルポリスチレンプレートで行なっ
た。 【０１０２】プレートは、４０mMＴris （pH8.0)、１５
０mMＮａＣｌ、５％ノンファットドライミルク（nonfat
dry milk ）ＢＬＯＴＴＯ）（第６．４．４節参照のこ
と）でブロックし、そしてＰＢＳ／０．１％トウィーン
２０で洗浄した。ＰＢＳ／トウィーン２０で１：１０に
希釈した培養上澄液を加え、２５°において６０分間イ
ンキュベートし、そして前述のように洗浄した。結合抗
体は、アルカリ性ホスファターゼ−ゴートＦ（ａｂ’）
2 抗−マウス（ＩｇＧ， ＩｇＭ）およびアルカリ性ホ
スファターゼ基質で検出した。その後、正の上澄液は、
精製ＰＢＯＭＰ−１，Ｅ．コリーＯＭＰ’ＳおよびＳ２
リポポリサッカリド（ＬＰＳ）を有する、ドットブロッ
ト分析でスクリーニングした。所定のハイブリドーマを
制限希釈法（McKearn ，１９８０，in Monoclonal Ant
ibodies, Kennett, McKearn andBechtol,eds., Plenum
Press，ｐ３７４）で再クローン化し、Ｈi ｂ ＯＭ
Ｐ’Ｓを有するウエスターンブロット法でスクリーニン
グした。選択ハイブリドーマは、標準的な方法で、腹水
として成長させるためにＢalb ／ｃマウスに注射した
（Brodeur et al., １９８４，J. Immunol. Meth， ７
１：２６５−７２）。 【０１０３】６．３．抗−ＰＢＯＭＰ−１抗体とE.コリ
ーとの反応性 抗−ＰＢＯＭＰ−１抗血清の反応性に関するウエスター
ンブロット分析法は、後述の６．４．４節に記載のよう
に行なった。２−メルカプトエタノール含有試料製剤バ
ッファー中に溶解した１０μｌのにわか細菌培養を１５
％ SDS−ＰＡＧＥゲルの各レーンに塗布した。電気泳動
およびニトロセルロースへの転換後、そのブロットをラ
ビットポリクローナル抗ＰＢＯＭＰ−１の１：２５０希
釈液でプローブした。ヤギ抗−ラビットＩｇＧ（Kirkeg
aard ＆ Perry Laboratories，ラリーランド州 ゲイ
セルバーグ）と接合したセイヨウワサビ ペルオキシダ
ーゼとのインキュベーションは、抗−ＰＢＯＭＰ−１抗
血清がヘモフィルス属（Haemophilus)中のＰＢＯＭＰ−
１とＥ．コリー中の１８０００ダルトンタンパク質を分
別することを示す（第２Ａ図）。 【０１０４】Ｅ．コリーの１８０００ダルトンタンパク
質と交差反応するＰＢＯＭＰ−１のエピトープを確認す
るために、ＰＢＯＭＰ−１に対して作られたモノクロー
ナル抗体は、Ｅ．コリータンパク質に対する反応性用に
スクリーニングした。スクリーニングされた大部分のモ
ノクローナル抗体がＥ．コリーと反応しなかったけれど
も、あるクラスのモノクローナル抗体は、モノクローナ
ルＧ１−１で例証されるように、ヘモフィルス属のＰＢ
ＯＭＰ−１およびＥ．コリー中の１８０００ダルトンタ
ンパク質と強く反応した（第２Ｂ図）。このことは、Ｐ
ＢＯＭＰ−１に存在する少なくとも１つのエピトープが
Ｅ．コリータンパク質のエピトープと交差反応すること
を示す。このことは、Ｈ．インフルエンザＰＢＯＭＰ−
１に対する抗血清があるＥ．コリーに対する感染を保護
するだろうということを示す。 【０１０５】６．４．組換え型プラスミドの調製に使用
される一般的な手段 ６．４．１ 制限酵素消化用条件 制限エンドヌクレアーゼは、ＢＲＬ（メリーランド州
ベセスダ），ＩＢＩ（コネチィカット州 ニューヘブ
ン），ニユーイングランド バイオラブス（マサチュー
セッツ州 ベバーリー）またはＵＳバイオケミカルコー
ポレーション（オハイオ州 クレーブランド）から購入
した。 【０１０６】制限酵素消化は、ＤＮＡを適切な制限バッ
ファーに懸濁させ、制限エンドヌクレアーゼを加え、適
切な時間インキュベートして完全消化を行なうように実
施した。１単位の酵素は、２０μｌの全反応混合物にお
いて１時間かけて １．０μｇのファージラムダＤＭＡ
を完全に消化するために必要な量と規定される。各種酵
素とともに使用されるバッファー類は、下記に示され
る。即ち、１０mMＴris(pH８．０），１０mMＭｇＣｌ2
および１０mMジチオスレイトール（ＤＴＴ）から成るＣ
laＩ，ＨpaＩ，ＨpaII，およびＫpnＩ消化用に使用され
る低塩バッファー。 ５０mMＴris(pH８．０），１０mM
ＭｇＣｌ2 ，５０mM ＮａＣｌおよび１０mMＤＴＴから
成るＡluＩ，ＡvaＩ， ＥcoＲII，ＥcoＲＶ，ＨaeII，
ＨaeIII ，Ｈinc III ，Ｈind III ，ＰstＩ，Ｓau３Ａ
Ｉ，ＳphＩ，ＳatＩ，ＳstII，ＴagＩ，およびＸhoＩ消
化用として使用される中塩バッファー。 ５０mMＴris
(pH８．０），１０mMＭｇＣｌ2 ，１５０mMＮａＣｌお
よび１０mMＤＴＴから成るＢamＨＩ，ＥcoＲＩ，Ｐvu
Ｉ，ＳalＩおよびＸbaＩ消化用として使用される高塩バ
ッファー。 【０１０７】ＳmaＩ消化用に使用したバッファーは、１
０mMトリス（pH８．０），２０mMＫＣｌ，１０mMＭｇＣ
ｌ2 および１０mMＤＴＴから成っていた。制限消化の全
ては、６０℃で行なったＴagＩを除き、３７℃で行なっ
た。 【０１０８】６．４．２ ＤＮＡフラグメントのＧＥＬ
精製 制限酵素消化後、種々のサイズのＤＮＡフラグメント
は、分離し、５０mMトリス−アセテート１mMＥＤＴＡバ
ッファーpH７．８を使用する低融点温度アガロース（Ｆ
ＭＣＬＧＴアガロース）中で、１０ボルト／cmの条件で
ゲル電気泳動して精製した。 【０１０９】アガロース濃度は、回収すべきフラグメン
トの大きさによって０．８％〜１．５％で変化した。Ｄ
ＮＡバンドは、エチジウムブロマイド螢光で視認化で
き、ゲルを切断した。ＤＮＡは、６５℃でアガロースを
溶融し、４容積の６５M ＮａＣｌ，１０M Ｔris(pH８．
０），１mMＥＤＴＡを加えて混合物の最終濃度を０．５
M ＮａＣｌとし、０．５mM ＮａＣｌ，１０mMＴris
pH８．０，１mMＥＤＴＡ（ローディングバッファー）で
平衡にしたＮＡＣＳカラム（BRL ，メリーランド州 ベ
セスダ）上にＤＮＡを負荷し、そのカラムを３〜５容積
の負荷バッファーで洗浄し、そして２〜３容積の２M Ｎ
ａＣｌ，１０mMＴris pH８．０，１mMＥＤＴＡで溶出さ
せて回収した。ＤＮＡ溶出物を二度蒸留Ｈ2 Ｏで１：１
に希釈し、３容積のエタノールで沈降させた。沈降物
は、７０％エタノールで洗浄し、真空乾燥し、１mMＥＤ
ＴＡ含有１０mMＴris −ＨＣｌバッファー（ＴＥバッフ
ァー）に再懸濁させた。 【０１１０】６．４．３ ＤＮＡ連結 連結の全ては、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて行なった。
Ｔ４ＤＮＡリガーゼは、ＢＲＬ（メリーランド州 ベ
ゼスタ），ユナイテッドステーツバイオケミカルス（オ
ハイオ州 クレーブランド）またはベーリンガー（イン
ジアナ州 インジアナポリス）から購入した。１単位
（Ｕ）の Ｔ４ＤＮＡリガーゼは、５’−ＤＮＡテルミ
ニ（termini)濃度が０．１２μM （３００μｇ／ml）に
おいて、20μl 容積リガードバッファー中１６℃で３０
分間かけてバクテリオファージラムダＤＮＡのＨind II
I フラグメントの５０％連結を形成するために必要な量
と規定される。ＤＮＡ連結は、５０mMＴris （pH７．
５），１０mMＭｇＣｌ2 ，１０mM ＤＴＴ，１mMアデノ
シントリフォスフェートからなるリガーゼバッファー中
で行なった。一般に、２０〜３０μｇ／ｍｌのＤＮＡ濃
度およびベクターの挿入物に対するモル比１：１であっ
た。Ｔ４ＤＮＡリガーゼは、２０μｌ反応容積当り１Ｕ
の比率で加えた。インキュベーションは、１８〜 ２４
時間行なった。結合端連結温度は、１５℃，ブラント
（blunt)端連結温度は２２℃であった。もし充分な物質
が利用できるならば、アガロースゲル電気泳動によるあ
る部分の反応混合物を分析して連結を調べられる。 【０１１１】６．４．４ タンパク質免疫ブロット分析
（ウエスターンブロット） タンパク質は、独特な適用法に依存するが、種々の方法
による免疫ブロット分析用にニトロセルロースシートに
固定する。ファージプラークは、徐々に無菌８．１cm直
径ニトロセルロース盤を配置することによって、アガー
プレートから１０cm直径のファージ力価プレートの表面
に移した。そのシートを完全に湿らせ、無菌針でフィル
ターを介してパンチングして位置を記し、そしてそのフ
ィルターを２分後に持ち上げた。 【０１１２】コロニーブロットは、細菌コロニーをニト
ロセルロースシートに移し、そのシート（コロニー面）
を栄養素アガー上に４〜６時間載置することによってそ
のコロニーを生長させ、そのシートをクロロホルム蒸気
に３０分間さらしてコロニーを溶解させることによって
行なった。タンパク質ゲル移動は、分析すべきタンパク
質混合物含有ＳＤＳ− ＰＡＧＥゲルをニトロセルロー
スシート上に載置し、ホエファートランスホー（Hoeffe
r Transphor)装置で０．５Ａ，１４時間の条件で２５mM
Ｔris ０．３８M グリセリンpH ８．８バッファー中で
水平電気泳動法を応用して行なった。 タンパク質移動
が完全になるや否や、フィルターは、コロニーブロット
を除いて、すべての場合に３７℃で１時間かけて５０mM
Ｔris(pH８．０），１５０mMＮａＣｌ，５％ノンファッ
トドライミルク（BLOTTO）に浸した。コロニーブロット
が実施されると、そのフィルターは、１mg／ｍｌリゾチ
ーム含有ＢＬＯＴＴＯに４℃で１晩浸して細胞デブリス
（debris）を消化した。その後、該フィルターは、３７
℃で３時間かけてＢＬＯＴＴＯ中で適切な希釈度（試行
錯誤によって決定する）において第１抗体プローブで吸
収し、ＢＬＯＴＴＯで１５分間かけて３回洗浄し、３７
℃で１時間かけてＢＬＯＴＴＯ中１：５００の希釈度で
セイヨウワサビ ペルオキシターゼ接合第２抗体で吸収
し、そしてＢＬＯＴＴＯで３回、１５分間かけて洗浄し
た。フィルターは、５０mMＴris(pH７．０），１５０mM
ＮａＣｌ，０.1％ハイドロジエンパーオキシダーゼ中に
置き、そしてメタノール中の０．０６％４−クロロ−１
−ナフトール（シグマケミカルコーポレーション，ミズ
ーリー州 セントルイス）を加えた。もし青色が２０分
間以内に展開しないならば、その反応は負であると考え
られた。その反応は、そのフィルターを蒸溜水に移し、
そして乾燥をブロット（blot）して止めた。 【０１１３】６．４．５ 遺伝子融合 ＰＢＯＭＰタンパク質またはそのペプチドをコード化す
る遺伝子または遺伝子と他の遺伝子、例えばアルカリ性
ホスファターゼ（ＰhoＡ）をコード化する遺伝子、との
融合は、マノイルおよびベックウイズによって記載され
たように行なった（Manoil and Beckwith ，１９８５，
Proc，Ｎat’l Acad.Sci. ＵＳＡ ８２：８１２９−８
１３３）。組換えプラスミドは、天然ＰhoＡを欠き、Ｆ
−プライム プラスミド上にＴn ５の左末端繰り返し中
に挿入したアルカリ性アスファターゼ遺伝子、即ちプロ
モーターとメンブラントランスポート信号配列の両者を
含まない、を含むトランスポゾンＴn ５の誘導体（Ｔn
ＰhoＡ）を運搬するＥ．コリー菌株中に導入した。それ
故、活性アルカリ性フォスファターゼ酵素の産生には、
Ｔn ＰhoＡの転移を必要とするので、ＰhoＡ遺伝子はフ
レーム中で融合してメンブラン転移信号ペプチド含有活
性転写遺伝子中に入るかかる転移は、４０μｇ／ｍｌの
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート
