JPH1057059A - インフルエンザ菌用ワクチンおよび診断法 - Google Patents

インフルエンザ菌用ワクチンおよび診断法

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JPH1057059A
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Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 ヘモフィルス・インフルエンザ外膜タン
パク質の抗原決定基をコードするＤＮＡ配列を含む単離
および精製されたＤＮＡフラグメント、該ＤＮＡフラグ
メントを含む組換えベクター、該組換えベクターを導入
した単細胞生物。 【効果】 本発明によれば、Ｈ．インフルエンザ細菌性
髄膜炎、中耳炎、喉頭蓋炎、および肺炎等の病因因子で
の感染に対して保護する種々のワクチン処方における免
疫原として使用できる、Ｈ．インフルエンザのエピトー
プを特定するＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２のタ
ンパク質並びにペプチドを遺伝子工学的に生産できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、インフルエンザ菌
（Haemophilus influenzae）の外膜と結合したタンパク
質およびペプチドの組成物および製造方法に関するもの
である。特に、本発明は、PBOMP-１およびＰＢＯＭＰ−
２を含む約１６００ダルトン分子量のｂ型および分類不
可能な外膜タンパク質のクラスに関連したタンパク質お
よびペプチドの組成物および製造方法を目的とするもの
である。このタンパク質およびペプチドは、能動免疫法
用および受動免疫法において使用される抗体の発生用の
ワクチン配合物中の免疫抗原としておよび診断法におけ
る薬剤として使用される。このタンパク質およびペプチ
ドは、インフルエンザ菌から新規な改良された精製法に
より得られるか、あるいは組換えＤＮＡ法または化学的
な合成法により製造できる。また、本発明は、タンパク
質およびペプチドに関連した ＰＢＯＭＰ−１および
ＰＢＯＭＰ−２の発現用に有用な、新規なＤＮＡ配列お
よびベクターに関するものである。ヌクレオチド配列
は、核酸ハイブリダイゼーション法における試薬として
使用される。
【０００２】
【従来の技術】
１. 組換えＤＮＡ技術および遺伝子発現 組換えＤＮＡ技術は、特異ＤＮＡ配列のＤＮＡベヒクル
（ベクター）内への挿入を伴い宿主細胞中に複写し得る
組換えＤＮＡ分子を形成する。一般的には、組換えＤＮ
Ａ配列は受領ＤＮＡベヒクルと異質である。すなわち挿
入DNA 配列とＤＮＡベクターは、遺伝子性情報を全く変
換しない生物から誘導されるかあるいはＤＮＡ配列が完
全にあるいは部分的に合成され得る。いくつかの組換え
ＤＮＡ分子の構造を可能にする一般的方法が開発されて
いる。例えば、コーヘンおよびボイヤー（ Cohen and B
oyer）の米国特許第４，２３７，２２４号は、制限酵素
での分裂のプロセスを用い公知の結紮の方法によりリゲ
ージを結合する該組換えプラスミドの産生を記載してい
る。これらの組換えプラスミドをついで転換により導入
し組繊倍地にて生長した原核生物および真核生物細胞を
含む単一細胞培養液に複写する。この特許に記載の技術
の一般的適用性のため米国特許第４，２３７，２２４号
をここに本明細に関連として取り入れる。単一細胞生物
中に組換えＤＮＡ分子を導入する他の方法は、コリンズ
およびホーン（Collins and Hohn）による米国特許第
４，３０４，８６３号に記載されておりこれも関連とし
て本明細書に取り入れる。この方法は、バクテリオファ
ージベクター（コスミド）でのパーケージング／形質導
入システムを利用する。組換え遺伝子をまた、ワクシニ
アウィルス等のウィルス中にも導入する。組換えウィル
スは、ウィルスで感染された細胞内へのプラスミドのト
ランスフェクションにより発生することができる。組立
てに使用する方法に関係なく、組換えＤＮＡ分子は、宿
主細胞と適合性でなければならない。すなわち宿主細胞
に自律性複写できるかあるいは、宿主細胞染色体に安定
に一体化されることができるかである。組換えＤＮＡ分
子またはウィルス（例えばワクシニアウィルス組換体）
はまた、所望の組換えＤＮＡ分子またはウィルスの選択
を許めるマーカー作用を有すべきである。加えて、好ま
しい複写、転写および翻訳シグナルのすべてが正確に組
換えＤＮＡ上に配列された場合、異質細胞は、バクテリ
ア発現プラスミドの場合よくあることだが転換バクテリ
ア細胞においてまたは、複写の真核源（origin）をもた
らす組換えウィルスまたは組換えプラスミドで感染した
任意の細胞系において適切に発現する。異質遺伝子シグ
ナルおよびプロセスエベントは、遺伝子発現の多くのレ
ベル、例えば、ＤＮＡ転写およびメッセンジャーＲＮＡ
（ mＲＮＡ）翻訳をコントロールする。DNA の転写は、
ＲＮＡポリメラーゼの結合を導くことによって mＲＮＡ
合成を促進するＤＮＡ配列であるプロモーターの存在に
依存する。真核プロモーターのＤＮＡ配列は、原核プロ
モーターのものと異なる。さらにまた、真核プロモータ
ーおよび付随遺伝子シグナルは、原核システムに認識さ
れないかまたは作用せず、さらに原核プロモーターは、
真核細胞に認識されず作用しない。同様に原核生物にお
ける mＲＮＡの翻訳は、真核生物のものとは異なる適切
な原核シグナルの存在に依存する。原核生物における効
果的な翻訳は、 mＲＮＡ上のシャイン−ダルガルノ（Sh
ine-Dalgarno）（ＳＤ）配列と呼ばれるリボソーム結合
部位を必要とする。この配列は、開始コドンの前に配置
される、一般にはタンパク質のアミノ末端メチオニンを
コード化するＡＵＧである、 mＲＮＡの短かいヌクレオ
チド配列である。このＳＤ配列は、１６Ｓ rＲＮＡ（リ
ボソームＲＮＡ）の３’末端に相補性でありまたおそら
く rＲＮＡで二重化する(duplexing）ことによりリボソ
ームに mＲＮＡを結合するのを促進しリボソームを正確
に配置する。遺伝子発現の最大化に対するレビューに関
して、ロバーツおよびラウアー（Roberts and Lauer １
９７９，Methsds in Enzymology ６８：４７３）参照の
こと。適当なシグナルが挿入され適切に配置された後で
さえも、多くの他の因子は、原核生物における異質遺伝
子の発現を複雑化する。このような因子の１つとしてエ
シェリキアコリ（Ｅ．Ｃoli ）および他の微生物におけ
る活性タンパク分解性システムの存在がある。このタン
パク質退化システムは、選択的に「異常」または異質タ
ンパク質を破壊するらしい。従って原核退化から微生物
に発現される原核タンパク質を保護する手段の発展によ
り多大な利用がもたらされる。ひとつの方策として、異
質配列を原核遺伝子で相に（すなわち正確な読取り枠
に）結紮するハイブリッド遺伝子を構成することがあ
る。このハイブリッド遺伝子の発現は、融合タンパク質
産生物（原核および異質アミノ酸配列のハイブリッドで
あるタンパク質）をもたらす。クローン遺伝子の首尾よ
い発現は、効率的なＤＮＡの転写、 mＲＮＡの翻訳およ
び数例においてはタンパク質の翻訳後変性を必要とす
る。発現ベクターを好適な宿主における遺伝子を発現す
るためおよびタンパク質産生を増加するために用いられ
ている。クローン遺伝子は、転写を必要の際始めること
ができるようコントロール可能な強力なプロモーターの
次に配置される。細胞を高密度に成長することができ、
ついでプロモーターを誘導して多数の転写を増加するこ
とができる。これは効率的に翻訳される場合、高収率の
タンパク質をもたらすであろう。このことは、異質タン
パク質が宿主細胞に有害である場合特に有効なシステム
である。
【０００３】１．１ 発現に関する宿主システムとして
のエシェリキアコリ エシェリキアコリに共通に用いるほとんどのプラスミド
クローニングベクターは、ＣolＥ１タイプリプリコンの
誘導体である［付加的情報に関しては、オカら（Oka et
al.，１９７９，Mol.Genet.１７２：１５１−１５９）
を参照のこと］。ＣolＥ１プラスミドは、１染色体につ
き約１５〜２０コピーのコピー数を有する単量性分子と
してエシェキアコリ菌株に安定に保持される。種々のレ
ベルのプラスミド中に挿入された異質遺伝子のヒトおよ
び動物タンパク質産生物の発現を得ている。しかしなが
ら高発現レベルを異質タンパク質産生物の産生を経済的
に実行可能になるためシステムに対して適切に得るべき
である。多量のある遺伝子産生物を得る１つの方法とし
て細菌細胞中で非常に高いコピー数を有するプラスミド
上に遺伝子をクローンすることがある。理論上は、特定
遺伝子のコピー数を増加することによって組換えウィル
スの増加産生を導く mＲＮＡレベルも増加する。
【０００４】１．２ 発現ベクターとしてのワクシニア
ウィルス ワクシニアウィルスをクローニングまたは発現ベクター
として用いることができる。該ウィルスは、感染細胞の
細胞形質内で転写する１８７kb程度の線状二重線維ゲノ
ムを含有する。これらのウィルスは、ウィルス感染性に
必要なウィルスコア内で完全な転写酵素システム（覆罩
capping)，メチル化およびポリアデニル化酵素を含む）
を含有する。ワクシニアウィルス規制配列は、ワクシニ
アＲＮＡポリマラーゼによる転写の開始に関しては許め
るが真核ＲＮＡポリマラーゼによるものは許めない。組
換えウィルスにおける異質遺伝子の発現は、異質遺伝子
をコードするタンパク質へのワクシニアプロモーターの
融合を必要とする。挿入ベクターとも呼ばれるプラスミ
ドベクターは、ワクシニアウィルス内にキメラ遺伝子を
挿入するように構成されている。１つのタイプの挿入ベ
クターは、（１）転写開始部位を含むワクシニアウィル
スプロモーター；（２）異質ＤＮＡフラグメントの挿入
に関する転写開始部位から下側のいくつかの唯一の制限
酵素エンドヌクレアーゼクローニング部位；（３）ウィ
ルスゲノムの相同性非本質的領域にキメラ遺伝子の挿入
を導くプロモーターおよびクローニング部位の側面にあ
る非本質的ワクシニアウィルスＤＮＡ（例えばＴＫ遺伝
子等）；および（４）エシェリキアコリにおける複製お
よび選択に関する複製および抗生レジスタンスマーカー
の細菌源から構成される。このようなベクターの例は、
マックケット（Mackett) （１９８４，J.Virol.４９：
８５７−８６４）に記載されている。組換えウィルス
は、ワクシニアウィルスで感染された細胞内への異質遺
伝子を含む組換え挿入プラスミドのトランスフェクショ
ンによって産生される。相同性組換は、感染細胞内で生
じウィルスゲノムへの異質遺伝子の挿入をもたらす。組
換えウィルスをスクリーンすることができ続いて免疫学
的技術、ＤＮＡプラークハイブリダイゼーションまたは
遺伝子選択を用いて単離することができる。これらのワ
クシニア組換体は、その根本的機能あるいは感染性を保
有できかつ３５kd程度の異質ＤＮＡを受け入れるように
構成されることができる。異質遺伝子の発現は、酵素的
または免疫学的検定法［例えば、免疫沈降法、酵素結合
免疫吸着剤検定法（ELISA)、ラジオイムノアッセイまた
はイムノブロッティング］により決定される。加えて、
組換ワクシニア感染細胞から産生される自然発生的糖タ
ンパク質は、グルコシル化され細胞表面に移送され得
る。高発現レベルを適当なベクターまたは好適な宿主に
おける強力なプロモーターまたは単一遺伝子のクローニ
ング多発性コピーを用いて得ることができる。
【０００５】１．３ 発現ベクターとしてのバキュロウ
ィルス オートグラフィカカリフォルニカ（Autographi
ca californica) 核発汗症ウィルス（Ａ cＮＰＶ）のよ
うなバキュロウィルス（baculovirus)もまた、クローニ
ングまたは発現ベクターとして用いることができる。Ａ
cＮＰＶからの感染性は、ウィルス閉塞に通常見い出さ
れる。この構造は、ウィルス粒子がぎっしり取り込まれ
たポリヘドリン（polyhedrin）ペプチドより主に構成さ
れる。ポリヘドリン遺伝子発現は、感染サイクルの非常
に後期、成熟ウィルス粒子が形成された後に生じる。従
ってポリヘドリン遺伝子発現は、不要な機能である。す
なわちポリヘドリン遺伝子発現の不存在下産生された未
閉塞ウィルス粒子が十分に活性でありまた培地中の細胞
を感染することができる。スミスら（Smith et al,.)に
よる欧州特許出願シリーズ番号第８４１０５８４１．５
によると、組換えバキュロウィルス発現ベクターは、バ
キュロウィルスＤＮＡを分裂してポリヘドリン遺伝子ま
たはそのタンパク質からなるフラグメントを産生し該フ
ラグメントをクローニングベヒクル内に挿入した後、ポ
リヒドリン遺伝子プロモーターのコントロール下である
ように発現された遺伝子を挿入することによって調製さ
れる。この方法にて形成された組換え転移ベクターをバ
キュロウィルスヘルパーＤＮＡと混合し培養液中の昆虫
細胞をトランスフェクションするのに使用しバキュロウ
ィルスゲノムのポリヒドリン遺伝子位置で選択遺伝子の
組換え並びに取り込みを行う。得られた組換えバキュロ
ウィルスで被感染性昆虫または培養昆虫細胞を感染する
のに用いる。
【０００６】２．ヘモフィルス（Hemophilus）インフル
エンザおよび疾病 ヘモフィルスインフルエンザ（Ｈ．インフルエンザ）
は、２つのグループ分けられる。公知のカプセルを有す
るこれらの菌株を関連抗血清とカプセルの血清学的反応
によって定型化する。タイプａ〜ｆは既に同定されてい
る。いずれの関連抗血清とも反応しない菌株は、分類不
能として知られている。Ｈ．インフルエンザタイプｂ
（Ｈi ｂ）は、アメリカ合衆国において新生児の髄膜炎
および他の侵略的感染の最も多発する症例である。［フ
レーザーら（Fraser et al., １９７４，Am.J.Epidemi
ol．１００：２９−３４）］。幼児髄膜炎は、主に１〜
５才の間に発生する。Ｈi ｂによるこれらの髄膜炎の６
０％が２才未満の幼児に発生する（フレーザーら，前
述）。分類不能Ｈ．インフルエンザ（Ｈi ）もまた、成
人における肺炎、菌血症、髄膜炎、産後の敗血症および
急性発熱性気管気管支炎等の症病を引き起こすことが現
在十分に確立されている［マーフィーら（Murphy et a
l.,１９８５，J.Infect．Diseases１５２：１３００−
１３０７）］。タイプ別け不能Ｈ．インフルエンザは、
全中耳炎症例の約 ２０〜４０％を引き起こす幼児およ
び若年成人における中耳炎の頻発病因因子である。幼児
は、感染が長期持続性免疫を与えないので同一生物によ
る種々の感染を受けるであろう。慢性または反復性中耳
炎に対する現在の治療法として抗生物または内耳をから
にするための管の挿入がある。Ｈi菌株はまた、洞炎の
主要病例として挙げられる［チェリー ジェイ．ディ
ー．およびジェイ．ピー．ダドレイ，（Cherry J.D.and
J.P.Dudley,１９８１，in Textbook ofPediatric Infe
ctions Disease,Feigin and Cherry eds.,pp１０３−１
０５）］。加えて、分類不能Ｈi は、新生児の敗血症を
引き起こす。ポリリボシルリビトールホスフェート（Ｐ
ＲＰ）からなる分類ｂＨ．インフルエンザ（Ｈi ｂ）の
カプセル性ポリサッカライドに対して産生する抗血清
は、Ｈi ｂに対して殺菌性または保護性であることが示
されている［スミスら（Smithet al.，１９７３，Pedia
trics５２：６３７− ６４４）；アンダーソンら（And
erson,et al.,１９７２，J.Clin.Inv．５１：３１−３
８）］。抗ＰＲＰ抗体は、分類不能Ｈ．インフルエンザ
に対して有効性でない。
【０００７】３．Ｈ．インフルエンザに対するワクチン ヘモフィルスワクチンへの理想的候補は、３つの性質を
有するであろう。すなわち（ａ）２〜６ヶ月の幼児に免
疫原性であること、（ｂ）分類可能および不能Ｈ．イン
フルエンザによって引き起こされた感染に対して保護す
る抗体を引き出すことおよび（ｃ）Ｈ．インフルエンザ
菌株の表面に見い出される決定因子に対する抗体を引き
出すことである。Ｈi ｂ感染に対して保護する現在利用
されるワクチンは、主にＰＲＰ、分類ｂカプセル性ポリ
サッカライドからなる。精製ＰＲＰポリサッカライド
は、年齢１８ヶ月以上の幼児には免疫原性であるが１８
ヶ月未満の幼児においては保護抗体応答を引き出さな
い。一般に、ポリサッカライドは、年齢１８ヶ月未満の
幼児には免疫原性が乏しいことが示されている。この問
題に向けると、種々の研究所は、ＰＲＰをタンパク質キ
ャリヤー分子に化学的に結合させる［アンダーソンら
（Anderson et al.,１９８５，Ped.Res.１８：２５２
A)］またはタンパク質分子と混合する［モンジーら（Mo
nji etal,.１９８６，Infect.Immun．５１：８６５−８
６７）］かのいずれかを研究し始めており、動物または
ヒトに投与されている。タンパク質へのＰＲＰの接合
は、６ヶ月程度のヒト幼児におけて抗ＰＲＰ抗体応答を
引き出すことが示されており一方ＰＲＰのタン白質との
混合は、幼年動物における抗ＰＲＰ抗体を産生している
（モンジーら、前述）。 接合または混合ワクチン処方
がＰＲＰワクチンの１つの困難、すなわち１８ヶ月未満
の幼児を保護することが不可能であることに目を向けら
れているが、これらは、ＰＲＰワクチンの他の主要な問
題に目を向けていない。抗ＰＲＰ抗体は、ＰＲＰカプセ
ルの明確さが欠ける分類不能Ｈ．インフルエンザに対し
て有効でない。従って、分類ｂおよび分類不能Ｈ．イン
フルエンザを含む両方の分類に対して １８ヶ月以下の
幼児において保護免疫応答を引き出すワクチンを確立す
る必要が望まれていた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の１つの目的
は、６ヶ月以下の子供における並びに６ヶ月以上の子供
および成人における分類ｂおよび分類可能Ｈ．インフル
エンザを含むＨ．インフルエンザに対する保護的免疫応
答を引き出すワクチン処方を提供することにある。本発
明のアプローチは、ヘモフィルスの表面上に露出される
タンパク質または、そのフラグメントでワクチン化する
ことである。最適の候補は、Ｈ．インフルエンザの外膜
タンパク質（ＯＭＰ）である。外膜タンパク質は、通常
表面露出分子である。これらは、幼児において通常免疫
原性であるタンパク質より成り、他の細菌系において保
護抗体を引き出すことができることが示されている［ス
ガサワラら（Sugasawara et al.,１９８３，Infect.Imm
un．４２： ９８０−９８５）］。加えてＨi およびＨ
i ｂ菌株は、同様なＯＭＰ外形を有することが示されて
いる［ロエブおよびスミス（Loeb andSmith,１９８０，
Infect.Immun．３０：７０９−７１７)]。ヘモフィルス
のＯＭＰへの抗体は、抗ＰＲＰがＨi ｂに対して殺菌性
およびオプソニンであることが示されている［アンダー
ソンら（Anderson et al.,１９７２，J.Clin. Invest.
