ES2377569T3 - Polinucleótidos de Haemophilus parasuis y su uso - Google Patents

Polinucleótidos de Haemophilus parasuis y su uso Download PDF

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Abstract

Polinucleótido de Haemophilus parasuis, caracterizado porque codifica un polipéptido que presenta una identidad de al menos el 70%, 80% ó 90% con un polipéptido definido por la SEC ID NO: 2.

Description

Polinucleótidos de Haemophilus parasuis y su uso
Campo de la técnica
La presente invención se encuadra en el campo del desarrollo de vacunas contra Haemophilus parasuis que comprenden polipéptidos obtenidos por tecnología recombinante.
Estado de la técnica anterior
La bacteria H. parasuis es el agente causante de la enfermedad de Glässer (poliserositis-artritis porcina) que tiene repercusiones económicas importantes en la industria porcina.
Se considera que la inmunidad materna aportada por el calostro es un factor determinante para la prevención de la enfermedad. La práctica del destete precoz de los lechones ha incrementado la frecuencia de esta enfermedad y ha aumentado la utilización de vacunas.
H. parasuis es una bacteria comensal del tracto respiratorio superior que sólo causa enfermedad cuando llega a colonizar el tracto respiratorio inferior y en particular los pulmones, provocando neumonías.
Ciertas cepas de alta virulencia cruzan la barrera pulmonar y colonizan tejidos séricos provocando serositis, pericarditis, artritis y en ciertas circunstancias meningitis. Consecuentemente, ciertas cepas de H. parasuis tienen el poder de colonizar e invadir eficazmente numerosos tejidos contrariamente a las cepas avirulentas que se quedan localizadas en el tracto respiratorio superior.
Una de las características primordiales de H. parasuis es su variabilidad antigénica, que reduce en gran medida la eficacia de las vacunas.
Existen por lo menos 15 serotipos, ya que un número importante de cepas no son tipificables, y cuando se procede a infecciones experimentales en cerdos el grado de virulencia es variable según la cepa.
Kielstein et al., J. Clin. Micro. 30: 4: 862 (1992) describe que existe una correlación entre serotipos y el grado de virulencia de la cepa. Se considera que las cepas de serotipo 1, 5, 10 y 12 son de gran virulencia mientras que las de serotipo 2, 4 y 15 son moderadamente virulentas y las de serotipo 3, 6, 7, 9 y 11 son avirulentas. Sin embargo, esta clasificación serológica no es absoluta y en la práctica se observan numerosas excepciones a esta regla.
No se conoce un método de diagnóstico comercial para clasificar las cepas de H. parasuis en virulentas y avirulentas, por lo que sería deseable disponer de un método que permitiera determinar si una cepa de H. parasuis es virulenta o no, sin tener que esperar a que se pusieran de manifiesto los síntomas de la enfermedad, y poder proceder al eventual tratamiento de la misma sin demora.
Para proteger cerdos contra H. parasuis se emplean vacunas que comprenden bacterias inactivadas (bacterinas), pero la eficacia es limitada porque inducen una respuesta inmune humoral dirigida esencialmente contra lipopolisacáridos que pueden variar de una cepa a otra.
En la solicitud de patente WO-A-00/01408 se describen vacunas contra las infecciones causadas por H.parasuis que utilizan un extracto celular de bacterias que tiene una actividad tóxica cuando se administra a cerdos por vía intraperitoneal, pero que ejerce una acción protectora cuando se administra por vía intramuscular en presencia de un adyuvante.
Por el momento no se ha caracterizado la naturaleza molecular de los antígenos responsables de la respuesta inmune y de la protección. Solamente se conoce que la actividad tóxica del extracto celular reside en una fracción proteica de alto peso molecular.
Esto se ha observado también en el caso de otra especie como es Haemophilus influenzae, ya que Hendrixson et al., Mol. Cell. 2: 841 (1998) describe que las moléculas responsables de la colonización e invasión de tejidos son glicoproteínas de membrana con propiedades de autotransporte, denominadas adhesinas, invasinas o hemaglutininas.
Para dicha especie H.influenzae, en la solicitud de patente WO-A-96/30519 se describen vacunas contra las infecciones causadas por dicha bacteria que contienen proteínas de adhesión obtenidas mediante tecnología recombinante.
No obstante, el principal inconveniente para desarrollar vacunas que confieran una buena protección inmunológica, reside en el desconocimiento existente sobre el genoma de H.parasuis, y en particular sobre los polinucleótidos que codifican las adhesinas, invasinas o hemaglutininas de H.parasuis.
Subsiste pues la necesidad de disponer de vacunas eficaces contra las infecciones causadas por H. parasuis.
Los autores de esta invención han desarrollado una vacuna contra las infecciones causadas por H.parasuis que incluye polipéptidos obtenidos mediante tecnología recombinante.
Objeto de la invención
El objeto de la presente invención es proporcionar polinucleótidos de H. parasuis.
En un segundo aspecto la invención tiene también por objeto los polipéptidos expresados por los polinucleótidos de la invención.
En un tercer aspecto la invención tiene también por objeto un vector de expresión que comprende al menos un polinucleótido de H. parasuis de la invención.
En un cuarto aspecto la invención tiene también por objeto una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende al menos un polinucleótido de H. parasuis de la invención.
En un quinto aspecto la invención tiene también por objeto un procedimiento para la preparación de los polipéptidos recombinantes de H. parasuis.
En un sexto aspecto, la invención tiene también por objeto el uso de los polipéptidos de la invención para la preparación de vacunas y/o composiciones inmunogénicas.
En un séptimo aspecto, la invención tiene también por objeto una vacuna contra las infecciones causadas por H.parasuis.
En un octavo aspecto, la invención tiene también por objeto el uso de los polinucleótidos para determinar si una cepa de H. parasuis es virulenta o avirulenta.
En un noveno aspecto, la invención tiene también por objeto un kit para determinar si una cepa de H. parasuis es virulenta o avirulenta.
Descripción de las figuras
Figura 1
En la Figura 1 se muestra un diagrama de las diferentes etapas técnicas que conducen a la secuenciación y anotación de los genes y proteínas codificante para polipéptidos considerados autotransportadores, adhesinas, invasinas o hemaglutininas de H. parasuis.
Figura 2
En la Figura 2 se muestra la alineación múltiple de las partes 3’ terminales de los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de H. parasuis. Los polinucleótidos se pueden agrupar en tres grupos estructurales denominados grupo 1, grupo 2, y grupo 3. El grupo 1 comprende los nucleótidos SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, y SEC ID NO: 25. El grupo 2 comprende los nucleótidos SEC ID NO: 5, y SEC ID NO: 11. El grupo 3 comprende los nucleótidos SEC ID NO: 13, y SEC ID NO: 17. El polinucleótido definido por la secuencia SEC ID NO: 15 se considera que pertenece al grupo1, pero no se puede introducir en la alineación múltiple de todos los polinucleótidos porque le falta un fragmento de la parte 3’ terminal. Las alineaciones múltiples se consiguen aplicando el programa CLUSTALX descrito en Thompson et al., Nucleic Acids Res. 25: 4876 (1997).
Figura 3
En la Figura 3 se muestra la alineación múltiple de los polinucleótidos que codifican las partes 5’ terminales de los polipéptidos de H. parasuis. Se observa una buena conservación en los 206 nucleótidos, y la identidad es completa para los 36 primeros nucleótidos.
Figura 4
En la Figura 4 se muestra la alineación múltiple de los aminoácidos de los polipéptidos de H. parasuis. Los polipéptidos pueden agruparse en tres grupos estructurales denominados grupo1, grupo 2, y grupo 3. El grupo 1 comprende los polipéptidos SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24 y SEC ID NO: 26. El grupo 2 comprende los polipéptidos SEC ID NO: 6, y SEC ID NO: 12. El grupo 3 comprende los polipéptidos SEC ID NO: 14, y SEC ID NO: 18.
Figura 5
En la Figura 5 se muestra la electroforesis por gel de agarosa de los productos de amplificación de los polinucleótidos de la invención de varias cepas virulentas y no virulentas de H. parasuis.
En la Figura 5A se presentan los productos de amplificación correspondientes a los polinucleótidos del grupo 1, definidos por las secuencias SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23.y SEC ID NO: 25.
En la Figura 5B se presentan los productos de amplificación correspondientes a los polinucleótidos del grupo 2, definidos por las secuencias SEC ID NO: 5, y SEC ID NO: 11.
En la Figura 5C se presentan los productos de amplificación correspondientes a los polinucleótidos del grupo 3 definidos por las secuencias SEC ID NO: 13, y SEC ID NO: 17.
En el carril M se presenta una escalera de 1 kb (New England Biolabs), que se ha empleado como marcador de peso molecular.
En el carril a se presentan los productos de amplificación correspondientes a la cepa H. parasuis (Nagasaki), que es una cepa de referencia de serotipo 5 altamente virulenta reproduciendo experimentalmente la enfermedad de Glässer.
En las columnas b – e se presentan los productos de amplificación correspondientes a cepas aisladas de la cavidad nasal de cerdos que no presentaban ningún síntoma o lesión característica de la enfermedad de Glässer y/o procedentes de granjas sin historial de la enfermedad.
En las columnas f – k se presentan los productos de amplificación correspondientes a cepas aisladas de distintos órganos de cerdos con la enfermedad de Glässer confirmada.
En la Figura 5B, la flecha situada sobre una banda de la columna j indica el producto de PCR de la cepa virulenta HP2269 que se ha secuenciado con el cebador pADH-F (SEC ID NO: 27), y que expresa un polipéptido denominado HP2269-2-j-1. La nomenclatura empleada identifica la cepa: HP2269, el grupo: 2, el carril de la electroforesis: j, y la posición de la banda empezando desde el peso molecular más bajo: 1.
Figura 6
En la Figura 6 se muestra el resultado de la comparación de la secuencia de aminoácidos correspondiente al polipéptido denominado HP2269-2-j-1. Dicho polipéptido es expresado por el producto de PCR perteneciente al polinucleótido de más bajo peso molecular del grupo 2 de la cepa HP2269 (banda señalada por una flecha en la Figura 5). La secuencia de polinucleótidos obtenida con el cebador pADH-F (SEC ID NO: 27) se traduce in silico , y la secuencia del polipéptido resultante se compara con las secuencias de los polipéptidos de la invención mediante el programa blastX.
En la Figura 6A se presenta la alineación obtenida con el polipéptido SEC ID NO: 16 pertenciente al grupo 1, y en la Figura 6B la alineación obtenida con el polipéptido SEC ID NO: 12, perteneciente al grupo 2. En ambos casos la secuencia de aminoácidos del polipéptido HP2269-2-j-1 presenta un 59% de identidad.