（ＸＰ，シグマケミカルコーポレーション，ミズーリー
州 セントルイス）の存在下に細胞を平板培養すること
により検出した。この染料の存在下において、活性アル
カリ性ホスファターゼ酵素を産生するコロニーは、濃青
色となり、一方活性アルカリ性ホスファターゼを欠くコ
ロニーは白くなる。 【０１１４】６．４．６ ＤＮＡフィルターハイブリダ
イゼーション分析（サザンブロット） ＤＮＡフィルターハイブリダイゼーション分析は、サザ
ンの方法に従って行なった（Southern，１９７５，J. M
olBiol．９８：５０８）。フィルターハイブリダイゼー
ションにより分析すべきＤＮＡは、適切な制限エンドヌ
クレアーゼで消化し、９０mMＴris −ボレート，８mMＥ
ＤＴＡバッファーを使用する０．８％アガロース(Seake
m Portland，ＭＥ）中１０ボルト／cmでアガロースゲル
電気泳動法で分離した。ゲル中のＤＮＡは、そのゲルを
１．５M ＮａＣｌ／０．５M ＮａＯＨ中に１時間浸し、
そして１．５M ＮａＣｌ／１．０M Ｔris −ＨＣｌに
１時間浸して中和することによって変性した。変性ＤＮ
Ａは、ブロッティングにより、ニトロセルロースフィル
ター紙に移した。ＤＮＡの転移後、フィルターは６×Ｓ
ＳＣ(1７５．５ｇＮａＣｌと８８．２ｇクエン酸Ｎａ／
リッターを含む２０×ＳＳＣ株から希釈して調製した）
で洗浄し、空気乾燥した。 DNAフラグメントは、真空下
８０℃で２時間ベーキングしてフィルターに固定した。 【０１１５】ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブ
は、リグバイ等の方法によるニックトランスレーション
法で調製した（Rigby et al., １９７７，J.Mo, Biol.,
１１３：２３７−２４４）。プローブ用ＤＮＡ（１−２
μｇ）１００μニックトランスレーションバッファーに
溶解した（50mMＴris −ＨＣｌ，pH７．４，１０mMＭｇ
ＳＯ4 ，１０mMＤＴＴ，５μｇ／ｍｌ牛血清アルブミン
および２０μｍ各 dＧＴＰ， dＣＴＰおよび dＴＴ
Ｐ）。この反応混合物に、１００μＣｉのα32Ｐ− dＡ
ＴＰ（アメルシャム，２−３０００ Ｃｉ／ｍモル）、
１．０ｎｇデオキシリボヌクレアーゼＩ（シグマケミカ
ル コーポレーション，ミズーリー州 セントルイス）
および１０Ｕ Ｅ．コリーＤＮＡポリメラーゼＩ（ベー
リンガー）を加えて、その混合物を１５℃で４５分間イ
ンキュベートした。反応は、ＥＤＴＡを５０mM加え、そ
して１０分間で６０℃に加熱して酵素を不活性化するこ
とによって止めた。標識化ＤＮＡは、３容積のエタノー
ルを加えて沈降させ、そして５０μｌの０．３Ｍアンモ
ニウムアセテート（ＮＨ4 ＯＡｃ）に再懸濁した。試料
は、０．３M ＮＨ4 ＯＡｃで平衡にした１ｍｌのバイオ
ゲルＰ−５０スピンカラムに加え、５００ xｇで５分間
かけて遠心分離して溶出させた。そのカラムを１００μ
ｌの０．３M ＮＨ4 ＯＡｃおよび結合溶出物で洗浄し、
そして３容積のエタノールで沈降させた。標識化ＤＮＡ
沈降物、即ち、ベックマン（ＬＳ９０００）シンチレー
ションカウンタでチェレンコーワ分散（Cherenkov Scat
tering）法によって測定した放射性合体を真空乾燥し、
そしてＴＥバッファーに再懸濁した。 【０１１６】ハイブリダイゼーション用に結合ＤＮＡを
有するフィルターは、６×ＳＳＣで湿らせ、６×ＳＳＣ
／０．５％ ＳＤＳ／５ｘデンハルト溶液／１００μｇ
／ｍｌ tＲＮＡでもって６８℃で２時間かけてプレハイ
ブリダイズしてフィルターの余分の結合能力をブロック
した（１ｘデンハルト溶液は、水中の０．０２％フィコ
ル，０．０２％ポリビニルピロリドン，０．０２％牛血
清アルブミンである。）。ハイブリダイゼーション反応
は、０．０１M ＥＤＴＡおよび５−10,000,000ＣＰＭ
（Cherenkov)標識化プローブを加えた同一バッファー中
で行なった。プローブ溶液は、適用前に１０分間で９０
℃まで加熱してＤＮＡ鎖を変性し、 ６８℃に冷却し、
そして６８℃で１８〜２４時間、フィルターとインキュ
ベートした。ハイブリダイゼーション後、フィルター
は、非特異結合ブローブ除去のため、６８℃で種々に変
化した０．１×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳで洗浄した。使
用条件下で、９０％以上のＤＮＡ相同性は、ＤＮＡプロ
ーブの正結合性を示すだろう。フィルターを空気乾燥
し、スクリーンを増度するデュポンクロネックス“ライ
ティングプラス”を使用して−７０℃でコダックＸＡＲ
フィルムに曝露した。 【０１１７】６．５．Ｈ．インフルエンザのＰＢＯＭＰ
遺伝子のクローニング ＰＢＯＭＰ遺伝子のクローニング用Ｈ．インフルエンザ
染色体ＤＮＡ源は、菌株ｂ−イーガン（Eagan)からタイ
プｂ＋にＤＮＡによって転換したＨi の非エンカプセル
化 Ｒd の誘導体であるＨ．インフルエンザＫＷ２０ｂ
（HiKW２０ｂ）（Moxon et al., １９８４，Clim.Inves
t,７３：２９８−３０６）かまたはＨiｂイーガンの突
然のカプセルなしの突然変異体であるＨ．インフルエン
ザＳ２（Ｈi Ｓ２）であった。 【０１１８】ファージラムダライブラリーを生成するた
めに、Ｈi からの染色体ＤＮＡを平均長さ約１５０００
塩基対（bp）にずらし、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによる
処理によってブラントエンド化し、ＥcoＲＩＤＮＡメチ
ラーゼで修飾し、合成ＥcoＲＩリンカーに連結し、そし
て組換えラムダファージベクターカロン４にクローン化
する。 【０１１９】プラスミドライブラリーを生成するため
に、Ｈi Ｓ２の染色体ＤＮＡは、Ｓau３Ａで部分的に開
裂し、このように生成した３〜８キロベース（kb）長制
限フラグメントを単離し、そしてＢamＨＩ制限部位にお
いてプラスミドベクター pＧＤ１０３に結合した。この
プラスミドは、 pＬＧ ３３９誘導体（第３図およびSt
ocker et al., １９８２，Gene １８：３３５−４１参
照のこと）であり、６〜８コピー／細胞で運ばれる。同
様に、ｌacＺ−αペプチドおよびプラスミド pＵＣ８か
らのポリリンカー領域を含む；それ故に、適切なＥ．コ
リー菌株（ＪＭ８３）に形質転換すると、Ｌac＋フェノ
タイプの損失をスクリーニングすることによって組換え
プラスミドの選択を許容する。普通の配向でクローン化
すると、Ｅ．コリー中で不完全に表わされるクローン化
遺伝子が強く調節されたｌacプロモーターの制限のもと
で生ずるだろう。組換えプラスミド含有Ｅ．コリーは、
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗− ＰＢＯ
ＭＰ−１抗血清のプール化混合物を使用するＰＢＯＭＰ
の産生用にスクリーニングされた。 【０１２０】６．５．１ ＨＩプラスライブラリーの構
成 ＰＢＯＭＰ−１タンパク質がラムダファージと表わせず
またはラムダファージと両立しないことも可能である。
このことを調べるために、我々はＨi Ｓ２のプラスミド
染色体ライブラリーを構成した。Ｅ．コリーＯＭＰ遺伝
子の高コピー数プラスミドのクローニングは、毒性であ
ることをている（例えば、Beck et al.,１９８０，Nucl
eic Acid Res.８：３０１１−３０２４参照のこと）。
この問題を避けるために、低コピー数プラスミド pＧＤ
１０３を使用した（第３図参照のこと）。 【０１２１】Ｈi Ｓ２からの染色体ＤＮＡを制限エンド
ヌクレアーゼＳau３Ａ（ＢＲＬ．メリーゴーランド州
ベセスダ）で部分的に修飾した。５００mgのＤＮＡは、
５ｍｌの制限バッファー中で３７℃において１時間かけ
て５０ユニットのＳau３Ａで消化した。フラグメント
は、ベックマンＳＷ２８ローター中で１０mMＴris （pH
８．０），１mMＥＤＴＡ，1MＮａＣｌ含有１０−４０％
ショ糖グラジェントでもって 140,000xｇで２４時間か
けて速度沈降法によって分離した。２ｍｌのフラクショ
ンを集め、アリコートをアガロースゲル電気泳動法によ
り分析した。長さ３〜８kbの制限フラグメント含有フラ
クションをプールし、ＴＥバッファー中で濃縮した。プ
ラスミド pＧＤ１０３ ＤＮＡは、ＢamＨＩエンドヌク
レアーゼで消化し、仔ウシアルカリ性ホスファターゼ処
理した（ベーリンガー，インジアナ州 インジアナポリ
ス）（１ユニット／μｇＤＮＡ，制限バッファー中で３
７℃で３０分間）。反応混合物からフェノール抽出およ
びエタノール沈降法によってＤＮＡを精製し、ＴＥバッ
ファーに再懸濁した。ＢamＨＩとＳau３Ａ制限酵素が付
着端を形成するので、連結前にさらにＤＮＡ処理を行な
う必要はなかった。 【０１２２】約２５μｇのＨi Ｓ２−Ｓau３Ａ消化ＤＮ
Ａと pＧＤ １０３／ＢamＨＩ／ＣＡＰ消化ＤＮＡのそ
れぞれを２５ＵＴ４−リガーゼ（ベーリンガー，インジ
アナ州 インジアナポリス）含有リゲーションバッファ
ー５００ｍｌで混合し、１５℃で１８時間かけてインキ
ュベートした。２０μｌアリコートの反応混合物は、連
結反応を実証するために、アガロースゲル電気泳動法に
よって分析した（出発物質は隣接レーンで行なった）。
その後、連結混合物は、３７℃においてＬＢ−ブイヨン
中で１時間かけてインキュベートした成分Ｅ．コリーＪ
Ｍ８３（Maniatis et al.,１９８２，Molecular Clonin
g Cold Spring Harbor Laboratory ｐ．２５０）に転換
し、５０μｇ／ｍｌカナマイシンサルフェート（シグマ
ケミカルコーポレーション，ミズーリー州 セントルイ
ス）および４０μｇ／ｍｌ５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリル−ベーター−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｘ
−gal ，ＢＲＬ，メリーランド州 ベセスダ）を含有す
るＬＢ−アガー板上で平板培養し、そして３７℃で２４
時間かけてインキュベートした。約５０％のカナマイシ
ン耐性（ＫanＲ）コロニーは、展開すると白である（Ｌ
ac-)が、 pＧＤ１０３のｌac領域（Ｌac＋非組換え体は
青である）におけるＳ２ＤＮＡのＢamIII 部位への挿入
を示す。 １０の白いコロニーを無差別に選択し、増強
し、そしてベクターＢamＨＩ部位における挿入で pＧＤ
１０３より４〜８kb大きいプラスミドを含むことが示さ
れる。 【０１２３】１５２５の白いコロニーを採取し、それぞ
れ増強し、９６ウエル微少力価皿において１８％の無菌
グリセロール含有ＬＢブイヨン中で−７０℃で凍結して
貯蔵した。 【０１２４】６．５．２ ＨＩＢラムダ遺伝子バンクの
構造 Ｈi ＫＷ２０ｂからの高分子量染色体ＤＮＡは、２００
μｇ／ｍｌ濃度でＴＥバッファーに懸濁させ、２５ゲー
ジ針を通過させて平均15000bp 長に剪断した。５０mMＴ
ris(pH８．８），１０mMＭｇＣｌ2 ，２０mM（ＮＨ4 ）
2 ＳＯ4 ，１０mMＤＴＴ，５０μM dＡＴＰ， dＣＴ
Ｐ， dＧＴＰおよび dＴＴＰ中で３７℃で２０分間かけ
てＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理によって突出端を除い
た。その後、１００mMＴris(pH８．０），１０mMＥＤＴ
Ａ，０.1mMＳ−アデノシル−メチオニン中において３７