５１：３１−３８）；キャテスら（Cates et., al.,１
９８５，Infect．Immun.４８：１８３−１８９）］と同
程度に殺菌性ならびにオプソニンであり得る。外膜タン
パク質は、Ｈi およびＨi ｂに共通であるという不加的
利益を有しかつ両タイプの細菌に対して保護し得る。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、出願人により
同定され「プラクシス・バイオロジクス・アウター・メ
ンブラン・プロテイン−１」 （“Praxis Biologics O
uter Membrane Protein −１”）（ＰＢＯＭＰ−１）と
命名した分子量約１６，０００ダルトンのヘモフィルス
インフルエンザの外膜タンパク質に関するおよびこれも
また出願人により同定され「プラクシス・バイロジクス
・アウター・メンブラン・プロテイン２」（ＰＢＯＭＰ
−２）と命名した分子量約１６，０００ダルトンのヘモ
フィルスインフルエンザの外膜タンパク質に抗原的に関
連するペプチドおよびタンパク質並びに該ペプチドおよ
びタンパク質をコード化する分子的にクローンされた遺
伝子または遺伝子フラグメントを導くものである。本発
明はまた、新規の改良された方法を用いてＨ．インフル
エンザから得られる実際的に純粋なＰＢＯＭＰ−１を導
くものである。本発明のペプチドまたはタンパク質は、
Ｈ．インフルエンザ用ワクチン処方における免疫原とし
てまたはＨ．インフルエンザに対する診断的検定におけ
る指薬として用いることができる。本発明はまた、ＰＢ
ＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２関連ペプチドをコード
化する遺伝子または遺伝子フラグメントの分子クローニ
ングする方法を導くものである。該分子的クローン配列
をついでコード化ペプチドに関する発現ベクターを含む
組換えＤＮＡ技術により他のベクターの別の構造にまた
は核酸ハイブリダイゼーションに基づくＨ．インフルエ
ンザに対する診断的検定に用いるＰＢＯＭＰ−１および
ＰＢＯＭＰ−２を得るのに用いる。本発明のペプチドま
たはタンパク質は、Ｈ．インフルエンザから純化される
か、いずれかのベクター宿主系における組換えＤＮＡ技
術を用いて産生されるかあるいは化学的方法により合成
される。従って、本発明はまた、ペプチドおよびタンパ
ク質が純化され得る適当な宿主細胞におけるＰＢＯＭＰ
−１およびＰＢＯＭＰ−２関連ペプチドまたはタンパク
質を導くのに用いられる新規のプラスミドＤＮＡまたは
ヒトウィルス、動物ウィルス、昆虫ウィルスまたはバク
テリオファージを含むウィルス性ＤＮＡの構成体を導く
ものである。ＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２関連
ペプチドおよびタンパク質の化学的合成を記載する。Ｐ
ＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２関連ペプチドおよび
タンパク質を分類ｂおよび分類不能Ｈ．インフルエンザ
の両分類を含む全病理学的Ｈ．インフルエンザに対して
用いるサブユニットワクチン処方における免疫原として
用いることができる。サブユニットワクチン調製用ＰＢ
ＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２関連タンパク質または
ペプチドを化学的合成、Ｈ．インフルエンザからの純化
または組換え発現ベクターからの純化により得ることが
できる。別に、ＰＢＯＭＰ−１またはＰＢＯＭＰ−２関
連ペプチドおよびタンパク質自身を産生する組換えウィ
ルスまたは、該組換えウィルスで感染された細胞の抽出
物をウィルスワクチン処方における免疫原として用いる
ことができる。このようなＰＢＯＭＰ−１またはＰＢＯ
ＭＰ−２タンパク質は、宿主動物において「異質」とし
て認定されるであろうからＰＢＯＭＰ−１またはＰＢＯ
ＭＰ−２に対して導かれる体液のおよびおそらく細胞媒
介免疫応答を導く。適切に調合されたワクチンにおいて
は、連続的Ｈ．インフルエンザ感染に対して保護すべき
である。さらに本サブユニットワクチン処方は、現在有
効なＰＲＰワクチンと適合性である。本発明のＰＢＯＭ
Ｐ−１関連および／またはＰＢＯＭＰ−２関連配列は、
ヒト医学的検定に用いることができる。これらは、血液
検体、体液および組繊等におけるＨ．インフルエンザの
決定用診断器具として有効なＥＬＩＳＡ試験およびラジ
オイムノアッセイ等の免疫検定における試薬としての本
発明のペプチドおよびタンパク質の使用を含む。ＰＢＯ
ＭＰ−１コード化および／またはＰＢＯＭＰ−２コード
化遺伝子配列をＨ．インフルエンザの同様な診断的検査
に対するＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリ
ダイゼーションに用いることができる。加えて、これら
の試薬は、Ｈ．インフルエンザの病因のメカニズムを引
き出すのに有効な器具を提供する。さらに、本発明は、
受動免疫摂生および診断免疫検定に有いる抗ＰＢＯＭＰ
−１および／またはＰＢＯＭＰ−２モノクローナル抗体
を導く。本発明を以下の発明の実施の形態および特定の
実施態様である実施例並びに添附図面を参照することに
より十分に理解することができる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
５．発明の詳細な説明 本発明は、分子量１６，０００ダルトン程度のＨ．イン
フルエンザ外膜タンパク質のエピトープに関連するタン
パク質またはペプチドすなわちＰＢＯＭＰ−１および分
子量１６，０００ダルトン程度のＨ．インフルエンザ外
膜タンパク質関連のものすなわちＰＢＯＭＰ−２を導
く。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて決定されるとおりの明ら
かな分子量は、いずれの翻訳後変質（例えば脂肪アシル
化およびアセチル化等）を含む総分子量の成熟（すなわ
ちタンパク分解性加工された）形態を表わす。本発明の
タンパク質およびペプチドを組換えＤＮＡ方法によりあ
るいは化学的合成により産生することができる。補足的
に、本発明のタンパク質またはペプチドを単離および純
化の新規かつ改良された方法を用いてＨ．インフルエン
ザの培養液から実質的に純粋な形態にて得ることができ
る。Ｈ．インフルエンザのエピトープを特定するＰＢＯ
ＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２のタンパク質並びにペプ
チドをＨ．インフルエンザ細菌性髄膜炎、中耳炎、喉頭
蓋炎、および肺炎等の病因因子での感染に対して保護す
る種々のワクチン処方における免疫原として用いること
ができる。該ワクチン処方は、ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅおよ
びｆ型を含む分類可能Ｈ．インフルエンザ菌株と分類不
能Ｈ．インフルエンザ菌株の両者に対して有効である。
さらに、本発明は、ＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−
２をコード化する遺伝子のヌクレオチド配列並びにPBOM
P-１およびＰＢＯＭＰ−２およびそのポリペプチドフラ
グメントのアミノ酸配列に関する。本発明のある実施態
様によると、組換ＤＮＡ技術を ＰＢＯＭＰ−１およ
びＰＢＯＭＰ−２エピトープをコード化するヌクレオチ
ド配列を好適なホスト細胞において該配列の制限を導く
制限ベクター内に挿入するのに用いる。該制限ベクター
宿主細胞系をＰＢＯＭＰ−１およびPBOMP-２並びに関連
タンパク質およびペプチドを産生するのに用いることが
できる。遺伝子産生物を培養液中の細胞から純化するこ
とができサブユニットワクチン処方における免疫原とし
て用いることができる。必要により、ＰＢＯＭＰ−１お
よびＰＢＯＭＰ−２タンパク質およびペプチドのアミノ
酸配列を（１）本明細書で教示されるとおりＨ．インフ
ルエンザから単離される実質的に純粋なタンパク質また
は（２）免疫原性ＰＢＯＭＰ−１またはＰＢＯＭＰ関連
タンパク質およびペプチドを発現する組換体に含まれる
Ｈ．インフルエンザヌクレオチド配列のいずれかから推
定できる。このれらのタンパク質およびペプチドをつい
で化学的に合成し、合成サブユニットワクチン処方に用
いる。ＰＢＯＭＰ−１および／またはＰＢＯＭＰ−２配
列を発現する発現ベクターが組換えウィルスである際
に、ウィルスそれ自身をワクチンとして用いることがで
きる。PBOMP-１および／またはＰＢＯＭＰ−２タンパク
質およびペプチドを発現しかつ宿主において疾病を引き
起こさない感染性組換えウィルスを生ウィルスワクチン
調合に用いて実質的免疫性を提供することができる。他
に、不活性ウィルスワクチンをＰＢＯＭＰ−１および／
またはＰＢＯＭＰ−２タンパク質およびペプチドを発現
する「殺された」組換えワクチンを用いて調合すること
ができる。さらに、本発明は、ＰＢＯＭＰ−１および／
またはＰＢＯＭＰ−２に対する多価抗血清およびモノク
ローナル抗体並びに受動免疫用該免疫グロブリンの使用
方法およびＨ．インフルエンザに対する診断的検定を導
く。説明するために、本発明の方法を以下の段階に分け
ることができる。（１）ＰＢＯＭＰ−１タンパク質の単
離および純化；（２）ＰＢＯＭＰ−１の部分的アミノ配
列化；（３）制限ベクター内への遺伝子または遺伝子フ
ラグメントの挿入を含むＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭ
Ｐ−２をコード化する遺伝子および遺伝子フラグメント
の分子クローニングおよび組換え遺伝子産生物の純化；
（４）PBOMP-１およびＰＢＯＭＰ−２をコード化する遺
伝子のヌクレオチド配列化；および（５）純化および組
換えタンパク質およびペプチド産生物に対する抗体の産
生によるＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２タンパク
質および関連タンパク質の免疫潜在能の決定。さらに、
該方法は、（６）ワクチンの処方および（７）体液試料
におけるＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２遺伝子ま
たは遺伝子産生物（および従ってＨ．インフルエンザ）
の検査のための診断的検定を含む。
【００１１】５．１．ＰＢＯＭＰ−１の単離および純化 Ｈ．インフルエンザｂイアガン（Eagan)およびＨ．イン
フルエンザの他の菌株において、外膜タンパク質PBOMP-
１を外膜細胞壁複合体と結合する。ＰＢＯＭＰ−１の純
化における必要段階は、外膜および細胞とかたく結合す
る外膜タンパク質を保持する結合の破壊である。これ
は、次の２段階、すなわち（１）Ｈ．インフルエンザの
物理的に破壊された細胞からＰＢＯＭＰ−１豊富不溶性
細胞膜フラクションを単離し、ついで（２）ヒトへの投
与に好適な洗浄剤の存在下加熱または洗浄剤の存在下ま
たは不存在化のいずれかにてリソチームで細胞壁フラク
ションを消化することにより細胞壁フラクションからＰ
ＢＯＭＰ−１を可溶化する段階からなる本発明の新規か
つ改良された方法により達成される。本発明の新規改良
方法は重要なエピトープを破壊し得、かつヒトへの投与
のためのワクチン用の好ましくない成分であるドデシル
硫酸ナトリウムおよび２−メルカプトエタノール等の変
質剤および還元剤の使用［マンソンら（Munson et al.,
１９８４，Infect.Immun．４９：５４４−４９）］を避
ける。
【００１２】５．１．１ Ｈ．インフルエンザからのＰ
ＢＯＭＰ−１豊富不溶性細胞膜物質の単離 総細胞膜フラクションをこれに限定されないがフレンチ
プレス他均質化装置からの排除による音波振とう（soni
cation）および紛粋を含むＨ．インフルエンザの破壊に
伴う特異性沈降により得ることができる。さらに、総膜
フラクションを密度勾配沈降法またはトリトンＸ-100
（商標）またはＮ−ラウロイルサルコシン、ナトリウム
塩（サルコシル）等の一定の洗浄剤で内膜の特異的可溶
化により内外膜に分割することができる。外膜は、好ま
しくは、１％（w/v)サルコシル１０mMヘペス（ＨＥＰＥ
Ｓ）NaOH，pH７．４溶液中の内膜の特異的可溶化により
調製される。ＰＢＯＭＰ−１の豊富なサブフラクション
を他の細胞膜の特異的洗浄抽出により調製することがで
きる。この豊富化は、例えば、１％オクチルグルコシド
ノニルグルコシド、シィータージェント（Zwittergent)
３−１４（商標）またはシィータージェント３−１４
（商標）で（前述のごとくトリトンＸ１００（商標）ま
たは、サルコシル抽出後に、残る）外膜−細胞壁複合体
を連続抽出しつづいて１％サルコシルでの不溶性物質の
抽出を行い、ついで遠心分離してＰＢＯＭＰ−１豊富不
溶性物質を単離することにより達成される。
【００１３】５．１．２ ＰＢＯＭＰ−１豊富不溶性細
胞膜物質の可溶化 外膜−細胞壁複合体からのＰＢＯＭＰ−１の可溶化は、
以下のアプローチ、すなわち（１）ＰＢＯＭＰ−１を限
定されないがトリトンＸ−１００（商標）、ツィーン８
０、ＣＨＡＰＳ，ＣＨＡＰＳＯ，ドデシルマルトシド、
シィータージェント３−１４（商標）およびシィーター
ジェント３−１６（商標）を含む洗浄剤の１種またはい
くつかの洗浄剤のいずれかの組合せで１時間５５〜６０
℃でＰＢＯＭ−１豊富フラクションの抽出により可溶化
することができる；（２）ＰＢＯＭ−１を洗浄剤の存在
または不在のいずれかの下、リソチームでＰＢＯＭＰ−
１豊富フラクションにおける細胞壁の破壊により可溶化
することができるということの１つまたはその組合せを
用いていくつかの異なる方で達成され得る。好ましい実
施態様によると洗浄剤は、デオキシコールエートおよび
ポリエトキシレートソルビタンモノオレエート（ツィー
ン８０）から選ばれる。代わりに、ＰＢＯＭＰ−１をこ
れに限定するものではないがトリトンＸ−１００（商
標）、サルコシル、オクチルグルコシド、ノニルグルコ
シド、シィータージェント３−１４（商標）またはシィ
ータージェント３−１６（商標）等の洗浄剤の１種ある
いは組合せで全Ｈ．インフルエンザ細胞、外膜またはそ
のサブフラクションを抽出することによって単離するこ
とができる。この抽出を好適な緩衝系内にて５５〜６０
℃または室温で行うことができる。可溶化の後、さらに
ＰＢＯＭＰ−１の純化を限定するものではないがイオン
交換、分子ふるい、疎水性または逆相クロマトグラフィ
ー、アフィーニティークロマトグラフィー、等電点クロ
マトグラフィー、等電点電気泳動および調製的電気泳動
等の当該技術分野に公知の標準方法により達成すること
ができる。
【００１４】５．２．アミノ酸検定およびＰＢＯＭＰペ
プチドの配列化によるＰＢＯＭＰ−１の特性づけ Ｈ．インフルエンザから得られたＰＢＯＭＰ−１をペプ
チドフラグメントの部分的アミノ酸配列化とともにアミ
ノ酸検定で特定づけすることができる。純化タンパク質
におけるアミノ酸の破壊および／または変性を最小化す
るために、トリプタミン含有メタンスルホン酸中のＰＢ
ＯＭＰ−１を加水分解することが好ましい［シンプソン
ら（Simpson etal.,１９７０，J.Biol.Clem.２５１：１
９３６−４０）］。本発明の１つの実験的実施例におい
て、このようなアミノ酸検定を記載（第６．１．１節参
照）のとおり単離した新規ペプチドを特徴づけるために
ＰＢＯＭＰ−１のトリプシンペプチドフラグメントのア
ミノ酸配列化と組み合せた。ヘモフィルス外膜タンパク
質のＮ末端をブロックすることを提案したエドマンケミ
ストリー（Edman Chemistery）によりPBOMP-１を配列す
る初期企みの間困難を経験した。ブラウン（Braun)（１
９７０，Eur.J. Biochem１４：３８７−３９１）による
研究は、脂肪酸がエシェリキアコリのブラウンのリポタ
ンパク質のＮ末端システイン残基と結合することを示し
ている。パルミチル部位をＮ末端システインにアミノ結
合する。すなわち２つの付加的脂肪酸もまた、エシェリ
キアコリブラウンリポタンパク質におけるチオエーテル
結合を形成するグリセリル基をを介して同一システイン
残基に付着する（同上）。従って、Ｈ．インフルエンザ
から得られたＰＢＯＭＰ−１は、さらに、脂肪酸検定に
よっても特性づけされた。このような研究は、本発明の
外膜タンパク質およびＮ末端残基が脂肪酸残基を共有結
合していることを示した。本発明の１実験的実施例にお
いて、このような脂肪酸検定は、３つの主要脂肪酸すな
わちラウリン酸、パルミチン酸およびパルミチン酸誘導
体の存在を明らかにした。共有的に結合する脂肪酸部位
を有する本発明のアセチル化タンパク質およびペプチド
は、Ｈ．インフルエンザに対するワクチン処方に特別有
効であり得る。
【００１５】５．３．ＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ
−２をコード化する遺伝子または遺伝子フラグメントの
分子クローニング ５．３．１ ＰＢＯＭＰ−１および関連ＰＢＯＭＰ類を
コード化する遺伝子の単離 分子量（MW）１６，０００ダルトンのＯＭＰを全試験さ
れたＨ．インフルエンザ菌株（現在数百）においてドデ
シル硫酸ナトリウム電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およ
びウエスタンブロット検定の両方で検定した。モノクロ
ーナル抗体データは、このタンパク質が非常に保護され
ることを示す［マーフィーら（Murphy et al.,１９８
６，Infect．Immun.５４．７７４−４９）］。従って、
いずれのＨ．インフルエンザ菌株もＰＢＯＭＰ遺伝子源
として提供する。多くのＨ．インフルエンザが検出可能
プラスミドまたは誘導可能前期染色体を含有しないので
ＰＢＯＭＰ遺伝子は、おそらく染色体である。従って、
ＰＢＯＭＰ類をコード化するＤＮＡ配列のクローニング
における第１段階は、Ｈ．インフルエンザ染色体ＤＮＡ
からの該配列の単離である。以下、Ｈ．インフルエンザ
遺伝子をコード化するＤＮＡを「Ｈi ＤＮＡ」と呼びま
たＰＢＯＭＰ類をコード化するＤＮＡを「ＰＢＯＭＰ
ＤＮＡ」と呼ぶ。
【００１６】Ｈi ＤＮＡフラグメントを発生するため、
Ｈi ＤＮＡを種々の制限酵素を用いて特異部位で分裂す
ることができる。代わりに、ＤＮＡをフラグメント化す
るため低濃度のDNA アーゼIを用いることができあるい
はＤＮＡを例えば音波振とうで物理的に分けることがで
きる。線状ＤＮＡをついで、これに限定されないがアガ
ロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動、カラム
クロマトグラフィー（例えば分子ふるいまたはイオン交
換クロマトグラフィー）またはショ糖勾配の速度沈降等
の標準技術により寸法に従って分離する。いずれかの制
限酵素または制限酵素の組合せを用いて ＤＮＡがＰＢ
ＯＭＰ遺伝子産生物の免疫潜在能を破壊しない条件でＰ
ＢＯＭＰ含有Ｈi ＤＮＡフラグメントを発生する。例え
ば、タンパク質の抗原部位は約７〜１４のアミノ酸から
なることができる。従ってＰＢＯＭＰペプチドの寸法の
タンパク質は、分泌抗体部位を有することができ従って
多くの部分的ＰＢＯＭＰポリペプチド遺伝子配列は、抗
原部位に関してコードすることができる。その結果、多
くの制限酵素組合せは、好適なベクター内に挿入された
際、異なる抗原決定子からなるＰＢＯＭＰ特定アミノ酸
配列の産生を誘導することのできるＤＮＡフラグメント
を発生するのに用いられる。ひとたびＤＮＡフラグメン
トを発生すると、ＰＢＯＭＰ遺伝子含有特定ＤＮＡフラ
グメントの同定を数多くの方法で達成することができ
る。ＰＢＯＭＰ遺伝子含有ＤＮＡ配列を合成オリゴヌク
レオチドプローブとのＨiＤＮＡフラグメントのハイブ
リダイゼーションにより同定することができる。余剰合
成オリゴヌクレオチドプローブは、ＰＢＯＭＰタンパク
質のペプチドフラグメントのアミノ酸配列に基づいて抗
生される。例えば、合成オリゴヌクレオチドプローブを
第５．１節に記載のＨ．インフルエンザから単離された
実質的に純粋な ＰＢＯＭＰ−１タンパク質のアミノ酸
配列に基づいて合成される。これらの合成プローブを32
Ｐ−アデノシントリホスフェートで放射線標識すること
ができＰＢＯＭＰ特異遺伝子配列含有クローンに関する
Ｈi ＤＮＡライブラリーをスクリーンするのに用いるこ
とができる［アンダーソンら（Anderson et al.,１９８
３，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA８０：６８３８−４２）
を参照のこと］。別にＰＢＯＭＰ遺伝子を「ショットガ
ン」アプローチでクローニングベクター内に挿入後同定
および単離することができる。当該技術分野に公知の数
多くのベクター−宿主系を用いることができる。ベクタ
ー系は、プラスミドまたは変性ウィルスのいずれかであ
り得る。好適なクローニングベクターとしては、これに
限定されないがラムダベクターシステムｇｔｌｌ，ｇｔ
ＷＥＳ．ｔＢおよびカーロン（Charon）４等のウィルス
ベクター類および pＢＲ３２２， pＢＲ３２５， pＡＣ
ＹＣ１７７， pＡＣＹＣ１８４， pＵＣ８， pＵＣ９，
pＵＣ１８， pＵＣ１９， pＬＧ３３９， pＲ２９
０， pＫＣ３７および pＫＣ１０１等のプラスミドベク
ター類および他の同様の系がある。ベクター系は、用い
る宿主細胞と適合性でなければならない。組換え分子を
変換、トランスフェクションまたは接種を経て細胞内に
取り込むことができる。ＰＢＯＭＰ遺伝子または遺伝子
フラグメント含有Ｈi ＤＮＡをクローニングベクター
内に挿入しかつ好適宿主細胞を転換するのに用いる際Ｐ
ＢＯＭＰ遺伝子または遺伝子フラグメントの多数のコピ
ーを発生することができる。これは、相補性末端を有す
るクローニングベクター内にＨi ＤＮＡフラグメントを
結紮することによって達成される。しかしながら、相補
性制限部位が存在しない場合、ＤＮＡ分子の終点を変性
する。このような変性として終点をブラントエンド結紮
できるので単線維ＤＮＡ末端を消化するかあるいは単線
維ＤＮＡ末端を満たすことによってブラントエンドを産
生することを含む。代って、いずれかの所望部位をＤＮ
Ａ末端上にヌクレオチド配列（リンカー）を結紮するこ
とによって産生することができる。これらの結紮リンカ
ーは、制限部位認定配列をコード化する特定の化学的合
成オリゴヌクレオチドから成ることができる。例えば、
マニエーティス（Maniatis）のＤＮＡ変性方法（Maniat
iset al.，１９８２，Molecular Cloning,Cold Spring
Harbor Laboratory, pp.１０７−１１４を参照のこ
と）によると、分割ＤＮＡを制限メチラーゼ（例えば、
M.Eco RI）で処置し、該酵素に関する制限部位をコード
化する合成 ＤＮＡリンカーに結紮する。ＤＮＡを末端
リンカーを分裂する（しかしながら変性内部制限部位を
分裂しない）制限エンドヌクレアーゼで処置し、好適な
ベクターアームに結紮する。別法において、分裂ベクタ
ーおよびＰＢＯＮＰ ＤＮＡフラグメントをホモポリマ
ー性後尾づけ（tailing)で変性することができる。クロ
ーンＰＢＯＭＰ遺伝子の同定をベクターシステムにおけ
るＨi の染色体遺伝子バンクを確立しこれに限定されな
いがＰＢＯＭＰ類に対するポリクローナルまたはモノク
ローナル抗体での特異反応等の本明細書に記載のいずれ
かの方法のよりＰＢＯＭＰ−１またはＰＢＯＭＰ−１関
連タンパク質に関する個々のクローンをスクリーニング
することによって達成することができる。
【００１７】５．３．２ 発現ベクター内へのＰＢＯＭ
Ｐ遺伝子の挿入 ＰＢＯＭＰ類またはそのタンパク質に関してコードする
ヌクレオチド配列を好適な発現ベクター、すなわち挿入
タンパク質コード配列の転写および翻訳に関する必須要
素を含有するベクター内に挿入する。種々の宿主−ベク
ター系をタンパク質コード化配列を発現するのに利用す
ることができる。主として、ベクター系は、使用宿主細
胞に適合性でなければならない。宿主−ベクター系とし
ては限定されないが次のものを含む。バクテリオファー
ジＤＮＡで転換した細菌；プラスミドＤＮＡまたはコス
ミドＤＮＡ；酵母ベクター含有酵母等の微生物；ウィル
ス（例えば、ワクシニアウィルスおよびアデノウィルス
等）で感染された哺乳類細胞系；およびウィルス（例え
ば、バキュロウィルス）で感染された昆虫細胞系があ
る。これらのベクターの発現要素は、その強さおよび特
異性で変化する。利用宿主−ベクターシステムにより、
数多くの好適な転写および翻訳要素のいずれか１つを用
いることができる。遺伝子（または遺伝子のタンパク
質）の効率的発現を得るために、プロモーターは発現ベ
クター内に存在しなければならない。ＲＮＡポリマラー
ゼは、通常プロモーターに結合し、遺伝子または遺伝子
および規制要素群（オペロンと呼ぶ）の転写を開始す
る。プロモーターは、その「強さ」すなわち転写を促進
する能力で変化する。クローン遺伝子を発現するため高
レベルの転写を得るため、従って、遺伝子の発現を得る
ための強力プロモーターを用いるのが望ましい。利用宿
主細胞系にもよるが、数多くの好適なプロモーターのい
ずれか１つを用いることができる。例えば、エシェリキ
アコリ、そのバクテリオファージまたはプラスミドにお
いてクローニングする際、 lacプロモーター、 trpプロ
モーター、 recＡプロモーター、リボソームＲＮＡプロ
モーター、コリファージのＰR およびＰL プロモーター
およびこれに限定されないが lacＵＶ５， ompＦ， bl
a，lpp 等の他のプロモーター等のプロモーターを高レ
ベルの近接ＤＮＡ区域の転写を導くのに用いることがで
きる。加えて、組換えＤＮＡあるいは他の合成ＤＮＡ技
術により産生したハイブリッド trp− lacＵＶ５（ ta
c）プロモーターまたは他のエシェリキアコリプロモー
ターを挿入遺伝子の転写を与えるのに用いることができ
る。特に誘導されない限りプロモーターの使用を禁止す
る細菌宿主菌株および発現ベクターを選択することがで
きる。一定のオペロンにおいて特定のインデューサーの
添加は、挿入ＤＮＡの効率的転写に必要である。すなわ
ち、例えば、 lacオペロンは、ラクトースまたはＩＰＴ
Ｇ（イソプロピルチオ−ベーター−Ｄ−ガラクトシド）
により誘導される。 trp， pro等の種々のオペロンは、
異なる制御下である。 trpオペロンは、トリプトファン
が生長倍地中不存在である際導かれ；またラムダのＰL
プロモーターは、感温ラムダリプレサー、例えば、ｃI
８５７含有宿主細胞における温度の上昇により誘導され
る。この方法で９５％以上のプロモーター誘導転写を未
誘導細胞において禁止し得る。従って遺伝子操作ＰＢＯ
ＭＰタンパク質またはそのペプチドの発現を制御するこ
とができる。これは、クローン遺伝子のタンパク質産生
物が宿主細胞に対して致命的または有害である場合、重
要である。このような場合、転移体は、プロモーターを
誘導しない条件下培養され、また細胞が生長培地におい
て好適密度に達した際、プロモーターをタンパク質の産
生に関して導くことができる。このようなプロモーター
／オペレータ系の１つは、言わゆる「 tac」または trp
− lacプロモーター／オペレータシステムである［ラッ
セルおよびベネット（Russel and Bennet，１９８２，
Gene２０：２３１−２３４）；デボアー（DeBoer），１
９８２年５月１８日出願欧州特許願第 ６７，５４０
号］。このハイブリッドプロモーターは、 −３５b.p.