Descripción detallada de la invención
Identificación de los polinucleótidos
La presente invención proporciona un polinucleótido que se ha identificado después de secuenciar el genoma de la cepa H. parasuis (Nagasaki), que es una cepa de referencia de serotipo 5 altamente virulenta reproduciendo experimentalmente la enfermedad de Glässer (Takahashi et al., J. Vet. Med. Sci. 63: 487 (2001)).
El polinucleótido de la invención y los polinucleótidos adicionales de SEC ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 y 25 tienen en común que expresan polipéptidos que tienen una homología significativa con autotransportadores, adhesinas, invasinas, hemaglutininas, y proteínas de membrana externa presentes en diversas protobacterias, es decir, expresan polipéptidos que están expuestos en la superficie de la bacteria a los anticuerpos del sistema inmunitario del huésped, de modo que son apropiados para preparar vacunas contra las infecciones causadas por H. parasuis.
El objeto de la invención se refiere a un polinucleótido de H. parasuis que tiene la secuencia SEC ID NO: 1.
El procedimiento empleado para la identificación del polinucleótido comprende la combinación de técnicas recombinantes con tratamientos informáticos, como se muestra en el esquema de la Figura 1.
Los métodos experimentales que se emplean en el procedimiento para la identificación del polinucleótido de la invención constituyen técnicas bien conocidas por el experto en la materia, y se encuentran bien descritos, por ejemplo, en el libro de Sambrook et al., op.cit.
El experto también dispone de una información complementaria que consiste en la documentación que acostumbra a acompañar los productos y equipos bioquímicos, en donde el fabricante sugiere procedimientos para el empleo de los productos y de los equipos.
De acuerdo con el esquema de la Figura 1, el procedimiento experimental que se sigue para la identificación del polinucleótido de la invención comprende las siguientes etapas:
1.-Cultivo de una cepa virulenta de H. parasuis
Para la purificación de ADN genómico y la realización de genotecas se escoge la cepa Nagasaki de H. parasuis, donación del Dr. Pat Blackall del Animal Research Institute (Queensland, Australia), que es una cepa virulenta de serotipo 5.
La cepa se cultiva en seis placas de 90 mm de diámetro sembradas a saturación en agar chocolate (Bio Mérieux) en estufa a 37º C con 5% de CO2 durante 48 horas. Se obtienen 3x1010 unidades formadoras de colonias (UFCs).
2.-Purificación del ADN genómico de H. parasuis
Las bacterias se recuperan de las placas por resuspensión en solución tampón PBS (Amresco) y se sedimentan por centrifugación a 3000 g. El sobrenadante se elimina, y el sedimento de bacterias se resuspende brevemente. A continuación se procede a la purificación del ADN genómico utilizando el kit Genomic-tip 100/G (Qiagen). Al finalizar el proceso de purificación se comprueba la integridad del ADN por electroforesis en gel de agarosa, obteniendo una banda única con un peso molecular superior a 30.000 pb (pares de bases).
3.1-Fragmentación del ADN genómico por digestión enzimática.
Se utilizan dos enzimas de restricción, Sau 3AI y Rsa I (New England Biolabs) para fragmentar el ADN genómico de
H. parasuis con los tampones de reacción adecuados y la albúmina sérica bovina (BSA) proveídos por el fabricante. El enzima de restricción Sau 3AI genera fragmentos cohesivos en el ADN de H. parasuis, y el enzima Rsa I fragmentos romos. En ambos casos, los fragmentos tienen un tamaño mayoritariamente comprendido entre 300 y
1.200 pb que los hace apropiados para ser clonados en plásmidos.
3.2.-Fragmentación del ADN genómico por sonicación
El tratamiento con ultrasonidos fragmenta el ADN genómico de manera aleatoria. La sonicación se efectúa sobre una solución de ADN de H. parasuis en un sonicador B. Braun Labsonic U. Se efectúan ciclos de sonicación a diferentes tiempos con diferente potencia según métodos convencionales bien conocidos por el experto.
Los fragmentos de ADN sonicados tienen un tamaño comprendido entre 100 y 1.500 pb, y la mayoría de ellos están comprendidos entre 400 y 900 pb, y se convierten en fragmentos con extremos romos mediante el empleo del enzima T4 polimerasa (New England Biolabs).
4.-Purificación por gel de agarosa de fragmentos de ADN digeridos o sonicados
Los fragmentos de ADN genómico de H. parasuis digeridos o sonicados se purifican en un gel de agarosa.
Con el ADN digerido con Sau 3AI se recuperan los fragmentos de 300 a 600 pb; con el ADN digerido con Rsa I, se recuperan los fragmentos de 400 a 800 pb, y con el ADN sonicado, se recuperan los fragmentos de 400 a 1500 pb.
La extracción de los fragmentos de ADN contenidos en los trozos de gel se efectúa con el kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen) o el kit MinElute Gel Extraction (Qiagen).
Los fragmentos de ADN purificados son cuantificados mediante la migración de una alícuota en gel de agarosa en el cual se ha migrado también un estándar de ADN cuantificado (pUC19 de New England Biolabs).
5.-Clonación de fragmentos de ADN en el plásmido pUC19 El plásmido pUC19 (New England Biolabs) es un plásmido de alto número de copias con sitios de clonación múltiple en el gen de la beta-galactosidasa que permite insertar fragmentos de ADN con una alta eficacia.
Para poder insertar los fragmentos de ADN obtenidos por digestión y por sonicación se prepara el plásmido para que sea compatible con los extremos cohesivos o romos de los fragmentos de ADN obtenidos.
La preparación del plásmido consiste en cortar el mismo con los enzimas adecuados para generar extremidades cohesivas o romas, y en la desfosforilación de las extremidades del plásmido con una fosfatasa para evitar su ciclación.
Para preparar el plásmido pUC19 con el fin de insertar los fragmentos de ADN genómico de H. parasuis generados por el enzima de restricción Sau 3AI, se realizan dos ciclos que incluyen cada uno una digestión con Bam HI (New England Biolabs), una purificación con el kit MinElute Reaction Cleanup (Qiagen), y una desfosforilación con la fosfatasa intestinal de ternera CIP (New England Biolabs), seguido de una purificación con el kit MinElute Reaction Cleanup (Qiagen).
Para insertar los fragmentos de ADN genómico de H. parasuis generados por el enzima de restricción Rsa I en el plásmido pUC19 se utiliza el enzima de restricción Sma I (New England Biolabs), y la desfosforilación de pUC19 se efectúa con la fosfatasa alcalina bacteriana BAP (Invitrogen) sin purificación previa del producto digerido. El plásmido desfosforilado, después de una migración en gel de agarosa se purifica con el kit MinElute Gel Extraction (Qiagen).
En el caso de la inserción de los fragmentos de ADN genómico de H. parasuis generados por sonicación se utiliza el enzima de restricción Sma I (New England Biolabs) para cortar el plásmido pUC19. En este caso la desfosforilación se efectúa con tres variantes para mejorar las capacidades de inserción de este plásmido:
a) con la fosfatasa intestinal de ternera CIP (New England Biolabs),
b) con la fosfatasa alcalina bacteriana BAP (Invitrogen), y
c) con una etapa de purificación previa en gel de agarosa empleando el kit MinElute Gel Extraction (Qiagen), y a continuación se lleva a cabo la desfosforilación con la fosfatasa intestinal de ternera CIP (New England Biolabs).
Finalmente, después de una migración por gel de agarosa, los plásmidos desfoforilados se purifican con el kit MinElute Gel Extraction (Qiagen), y cuantificados por migración de una alícuota en gel de agarosa en el cual se migra conjuntamente un estándar de ADN cuantificado (pUC19 de New England Biolabs).
Aunque se realizaron y se explotaron genotecas con todas las preparaciones descritas, el modo de preparación c) resulta ser el más efectivo.
La inserción de los fragmentos de ADN de H. parasuis (Nagasaki) en los plásmidos desfosforilados se realiza mediante la ligasa T4 (Quick Ligation Kit, New England Biolabs). Seguidamente se purifican los productos de la reacción con el kit MinElute Reaction Cleanup (Qiagen), realizando la elución con agua milliQ.
Se utilizan las bacterias electrocompetentes E.coli DH5a o DH10B, que son defectivas en el gen lac Z de la beta galactosidasa y sensibles a la ampicilina. Dichas bacterias se transforman por electroporación con los productos de ligación purificados.
De este modo se obtienen bacterias recombinantes; la mayoría de ellas incorporan el plásmido pUC19 con inserciones de los fragmentos de ADN de H. parasuis.
6.-Selección de clones recombinantes
Las colonias de las bacterias que incorporan pUC19 con una inserción de ADN de H. parasuis son de color blanco, mientras que las bacterias azules son las que contienen el plásmido pUC19 sin la inserción de un fragmento de ADN de H. parasuis. De este modo se pueden seleccionar los clones apropiados.
Cada genoteca contiene habitualmente decenas de miles de recombinantes. Los mejores resultados fueron obtenidos con el plásmido pUC19 cortado con Sma I desfosforilado y purificado según la variante c).
7.-Purificación de los plásmidos recombinantes
Para purificar los plásmidos recombinantes se pueden utilizar los kits: -R.E.A.L Prep 96 BioRobot (Qiagen) y NucleoSpin 96 Flash (Macherey-Nagel) con un autómata (BioRobot 3000, Qiagen), o -NucleoSpin 96 Flash (Macherey-Nagel) si este proceso se realiza manualmente.
Estos kits utilizan el principio de la lisis alcalina de las bacterias seguido de una neutralización, clarificación del lisado, y precipitación de los plásmidos por la adición de isopropanol.
Típicamente la concentración del plásmido se sitúa entre 50 y 150 ng/ll.
8.-Secuenciación de los fragmentos de ADN de H. parasuis clonados en los plásmidos
La gran mayoría de los plásmidos purificados poseen insertado un fragmento de ADN de H. parasuis (Nagasaki) en el sitio de clonación de pUC19.
Los insertos se secuencian mediante uno u otro de dos cebadores universales situados a las dos extremidades del sitio de clonación por extensión con la Taq polimerasa en presencia de dNTPs (nucleótidos dATP, dGTP, dCTP, y dTTP) y ddNTPs; estos últimos marcados con fluorocromos diferentes.
Los cebadores universales que se emplean son de Eurogentec, y tienen las secuencias: -5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’ -5’-AACAGCTATGACCATG-3’.
Se realizan 23.676 secuencias con el kit BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems) en placas de 96 pocillos (Applied Biosystems o Axygen) adaptables a termocicladores y secuenciadores del fabricante Applied Biosystems.
La lectura de las secuencias se efectúa de manera automática introduciendo en ficheros informáticos todos los parámetros necesarios para construir los electroferogramas.
9.-Ensamblado de las secuencias.
En la presente invención se utiliza la cadena de programas Phred (Ewing and Green, Genome research, 8: 175, 186(1998)), y Phrap y Consed (Gordon et al., Genome Research, 8: 195(1998)) para ensamblar los 23.676 polinucleótidos descritos en el apartado 8.