℃で３時間かけてＥcoＲＩＤＮＡメチラーゼ（１Ｕ／μ
ｇＤＮＡ）（ＢＲＬメリーランド州 ベセスダ）で処理
してＤＮＡを修飾した。ＤＮＡのメチル化は、反応から
１μｇのＤＮＡを除去し、１μｇの未修飾ラムダＤＮＡ
と混合し、そして２０μｇの高塩制限バッファー中で３
７℃において１時間かけて５単位の ＥcoＲＩを消化す
ることによって立証した。これらの条件下において、修
飾Ｈi ＤＮＡは消化されないが、添加ラムダＤＮＡは完
全に消化された。 【０１２５】１００μｌの反応混合物中においてＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ（５Ｕ）を使用した２０μｇの修飾Ｈi Ｄ
ＮＡは、１μｇの化学的に合成されたＥcoＲＩリンカー
（ＢＲＬメリーランド州 ベセスダ）と連結した。１８
時間後、２０分で ６０℃まで加熱してその反応を停止
し、最終濃度１５０mMになるようにＮａＣｌを加え、そ
して混合物を６時間かけて１０U ＥcoＲＩで消化した。
前記のようにアガロースゲル電気泳動法によって開裂お
よび未連結リンカーから修飾Ｈi ＤＮＡとリンカーを分
離した。 【０１２６】調製Ｈi ＤＮＡは、ラムダカロン４ＤＮＡ
の左および右のＥcoＲＩフラグメントと１：１：１のモ
ル比で混合し、そして１８時間かけてＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼと連結した。インビトロパッキング反応を使用し
て、連結化ＤＮＡ混合物をラムダファージ粒子中に詰め
た。４μｌＨ2 Ｏ中の５μｇの連結ＤＮＡを７μｌの２
０mMＴris(pH８），１０mM２−メルカプトエタノール
（２−ＭＥ），３mMＭｇＣｌ2 ，１μｌの１０mMＴris
，pH７．５，１mMスペルミジン，２mMプトレシン，１
０mMＭｇＣｌ2 ，１．５mMＡＴＰ，５mM２ＭＥおよび
Ｅ．コリーＢＨＢ２６９０（−１imm ４３４，ＣＩts，
ｂ２．red ３，Ｅam１５，Ｓam７）溶解産物からの５μ
ｌの音波抽出物に加えた（Ｈohn et al., １９７７，Pr
oc.Nat’l Acad.Sci. ７４：３２５９）。反応混合物
は、２２℃で１時間インキュベートし、ベックマンＳＷ
５０.1ローター中で４時間250,000xｇで３M 〜５M Ｃｓ
Ｃｌ［10mMＴris(pH７．５），１０mMＭｇＣｌ2 ，０．
２％ゲラチン（ＴＭＧバッファー）中でステップグラジ
エント中で遠心分離してパッケージ化ファージを分離し
た。ファージを界面から除き、ＴＭＧに対して透析し
た。このように調製されたファージの力価を測定する
と、Ｈi ゲノムの２５−３００００独立クローンのライ
ブラリーが生成したことを示している。ファージホスト
としてＥ．コリーＫＨ８０２を使用してプラート増強に
よってファージライブラリーを増強して１０-9プラーク
形成ユニット（ＰＦＵ）／ｍｌ含有ファージサスペンシ
ョン５ｍｌを産生した。 【０１２７】６．６．ＰＢＯＭＰ遺伝子の単離 ６．６．１ ＰＢＯＭＰ−１に対するモノクローナル抗
体と反応するタンパク質をコード化するＰＢＯＭＰ遺伝
子の単離 ＬＢカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）アガー上のニトロ
セルロースシートにＨi プラスミドライブラリーを移
し、３７℃で２４時間かけて成長させ、プローブとして
の ＰＢＯＭＰ−１に対する５の非競合モノクローナ
ル抗体混合物を利用するコロニーブロット法により分析
した。混合モノクローナルプローブと反応するクローン
を単離し、そしてそのプラスミドを pＡＡ１５２と指定
した。 【０１２８】第４図は、ベクター pＧＤ１０３に挿入し
た４．２kbＨi ＤＮＡを含有する pＡＡ１５２の制限マ
ップを示す。ウエスターンブロット分析は、クローン p
ＡＡ１５２がポリクローナル抗−ＰＢＯＭＰ−１および
同様にプール化モノクローナル抗体プローブによって認
識される１６００ダルトンタンパク質を発現することを
立証する。その後、クローン pＡＡ１５２は、最初のプ
ールにおいて使用された個々のモノクローナル抗体によ
って認識されるタンパク質を産生することが示される
（第５図）。 【０１２９】pＡＡ１５２に挿入したＳau３Ａは、挿入
の一端においてポリリンカー領域のＢamIII 部位を再成
することが見い出された。このＢamIII からＨi ＤＮＡ
の単一ＢglIII 部位かまたはＸbaＩ部位への欠失は、ウ
エスターンブロットで検出したＰＢＯＭＰの発現の損失
を生じた。ポリリンカーの Ｈinc II部位からＨi 挿入
ＤＮＡのＸbaＩかまたはＢglII部位への欠失は、ＰＢＯ
ＭＰ発現を保持した（第４図）。これらの結果から、我
々はＰＢＯＭＰをコード化する遺伝子が pＡＡ１５２の
Ｈi ＤＮＡ挿入物内のＢglII−Ｂam ＨＩ７３７塩基対
フラグメント中に在ると結論づける。 pＡＡ１５２を
運搬する小細胞の分析（Achtman et al., １９７９，Pr
oc.Nat’l Acad. Sci,ＵＳＡ 76：４８３７−４１）
は、クローン化Ｈi ＤＮＡがそれぞれ１６０００および
４００００ダルトンの２タンパク質をコード化すること
を示した（第６図）。ＪＭ８３（ pＡＡ１５２）のウエ
スターンブロットは、ＰＢＯＭＰ−１に対して生じたプ
ール化モノクローナル抗体が１６０００ダルトンタンパ
ク質と反応することを示す。４００００ダルトン分子量
領域内において、交差反応は無い。 【０１３０】６．６．２ ポリクローナル抗−ＰＢＯＭ
Ｐ−１抗血清と反応するタンパク質をコード化するＰＢ
ＯＭＰ遺伝子の単離 第６．５．１節で記載したように調製した増強ファージ
ライブラリーは、１ｍｌのＴＭＧにおいて１−２０００
pFUに希釈し、そして５０μｌのＥ．コリーＫＨ８０２
（５×１０9 細胞／ｍｌ）を加えた。その混合物を３７
℃で２０分間インキュベートし、ＮＺＹＣＭ媒地、即ち
１０ｇＮＺアミンＡ，５．０ｇＮa Ｃｌ，２．０ｇＭｇ
ＳＯ4 ，７Ｈ2 Ｏ，５ｇイースト抽出物，１ｇカザミノ
酸（１リットル当り）を含む、を含有するアガープレー
ト上の３ｍｌの軟アガーで平板培養した。プレートは、
一夜インキュベートし、３０〜６０分間４℃に冷却し、
そしてプラークをニトロセルースに移した。上記第６．
４．４節で記載したように、ポリクロナール抗−ＰＢＯ
ＭＰ−１でフィルターをプローブした。この方法で種々
の正プラークを検出した。しかしながら、ＰＢＯＭＰ−
１モノクローナル抗体をプローブとして使用した場合に
は正プラークは検出されなかった。プレートから正プラ
ークを採取し、Ｅ．コリー（Ｅ．Ｃoli)ＫＨ８０２にお
ける成長によって増強した。溶解産物のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅゲル／ウエスターンブロット分析によってクローンを
立証した。正クローンの全ては、ＰＢＯＭＰ−１ポリク
ローナル抗体と反応する見掛分子量１６０００ダルトン
のタンパク質を発現した。 【０１３１】このタンパク質は、カロチン４ファージ対
照溶解産物中に存在しなかった。類似実験において、正
クローンからの溶解産物は、モノクローナル抗体と反応
してＰＢＯＭＰ−１となること失敗した。ある正ファー
ジ、それはラムダ１６−３と称されるが、次の分析のた
めに選択した。このファージ単離は、NZYCM ブイヨン中
のＥ．コリーＫＨ８０２中の成長によって増強され、２
０％ポリエチエングリコール６０００による沈降によっ
て回収され、そしてセシウムクロライド平衡グラジェン
トにおいてバンドを示した（ＴＭＧ中の４M ＣｓＣｌ，
ベックマンＳＷ５０．１ローター， 3000,000xｇで２４
時間）。０．１％ＳＤＳおよび２０μｇ／ｍｌプロティ
ナーゼＫ（シグマケミカルコーポレーション，ミズーリ
ー州 セントルイス）処理を５５℃で行ない、その後フ
ェノール抽出およびエタノール沈降によってファージＤ
ＮＡを単離した。 【０１３２】ＥcoＲＩでラムダ１６−３ＤＮＡを消化
し、そしてＨi 染色体挿入物の部分物理マップを得た。
その挿入物の ＥcoＲＩフラグメントを単離し、プラ
スミドベクター pＧＤ１０３にサブクローンした。
細胞溶解産物のウエスターンブロット転写分析法によっ
て、１６０００ダルトンタンパク質に交差反応性ＰＢＯ
ＭＰ−１を発現するフラグメントを運搬するクローンを
同定した。これらの１つを pＡＡ１３０と指定した。
第７図は、 pＧＤ１０３プラスミドにクローン化したＨ
i ＤＮＡからの５．７kbフラグメントを有するプラスミ
ドの制限マップを表わす。 【０１３３】ＰＢＯＭＰ−１に対するモノクローナル抗
体は、 pＡＡ１３０から発現した１６０００ダルトンタ
ンパク質とは反応しなかった（データは示されていな
い）。この組換えプラスミドによって発現されるタンパ
ク質は、しかしながら、ポリクローナル抗−ＰＢＯＭＰ
−１抗血清によって認められた（例えば、第８図参照の
こと）。 【０１３４】pＡＡ１３０を運搬する小細胞の分析（Ach
tman et al.，前記）は、クローン化Ｈi ｂ ＤＮＡが
見掛分子量 16000および１７０００ダルトンのタンパク
質をコードすることを示した。ポリクローナル抗−ＰＢ
ＯＭＰ−１によって、標識化１６０００ダルトンタンパ
ク質は、特異的に免疫沈降化した（データは示されな
い）。このように、プラスミド pＡＡ１３０は、１６０
００ダルトン分子量ＰＢＯＭＰの発現を教える。 【０１３５】挿入物の単一ＰstＩ部位およびポリリンカ
ーの単一ＰstＩの間に挿入されたＤＮＡの切除によって
生じた内部欠失は、交差反応タンパク質の発現に影響を
与えなかった。類似方法によって、このプラスミドのＸ
baＩフラグメントを除去し、そしてＰＢＯＭＰ−１交差
反応性タンパク質の発現が保持された（第７図）。二内
部ＢglII部位の再連結化によって、このプラスミドの付
加的欠失誘導体を生成し、そしてこの誘導体もＰＢＯＭ
Ｐ−交差反応性タンパク質発現を維持した。 【０１３６】低融点アガロースゲルからフラグメントを
単離し、 DNA−ポリメラーゼＩのクレノウフラグメント
でＥstＥII端を満たし、そのフラグメントを pＧＤ１０
３のＨinc II部位にクローニングすることによって７８
１塩基対ＢstＥII−ＸmnＩフラグメントをクローン化し
た。ポリクローナル抗−ＰＢＯＭＰ−１を使用するウエ
スターンブロット分析は、このプラスミドが１６０００
ダルトンＰＢＯＭＰの発現を維持することを示した。 p
ＡＡ１３０の場合のように、このプラスミドから産生し
たＰＢＯＭＰは、モノクローナル抗体と反応してＰＢＯ
ＭＰ−１とならなかった。 【０１３７】このＰＢＯＭＰ遺伝子の局在を立証する独
立の方法として、 pＡＡ１３０の大ＥcoＲＩ−ＰvuIIフ
ラグメントは、 pＬＧ３３９のＥcoＲＩ−ＰvuIIフラグ
メントと連結して pＡＡ１３６と指定された新規なテト
ラサイクリン耐性プラスミドを生成する。このプラスミ
ドは、ウエスターンブロット法で立証されるようにＰＢ
ＯＭＰを発現する。染色体のアルカリ性フォスファター
ゼ遺伝子（ＰhoＡ）の欠失でこのプラスミドは、Ｅ．コ
リー菌株に転換され、そして移動性元素Ｔn ＰhoＡを運
搬する。アルカリ性フォスファターゼ活性を再貯蔵する
pＡＡ１３６へのＴn ＰhoＡ元素の３つの独立移動は単
離された。Ｔn ＰhoＡ部位の pＡＡ１３６への挿入は、
Ｔn ＰhoＡの左末端領域近傍の単一 ＤraＩ制限部位お
よび pＡＡ１３６のＨind III ，ＢstIII ，ＸmnＩ，お
よびＰstＩ部位を使用して測定された。３種の挿入の全
ては、 pＡＡ１３６のＢstＥII−ＸmnＩフラグメント内