（−３５領域）の trpプロモーターおよび−10b.p.（−
１０領域またはプリブナウボックス（Pribnow box)）
の lacプロモーターを結合することにより構成される
（ＲＮＡポリマーラーゼ結合部位であるＤＮＡの配
列。）トリプトファンプロモーターの強いプロモーター
特性の維持に加えて、 tacもまたlac レプレッサーで制
御する。真核生物宿主細胞におけるクローニングの際、
強化配列（例えば、７２bpタンデン繰返しのＳＶ４０Ｄ
ＮＡまたはレトロウィルス長末端繰り返しまたはＬＴＲ
等）を挿入して転写効率を増加することができる。強化
配列は、隣接遺伝子に関するその位置および方向に比較
的無関係な方法で転写効率を増加するらしい真核生物Ｄ
ＮＡ要素の一組である。すぐに遺伝子に５'を配置しな
ければならない古典的プロモーター要素（例えば、ポリ
マラーゼ結合部位およびゴールドバーグ−オネス（Gold
berg Hogness）「ＴＡＴＡ」ボックス）とは違い、強化
配列は、真核生物遺伝子から上側、内部または下側から
作用する著しい能力を有しており、従って、挿入遺伝子
に関する強化配列の位置は、危険性が少ない。特定開始
シグナルもまた、真核生物細胞における効率的遺伝子転
写および翻訳に必要である。これらの転写および翻訳開
始シグナルは、遺伝子特異性メッセンジャーＲＮＡおよ
び合成タンパク質の各々の量により測定された「強さ」
で変化する。プロモーターを含むＤＮＡ発現ベクターも
また種々の「強力な」転写および／または翻訳シグナル
のいずれの組合せを含む。例えば、エシェリキアコリに
おける効率的翻訳は、リボソーム結合部位を与えるため
開始コドン（ＡＴＧ）にシャイン−ダルガルノ（Shine-
Dalgarno）（ＳＤ）配列約７〜９塩基５'を必要とす
る。従って、宿主細胞リボソームにより利用し得るいず
れかのＳＤ−ATG 組合せを利用できる。このような組合
せとしてこれに限定されないがコリファージラムダの c
ro遺伝子またはＮ遺伝子からのまたはエシェリキアコリ
トリプトファンＥ，Ｄ，Ｃ，ＢまたはＡ遺伝子からのＳ
Ｄ−ＡＴＧ組合せがある。付加的に、組換えＤＮＡ技術
または、合成ヌクレオチドの取り込みに関与する他の技
術により産生したいずれのＳＤ−ＡＴＧ組合せも用いる
ことができる。ベクター内へのＤＮＡフラグメントの挿
入に関して先に記載のいずれの方法もベクター内の特異
部位内へのプロモーターまたは他のコントロール要素を
結紮するのに利用できる。従ってＰＢＯＭＰタンパク質
またはペプチドに関してコードするＨ．インフルエンザ
遺伝子配列領域を含むＨ．インフルエンザ遺伝子配列を
組換えＤＮＡ分子が宿主細胞内に取り込まれた際に異質
遺伝子を宿主細胞で発現（すなわち転写または翻訳）で
きるためのベンタープロモーターおよびコントロール要
素に関して特異部位で制限ベクター内へ結紮することが
できる。組換えＤＮＡ分子を転換、導入またはトランス
フェクション（ベクター／宿主細胞系による）により好
適な宿主細胞（これに限定されないが細菌、ウィルス、
哺乳類細胞等を含む）に取り込むことができる。転移体
を pＢＲ３２２における抗アンピシリン性または抗トラ
ンスシクリン性または真核生物宿主系におけるチミジン
キナーゼ活性等のベクターに通常存在する１種以上の好
適な遺伝子マーカーの発現に基づいて選択する。このよ
うなマーカー遺伝子の発現は組換えＤＮＡが損われずか
つ複写することを示さなければならない。発現ベクター
は、マーカー機能を通常含むクローニングベクターから
誘導し得る。このようなクローニングベクターとしてこ
れに限定されないが以下のものがある。ＳＶ４０および
アデノウィルス、ワクシニアウィルス、バキュロウィル
ス等の昆虫ウィルス、酵母ベクター，ラムダgt−ＷＥＳ
−ラムダＢ，カーロン（Charon）２８，カーロン４Ａ，
ラムダgt−１−ラムダ ＢＣ，ラムダgt−１−ラムダ
Ｂ，Ｍ１３mp７，Ｍ１３mp８，Ｍ１３mp９等のバクテリ
オファージベクター、または pＢＲ３２２， pＡＣ１０
５， pＶＡ５１， pＡＣＹ 177， pＫＨ４７， pＡＣＹ
Ｃ１８４， pＵＢ１１０， pＭＢ９， pＢＲ３２５，Ｃ
olＥ１， pＳＣ１０１， pＢＲ３１３， pＭＬ２１，Ｒ
ＳＦ２１２４，pＣＲ１，ＲＰ４， pＢＲ３２８等のプ
ラスミドＤＮＡベクター等。接合を介してＨ．インフル
エンザとエシェリキアコリの間の耐薬剤因子の転移［ス
タイ（Study,１９７９，J.Bact．１３９：５２０−５２
９）］；およびエシェリキアコリにおけるヘモフィルス
染色体遺伝子の翻訳［マン（Mann， １９７９，Plasmi
d ２：５０３−５０５）］およびクローニング［マンら
（Mann et al.,１９８０,Gene ３：９７−１１２）］
は、少なくともいくつかの遺伝子が両生物において効率
的に発現し得ることを示し；また転写または翻訳コント
ロールの基礎メカニズムが同様であり得ることを示す。
本発明の実施例における特定の実施態様において、エシ
ェリキアコリプラスミド系を発現ベクターとして選択し
た。しかしながら本発明は、このようなエシェリキアコ
リ発現ベクターの使用に限定されるものではない。遺伝
子操作技術もまた、クローン遺伝子をさらに特性づけお
よび／または適合するのに使用し得た。例えば、ＰＢＯ
ＭＰタンパク質をコード化する遺伝子の変異誘発を導く
部位は、保護抗体応答の発生に応答性のタンパク質の部
位を同定するのに使用し得た。また、これは、例えば、
タンパク質の可溶性を高めより容易に純化するために保
護領域外領域におけるタンパク質を変性するのに用いる
ことができた。
【００１８】５．３．３．発現遺伝子産生物の同定およ
び純化 異質遺伝子挿入物含有発現ベクターを以下の３つの一般
的アプローチで同定し得る。（１）異質挿入遺伝子と相
同性である配列からなるプローブを用いるＤＮＡ−ＤＮ
Ａハイブリダイゼーション、（２）「マーカー」遺伝子
機能（例えば、耐抗生物質性、転換表現型、およびチミ
ジンキナーゼ活性等）の存在または不存在；および
（３）遺伝子産生物の物理的、免疫学的または機能的性
質に基づく挿入配列の発現。ＰＢＯＭＰ遺伝子を発現す
る組換体を同定すると、遺伝子産生物を検定すべきであ
る。究極の目標がワクチン処方におけるこのような産生
物を発現するおよび／または診断的免疫検定における抗
原として遺伝子産生物または組換えウィルスを使用する
ことであるので免疫学的検定は、とりわけ重要である。
種々の抗血清、例えばこれに限定されないが後述の第
６．２節に記載の多価抗血清およびモノクローナル抗体
は、産生物の免疫反応性を検定するのに有効である。本
発明のタンパク質およびペプチドの同定は、 PBOMP関連
タンパク質またはペプチドがＰＢＯＭＰまたはその類縁
体および誘導体に対して誘導される種々の抗体に免疫反
応性であることを必要とする。タンパク質またはペプチ
ドが遺伝子配列の部分である全ＰＢＯＭ遺伝子配列の発
現から生じようと融合タンパク質の産生のため結紮され
る２以上の遺伝子配列から生じようとタンパク質または
ペプチドは、免疫反応性であるべきである。この反応性
は、放射線免疫沈降、放射線競合、ＥＬＩＳＡまたはイ
ムノブロット等の標準免疫学的技術で示し得る。Ｈ．イ
ンフルエンザ関連タンパク質を同定すると、クロマトグ
ラフィー（例えば、イオン交換、アフィーニティーおよ
びサイジングカラムクロマトグラフィー）、沈降および
溶解度差等の標準方法でまたはタンパク質の純化用の他
の標準技術で単離および純化し得る。別に、組換体によ
り産生した免疫反応性Ｈ．インフルエンザＰＢＯＭＰ関
連タンパク質をひとたび同定すると、免疫反応性タンパ
ク質のアミノ酸配列を組換体中に含有されるキメラ遺伝
子のヌクレオチド配列から推定できる。その結果、タン
パク質を当該技術分野に公知の標準化学方法で合成でき
る［例えばハンカピラーら（Hunkapiller et al.，１９
８４，Nature３１０：１０５−１１１）参照のこと］。
本発明の特定の実施態様において、組換ＤＮＡ技術あ
るいは化学的合成法のいずれかにより産生した該ペプチ
ドとしてこれに限定されないが機能的に等しいアミノ酸
残基をわずかな変化を生じる配列内の残基に置き換えた
改良配列を含む第１１図および／または第１５図に実質
的に表わされた全または部分的アミノ酸配列がある。例
えば、配列内の１以上のアミノ酸を機能的に等しく作用
する同様の極性の別のアミノ酸で置き換える結果わずか
に変更する。配列内でのアミノ酸の置き換えは、アミノ
酸の属する類の他のメンバーから選択され得る。例え
ば、無極性（疎水性）アミノ酸として、グリシン、アラ
ニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フ
ェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンがあ
る。極性天然アミノ酸としてセリン、トレオニン、シス
テイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンがあ
る。陽性帯電（塩基性）アミノ酸としてアルギニン、リ
シンおよびヒスチジンがある。陰性帯電（酸性）アミノ
酸としてアスパラギン酸およびグルタミン酸がある。
【００１９】５．４．ＰＢＯＭＰ遺伝子のヌクレオチド
配列化 ＰＢＯＭＰ遺伝子含有ＤＮＡのフラグメントをひとたび
同定したら、これらの遺伝子の実際のヌクレオチド配列
をＤＮＡの配列検定により確認できる。塩基対の配列順
序をマクサムおよびギルバート（Maxam and Gilbert,１
９８０，Methods in Enzymology,６５：４９）の方法ま
たはデオキシ法［サンガーら（Sanger et al.,１９７
７，Proc． Nat'l Acad.Sci.USA７４：５４６３）］の
いずれかの方法で決定できる。ＰＢＯＭＰ遺伝子の実際
の開始および停止シグナルを読み取り枠のヌクレオチド
配列の検定により確認できる。［ローゼンバーグら（Ro
senberg et al.， １９７９，Ann.Rev.Gent．１３：３
１９）］。より多くの読み取り枠を特定ＤＮＡフラグメ
ントに見い出した際、実際の遺伝子の同一性をＰＢＯＭ
Ｐのアミノ酸配列に遺伝子産生物の予想アミノ酸配列を
比較することにより確認できた。好適な読み取枠の配置
もまた遺伝子融合の使用により確認できる。
【００２０】５．５．ＰＢＯＭＰの免疫潜在能の決定 ｂ型ヘモフィルスインフルエンザのポリサッカライド、
すなわちＰＲＰへの抗体での実験は、インビトロ検定に
おいて細菌を殺しかつ動物モデル系におけるＨi ｂでの
免疫テストに対して保護する抗体の能力は、ヒト幼児に
おいて保護免疫応答を引き出す能力とほぼ相関すること
を示している。本発明のＰＢＯＭＰタンパク質およびペ
プチドへの応答において引き出される抗ＢＯＭＰ抗体
は、Ｈi およびＨi ｂの両方を殺しＨi ｂでの免疫テス
トからの動物モデル系において保護する能力を示すため
同様のインビトロ検定システムおよび動物モデル系を用
いて試験し得る。これらのシステムからの結果は、保護
免疫応答を引き出しヒト幼児、小児および成人用ワクチ
ンとして利用するため各 PBOMPの潜在能と同様な相関を
示すべきである。Ｈ．インフルエンザに対するＰＲＰお
よびリポポリサッカライド（ＬＰＳ）の抗体の細菌活性
を予め用いられているインビトロ補体媒介細菌検定シス
テム［マッシャーら（Musher et al.,１９７２，J.Cli
n.Invest.５１：３１−３８）］は、特定ＰＢＯＭＰペ
プチドまたはそのフラグメントに対して誘導される抗体
がｂ型Ｈ．インフルエンザおよび分類不能Ｈ．インフル
エンザに対する細菌活性を有するか否かを決定するのに
用いられた。これらの検定を広範囲の菌株を殺すかどう
かを決定するために比較的多数の両タイプ細菌の臨床単
離体に対して実施できる。このようなインビトロ細菌を
説明する実施例については後述の第7.1.節を参照のこ
と。さらに保護抗体応答を引き出すＰＢＯＭＰの能力に
対するデータを幼年ラット髄膜炎モデル系の使用により
もたらすことができる［スミスら（Smith et al.，１９
７３， Infect.Immun．８：２７８−２９０）］。生後
６日前に対抗した幼年ラットは、好適服用量のＨ．イン
フルエンザｂ型を受けたものであり、ヒト幼児に見られ
るのと同様な菌血症および致命的髄膜炎を成長させる。
対抗菌株に対して細菌性である抗体を対抗前に幼年ラッ
トを受動的に免疫化するのに用いる場合、ついでこれら
を髄膜炎および死亡から保護する。ｂ型ヘモフィルス用
最新ワクチンに対して誘導される抗体、ＰＲＰは、この
幼年ラットモデル系において保護的である。ｂ型ヘモフ
ィルス髄膜炎に対する受動的保護をラビットポリクロー
ナル抗ＰＢＯＭＰ抗体で幼年ラットを免疫化し、ひきつ
づきラットを致死量のＨ．インフルエンザｂ型で対抗す
ることによって示すことができた。本発明のタンパク質
およびペプチドにより引き出されたこのようなインビボ
保護抗体を説明する実施例に関しては、後述の第７．２
節を参照のこと。Ｈi に対して保護する特定ＰＢＯＭＰ
への抗体の能力に対するデータをチンチラ（chinchill
a）中耳炎動物モデルシステムを用いて得ることができ
た。［バーレンカンプら（Barenkamp et al.，１９８
６，Infect Immun．５２： ５７２−７８）］。この動
物モデルにおいて、チンチラをＨi で内耳管の接種によ
り対抗する。ヒトに見られるのと非常によく似た中耳炎
が発達する。Ｈi ＯＭＰで活性的またはＨi ＯＭＰに対
して導かれた抗体で受動的にのいずれかで免疫化された
チンチラをＨi での聴覚対抗に対して保護する（バーレ
ンカンプら前述）。この動物モデル系をＨi に対して保
護するＰＢＯＭＰへの抗体の能力を示すのに用いること
ができた。抗ＰＢＯＭ抗体が幼年動物モデルの使用によ
り抗ＰＲＰ抗体に加えて付加的保護が可能であることを
示すことは、可能である。抗ＰＢＯＭＰ１がもはやＨi
ｂでの対抗に対して幼年ラットを保護することができな
い点まで稀釈し、同様の稀釈の抗ＰＲＰ抗体と混合した
抗ＰＢＯＭＰ１抗体は、付加的保護を示すことができ、
そしてそれ故に幼年ラットの死亡を防ぐことができる。
この付加的保護は、PRP またはそのフラグメントまたは
接合体とＰＢＯＭＰまたはそのフラグメントから構成さ
れる可能混合ワクチンに有効である。
【００２１】５．６．ワクチンの処方 ヒトまたは動物内に後述のワクチン処方を導入するため
に多くの方法を用いることができる。例えばこれに限定
されないが皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下および
鼻腔内の投与の経路がある。
【００２２】５．６．１ サブユニットワクチン処方 本発明の一つの目的は、Ｈ．インフルエンザ感染の髄膜
炎および他の疾病症状に対して保護するワクチン処方に
おける免疫原として用いられるＰＢＯＭＰ−１，ＰＢＯ
ＭＰ−２および関連タンパク質およびペプチドを含む
Ｈ．インフルエンザの外膜タンパク質に関連するタンパ
ク質またはペプチドを提供することである。サブユニッ
トワクチンは、単に宿主を免疫化するのに必要な適切な
免疫原性物質からなる。免疫遺伝子学的処理免疫原、化
学合成免疫原および／または本明細書に記載のごとく単
離された確かな実質的に純粋なＨ．インフルエンザＰＢ
ＯＭからなる免疫原から処方され、保護免疫応答を引き
出すことのできるワクチンは、受領者の感染の危険がな
いので特に有効である。従ってＰＢＯＭＰ関連タンパク
質またはそのフラグメントを ＰＢＯＭＰを発現する組
換体から純化できる。このような組換としては、細菌転
移体、酵母転移体またはＰＢＯＭＰエピトープを発現す
る組換体で感染された培養細胞がある（前述の第５．３
節および第５．４節を参照のこと）。他にＰＢＯＭＰ関
連タンパク質またはペプチドを化学的に合成できる。こ
のため、このようなタンパク質またはペプチドをその発
現を誘く遺伝子のヌクレオチド配列から推定できる（前
述の第５．４節を参照のこと）。さらに別の実施態様に
おいて、ＰＢＯＭＰ関連タンパク質またはペプチドを
Ｈ．インフルエンザ培養液から実質的に純粋な形態で単
離できる（例えば、前述の第５．１節を参照のこと）。
免疫原が組換体から純化されようと化学的に合成されよ
うと、最終産生物を好適濃度に調節しいずれかの好適な
ワクチンアジュバンドで処方する。好適なアジュバンド
としては、これに限定されるものではないが、界面活性
剤、例えば、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミ
ン、オクタデシルアミノ酸エステル、リゾレシチン、ジ
メチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、Ｎ，Ｎ−
ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシプロパ
ンジアミン）、メトキシヘキサデシルグリセロールおよ
びプルロニックポリオール；ポリアミン類（plyamines)
例えば、ピラン、デキストランスルフェート、ポリＩ
Ｃ、ポリアクリル酸、カーボポール；ペプチド類、例え
ばムラミルジペプチド、ジトチルグリシン、ツフトシン
（tuftsin)；オイルエマルジョン；および鉱物ゲル例え
ばアルミニウムヒドロキシド、アルミニウムホスフェー
ト等がある。免疫原もまたワクチン処方に用いるためリ
ポソーム内に導入またはポリサッカライドおよび／また
は他のポリマーに接合することができる。本発明のこの
態様のさらに別の実施態様において、ＰＢＯＭＰ関連タ
ンパク質またはペプチドは、ハプテン、すなわち同形の
抗体と特異的または選択的に反応するものに抗原性であ
るが免疫応答を引き出せないものに免疫原性でない分子
である。このような場合、ハプテンをキャリーヤーまた
は免疫原性分子に共有結合できる。すなわち、例えば、
タンパク質血清アルブミン等の巨大タンパク質は、免疫
原性をそれと結合するハプテンに与える。ハプテン−キ
ャリヤーをサブユニットワクチンとして使用するために
処方できる。
【００２３】５．６．２ ウィルス性ワクチン処方 本発明の別の目的は、Ｈ．インフルエンザの髄膜炎また
は他の疾病症状に対して保護するのに用いられる生組換
ウィルス性ワクチンまたは不滑性組換ウィルス性ワクチ
ンのいずれかを提供することである。このため、組換え
ウィルスをＰＢＯＭＰ関連エピトープを発現するように
調合する（前述の第５．３節および第５．４節を参照の
こと）。組換ウィルスが免疫化されるが疾病を引き起こ
されない宿主に感染症である場合、宿主における増殖が
長期刺激を導き、従って、実質的に長期持続免疫性を与
えるので生ワクチンが好ましい。宿主内に導入した際感
染性組換えウィルスは、そのキメラ遺伝子からＰＢＯＭ
Ｐ関連タンパク質またはペプチドフラグメントを発現で
きそしてそれによりＨ．インフルエンザ抗原に対する免
疫応答を引き出せる。このような免疫応答が連続Ｈ．イ
ンフルエンザ感染に対して保護的である場合には、生組
換ウィルス自身をＨ．インフルエンザ感染に対する抑制
ワクチンに用いることができる。このような組換えウィ
ルスの産生は、インビトロ（例えば、組繊培養細胞）と
インビボ（例えば、未処理宿主動物）系のいずれも含
む。例えば痘瘡ワクチンを調製し処方する従来の方法を
ＰＢＯＭＰ関連タンパク質またはポリペプチドを発現す
る生組換えワクチンに適応できる。多価生ウィルスワク
チンをＨ．インフルエンザPBOMP のエピトープに加えて
疾症を引き起こす生物のエピトープを発現する単一また
はいくつかの感染性組換ウィルスから調合できる。例え
ば、ワクシニアウィルスをＨ．インフルエンザＰＢＯＭ
Ｐのものに加えて他のエピトープに関するコード配列を
含むよう処理できる。このような組換ウィルス自身を多
価ワクチンにおける免疫原として使用できる。別に、各
々ＰＢＯＭＰの異なるエピトープおよび／または他の疾
病を起こす生物のエピトープに関してコード化する異な
る遺伝子を発現するワクシニアまたは他のウィルスの混
合物を多価ワクチンに処方できる。組換えウィルスが免
疫化される宿主に感染性があるか否かにかかわらず不活
性ワクチンを処方できる。不活性ワクチンは、その感染
性が通常は化学的処理（例えばホルムアルデヒド）によ
り破壊されているという意味では「死」である。理想的
には、ウィルスの感染性をウィルスの免疫原性をもたら
すタンパク質を影響することなく破壊する。不活性ワク
チンを調合するために、ＰＢＯＭＰ関連タンパク質また
はペプチドを発現する多量の組換えウィルスを必要量の
適切抗原を与えるため培養液中生長させなければならな
い。異なるエピトープを発現する不活性化ワクチンの混
合物を「多価」ワクチンの処方に用いることができる。
明らかな例として、これらの「多価」不活性化ワクチン
は、互いに投与された生ワクチンの相互干渉による潜在
的困難のため生ワクチン処方より好ましい。いずれかの
場合において、不活性化組換えワクチンまたはウィルス
の混合物は、抗原に対する免疫学的応答を高めるため好
適なアジュバンドで処方されるべきである。好適なアジ
ュバンドとして、これに限定されるものではないが、界
面活性剤、例えばヘキサデシルアミン、オクタデシルア
ミノ酸エステル、オクタデシルアミン、リゾレチン、ジ
メチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、Ｎ，Ｎ−
ジオクタデシル−Ｎ'，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチ
ルプロパンジアミン）、メトキシヘキサドデシルグリセ
ロールおよびプルロニックポリオール；ポリアミン類、
例えば、ピラン、デキストランスルフェート、ポリＩ
Ｃ、ポリアクリル酸、カーボポール；ペプチド類、例え
ばムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、ツフトシ
ン；オイルエマルジョン；および鉱物ゲル、例えばアル
ミニウムヒドロキシド、アルミニウムホスフェート等が
ある。
【００２４】５．６．３ 受動免疫および抗イデオタイ
プ抗体 ウィルスまたはサブユニットワクチンで能動的に免疫化
するのに代えて、Ｈ．インフルエンザのエピトープに対
する予備形成抗体の投与により宿主に対する短期間保護
を与えることも可能である。従って、ワクチン処方を受
動免疫治療に用いる抗体を産生するために用いることが
できる。ヒト免疫グロブリンは、異質免疫グロブリンが
その異質免疫性成分に対する免疫応答を拒絶するのでヒ
ト医薬に好ましい。このような受動免疫化は、特別の危
険にさらされる免疫化されない個体、例えば細菌性髄膜
炎患者との接触にさらされる若年幼児の速やかな保護の
ための緊急の理由において用いられる。他に、これらの
抗体をＨ．インフルエンザＰＢＯＭＰエピトープに対す
る免疫応答を刺激する抗体として交替で使用し得る抗イ
デオタイプ抗体の保護に使用し得る。
【００２５】５．７．診断的検定 本発明のさらに別の目的は、Ｈ．インフルエンザ感染を
推測される個体の種々の体液においてＰＢＯＭＰ抗原
（および従って、Ｈ．インフルエンザ）の検査に対する
診断的検定に用いる指薬を提供することである。
【００２６】５．７．１ 免疫検定 この実施態様の１つの態様において、本発明の PBOMP関
連タンパク質およびペプチドを種々の患者組繊およびこ
れに限定されるものではないが血液、脊髄液および痰等
を含む体液におけるＨ．インフルエンザの検査用免疫検
定における抗原として使用できる。本発明の抗原は、当
該技術分野に公知のいずれの免疫検定、すなわちこれに
限定されるものではないがラジオイムノアッセイ、ＥＬ
ＩＳＡ検定、“サンドイッチ”検定沈降反応、ゲル拡散
沈降反応、免疫拡散検定、凝集検定、蛍光イムノアッセ
イ、プロテインＡイムノアッセイおよび免疫電気泳動検
定が少ないが挙げられる、に使用できる。
【００２７】５．７．２ 核酸ハイブリダイゼーション
検定 この実施態様の別の態様において、本発明のＰＢＯＭＰ
関連タンパク質およびペプチドをコード化する遺伝子の
新規ヌクレオチド配列を種々の患者組織およびこれに限
定されるものではないが血液、脊髄液、および痰等を含
む体液におけるＨ．インフルエンザの検査用核酸ハイブ
リダイゼーションにおけるプローブとして使用できる。
本発明のヌクレオチド配列をこれに限定されるものでは
ないがサザンブロット［サザン（Southern，１９７５，
J.Mol.Biol．９８：５０８）］；ノーザンブロット［ト
ーマスら（Thomas et al.,１９８０，Proc． Nat'l Aca
d.Sci．USA ７７：５２０１−０５）］；およびコロニ
ーブロット［グルンステインら（Grunstein et al.，１
９７５，Proc． Nat'l Acad.Sci.USA７２：３９６１−
６５）］等を含む当該技術分野において公知のいずれの
核酸ハイブリダイゼーション検定にも使用できる。以下
の一連の実施例は、説明の目的で記載したものであり本
発明の範囲の限定するためではない。
【００２８】
【実施例】 ６．ネィティブおよび組換ＤＮＡ−誘導ＰＢＯＭＰの単
離および特徴 ６．１．ＰＢＯＭＰ−１の単離・精製および分析 一連の実験において、他の細胞壁成分が実質的にない
ＰＢＯＭＰ−１は、次のようにＨ．インフルエンザ（H.