Un contig es el ensamblado de varias secuencias de polinucleótidos con un grado significativo de solapamiento.
En total se obtienen 721 contigs y 94 secuencias huérfanas (secuencias que no entran dentro de un contig). Sumando el tamaño en nucleótidos de todos los contigs y secuencias huérfanas se obtienen 2.139.054 pb. Si se tiene en cuenta que el tamaño estimado de H. parasuis (Nagasaki) es de aproximadamente 2.500.000 pb, se puede considerar que se ha cubierto más del 80% del genoma de H. parasuis (Nagasaki) con una buena calidad de secuenciación.
10.-Anotación de los contigs e identificación de los polipéptidos de H. parasuis
La anotación de los polinucleótidos (contigs) obtenidos en el apartado 9 se realiza utilizando el programa de comparación de secuencias denominado blastX con la base de datos GenBank nr que se puede encontrar en la web del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
El programa traduce in silico los polinucleótidos en polipéptidos, y se seleccionan aquellas alineaciones de polipéptidos que tienen una mayor probabilidad de ser homólogas con secuencias de polipéptidos del tipo adhesinas, invasinas, hemaglutininas y autotransportadores de otros microorganismos, que son unas proteínas consideradas responsables de la colonización e invasión de tejidos en numerosos microorganismos.
Los inventores han identificado secuencias de interés en 13 contigs de polinucleótidos, que se han denominado SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, y SEC ID NO: 25, siendo SEC ID NO: 1 el objeto de la invención.
Las secuencias de los polipéptidos que se comparan se corresponden con las traducciones in silico del polinucleótido de la invención y otros polinucleótidos adicionales de SEC ID: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 y 25, de modo que el polipéptido definido por la secuencia SEC ID NO: 2 es la traducción in silico del polinucleótido definido por la secuencia SEC ID NO: 1, y así sucesivamente hasta el polipéptido definido por la secuencia SEC ID NO: 26, resultante de la traducción in silico del polinucleótido definido por la secuencia SEC ID NO: 25.
No se ha identificado ninguna secuencia de ADN de otros organismos que presente una homología significativa con las secuencias del polinucleótido de la invención y otros polinucléotidos adicionales de SEC ID: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 y 25, cuando se comparan dichas secuencias con las secuencias presentes en la base de datos GenBank utilizando el programa blastN.
Por tanto, la secuencia de polinucleótido de la invención es nueva. Las secuencias de polinucleótidos también presentan un buen grado de homología entre ellas, que se pone de manifiesto en la alineación múltiple de los extremos 5’ del polinucleótido de la invención y otros polinucléotidos adicionales de SEC ID: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 y 25 (Figura 3). Dicha alineación múltiple muestra una buena conservación en los 206 primeros nucleótidos, siendo la identidad completa para los 36 primeros nucleótidos.
Como se muestra en la alineación múltiple de las partes 3’ terminales de los polinucleótidos de H. parasuis de la Figura 2, los polinucleótidos se pueden agrupar en tres grupos estructurales denominados grupo 1, grupo 2, y grupo
3. El grupo 1 comprende los nucleótidos SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 19 SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23 y SEC ID NO: 25. El grupo 2 comprende los nucleótidos SEC ID NO: 5, y SEC ID NO: 11. El grupo 3 comprende los nucleótidos SEC ID NO: 13, y SEC ID NO: 17. El polinucleótido SEC ID NO: 15 no se puede clasificar formalmente en ningún grupo porque le falta al menos un fragmento de la parte 3’ terminal. Sin embargo, los últimos 198 nucleótidos de SEC ID NO: 15, poseen una identidad comprendida entre el 98% y el 99% con las regiones correspondientes a todas las secuencias del grupo 1, por lo que se considera que SEC ID NO: 15 pertenece al grupo 1.
Procedimiento para la preparación del polinucleótido de la invención y polinucléotidos adicionales de SEC ID: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 y 25
A partir de los alineamientos múltiples de la parte 5’ de los polinucleótidos SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, y SEC ID NO: 25, que se muestran en la Figura 3, se deriva un oligonucleótido que hibrida con los primeros 27 nucleótidos a partir del codón de inicio de los polipéptidos.
Dicho oligonucleótido, que también se puede denominar cebador, tiene la siguiente secuencia:
-pADH-F: 5’-ATGAATAAAATATTTAGAGTTATTTGG-3’ (SEC ID NO: 27)
Los oligonucleótidos que se mencionan en esta descripción se han obtenido de la empresa Eurogentec, que los prepara a escala comercial a partir de la secuencia que se le entrega.
De la misma manera, a partir del alineamiento múltiple de la extremidad 3’ de los polinucleótidos (Figura 2), se derivan tres oligonucleótidos, que hibridan con los últimos 24 o 25 nucleótidos de los genes de los polipéptidos acabando en el codón del último aminoácido.
Las secuencias de estos oligonucleótidos (Eurogentec) son:
pADH-R1: 5’-CCACACAAAACCTACCCCTCCTCC-3’ (SEC ID NO: 28) pADH-R2: 5’-CCACTGATAACCTACCCCCACAGAG-3’ (SEC ID NO: 29) pADH-R3: 5’CCACTGTAATGCAATACCTGCACC-3’ (SEC ID NO: 30)
El oligonucleótido pADH-R1 hibrida con los polinucleótidos del grupo 1 (SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23 y SEC ID NO: 25). Asimismo el oligonucleótido pADH-R2 hibrida con los polinucleótidos del grupo 2 (SEC ID NO: 5 y SEC ID NO: 11) y el oligonucleótido pADH-R3 hibrida con los polinucleótidos del grupo 3 (SEC ID NO: 13 y SEC ID NO: 17).
Los oligonucleótidos aquí descritos se pueden emplear como cebadores para amplificar los polinucleótidos de la invención en una cepa de H. parasuis (Nagasaki) utilizando, por ejemplo, el sistema AccuPrime™ Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen).
El resultado de la amplificación se analiza por electroforesis en un gel de agarosa al 0.8% teñido por SybrGold (Molecular Probes).
En el carril a de la Figura 5 se muestran los productos de amplificación correspondientes a la cepa H. parasuis (Nagasaki).
En el carril M de la Figura 5 se presenta una escalera de 1 kb (New England Biolabs), que se ha empleado como marcador de peso molecular.
Se pueden distinguir los productos de amplificación correspondientes a las secuencias SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 19 SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23 y SEC ID NO: 25 del grupo 1 (Figura 5A, columna a); SEC ID NO: 5 y SEC ID NO: 11 del grupo 2 (Figura 5B, columna a); SEC ID NO: 13 y SEC ID NO: 17 del grupo 3 (Figura 5C, columna a) indicados por el signo < y su número correspondiente.
El polinucleótido SEC ID NO: 15 se encuentra en la zona de los polinucleótidos definidos por las secuencias SEC ID NO: 3 y SEC ID NO:23.
Se puede comprobar que existe una buena correlación entre el tamaño expresado en pares de bases (pb) de las secuencias SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23 y SEC ID NO: 25, y los pesos moleculares aparentes de los productos de amplificación indicados en el gel.
Cada una de las bandas de polinucleótido se extrae y se puede amplificar posteriormente siguiendo técnicas convencionales como las mencionadas anteriormente en esta descripción, de modo que se obtienen productos de amplificación para el polinucleótido de la invención y polinucléotidos adicionales de SEC ID: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 y 25.
En el caso de los polinucleótidos que tienen pesos moleculares semejantes, y aparecen confundidos en el gel de la electroforesis, se separan posteriormente mediante una electroforesis realizada en unas condiciones que permita su separación, como es bien conocido por el experto, por ejemplo, aumentando la longitud del gel y/o el tiempo de desarrollo de la electroforesis, o clonando en vectores plasmídicos.
Procedimiento para determinar si una cepa de H. parasuis es virulenta o avirulenta
Como ya se ha mencionado anteriormente, una de las características primordiales de H. parasuis es su variabilidad antigénica, y cuando se realizan infecciones experimentales en animales, el grado de virulencia es variable según la cepa. Por tanto, es deseable disponer de un procedimiento para identificar las cepas de H. parasuis que permita su clasificación entre virulentas y avirulentas.
En un aspecto de la invención, ésta tiene por objeto el uso de los polinucleótidos de la invención para determinar si una cepa de H. parasuis es virulenta o avirulenta.
Se ha encontrado que las cepas virulentas presentan productos de amplificación genómica correspondientes a uno o a varios polinucleótidos (entre ellos el polinucleótido de la invención), mientras que las cepas avirulentas no los presentan.
El procedimiento para determinar si una cepa de H. parasuis es virulenta o avirulenta sigue substancialmente el protocolo experimental de amplificación genómica de los polinucleótidos descrito en el apartado anterior (Procedimiento para la preparación del polinucleótido de la invención y polinucléotidos adicionales de SEC ID: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 y 25).
En este caso se ensaya el ADN de una cepa cuyo genotipo de virulencia se desea determinar, y además se puede ensayar el ADN de la cepa H. parasuis (Nagasaki), que sirve de control.
En dicho procedimiento se emplea el cebador pADH-F, conjuntamente con uno de los cebadores pADH-R1, pADH-R2, y pADH-R3, ya mencionados anteriormente, para amplificar de forma selectiva los polinucleótidos del grupo 1, 2 y 3, respectivamente.
La amplificación se puede llevar a cabo empleando, por ejemplo, el sistema AccuPrime™ Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen).
El resultado se analiza por electroforesis en un gel de agarosa al 0.8% teñido por SybrGold (Molecular Probes).
En la Figura 5 se muestran los productos de amplificación correspondientes a la cepa H. parasuis (Nagasaki), carril a, y a varias cepas ensayadas, que como se verá en los Ejemplos, corresponden a distintos serotipos:
-
Los carriles b – e se presentan los productos de amplificación correspondientes a cepas aisladas de la cavidad nasal de cerdos que no presentaban ningún síntoma o lesión característica de la enfermedad de Glässer y/o procedentes de granjas sin historial de la enfermedad.
-
Los carriles f – k se presentan los productos de amplificación correspondientes a cepas aisladas de distintos órganos de cerdos con la enfermedad de Glässer confirmada.
-
Se puede observar que las cepas avirulentas no presentan ningún producto de amplificación correspondiente al polinucleótido de la invención y polinucléotidos adicionales de SEC ID: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 y 25, mientras que los productos de amplificación de las cepas virulentas presentan correspondencias con uno o varios polinucleótidos (entre ellos el polinucleótido de la invención).
Por tanto, se comprueba que el uso del polinucleótido de la invención permite determinar de forma sencilla si una cepa de H. parasuis es virulenta o avirulenta, con independencia de la variabilidad antigénica que presenta dicho microorganismo.