に入ると決定された。３種のＴn Ｐho挿入の全ては、Ｐ
ＢＯＭＰ遺伝子の転写が pＡＡ１３６においてＢstＥII
部位からＸmnＩ部位であることを示す同一配向であっ
た。３種のＴn ＰhoＡ移動の全ては、ウエスターンブロ
ットで検出されたように、ポリクローナル抗−ＰＢＯＭ
Ｐ−１抗血清によって検出された１６０００タンパク質
の損失を生じた。ある融合は、ウエスターンブロット上
ポリクローナル抗−ＰＢＯＭＰ−１抗血清によって検出
された60000 ダルトンにおいて新しいバンドを生成し
た。この大きさは、アルカリ性フォスファターゼ（４５
０００ダルトンＭＷ）から１６０００ダルトルＭＷタン
パク質の融合によって生成したであろう融合タンパク質
の予想範囲内である。これらの移動におけるＰhoＡ活性
の回復は、ＰＢＯＭＰタンパク質がメンブラン移動、そ
れ故にメンブランタンバク質であろう、のペプチド信号
を保持することを立証する。 【０１３８】Ｔn Ｐho融合は、Ｔn ＰhoＡとＨi クロー
ン化ＤＮＡ配列間の結合をＭ１３にサブクローンするこ
とにより配列化した。すべての場合において、ＰhoＡコ
ード配列は、 pAA１３０のＰＢＯＭＰ−２遺伝子用の予
想読み取り枠を有する枠であると決定された（後述の第
６．７．２節参照のこと）。 【０１３９】６．７ ＰＢＯＭＰ遺伝子のヌクレオチド
配列決定 ６．７．１ pAA152 によって発現されるＰＢＯＭＰ遺
伝子の配列戦略 pＡＡ１５２によって発現されるＰＢＯＭＰ遺伝子のヌ
クレオチド配列は、 pＡＡ１５２の７３７bpＢglIII −
ＢamＨＩフラグメントのジデオキシヌクレオチド配列化
（Sangar et al.,１９７８，Proc. Nat’l Acad, Sci
ＵＳＡ ７４：５４６３−５４６７）、即ち、Ｍ１３
ファミリー、Ｍ１３mp１８およびmp１９の単一鎖ファー
ジへのサブクローン後であるが、によって得られた。
これらのサブクローンから決定された配列の位置および
方向は、第９図に示されている。ＢglII−ＢamＨＩフラ
グメントの完全ヌクレオチド配列は、第１０図に示され
ている。 【０１４０】pＡＡ１５２の７３７ＢglII−ＢamＨＩフ
ラグメントは、１５３のアミノ酸のポリペプチドをコー
ドする単一読み取り枠（ＯＲＦ）を含む（第１１図）。
ＤＮＡ配列から決定されたＰＢＯＭＰ遺伝子のアミノ酸
組成は、ＰＢＯＭＰ−１精製タンパク質のアミノ酸組成
に極めて匹敵する（第１表および第２表参照のこと）。 【０１４１】 【表２】 （第２表） ───────────────────────────── 成熟ＰＢＯＭＰ−１とＰＢＯＭＰ−２の推定アミノ酸組成 ───────────────────────────── アミノ酸残基 pAA152a の成熟 pAA130b の成熟 ＰＢＯＭＰ−１ ＰＢＯＭＰ−２ ───────────────────────────── アスパラギン酸 ９ ６ アスパラギン ８ ４ トレオニン ７ ５ セリン ６ １３ グルタミン酸 ７ ５ グルタミン ５ ７ プロリン ３ １ グリシン １６ ２４ アラニン ２１ １６ システイン １ １ バリン １０ １８ メチオニン ０ １ イソロイシン ３ １３ ロイシン ９ ５ チロシン １１ ２ フェニルアラニン ３ ２ リシン(Lysine) ７ ７ ヒスチジン ２ ０ アルギニン ６ ６ トリプトファン ０ ０ ─────────────────────────────a 成熟ＰＢＯＭＰ−１の見掛分子量は14,238ダルトン
であった。アミノ酸残基数は１３４であった。b 成熟ＰＢＯＭＰ−２の見掛分子量は13,461であっ
た。アミノ酸残基数は１３６であった。加えて、ＰＢＯ
ＭＰ−１遺伝子は、Ｔ９ペプチド配列がないＬeu−６８
残基が許容されるならば、アミノ酸がＰＢＯＭＰ−１の
Ｔ９内部ペプチドのアミノ酸配列に参加する（３０／３
３）内部ペプチド配列（ＡＡ４８−８１）を有する（第
１２図）。同様に、ＰＢＯＭＰ−１のアミノ末端領域
は、他のメンブラン移動ペプチド配列と類似性を示すア
ミノ酸配列を含有する(Watson,１９８４，Nucleic Acid
s Res. １２：５１４５−５１６４）。これらのデータ
およびモノクローナル抗体結合データから、我々は、こ
の遺伝子がＰＢＯＭＰ−１タンパク質をコードすると結
論づける。 【０１４２】６．７．２ pＡＡ１３０のＰＢＯＭＰ遺
伝子の配列戦略 pＡＡ１３０のＰＢＯＭＰ遺伝子のヌクレオチド配列
は、Ｍ１３mp１８およびmp１９ファージへのサブクロー
ン後 pＡＡ１３０の７８９塩基対のＢstＥII−ＸmnＩ
フラグメントのジデオキシヌクレオチド配列化（Sanger
et al.,前記参照）によって決定した。これらの組換え
ファージは、それぞれＭ１８００１およびＭ１９００１
と指定されている。一般の１７塩基オリゴヌクレオチド
配列化プライマー（ニューイングランド バイオラブ
ス）は、ＢstＥII− ＸmnＩフラグメントの両端からの
配列を決定するために使用された（第１３図参照のこ
と）。２つの付加的なオリゴヌクレオチドは合成され、
ジデオキシヌクレオチド配列用のプライマーとして使用
された（M18 ＰＲＩ，M19 ＲＲ2)。他の配列化プライマ
ーの全ては、ニユーヨーク州ロチェスタープラクシスバ
イオロジックスにおいてアプライドバイオシステム３８
０Ｂ ＤＮＡシンセサイザーで作られた。 それらのプ
ライマーは、ベータシアノエチルホスフェート保護基化
学特性を有する１μモル対照ポアーガラスカラムで製造
された。オリゴヌクレオチド産出物は、十分に純粋であ
り、さらに精製することなくカラムから直接的にプライ
マーを使用することを許容する。第１３図に示されるよ
うに、２合成オリゴヌクレオチドプライマーは、フラグ
メントの各端において約２００ヌクレオチド配列に結合
する。 【０１４３】pＡＡ１３０のＢstＥII−ＸmnＩフラグメ
ントの全 ７８９bpＤＮＡ配列は、第１４図に示され
る。ＯＲＦは、第１５図に示されるようにアンダーライ
ンで示される。このようにＯＲＦは、１５４のアミノ酸
ポリペプチドをコード化する。アミノ末端１８残基ペプ
シドは、他のタンパク質を決定するメンブラン運搬信号
配列に似ている（Watson，１９８４，前記した）。加え
て、 pＡＡ１３０においてＴn ＰhoＡ融合からの配列デ
ータは、３種の移動の全てが１５４アミノ酸ポリペプチ
ドの読み取り枠の中であることを示した。 【０１４４】pＡＡ１３０のＯＲＥのＤＮＡ配列から推
定されるように、提案された成熟遺伝子のアミノ酸組成
は、精製PBOMP-１のアミノ酸分析によって決定されたも
のと著るしく異なる（第１表および第２表）。 pＡＡ１
３０のＰＢＯＭＰ遺伝子のアミノ酸配列を精製ＰＢＯＭ
Ｐ−１タンパク質からのトリプシンペプチドＴ９と比較
すると、顕著な相同性は見い出されなかった。加えて、
この遺伝子によってコード化された生産物がポリクロー
ナル抗−ＰＢＯＭＰ−１抗血清によって認識されるけれ
ども、ＰＢＯＭＰ−１へのモノクローナル抗体によって
認識されない。これらの観察から、 pＡＡ１３０によっ
て発現されるＨi 遺伝子がＰＢＯＭＰ−１用の遺伝子で
はないことは、明らかである。このように pＡＡ１３０
によってコード化されたＰＢＯＭＰ−遺伝子は、ＰＢＯ
ＭＰ−２と指定された。 【０１４５】６．８．組換えE.コリーによって発現され
るＰＢＯＭＰのリポタンパク質としての特徴 第６．１．２節で記載したように、Ｈ．インフルエンザ
から単離されたＰＢＯＭＰ−１は、ラウリン酸，パルミ
チン酸およびパルミチン酸誘導体を含む脂肪酸に共有結
合的に付着するので、細菌リポタンパク質として分類し
得る。次の実験は、組換えＥ．コリーによって発現され
る PBOMPがリポタンパク質として存在するか否か調査す
るために行なった。２種の異なるインビボ方法は、発現
ＰＢＯＭＰのリポタンパク質の性質を立証するために使
用した。 【０１４６】一連の実験において、ＰＢＯＭＰ発現性組
換えプラスミド含有細胞は、放射性標識化脂肪酸の存在
化で培養した。かかる条件下で、共有結合的に付着した
脂肪酸を含有するように形成されたいずれのリポタンパ
ク質も、特異的に放射性標識化されるだろう。ＰＢＯＭ
Ｐ−１発現性プラスミド pＡＡ１５２かまたはＰＢＯＭ
Ｐ−２発現性プラスミド pＡＡ１３０のいずれかを含有
するＥ．コリーＪＭ８３細胞は、５０μＣi/ｍｌ14Ｃ−
パルミチン酸含有Ｍ９最少培地で２時間かけて増殖し
た。全細胞溶解産物（１００００トリクロロ酢酸沈降性
cpm／レーン）を３５mAの一定電流値でもって１５％Ｓ
ＤＳ− ＰＡＧＥゲルで電気泳動した。そのゲルは、サ
リチル酸ナトリウムで飽和し（５×ゲル容積×１Ｍ溶液
で２０分間）、乾燥し、そして−７０℃においてＸＡＲ
−５フィルムで感光した（イーストマンコダックカンパ
ニー，ニューヨーク州 ロチェスター）。同様に培養し
た正常Ｅ．コリーＪＭ８３細胞の細胞溶解産物の全て
は、対照とした。得られた結果は、第１７図に示す。 【０１４７】第１７図に示されるように、約１５０００
ダルトンの放射性標識タンパク質は、 pＡＡ１５２およ
び対照Ｅ．コリー細胞の溶解産物中では見い出されなか
ったpＡＡ１３０を含有するＥ．コリーの溶解産物中で
観察された。このように、ＰＢＯＭＰ−１および組換え
Ｅ．コリーによって発現されたＰＢＯＭＰ−２は、特異
的に放射性標識化される。 他の一連の実験において、
ＰＢＯＭＰ発現性組換えプラスミド含有細胞は、グロボ
マイシン，抗生物質の存在下で培養し、リポタンパク質
信号ペプチターゼの阻害によって既知細菌性リポタンパ
ク質の全てのプロセスを特異的にブロックする（Inukai
et al., １９７８，J. Antibiotics(Tokyo) ３１：１
２０３−１２０５）。 【０１４８】pＡＡ１５２かまたは pＡＡ１３０のいず
れかを含有するＥ．コリーＪＭ８３細胞は、２５μｇ／
ｍｌグロボマイシンの存在下で１時間かけて培養される
（ニューヨーク州 ピスカタウェイ．ロバートウーズシ
ョンソンメディカルデンタルスクールのＤr.Ｍ．イノウ
エから得たものである）。グロボマイシン非処理類似培
養を対照とした。細胞溶解産物の全ては、１５％ＳＤＳ
−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、ニトロセルロースに移
し、そしてポリクローナル抗−ＰＢＯＭＰ−１抗血清で
プローブした。得られた結果を第１８図を示す。 【０１４９】第１８図に示されるように、ＰＢＯＭＰ−
１かまたは ＰＢＯＭＰ−２のいずれかを発現するグロ
ブマイシン処理細胞の溶解産物において、対照または非
処理細胞の溶解産物においては検出されない約１６５０
０ダルトンバンドが観察された。両方の一連のインビボ
実験で得られた実験に基づくと、ＰＢＯＭＰ遺伝子含有
組換えＥ．コリー（Ｅ．coli）によって発現されるＰＢ
ＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２は、リポタンパク質で
ある。 【０１５０】７． ＰＢＯＭＰ−１サブユニットワクチ
ンの効能 ７．１ ＰＢＯＭＰ−１によって誘導された抗血清の殺
菌性活性 抗−ＰＢＯＭＰ−１ポリクローナルラビット抗血清は、
第６．２節の記載のように調製されたものであり、イン
ビトロ補体介在殺菌性アッセイシステムにおいてＨi ｂ
およびＨi の殺害能力について試験した（Musher et a
l., １９８３，Infect, Immun. ３９：２９７−３０
４； Anderson et al.,１９７２，J. Clin. Invest.