influenzae）から得られた。Ｈ．インフルエンザイー
ガン（H.influenzae Eagan）は、一夜、１０μｇ／mlの
ヘミンおよび１μｇ／mlＮＡＤ （ＢＨI−ＸＶ）を含
む脳心輸液媒地かまたは mＭＩＣ（ヘリオット等の修
正、Herriot et al.，１９７０，J. Bacteriol.１０
１：５１３−１６）媒地で育てた。４℃において１０，
０００xgで１５分間遠心分離した後、上澄液をローカル
（Rocal)IITM消毒薬中に棄てた。沈降物（ペレット）
は、重量を測定し、細胞の湿式重量の約５倍量に等しい
バッファーを有する１０mMヘペス−ＮａＯＨ（pH7.4)、
１mMＥＤＴＡに懸濁した。その後、細胞懸濁液をブラン
ソンモデル３５０ソニケーターセルディスラプター(Bra
nsonSonic Power,コネティカット州 ダンバリー）で６
０％出力のパルス設定で氷浴中１００mlアリコートで５
分間音波破砕した。音波破砕後、粉砕した細胞懸濁液を
４℃で５分間かけて１０，０００xgで遠心分離にかけて
未破砕細胞を除いた。その後、沈降未破砕細胞を計量
し、前記の如く未破砕細胞の湿式重量の約５倍に等しい
１０mMのヘペス− ＮａＯＨ（pH７．４）１mMＥＤＴＡ
中で再び音波破砕した。全メンブランフラクションは、
最終０．５M ＮａＣｌを得るように十分なＮａＣｌの添
加および約１時間の破砕細胞物質の 100,000xgの超遠心
分離後、沈降物として得た。その後外部メンブラン細胞
壁複合体は、全メンブランフラクションの１０mMヘペス
ＮａＯＨ，pH７．４，中の１％サルコシル（sarcosyl）
で再抽出による、全メンブランフラクションから内部メ
ンブラン成分を除去して得た。外部メンブラン細胞壁フ
ラクション含有不溶性残留物は、350,000xg で３０分間
遠心分離にかけて単離し、５０mMトリスpH８．０，５mM
ＥＤＴＡに懸濁させて４℃で一夜貯蔵した。ＰＢＯＭＰ
−１細胞壁複合体は、外部メンブランフラクション中の
他のタンパク質の残りのものから、オクチルグルコシド
で外部メンブラン細胞壁フラクションを逐次抽出し（２
度）、その後サルコシル（２度）によって抽出して得
た。両洗浄剤は、５０mMトリス中の１％(w/v）５mM EDT
A pH８．０で使用した。抽出は、室温（２０℃）で３０
分間、それぞれ行なった。その後、混合物を 100,000xg
で１時間かけて遠心分離した。オクチルグルコシドおよ
びサルコシルの抽出後、残留する不溶性沈降物質は、Ｐ
ＢＯＭＰ−１細胞壁複合体である。ＰＢＯＭＰ−１は、
二法によって可溶化した。すなわち（１）種々の洗浄剤
のなかの１種の存在下で１時間かけて６０℃に加熱する
方法または（２）洗浄剤の存在化または不存在下で３７
℃で１時間リゾチーム消化により細胞壁を破壊する方法
である。（１）かまたは（２）の後、可溶性 ＰＢＯＭ
Ｐ−１を不溶性物質から１５℃で１時間かけて 100,00
0 xgで遠心分離にかけて分離した。（１）かまたは
（２）のいずれの方法においても、可溶化の臨界的に特
別な洗浄剤は選択されなかった。事実、今日迄に試験し
た洗浄剤の全ては（デオキシコール酸塩、トリトンX-１
００TM、トウーン−８０、チャプス（ＣＨＡＰＳ）、チ
ャプソー（ＣＨＡＰＳＯ）、ドデシルマルトサイド、ト
ウィッテルジェント３−１４TMおよびトウィッテルジェ
ント3-１６TMを含む）、リゾチーム誘導可溶化と同様に
加熱依存可溶化に効果的である。加えて、オクチルグル
コシドは、リゾチーム誘導可溶化にきわめて有効であ
り、１％（w/v)最終濃度で定型的に使用されていた。４
０ｇの湿式重量の細胞から、８mgの実質的に他の細胞壁
成分のないＰＢＯＭＰ−１を単離することが典型的に可
能であった。この実質的に純粋なＰＢＯＭＰ−１製剤
は、ＳＤＳ ＰＡＧＥシステムで分析してこのタンパク
質の減少変成形態の相対分子量を決定し、そしてその純
度を評価した（第１図）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のた
め、５×濃縮サンプルバッファーで０．１Ｍ TrisＨＣ
ｌ，pH７．０，２５mMジチオスレイトールおよび２％Ｓ
ＤＳに調節し、そして１００℃で５分間加熱してサンプ
ルを調製した。電気泳動法前に、サンプルの全てを調節
して６％（w/v)ショ糖および 0.001％ブロモフェノール
ブルーにした。大部分の定型分析は、バイオ−ラド ミ
ニプロテアンゲルシステム（カリフォルニア州 レッド
モンド）を使用して行なった。ゲルは、１．５mm厚であ
り、アクリルアミドは、２倍比の３０：０．８まで有す
る１５％アクリルアミド、０．３７５ＭトリスHCl （pH
８．８）および０．１％ＳＤＳを含んでいた。積み重ね
たゲルは、ゲル当りアクリルアミドの同じ比率、２倍、
まで有する４．８％アクリルアミド、１２５mMトリスHC
l （pH７．０）および０．１％ＳＤＳを含んでいた。電
気泳動後、ゲルを少なくとも１時間、エタノール：酢
酸：水（５：１：５）中で０．１２５％クマーシーブル
ーで染色し、その後青色染料なしで同一溶媒系で脱染色
した。オボアルブミン４３，０００；α−キモトリプシ
ノーゲン、２５，７００；β−ラクトグロブリン、１
８，４００；リゾチーム、１４，３００；ボビントリプ
シンインヒビター、６，２００；インスリン（ＡとＢ
鎖）、２，３００および３，４００（ＢＲＬ，Bethesd
a，ＭＤ）を含む前染色低分子重量基準物質を用いてＰ
ＢＯＭＰ−１の相対分子量の測定を補助した。さらに、
ＰＢＯＭＰ−１の精製は、イオン交換クロマトグラフィ
ーモレキュラーシーブ、疎水性または逆相クロマトグラ
フィー、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動等の標
準的な方法で達成し得る。
【００２９】６．１．１ ＰＢＯＭＰ−１のアミノ酸組
成および配列の特徴 アミノ酸分析は、シンプソン等の方法によって行なった
（Simpson et al.，１９７６，J.Biol.Clem.２５１：19
36−１９４０）。加水分解は、１００℃で３３時間厚い
壁で被覆されたガラス試験管中で、真空下０．１ｍｌの
４Ｎメタンスルホン酸中において０．５〜１mgのタンパ
ク質を加熱して行なった。各アミノ酸量は、既知量の基
準アミノ酸を使用して得られた面積を有する各種のピー
クのもとで、面積の比較によって得られる。得られた結
果を第１表に示す。
【００３０】
【表１】 （第１表） ──────────────────── ＰＢＯＭＰ−１a のアミノ酸組成 ──────────────────── アミノ酸残基 数 ──────────────────── アスパラギン酸 １５ （Ａsp＋Ａsn） トレオニン ６ セリン ７ グルタミン酸 １２ （Ｇlu＋Ｇln） プロリン ３ グリシン １８ アラニン １９ システイン １ バリン １０ メチオニン ０ イソロイシン ４ ロイシン １１ チロシン １３ フェニルアラニン ４ リシン（Lysine） ８ ヒスチジン ２ アルギニン ７ トリプトファン ０ ────────────────────a ＰＢＯＭＰ−１の見掛け分子量は、15.057ダルトンで
あった。アミノ酸残基の全数は、140 であった。エドマ
ン化学を使用するＰＢＯＭＰ−１の配列化の最初の試み
は、遮断Ｎ−末端残基のために満足な結果を与えなかっ
た。部分アミノ酸配列情報を得るために、１６０００ダ
ルトン分子量のＰＢＯＭＰをタンパク分解性酵素で酵素
的に消化して配列分析し安いペプチドフラグメントを得
ることが必要になっている。トリプシンを使用して２７
℃で１時間かけて得られる１６０００ダルトンのＰＢＯ
ＭＰ−１のタンパク分解性消化品は、Ｃ１８カラムを用
いる逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬ
Ｃ）で分離した。多数の疎水性ペプチドピーク（Ｔ９）
は、単離し、その後アミノ酸配列化開始前にポリブレン
（polybrene)被覆グラスファイバー紙上に固定した。Ｔ
９ペプチドは、エドマン分解法により配列化した（ Edm
an et al.,１９６７, Eur. J. Biochem.１：８０−９
１）。配列化器からの各サイクルは、アニリノチアゾリ
ンフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸を生成
した。分析は、液体クロマトグラフィーシステムの逆相
Ｃ１８ＨＰＬＣカートリッジカラムで行なった。ＰＴ
Ｈは、ソディウムアセテート−アセトニトリルグラジェ
ントを用いて室温で溶出し、そして可変ＵＶ波長検出器
を用いて２７０ナノメーターで検出した。Ｔ９ペプチド
の配列分析の結果は次のようである。Ｔyr−Ａsn−Ｔhr
−Ｖal−Ｔyr−Ｐhe−Ｇly−Ｐhe−Ａsp−Ｌys−Ｔyr−
Ａsp−Ｉle−Ｔhr−Ｇly−Ｐhe−Ｔyr−Ｖal−Ｔhr−Ｉ
le−Ａsp−Ａla−Ａsp−Ａla−Ａla− Ｔyr−Ｌeu−Ａ
sn−Ａla−Ｔhr−Ｐro−Ａla−Ａla８の芳香族アミノ酸
（５Ｔyr，３phe)および５の脂肪族側鎖アミノ酸（１Ｌ
eu，２Ｖal，２Ｉle）を含むＴ９ペプチドは、極めて疎
水性である。このペプチドのチロシン含量は高いが、Ｐ
ＢＯＭＰ−１の全アミノ酸組成に対して一定である（第
１表）。加えて、ＰＢＯＭＰ−１が、１３のチロシンを
含むがメチオニンまたはトリプトファンを含まないこと
は一般的である。
【００３１】６．１．２ 脂肪酸分析によるＰＢＯＭＰ
−１の特徴 第６．１．１節に示すように、エドマン分解法による
ＰＢＯＭＰ−１の配列化の最初の試みは、遮断Ｎ−末端
残基のために満足すべき結果を生じなかった。精製Ｈ．
インフルエンザ（Ｈ．influenzae）ＰＢＯＭＰ−１の脂
肪酸分析は、共有結合性結合脂肪族アシル基がＰＢＯＭ
Ｐ−１ペプチド上で同定できるか否かを調査するために
行なった。 脂肪酸分析に先立ち、前記第６．１節の記
載のように、単離ＰＢＯＭＰ−１タンパク質を有機溶媒
混合物、例えばクロロホルム：メタノール（２：１）お
よびデオキシコール酸塩洗浄剤で充分に抽出していかな
る微量不純物の内因性脂質，ホスホリピト等を除いた。
裸のタンパク質は、アセトン沈降法かまたは充分な透析
で得て、凍結乾燥法で乾燥した。既知量のノナデカン酸
を内部標準物質として乾燥精製ＰＢＯＭＰ−１（１〜３
mg）に加え、その混合物を窒素雰囲気下１１０℃で４時
間かけて 200μｌの４ＮＨＣｌで加水分解した。かかる
酸加水分解は、アミドまたはエステル結合脂肪酸を放出
する。加水分解物質は、水で２mlに希釈し、同容量のヘ
キサンで３回抽出した。結合したヘキサン相を同容量の
食塩水で２回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。脂肪
酸は、パーキンエレマー モデル８５００ガスクロマト
グラフに注入する前に、ジアゾメタン(Schlenk，１９６
０, Anal, Chem, ３２：１４１２−１４１４）で対応す
るメチルエステルに変化させた。脂肪酸メチルエステル
の分離は、ＳＰＢ−１溶融シリカキャピラリーカラム
（Supelco 会社製，ペンシルバニア州ベルフォンテ）で
行なった。得られたピークは、既知標準物質と比較して
同定した。得られた結果を第１６図に示す。第１６図に
示すように、３種類の主要な脂肪酸、即ち、ラウリン酸
（Ｃ１２），パルミチン酸（１６）およびまだ明確に同
定されるパルミチン酸誘導体（Ｃ１６'）は、 ＰＢＯ
ＭＰ−１と結合している。Ｃ１６'は、恐らく１６個の
炭素数を有する分岐脂肪酸である。
【００３２】６．２． 抗−ＰＢＯＭＰ−１抗体の調製 ６．２．１ ポリクローナル抗−ＰＢＯＭＰ−１抗血清
の調製 実質的に純粋なＰＢＯＭＰ−１は、イムノゲンとして抗
−ＰＢＯＭＰ−１抗体の調製に使用した。部分的に純粋
なＰＢＯＭＰ−１の豊富なフラクションは、第６．１節
で記載したように調製し、１０℃において３５mAの一定
電流のもとで１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し
た。タンパク質バンドを第６．１．１節で記載したよう
に固定し染色した。ＰＢＯＭＰ−１バンドは、ゲルから
切除し、平衡になるまでリン酸塩バッファード食塩水
（ＰＢＳ）（２０mMリン酸ナトリウム，１５０mMＮａＣ
ｌ，pH７．４）で透析した。ＰＢＯＭＰ−１含有アクリ
ルアミドゲルフラグメントをＰＢＳ中で２５ゲージニー
ドルで切りきざんだ。そのフラグメントをニュージーラ
ンド ホワイトラビットの多部位に筋肉注射した。各々
のラビットは、全量で約２０μｇのＰＢＯＭＰ−１を受
けた。ラビットは、最初の免疫化の後に、２週間および
３週間に再免疫化した。最終免疫化後１週間で動物の血
を流し、その血清を回収した。動物にアクリルアミド中
２０μｇのＰＢＯＭＰ−１を２ケ月毎に投与して抗−Ｐ
ＢＯＭＰ−１抗体の高力価を維持した。またＰＢＯＭＰ
−１は、第５．１節で記載したように単離したものであ
り、不完全フロイントアジュバント（Freund's adjuvan
t) と混合して乳化した。ラビットにフロイントアジュ
バント中の約２０μｇのＰＢＯＭＰ−１を筋肉注射し
た。動物は、最初の免疫化後２週間および３週間に再免
疫化し、最終免疫化の１週間に採血した。
【００３３】６．２．２ 抗−ＰＢＯＭＰ−１モノクロ
−ナル抗体の産生 ＰＢＯＭＰ−１に対する抗体を排泄するハイブリドーマ
細胞系は、マウス骨髄腫細胞系，Ｘ６３，Ａｇ８，6543
とＨ．インフルエンザに対して免疫化したＣ５７／Ｂ１
マウスから得た脾蔵細胞系との融合によって、次のよう
にして得た。即ち、雌Ｃ５７／Ｂ１マウスに１×１０6
Ｈ．インフルエンザ菌株Ｓ２細胞を、２ケ月間に４回、
腹腔内注射した。３ケ月後、そのマウスは、第６．２．
１節に記載したように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドから単
離した実質的に純粋なＰＢＯＭＰ−１で免疫化した。１
ケ月後、そのマウスは、Ｓ２から全外部メンブランの静
脈注射を受けた。細胞融合は、静脈注射後第４日に、当
業者に一般的な標準的な方法で行なった［ゲフター等
（Gefter et al.,１９７７，Somat, Cell. Gemet ３：
２３１−３６）を参照のこと］。 ハイブリドーマ細胞
培養上澄液は、抗体としてＨ．インフルエンザ外部メン
ブランタンパク質を使用する、標準的なエリサ（ＥＬＩ
ＳＡ）でスクリ―ニングした。検定は、４℃で一夜ＯＭ
Ｐ被覆した９６ウエルポリスチレンプレートで行なっ
た。プレートは、４０mMＴris （pH8.0)、１５０mMＮａ
Ｃｌ、５％ノンファットドライミルク（nonfat dry mil
k ）ＢＬＯＴＴＯ）（第６．４．４節参照のこと）でブ
ロックし、そしてＰＢＳ／０．１％トウィーン２０で洗
浄した。ＰＢＳ／トウィーン２０で１：１０に希釈した
培養上澄液を加え、２５°において６０分間インキュベ
ートし、そして前述のように洗浄した。結合抗体は、ア
ルカリ性ホスファターゼ−ゴートＦ（ａｂ'）2 抗−マ
ウス（ＩｇＧ， ＩｇＭ）およびアルカリ性ホスファタ
ーゼ基質で検出した。その後、正の上澄液は、精製ＰＢ
ＯＭＰ−１，Ｅ．コリーＯＭＰ'ＳおよびＳ２リポポリ
サッカリド（ＬＰＳ）を有する、ドットブロット分析で
スクリーニングした。所定のハイブリドーマを制限希釈
法（McKearn ，１９８０，in Monoclonal Antibodies,
Kennett, McKearn andBechtol,eds., Plenum Press，
ｐ３７４）で再クローン化し、Ｈi ｂ ＯＭＰ'Ｓを有
するウエスターンブロット法でスクリーニングした。選
択ハイブリドーマは、標準的な方法で、腹水として成長
させるためにＢalb ／ｃマウスに注射した（Brodeur et
al., １９８４，J. Immunol. Meth， ７１：２６５−
７２）。
【００３４】６．３．抗−ＰＢＯＭＰ−１抗体とE.コリ
ーとの反応性 抗−ＰＢＯＭＰ−１抗血清の反応性に関するウエスター
ンブロット分析法は、後述の６．４．４節に記載のよう
に行なった。２−メルカプトエタノール含有試料製剤バ
ッファー中に溶解した１０μｌのにわか細菌培養を１５
％ SDS−ＰＡＧＥゲルの各レーンに塗布した。電気泳動
およびニトロセルロースへの転換後、そのブロットをラ
ビットポリクローナル抗ＰＢＯＭＰ−１の１：２５０希
釈液でプローブした。ヤギ抗−ラビットＩｇＧ（Kirkeg
aard ＆ Perry Laboratories，ラリーランド州 ゲイ
セルバーグ）と接合したセイヨウワサビ ペルオキシダ
ーゼとのインキュベーションは、抗−ＰＢＯＭＰ−１抗
血清がヘモフィルス属（Haemophilus)中のＰＢＯＭＰ−
１とＥ．コリー中の１８０００ダルトンタンパク質を分
別することを示す（第２Ａ図）。Ｅ．コリーの１８００
０ダルトンタンパク質と交差反応するＰＢＯＭＰ−１の
エピトープを確認するために、ＰＢＯＭＰ−１に対して
作られたモノクローナル抗体は、Ｅ．コリータンパク質
に対する反応性用にスクリーニングした。スクリーニン
グされた大部分のモノクローナル抗体がＥ．コリーと反
応しなかったけれども、あるクラスのモノクローナル抗
体は、モノクローナルＧ１−１で例証されるように、ヘ
モフィルス属のＰＢＯＭＰ−１およびＥ．コリー中の１
８０００ダルトンタンパク質と強く反応した（第２Ｂ
図）。このことは、ＰＢＯＭＰ−１に存在する少なくと
も１つのエピトープがＥ．コリータンパク質のエピトー
プと交差反応することを示す。このことは、Ｈ．インフ
ルエンザＰＢＯＭＰ−１に対する抗血清があるＥ．コリ
ーに対する感染を保護するだろうということを示す。
【００３５】６．４．組換え型プラスミドの調製に使用
される一般的な手段 ６．４．１ 制限酵素消化用条件 制限エンドヌクレアーゼは、ＢＲＬ（メリーランド州
ベセスダ），ＩＢＩ（コネチィカット州 ニューヘブ
ン），ニユーイングランド バイオラブス（マサチュー
セッツ州 ベバーリー）またはＵＳバイオケミカルコー
ポレーション（オハイオ州 クレーブランド）から購入
した。制限酵素消化は、ＤＮＡを適切な制限バッファー
に懸濁させ、制限エンドヌクレアーゼを加え、適切な時
間インキュベートして完全消化を行なうように実施し
た。１単位の酵素は、２０μｌの全反応混合物において
１時間かけて １．０μｇのファージラムダＤＭＡを完
全に消化するために必要な量と規定される。各種酵素と
ともに使用されるバッファー類は、下記に示される。即
ち、１０mMＴris(pH８．０），１０mMＭｇＣｌ2 および
１０mMジチオスレイトール（ＤＴＴ）から成るＣlaI，
ＨpaI，ＨpaII，およびＫpnI消化用に使用される低塩バ
ッファー。５０mMＴris(pH８．０），１０mMＭｇＣ
ｌ2 ，５０mM ＮａＣｌおよび１０mMＤＴＴから成るＡ
luI，ＡvaI， ＥcoＲII，ＥcoＲV，ＨaeII，ＨaeIII
，ＨincIII ，Ｈind III ，ＰstI，Ｓau３ＡI，Ｓph
I，ＳatI，ＳstII，ＴagI，およびＸhoI消化用として使
用される中塩バッファー。 ５０mMＴris(pH８．０），
１０mMＭｇＣｌ2 ，１５０mMＮａＣｌおよび１０mMＤＴ
Ｔから成るＢamＨI，ＥcoＲI，ＰvuI，ＳalIおよびＸba
I消化用として使用される高塩バッファー。ＳmaI消化用
に使用したバッファーは、１０mMトリス（pH８．０），
２０mMＫＣｌ，１０mMＭｇＣｌ2 および１０mMＤＴＴか
ら成っていた。制限消化の全ては、６０℃で行なったＴ
agIを除き、３７℃で行なった。
【００３６】６．４．２ ＤＮＡフラグメントのＧＥＬ
精製 制限酵素消化後、種々のサイズのＤＮＡフラグメント
は、分離し、５０mMトリス−アセテート１mMＥＤＴＡバ
ッファーpH７．８を使用する低融点温度アガロース（Ｆ
ＭＣＬＧＴアガロース）中で、１０ボルト／cmの条件で
ゲル電気泳動して精製した。アガロース濃度は、回収す
べきフラグメントの大きさによって０．８％〜１．５％