En otro aspecto de la invención, ésta tiene por objeto un kit para determinar si una cepa de H. parasuis es virulenta o avirulenta, caracterizado porque comprende:
a) los productos de amplificación de los polinucleótidos con la SEC ID NO: 1,
b) el oligonucleótido pADH-F (SEC ID NO: 27),
b) los oligonucleótidos pADH-R1 (SEC ID NO: 28), pADH-R2 (SEC ID NO: 29), y pADH-R3 (SEC ID NO:
30), y
c) los reactivos necesarios para llevar a cabo la reacción de amplificación mediante la técnica de PCR.
Los productos de amplificación del polinucleótido de la invención son empleados como patrones al lado de la escalera de patrones de peso molecular, por ejemplo, la escalera de 1 kb (New England Biolabs).
Los oligonucleótidos que se incluyen en el kit, se emplean para amplificar los polinucleótidos homológos de la invención eventualmente presentes en las cepas de ensayo mediante la técnica de PCR bien conocida por el experto en la materia, y determinar si la cepa es virulenta o avirulenta, siguiendo el método ya descrito en este mismo apartado.
En una realización preferida, el kit puede comprender la cepa H. parasuis (Nagasaki) para que sirva de control, ya que en ella se amplifican todos los nucleótidos de la invención.
Homología
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos en esta invención designa el porcentaje de residuos de aminoácidos idénticos entre las dos secuencias que se comparan, que se obtiene después de conseguir la mejor alineación, y siendo el porcentaje puramente estadístico, y las diferencias entre las dos secuencias pueden estar distribuidas aleatoriamente y a lo largo de toda la secuencia. La mejor alineación se refiere a la alineación para la cual el porcentaje de identidad es el mayor.
La comparación entre dos secuencias de aminoácidos se puede hacer por ejemplo empleando el programa informático blastP que se encuentra disponible en la página web (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) del National Center for Biotechnology Information .
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se calcula comparando en primer lugar las dos secuencias colocadas según la mejor alineación, y determinando el número de posiciones idénticas para las cuales el residuo del aminoácido es idéntico entre las dos secuencias.
El porcentaje de identidad entre las dos secuencias comparadas se calcula dividiendo este número de posiciones idénticas por el número total de posiciones comparadas, y multiplicando el resultado por 100.
Un polipéptido que tiene un cierto porcentaje de identidad con otro, habitualmente se designa como polipéptido homólogo.
El porcentaje de identidad entre secuencias de nucleótidos se puede calcular del mismo modo como con las secuencias de aminoácidos.
El grado de identidad entre polinucleótidos homólogos se puede determinar experimentalmente por ejemplo mediante la secuenciación de polinucleótidos que se encuentran en los carriles correspondientes a las cepas virulentas de la Figura 5.
En la electroforesis de la Figura 5 se puede observar que además del polinucleótido de la invención y otros polinucleótidos adicionales de SEC ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 y 25, al amplificar el ADN de las cepas virulentas con los cebadores pADH-F, y pADH-R1, pADH-R2, o pADH-R3, se amplifican además otros polinucleótidos, cuyos pesos moleculares no se corresponden con los pesos moleculares del polinucleótido de la invención y otros polinucleótidos adicionales de SEC ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 y 25.
Estos polinucleótidos que también se amplifican con los cebadores diseñados para amplificar el polinucleótido de la invención y otros polinucleótidos adicionales de SEC ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 y 25 son considerados polinucleótidos homólogos.
Se han extraído polinucleótidos homólogos del gel de electroforesis correspondientes a las cepas de los carriles g, j, i y k pertenecientes a los grupos 1 y 2, y polinucleótidos correspondientes a las cepas de los carriles f y h pertenecientes al grupo 2, y sus extremos se han secuenciado directamente con los cebadores p-ADH-F y pADH-R1
o p-ADH-R2, según pertenezcan al grupo 1 o al grupo 2.
Una vez seleccionadas las zonas de más alta calidad, las secuencias obtenidas se han comparado con el polinucleótido de la invención y otros polinucleótidos adicionales de SEC ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 y 25 utilizando el programa blastX, ya mencionado anteriormente. De la misma forma se comparan las secuencias de los polipéptidos homólogos, que se han obtenido mediante la traducción in silico de las secuencias de los polinucleótidos.
En la parte 3’ terminal correspondiente a las secuencias realizadas con el cebador pADH-R1 o p-ADH-R2 se han obtenido homologías comprendidas entre el 95% y el 98%, y la pertenencia de los homólogos con los diferentes grupos es respetada.
Las secuencias obtenidas en la parte 5’ terminal tienen homologías que varían entre el 59% y el 94%.
En la Figura 6 se muestra el resultado de la comparación de la secuencia de aminoácidos correspondiente al polipéptido denominado HP2269-2-j-1. Dicho polipéptido es codificado por el producto de PCR perteneciente al polinucleótido de más bajo peso molecular del grupo 2 de la cepa HP2269 que está en el carril j (banda señalada por una flecha en la Figura 5). La secuencia de polinucleótidos obtenida con el cebador pADH-F (SEC ID NO: 27) se traduce in silico , y la secuencia del polipéptido resultante se compara con las secuencias de los polipéptidos de SEC ID NO: 2 (objeto de la invención), 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y 26 mediante el programa blastX.
En la Figura 6A se presenta la alineación obtenida con el polipéptido SEC ID NO: 16 perteneciente al grupo 1, y en la Figura 6B la alineación obtenida con el polipéptido SEC ID NO: 12, perteneciente al grupo 2. En ambos casos la secuencia de aminoácidos del polipéptido HP2269-2-j-1 presenta un 59% de identidad, y es la mejor homología con el polipéptido de SEC ID NO: 2 (objeto de la invención), 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y 26 que se ha podido encontrar.
Por tanto, también forma parte de la invención un polinucleótido de H. parasuis que expresa un polipéptido que presenta una identidad de al menos un 70%, 80% ó 90% con un polipéptido definido por SEC ID NO: 2.
La identidad con las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos es al menos del 95%, siendo especialmente preferido.
El porcentaje de identidad entre secuencias de nucleótidos también se puede determinar mediante estudios de hibridación.
Preferiblemente el polinucleótido de la invención tiene una secuencia capaz de hibridarse en condiciones de alta astringencia a la secuencia SEC ID NO: 1.
La hibridación en condiciones de alta astringencia significa que las condiciones de temperatura y fuerza iónica se seleccionan de modo que permiten que la hibridación se mantenga entre dos fragmentos de ADN complementarios. Estas condiciones son bien conocidas por el experto, y se encuentran descritas por ejemplo en el libro Sambrook, J., y Russell, R.W., Molecular cloning, a laboratory manual. Third Edition. CSHL press, Cold Spring Harbor, New York, 2001. Por ejemplo, unas condiciones de alta astringencia incluyen, pero no están limitadas, a lavados con 0,1XSSC a 65º C, con lo que se consigue que solamente se hibriden polinucleótidos con al menos un 95% de identidad.
Polipéptidos
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de H. parasuis que presenta una identidad de al menos el 70%, 80% ó 90% con un polipéptido definido por SEC ID NO: 2.
El porcentaje de identidad entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido se determina de la misma forma como ya se ha explicado anteriormente.
Preferiblemente los polipéptidos homólogos presentan al menos un 95%, siendo especialmente preferido, de identidad con las secuencias de aminoácidos del polipéptido de la invención.
Preferiblemente, el polipéptido tiene la secuencia SEC ID NO: 2.
Como ya se ha dicho anteriormente, el polipéptido definido por la secuencia SEC ID NO: 2 es la traducción in silico del polinucleótido definido por la secuencia SEC ID NO: 1.
Las características estructurales comunes de este polipéptido lo hace candidato a ser considerado con una elevada probabilidad como proteína del tipo adhesina, invasina, hemaglutinina o autotransportador.
Como se muestra en la alineación múltiple de las extremos 3’ de los polipéptidos de H. parasuis de la Figura 4, éstos pueden agruparse en tres grupos denominados grupo 1, grupo 2, y grupo 3.
El grupo 1 comprende los polipéptidos SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 24 y SEC ID NO: 26. El grupo 2 comprende los polipéptidos SEC ID NO: 6, y SEC ID NO: 12. El grupo 3 comprende los polipéptidos SEC ID NO: 14, y SEC ID NO: 18. El polipéptido definido por la secuencia SEC ID NO: 16 no puede clasificarse formalmente en ninguno de los grupos, pero al igual que el polinucleótido del que deriva, definido por la secuencia SEC ID NO: 15, se considera que forma parte del grupo 1.
Procedimiento para la preparación del polipéptido de la invención
En otro aspecto de la invención, ésta se refiere a un procedimiento para la preparación del polipéptido de la invención mediante tecnología recombinante, que comprende las siguientes etapas:
a) cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que
expresa un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 70%, 80% ó 90% con un polipéptido definido
por la secuencia SEC ID NO: 2,
b) expresar dicho polinucleótido para producir dicho polipéptido.
Preferiblemente en la etapa a) el polinucleótido tiene una secuencia capaz de hibridarse, en condiciones de alta astringencia, a la secuencia SEC ID NO: 1.
Más preferiblemente en la etapa a) el polinucleótido tiene la secuencia SEC ID NO: 1.
Para llevar a cabo dicho procedimiento se seleccionan células huésped transformadas con vectores de expresión que permiten la expresión del polinucleótido de H. parasuis de la invención en polipéptido.
Entre las células huésped que se pueden emplear para expresar los polinucleótidos se encuentran, por ejemplo, cualquier cepa de E. coli, levaduras, y células eucariotas superiores. Preferiblemente se emplean las cepas de E. coli que presentan un alto rendimiento de expresión como por ejemplo la cepa E. coli BL21 (ED3) (Novagen).
En otro aspecto de la invención, ésta tiene por objeto una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende al menos un polinucleótido que expresa un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 70%, 80% ó 90% con un polipéptido definido por la secuencia SEC ID NO: 2.
Preferiblemente el polinucleótido tiene una secuencia capaz de hibridarse, en condiciones de alta astringencia, a la secuencia SEC ID NO: 1.
Más preferiblemente el polinucleótido tiene la secuencia SEC ID NO: 1.
En otro aspecto adicional de la invención, ésta tiene por objeto un vector de expresión que comprende un polinucleótido que expresa un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 70%, 80% ó 90% con un polipéptido definido por la secuencia SEC ID NO: 2.
Preferiblemente el polinucleótido tiene una secuencia capaz de hibridarse en condiciones de alta astringencia a la secuencia SEC ID NO: 1.
Más preferiblemente el polinucleótido tiene la secuencia SEC ID NO: 1.
El vector de expresión es una entidad que se utiliza para introducir un polinucleótido en una célula. Normalmente se emplean plásmidos y fagos.