５１： ３１−３８参照のこと）。アッセイシステム
で使用する補体源は、プレコロストラル牛血清（PCCS，
Pre-collostralcalf serum）かまたは予め存在する抗ヘ
モフィルス属 （Haemophilus)抗体を除去するために
予め非タイプＨi 菌株，Ｓ２で吸着した正常ラビット血
清（ＮＲＳ）のいずれかであった。ＰＣＣＳは、そのま
まで使用し、ＮＲＳは、Ｈi ｂに対して１：４，非タイ
プＨi に対して１：８に希釈して使用した。希釈液の全
ては、ホスファターゼバッファードサリーン［２０mMホ
スフェートバッファー（pH7.4)，０．１５mMＭｇＣｌ2
および０．５mMＣａＣｌ2 含有０．１５M ＮａＣｌ（Ｐ
ＣＭ）］を使用した。被試験細菌性菌株は、４９０mmに
おいて光学密度で測定されるように１×１０9 細胞／ｍ
ｌ濃度に達するまでＢＨＩ−ＸＶで増強する。細菌は、
ＰＣＭ中で最終濃度１２５０細菌／20μｌに希釈した。
ＰＣＭ中の20μｌの適切な抗体希釈液は、氷上２４ウエ
ル微少力価プレート（Costar）のウエルで２０μｌの補
体源と混合した。微少力価プレートは、氷から除き、そ
して２０μｌの試験希釈細菌を各ウエルに加えた。抗体
非含有ウエルを負対照とした。３７°で３０分間インキ
ュベーションした後、８００μｌのＢＨＩ−ＸＶは、
５６℃で０．７５％アガーを含んでいる、各ウエルに加
え、そして室温で固化した。そのプレートは、３７℃で
一夜インキュベートし、そして次の日に研究した抗血清
のＢＣ力価は、非抗体対照ウエルと比較して、試験細菌
の５０％殺害可能な最も高い希釈液の逆数として研究し
た。 【０１５１】抗−ＰＢＯＭＰ−１は、種々のＨi ｂ臨床
および実験室単離体に対する殺菌性（ＢＣ）活性につい
て試験し、その結果を第３表に示す。 【０１５２】 【表３】 （第３表） ──────────────────────────────────── ヘモフィルス属インフルエンザの実験室および臨床菌株に対する抗−ＰＢＯＭ Ｐ−１抗血清のＢＣ活性 ──────────────────────────────────── 実験室菌株 抗−ＰＢＯＭＰ−１ によって殺された ──────────────────────────────────── ヘモルス属インフルエンザ （Ｈ. influenzae） ＋a/ タイプａ ＨＳＴ−１ ヘモフィルス属インフルエンザ ＋／−b/ タイプｃ ＨＳＴ−５ ヘモフィルス属インフルエンザ ＋ タイプｂ ＨＳＴ−３ ヘモフィルス属インフルエンザ ＋ タイプｂ ＨＳＴ−10 ヘモフィルス属インフルエンザ ＋ タイプｂ ＨＳＴ−12 N.T.ヘモフィルス属インフルエンザ S-2 ＋Ｎ．Ｔ．臨床菌株 N.T.ヘモフィルス属インフルエンザ ＋ ＨＳＴ−３１ N.T.ヘモフィルス属インフルエンザ ＋ ＨＳＴ−３５ＨＩＢ．臨床菌株 １１２ 試験菌株 112菌株は殺害された ａ ＋ ＝試験細菌の５０％殺害 ｂ ＋／−＝約５０％の生存試験細菌 【０１５３】第３表から明らかなように、抗−ＰＢＯＭ
Ｐ−１抗体は、タイプ（例えば、ａ，ｂ，ｃ）および非
タイプＨ．インフルエンザ菌株の両者の広範な臨床単離
体に対してＢＣ活性を有した。１１２Ｈi ｂ臨床単離体
からの１１２は、抗−ＰＢＯＭＰ−１抗血清によって殺
害した。これらの菌株は、南西米国，北東米国および西
部カナダで単離されたものであった。 【０１５４】殺害が抗−ＬＳＰ抗体の結果であるとする
可能性を除くために、ＢＣアッセイは、各ウエル中でイ
ムノゲンを調製するために使用したＨi ｂ菌株からの２
００ｎｇのＬＰＳを加えて行った。実験結果は、第４表
に示す。 【０１５５】 【表４】 （第４表） ────────────────────────── ＬＰＳ吸収抗血清の殺菌活性 ────────────────────────── 抗血清 ＬＰＳa 試験細菌 力 価b ────────────────────────── PBOMP-1 ＋ N.T.H.インフルエンザ ４０ − N.T.H.インフルエンザ １６０ ＋ Hi bイーガン(Eagan) ４０ − Hi bイイーガン ４０ PRP-CRM ＋ N.T.H.インフルエンザ １０ − N.T.H.インフルエンザ １０ ＋ Hi bイーガン ４００ − Hi bイーガン ８００ ──────────────────────────a 零または２００ｎｇＨi ｂイーガンＬＰＳをウエル当
り使用した。 【０１５６】b ５０％細菌生存率を示す抗血清の高い希
釈の逆数として表示した。ＬＰＳは、抗ＰＲＰ力価を１
／２に下げ、Ｈi に対する抗−ＰＢＯＭＰ−１力価を１
／４に下げそしてＨi ｂに対する抗−ＰＢＯＭＰ−１力
価を全く下げなかった。ＬＰＳが抗−ＰＢＯＭＰ−１の
ＢＣ活性を低下させるけれども、それを除去することは
できなかった。抗−ＰＲＰ ＢＣ力価減少によって示さ
れるように、観察された減少のなかのあるものは、疑い
もなく、ＬＰＳの抗−相補活性の結果であった。 【０１５７】７．２ Ｈ．インフルエンザからの幼児ラ
ットの保護 幼児ラット保護の研究は、スミス等の方法に従って行な
った（Smith et al.,１９７３，Rediatrics 52：６３
７−６４４）。スプラグ−ダーレイー（Sprague-Dawle
y）幼児ラットは、ＰＣＭ中の０．１ｍｌの希釈度の変
化するラビット抗血清を用いて生存第４日に腹腔内接種
によって受動免疫化した。免疫化１８時間後、そのラッ
トは、０．１ｍｌのＰＣＭ中の１０4 〜１０6 Ｈi ｂ細
胞で腹腔内に対抗を受けた。感染７２時間後における対
抗ラットの生存は、保護を示した。実験結果を第５表に
示す。 【０１５８】 【表５】 （第５表） ────────────────────────── 抗−ＰＢＯＭＰ−１による幼児ラットの保護 ────────────────────────── Ｈi ｂ 受動トラン 抗血清 生存数 スファーさ 対抗量 対抗菌株 れた抗血清 希 釈 全 数 ────────────────────────── ＨＳＴ−60 ＮＲＳ 1/10 106 0/6 PBOMP−１ 1/10 106 5/5 PBOMP−１ 1/30 106 6/6 PBOMP−１ 1/90 106 6/6 ＨＳＴ−61 ＮＲＳ 1/10 105 0/5 PBOMP−１ 1/10 105 6/6 PBOMP−１ 1/30 105 6/6 PBOMP−１ 1/90 105 3/5 イーガン ＮＲＳ 1/10 104 0/4 （Ｅagan） PBOMP−１ 1/10 104 3/5 PBOMP−１ 1/30 104 5/5 PBOMP−１ 1/90 104 0/5 ────────────────────────── 第５表の結果は、幼児ラットが受動トランスファーされ
た抗−ＰＢＯＭＰ−１抗体によって致死量で対抗に対し
て保護されることを示す。付加的な臨床Ｈi ｂ菌株は、
対抗菌株として幼児ラット髄膜炎モデルにおいて抗-PBO
MP-1が異種Ｈiｂに対して臨床的単離体を保護すること
を示すために使用された。 【０１５９】抗−ＰＢＯＭＰ−１が抗−ＰＲＰの保護効
果をブロックし、または付加的な効果を有するか否か決
定するために、幼児ラットは、保護終点内に希釈された
抗−ＰＲＰおよび抗−ＰＢＯＭＰ−１で受動免疫化し
た。Ｈi ｂで対抗すると、抗血清とともに、上記のいず
れか１つより高希釈液を保護できた（第６表）。第６表
に示される結果は、抗− ＰＢＯＭＰ−１抗体および抗
−ＰＲＰ抗体が互いに干渉せず、そして幼児ラット髄膜
炎モデルにおいて付加的な保護を与えることが可能なこ
とを示す。 【０１６０】 【表６】 （第６表） ────────────────────────── 抗−ＰＢＯＭＰ−１＋抗−ＰＲＰ幼児研究 注 入 血 清 ────────────────────────── 抗-PBOMP-1（1:100)a 抗−ＰＲＰb 生存数／全数c ────────────────────────── − ０／６ ＋ １／６ − １：2000 ２／６ ＋ １：1000 ６／６ ＋ １：3000 ５／６ ＋ １：4000 ４／６ ────────────────────────── a ＰＣＭ中で希釈されたポリクローナルラビット抗−ＰＢＯＭＰ−１ b ポリクローナルラビット抗−ＰＲＰ：ＣＲＭ197 接合体 c ７２時間対抗後の幼児スプラグ−ダーレイラットの生存 【０１６１】７．３ ヒト成人におけるＰＢＯＭＰ−１
の免疫抗原性 ６人のヒト成人有志者は、唯１回の接種を受けた１人を
除き、１ケ月間隔で第６．１節で記載したようにＨ．イ
ンフルエンザから単離したＰＢＯＭＰ−１から成るワク
チン組成を有する二種の接種を受けた（ミョウバンなし
で 5.2μｇＰＢＯＭＰ−１）。血液サンプルは、最初の
接種直前およびその後１ケ月間隔で得た。ワクチン化成
人の特異抗体応答性は、H.インフルエンザＰＢＯＭＰ
（ＥＬＩＳＡ），ジフテリアトキソイド（ＥＬＩＳＡ）
（Engvall et al., １９７２，J. Immunol. １０９：１
２９−１３５に記載のＥＬＩＳＡアッセイの一般的記述
を参照のこと）および Ｈib ＰＲＰポリサッカリド
（Farr−タイプＲＩＡ）（Farr, １９５８，J. Infect,
Dis. １０３：２３９− ２６２のファー（Farr）タイ
プＲＩＡの記述を参照のこと）の抗体力価測定によって
評価した。ＰＢＯＭＰ−１ ELISAアッセイで得られた結
果を第１９図に示す。 【０１６２】第１９図に示されるように、６人のうち３
人は、PBOMP-１に対する抗体力価において顕著な増加を
示した。抗体力価のこの上昇は、ジフテリアトキソイド
かまたはＨi ｂ ＰＲＰのいずれかに特異な抗体の力価
では顕著な変化は観察されなかったけれども（結果は示
されていない）、イムノゲンとして使用したＰＢＯＭＰ
−１に極めて特異的であった。 【０１６３】７．４ 信号なし ＰＢＯＭＰ−１によっ
て誘導された抗血清の殺菌活性 後述の第８．１節の記載のようにプラスミド pＰＸ 167
含有Ｅ．コリーＰＲ１３細胞から得た組換え信号なし
ＰＢＯＭＰ−１（以後 rＰＢＯＭＰ−１と称する）は、
ホワイトニュージーランドラビットを免疫化するために
イムノゲンとして使用した。 rＰＢＯＭＰ−１は、不完
全フロイントのアジュバンド（ＩＦＡ）中で乳化かまた
は水酸化アルミニウムと結合した。 rＰＢＯＭＰ−１
は、０．８５％食塩水において５００μｇ／ｍｌ濃度の
rＰＢＯＭＰ−１と５００μｇ／ｍｌ濃度のミョウバン
を１：１の比率で混合することによって、ミョウバンと
結合する。その混合物は、３７℃で３時間撹拌し、そし
てミョウバンを遠心分離して沈降させた。未結合タンパ
ク質検定用にＢＣＡタンパク質アッセイ（ピアースケミ
ストリーコーポレイション，イリノイ州 シカゴ）によ
って上澄液を検定した。何も検出されなかった。ミョウ
バンは、５０μｇ／ｍｌで生理食塩水に再懸濁した。 r
ＰＢＯＭＰ−１をＩＦＡ（Difco)に１：１の比率で乳化
した。動物は、４週間間隔でいずれかの製剤５０μｇで
筋肉内免疫した。動物は、０．６週および各免疫前に採
血した。 【０１６４】得られた抗−ＰＢＯＭＰ−１ポリクローナ
ルラビット抗血清は、前述第７．１節で記載したよう
に、インビドロ補体介在殺菌アッセイシステムにおける
Ｈi 殺害能のために試験した。最初の免疫化前，０週か
ら第２免疫化の後２週間，６週，に抗血清は、試験し
た。抗血清の殺菌（ＢＣ）活性は、Ｈ．インフルエンザ
（“ネイティブＰＢＯＭＰ−１”と指定された）から単
離したＰＢＯＭＰ−１に対して作って抗血清のそれと比
較した。試験細菌は、非タイプＨ．インフルエンザ菌株
Ｓ−２であった。結果は、第７表に示す。 【０１６５】 【表７】 （第７表） ─────────────────────────── pPBOMP-1a に対する抗血清のＢＣ活性に対する抗血清 ─────────────────────────── 抗血清b ネイティブ rPBOMP−１ rPBOMP−１ PBOMP−１ （ＩＦＡ） （Ａlu） ─────────────────────────── ０週 １：５ １：５ １：10 ６週 ＮＴ １：160 １：80 ハイパーC １：160 ＮＴ ＮＴ イムユン ─────────────────────────── a 試験微生物：非タイプ Ｈ．インフルエンザＳ−２ b 抗血清を得るために使用した免疫化の詳細なテキスト用 c ハイパーイムユン抗血清は、ネイティブPBOMP-1 の多投与用に作られた 抗血清のＢＣ力価は、非抗体対照ウエルと比較して、試験細菌の５０％殺害可 能な最高希釈の逆数として研究された。 【０１６６】両ラビットが免疫前に低レベルのＢＣ活