で変化した。ＤＮＡバンドは、エチジウムブロマイド螢
光で視認化でき、ゲルを切断した。ＤＮＡは、６５℃で
アガロースを溶融し、４容積の６５M ＮａＣｌ，１０M
Ｔris(pH８．０），１mMＥＤＴＡを加えて混合物の最終
濃度を０．５M ＮａＣｌとし、０．５mM ＮａＣｌ，
１０mMＴris pH８．０，１mMＥＤＴＡ（ローディングバ
ッファー）で平衡にしたＮＡＣＳカラム（BRL ，メリー
ランド州 ベセスダ）上にＤＮＡを負荷し、そのカラム
を３〜５容積の負荷バッファーで洗浄し、そして２〜３
容積の２M ＮａＣｌ，１０mMＴris pH８．０，１mMＥＤ
ＴＡで溶出させて回収した。ＤＮＡ溶出物を二度蒸留Ｈ
2 Ｏで１：１に希釈し、３容積のエタノールで沈降させ
た。沈降物は、７０％エタノールで洗浄し、真空乾燥
し、１mMＥＤＴＡ含有１０mMＴris −ＨＣｌバッファー
（ＴＥバッファー）に再懸濁させた。
【００３７】６．４．３ ＤＮＡ連結 連結の全ては、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて行なった。
Ｔ４ＤＮＡリガーゼは、ＢＲＬ（メリーランド州 ベ
ゼスタ），ユナイテッドステーツバイオケミカルス（オ
ハイオ州 クレーブランド）またはベーリンガー（イン
ジアナ州 インジアナポリス）から購入した。１単位
（Ｕ）の Ｔ４ＤＮＡリガーゼは、５'−ＤＮＡテルミ
ニ（termini)濃度が０．１２μM （３００μｇ／ml）に
おいて、20μl 容積リガードバッファー中１６℃で３０
分間かけてバクテリオファージラムダＤＮＡのＨind II
I フラグメントの５０％連結を形成するために必要な量
と規定される。ＤＮＡ連結は、５０mMＴris （pH７．
５），１０mMＭｇＣｌ2 ，１０mM ＤＴＴ，１mMアデノ
シントリフォスフェートからなるリガーゼバッファー中
で行なった。一般に、２０〜３０μｇ／ｍｌのＤＮＡ濃
度およびベクターの挿入物に対するモル比１：１であっ
た。Ｔ４ＤＮＡリガーゼは、２０μｌ反応容積当り１Ｕ
の比率で加えた。インキュベーションは、１８〜 ２４
時間行なった。結合端連結温度は、１５℃，ブラント
（blunt)端連結温度は２２℃であった。もし充分な物質
が利用できるならば、アガロースゲル電気泳動によるあ
る部分の反応混合物を分析して連結を調べられる。
【００３８】６．４．４ タンパク質免疫ブロット分析
（ウエスターンブロット） タンパク質は、独特な適用法に依存するが、種々の方法
による免疫ブロット分析用にニトロセルロースシートに
固定する。ファージプラークは、徐々に無菌８．１cm直
径ニトロセルロース盤を配置することによって、アガー
プレートから１０cm直径のファージ力価プレートの表面
に移した。そのシートを完全に湿らせ、無菌針でフィル
ターを介してパンチングして位置を記し、そしてそのフ
ィルターを２分後に持ち上げた。コロニーブロットは、
細菌コロニーをニトロセルロースシートに移し、そのシ
ート（コロニー面）を栄養素アガー上に４〜６時間載置
することによってそのコロニーを生長させ、そのシート
をクロロホルム蒸気に３０分間さらしてコロニーを溶解
させることによって行なった。タンパク質ゲル移動は、
分析すべきタンパク質混合物含有ＳＤＳ− ＰＡＧＥゲ
ルをニトロセルロースシート上に載置し、ホエファート
ランスホー（Hoeffer Transphor)装置で０．５Ａ，１４
時間の条件で２５mMＴris ０．３８M グリセリンpH
８．８バッファー中で水平電気泳動法を応用して行なっ
た。 タンパク質移動が完全になるや否や、フィルター
は、コロニーブロットを除いて、すべての場合に３７℃
で１時間かけて５０mMＴris(pH８．０），１５０mMＮａ
Ｃｌ，５％ノンファットドライミルク（BLOTTO）に浸し
た。コロニーブロットが実施されると、そのフィルター
は、１mg／ｍｌリゾチーム含有ＢＬＯＴＴＯに４℃で１
晩浸して細胞デブリス（debris）を消化した。その後、
該フィルターは、３７℃で３時間かけてＢＬＯＴＴＯ中
で適切な希釈度（試行錯誤によって決定する）において
第１抗体プローブで吸収し、ＢＬＯＴＴＯで１５分間か
けて３回洗浄し、３７℃で１時間かけてＢＬＯＴＴＯ中
１：５００の希釈度でセイヨウワサビ ペルオキシター
ゼ接合第２抗体で吸収し、そしてＢＬＯＴＴＯで３回、
１５分間かけて洗浄した。フィルターは、５０mMＴris
(pH７．０），１５０mMＮａＣｌ，０.1％ハイドロジエ
ンパーオキシダーゼ中に置き、そしてメタノール中の
０．０６％４−クロロ−１−ナフトール（シグマケミカ
ルコーポレーション，ミズーリー州 セントルイス）を
加えた。もし青色が２０分間以内に展開しないならば、
その反応は負であると考えられた。その反応は、そのフ
ィルターを蒸溜水に移し、そして乾燥をブロット（blo
t）して止めた。
【００３９】６．４．５ 遺伝子融合 ＰＢＯＭＰタンパク質またはそのペプチドをコード化す
る遺伝子または遺伝子と他の遺伝子、例えばアルカリ性
ホスファターゼ（ＰhoＡ）をコード化する遺伝子、との
融合は、マノイルおよびベックウイズによって記載され
たように行なった（Manoil and Beckwith ，１９８５，
Proc，Ｎat'l Acad.Sci. ＵＳＡ ８２：８１２９−８
１３３）。組換えプラスミドは、天然ＰhoＡを欠き、Ｆ
−プライム プラスミド上にＴn ５の左末端繰り返し中
に挿入したアルカリ性アスファターゼ遺伝子、即ちプロ
モーターとメンブラントランスポート信号配列の両者を
含まない、を含むトランスポゾンＴn ５の誘導体（Ｔn
ＰhoＡ）を運搬するＥ．コリー菌株中に導入した。それ
故、活性アルカリ性フォスファターゼ酵素の産生には、
Ｔn ＰhoＡの転移を必要とするので、ＰhoＡ遺伝子はフ
レーム中で融合してメンブラン転移信号ペプチド含有活
性転写遺伝子中に入るかかる転移は、４０μｇ／ｍｌの
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート
（ＸＰ，シグマケミカルコーポレーション，ミズーリー
州 セントルイス）の存在下に細胞を平板培養すること
により検出した。この染料の存在下において、活性アル
カリ性ホスファターゼ酵素を産生するコロニーは、濃青
色となり、一方活性アルカリ性ホスファターゼを欠くコ
ロニーは白くなる。
【００４０】６．４．６ ＤＮＡフィルターハイブリダ
イゼーション分析（サザンブロット） ＤＮＡフィルターハイブリダイゼーション分析は、サザ
ンの方法に従って行なった（Southern，１９７５，J. M
olBiol．９８：５０８）。フィルターハイブリダイゼー
ションにより分析すべきＤＮＡは、適切な制限エンドヌ
クレアーゼで消化し、９０mMＴris −ボレート，８mMＥ
ＤＴＡバッファーを使用する０．８％アガロース(Seake
m Portland，ＭＥ）中１０ボルト／cmでアガロースゲル
電気泳動法で分離した。ゲル中のＤＮＡは、そのゲルを
１．５M ＮａＣｌ／０．５M ＮａＯＨ中に１時間浸し、
そして１．５M ＮａＣｌ／１．０M Ｔris −ＨＣｌに
１時間浸して中和することによって変性した。変性ＤＮ
Ａは、ブロッティングにより、ニトロセルロースフィル
ター紙に移した。ＤＮＡの転移後、フィルターは６×Ｓ
ＳＣ(1７５．５ｇＮａＣｌと８８．２ｇクエン酸Ｎａ／
リッターを含む２０×ＳＳＣ株から希釈して調製した）
で洗浄し、空気乾燥した。 DNAフラグメントは、真空下
８０℃で２時間ベーキングしてフィルターに固定した。
ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブは、リグバイ等
の方法によるニックトランスレーション法で調製した
（Rigby et al., １９７７，J.Mo, Biol.,１１３：２３
７−２４４）。プローブ用ＤＮＡ（１−２μｇ）１００
μニックトランスレーションバッファーに溶解した（50
mMＴris −ＨＣｌ，pH７．４，１０mMＭｇＳＯ4 ，１０
mMＤＴＴ，５μｇ／ｍｌ牛血清アルブミンおよび２０μ
ｍ各 dＧＴＰ， dＣＴＰおよび dＴＴＰ）。この反応混
合物に、１００μＣｉのα32Ｐ− dＡＴＰ（アメルシャ
ム，２−３０００ Ｃｉ／ｍモル）、１．０ｎｇデオキ
シリボヌクレアーゼI（シグマケミカル コーポレーシ
ョン，ミズーリー州 セントルイス）および１０Ｕ
Ｅ．コリーＤＮＡポリメラーゼI（ベーリンガー）を加
えて、その混合物を１５℃で４５分間インキュベートし
た。反応は、ＥＤＴＡを５０mM加え、そして１０分間で
６０℃に加熱して酵素を不活性化することによって止め
た。標識化ＤＮＡは、３容積のエタノールを加えて沈降
させ、そして５０μｌの０．３Ｍアンモニウムアセテー
ト（ＮＨ4 ＯＡｃ）に再懸濁した。試料は、０．３M Ｎ
Ｈ4 ＯＡｃで平衡にした１ｍｌのバイオゲルＰ−５０ス
ピンカラムに加え、５００ xｇで５分間かけて遠心分離
して溶出させた。そのカラムを１００μｌの０．３M Ｎ
Ｈ4 ＯＡｃおよび結合溶出物で洗浄し、そして３容積の
エタノールで沈降させた。標識化ＤＮＡ沈降物、即ち、
ベックマン（ＬＳ９０００）シンチレーションカウンタ
でチェレンコーワ分散（Cherenkov Scattering）法によ
って測定した放射性合体を真空乾燥し、そしてＴＥバッ
ファーに再懸濁した。ハイブリダイゼーション用に結合
ＤＮＡを有するフィルターは、６×ＳＳＣで湿らせ、６
×ＳＳＣ／０．５％ ＳＤＳ／５ｘデンハルト溶液／１
００μｇ／ｍｌ tＲＮＡでもって６８℃で２時間かけて
プレハイブリダイズしてフィルターの余分の結合能力を
ブロックした（１ｘデンハルト溶液は、水中の０．０２
％フィコル，０．０２％ポリビニルピロリドン，０．０
２％牛血清アルブミンである。）。ハイブリダイゼーシ
ョン反応は、０．０１M ＥＤＴＡおよび５−10,000,000
ＣＰＭ（Cherenkov)標識化プローブを加えた同一バッフ
ァー中で行なった。プローブ溶液は、適用前に１０分間
で９０℃まで加熱してＤＮＡ鎖を変性し、 ６８℃に冷
却し、そして６８℃で１８〜２４時間、フィルターとイ
ンキュベートした。ハイブリダイゼーション後、フィル
ターは、非特異結合ブローブ除去のため、６８℃で種々
に変化した０．１×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳで洗浄し
た。使用条件下で、９０％以上のＤＮＡ相同性は、ＤＮ
Ａプローブの正結合性を示すだろう。フィルターを空気
乾燥し、スクリーンを増度するデュポンクロネックス
“ライティングプラス”を使用して−７０℃でコダック
ＸＡＲフィルムに曝露した。
【００４１】６．５．Ｈ．インフルエンザのＰＢＯＭＰ
遺伝子のクローニング ＰＢＯＭＰ遺伝子のクローニング用Ｈ．インフルエンザ
染色体ＤＮＡ源は、菌株ｂ−イーガン（Eagan)からタイ
プｂ＋にＤＮＡによって転換したＨi の非エンカプセル
化 Ｒd の誘導体であるＨ．インフルエンザＫＷ２０ｂ
（HiKW２０ｂ）（Moxon et al., １９８４，Clim.Inves
t,７３：２９８−３０６）かまたはＨiｂイーガンの突
然のカプセルなしの突然変異体であるＨ．インフルエン
ザＳ２（Ｈi Ｓ２）であった。ファージラムダライブラ
リーを生成するために、Ｈi からの染色体ＤＮＡを平均
長さ約１５０００塩基対（bp）にずらし、Ｔ４ＤＮＡポ
リメラーゼによる処理によってブラントエンド化し、Ｅ
coＲIＤＮＡメチラーゼで修飾し、合成ＥcoＲIリンカー
に連結し、そして組換えラムダファージベクターカロン
４にクローン化する。プラスミドライブラリーを生成す
るために、Ｈi Ｓ２の染色体ＤＮＡは、Ｓau３Ａで部分
的に開裂し、このように生成した３〜８キロベース（k
b）長制限フラグメントを単離し、そしてＢamＨI制限部
位においてプラスミドベクター pＧＤ１０３に結合し
た。このプラスミドは、 pＬＧ ３３９誘導体（第３図
およびStocker et al., １９８２，Gene １８：３３５
−４１参照のこと）であり、６〜８コピー／細胞で運ば
れる。同様に、ｌacＺ−αペプチドおよびプラスミド p
ＵＣ８からのポリリンカー領域を含む；それ故に、適切
なＥ．コリー菌株（ＪＭ８３）に形質転換すると、Ｌac
＋フェノタイプの損失をスクリーニングすることによっ
て組換えプラスミドの選択を許容する。普通の配向でク
ローン化すると、Ｅ．コリー中で不完全に表わされるク
ローン化遺伝子が強く調節されたｌacプロモーターの制
限のもとで生ずるだろう。組換えプラスミド含有Ｅ．コ
リーは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗−
ＰＢＯＭＰ−１抗血清のプール化混合物を使用するＰ
ＢＯＭＰの産生用にスクリーニングされた。
【００４２】６．５．１ ＨＩプラスライブラリーの構
成 ＰＢＯＭＰ−１タンパク質がラムダファージと表わせず
またはラムダファージと両立しないことも可能である。
このことを調べるために、我々はＨi Ｓ２のプラスミド
染色体ライブラリーを構成した。Ｅ．コリーＯＭＰ遺伝
子の高コピー数プラスミドのクローニングは、毒性であ
ることをている（例えば、Beck et al.,１９８０，Nucl
eic Acid Res.８：３０１１−３０２４参照のこと）。
この問題を避けるために、低コピー数プラスミド pＧＤ
１０３を使用した（第３図参照のこと）。Ｈi Ｓ２から
の染色体ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＳau３Ａ（Ｂ
ＲＬ．メリーゴーランド州 ベセスダ）で部分的に修飾
した。５００mgのＤＮＡは、５ｍｌの制限バッファー中
で３７℃において１時間かけて５０ユニットのＳau３Ａ
で消化した。フラグメントは、ベックマンＳＷ２８ロー
ター中で１０mMＴris （pH８．０），１mMＥＤＴＡ，1M
ＮａＣｌ含有１０−４０％ショ糖グラジェントでもって
140,000xｇで２４時間かけて速度沈降法によって分離
した。２ｍｌのフラクションを集め、アリコートをアガ
ロースゲル電気泳動法により分析した。長さ３〜８kbの
制限フラグメント含有フラクションをプールし、ＴＥバ
ッファー中で濃縮した。プラスミド pＧＤ１０３ ＤＮ
Ａは、ＢamＨIエンドヌクレアーゼで消化し、仔ウシア
ルカリ性ホスファターゼ処理した（ベーリンガー，イン
ジアナ州 インジアナポリス）（１ユニット／μｇＤＮ
Ａ，制限バッファー中で３７℃で３０分間）。反応混合
物からフェノール抽出およびエタノール沈降法によって
ＤＮＡを精製し、ＴＥバッファーに再懸濁した。ＢamＨ
IとＳau３Ａ制限酵素が付着端を形成するので、連結前
にさらにＤＮＡ処理を行なう必要はなかった。約２５μ
ｇのＨi Ｓ２−Ｓau３Ａ消化ＤＮＡと pＧＤ １０３／
ＢamＨI／ＣＡＰ消化ＤＮＡのそれぞれを２５ＵＴ４−
リガーゼ（ベーリンガー，インジアナ州 インジアナポ
リス）含有リゲーションバッファー５００ｍｌで混合
し、１５℃で１８時間かけてインキュベートした。２０
μｌアリコートの反応混合物は、連結反応を実証するた
めに、アガロースゲル電気泳動法によって分析した（出
発物質は隣接レーンで行なった）。その後、連結混合物
は、３７℃においてＬＢ−ブイヨン中で１時間かけてイ
ンキュベートした成分Ｅ．コリーＪＭ８３（Maniatis e
t al.,１９８２，Molecular Cloning Cold Spring Harb
or Laboratory ｐ．２５０）に転換し、５０μｇ／ｍｌ
カナマイシンサルフェート（シグマケミカルコーポレー
ション，ミズーリー州 セントルイス）および４０μｇ
／ｍｌ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ベー
ター−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｘ−gal ，ＢＲＬ，メ
リーランド州 ベセスダ）を含有するＬＢ−アガー板上
で平板培養し、そして３７℃で２４時間かけてインキュ
ベートした。約５０％のカナマイシン耐性（ＫanＲ）コ
ロニーは、展開すると白である（Ｌac-)が、 pＧＤ１０
３のｌac領域（Ｌac＋非組換え体は青である）における
Ｓ２ＤＮＡのＢamIII 部位への挿入を示す。 １０の白
いコロニーを無差別に選択し、増強し、そしてベクター
ＢamＨＩ部位における挿入で pＧＤ１０３より４〜８kb
大きいプラスミドを含むことが示される。１５２５の白
いコロニーを採取し、それぞれ増強し、９６ウエル微少
力価皿において１８％の無菌グリセロール含有ＬＢブイ
ヨン中で−７０℃で凍結して貯蔵した。
【００４３】６．５．２ ＨＩＢラムダ遺伝子バンクの
構造 Ｈi ＫＷ２０ｂからの高分子量染色体ＤＮＡは、２００
μｇ／ｍｌ濃度でＴＥバッファーに懸濁させ、２５ゲー
ジ針を通過させて平均15000bp 長に剪断した。５０mMＴ
ris(pH８．８），１０mMＭｇＣｌ2 ，２０mM（ＮＨ4 ）
2 ＳＯ4 ，１０mMＤＴＴ，５０μM dＡＴＰ， dＣＴ
Ｐ， dＧＴＰおよび dＴＴＰ中で３７℃で２０分間かけ
てＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理によって突出端を除い
た。その後、１００mMＴris(pH８．０），１０mMＥＤＴ
Ａ，０.1mMＳ−アデノシル−メチオニン中において３７
℃で３時間かけてＥcoＲIＤＮＡメチラーゼ（１Ｕ／μ
ｇＤＮＡ）（ＢＲＬメリーランド州 ベセスダ）で処理
してＤＮＡを修飾した。ＤＮＡのメチル化は、反応から
１μｇのＤＮＡを除去し、１μｇの未修飾ラムダＤＮＡ
と混合し、そして２０μｇの高塩制限バッファー中で３
７℃において１時間かけて５単位の ＥcoＲIを消化す
ることによって立証した。これらの条件下において、修
飾Ｈi ＤＮＡは消化されないが、添加ラムダＤＮＡは完
全に消化された。１００μｌの反応混合物中においてＴ
４ＤＮＡリガーゼ（５Ｕ）を使用した２０μｇの修飾Ｈ
i ＤＮＡは、１μｇの化学的に合成されたＥcoＲIリン
カー（ＢＲＬメリーランド州 ベセスダ）と連結した。
１８時間後、２０分で ６０℃まで加熱してその反応を
停止し、最終濃度１５０mMになるようにＮａＣｌを加
え、そして混合物を６時間かけて１０U ＥcoＲIで消化
した。前記のようにアガロースゲル電気泳動法によって
開裂および未連結リンカーから修飾Ｈi ＤＮＡとリンカ
ーを分離した。調製Ｈi ＤＮＡは、ラムダカロン４ＤＮ
Ａの左および右のＥcoＲIフラグメントと１：１：１の
モル比で混合し、そして１８時間かけてＴ４ＤＮＡポリ
メラーゼと連結した。インビトロパッキング反応を使用
して、連結化ＤＮＡ混合物をラムダファージ粒子中に詰
めた。４μｌＨ2 Ｏ中の５μｇの連結ＤＮＡを７μｌの
２０mMＴris(pH８），１０mM２−メルカプトエタノール
（２−ＭＥ），３mMＭｇＣｌ2 ，１μｌの１０mMＴris
，pH７．５，１mMスペルミジン，２mMプトレシン，１
０mMＭｇＣｌ2 ，１．５mMＡＴＰ，５mM２ＭＥおよび
Ｅ．コリーＢＨＢ２６９０（−１imm ４３４，ＣＩts，
ｂ２．red ３，Ｅam１５，Ｓam７）溶解産物からの５μ
ｌの音波抽出物に加えた（Ｈohn et al., １９７７，Pr
oc.Nat'l Acad.Sci. ７４：３２５９）。反応混合物
は、２２℃で１時間インキュベートし、ベックマンＳＷ
５０.1ローター中で４時間250,000xｇで３M 〜５M Ｃｓ
Ｃｌ［10mMＴris(pH７．５），１０mMＭｇＣｌ2 ，０．
２％ゲラチン（ＴＭＧバッファー）中でステップグラジ
エント中で遠心分離してパッケージ化ファージを分離し
た。ファージを界面から除き、ＴＭＧに対して透析し
た。このように調製されたファージの力価を測定する
と、Ｈi ゲノムの２５−３００００独立クローンのライ
ブラリーが生成したことを示している。ファージホスト
としてＥ．コリーＫＨ８０２を使用してプラート増強に
よってファージライブラリーを増強して１０-9プラーク