En el estado de la técnica son bien conocidos numerosos tipos de vectores de expresión apropiados. Entre ellos se pueden mencionar, por ejemplo, los vectores de la serie pET (Novagen) o los de la serie pQE (Qiagen).
Cuando se emplean los vectores de la serie pET (Novagen), éstos permiten clonar de manera direccional los genes que estarán en 5’ bajo el control del promotor T7lac y una secuencia de fijación de ribosomas. En la parte 3’ del sitio múltiple de clonación de los vectores pET-24a(+) y pET-24d(+) se encuentran secuencias codificantes para 6 histidinas para facilitar la purificación del polipéptido recombinante.
Los enzimas de restricción Nde I y Nco I presentes en pET-24a(+) y pET-24d(+) respectivamente generan cortes en la parte 5’ del sitio múltiple de clonación adecuados para la inserción de genes que empiezan con el triplete ATG de inicio de la traducción.
Habitualmente se clona el gen en su parte 3’ lo más cerca posible de la cola de histidinas, para ello existe el sitio de restricción Xho I.
Generalmente los insertos no tienen secuencias reconocidas por los enzimas de restricción Nde I, Nco I y Xho I. En el caso de que esto suceda, se diseñan cebadores capaces de amplificar los extremos 5’ y 3’ de los polipéptidos, pero que incluyan los sitios de restricción adecuados en las extremidades de estos cebadores.
Otros enzimas de restricción pueden generar extremidades cohesivas compatibles con aquellas realizadas por Nde I, Nco I o Xho I. Esta propiedad es particularmente interesante cuando los genes que se tienen que clonar poseen sitios de restricción Nde I, Nco I o Xho I, pero no los de otros enzimas con extremidades compatibles. En ese caso, se diseñan cebadores con los sitios de restricción correspondientes a los enzimas compatibles con Nde I, Nco I o Xho I.
Las secuencias de los cebadores que se pueden emplear son las siguientes:
-pADH-F-BspHI: 5’ GACTGATCATGAATAAAATATTTAGAGTTATTTGG 3’ (SEC ID NO: 31) -pADH-F-NdeI: 5’ GACTGACATATGAATAAAATATTTAGAGTTATTTGG 3’ (SEC ID NO: 32) -pADH-R1-XhoI: 5’ TTACTCGAGCCACACAAAACCTACCCCTCCTCC 3’(SEC ID NO: 33) -pADH-R2-SalI: 5’ TAGTTAGTCGACCCACTGATAACCTACCCCCACAGAG 3’ (SEC ID NO: 34) -pADH-R3-XhoI: 5’ TTACTCGAGCCACTGTAATGCAATACCTGCACC 3’ (SEC ID NO: 35)
Las secuencias de reconocimiento de los enzimas de restricción están subrayadas mientras que las secuencias codificantes para los polipéptidos están en negrita. Los nucleótidos adicionales en la parte 5’ de los cebadores son aleatorios, pero son necesarios para el buen funcionamiento de los enzimas de restricción.
Las técnicas de tecnología recombinante que se emplean en el procedimiento para preparar el polipéptido de la invención y el polipéptido adicional de SEC ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y 26 son bien conocidas por el experto en la materia, y se encuentran descritas, por ejemplo, en el libro de Sambrook et al., op.cit.
Informaciones complementarias para llevar a cabo dicho procedimiento también son facilitadas por las empresas que comercializan los vectores de expresión, y se pueden encontrar, por ejemplo, en la página web: www.emdbiosciences.com.
A modo de ejemplo entre ellas se pueden mencionar:
1.
Preparación de los vectores (plásmidos pET-24a(+) (Novagen), y pET-24d(+) (Novagen)).
2.
Preparación de los insertos de ADN a partir de los polinucleótidos amplificados por PCR.
3.
Ligación de los insertos en los plásmidos preparados pET-24(+) y pET-24d(+) con la ligasa T4 (Quick Ligation Kit, New England Biolabs)
4. Transformación de los productos de ligación en E. coli Novablue (Novagen).
5.
Caracterización de los plásmidos recombinantes por secuenciación, empleando los cebadores T7 promotor: 5’TAATACGACTCACTATAGG3’ y T7 terminator: 5’GCTAGTTATTGCTCAGCGG3’ que se encuentran a las extremidades del sitio de clonación.
6.
Transformación de los plásmidos recombinantes en E. coli BL21 (ED3) (Novagen).
7.
Producción y recuperación de los polipéptidos recombinantes de H. parasuis en E. coli BL21 (ED3).
8. Purificación de los polipéptidos recombinantes a partir de corpúsculos de inclusión con el kit His Bind Resin Ni-charged (Novagen).
Los polipéptidos de la invención se obtienen habitualmente con un grado de pureza muy elevado.
En otro aspecto la invención se refiere al uso de los polipéptidos de la invención para la preparación de vacunas y/o composiciones inmunogénicas para el tratamiento profiláctico o terapéutico de la infección causada por H. parasuis en un animal.
Vacunas
La vacuna contra las infecciones causadas por H. parasuis, objeto de la invención, comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 70%, 805 ó 90% con un polipéptido que tiene la secuencia SEC ID NO: 2 y un agente auxiliar.
La identidad con las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos es al menos un 90%, siendo especialmente preferido.
De forma más preferida, la vacuna comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un polipéptido que tiene la secuencia SEC ID NO: 2.
La vacuna puede comprender el polipéptido de la invención y polipéptidos adicionales de SEC ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y 26 con el fin de aumentar la respuesta inmunológica.
En esta descripción, se entiende por vacuna o composición inmunogénica un antígeno o compuesto que induce una respuesta inmunológica en un animal.
Como cantidad inmunológicamente efectiva se entiende aquella cantidad de antígeno que es capaz de inducir o contribuir a la generación de una respuesta inmunológica protectiva (total o parcialmente) frente a una infección con
H. parasuis.
Una respuesta inmunológica protectiva se puede manifestar como cualquier reducción en la tasa de infección por el patógeno y/o cualquier reducción en los síntomas o la severidad de la infección provocada por el microorganismo patógeno.
La vacuna se puede administrar de forma profiláctica a un animal que no haya estado expuesto al antígeno, de manera que se prevenga una infección subsiguiente por H. parasuis. Alternativamente, la vacuna se puede administrar de forma terapéutica a un animal que haya estado expuesto o infectado previamente por H. parasuis. Aunque no se pueda evitar la infección, la respuesta inmunológica generada por el organismo del animal permite que el sistema inmunológico del mismo actúe más eficazmente contra la infección, y, por ejemplo, los síntomas asociados con la infección se presenten de forma más leve.
Las vacunas que contienen polipéptidos son generalmente bien conocidas en el estado de la técnica, por ejemplo se describen en las patentes EP-B-0074248, y EP-B-0155146.
También se pueden desarrollar vacunas que contienen una cantidad inmunológicamente efectiva de los polinucleótidos de H. parasuis de la invención.
La vacuna de la invención puede ser también una vacuna combinada con el fin de proteger a los animales frente a la infección por H. parasuis y por uno o más patógenos. El segundo componente de la vacuna combinada se selecciona con base en su capacidad de generar una respuesta protectiva frente a un patógeno y/o su capacidad de mejorar los síntomas o condición patológica del animal.
Estas composiciones inmunogénicas pueden contener, pero no están limitadas, a aquellas que además de proteger frente a la infección por H. parasuis también proporcionan protección frente a Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis, Pasteurella multocida, Salmonella cholerasuis, Streptococcus suis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Leptospira sp., Staphylococcus hyicus, Bordetella bronchiseptica, Mycoplasma hyopneumoniae, Lawsonia intracellularis, Escherichia coli, PRRS, gripe porcina, parvovirus porcino, coronavirus y circovirus.
Opcionalmente, el antígeno que forma parte del segundo componente de la vacuna puede estar unido covalentemente al primer componente formando una molécula quimérica. El antígeno del segundo componente puede también estar unido a un hapteno.
Las moléculas quiméricas que contienen el primer y el segundo componente de la vacuna combinada pueden ser sintetizadas utilizando diferentes técnicas bien descritas. Por ejemplo, pueden ser producidos sintéticamente utilizando sintetizadores peptídicos comerciales y procesos químicos estándar (Merrifield, Science, 232:341-347 (1985)). Alternativamente, los antígenos pueden ser sintetizados separadamente y después ser unidos covalentemente mediante una reticulación química.
La vacuna puede ser administrada por la vía apropiada como es por ejemplo la vía oral, intranasal, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, rectal, vaginal, o por una combinación de cualquiera de las rutas mencionada anteriormente.
La forma farmacéutica de las vacunas objeto de la invención depende de la forma de administración, y puede ser por ejemplo en forma de inyectables (soluciones, suspensiones, o emulsiones), pastillas, supositorios, cápsulas, formulaciones de liberación prolongada, o polvos.
La cantidad de antígeno/s que se incluye en la vacuna depende de diferentes factores como son la edad, el peso, la salud y las características físicas generales del animal que va a ser vacunado, así como de la vacuna en particular que va a ser administrada. La determinación de la dosis óptima de vacunación para cada uno de los componentes, puede ser evaluada mediante técnicas rutinarias como es el análisis de seroconversión.
Habitualmente dichas vacunas contienen entre un 10-95% en peso de los polipéptidos objeto de la invención, y generalmente comprenden sustancias auxiliares que se seleccionan en función de la forma farmacéutica y del modo de administración.
Los agentes auxiliares que acompañan a los polipéptidos en las vacunas de la invención se seleccionan entre los excipientes farmacéuticamente aceptables que se describen, por ejemplo, en el libro de R.C.Rowe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, Pharmaceutical Press, 4th Edition, Londres, 2003 (ISBN: 0-85369-472-9).
En el caso de formulaciones líquidas, los agentes auxiliares pueden ser entre otros: agentes humectantes, agentes emulsionantes, soluciones tampón para control de pH, agua, solución salina, glicerina, etanol, agentes conservantes, y/o vehículos oleosos.
En el caso de vacunas en forma sólida, las formulaciones pueden incluir entre otros: agentes aglutinantes, agentes lubricantes, agentes edulcorantes, cargas, y/o agentes disgregantes.
Las vacunas objeto de la invención también pueden incluir agentes adyuvantes con el fin de incrementar la inmunogeneicidad de las mismas, y con ello su eficacia.
Como agentes adyuvantes se pueden emplear por ejemplo fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, hidróxido de
5 aluminio, extracto de Quillaja saponaria (QS21), saponina purificada (Quil A), complejos inmunoestimulantes (ISCOMs), fosfato cálcico, hidróxido cálcico, hidróxido de zinc, CARBOPOL, muramil dipéptido y/o cualquier combinación entre ellos.
Además, la vacuna puede contener cualquier agente inmunomodulador como por ejemplo citoquinas.