性、即ち力価 １：５および１：１０を有するが、６週
に得られた血清のＢＣは、ＢＣ活性において顕著に増加
していた。ＩＦＡ中の rＰＢＯＭＰ−１で免疫化したラ
ビットは、１：１６０の力価、ミョウバン中の rＰＢＯ
ＭＰ−１で免疫化したラビットは、１：８０の力価を示
した。ハイパーイムユン抗血清は、ラビットがネイティ
ブＰＢＯＭＰ−１の多投与を受けた後に得られたた。ハ
イパーイムユンラビット抗− ＰＢＯＭＰ−１血清は、
１：１６０の力価を示した。これらの結果は、 rＰＢＯ
ＭＰ−１がヘモフィルス属中のネイティブＰＢＯＭＰ−
１を認識する抗体を引き出し、そして殺菌アッセイシス
テムにおいて生理学的に活性であることを明らかに示
す。 【０１６７】８． Ｅ．コリーにおけるＰＢＯＭＰ発現
高揚のための新規プラスミド ８．１ Ｅ．コリーにおけるＰＢＯＭＰ−１の発現高揚 ＰＢＯＭＰ−１タンパク質は、たぶんネイティブプロモ
ーターのコントロールのもとで、 pＡＡ１５２の７３７
bpＢamＨＩ−ＢglIIフラグメントから発現させられる。
その配列は、良質なコンセンサスリボソーム結合部位お
よび ＰＢＯＭＰ−１遺伝子の開始コドンを含む。この
フラグメント含有プラスミドを有するＥ．コリー中で発
現した ＰＢＯＭＰ−１がウエスターンブロット分析
法によって簡単に検出されるけれども、かかる産生タン
パク質量は、１％の細胞タンパク質よりも少なかった、
即ちネイティブ遺伝子含有Ｈ．インフルエンザ細胞中で
作られたＰＢＯＭＰ−１の量よりも少なかった。 【０１６８】Ｅ．コリー中で高レベルのＰＢＯＭＰ−１
を産生するための最初の試みとして、クローン化遺伝
子、高タンパク質産生を得るために既知のプロモーター
ＬacとラムダＰL のコントロールのもとに置いた。プロ
モーターは、ＰＢＯＭＰ−１開始コドン上流のＢstＮＩ
部位に結合した（第４図）。この部位の開裂は、ネイテ
ィブＰＢＯＭＰ−１プロモーターを除くがリボソーム結
合部位をそのまま残す。 【０１６９】これらの組み立ては、次のように行なわれ
た。第１に、ＰＢＯＭＰ−１遺伝子運搬 pＡＡ１５２の
739bpＢamＨＩ−ＢglIIフラグメントは、プラスミド p
ＵＣ １９のｌacプロモーターのＢamＨＩ部位にクロー
ンした。ｌacプロモーターと同一配向においてＰＢＯＭ
Ｐ−１遺伝子を運搬するクローンは、 pＰＸ１６０と指
定する。Ｅ．コリーＪＭ１０３中の pＰＸ１６０からの
ＰＢＯＭＰ−１の発現は、ネイティブプロモーター調節
の条件であり、ｌac調節条件のもとではなかった。即
ち、明らかにＢglII部位およびＰＢＯＭＰ−１の翻訳開
始コドン間の２４０bpにおける転写終結コドン（信号）
によるからである。その後、プラスミド pＰＸ１６０
は、ＢstＮＩで開裂した。そのＢstＮＩは、ＰＢＯＭＰ
−１開始コドンと遺伝子のコンセンサス翻訳開始部位間
を開裂するが、コード化領域に付着したリボソーム結合
部位を残す。その末端は、Ｅ．コリーＤＮＡポリメラー
ゼＩ（クレノウフラグメント）で満たし、直線化プラス
ミドはＢamＨＩで開裂した。プロモーターのないＰＢＯ
ＭＰ−１遺伝子を運搬する577bp ＢstＮＩ−ＢglIIフラ
グメントは、Ｈinc IIおよびＢamＨＩで開裂した pＵＣ
１９に連結した。 pＰＸ１６６と称するその後生じたプ
ラスミドは、ウエスターンブロット法により、Ｅ．コリ
ーＪＭ１０３のｌacプロモーターの調節条件のもとでＰ
ＢＯＭＰ−１を発現することが見い出された。 【０１７０】ＰＢＯＭＰ−１がＥ．コリーＪＭ１０３ま
たはＨＢ 101菌株のｌacまたはＰLプロモーターから発
現すると、唯低レベルのＰＢＯＭＰ−１が発現した。モ
ノクローナル抗体Ｇ−２０４、これは成熟ＰＢＯＭＰ−
１のアミノ末端２０アミノ酸に結合する、を有するこれ
らの細胞からの溶解産物のウエスターンブロット分析
は、このモノクローナル抗体によって認識された４００
０−５０００ダルトンペプチドの存在を示した（第２０
図）。誘導ＰL プロモーターの調節のもとでＰＢＯＭＰ
−１を発現する細胞において、Ｇ−２０４結合活性の９
０％以上は、この予想分解生成物中であり、Ｅ．コリー
中で高いレベルで発現されたＰＢＯＭＰ−１が不安定で
あることを示した。 【０１７１】プラスミド pＰＸ１６０および pＰＸ１６
６は、外部タンパク質の安定化が報告された突然変異体
を含有する種々のＥ．コリー菌株に転換した。これは、
ＡＴＰ−従属プロテアーゼ（ｌon- ）突然変異体，熱衝
撃応答（htp)および mＲＮＡ−安定化突然変異体（pnp)
を含む。加えて、リポタンパク質としてのＰＢＯＭＰ−
１のプロセスがその安定性を高めるので、プラスミド
は、重要なネイティブＥ．コリーリポタンパク質，ムレ
インリポタンパク質（ｌpp- ）を欠くＥ．コリー菌株中
に置かれた。試験された菌株の全てにおいて、モノクロ
ーナル抗体Ｇ−２０４によって認識されるＰＢＯＭＰ−
１分解生成物は、ほとんど同一レベルで存在した。それ
故に、Ｅ．コリーのＰＢＯＭＰ−１の分解かある他の未
同定によることは、明らかである。 【０１７２】第２の解決手段として、遺伝子のネイティ
ブ信号配列を除去することによって修飾ＰＢＯＭＰ−１
遺伝子を生成した。かかる組み立ては、ネイティブＰＢ
ＯＭＰタンパク質に二つの潜在的な利益をもたらす。第
一に、信号のない ＰＢＯＭＰ−１は、メンブランに移
らないだろう、従ってＰＢＯＭＰ−１の過多発現による
毒性効果は、減少するだろう、第二に、極めて疎水性の
脂質基によって修飾されないので、信号無しＰＢＯＭＰ
−１は、溶液中の単離または貯臓に洗浄剤の使用を要求
しないだろう。 【０１７３】ＰＢＯＭＰ−１の信号無し形態の構成は、
第２１図に示される。第２１図に示されるように、プラ
スミド pＰＸ １６０からのＰＢＯＭＰ−１遺伝子は、
ＡluＩ制限エンドヌクレアーゼでコドン１９において開
裂する。生成するフラグメントは、 pＵＣ１９ポリリン
カー領域内のＳmaＩ制限部位に連結する。生成する遺伝
子は、ネイティブPBOMP-１のアミノ酸配列にアミノ末端
における pＵＣ１９ポリリンカー領域からの付加的な１
８のアミノ酸を加えたものの全てを含有するハイブリッ
ドタンパク質を発現した。このプラスミドは、 pＰＸ１
６７と指定された。 【０１７４】更に第２１図に示されるように、ＰＢＯＭ
Ｐ−１を発現する第二の組換えプラスミドは、ポリリン
カーのＢamＨＩ部位において開裂し、そしてそのフラグ
メントをプラスミド pＩＮIII −ompA３のＢamＨＩ部位
にクローニングすることによって、プラスミド pＰＸ１
６７から誘導された。生成するプラスミド pＰＸ１６８
は、アミノ末端においてＥ．コリーＯＭＰ Ａタンパク
質の信号配列に連結した成熟 ＰＢＯＭＰ−１をコード
化するハイブリッド遺伝子を含む。このハイブリッド生
成物は、リポタンパク質修飾を欠きかつそのアミノ末端
において８個の付加的アミノ酸を含有する成熟ＰＢＯＭ
Ｐ−１を生成するために、ＯＭＰＡ信号配列によってメ
ンブランから処理した。 【０１７５】プラスミド pＰＸ１６７および pＰＸ１６
８は、Ｅ．コリーＪＭ１０３に転換し、組換えＰＢＯＭ
Ｐ−１合成について調べた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥウエスタ
ーンブロット分析により、両プラスミドは、ポリクロー
ナルおよびモノクローナル抗−ＰＢＯＭＰ−１抗血清に
よって認識されたタンパク質をコード化することを示し
た。 pＰＸ１６７から合成された修飾ＰＢＯＭＰ−１
は、イソプロピルチオベータ−ｄ−ガラクトピラノシド
（ＩＰＴＧ）と誘導性であり、細胞質中に位置し、そし
て洗浄剤の不存在下で溶解する。その修飾ＰＢＯＭＰ−
１は、ＩＰＴＧ誘導細胞からの全細胞溶解産物のクマー
シーブル―染色によって検出されず、１％以下の全細胞
タンパク質から成り立っている。 pＰＸ １６８から合
成された修飾ＰＢＯＭＰ−１は、同様にＩＰＴＧと誘導
性であり（ハイブリッドライラックプロモータの制御の
もとで）、媒地に排泄され、同様に洗浄剤の不存在下で
可溶性である。十分に誘導されると、この修飾ＰＢＯＭ
Ｐ−１は、約１〜２mgの細胞レベルで産生された。 プ
ラスミド pＰＸ１６７および pＰＸ１６８は、同様に発
現レベル用に種々のＥ．コリー菌株中で試験した。最も
好結果な組み合せは、Ｅ．コリーＰＲ１３に転換した p
ＰＸ１６７キメラプラスミド、 mＲＮＡ安定化突然変異
体 pnp含有菌株であった。この菌株において、ｌac誘導
後、約２〜３％の全細胞タンパク質においてｌacプロモ
ーターの調節のもとで組換えＰＢＯＭＰ−１は発現す
る。この組換えＰＢＯＭＰ-1は、ｌacα−ペプチドおよ
びＰＢＯＭＰ−１遺伝子のアミノ末端に融合した多クロ
ーニング配列からの約１７アミノ酸を含有する細胞質融
合タンパク質として発現する。 【０１７６】８．１．１ 信号無しＰＢＯＭＰ-1の精製
および特徴 次の実験は、信号無しＰＢＯＭＰ−１を精製しかつ特徴
づけるために行なった（ここでは rＰＢＯＭＰ−１と称
する）。細胞質抽出物の単離 ３７℃においてルリア（Luria)ブイヨンで増強した pＰ
Ｘ１６７含有Ｅ．コリーＰＲ１３の一夜培養からの細胞
は、４℃でＧＳＡローター中において８，０００rpm で
１０分間沈降させた。ペレットは、１／１０容積の１０
mMＴris −ＨＣｌ，pH７．５で洗浄し、そして１０μｇ
／ｍｌＤＮアーゼおよび１０μｇ／ｍｌＲＮアーゼを含
有する１／１００容積の１０mMＴris ，pH７．５に再懸
濁した。細胞は、４０Ｗで１０分間氷上で音波破砕かま
たは２０，０００psi でフレンチプレッシャーセルに３
回通すことのいずれかにより破砕した。未破砕細胞は、
ＳＳ−３４ローターを用いて４℃において１０分間かけ
て１０，０００rpm で遠心分離して除去した。全細胞メ
ンブランは、４℃において６０Ｔi ローターで５５，０
００ rpm ，３０分間遠心分離して、除去した。メンブ
ランを棄て、上澄液を保持した。 【０１７７】細胞出力抽出物のＤＥＡＥ分別 上澄液は、１０mM Ｔris ,pH ７．５で平衡にしたイオ
ン交換ＤＥＡＥ−バイオゲルＡ（バイオラド ラボラト
リーズ，カリフォルニア州 リッチモンド）カラムを通
した。本質的にタンパク質の全ては、これらの条件下で
カラムに結合した。結合 rＰＢＯＭＰ−１および他
のタンパク質を80mMＮａＣｌ含有１０mMＴris ，pH７．
５を用いて徐々に溶出このバッファーによって溶出した
タンパク質の全ては、プールしそして４℃で６０％飽和
硫酸アンモニウムを用いて沈降させて濃縮した。そのペ
レットを遠心分離して集め、残留硫酸アンモニウムを除
去するために同一バッファーに対して透析した後１０mM
Ｔris ，pH．７．５に溶解した。 【０１７８】rＰＢＯＭＰ−１の逆相クロマトグラフィ
ー 上澄液含有 rＰＢＯＭＰ−１は、 dＨ2 Ｏ中の０．１％
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）含有バッファー中に希釈
後、４．６×１５mmＣ−４逆相ＨＰＬＣカラムに流し
た。そのカラムは、同一バッファーを用いて流速２ｍｌ
／分で流れた。タンパク質の大部分は、これらの条件下
でカラムに結合した。結合 rＰＢＯＭＰ−１は、２０分
かけて０．１％ＴＦＡの０〜９５％アセトニトリルグラ
ジェントによって単一ピークとして溶出した。 rＰＢＯ
ＭＰ−１含有巨大ピーク（第２２図，ピーク１参照のこ
と）は集め、フラクションをプールし、溶媒を蒸発して
濃縮した。乾燥 rＰＢＯＭＰ−１は、 dＨ2Ｏに再溶解
した。 【０１７９】ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、前記のように、細胞