形成ユニット（ＰＦＵ）／ｍｌ含有ファージサスペンシ
ョン５ｍｌを産生した。
【００４４】６．６．ＰＢＯＭＰ遺伝子の単離 ６．６．１ ＰＢＯＭＰ−１に対するモノクローナル抗
体と反応するタンパク質をコード化するＰＢＯＭＰ遺伝
子の単離 ＬＢカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）アガー上のニトロ
セルロースシートにＨi プラスミドライブラリーを移
し、３７℃で２４時間かけて成長させ、プローブとして
の ＰＢＯＭＰ−１に対する５の非競合モノクローナ
ル抗体混合物を利用するコロニーブロット法により分析
した。混合モノクローナルプローブと反応するクローン
を単離し、そしてそのプラスミドを pＡＡ１５２と指定
した。第４図は、ベクター pＧＤ１０３に挿入した４．
２kbＨi ＤＮＡを含有する pＡＡ１５２の制限マップを
示す。ウエスターンブロット分析は、クローン pＡＡ１
５２がポリクローナル抗−ＰＢＯＭＰ−１および同様に
プール化モノクローナル抗体プローブによって認識され
る１６００ダルトンタンパク質を発現することを立証す
る。その後、クローン pＡＡ１５２は、最初のプールに
おいて使用された個々のモノクローナル抗体によって認
識されるタンパク質を産生することが示される（第５
図）。pＡＡ１５２に挿入したＳau３Ａは、挿入の一端
においてポリリンカー領域のＢamIII 部位を再成するこ
とが見い出された。このＢamIII からＨi ＤＮＡの単一
ＢglIII 部位かまたはＸbaI部位への欠失は、ウエスタ
ーンブロットで検出したＰＢＯＭＰの発現の損失を生じ
た。ポリリンカーの Ｈinc II部位からＨi 挿入ＤＮＡ
のＸbaIかまたはＢglII部位への欠失は、ＰＢＯＭＰ発
現を保持した（第４図）。これらの結果から、我々はＰ
ＢＯＭＰをコード化する遺伝子が pＡＡ１５２のＨi Ｄ
ＮＡ挿入物内のＢglII−Ｂam ＨI７３７塩基対フラグ
メント中に在ると結論づける。 pＡＡ１５２を運搬す
る小細胞の分析（Achtman et al., １９７９，Proc.Na
t'l Acad. Sci,ＵＳＡ 76：４８３７−４１）は、クロ
ーン化Ｈi ＤＮＡがそれぞれ１６０００および４０００
０ダルトンの２タンパク質をコード化することを示した
（第６図）。ＪＭ８３（ pＡＡ１５２）のウエスターン
ブロットは、ＰＢＯＭＰ−１に対して生じたプール化モ
ノクローナル抗体が１６０００ダルトンタンパク質と反
応することを示す。４００００ダルトン分子量領域内に
おいて、交差反応は無い。
【００４５】６．６．２ ポリクローナル抗−ＰＢＯＭ
Ｐ−１抗血清と反応するタンパク質をコード化するＰＢ
ＯＭＰ遺伝子の単離 第６．５．１節で記載したように調製した増強ファージ
ライブラリーは、１ｍｌのＴＭＧにおいて１−２０００
pFUに希釈し、そして５０μｌのＥ．コリーＫＨ８０２
（５×１０9 細胞／ｍｌ）を加えた。その混合物を３７
℃で２０分間インキュベートし、ＮＺＹＣＭ媒地、即ち
１０ｇＮＺアミンＡ，５．０ｇＮa Ｃｌ，２．０〓Ｍｇ
ＳＯ4 ，７Ｈ2 Ｏ，５ｇイースト抽出物，１ｇカザミノ
酸（１リットル当り）を含む、を含有するアガープレー
ト上の３ｍｌの軟アガーで平板培養した。プレートは、
一夜インキュベートし、３０〜６０分間４℃に冷却し、
そしてプラークをニトロセルースに移した。上記第６．
４．４節で記載したように、ポリクロナール抗−ＰＢＯ
ＭＰ−１でフィルターをプローブした。この方法で種々
の正プラークを検出した。しかしながら、ＰＢＯＭＰ−
１モノクローナル抗体をプローブとして使用した場合に
は正プラークは検出されなかった。プレートから正プラ
ークを採取し、Ｅ．コリー（Ｅ．Ｃoli)ＫＨ８０２にお
ける成長によって増強した。溶解産物のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅゲル／ウエスターンブロット分析によってクローンを
立証した。正クローンの全ては、ＰＢＯＭＰ−１ポリク
ローナル抗体と反応する見掛分子量１６０００ダルトン
のタンパク質を発現した。このタンパク質は、カロチン
４ファージ対照溶解産物中に存在しなかった。類似実験
において、正クローンからの溶解産物は、モノクローナ
ル抗体と反応してＰＢＯＭＰ−１となること失敗した。
ある正ファージ、それはラムダ１６−３と称されるが、
次の分析のために選択した。このファージ単離は、NZYC
M ブイヨン中のＥ．コリーＫＨ８０２中の成長によって
増強され、２０％ポリエチエングリコール６０００によ
る沈降によって回収され、そしてセシウムクロライド平
衡グラジェントにおいてバンドを示した（ＴＭＧ中の４
M ＣｓＣｌ，ベックマンＳＷ５０．１ローター， 3000,
000xｇで２４時間）。０．１％ＳＤＳおよび２０μｇ／
ｍｌプロティナーゼＫ（シグマケミカルコーポレーショ
ン，ミズーリー州 セントルイス）処理を５５℃で行な
い、その後フェノール抽出およびエタノール沈降によっ
てファージＤＮＡを単離した。ＥcoＲIでラムダ１６−
３ＤＮＡを消化し、そしてＨi 染色体挿入物の部分物理
マップを得た。その挿入物の ＥcoＲIフラグメント
を単離し、プラスミドベクター pＧＤ１０３にサブ
クローンした。細胞溶解産物のウエスターンブロット転
写分析法によって、１６０００ダルトンタンパク質に交
差反応性ＰＢＯＭＰ−１を発現するフラグメントを運搬
するクローンを同定した。これらの１つを pＡＡ１３
０と指定した。第７図は、 pＧＤ１０３プラスミドにク
ローン化したＨi ＤＮＡからの５．７kbフラグメントを
有するプラスミドの制限マップを表わす。ＰＢＯＭＰ−
１に対するモノクローナル抗体は、 pＡＡ１３０から発
現した１６０００ダルトンタンパク質とは反応しなかっ
た（データは示されていない）。この組換えプラスミド
によって発現されるタンパク質は、しかしながら、ポリ
クローナル抗−ＰＢＯＭＰ−１抗血清によって認められ
た（例えば、第８図参照のこと）。pＡＡ１３０を運搬
する小細胞の分析（Achtman et al.，前記）は、クロー
ン化Ｈi ｂ ＤＮＡが見掛分子量 16000および１７００
０ダルトンのタンパク質をコードすることを示した。ポ
リクローナル抗−ＰＢＯＭＰ−１によって、標識化１６
０００ダルトンタンパク質は、特異的に免疫沈降化した
（データは示されない）。このように、プラスミド pＡ
Ａ１３０は、１６０００ダルトン分子量ＰＢＯＭＰの発
現を教える。挿入物の単一ＰstI部位およびポリリンカ
ーの単一ＰstIの間に挿入されたＤＮＡの切除によって
生じた内部欠失は、交差反応タンパク質の発現に影響を
与えなかった。類似方法によって、このプラスミドのＸ
baIフラグメントを除去し、そしてＰＢＯＭＰ−１交差
反応性タンパク質の発現が保持された（第７図）。二内
部ＢglII部位の再連結化によって、このプラスミドの付
加的欠失誘導体を生成し、そしてこの誘導体もＰＢＯＭ
Ｐ−交差反応性タンパク質発現を維持した。低融点アガ
ロースゲルからフラグメントを単離し、 DNA−ポリメラ
ーゼIのクレノウフラグメントでＥstＥII端を満たし、
そのフラグメントを pＧＤ１０３のＨinc II部位にクロ
ーニングすることによって７８１塩基対ＢstＥII−Ｘmn
Iフラグメントをクローン化した。ポリクローナル抗−
ＰＢＯＭＰ−１を使用するウエスターンブロット分析
は、このプラスミドが１６０００ダルトンＰＢＯＭＰの
発現を維持することを示した。 pＡＡ１３０の場合のよ
うに、このプラスミドから産生したＰＢＯＭＰは、モノ
クローナル抗体と反応してＰＢＯＭＰ−１とならなかっ
た。このＰＢＯＭＰ遺伝子の局在を立証する独立の方法
として、 pＡＡ１３０の大ＥcoＲI−ＰvuIIフラグメン
トは、 pＬＧ３３９のＥcoＲI−ＰvuIIフラグメントと
連結して pＡＡ１３６と指定された新規なテトラサイク
リン耐性プラスミドを生成する。このプラスミドは、ウ
エスターンブロット法で立証されるようにＰＢＯＭＰを
発現する。染色体のアルカリ性フォスファターゼ遺伝子
（ＰhoＡ）の欠失でこのプラスミドは、Ｅ．コリー菌株
に転換され、そして移動性元素Ｔn ＰhoＡを運搬する。
アルカリ性フォスファターゼ活性を再貯蔵する pＡＡ１
３６へのＴn ＰhoＡ元素の３つの独立移動は単離され
た。Ｔn ＰhoＡ部位の pＡＡ１３６への挿入は、Ｔn Ｐ
hoＡの左末端領域近傍の単一 ＤraI制限部位および p
ＡＡ１３６のＨind III ，ＢstIII ，ＸmnI，およびＰs
tI部位を使用して測定された。３種の挿入の全ては、 p
ＡＡ１３６のＢstＥII−ＸmnIフラグメント内に入ると
決定された。３種のＴn Ｐho挿入の全ては、ＰＢＯＭＰ
遺伝子の転写が pＡＡ１３６においてＢstＥII部位から
ＸmnI部位であることを示す同一配向であった。３種の
Ｔn ＰhoＡ移動の全ては、ウエスターンブロットで検出
されたように、ポリクローナル抗−ＰＢＯＭＰ−１抗血
清によって検出された１６０００タンパク質の損失を生
じた。ある融合は、ウエスターンブロット上ポリクロー
ナル抗−ＰＢＯＭＰ−１抗血清によって検出された6000
0 ダルトンにおいて新しいバンドを生成した。この大き
さは、アルカリ性フォスファターゼ（４５０００ダルト
ンＭＷ）から１６０００ダルトルＭＷタンパク質の融合
によって生成したであろう融合タンパク質の予想範囲内
である。これらの移動におけるＰhoＡ活性の回復は、Ｐ
ＢＯＭＰタンパク質がメンブラン移動、それ故にメンブ
ランタンバク質であろう、のペプチド信号を保持するこ
とを立証する。Ｔn Ｐho融合は、Ｔn ＰhoＡとＨi クロ
ーン化ＤＮＡ配列間の結合をＭ１３にサブクローンする
ことにより配列化した。すべての場合において、ＰhoＡ
コード配列は、 pAA１３０のＰＢＯＭＰ−２遺伝子用の
予想読み取り枠を有する枠であると決定された（後述の
第６．７．２節参照のこと）。
【００４６】６．７ ＰＢＯＭＰ遺伝子のヌクレオチド
配列決定 ６．７．１ pAA152 によって発現されるＰＢＯＭＰ遺
伝子の配列戦略 pＡＡ１５２によって発現されるＰＢＯＭＰ遺伝子のヌ
クレオチド配列は、 pＡＡ１５２の７３７bpＢglIII −
ＢamＨIフラグメントのジデオキシヌクレオチド配列化
（Sangar et al.,１９７８，Proc. Nat'l Acad, Sci
ＵＳＡ ７４：５４６３−５４６７）、即ち、Ｍ１３
ファミリー、Ｍ１３mp１８およびmp１９の単一鎖ファー
ジへのサブクローン後であるが、によって得られた。
これらのサブクローンから決定された配列の位置および
方向は、第９図に示されている。ＢglII−ＢamＨIフラ
グメントの完全ヌクレオチド配列は、第１０図に示され
ている。pＡＡ１５２の７３７ＢglII−ＢamＨIフラグメ
ントは、１５３のアミノ酸のポリペプチドをコードする
単一読み取り枠（ＯＲＦ）を含む（第１１図）。ＤＮＡ
配列から決定されたＰＢＯＭＰ遺伝子のアミノ酸組成
は、ＰＢＯＭＰ−１精製タンパク質のアミノ酸組成に極
めて匹敵する（第１表および第２表参照のこと）。
【００４７】
【表２】 （第２表） ──────────────────────────── 成熟ＰＢＯＭＰ−１とＰＢＯＭＰ−２の推定アミノ酸組成 ──────────────────────────── アミノ酸残基 pAA152a の成熟 pAA130b の成熟 ＰＢＯＭＰ−１ ＰＢＯＭＰ−２ ──────────────────────────── アスパラギン酸 ９ ６ アスパラギン ８ ４ トレオニン ７ ５ セリン ６ １３ グルタミン酸 ７ ５ グルタミン ５ ７ プロリン ３ １ グリシン １６ ２４ アラニン ２１ １６ システイン １ １ バリン １０ １８ メチオニン ０ １ イソロイシン ３ １３ ロイシン ９ ５ チロシン １１ ２ フェニルアラニン ３ ２ リシン(Lysine) ７ ７ ヒスチジン ２ ０ アルギニン ６ ６ トリプトファン ０ ０ ────────────────────────────a 成熟ＰＢＯＭＰ−１の見掛分子量は14,238ダルトンであった。アミノ酸残基 数は１３４であった。b 成熟ＰＢＯＭＰ−２の見掛分子量は13,461であった。アミノ酸残基数は１３ ６であった。 加えて、ＰＢＯＭＰ−１遺伝子は、Ｔ９ペプチド配列が
ないＬeu−６８残基が許容されるならば、アミノ酸がＰ
ＢＯＭＰ−１のＴ９内部ペプチドのアミノ酸配列に参加
する（３０／３３）内部ペプチド配列（ＡＡ４８−８
１）を有する（第１２図）。同様に、ＰＢＯＭＰ−１の
アミノ末端領域は、他のメンブラン移動ペプチド配列と
類似性を示すアミノ酸配列を含有する(Watson,１９８
４，Nucleic Acids Res. １２：５１４５−５１６
４）。これらのデータおよびモノクローナル抗体結合デ
ータから、我々は、この遺伝子がＰＢＯＭＰ−１タンパ
ク質をコードすると結論づける。
【００４８】６．７．２ pＡＡ１３０のＰＢＯＭＰ遺
伝子の配列戦略 pＡＡ１３０のＰＢＯＭＰ遺伝子のヌクレオチド配列
は、Ｍ１３mp１８およびmp１９ファージへのサブクロー
ン後 pＡＡ１３０の７８９塩基対のＢstＥII−ＸmnI
フラグメントのジデオキシヌクレオチド配列化（Sanger
et al.,前記参照）によって決定した。これらの組換え
ファージは、それぞれＭ１８００１およびＭ１９００１
と指定されている。一般の１７塩基オリゴヌクレオチド
配列化プライマー（ニューイングランド バイオラブ
ス）は、ＢstＥII− ＸmnIフラグメントの両端からの
配列を決定するために使用された（第１３図参照のこ
と）。２つの付加的なオリゴヌクレオチドは合成され、
ジデオキシヌクレオチド配列用のプライマーとして使用
された（M18 ＰＲI，M19 ＲＲ2)。他の配列化プライマ
ーの全ては、ニユーヨーク州ロチェスタープラクシスバ
イオロジックスにおいてアプライドバイオシステム３８
０Ｂ ＤＮＡシンセサイザーで作られた。 それらのプ
ライマーは、ベータシアノエチルホスフェート保護基化
学特性を有する１μモル対照ポアーガラスカラムで製造
された。オリゴヌクレオチド産出物は、十分に純粋であ
り、さらに精製することなくカラムから直接的にプライ
マーを使用することを許容する。第１３図に示されるよ
うに、２合成オリゴヌクレオチドプライマーは、フラグ
メントの各端において約２００ヌクレオチド配列に結合
する。pＡＡ１３０のＢstＥII−ＸmnIフラグメントの全
７８９bpＤＮＡ配列は、第１４図に示される。ＯＲＦ
は、第１５図に示されるようにアンダーラインで示され
る。このようにＯＲＦは、１５４のアミノ酸ポリペプチ
ドをコード化する。アミノ末端１８残基ペプシドは、他
のタンパク質を決定するメンブラン運搬信号配列に似て
いる（Watson，１９８４，前記した）。加えて、 pＡＡ
１３０においてＴn ＰhoＡ融合からの配列データは、３
種の移動の全てが１５４アミノ酸ポリペプチドの読み取
り枠の中であることを示した。pＡＡ１３０のＯＲＥの
ＤＮＡ配列から推定されるように、提案された成熟遺伝
子のアミノ酸組成は、精製PBOMP-１のアミノ酸分析によ
って決定されたものと著るしく異なる（第１表および第
２表）。 pＡＡ１３０のＰＢＯＭＰ遺伝子のアミノ酸配
列を精製ＰＢＯＭＰ−１タンパク質からのトリプシンペ
プチドＴ９と比較すると、顕著な相同性は見い出されな
かった。加えて、この遺伝子によってコード化された生
産物がポリクローナル抗−ＰＢＯＭＰ−１抗血清によっ
て認識されるけれども、ＰＢＯＭＰ−１へのモノクロー
ナル抗体によって認識されない。これらの観察から、 p
ＡＡ１３０によって発現されるＨi 遺伝子がＰＢＯＭＰ
−１用の遺伝子ではないことは、明らかである。このよ
うに pＡＡ１３０によってコード化されたＰＢＯＭＰ−
遺伝子は、ＰＢＯＭＰ−２と指定された。
【００４９】６．８．組換えE.コリーによって発現され
るＰＢＯＭＰのリポタンパク質としての特徴 第６．１．２節で記載したように、Ｈ．インフルエンザ
から単離されたＰＢＯＭＰ−１は、ラウリン酸，パルミ
チン酸およびパルミチン酸誘導体を含む脂肪酸に共有結
合的に付着するので、細菌リポタンパク質として分類し
得る。次の実験は、組換えＥ．コリーによって発現され
る PBOMPがリポタンパク質として存在するか否か調査す
るために行なった。２種の異なるインビボ方法は、発現
ＰＢＯＭＰのリポタンパク質の性質を立証するために使
用した。一連の実験において、ＰＢＯＭＰ発現性組換え
プラスミド含有細胞は、放射性標識化脂肪酸の存在化で
培養した。かかる条件下で、共有結合的に付着した脂肪
酸を含有するように形成されたいずれのリポタンパク質
も、特異的に放射性標識化されるだろう。ＰＢＯＭＰ−
１発現性プラスミド pＡＡ１５２かまたはＰＢＯＭＰ−
２発現性プラスミド pＡＡ１３０のいずれかを含有する
Ｅ．コリーＪＭ８３細胞は、５０μＣi/ｍｌ14Ｃ−パル
ミチン酸含有Ｍ９最少培地で２時間かけて増殖した。全
細胞溶解産物（１００００トリクロロ酢酸沈降性 cpm／
レーン）を３５mAの一定電流値でもって１５％ＳＤＳ−
ＰＡＧＥゲルで電気泳動した。そのゲルは、サリチル
酸ナトリウムで飽和し（５×ゲル容積×１Ｍ溶液で２０
分間）、乾燥し、そして−７０℃においてＸＡＲ−５フ
ィルムで感光した（イーストマンコダックカンパニー，
ニューヨーク州 ロチェスター）。同様に培養した正常
Ｅ．コリーＪＭ８３細胞の細胞溶解産物の全ては、対照
とした。得られた結果は、第１７図に示す。第１７図に
示されるように、約１５０００ダルトンの放射性標識タ
ンパク質は、 pＡＡ１５２および対照Ｅ．コリー細胞の
溶解産物中では見い出されなかったpＡＡ１３０を含有
するＥ．コリーの溶解産物中で観察された。このよう
に、ＰＢＯＭＰ−１および組換えＥ．コリーによって発
現されたＰＢＯＭＰ−２は、特異的に放射性標識化され
る。 他の一連の実験において、ＰＢＯＭＰ発現性組換
えプラスミド含有細胞は、グロボマイシン，抗生物質の
存在下で培養し、リポタンパク質信号ペプチターゼの阻
害によって既知細菌性リポタンパク質の全てのプロセス
を特異的にブロックする（Inukai et al., １９７８，
J. Antibiotics(Tokyo) ３１：１２０３−１２０５）。
pＡＡ１５２かまたは pＡＡ１３０のいずれかを含有す
るＥ．コリーＪＭ８３細胞は、２５μｇ／ｍｌグロボマ
イシンの存在下で１時間かけて培養される（ニューヨー
ク州 ピスカタウェイ．ロバートウーズションソンメデ
ィカルデンタルスクールのＤr.Ｍ．イノウエから得たも
のである）。グロボマイシン非処理類似培養を対照とし
た。細胞溶解産物の全ては、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ルで電気泳動し、ニトロセルロースに移し、そしてポリ
クローナル抗−ＰＢＯＭＰ−１抗血清でプローブした。
得られた結果を第１８図を示す。第１８図に示されるよ
うに、ＰＢＯＭＰ−１かまたは ＰＢＯＭＰ−２のいず
れかを発現するグロブマイシン処理細胞の溶解産物にお
いて、対照または非処理細胞の溶解産物においては検出
されない約１６５００ダルトンバンドが観察された。両
方の一連のインビボ実験で得られた実験に基づくと、Ｐ
ＢＯＭＰ遺伝子含有組換えＥ．コリー（Ｅ．coli）によ
って発現されるＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２
は、リポタンパク質である。
【００５０】７． ＰＢＯＭＰ−１サブユニットワクチ
ンの効能 ７．１ ＰＢＯＭＰ−１によって誘導された抗血清の殺
菌性活性 抗−ＰＢＯＭＰ−１ポリクローナルラビット抗血清は、
第６．２節の記載のように調製されたものであり、イン
ビトロ補体介在殺菌性アッセイシステムにおいてＨi ｂ
およびＨi の殺害能力について試験した（Musher et a
l., １９８３，Infect, Immun. ３９：２９７−３０
４； Anderson et al.,１９７２，J. Clin. Invest.