10 La vacuna también puede ser formulada con sistemas de liberación controlada del antígeno, por ejemplo, aquellas en las que se combina el antígeno con polímeros biocompatibles como el ácido poliláctico, ácido poli(lácticoglicólico), metilcelulosa, ácido hialurónico o colágeno. Alternativamente, el antígeno puede ser microencapsulado con el fin de mejorar su administración y/o aumentar su eficacia.
15 En algunos casos puede ser conveniente almacenar la vacuna en forma liofilizada que se reconstituye con un diluyente estéril antes de su administración.
Las vacunas de la invención presentan una alta eficacia en cerdos tanto cuando la vacunación se realiza de forma 20 profiláctica, como en el caso de una vacunación terapéutica cuando el animal ya manifiesta los síntomas de la infección por H. parasuis.
Los ejemplos que siguen a continuación se exponen a efectos de proporcionar al experto en la materia una explicación suficientemente clara y completa de la presente invención, pero no deben ser considerados como 25 limitaciones a los aspectos esenciales del objeto de la misma, tal y como han sido expuestos en los apartados anteriores de esta descripción.
Ejemplos
30 Ejemplo 1.-Preparación del polinucleótido de H. parasuis de la invención y polinucleótidos adicionales de SEC ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 y 25
En primer lugar se aísla y purifica el ADN de H. parasuis (Nagasaki) empleando los métodos convencionales descritos en Sambrook y Russell, (Molecular cloning, a laboratory manual. Third Edition. CSHL press, Cold Spring 35 Harbor, New York, 2001) o con kits de purificación de ADN genómico como los propuestos por Qiagen o Macherey-Nagel.
Para la preparación de los polinucleótidos de la invención se emplea la tecnología PCR de amplificación genómica del sistema AccuPrime™ Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen), siguiendo las indicaciones sugeridas por el 40 fabricante.
Se preparan tres tubos de reacción de 200 µl adaptables a termocicladores (Axygen), que contienen una dilución del ADN de H. parasuis (Nagasaki) en H2O MilliQ, y los oligonucleótidos que se emplean para llevar a cabo la amplificación, y se mantienen siempre todos los reactivos en hielo
45 Cada uno de los tres tubos de reacción incluye el oligonucleótido pADH-F (SEC ID NO: 27) (Eurogentec), y además, cada tubo contiene un oligonucleótido específico para amplificar los grupos 1, 2 y 3 de polinucleótidos.
Para amplificar el grupo 1 de polinucleótidos se emplea el oligonucleótido pADH-R1 (SEC ID NO: 28) (Eurogentec), 50 para el grupo 2 el oligonucleótido pADH-R2 (SEC ID NO: 29) (Eurogentec), y para el grupo 3 el oligonucleótido pADH-R3 (SEC ID NO: 30) (Eurogentec).
Los volúmenes que se introducen en cada tubo de reacción son los siguientes: La reacción de amplificación se lleva a cabo en un termociclador Applied Biosystems (Axygen) programado con los parámetros siguientes:
Componente
Volumen
10x AccuPrime PCR buffer II
5 µl
Oligonucleótido pADH-F 10 pmol/µl
4 µl
Oligonucleótido pADH-R1 o pADH-R2 o pADH-R3 10 pmol/µl
2 µl
ADN H. parasuis (Nagasaki) 50 ng/µl
3 µl
AccuPrime™ Taq DNA Polymerase High Fidelity (5 U/ll)
0.2 µl
H2O MilliQ
35.8 µl
-
1 ciclo de 2 min a 94º C, seguido de -30 ciclos de 30 sec a 94º C, 30 sec a 60º C y 15 min a 68º C, y -1 ciclo final de 15 min a 68º C.
Posteriormente, a los productos de amplificación de los polinucleótidos del grupo 1 se les añadió 0,05
ll de
AccuPrime™ Taq DNA Polymerase High Fidelity y se incubaron durante 1 h 30 min a 68º C.
Los productos de amplificación de los polinucleótidos de los grupos 2 y 3 se incubaron durante 3 h a 37º C.
Estos tratamientos permitieron eliminar bandas accesorias correspondientes a productos de amplificación incompletos aprovechando el hecho que esta polimerasa tiene una actividad de exonucleasa.
El resultado se analiza por electroforesis en un gel de agarosa al 0.8% teñido por SybrGold (Molecular Probes), migrando 10 µl del producto de la reacción de amplificación.
Los resultados de la electroforesis se muestran en la Figura 5. En el carril M se presenta una escalera de 1 kb (New England Biolabs), que se emplea como marcador de peso molecular.
En el carril a se encuentran los polinucleótidos de SEC ID NO: 1 (objeto de la invención), 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 y 25 que se han amplificado empleando la cepa H. parasuis (Nagasaki).
En el carril a de la Figura 5A se pueden distinguir los productos de amplificación correspondientes a los polinucleótidos del grupo 1 definidos por las secuencias SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 19 SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, y SEC ID NO: 25.
En el carril a de la Figura 5B se pueden distinguir los productos de amplificación correspondientes a los polinucleótidos del grupo 2 definidos por las secuencias: SEC ID NO: 5 y SEC ID NO: 11.
En el carril a de la Figura 5C se pueden distinguir los productos de amplificación correspondientes a los polinucleótidos del grupo 3 definidos por las secuencias: SEC ID NO: 13 y SEC ID NO: 17.
El polinucleótido SEC ID NO: 15 se encuentra en la zona de los polinucleótidos definidos por las secuencias SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 23.
Se puede comprobar que existe una buena correlación entre el tamaño expresado en pares de bases (pb) de las secuencias SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, y SEC ID NO: 25, y los pesos moleculares aparentes de los productos de amplificación indicados en el gel.
Cada una de las bandas de polinucleótido se extrae y se puede amplificar posteriormente siguiendo técnicas convencionales como las mencionadas anteriormente en esta descripción, de modo que se obtienen productos de amplificación para cada uno de los polinucleótidos de SEC ID NO: 1 (objeto de la invención), 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 y 25.
En el caso de los polinucleótidos que tienen pesos moleculares semejantes, y aparecen confundidos en el gel de la electroforesis, se separan posteriormente mediante una electroforesis realizada en unas condiciones que permita su separación, como es bien conocido por el experto, por ejemplo, aumentando la longitud del gel y/o el tiempo de desarrollo de la electroforesis, o clonando en vectores plasmídicos.
Ejemplo 2.-Clasificación de cepas de H. parasuis
Para la clasificación de cepas de H. parasuis entre cepas virulentas y avirulentas se emplea el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 para la cepa H. parasuis (Nagasaki) para cada cepa que se desea clasificar.
En la Tabla I se presentan las características de las cepas ensayadas que pertenecen a varios serotipos distintos:
TABLA I
Carril (1)
Cepa Órgano Lesiones Serotipo
a
Nagasaki cerebro septicemia 5
b
*SW114 (4) nasal sin lesiones 3
c
F9 (5) nasal sin síntomas clínicos NT (2)
d
*D74 (4) ND (3) ND (3) 9
e
HP-3123 (6) nasal enteritis E. coli NT
f
HP-1205 (6) pericardio pericarditis y pleuritis 11
g
HP-1302 (6) cerebro poliserositis 1
h
HP-1319 (6) cerebro poliserositis NT
i
HP-2163 (6) articulación neumonía y artritis NT
j
HP-2269 (6) articulación neumonía y artritis NT
k
HP-33 (6) pulmón neumonía 1
(1) Carril de la electroforesis de la Figura 5 en el que se visualizan los polinucleótidos amplificados para cada cepa. (2) NT: cepa no tipificable. (3) ND: no documentado. (4) Las cepas identificadas con el signo * son cepas avirulentas de referencia, cuya no virulencia se ha comprobado experimentalmente mediante infecciones en cerdos. (5) Cepa aislada en la facultad veterinaria de la Universidad Autónoma de Barcelona. (6) Cepas aisladas por los laboratorios HIPRA. La cepa HP-3123 ha sido aislada de un cerdo procedente de una granja sin historial de enfermedad de Glässer.
Las cepas correspondientes a los carriles b – e corresponden a cepas aisladas de la cavidad nasal de cerdos que no 5 presentaban ningún síntoma o lesión característica de la enfermedad de Glässer, y/o procedentes de granjas sin historial de la enfermedad, por lo que se pueden considerar como cepas avirulentas.
Las cepas correspondientes a los carriles f – k corresponden a cepas aisladas de distintos órganos de cerdos con la enfermedad de Glässer confirmada, por tanto son cepas virulentas. 10 El resultado del análisis por PCR del panel de cepas virulentas y avirulentas se muestra en la Figura 5.
Se puede observar que las cepas SW114 (b), F9 (c), D74 (d) y HP3123 (e), procedentes de cerdos que no presentaban ningún síntoma o lesión característica de la enfermedad de Glässer, no muestran amplificación alguna 15 en las zonas correspondientes a los polinucleótidos de la invención.
En cambio, todas las cepas que proceden de órganos de cerdos con la enfermedad de Glässer confirmada presentan al menos una amplificación correspondiente a los polinucleótidos de la invención. Como se puede comprobar en la Figura 5, la mayoría de las cepas virulentas HP1205 (f), HP1302 (g), HP1319 (h), HP2163 (i),
20 HP2269 (j) y HP33 (k), presentan varias amplificaciones correspondientes a los polinucleótidos de SEC ID NO: 1 (objeto de la invención), 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 y 25.
Por tanto, el empleo del polinucleótido de la invención permite la clasificación de las cepas de H. parasuis entre virulentas y avirulentas con independencia de la variabilidad antigénica que presenta dicho microorganismo.
25 Ejemplo 3.-Preparación del polipéptido de H. parasuis de la invención y polipéptidos adiconales de SEC ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y 26.
1.-Preparación de los vectores
El plásmido pET-24a(+) (Novagen) se digiere añadiendo en un tubo estéril de 1,5 ml los componentes siguientes:
pET-24a(+) (1 !g/!l)
5 !l
BSA 10 X
5 !l
Tampón 10 X
5 !l
Nde I (20 U/!l)
1 !l
Xho I (20 U/!l)
2,5 !l
H2O
31,5 !l
El plásmido pET-24d(+) se digiere añadiendo en un tubo estéril de 1,5 ml los componentes siguientes:
pET-24d(+) (1 !g/!l)
5 !l
BSA 10 X
5 !l
Tampón 10 X
5 !l
Xho I (20 U/!l)
2,5 !l
Nco I (10 U/!l)
1 !l
H2O
31,5 !l
Las reacciones se llevan a cabo en un baño a 37º C durante 2 horas. Después, los plásmidos digeridos se purifican por gel de agarosa siguiendo técnicas convencionales, como ya se ha mencionado en esta descripción.