質抽出物、 ＤＥＡＥ溶出物およびプラスミド pＰＸ１
６７含有Ｅ．コリーＰＲ１３細胞から得た逆相溶出物に
基づいて行なった。電気泳動後、そのゲルは、クマーシ
ーブリリアントブルー染色で約２時間かけて染色した。
モノクローナル抗体ＧＤ２０４を使用するエウスターン
ブロット分析は、同様に行なった。得られた結果は、第
２３図ＡとＢに示す。 【０１８０】第２３Ａ図に示すように、 rＰＢＯＭＰ−
１は、クマーシー染料で染色する際に、プラスミド pＰ
Ｘ１６７含有Ｅ．コリーＰＲ１３細胞の細胞質抽出物中
に存在する主要なタンパク質である（第２３Ａ図，レー
ン１）。ウエスターンブロット反応性で評価されたよう
に、９５％以上のrPBOMP−１は、細胞質抽出物に位置す
る。細胞質抽出物の調製に洗浄剤が使用されていなかっ
たので、その結果は、これらの細胞から得た rＰＢＯＭ
Ｐ−１が洗浄剤なしで１０mM Ｔris −ＨＣｌ，pH７．
５に可溶性であることを示す。このことは、Ｈi ｂ細胞
から得られたＰＢＯＭＰ−１からそれたものをリポタン
パク質として表わす。 【０１８１】細胞質抽出物を使用する主要な実験は、 p
ＰＸ１６７含有Ｅ．コリーＰＲ１３細胞から得られた r
ＰＢＯＭＰ−１が、それ自身かまたは他の細胞質タンパ
ク質とのいずれかの複合体として水溶液中に存在するだ
ろうということを示す。アクリルアミド−アガロースポ
リマーまたはセファデックスビーズを用いるゲルフィル
トレーションクロマトグラフィーがこの rＰＢＯＭＰ−
１を使用して行なうと、その rＰＢＯＭＰ−１は、100,
000 ダルトン以上の見掛け分子量の位置で溶出した（デ
ータは示されていない）。 ＤＥＡＥ−バイオゲルＡ
（バイオラド ラボラトリーズ，カリフォルニア州 リ
ッチモンド）を使用するイオン交換クロマトグラフィー
は、 rＰＢＯＭＰ−１が特有の塩濃度で単一ピークとし
て溶出しなかった事実を示した。rPBOMP−１は、１０mM
Ｔris ，pH７．５において約２０mM〜７５mMのＮａＣｌ
濃度範囲にわたって溶出した。溶出rPBOMP-1が８０mMＮ
ａＣｌ洗浄液中の多くの溶出タンパク質の１種であるけ
れども、残留する多くの細胞質タンパク質は、８０mM以
上の塩濃度でカラムに結合した。このように、上記のよ
うにＤＥＡＥクロマトグラフィーは、 rＰＢＯＭＰ−１
から多くの不純物タンパク質を除去するための主要なス
テップとして使用した。 【０１８２】第２３Ａ図に示されるように、ＤＥＡＥク
ロマトグラフィーは、細胞質物質中に見い出された多く
のタンパク質を極めて減らし（第23Ａ図，レーン2)、そ
してrＰＢＯＭＰ−１とモノクローナル抗体との反応性
を変更しなかった（第２３Ｂ図，レーン２）。rＰＢＯ
ＭＰ−１のアミノ酸配列は、相対的に疎水性タンパク質
であるべきことを示す。そのことは洗浄剤なしで細胞質
抽出物に可溶性であることを示すけれども、rPBOMP−１
が多くの細胞質タンパク質より疎水性であることが期待
される。 rＰＢＯＭＰ−１含有ＤＥＡＥ溶出物は、前記
のようにＣ−４疎水性相互作用カラムでクロマトグラフ
ィーにかけ、アセトニトリルの増加するグラジェントを
使用して溶出した。このシステムにおいて、より多くの
疎水性タンパク質は、カラムにより強く結合し、そして
アセトニトリルの高濃度において溶出するだろう。 rＰ
ＢＯＭＰ−１が多くの不純物タンパク質よりも強く結合
し、そしてそれらの多くのものの後から溶出すると考え
らられる。フラクション含有 rＰＢＯＭＰ−１をＣ−４
カラムでクロマトグラフィーにかけると、ＰＢＯＭＰ−
１は、カラムから溶出した主要ピークであることが見い
出され（第２１図）、そして驚くべきことに、低アセト
ニトリル濃度で最初に溶出した。 【０１８３】第２３Ａ図，レーン３に示されるように、
rＰＢＯＭＰ−１ピークは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の１０
μｇのタンパク質におけるクマーシーブリリアントブル
ーＲ−２５０染色によって測定されたように、純粋であ
った。そのピークは、クマーシー染色で主および副の２
バンドを示し、両者は、ＰＢＯＭＰ−１のアミノ末端２
０アミノ酸を認識するＰＢＯＭＰ−１のモノクローナル
抗体と反応した（第２３Ｂ図，レーン３）全サイズ rＰ
ＢＯＭＰ−１よりも約2000キロダルトン小さい副バンド
は、より小さなタンパク質が精製プロセスの副産物では
ないことを示すＰＲ１３(pＰＸ１６７）の全細胞抽出物
中にも存在した。溶媒蒸発による濃縮後、精製 rＰＢＯ
ＭＰ−１は洗浄剤なしでも水性溶媒に可溶性であった。 【０１８４】ラビットの免疫法 ニュージーランド
ホワイトラビットは、不完全フロイントアジュバント中
で乳化かまたは水酸化アルミニウムに結合した pＰＸ１
６７を含有するＥ．コリーＰＲ１３細胞から得た rＰＢ
ＯＭＰ−１で免疫化した。 rＰＢＯＭＰ−１は、 rＰＢ
ＯＭＰ−１を０．８５％食塩水中５００μｇ／ｍｌの濃
度でミョウバン（alum）を ５００μｇ／ｍｌ濃度で、
１：１の比率で混合して、ミョウバンと結合した。その
混合物は、３７℃で３時間振盪し、そしてミョウバンを
遠心分離によって沈降した。上澄液は、未反応タンパク
質に関してＢＣＡタンパク質アッセイ（ピアース ケミ
カル コーポレーション，イリノイ州シカゴ）で検定し
た。何も検出されなかった。ミョウバンは、生理食塩水
に５００μｇ／ｍｌで再懸濁した、 rＰＢＯＭＰ−１
は、不完全フロイントアジュバント（Difco)に１：１の
比率で乳化した。動物は、４週間間隔で５０μｇのいず
れかの製剤で筋肉内に免疫化した。動物は、０，６週お
よび各免疫化前に採血した。血清は、エリサ（ELISA)お
よびウエスターンブロット分析を用いて抗−ＰＢＯＭＰ
−１および抗− rＰＢＯＭＰ−１抗体を目的として検定
した。 【０１８５】組換えＰＢＯＭＰ−１を用いる免疫化は、
ＥＬＩＳＡ検定法によって決定されたように、Ｈ．イン
フルエンザ（ネイティブＰＢＯＭＰ−１と称する）から
得たＰＢＯＭＰ−１および組換えＰＢＯＭＰ−１に対す
る抗体力価を引き出した。結果は、第８表に示す。 【０１８６】 【表８】 （第８表） ─────────────────────────── rＰＢＯＭＰ−１に対する抗血清のＥＬＩＳＡ力価 に対するＥＬＩＳＡ力価a 抗-rPBOMP-1 ネイティブ 抗 血 清 アジュバント rPBOMP-1 PBOMP-1 ─────────────────────────── ０週 ミョウバン(Alum) 800 800 ６週 ミョウバン 12,800 12,800 ０週 ＩＦＡ 800 800 ６週 ＩＦＡ 12,800 12,000 ─────────────────────────── a ＥＬＩＳＡ力価は、バックグランドの２倍を生ずる抗血清の最高希釈の逆 数を表わす。 【０１８７】第８表に示されるように、ミョウバンかま
たはＩＦＡのいずれかの rＰＢＯＭＰ−１を用いる動物
の免疫化は、免疫後６週間において rＰＢＯＭＰ−１と
ネイティブPBOMP-１の両者に反応性の抗体の大きな力価
を引き出した。 【０１８８】８．２ Ｅ．コリー中のＰＢＯＭＰ−２の
発現高揚 ＰＢＯＭＰ−２は、プラスミド pＡＡ１３０から低濃度
（セルタンパク質の１％未満）で同様に発現した。PBOM
P-２の発現は、明らかにネイティブプロモーターの制御
のもとである。ＰＢＯＭＰ−２の生産性を高めるため
に、 pＡＡ１３０のＰＢＯＭＰ−２遺伝子は、ＰＢＯＭ
Ｐ−２開始コドンへの単一ＳspＩ制限部位５塩基５’に
おいて開裂し、そして pＵＣ19のＳmaＩ部位に連結す
る。連結は、全ＰＢＯＭＰ−2 ＯＲＦ（信号配列を含
む）に pＵＣ１９からの１８コドンおよび遺伝子融合部
位からの２コドンを含むハイブリッド転写解読枠（ＯＲ
Ｆ）を生ずる。この融合遺伝子のタンパク質生成物は、
１７９９９ダルトンの分子量予想し、そしてｌacプロモ
ーター制御のもとで発現される。このプラスミドは、 p
ＰＸ１６３と称される。 【０１８９】プラスミド pＰＸ１６３がＥ．コリーＪＭ
１０３へ転換しそしてＩＰＴＧで誘導すると、１７，５
００ダルトン見掛分子量のタンパク質は、発現した。加
えて、１５，０００ダルトン分子量のタンパク質双極子
（doublet)は、観察された。３種のタンパク質の全て
は、ウエスターンブロット上の抗−ＰＢＯＭＰ−１抗血
清によって認識された（第２５図）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
のクマーシーブルー染色によって、組換えＰＢＯＭＰ−
２の３種の形は、ｌac誘導後の約１５％全細胞タンパク
質から成っていた（第２５図，レーン３）。 pＰＸ１６
３から発現した組換えＰＢＯＭＰ−２の３種は、単離さ
れ、Ｎ−末端ペプチド分析は次のことを示す。 １．１７，５００ダルトン見掛け分子量バンドは、予想
p ＵＣ１９／ＰＢＯＭＰ−２ハイブリッドタンパク質で
ある。 ２．１５，０００ダルトン分子量以上のバンドは、ＰＢ
ＯＭＰ−２信号配列の第１メチオニン残基から出発し
（即ち、ＰＢＯＭＰ−2 ＯＲＦの開始コドン）そして、
この点における翻訳の再開始によることが明らかであ
る。そして ３．１５０００ダルトン分子量より少ないバンドは、Ｎ
−末端分析にブロックし、そして14Ｃ−パルミテートで
標識化し得る。従って、このバンドは、ＰＢＯＭＰ−２
を処理したリポタンパク質からなる。 【０１９０】９． 微生物の寄託 表にしたプラスミドをもたらす次のエシェリキアコリ菌
株をアグリカルチュラル・リサーチ・カルチャー・コレ
クション（ＮＲＲＬ），ペオリア，ＩＬ（Agricultural
Research Culture Collection （ＮＲＲＬ），Peor
ia，ＩＬ．）で寄託し以下の受入れ番号を得ている。 【０１９１】エシェリキア コリ菌株 プラスミド 受入番号 ＪＭ ８３ pＡＡ１５２ Ｂ−１８１５５ ＪＭ ８３ pＡＡ１３０ Ｂ−１８１５４ ＪＭ ８３ pＧＤ１０３ Ｂ−１８１５３ ＪＭ １０３ pＰＸ１６３ Ｂ−１８２８５ ＰＲ １３ pＰＸ１６７ Ｂ−１８２８６ ＪＭ １０３ pＰＸ１６８ Ｂ−１８２８７ 【０１９２】寄託された実施態様は、本発明の一態様の
単なる説明として意味され、また機能的に等しい微生物
は、本発明の範囲内であるので、本発明は、寄託微生物
による範囲に制限されるものではない。事実、本明細書
に示しまた記載したものに加えて種々の変更は、先の記
載および添付図面から当業者に明らかになるであろう。
このような変更を添附の請求の範囲内にあることを意図
する。 【０１９３】また、ヌクレオチドに対して与えられた全
塩基対は、概算であり説明のために用いられたことを理
解すべきである。 【０１９４】
【図面の簡単な説明】 【図１】 第１図は、ＰＢＯＭＰ−１のドデシル硫酸ナ
トリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）検定を表わす。サンプルおよびゲルを第６．１
節に記載のごとく調合した。レーンＡは、約５μｇＰＢ
ＯＭＰ−１を含む。レーンＢは、予め着色した低分子量
（MW）標準、すなわちオバルブミンアルファー−キモト
リプシノーゲン（chymotrypsinogen）、ベーター−ラク
トグロブリン、リソチーム、ウシトリプシン禁止剤およ
びインスリン（ＡおよびＢ鎖）を含む。関連分子量を側
面に示す。 【図２】 第２図（ＡおよびＢ）は、ポリクローナル抗
ＰＢＯＭＰ−１抗体およびモノクローナル抗ＰＢＯＭＰ
−１抗体（Ｇ１−１）とのエシェリキアコリおよびＨ．
インフルエンザの全細胞溶解産物の反応性を表わす。第
２Ａ図において、溶解産物をポリクローナル抗ＰＢＯＭ
Ｐ−１抗体と反応した。各レーンは、次のとおりであ
る。すなわち（１）エシェリキアコリＨＢ１０１；
（２）エシェリキアコリ ＪＭ８３；（３）分子量標
準；および（４）培養Ｈ．インフルエンザ細胞から得ら
れた純化ＰＢＯＭＰ−１である。第２Ｂ図において、溶
解産物をモノクローナル抗−PBOMP-１抗体と反応した。