５１： ３１−３８参照のこと）。アッセイシステム
で使用する補体源は、プレコロストラル牛血清（PCCS，
Pre-collostralcalf serum）かまたは予め存在する抗ヘ
モフィルス属 （Haemophilus)抗体を除去するために
予め非タイプＨi 菌株，Ｓ２で吸着した正常ラビット血
清（ＮＲＳ）のいずれかであった。ＰＣＣＳは、そのま
まで使用し、ＮＲＳは、Ｈi ｂに対して１：４，非タイ
プＨi に対して１：８に希釈して使用した。希釈液の全
ては、ホスファターゼバッファードサリーン［２０mMホ
スフェートバッファー（pH7.4)，０．１５mMＭｇＣｌ2
および０．５mMＣａＣｌ2 含有０．１５M ＮａＣｌ（Ｐ
ＣＭ）］を使用した。被試験細菌性菌株は、４９０mmに
おいて光学密度で測定されるように１×１０9 細胞／ｍ
ｌ濃度に達するまでＢＨＩ−ＸＶで増強する。細菌は、
ＰＣＭ中で最終濃度１２５０細菌／20μｌに希釈した。
ＰＣＭ中の20μｌの適切な抗体希釈液は、氷上２４ウエ
ル微少力価プレート（Costar）のウエルで２０μｌの補
体源と混合した。微少力価プレートは、氷から除き、そ
して２０μｌの試験希釈細菌を各ウエルに加えた。抗体
非含有ウエルを負対照とした。３７°で３０分間インキ
ュベーションした後、８００μｌのＢＨＩ−ＸＶは、
５６℃で０．７５％アガーを含んでいる、各ウエルに加
え、そして室温で固化した。そのプレートは、３７℃で
一夜インキュベートし、そして次の日に研究した 抗血清のＢＣ力価は、非抗体対照ウエルと比較して、試
験細菌の５０％殺害可能な最も高い希釈液の逆数として
研究した。抗−ＰＢＯＭＰ−１は、種々のＨi ｂ臨床お
よび実験室単離体に対する殺菌性（ＢＣ）活性について
試験し、その結果を第３表に示す。
【００５１】
【表３】 （第３表） ────────────────────────────────── ヘモフィルス属インフルエンザの実験室および臨床菌株に対する抗−ＰＢＯＭ Ｐ−１抗血清のＢＣ活性 ────────────────────────────────── 実験室菌株 抗−ＰＢＯＭＰ−１ によって殺された ────────────────────────────────── ヘモルス属インフルエンザ （Ｈ. influenzae） ＋a/ タイプａ ＨＳＴ−１ ヘモフィルス属インフルエンザ ＋／−b/ タイプｃ ＨＳＴ−５ ヘモフィルス属インフルエンザ ＋ タイプｂ ＨＳＴ−３ ヘモフィルス属インフルエンザ ＋ タイプｂ ＨＳＴ−10 ヘモフィルス属インフルエンザ ＋ タイプｂ ＨＳＴ−12 N.T.ヘモフィルス属インフルエンザ S-2 ＋Ｎ．Ｔ．臨床菌株 N.T.ヘモフィルス属インフルエンザ ＋ ＨＳＴ−３１ N.T.ヘモフィルス属インフルエンザ ＋ ＨＳＴ−３５ＨＩＢ．臨床菌株 １１２ 試験菌株 112菌株は殺害された ａ ＋ ＝試験細菌の５０％殺害 ｂ ＋／−＝約５０％の生存試験細菌
【００５２】第３表から明らかなように、抗−ＰＢＯＭ
Ｐ−１抗体は、タイプ（例えば、ａ，ｂ，ｃ）および非
タイプＨ．インフルエンザ菌株の両者の広範な臨床単離
体に対してＢＣ活性を有した。１１２Ｈi ｂ臨床単離体
からの１１２は、抗−ＰＢＯＭＰ−１抗血清によって殺
害した。これらの菌株は、南西米国，北東米国および西
部カナダで単離されたものであった。殺害が抗−ＬＳＰ
抗体の結果であるとする可能性を除くために、ＢＣアッ
セイは、各ウエル中でイムノゲンを調製するために使用
したＨi ｂ菌株からの２００ｎｇのＬＰＳを加えて行っ
た。実験結果は、第４表に示す。
【００５３】
【表４】 （第４表） ────────────────────────── ＬＰＳ吸収抗血清の殺菌活性 ────────────────────────── 抗血清 ＬＰＳa 試験細菌 力 価b ────────────────────────── PBOMP-1 ＋ N.T.H.インフルエンザ ４０ − N.T.H.インフルエンザ １６０ ＋ Hi bイーガン(Eagan) ４０ − Hi bイイーガン ４０ PRP-CRM ＋ N.T.H.インフルエンザ １０ − N.T.H.インフルエンザ １０ ＋ Hi bイーガン ４００ − Hi bイーガン ８００ ────────────────────────── a 零または２００ｎｇＨi ｂイーガンＬＰＳをウエル当り使用した。 b ５０％細菌生存率を示す抗血清の高い希釈の逆数として表示した。 ＬＰＳは、抗ＰＲＰ力価を１／２に下げ、Ｈi に対する
抗−ＰＢＯＭＰ−１力価を１／４に下げそしてＨi ｂに
対する抗−ＰＢＯＭＰ−１力価を全く下げなかった。Ｌ
ＰＳが抗−ＰＢＯＭＰ−１のＢＣ活性を低下させるけれ
ども、それを除去することはできなかった。抗−ＰＲＰ
ＢＣ力価減少によって示されるように、観察された減
少のなかのあるものは、疑いもなく、ＬＰＳの抗−相補
活性の結果であった。
【００５４】７．２ Ｈ．インフルエンザからの幼児ラ
ットの保護 幼児ラット保護の研究は、スミス等の方法に従って行な
った（Smith et al.,１９７３，Rediatrics 52：６３
７−６４４）。スプラグ−ダーレイー（Sprague-Dawle
y）幼児ラットは、ＰＣＭ中の０．１ｍｌの希釈度の変
化するラビット抗血清を用いて生存第４日に腹腔内接種
によって受動免疫化した。免疫化１８時間後、そのラッ
トは、０．１ｍｌのＰＣＭ中の１０4 〜１０6 Ｈi ｂ細
胞で腹腔内に対抗を受けた。感染７２時間後における対
抗ラットの生存は、保護を示した。実験結果を第５表に
示す。
【表５】 （第５表） ────────────────────────── 抗−ＰＢＯＭＰ−１による幼児ラットの保護 ────────────────────────── Ｈi ｂ 受動トラン 抗血清 生存数 スファーさ 対抗量 対抗菌株 れた抗血清 希 釈 全 数 ────────────────────────── ＨＳＴ−60 ＮＲＳ 1/10 106 0/6 PBOMP−１ 1/10 106 5/5 PBOMP−１ 1/30 106 6/6 PBOMP−１ 1/90 106 6/6 ＨＳＴ−61 ＮＲＳ 1/10 105 0/5 PBOMP−１ 1/10 105 6/6 PBOMP−１ 1/30 105 6/6 PBOMP−１ 1/90 105 3/5 イーガン ＮＲＳ 1/10 104 0/4 （Ｅagan） PBOMP−１ 1/10 104 3/5 PBOMP−１ 1/30 104 5/5 PBOMP−１ 1/90 104 0/5 ────────────────────────── 第５表の結果は、幼児ラットが受動トランスファーされ
た抗−ＰＢＯＭＰ−１抗体によって致死量で対抗に対し
て保護されることを示す。付加的な臨床Ｈi ｂ菌株は、
対抗菌株として幼児ラット髄膜炎モデルにおいて抗-PBO
MP-1が異種Ｈiｂに対して臨床的単離体を保護すること
を示すために使用された。抗−ＰＢＯＭＰ−１が抗−Ｐ
ＲＰの保護効果をブロックし、または付加的な効果を有
するか否か決定するために、幼児ラットは、保護終点内
に希釈された抗−ＰＲＰおよび抗−ＰＢＯＭＰ−１で受
動免疫化した。Ｈi ｂで対抗すると、抗血清とともに、
上記のいずれか１つより高希釈液を保護できた（第６
表）。第６表に示される結果は、抗− ＰＢＯＭＰ−１
抗体および抗−ＰＲＰ抗体が互いに干渉せず、そして幼
児ラット髄膜炎モデルにおいて付加的な保護を与えるこ
とが可能なことを示す。
【００５５】
【表６】 （第６表） ───────────────────────── 抗−ＰＢＯＭＰ−１＋抗−ＰＲＰ幼児研究 注 入 血 清 ───────────────────────── 抗-PBOMP-1（1:100)a 抗−ＰＲＰb 生存数／全数c ───────────────────────── − ０／６ ＋ １／６ − １：2000 ２／６ ＋ １：1000 ６／６ ＋ １：3000 ５／６ ＋ １：4000 ４／６ ───────────────────────── a ＰＣＭ中で希釈されたポリクローナルラビット抗−ＰＢＯＭＰ−１ b ポリクローナルラビット抗−ＰＲＰ：ＣＲＭ197 接合体 c ７２時間対抗後の幼児スプラグ−ダーレイラットの生存
【００５６】７．３ ヒト成人におけるＰＢＯＭＰ−１
の免疫抗原性 ６人のヒト成人有志者は、唯１回の接種を受けた１人を
除き、１ケ月間隔で第６．１節で記載したようにＨ．イ
ンフルエンザから単離したＰＢＯＭＰ−１から成るワク
チン組成を有する二種の接種を受けた（ミョウバンなし
で 5.2μｇＰＢＯＭＰ−１）。血液サンプルは、最初の
接種直前およびその後１ケ月間隔で得た。ワクチン化成
人の特異抗体応答性は、H.インフルエンザＰＢＯＭＰ
（ＥＬＩＳＡ），ジフテリアトキソイド（ＥＬＩＳＡ）
（Engvall et al., １９７２，J. Immunol. １０９：１
２９−１３５に記載のＥＬＩＳＡアッセイの一般的記述
を参照のこと）および Ｈib ＰＲＰポリサッカリド
（Farr−タイプＲＩＡ）（Farr, １９５８，J. Infect,
Dis. １０３：２３９− ２６２のファー（Farr）タイ
プＲＩＡの記述を参照のこと）の抗体力価測定によって
評価した。ＰＢＯＭＰ−１ ELISAアッセイで得られた結
果を第１９図に示す。第１９図に示されるように、６人
のうち３人は、PBOMP-１に対する抗体力価において顕著
な増加を示した。抗体力価のこの上昇は、ジフテリアト
キソイドかまたはＨi ｂ ＰＲＰのいずれかに特異な抗
体の力価では顕著な変化は観察されなかったけれども
（結果は示されていない）、イムノゲンとして使用した
ＰＢＯＭＰ−１に極めて特異的であった。
【００５７】７．４ 信号なし ＰＢＯＭＰ−１によっ
て誘導された抗血清の殺菌活性 後述の第８．１節の記載のようにプラスミド pＰＸ 167
含有Ｅ．コリーＰＲ１３細胞から得た組換え信号なし
ＰＢＯＭＰ−１（以後 rＰＢＯＭＰ−１と称する）は、
ホワイトニュージーランドラビットを免疫化するために
イムノゲンとして使用した。 rＰＢＯＭＰ−１は、不完
全フロイントのアジュバンド（ＩＦＡ）中で乳化かまた
は水酸化アルミニウムと結合した。 rＰＢＯＭＰ−１
は、０．８５％食塩水において５００μｇ／ｍｌ濃度の
rＰＢＯＭＰ−１と５００μｇ／ｍｌ濃度のミョウバン
を１：１の比率で混合することによって、ミョウバンと
結合する。その混合物は、３７℃で３時間撹拌し、そし
てミョウバンを遠心分離して沈降させた。未結合タンパ
ク質検定用にＢＣＡタンパク質アッセイ（ピアースケミ
ストリーコーポレイション，イリノイ州 シカゴ）によ
って上澄液を検定した。何も検出されなかった。ミョウ
バンは、５０μｇ／ｍｌで生理食塩水に再懸濁した。 r
ＰＢＯＭＰ−１をＩＦＡ（Difco)に１：１の比率で乳化
した。動物は、４週間間隔でいずれかの製剤５０μｇで
筋肉内免疫した。動物は、０．６週および各免疫前に採
血した。得られた抗−ＰＢＯＭＰ−１ポリクローナルラ
ビット抗血清は、前述第７．１節で記載したように、イ
ンビドロ補体介在殺菌アッセイシステムにおけるＨi 殺
害能のために試験した。最初の免疫化前，０週から第２
免疫化の後２週間，６週，に抗血清は、試験した。抗血
清の殺菌（ＢＣ）活性は、Ｈ．インフルエンザ（“ネイ
ティブＰＢＯＭＰ−１”と指定された）から単離したＰ
ＢＯＭＰ−１に対して作って抗血清のそれと比較した。
試験細菌は、非タイプＨ．インフルエンザ菌株Ｓ−２で
あった。結果は、第７表に示す。
【００５８】
【表７】 （第７表） ────────────────────────── pPBOMP-1a に対する抗血清のＢＣ活性に対する抗血清 ────────────────────────── 抗血清b ネイティブ rPBOMP−１ rPBOMP−１ PBOMP−１ （ＩＦＡ） （Ａlu） ────────────────────────── ０週 １：５ １：５ １：10 ６週 ＮＴ １：160 １：80 ハイパーC １：160 ＮＴ ＮＴ イムユン ────────────────────────── a 試験微生物：非タイプ Ｈ．インフルエンザＳ−２ b 抗血清を得るために使用した免疫化の詳細なテキスト用 c ハイパーイムユン抗血清は、ネイティブPBOMP-1 の多投与用に作られた 抗血清のＢＣ力価は、非抗体対照ウエルと比較して、試
験細菌の５０％殺害可能な最高希釈の逆数として研究さ
れた。両ラビットが免疫前に低レベルのＢＣ活性、即ち
力価 １：５および１：１０を有するが、６週に得られ
た血清のＢＣは、ＢＣ活性において顕著に増加してい
た。ＩＦＡ中の rＰＢＯＭＰ−１で免疫化したラビット
は、１：１６０の力価、ミョウバン中の rＰＢＯＭＰ−
１で免疫化したラビットは、１：８０の力価を示した。
ハイパーイムユン抗血清は、ラビットがネイティブＰＢ
ＯＭＰ−１の多投与を受けた後に得られたた。ハイパー
イムユンラビット抗− ＰＢＯＭＰ−１血清は、１：１
６０の力価を示した。これらの結果は、 rＰＢＯＭＰ−
１がヘモフィルス属中のネイティブＰＢＯＭＰ−１を認
識する抗体を引き出し、そして殺菌アッセイシステムに
おいて生理学的に活性であることを明らかに示す。
【００５９】８． Ｅ．コリーにおけるＰＢＯＭＰ発現
高揚のための新規プラスミド ８．１ Ｅ．コリーにおけるＰＢＯＭＰ−１の発現高揚 ＰＢＯＭＰ−１タンパク質は、たぶんネイティブプロモ
ーターのコントロールのもとで、 pＡＡ１５２の７３７
bpＢamＨI−ＢglIIフラグメントから発現させられる。
その配列は、良質なコンセンサスリボソーム結合部位お
よび ＰＢＯＭＰ−１遺伝子の開始コドンを含む。この
フラグメント含有プラスミドを有するＥ．コリー中で発
現した ＰＢＯＭＰ−１がウエスターンブロット分析
法によって簡単に検出されるけれども、かかる産生タン
パク質量は、１％の細胞タンパク質よりも少なかった、
即ちネイティブ遺伝子含有Ｈ．インフルエンザ細胞中で
作られたＰＢＯＭＰ−１の量よりも少なかった。Ｅ．コ
リー中で高レベルのＰＢＯＭＰ−１を産生するための最
初の試みとして、クローン化遺伝子、高タンパク質産生
を得るために既知のプロモーターＬacとラムダＰL のコ
ントロールのもとに置いた。プロモーターは、ＰＢＯＭ
Ｐ−１開始コドン上流のＢstＮI部位に結合した（第４
図）。この部位の開裂は、ネイティブＰＢＯＭＰ−１プ
ロモーターを除くがリボソーム結合部位をそのまま残
す。これらの組み立ては、次のように行なわれた。第１
に、ＰＢＯＭＰ−１遺伝子運搬 pＡＡ１５２の 739bpＢ
amＨI−ＢglIIフラグメントは、プラスミド pＵＣ １
９のｌacプロモーターのＢamＨI部位にクローンした。
ｌacプロモーターと同一配向においてＰＢＯＭＰ−１遺
伝子を運搬するクローンは、 pＰＸ１６０と指定する。
Ｅ．コリーＪＭ１０３中の pＰＸ１６０からのＰＢＯＭ
Ｐ−１の発現は、ネイティブプロモーター調節の条件で
あり、ｌac調節条件のもとではなかった。即ち、明らか
にＢglII部位およびＰＢＯＭＰ−１の翻訳開始コドン間
の２４０bpにおける転写終結コドン（信号）によるから
である。その後、プラスミド pＰＸ１６０は、ＢstＮI
で開裂した。そのＢstＮIは、ＰＢＯＭＰ−１開始コド
ンと遺伝子のコンセンサス翻訳開始部位間を開裂する
が、コード化領域に付着したリボソーム結合部位を残
す。その末端は、Ｅ．コリーＤＮＡポリメラーゼI（ク
レノウフラグメント）で満たし、直線化プラスミドはＢ
amＨIで開裂した。プロモーターのないＰＢＯＭＰ−１
遺伝子を運搬する577bp ＢstＮI−ＢglIIフラグメント
は、Ｈinc IIおよびＢamＨIで開裂したpＵＣ１９に連結
した。 pＰＸ１６６と称するその後生じたプラスミド
は、ウエスターンブロット法により、Ｅ．コリーＪＭ１
０３のｌacプロモーターの調節条件のもとでＰＢＯＭＰ
−１を発現することが見い出された。ＰＢＯＭＰ−１が
Ｅ．コリーＪＭ１０３またはＨＢ 101菌株のｌacまたは
ＰLプロモーターから発現すると、唯低レベルのＰＢＯ
ＭＰ−１が発現した。モノクローナル抗体Ｇ−２０４、
これは成熟ＰＢＯＭＰ−１のアミノ末端２０アミノ酸に
結合する、を有するこれらの細胞からの溶解産物のウエ
スターンブロット分析は、このモノクローナル抗体によ
って認識された４０００−５０００ダルトンペプチドの
存在を示した（第２０図）。誘導ＰL プロモーターの調
節のもとでＰＢＯＭＰ−１を発現する細胞において、Ｇ
−２０４結合活性の９０％以上は、この予想分解生成物
中であり、Ｅ．コリー中で高いレベルで発現されたＰＢ
ＯＭＰ−１が不安定であることを示した。プラスミド p
ＰＸ１６０および pＰＸ１６６は、外部タンパク質の安
定化が報告された突然変異体を含有する種々のＥ．コリ
ー菌株に転換した。これは、ＡＴＰ−従属プロテアーゼ
（ｌon- ）突然変異体，熱衝撃応答（htp)および mＲＮ
Ａ−安定化突然変異体（pnp)を含む。加えて、リポタン
パク質としてのＰＢＯＭＰ−１のプロセスがその安定性
を高めるので、プラスミドは、重要なネイティブＥ．コ
リーリポタンパク質，ムレインリポタンパク質（ｌpp-
）を欠くＥ．コリー菌株中に置かれた。試験された菌
株の全てにおいて、モノクローナル抗体Ｇ−２０４によ
って認識されるＰＢＯＭＰ−１分解生成物は、ほとんど
同一レベルで存在した。それ故に、Ｅ．コリーのＰＢＯ
ＭＰ−１の分解かある他の未同定によることは、明らか
である。第２の解決手段として、遺伝子のネイティブ信
号配列を除去することによって修飾ＰＢＯＭＰ−１遺伝
子を生成した。かかる組み立ては、ネイティブＰＢＯＭ
Ｐタンパク質に二つの潜在的な利益をもたらす。第一
に、信号のない ＰＢＯＭＰ−１は、メンブランに移ら
ないだろう、従ってＰＢＯＭＰ−１の過多発現による毒
性効果は、減少するだろう、第二に、極めて疎水性の脂
質基によって修飾されないので、信号無しＰＢＯＭＰ−
１は、溶液中の単離または貯臓に洗浄剤の使用を要求し
ないだろう。ＰＢＯＭＰ−１の信号無し形態の構成は、
第２１図に示される。第２１図に示されるように、プラ
スミド pＰＸ １６０からのＰＢＯＭＰ−１遺伝子は、
ＡluI制限エンドヌクレアーゼでコドン１９において開
裂する。生成するフラグメントは、 pＵＣ１９ポリリン
カー領域内のＳmaI制限部位に連結する。生成する遺伝
子は、ネイティブPBOMP-１のアミノ酸配列にアミノ末端
における pＵＣ１９ポリリンカー領域からの付加的な１
８のアミノ酸を加えたものの全てを含有するハイブリッ
ドタンパク質を発現した。このプラスミドは、 pＰＸ１
６７と指定された。更に第２１図に示されるように、Ｐ
ＢＯＭＰ−１を発現する第二の組換えプラスミドは、ポ
リリンカーのＢamＨI部位において開裂し、そしてその
フラグメントをプラスミド pＩＮIII −ompA３のＢamＨ
I部位にクローニングすることによって、プラスミド p
ＰＸ１６７から誘導された。生成するプラスミド pＰＸ
１６８は、アミノ末端においてＥ．コリーＯＭＰ Ａタ
ンパク質の信号配列に連結した成熟 ＰＢＯＭＰ−１を
コード化するハイブリッド遺伝子を含む。このハイブリ
ッド生成物は、リポタンパク質修飾を欠きかつそのアミ
ノ末端において８個の付加的アミノ酸を含有する成熟Ｐ
ＢＯＭＰ−１を生成するために、ＯＭＰＡ信号配列によ
ってメンブランから処理した。プラスミド pＰＸ１６７
および pＰＸ１６８は、Ｅ．コリーＪＭ１０３に転換
し、組換えＰＢＯＭＰ−１合成について調べた。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥウエスターンブロット分析により、両プラス
ミドは、ポリクローナルおよびモノクローナル抗−ＰＢ
ＯＭＰ−１抗血清によって認識されたタンパク質をコー
ド化することを示した。 pＰＸ１６７から合成された修
飾ＰＢＯＭＰ−１は、イソプロピルチオベータ−ｄ−ガ
ラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）と誘導性であり、細胞質
中に位置し、そして洗浄剤の不存在下で溶解する。その
修飾ＰＢＯＭＰ−１は、ＩＰＴＧ誘導細胞からの全細胞
溶解産物のクマーシーブル―染色によって検出されず、
１％以下の全細胞タンパク質から成り立っている。 pＰ
Ｘ １６８から合成された修飾ＰＢＯＭＰ−１は、同様
にＩＰＴＧと誘導性であり（ハイブリッドライラックプ
ロモータの制御のもとで）、媒地に排泄され、同様に洗
浄剤の不存在下で可溶性である。十分に誘導されると、
この修飾ＰＢＯＭＰ−１は、約１〜２mgの細胞レベルで
産生された。 プラスミド pＰＸ１６７および pＰＸ１
６８は、同様に発現レベル用に種々のＥ．コリー菌株中
で試験した。最も好結果な組み合せは、Ｅ．コリーＰＲ
１３に転換した pＰＸ１６７キメラプラスミド、 mＲＮ
Ａ安定化突然変異体 pnp含有菌株であった。この菌株に
おいて、ｌac誘導後、約２〜３％の全細胞タンパク質に
おいてｌacプロモーターの調節のもとで組換えＰＢＯＭ
Ｐ−１は発現する。この組換えＰＢＯＭＰ-1は、ｌacα
−ペプチドおよびＰＢＯＭＰ−１遺伝子のアミノ末端に
融合した多クローニング配列からの約１７アミノ酸を含
有する細胞質融合タンパク質として発現する。
【００６０】８．１．１ 信号無しＰＢＯＭＰ-1の精製
および特徴 次の実験は、信号無しＰＢＯＭＰ−１を精製しかつ特徴
づけるために行なった（ここでは rＰＢＯＭＰ−１と称
する）。細胞質抽出物の単離 ３７℃においてルリア（Luria)ブイヨンで増強した pＰ
Ｘ１６７含有Ｅ．コリーＰＲ１３の一夜培養からの細胞
は、４℃でＧＳＡローター中において８，０００rpm で
１０分間沈降させた。ペレットは、１／１０容積の１０
mMＴris −ＨＣｌ，pH７．５で洗浄し、そして１０μｇ
／ｍｌＤＮアーゼおよび１０μｇ／ｍｌＲＮアーゼを含
有する１／１００容積の１０mMＴris ，pH７．５に再懸
濁した。細胞は、４０Ｗで１０分間氷上で音波破砕かま
たは２０，０００psi でフレンチプレッシャーセルに３
回通すことのいずれかにより破砕した。未破砕細胞は、
ＳＳ−３４ローターを用いて４℃において１０分間かけ
て１０，０００rpm で遠心分離して除去した。全細胞メ
ンブランは、４℃において６０Ｔi ローターで５５，０
００ rpm ，３０分間遠心分離して、除去した。メンブ
ランを棄て、上澄液を保持した。細胞出力抽出物のＤＥＡＥ分別 上澄液は、１０mM Ｔris ,pH ７．５で平衡にしたイオ
ン交換ＤＥＡＥ−バイオゲルＡ（バイオラド ラボラト
リーズ，カリフォルニア州 リッチモンド）カラムを通
した。本質的にタンパク質の全ては、これらの条件下で
カラムに結合した。結合 rＰＢＯＭＰ−１および他
のタンパク質を80mMＮａＣｌ含有１０mMＴris ，pH７．
５を用いて徐々に溶出このバッファーによって溶出した
タンパク質の全ては、プールしそして４℃で６０％飽和
硫酸アンモニウムを用いて沈降させて濃縮した。そのペ
レットを遠心分離して集め、残留硫酸アンモニウムを除
去するために同一バッファーに対して透析した後１０mM
Ｔris ，pH．７．５に溶解した。 rＰＢＯＭＰ−１の逆相クロマトグラフィー 上澄液含有 rＰＢＯＭＰ−１は、 dＨ2 Ｏ中の０．１％
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）含有バッファー中に希釈
後、４．６×１５mmＣ−４逆相ＨＰＬＣカラムに流し
た。そのカラムは、同一バッファーを用いて流速２ｍｌ
／分で流れた。タンパク質の大部分は、これらの条件下
でカラムに結合した。結合 rＰＢＯＭＰ−１は、２０分
かけて０．１％ＴＦＡの０〜９５％アセトニトリルグラ
ジェントによって単一ピークとして溶出した。 rＰＢＯ
ＭＰ−１含有巨大ピーク（第２２図，ピーク１参照のこ
と）は集め、フラクションをプールし、溶媒を蒸発して
濃縮した。乾燥 rＰＢＯＭＰ−１は、 dＨ2Ｏに再溶解
した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、前記のように、細胞質抽出
物、 ＤＥＡＥ溶出物およびプラスミド pＰＸ１６７含
有Ｅ．コリーＰＲ１３細胞から得た逆相溶出物に基づい
て行なった。電気泳動後、そのゲルは、クマーシーブリ
リアントブルー染色で約２時間かけて染色した。モノク
ローナル抗体ＧＤ２０４を使用するエウスターンブロッ