10 De esta forma se obtiene un plásmido lineal que presenta dos extremidades incompatibles.
2.-Preparación de los insertos
15 1 ng de los polinucleótidos de de SEC ID NO: 1 (objeto de la invención), 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 y 25 preparados según el Ejemplo 1 se amplifican individualmente siguiendo el procedimiento experimental descrito en dicho ejemplo, empleando los oligonucleótidos siguientes:
-pADH-F-BsHI: 5’ GACTGATCATGAATAAAATATTTAGAGTTATTTGG 3’ (SEC ID NO: 31),
20 -pADH-F-NdeI: 5’ GACTGACATATGAATAAAATATTTAGAGTTATTTGG 3’ (SEC ID NO: 32), -pADH-R1-XhoI: 5’ TTACTCGAGCCACACAAAACCTACCCCTCCTCC 3’ (SEC ID NO: 33), -pADH-R2-SalI: 5’ TAGTTAGTCGACCCACTGATAACCTACCCCCACAGAG 3’ (SEC ID NO: 34), y -pADH-R3-XhoI: 5’ TTACTCGAGCCACTGTAATGCAATACCTGCACC 3’ (SEC ID NO: 35)
25 Las secuencias de reconocimiento de los enzimas de restricción están subrayadas mientras que las secuencias codificantes para los polipéptidos están en negrita. Los nucleótidos adicionales en la parte 5’ de los cebadores son aleatorios pero necesarios para el buen funcionamiento de los enzimas de restricción.
La amplificación sigue el procedimiento experimental del Ejemplo 1, excepto que sólo se realizan 22 ciclos de 30 amplificación, en lugar de 30.
En la Tabla II se indica la presencia o ausencia de los sitios de restricción Nde I, Nco I, Xho I, BspH I (compatible con Nco I) y Sal I (compatible con Xho I) en los polinucleótidos de la invención, el par de cebadores utilizados para amplificar estos polinucleótidos, y el vector en el cual se clonan.
TABLA II
SEC ID NO:
Nde I Nco I BspHI Xho I Sal I Cebadores Vector
1
- - - - pADH-F-NdeI/ pADH-R1-XhoI pET-24a(+) Nde/Xho
3
- - - - pADH-F-NdeI/ pADH-R1-XhoI pET-24a(+) Nde/Xho
5
+ - - - - pADH-F-BspHI/ pADH-R2-SalI pET-24d(+) Nco/Xho
7
- - - - pADH-F-NdeI/ pADH-R1-XhoI pET-24a(+) Nde/Xho
9
- - - - pADH-F-NdeI/ pADH-R1-XhoI pET-24a(+) Nde/Xho
11
+ - - + - pADH-F-BspHI/ pADH-R2-SalI pET-24d(+) Nco/Xho
13
- - - - pADH-F-NdeI/ pADH-R3-XhoI pET-24a(+) Nde/Xho
15
- - - - pADH-F-NdeI pADH-R1-XhoI pET-24a(+) Nde/Xho
17
- - - - pADH-F-NdeI/ pADH-R3-XhoI pET-24a(+) Nde/Xho
19
- - + - pADH-F-NdeI/ pADH-R1-XhoI pET-24a(+) Nde/Xho
21
- - - - pADH-F-NdeI/ pADH-R1-XhoI pET-24a(+) Nde/Xho
23
- - - - pADH-F-NdeI/ pADH-R1-XhoI pET-24a(+) Nde/Xho
25
- - - - pADH-F-NdeI/ pADH-R1-XhoI pET-24a(+) Nde/Xho
5 Después de la amplificación, se purifican los productos obtenidos con el kit MinElute Reaction Cleanup (Qiagen) siguiendo las indicaciones del fabricante, excepto que la etapa de elución se hace con 40 !l de tampón de elución.
La digestión de las extremidades de los productos de amplificación se realiza en función del grupo al cual pertenecen los polipéptidos.
10 Para los productos de amplificación procedentes de SEC ID NO: 1, 3, 7, 9, 13, 15, 17, 19, 21, 23 y 25 en un tubo de 1,5 ml estéril se añade:
Producto de amplificación
38 !l
Tampón 10 X
5 !l
Xho I (20 U/!l)
1 !l
Nde I (20 U/!l)
1 !l
BSA 10 X
5 !l
15 Para los productos de amplificación procedente de SEC ID NO: 5 y 11, en un tubo de 1,5 ml estéril se añade:
Producto de amplificación
38 !l
Tampón 10 X
5 !l
BspHI (10U//!l)
2 !l
Sal I (20U//!l)
2 !l
BSA 10 X
5 !l
Las reacciones se llevan a cabo a 37º C en un baño durante 2 horas. La purificación de los productos de amplificación doblemente digeridos se realiza en gel de agarosa siguiendo el procedimiento descrito en el kit 5 MinElute Reaction Cleanup de Qiagen.
3.-Ligación de los insertos en pET-24a(+) y pET-24d(+).
Se procede a la ligación con la ligasa T4 (Quick Ligation Kit, New England Biolabs) siguiendo las recomendaciones 10 del fabricante. Previamente se ajustan con H2O milliQ las concentraciones de plásmido e inserto a 50 ng/!l. En tubo estéril de 1,5 ml se añade lo siguiente:
H2O MilliQ
6,5 ll
ADN digerido (50 ng/!l)
1,5 ll
pET-24a(+) o pET-24d(+) (50 ng/!l)
1 ll
tampón 2X
10 ll
ligasa T4 (el fabricante no especifica la concentración del enzima).
1 ll
La incubación se realiza a una temperatura comprendida entre 22º C y 25º C durante 15 min. 15 4.-Transformación de los productos de ligación en E.coli Novablue.
No es necesario purificar los productos de ligación para transformar las bacterias competentes E. coli Novablue (Novagen). Esta cepa de E. coli no permite la expresión de proteínas recombinantes y sirve para expandir el 20 plásmido recombinante antes de transformar las cepas apropiadas.
En un tubo de 1,5 ml estéril previamente enfriado en hielo se añaden 20 !l de células competentes y 1 !l de producto de ligación. Después de una incubación de 5 min en hielo, se introduce el tubo en un baño a 42º C durante 30 s. Seguidamente, se vuelve a incubar en hielo durante 2 min. Después de este choque térmico, se añaden 80 !l
25 de medio SOC (Novagen) y se incuban las bacterias transformadas a 37º C bajo agitación (250 rpm).
La selección y clonación de las bacterias recombinantes se efectúa en placas de LB-agar en presencia de kanamicina (30 !g/!l).
30 5.-Caracterización de los plásmidos recombinantes.
Los clones recombinantes se hacen crecer en placas de 96 pocillos con capacidad de 2 ml/pocillo, y el plásmido se purifica con cualquiera de los siguientes kits:
35 -R.E.A.L Prep 96 BioRobot (Qiagen) y NucleoSpin 96 Flash (Macherey-Nagel) con un autómata (BioRobot 3000, Qiagen), o -NucleoSpin 96 Flash (Macherey-Nagel) si este proceso se realiza manualmente. -Para cada preparación se obtienen unos 500 nanogramos de plásmido superenrollado.
40 Cada inserto se caracteriza por secuenciación con el kit BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems) en placas de 96 pocillos (Applied Biosystems o Axygen) adaptables a termocicladores y secuenciadores del fabricante Applied Biosystems.
Los cebadores utilizados flanquean los sitios de clonación del plásmido y tienen las secuencias siguientes:
45 Promotor T7: 5’TAATACGACTCACTATAGG3’ Terminador T7: 5’GCTAGTTATTGCTCAGCGG3’
6.-Transformación de los plásmidos recombinantes en E. coli BL21 (ED3).
La cepa E. coli BL21 (ED3) (Novagen) es una cepa especialmente diseñada para la expresión de grandes cantidades de proteínas recombinantes bajo el mando del T7.
La transformación con los plásmidos recombinantes pET-24a(+) y pET-24d(+) se efectúa añadiendo 20 !l de bacterias competentes y 1 !l de producto de ligación en un tubo de 1,5 ml estéril previamente enfriado en hielo.
Después de una incubación de 5 min en hielo, se introduce el tubo en un baño a 42º C durante 30 s. Seguidamente, se vuelve a incubar en hielo durante 2 min. Después de este choque térmico, se añaden 80 !l de medio SOC (Novagen) y se incuban las bacterias transformadas a 37º C bajo agitación a 250 rpm.
La selección y clonación de las bacterias recombinantes se efectúa en placas de LB-agar en presencia de kanamicina (30 !g/!l).
7.-Producción de polipéptidos recombinantes de H. parasuis en E. coli BL21 (ED3).
Para la producción de cada polipéptido recombinante, se siembra una colonia en 50 ml de medio LB que tiene 30 !g/!l de kanamicina. El crecimiento de la bacteria se efectúa a 37º C en un agitador orbital con ventilación hasta obtener un valor de 0,6 de densidad óptica a 600 nm.
Se añade IPTG a 1mM en concentración final y se sigue la incubación a 37º C durante 3 h. Seguidamente las bacterias se enfrían en hielo durante 5 min y se procede a una centrifugación de 5000 g durante 5 min a 4º C. Se resuspende el precipitado bacteriano con 12,5 ml de 20 mM Tris-HCl pH 8 frío, y se vuelve a centrifugar en las mismas condiciones.
Los polipéptidos recombinantes se encuentran en forma de corpúsculos de inclusión en el citoplasma de la bacteria, y se recuperan utilizando el método preconizado por Novagen de tratamiento por los productos BugBuster Benzonase y rLysozyme (pET system manual, www.emdbiosciences.com/html/NVG/User-protocols.html) añadiendo inhibidores de proteasas (pefabloc, Roche Diagnostic) .
El método consiste en una solubilización suave de la bacteria, digestión del péptidoglicano y del ADN, seguido de una serie de centrifugaciones destinadas a eliminar las impurezas de los corpúsculos de inclusión.
La presencia y cantidad relativa de polipéptidos recombinantes se aprecia por electroforesis en gel de poliacrilamida (Laemmli, Nature, 227:680-685, (1970)).
Típicamente, cada polipéptido recombinante representa entre 30 a 50% del total de los polipéptidos de E. coli BL21(ED3) transformada y el 90% de los polipéptidos encontrados en los corpúsculos de inclusión.
8.-Purificación de los polipéptidos recombinantes a partir de corpúsculos de inclusión.
Se utiliza el kit His Bind Resin Ni-charged en condiciones desnaturalizantes según el método especificado por el fabricante (Novagen).
En primer lugar, se disuelven los corpúsculos de inclusión en un tampón conteniendo urea 6M. Esta solución se aplica a una columna conteniendo 2,5 ml de resina acoplada con el metal Ni2+.
Las polihistidinas tienen una fuerte afinidad con este ión metálico y los polipéptidos recombinantes se adsorben en la columna. Después de los correspondientes lavados, se procede a la elución de la proteína recombinante con un tampón conteniendo urea 6M e imidazol 1M.