レーンは、第２Ａ図に記載のとおりである。 【図３】 第３図は、 pＬＧ３３９の誘導体である pＧ
Ｄ１０３の制限マップである［ストーカーら（Stoker e
t al.,1982，Gene１８：３３５−４１）を参照のこ
と］。 【図４】 第４図（ＡおよびＢ）は、 pＧＤ１０３内に
クローンされたＨ．インフルエンザＤＮＡの４．２kbフ
ラグメントからなる pＡＡ１５２のマップを表わす。遺
伝子コード化 ＰＢＯＭＰ−１を７３７ＢglII−ＢamＨ
Ｉフラグメントに局在定位する。第４Ａ図は、 pＡＡ１
５２の循環制限マップである。第４Ｂ図は、 pＡＡ１５
２の挿入フラグメントの決定検定を示す。遺伝子欠如誘
導体における残余Ｈ．インフルエンザを黒線で示す。 【図５】 第５図は、ＰＢＯＭＰ−１の異なるエピトー
プと反応する個々のモノクローナル抗体との pＡＡ１５
２含有エシェリキアコリ．ＪＭ８３の全細胞溶解産物の
反応性を表わす。レーンは、次のとおりである。すなわ
ち（Ａ）モノクローナル抗体Ｇ１−１；（Ｂ）モノクロ
ーナル抗体Ｇ９４−３；（Ｃ）モノクローナル抗体Ｇ１
８−３；（Ｄ）モノクローナル抗体２５−２；および
（Ｅ）モノクローナル抗体Ｇ２−３である。 【図６】 第６図は、組換えプラスミド pＡＡ１３０お
よび pＡＡ１５２を含有するＤＳ４１０微小細胞（mini
cells)のラジオオートグラム検定を表わす。分子量標準
を同図の左に示した。レーンは、（Ａ）ＤＳ４１０（ p
ＡＡ１３０）；（Ｂ）ＤＳ４１０（ pＧ１０３）；およ
び（Ｃ）ＤＳ 410（ pＡＡ１５２）を示す。カナマイシ
ンアミノグリコシダーゼ（Kanamycin aminoglycosidas
e）の位置を同図の右に示した。 【図７】 第７図（ＡおよびＢ）は、 pＧＤ１０３内に
クローンされたＨ．インフルエンザの５．７kbフラグメ
ントからなる pＡＡ１３０のマップを示す。第７Ａ図
は、 pＡＡ１３０の循環制限マップを示す。第７Ｂ図
は、Ｈ．インフルエンザ挿入 pＡＡ１３０フラグメント
の遺伝子欠如検定を示す。黒一色の線は、遺伝子欠如誘
導体における残余Ｈ．インフルエンザＤＮＡを示す。Ｐ
ＢＯＭＰ表現型を右に示す。遺伝子コード化ＰＢＯＭＰ
を７８１bpＢstＥII−ＸmnＩフラグメントに局在定位す
る。 【図８】 第８図は、ポリクローナル抗ＰＢＯＭＰ−１
抗血清とのエシェリキアコリＪＭ８３および pＡＡ１３
０含有エシェリキアコリＪＭ８３の全細胞溶解産物の反
応性を表わす。レーンは、（Ａ） pＡＡ１３０含有ＪＭ
８３；（Ｂ）pＡＡ１３０含有ＪＭ８３；（Ｃ）ＪＭ８
３；（Ｄ）ＪＭ８３；（Ｅ）同図の右側にキロダルトン
で表示された分子量標準；および（Ｆ）Ｈi Ｓ−２を表
わす。 【図９】 第９図は、種々クローンから決定された発生
源、方向および範囲を示す pＡＡ１５２の７３７挿入フ
ラグメントのＤＮＡ配列法を示す。底部の矢印は、主要
読み取り枠 （ＯＰＦ）の位置を示す。 【図１０】 第１０図は、ＰＢＯＭＰ−１遺伝子を含有
する７３７bpフラグメントのヌクレオチド配列を表わ
す。予想読み取り枠（ＯＲＦ）を下線を引いた配列で示
し転写方向を矢印で示す。 【図１１】 第１１図は、ＰＢＯＭＰ−１の推定アミノ
酸配列を示す。ヌクレオチド配列を下線上に描き、相当
アミノ配列を下側に示す。四角で囲んだアミノ酸は、タ
ンパク質からの成熟した予想Ｎ末端アミノ酸を示す。 【図１２】 第１２図は、ＰＢＯＭＰ−１遺伝子の誘導
アミノ酸配列の部分（上側）とともにＰＢＯＭＰ−１か
ら誘導されたペプチドの部分的アミノ酸配列（下側）の
列を表わす。四角で囲んだ残基は、不適当な組合せを表
わす。 【図１３】 第１３図は、各クローンから決定された発
生源、方向および配列の範囲を示す pＡＡ１３０の７８
９bpＢstII− ＸmnＩフラグメントの配列法を表わす。
下側の矢印は、主要読み取り枠（ＯＲＦ）を示す。 【図１４】 第１４図は、ＰＢＯＭＰ−２遺伝子を含有
する pＡＡの７８９bpＢstII−ＸmnＩフラグメントのヌ
クレオチド配列を示す。予想ＯＲＦを下線を引いた配列
で示す。転写の方向を矢印で示す。「Ｎ」で表わした２
つの塩基は、未知ヌクレオチドを表わす。 【図１５】 第１５図は、ＰＢＯＭＰ−２の推定アミノ
酸配列を示す。ヌクレオチド配列を上側に示しまた相当
アミノ酸配列を下側に示した。四角で囲んだ残余は、タ
ンパク質からの成熟した予想Ｎ−末端アミノ酸である。 【図１６】 第１６図は、ＰＢＯＭＰ−１の脂肪酸の気
液クロマトグラフィーを用いて得られたクロマトグラム
である。ノナデカン酸（Ｃ１９）を内部標準として含め
た。 【図１７】 第１７図は、組換プラスミド pＡＡ１３０
および pG103含有エシェリキアコリＪＭ８３細胞並びに
pＧＤ１０３含有対照エシェリキアコリＪＭ８３細胞ラ
ジオオートグラフＳＤＳ−ＰＡＧＥ検定を表わす。レー
ンは、（１）pＡＡ１３０；（２） pＡＡ１５２および
（３） pＧＤ１０３を示す。分子量約１５，０００のバ
ンドの位置を同図の左側に示す。 【図１８】 第１８図（ＡおよびＢ）は、グロボマイシ
ン（globomycin）の存在下または不存在下 pＡＡ１３０
または pＡＡ１５２含有エシェリキアコリＪＭ８３の全
細胞溶解産物のウエスタンブロットゲル検定を表わす。
分子量標準を第１８図（ＡおよびＢ）の左側に示す。第
１８Ａ図は、ＰＢＯＭＰ−１遺伝子を含有する pＡＡ１
５２含有細胞の溶解産物を表わす。レーンは、（１）グ
ロボマイシン不存在および（２）グロボマイシン存在を
表わす。第１８Ｂ図は、ＰＢＯＭＰ−２遺伝子を含有す
る pＡＡ１３０含有細胞の溶解産物を表わす。レーン
は、（１）グロボマイシン不存在および（２）グロボマ
イシン存在を表わす。 【図１９】 第１９図は、ＰＢＯＭＰ−１（５．２μ
ｇ）からなるワクチン処方をヒト成人に投与した際得ら
れた抗体応答を示す。 【図２０】 第２０図は、モノクローナル抗体Ｇ２０４
とのエシェリキアコリＪＭ１０１またはＪＭ１０３の全
細胞溶解産物の反応性を表わす。レーンは、（Ａ） pＰ
Ｘ１６６含有ＪＭ１０３；（Ｂ） pＰＸ１６０含有ＪＭ
１０３；（Ｃ）ｐＵＣ１９含有ＪＭ１０１；（Ｄ）同図
の左側にキロダルトンで表示した分子量標準；および
（Ｅ）Ｈ．インフルエンザからの自然発生ＰＢＯＭＰ−
１を表わす。 【図２１】 第２１図は、ＰＢＯＭＰ−１シグナル配列
欠如配列をコードするＰＢＯＭＰ−１タンパク質含有プ
ラスミドの構成の概略図である。プラスミドpＰＸ１６
７において、シグナル配列欠如ＰＢＯＭＰ−１をｌacプ
ロモーターから下側に挿入する。血漿 pＰＸ１６３は、
ポリリンカーにおけるＢamＨＩ部位でpＰＸ１６７にＰ
ＢＯＭＰ−１コード配列を分裂し、プラスミド pＩＮII
I − ompＡ3 のＢamＨＩ中に得られたフラグメントをク
ローニングすることにより構成される。プラスミド pＰ
Ｘ１６８は、エシェリキアコリ ompＡタンパク質のシ
グナル配列へのアミノ末端でリンクされた成熟ＰＢＯＭ
Ｐ−１に関してコードするキメラ配列を含有する。 【図２２】 第２２図は、プラスミド含有エシェリキア
コリ菌株ＰＲ１３の細胞質抽出物の上澄フラクションの
逆相Ｃ−４高性能液体クロマトグラフィーを用いて得ら
れたクロマトグラムを表わす。 【図２３】 第２３Ａ図は、クマーシー染色で染色され
たプラスミド pＰＸ１６７を含有するエシェリキアコリ
ＰＲ１３から得られたシグナルレスＰＢＯＭＰ−１のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥを表わす。レーンは、（１）細胞質フラ
クション、（２） ＤＥＡＥ溶出物；および（３）逆相
溶出物を表わす。分子量標準をレーン１の左側まで操作
し、関連ＭＷS （キロダルトン）を同図の左側に示し
た。第２３Ｂ図は、抗PBOMP-１モノクロナール抗体との
該フラクションの反応性を表わす。 【図２４】 第２４図は、ｌacプロモーターから下側に
挿入された ＰＢＯＭＰ−２タンパク質の完全コード配
列を含むプラスミド pＰＸ１６３の構造の概略図であ
る。 【図２５】 第２５図は、ＩＰＴＧの存在下または不存
在下生長した pＰＸ１６３含有エシェリキアコリの全細
胞溶解産物の ＳＤＳ−ＰＡＧＥ検定を表わす。レーン
は、（１）分子量標準：キロダルトン；（２）ＩＰＴＧ
なしで生長した pＰＸ１６３含有ＪＭ１０３の溶解産
物；および（３）レーン２において４時間ＩＰＴＧ（５
mM）の存在で生長したものを表わす。矢印はＩＰＴＧに
より誘導された３つの ＰＢＯＭＰ−２反応性バンドを
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (72)発明者 グリーン，ブルース アメリカ合衆国 ニューヨーク州 14534 ピッツフォード ノースフィー ルド ゲート 49 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA A61K 31/00 631 A61K 39/102 C07K 14/285 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (1)

  1. (57)【特許請求の範囲】 １．第１５図に実質的に示したとおりのアミノ酸配列か
    らなるアミノ酸配列を有する分子量約１６０００ダルト
    ンの外膜タンパク質からなる、ＰＢＯＭＰ−２と称する
    ヘモフィルス・インフルエンザのエピトーブと関係のあ
    る実質的に純粋な抗原性ペプチドまたはタンパク質。 ２．第１５図に実質的に示したとおりのアミノ酸残基１
    ９から１５４までのアミノ酸配列またはその抗原性部分
    からなるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のペプ
    チドまたはタンパク質。 ３．前記のペプチドまたはタンパク質が培養細胞によっ
    て発現されるように遺伝子発現を調節する第２のヌクレ
    オチド配列の制御下にある該ペプチドまたはタンパク質
    をコードするヌクレオチド配列を含有する培養細胞から
    精製されたものである、請求項１または２記載のペプチ
    ドまたはタンパク質。 ４．培養細胞が微生物である、請求項３に記載のペプチ
    ドまたはタンパク質。 ５．微生物が細菌である、請求項４に記載のペプチドま
    たはタンパク質。 ６．微生物が酵母である、請求項４に記載のペプチドま
    たはタンパク質。 ７．培養細胞が動物細胞系である、請求項３に記載のペ
    プチドまたはタンパク質。 ８．培養細胞が昆虫細胞系である、請求項３に記載のペ
    プチドまたはタンパク質。 ９．前記のペプチドまたはタンパク質が化学的に合成さ
    れたものである、請求項１または２記載のペプチドまた
    はタンパク質。 １０．前記のペプチドまたはタンパク質が、（ａ）ヘモ
    フィルス・インフルエンザの物理的に破壊した細胞から
    外膜タンパク質に富む不溶性の細胞壁画分を単離し、そ
    して（ｂ）（ｉ）ヒトへの投与に適する界面活性剤の存
    在下で該画分を加熱するか、または（ｉｉ）該界面活性
    剤の存在下または不在下に該画分をリゾチームで消化す
    るかのいずれかにより、不溶性の細胞壁画分から可溶性
    形態のペプチドまたはタンパク質を得る、ことからなる
    方法により、ヘモフィルス・インフルエンザの細胞培養
    物から得られたものであり、請求項１に記載のペプチド
    またはタンパク質。 １１．ワクチンの免疫源が、製薬学的キャリヤーと混合
    された有効量の、第１５図に実質的に示したとおりのア
    ミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有する分子量約１６
    ０００ダルトンの外膜タンパク質からなる、ＰＢＯＭＰ
    −２と称するヘモフィルス・インフルエンザのエピトー
    ブと関係のある実質的に純粋な抗原性ペプチドまたはタ
    ンパク質からなる、サブユニットワクチン製剤。
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