ト分析は、同様に行なった。得られた結果は、第２３図
ＡとＢに示す。第２３Ａ図に示すように、 rＰＢＯＭＰ
−１は、クマーシー染料で染色する際に、プラスミド p
ＰＸ１６７含有Ｅ．コリーＰＲ１３細胞の細胞質抽出物
中に存在する主要なタンパク質である（第２３Ａ図，レ
ーン１）。ウエスターンブロット反応性で評価されたよ
うに、９５％以上のrPBOMP−１は、細胞質抽出物に位置
する。細胞質抽出物の調製に洗浄剤が使用されていなか
ったので、その結果は、これらの細胞から得た rＰＢＯ
ＭＰ−１が洗浄剤なしで１０mM Ｔris −ＨＣｌ，pH
７．５に可溶性であることを示す。このことは、Ｈi ｂ
細胞から得られたＰＢＯＭＰ−１からそれたものをリポ
タンパク質として表わす。細胞質抽出物を使用する主要
な実験は、 pＰＸ１６７含有Ｅ．コリーＰＲ１３細胞か
ら得られた rＰＢＯＭＰ−１が、それ自身かまたは他の
細胞質タンパク質とのいずれかの複合体として水溶液中
に存在するだろうということを示す。アクリルアミド−
アガロースポリマーまたはセファデックスビーズを用い
るゲルフィルトレーションクロマトグラフィーがこの r
ＰＢＯＭＰ−１を使用して行なうと、その rＰＢＯＭＰ
−１は、100,000 ダルトン以上の見掛け分子量の位置で
溶出した（データは示されていない）。 ＤＥＡＥ−バ
イオゲルＡ（バイオラド ラボラトリーズ，カリフォル
ニア州 リッチモンド）を使用するイオン交換クロマト
グラフィーは、 rＰＢＯＭＰ−１が特有の塩濃度で単一
ピークとして溶出しなかった事実を示した。rPBOMP−１
は、１０mMＴris ，pH７．５において約２０mM〜７５mM
のＮａＣｌ濃度範囲にわたって溶出した。溶出rPBOMP-1
が８０mMＮａＣｌ洗浄液中の多くの溶出タンパク質の１
種であるけれども、残留する多くの細胞質タンパク質
は、８０mM以上の塩濃度でカラムに結合した。このよう
に、上記のようにＤＥＡＥクロマトグラフィーは、 rＰ
ＢＯＭＰ−１から多くの不純物タンパク質を除去するた
めの主要なステップとして使用した。第２３Ａ図に示さ
れるように、ＤＥＡＥクロマトグラフィーは、細胞質物
質中に見い出された多くのタンパク質を極めて減らし
（第23Ａ図，レーン2)、そしてrＰＢＯＭＰ−１とモノ
クローナル抗体との反応性を変更しなかった（第２３Ｂ
図，レーン２）。rＰＢＯＭＰ−１のアミノ酸配列は、
相対的に疎水性タンパク質であるべきことを示す。その
ことは洗浄剤なしで細胞質抽出物に可溶性であることを
示すけれども、rPBOMP−１が多くの細胞質タンパク質よ
り疎水性であることが期待される。 rＰＢＯＭＰ−１含
有ＤＥＡＥ溶出物は、前記のようにＣ−４疎水性相互作
用カラムでクロマトグラフィーにかけ、アセトニトリル
の増加するグラジェントを使用して溶出した。このシス
テムにおいて、より多くの疎水性タンパク質は、カラム
により強く結合し、そしてアセトニトリルの高濃度にお
いて溶出するだろう。 rＰＢＯＭＰ−１が多くの不純物
タンパク質よりも強く結合し、そしてそれらの多くのも
のの後から溶出すると考えらられる。フラクション含有
rＰＢＯＭＰ−１をＣ−４カラムでクロマトグラフィー
にかけると、ＰＢＯＭＰ−１は、カラムから溶出した主
要ピークであることが見い出され（第２１図）、そして
驚くべきことに、低アセトニトリル濃度で最初に溶出し
た。第２３Ａ図，レーン３に示されるように、 rＰＢＯ
ＭＰ−１ピークは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の１０μｇのタ
ンパク質におけるクマーシーブリリアントブルーＲ−２
５０染色によって測定されたように、純粋であった。そ
のピークは、クマーシー染色で主および副の２バンドを
示し、両者は、ＰＢＯＭＰ−１のアミノ末端２０アミノ
酸を認識するＰＢＯＭＰ−１のモノクローナル抗体と反
応した（第２３Ｂ図，レーン３）全サイズ rＰＢＯＭＰ
−１よりも約2000キロダルトン小さい副バンドは、より
小さなタンパク質が精製プロセスの副産物ではないこと
を示すＰＲ１３(pＰＸ１６７）の全細胞抽出物中にも存
在した。溶媒蒸発による濃縮後、精製 rＰＢＯＭＰ−１
は洗浄剤なしでも水性溶媒に可溶性であった。ラビット
の免疫法 ニュージーランド ホワイトラビットは、
不完全フロイントアジュバント中で乳化かまたは水酸化
アルミニウムに結合した pＰＸ１６７を含有するＥ．コ
リーＰＲ１３細胞から得た rＰＢＯＭＰ−１で免疫化し
た。 rＰＢＯＭＰ−１は、 rＰＢＯＭＰ−１を０．８５
％食塩水中５００μｇ／ｍｌの濃度でミョウバン（alu
m）を ５００μｇ／ｍｌ濃度で、１：１の比率で混合
して、ミョウバンと結合した。その混合物は、３７℃で
３時間振盪し、そしてミョウバンを遠心分離によって沈
降した。上澄液は、未反応タンパク質に関してＢＣＡタ
ンパク質アッセイ（ピアース ケミカル コーポレーシ
ョン，イリノイ州シカゴ）で検定した。何も検出されな
かった。ミョウバンは、生理食塩水に５００μｇ／ｍｌ
で再懸濁した、 rＰＢＯＭＰ−１は、不完全フロイント
アジュバント（Difco)に１：１の比率で乳化した。動物
は、４週間間隔で５０μｇのいずれかの製剤で筋肉内に
免疫化した。動物は、０，６週および各免疫化前に採血
した。血清は、エリサ（ELISA)およびウエスターンブロ
ット分析を用いて抗−ＰＢＯＭＰ−１および抗− rＰＢ
ＯＭＰ−１抗体を目的として検定した。組換えＰＢＯＭ
Ｐ−１を用いる免疫化は、ＥＬＩＳＡ検定法によって決
定されたように、Ｈ．インフルエンザ（ネイティブＰＢ
ＯＭＰ−１と称する）から得たＰＢＯＭＰ−１および組
換えＰＢＯＭＰ−１に対する抗体力価を引き出した。結
果は、第８表に示す。
【００６１】
【表８】 （第８表） ────────────────────────── rＰＢＯＭＰ−１に対する抗血清のＥＬＩＳＡ力価 に対するＥＬＩＳＡ力価a 抗-rPBOMP-1 ネイティブ 抗 血 清 アジュバント rPBOMP-1 PBOMP-1 ────────────────────────── ０週 ミョウバン(Alum) 800 800 ６週 ミョウバン 12,800 12,800 ０週 ＩＦＡ 800 800 ６週 ＩＦＡ 12,800 12,000 ────────────────────────── a ＥＬＩＳＡ力価は、バックグランドの２倍を生ずる抗血清の最高希釈の逆 数を表わす。 第８表に示されるように、ミョウバンかまたはＩＦＡの
いずれかの rＰＢＯＭＰ−１を用いる動物の免疫化は、
免疫後６週間において rＰＢＯＭＰ−１とネイティブPB
OMP-１の両者に反応性の抗体の大きな力価を引き出し
た。
【００６２】８．２ Ｅ．コリー中のＰＢＯＭＰ−２の
発現高揚 ＰＢＯＭＰ−２は、プラスミド pＡＡ１３０から低濃度
（セルタンパク質の１％未満）で同様に発現した。PBOM
P-２の発現は、明らかにネイティブプロモーターの制御
のもとである。ＰＢＯＭＰ−２の生産性を高めるため
に、 pＡＡ１３０のＰＢＯＭＰ−２遺伝子は、ＰＢＯＭ
Ｐ−２開始コドンへの単一ＳspI制限部位５塩基５'にお
いて開裂し、そして pＵＣ19のＳmaI部位に連結する。
連結は、全ＰＢＯＭＰ−2 ＯＲＦ（信号配列を含む）に
pＵＣ１９からの１８コドンおよび遺伝子融合部位から
の２コドンを含むハイブリッド転写解読枠（ＯＲＦ）を
生ずる。この融合遺伝子のタンパク質生成物は、１７９
９９ダルトンの分子量予想し、そしてｌacプロモーター
制御のもとで発現される。このプラスミドは、 pＰＸ１
６３と称される。プラスミド pＰＸ１６３がＥ．コリー
ＪＭ１０３へ転換しそしてＩＰＴＧで誘導すると、１
７，５００ダルトン見掛分子量のタンパク質は、発現し
た。加えて、１５，０００ダルトン分子量のタンパク質
双極子（doublet)は、観察された。３種のタンパク質の
全ては、ウエスターンブロット上の抗−ＰＢＯＭＰ−１
抗血清によって認識された（第２５図）。ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥのクマーシーブルー染色によって、組換えＰＢＯＭ
Ｐ−２の３種の形は、ｌac誘導後の約１５％全細胞タン
パク質から成っていた（第２５図，レーン３）。 pＰＸ
１６３から発現した組換えＰＢＯＭＰ−２の３種は、単
離され、Ｎ−末端ペプチド分析は次のことを示す。 １．１７，５００ダルトン見掛け分子量バンドは、予想
p ＵＣ１９／ＰＢＯＭＰ−２ハイブリッドタンパク質で
ある。 ２．１５，０００ダルトン分子量以上のバンドは、ＰＢ
ＯＭＰ−２信号配列の第１メチオニン残基から出発し
（即ち、ＰＢＯＭＰ−2 ＯＲＦの開始コドン）そして、
この点における翻訳の再開始によることが明らかであ
る。そして ３．１５０００ダルトン分子量より少ないバンドは、Ｎ
−末端分析にブロックし、そして14Ｃ−パルミテートで
標識化し得る。従って、このバンドは、ＰＢＯＭＰ−２
を処理したリポタンパク質からなる。
【００６３】９． 微生物の寄託 表にしたプラスミドをもたらす次のエシェリキアコリ菌
株をアグリカルチュラル・リサーチ・カルチャー・コレ
クション（ＮＲＲＬ），ペオリア，ＩＬ（Agricultural
Research Culture Collection （ＮＲＲＬ），Peor
ia，ＩＬ．）で寄託し以下の受入れ番号を得ている。 エシェリキア コリ菌株 プラスミド 受入番号 ＪＭ ８３ pＡＡ１５２ Ｂ−１８１５５ ＪＭ ８３ pＡＡ１３０ Ｂ−１８１５４ ＪＭ ８３ pＧＤ１０３ Ｂ−１８１５３ ＪＭ １０３ pＰＸ１６３ Ｂ−１８２８５ ＰＲ １３ pＰＸ１６７ Ｂ−１８２８６ ＪＭ １０３ pＰＸ１６８ Ｂ−１８２８７
【００６４】寄託された実施態様は、本発明の一態様の
単なる説明として意味され、また機能的に等しい微生物
は、本発明の範囲内であるので、本発明は、寄託微生物
による範囲に制限されるものではない。事実、本明細書
に示しまた記載したものに加えて種々の変更は、先の記
載および添付図面から当業者に明らかになるであろう。
このような変更を添附の請求の範囲内にあることを意図
する。また、ヌクレオチドに対して与えられた全塩基対
は、概算であり説明のために用いられたことを理解すべ
きである。
【００６５】本発明によれば、Ｈ．インフルエンザ細菌
性髄膜炎、中耳炎、喉頭蓋炎、および肺炎等の病因因子
での感染に対して保護する種々のワクチン処方における
免疫原として使用できる、Ｈ．インフルエンザのエピト
ープを特定するＰＢＯＭＰ−１およびＰＢＯＭＰ−２の
タンパク質並びにペプチドを遺伝子工学的に生産でき
る。
【００６６】
【図面の簡単な説明】
【図１】 第１図は、ＰＢＯＭＰ−１のドデシル硫酸ナ
トリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）検定を表わす。サンプルおよびゲルを第６．１
節に記載のごとく調合した。レーンＡは、約５μｇＰＢ
ＯＭＰ−１を含む。レーンＢは、予め着色した低分子量
（MW）標準、すなわちオバルブミンアルファー−キモト
リプシノーゲン（chymotrypsinogen）、ベーター−ラク
トグロブリン、リソチーム、ウシトリプシン禁止剤およ
びインスリン（ＡおよびＢ鎖）を含む。関連分子量を側
面に示す。
【図２】 第２図（ＡおよびＢ）は、ポリクローナル抗
ＰＢＯＭＰ−１抗体およびモノクローナル抗ＰＢＯＭＰ
−１抗体（Ｇ１−１）とのエシェリキアコリおよびＨ．
インフルエンザの全細胞溶解産物の反応性を表わす。第
２Ａ図において、溶解産物をポリクローナル抗ＰＢＯＭ
Ｐ−１抗体と反応した。各レーンは、次のとおりであ
る。すなわち（１）エシェリキアコリＨＢ１０１；
（２）エシェリキアコリ ＪＭ８３；（３）分子量標
準；および（４）培養Ｈ．インフルエンザ細胞から得ら
れた純化ＰＢＯＭＰ−１である。第２Ｂ図において、溶
解産物をモノクローナル抗−PBOMP-１抗体と反応した。
レーンは、第２Ａ図に記載のとおりである。
【図３】 第３図は、 pＬＧ３３９の誘導体である pＧ
Ｄ１０３の制限マップである［ストーカーら（Stoker e
t al.,1982，Gene１８：３３５−４１）を参照のこ
と］。
【図４】 第４図（ＡおよびＢ）は、 pＧＤ１０３内に
クローンされたＨ．インフルエンザＤＮＡの４．２kbフ
ラグメントからなる pＡＡ１５２のマップを表わす。遺
伝子コード化 ＰＢＯＭＰ−１を７３７ＢglII−ＢamＨ
Iフラグメントに局在定位する。第４Ａ図は、 pＡＡ１
５２の循環制限マップである。第４Ｂ図は、 pＡＡ１５
２の挿入フラグメントの決定検定を示す。遺伝子欠如誘
導体における残余Ｈ．インフルエンザを黒線で示す。
【図５】 第５図は、ＰＢＯＭＰ−１の異なるエピトー
プと反応する個々のモノクローナル抗体との pＡＡ１５
２含有エシェリキアコリ．ＪＭ８３の全細胞溶解産物の
反応性を表わす。レーンは、次のとおりである。すなわ
ち（Ａ）モノクローナル抗体Ｇ１−１；（Ｂ）モノクロ
ーナル抗体Ｇ９４−３；（Ｃ）モノクローナル抗体Ｇ１
８−３；（Ｄ）モノクローナル抗体２５−２；および
（Ｅ）モノクローナル抗体Ｇ２−３である。
【図６】 第６図は、組換えプラスミド pＡＡ１３０お
よび pＡＡ１５２を含有するＤＳ４１０微小細胞（mini
cells)のラジオオートグラム検定を表わす。分子量標準
を同図の左に示した。レーンは、（Ａ）ＤＳ４１０（ p
ＡＡ１３０）；（Ｂ）ＤＳ４１０（ pＧ１０３）；およ
び（Ｃ）ＤＳ 410（ pＡＡ１５２）を示す。カナマイシ
ンアミノグリコシダーゼ（Kanamycin aminoglycosidas
e）の位置を同図の右に示した。
【図７】 第７図（ＡおよびＢ）は、 pＧＤ１０３内に
クローンされたＨ．インフルエンザの５．７kbフラグメ
ントからなる pＡＡ１３０のマップを示す。第７Ａ図
は、 pＡＡ１３０の循環制限マップを示す。第７Ｂ図
は、Ｈ．インフルエンザ挿入 pＡＡ１３０フラグメント
の遺伝子欠如検定を示す。黒一色の線は、遺伝子欠如誘
導体における残余Ｈ．インフルエンザＤＮＡを示す。Ｐ
ＢＯＭＰ表現型を右に示す。遺伝子コード化ＰＢＯＭＰ
を７８１bpＢstＥII−ＸmnIフラグメントに局在定位す
る。
【図８】 第８図は、ポリクローナル抗ＰＢＯＭＰ−１
抗血清とのエシェリキアコリＪＭ８３および pＡＡ１３
０含有エシェリキアコリＪＭ８３の全細胞溶解産物の反
応性を表わす。レーンは、（Ａ） pＡＡ１３０含有ＪＭ
８３；（Ｂ）pＡＡ１３０含有ＪＭ８３；（Ｃ）ＪＭ８
３；（Ｄ）ＪＭ８３；（Ｅ）同図の右側にキロダルトン
で表示された分子量標準；および（Ｆ）Ｈi Ｓ−２を表
わす。
【図９】 第９図は、種々クローンから決定された発生
源、方向および範囲を示す pＡＡ１５２の７３７挿入フ
ラグメントのＤＮＡ配列法を示す。底部の矢印は、主要
読み取り枠 （ＯＰＦ）の位置を示す。
【図１０】 第１０図は、ＰＢＯＭＰ−１遺伝子を含有
する７３７bpフラグメントのヌクレオチド配列を表わ
す。予想読み取り枠（ＯＲＦ）を下線を引いた配列で示
し転写方向を矢印で示す。
【図１１】 第１１図は、ＰＢＯＭＰ−１の推定アミノ
酸配列を示す。ヌクレオチド配列を下線上に描き、相当
アミノ配列を下側に示す。四角で囲んだアミノ酸は、タ
ンパク質からの成熟した予想Ｎ末端アミノ酸を示す。
【図１２】 第１２図は、ＰＢＯＭＰ−１遺伝子の誘導
アミノ酸配列の部分（上側）とともにＰＢＯＭＰ−１か
ら誘導されたペプチドの部分的アミノ酸配列（下側）の
列を表わす。四角で囲んだ残基は、不適当な組合せを表
わす。
【図１３】 第１３図は、各クローンから決定された発
生源、方向および配列の範囲を示す pＡＡ１３０の７８
９bpＢstII− ＸmnIフラグメントの配列法を表わす。
下側の矢印は、主要読み取り枠（ＯＲＦ）を示す。
【図１４】 第１４図は、ＰＢＯＭＰ−２遺伝子を含有
する pＡＡの７８９bpＢstII−ＸmnIフラグメントのヌ
クレオチド配列を示す。予想ＯＲＦを下線を引いた配列
で示す。転写の方向を矢印で示す。「Ｎ」で表わした２
つの塩基は、未知ヌクレオチドを表わす。
【図１５】 第１５図は、ＰＢＯＭＰ−２の推定アミノ
酸配列を示す。ヌクレオチド配列を上側に示しまた相当
アミノ酸配列を下側に示した。四角で囲んだ残余は、タ
ンパク質からの成熟した予想Ｎ−末端アミノ酸である。
【図１６】 第１６図は、ＰＢＯＭＰ−１の脂肪酸の気
液クロマトグラフィーを用いて得られたクロマトグラム
である。ノナデカン酸（Ｃ１９）を内部標準として含め
た。
【図１７】 第１７図は、組換プラスミド pＡＡ１３０
および pG103含有エシェリキアコリＪＭ８３細胞並びに
pＧＤ１０３含有対照エシェリキアコリＪＭ８３細胞ラ
ジオオートグラフＳＤＳ−ＰＡＧＥ検定を表わす。レー
ンは、（１）pＡＡ１３０；（２） pＡＡ１５２および
（３） pＧＤ１０３を示す。分子量約１５，０００のバ
ンドの位置を同図の左側に示す。
【図１８】 第１８図（ＡおよびＢ）は、グロボマイシ
ン（globomycin）の存在下または不存在下 pＡＡ１３０
または pＡＡ１５２含有エシェリキアコリＪＭ８３の全
細胞溶解産物のウエスタンブロットゲル検定を表わす。
分子量標準を第１８図（ＡおよびＢ）の左側に示す。第
１８Ａ図は、ＰＢＯＭＰ−１遺伝子を含有する pＡＡ１
５２含有細胞の溶解産物を表わす。レーンは、（１）グ
ロボマイシン不存在および（２）グロボマイシン存在を
表わす。第１８Ｂ図は、ＰＢＯＭＰ−２遺伝子を含有す
る pＡＡ１３０含有細胞の溶解産物を表わす。レーン
は、（１）グロボマイシン不存在および（２）グロボマ
イシン存在を表わす。
【図１９】 第１９図は、ＰＢＯＭＰ−１（５．２μ
ｇ）からなるワクチン処方をヒト成人に投与した際得ら
れた抗体応答を示す。
【図２０】 第２０図は、モノクローナル抗体Ｇ２０４
とのエシェリキアコリＪＭ１０１またはＪＭ１０３の全
細胞溶解産物の反応性を表わす。レーンは、（Ａ） pＰ
Ｘ１６６含有ＪＭ１０３；（Ｂ） pＰＸ１６０含有ＪＭ
１０３；（Ｃ）ｐＵＣ１９含有ＪＭ１０１；（Ｄ）同図
の左側にキロダルトンで表示した分子量標準；および
（Ｅ）Ｈ．インフルエンザからの自然発生ＰＢＯＭＰ−
１を表わす。
【図２１】 第２１図は、ＰＢＯＭＰ−１シグナル配列
欠如配列をコードするＰＢＯＭＰ−１タンパク質含有プ
ラスミドの構成の概略図である。プラスミドpＰＸ１６
７において、シグナル配列欠如ＰＢＯＭＰ−１をｌacプ
ロモーターから下側に挿入する。血漿 pＰＸ１６３は、
ポリリンカーにおけるＢamＨＩ部位でpＰＸ１６７にＰ
ＢＯＭＰ−１コード配列を分裂し、プラスミド pＩＮII
I − ompＡ3 のＢamＨI中に得られたフラグメントをク
ローニングすることにより構成される。プラスミド pＰ
Ｘ１６８は、エシェリキアコリ ompＡタンパク質のシ
グナル配列へのアミノ末端でリンクされた成熟ＰＢＯＭ
Ｐ−１に関してコードするキメラ配列を含有する。
【図２２】 第２２図は、プラスミド含有エシェリキア
コリ菌株ＰＲ１３の細胞質抽出物の上澄フラクションの
逆相Ｃ−４高性能液体クロマトグラフィーを用いて得ら
れたクロマトグラムを表わす。
【図２３】 第２３Ａ図は、クマーシー染色で染色され
たプラスミド pＰＸ１６７を含有するエシェリキアコリ
ＰＲ１３から得られたシグナルレスＰＢＯＭＰ−１のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥを表わす。レーンは、（１）細胞質フラ
クション、（２） ＤＥＡＥ溶出物；および（３）逆相
溶出物を表わす。分子量標準をレーン１の左側まで操作
し、関連ＭＷS （キロダルトン）を同図の左側に示し
た。第２３Ｂ図は、抗PBOMP-１モノクロナール抗体との
該フラクションの反応性を表わす。
【図２４】 第２４図は、ｌacプロモーターから下側に
挿入された ＰＢＯＭＰ−２タンパク質の完全コード配
列を含むプラスミド pＰＸ１６３の構造の概略図であ
る。
【図２５】 第２５図は、ＩＰＴＧの存在下または不存
在下生長した pＰＸ１６３含有エシェリキアコリの全細
胞溶解産物の ＳＤＳ−ＰＡＧＥ検定を表わす。レーン
は、（１）分子量標準：キロダルトン；（２）ＩＰＴＧ
なしで生長した pＰＸ１６３含有ＪＭ１０３の溶解産
物；および（３）レーン２において４時間ＩＰＴＧ（５
mM）の存在で生長したものを表わす。矢印はＩＰＴＧに
より誘導された３つの ＰＢＯＭＰ−２反応性バンドを
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/11 ＺＮＡ Ｃ０７Ｋ 14/11 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｌ 33/577 33/577 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ジロトニック，ガリー アメリカ合衆国 ニューヨーク州 14526 ペンフィールド レッドウッド ドライ ブ 17 (72)発明者 グリーン，ブルース アメリカ合衆国 ニューヨーク州 14534 ピッツフォード ノースフィールド ゲ ート 49

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヘモフィルス・インフルエンザ外膜タン
    パク質の抗原決定基をコードするＤＮＡ配列を含む組換
    えベクターであって、該外膜タンパク質が第１１図に実
    質的に示されたとおりのアミノ酸配列または少なくとも
    ７個の隣接したアミノ酸からなるその部分配列を有し、
    該アミノ酸配列がヘモフィルス・インフルエンザ外膜タ
    ンパク質の抗原決定基を１以上含むものである、上記の
    組換えベクター。
  2. 【請求項２】 ヘモフィルス・インフルエンザ外膜タン
    パク質の抗原決定基をコードするＤＮＡ配列を含む組換
    えベクターであって、該外膜タンパク質が第１５図に実
    質的に示されたとおりのアミノ酸配列または少なくとも
    ７個の隣接したアミノ酸からなるその部分配列を有し、
    該アミノ酸配列がヘモフィルス・インフルエンザ外膜タ
    ンパク質の抗原決定基を１以上含むものである、上記の
    組換えベクター。
  3. 【請求項３】 前記のＤＮＡ配列が発現調節要素の制御
    下にある、請求項１または２に記載の組換えベクター。
  4. 【請求項４】 前記のベクターが、ｐＡＡ１５２、ｐＰ
    Ｘ１６７、ｐＰＸ１６８、ｐＡＡ１３０、またはｐＰＸ
    １６３、もしくはその変異体、組換え体、あるいは遺伝
    子工学的に操作された誘導体である、請求項１〜３いず
    れか１つに記載の組換えベクター。
  5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１つに記載の組
    換えベクターを含有する単細胞生物。
  6. 【請求項６】 細菌からなる、請求項５に記載の単細胞
    生物。
  7. 【請求項７】 ＮＲＲＬに寄託して受託番号Ｂ−１８１
    ５４、Ｂ−１８１５５、Ｂ−１８２８６、Ｂ−１８２８
    ７、またはＢ−１８２８５を指定されたエシェリキア・
    コリ細菌またはその変異体、組換え体もしくは遺伝子工
    学的に操作された誘導体からなる、請求項６に記載の単
    細胞生物。
  8. 【請求項８】 ヘモフィルス・インフルエンザＰＢＯＭ
    Ｐ−１タンパク質の抗原決定基を１以上含む第１１図に
    実質的に示したとおりのアミノ酸配列または少なくとも
    ７個の隣接したアミノ酸からなるその部分配列を有す
    る、ヘモフィルス・インフルエンザ外膜タンパク質の抗
    原決定基をコードするＤＮＡ配列を含む単離および精製
    されたＤＮＡフラグメント。
  9. 【請求項９】 ヘモフィルス・インフルエンザＰＢＯＭ
    Ｐ−２タンパク質の抗原決定基を１以上含む第１５図に
    実質的に示したとおりのアミノ酸配列または少なくとも
    ７個の隣接したアミノ酸からなるその部分配列を有す
    る、ヘモフィルス・インフルエンザ外膜タンパク質の抗
    原決定基をコードするＤＮＡ配列を含む単離および精製
    されたＤＮＡフラグメント。
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