Seguidamente, se procede a la renaturalización de las proteínas por diálisis utilizando el kit Protein Refolding (Novagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Se obtiene cada uno de los polipéptidos de SEC ID NO: 2 (objeto de la invención), 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y 26 con un grado de pureza superior al 99%, que es apropiado para que se puedan formular en composiciones inmunogénicas y/o vacunas contra las infecciones causadas por H. parasuis.
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<212> ADN
<213> Haemophilus parasuis
<400> 1 atgaataaaa tatttagagt tatttggagt catgctcaac aggcttgggt ggttgtgtct 60 gagttagtaa agtctcatac caaaacatcc gcttacacgg ataaaagagc tcaagtatgc 120 acctcagatt attttttaga taaacagcaa gataaattta aattaagtct tttaagtcta 180 gtattactaa gtatattttt tagtccagta gcagtaggtg cacaacttca cacaggaaca 240 gcatttcttc tagatggttc taataaatcg aagctaggaa ctgacgacgg tactattggt 300 attggtaaag atagtaaggc tgggtatggt gctattgcta tcggtcagta ttcaaaagct 360 aaagctaggc ataatgttgc gataggttat aaagcagatt caggagtaca accaaacact 420 attacgatag gctacaatac taaagtaagt gggcaggaag caattgccat cgggaaagag 480 tcaaaagcgg gaaaggaatc tgttgtctta ggcggacaag ccagtgcggc aaatattgaa 540 caagcagttg taataggtca ctctgctact gcaagtgcgt cacaatctat tgctatcggt 600 gcgagaagta agtctaccgc tgattacggt attgcggttg gtggtggtgc aactgctgga 660 aagaacgccg ttgctgttgg tagggactcg aaaggtgctg ggacagattc cattgcgata 720 ggtaattctg cgaaaacaac aggggtagac tctgttgttg tgggtgccaa tatcaatgtg 780 acagatggac aattagtggc aattggacgc gaagcaaaag ctggaagcca ttctactgcc 840 ttgggttata aagcctctgc cggtggtatg cactctgttg ctgtgggtga aagtgccatg 900 acaaatgatg gtgctgctag agcaaccgca cttggtaata ataccgttgt caccgtgggc 960 ggcggtgtgg cattgggtta tgggtctaat gcaagtacag ctggcggtgt agtggggtta 1020 aaacaaaatc attctgtcac aacgggagaa agcactgtcg ataacggctt taaatctaca 1080 gaaagtgttg ataacaatcc taatcctatt cctattggtg cggtttctgt gggtaataac 1140 aacatcaaac gccaaatcgt caatgtggcg gcaggtaaag aattaaccga tgcggtaaac 1200 gtggcgcagc ttcaatcttt gacgatgaaa attagtggtg ataacagcag tagtggcaag 1260 gtaggcattt gggatggtac gctgaaagta gtgggtacaa gcggtcagat taagacttcc 1320 gcaaacggtg ataccatcac attgaaatta gatgaaacat tgaaaaacaa aattgataat 1380 attgacaatt taggttggaa acttgcaatt actaagggat cggggggtga agtaacgact 1440 cctaatactc catatcttat caaaatgagc gatatggcaa ccgtaacctt taccgctgga 1500 aataatatta aattagaaca agcggacgga aatattacga tttctacgat tggtaagtta 1560 attgcaaaga ctgaatggga aaatgatggt ttgaaaatta cttatacgga tggtatgcat 1620 gacattatca agaaaggtga aaaaggagat cgtggcgaaa aaggtccaaa aggcgataga 1680 ggagaaactg gctctgcggg tccagcgggt ccagcaggtg ctcaaggtcc agtaggtcct 1740 gcgggtccag caggtccaac tggaccacaa ggtgcaactg gtcctgcagg tccaaaagga 1800 gaggcaggag cagctggacc taagggtgag aaaggtgatc caggaccaaa aggcgaagct 1860 ggttcaacag gtccaacggg gcctgctggt ccaaaaggcg atccaggaca agcgggtcca 1920 aaaggagata caggtcagaa aggtgaaact ggtcctgcgg gtccagcggg accacaaggt 1980 cctgcgggtc cagcaggggc taagggtgac aaaggtgata cgggtccagc aggaccacga 2040 ggccctgcgg gtccaacggg accacaaggc cctgcgggtc cagcgggacc acaagaccct 2100 gcgggtccaa ctggaaattc ggaattaaaa ggcattacct cgattgccaa tggtaacgac 2160 gccaccaagg cgaatggggc taagattacc ttgtctgcag gttctacaga taaaacagtt 2220 aatgttaatg atgcgaaaat taccaatgtg gcggctggta cagcagatac tgatgcggta 2280 aatgtgagcc agttaaatac taaggcagca gcttcaaaaa cagaggttga agcgggtaaa 2340 aatgtgaaag tgacttcaaa aacgggtgca aatggtcaga atatttacaa tgtgagcgtg 2400 tctggagatt taagcgacat tacttcaatt agtaatggcg atacgaaagt atctttaggt 2460 aaagataagc aaggaaatcc agttgtaaat atgaatggcg ccagaattac caacgttgga 2520 gatggtagtg ctgagggcga tattgtgaat gttcgtcagc tcaacaaagt ggtttcttct 2580 gtgaatacag gatttaatca attatcaaga gatattggtc gtgttgatgt taatgcaaga 2640 gcgggtattg cttctgctgg ggcgatggct aatttgccac aaatttcttt accaggtaaa 2700 agtgctattt ctgtttctaa tgcacaatat cgcgggcaat ctgcctatgc tataggttat 2760 tccagaattt ctgataatgg caaatggctt attcgagcgt ctgttagcag taatactcag 2820 cgggatacca tgattggagg aggggtaggt tttgtgtgg 2859
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atgaataaaa tatttagagt tatttggagt catgctcaac aggcttgggt ggttgtatct
gagttagtaa agtcttatac caaaacatcc gcttacacgg ataaaagagc tcaagtatgc 120 acctcagatt attttttaga taaacagcaa gataaattta aattaagtct tttaagtcta 180 gtattactgg gtatattttt tagtccagta gcaggttcaa ttactgattc atcatatttt 240 caacatggtg ctacttacgg gactaaacat aaatctgacg ccggtactat tggtattggt 300 agacagagta cggctgggcc tggttctatt gccatcggtc agcatacaaa agctgatggt 360 aggactgttg ttgcgatagg ttattcagca gtaacgacag atataggctc ccctgttgcg 420 ataggcggcc acactagcgc aaatggggag agcgcaattg ccatagggct taagtcaagt 480 tcgggaggaa aggaatctat tgtcttaggc aacaacgcca atacgacaac tggtcaaaca 540 gttgtaatag gtgcacatgc tagtgcaaaa gggcaacaat ctgttgctat cggggcagat 600 accaaagcgg atgggtatgg ctccatatca atcggtggag atgatttaaa aacaacgaaa 660 tatcacaagg gtagccattc cagcacaact gcgaaaggta aggcctctgt tgctattggg 720 ggtatgtctt tggctggggg cgaaggatct attgttttag gtcctgtagc atctgcaagt 780 catgttgaag gcattgctat cggtgcgaga agtaagtcta ccgctgatta cggtattgcg 840 gttggtggtg gtgcaactgc tggaaagaac gccgttgctg ttggtaggga gtcgaaaggt 900 actgggacaa attccattgc gataggtaat tctgcgagaa caacaggggc agactctgtt 960 gttgtgggtg ccaatatcaa tgtgacagat ggacaattag tggcaattgg ataccaagca 1020 agtgctaaaa gtcgttctac tgccttgggt tataaagcct ctgccggtgg taggagctct 1080 gttgctgtgg gtgaagaggc aaagacaaca ccagacagag caaccgcact tggtaataat 1140 accgttgtct ccgtgggtgg cggtgtggca ttaggttatg gatctaatgc aaatacagct 1200 ggcggtgtag aggggttaaa acaagctcat tctgtcacaa cggaaccaag cactgacaag 1260 aacggcttta aatccacaga aaaggttgat ggtaataaga ttggtgcggt ttctgtcggt 1320 gtaggctcag gtagtaaact catcaaacgc caaatcacca acgttgctgc aggtaaagaa 1380 ttaaccgatg cagtaaacgt ggcacagctt aaatcgctca ccatgctaat aggaggcgat 1440 aacagcagca gtggcaaggt aggcatttgg gatggcaaac ttgaagttaa aggcacaaat 1500 ggcgaaatca agaccaatgc gtctggctca accatcacaa tatcactaga cgataagatt 1560 aaaaaacaat tagctgatgc caaagcagga agtttgacat tcaaaggcga aaaaacaggt 1620 acaggtacaa taacaaatga tgtttcgggt caaaaatgga atgccaacca agataagacc 1680 gttaccatta caagtaaaga aacataccaa aatggtggtg ttcgatacaa aggcgataac 1740 attgaaattt atcgtaaaaa tcttaacaat ggaaacacag aattccatgt gttgatgaaa 1800 gatacaccaa cattcagcag cgttcaatat ggcaataatg gacctaagat taccagcact 1860 ggcggtaatc taaaagtaac aggtgcaaac ggcacttccc cagttaagat caccaattta 1920 gcacaaggta cacaaaataa cgatgcggtg aactacatgc aattttcaaa tgctggttgg 1980 aaacttgcaa ttgctcaggg aacggggggg caagcaactc cacctacggc acatcttatc 2040 aaaataggcg ataccgcaac ctttaccgct ggaaataata ttaaattaga acaaaataac 2100 ggaaatatta cgatttctac gattggtaag ttaattaaaa agactgaaag cctagcaaat 2160 ggtgatttga aaattactta tacggatgac acccatgata ctattgctaa ggggaaagac 2220 ggtaaaaatg gtgcgaaagg tgatggaggg gaacaaggct cagcagggcc tagaggcgaa 2280 gcaggtccag caggatcaca aggtgcaact ggtcctgtag gtccaaaagg agatgcagga 2340 gtaaaaggcg ataggggtga gcgtggtgaa gcaggagcag tgggccctca agatcctgcg 2400 ggtgcaactg gctctgcggg tccagcaggg gctaggggtg aacagggttc taaaggagat 2460 acaggtccta aaggagatac aggtccaaaa ggcgaagctg gttcaacagg ttcgatgggt 2520 ccagtggatc cgaaaggtga aaaaggagat caagattcga tgggtccagc agaaccacaa 2580 ggacctacgg gtccaacggg accacaagga cctacgggtc caacgggacc acaaggacct 2640 acggggccaa cgggaccaca aggccctgcg agtccaacgg gatcacaagg ccctgcgagt 2700 ccaacgggat cacaaggacc tgcgggtcca acgggtccag caggaccaca aggacctacg 2760 ggtccaacgg ggcctgcggg tccaacggga ccacaaggac ctgcgggtcc agcaggacca 2820 caaggaccgc agggtccagc aggaccacaa ggacctgcgg gtccaacggg gcctgctggt 2880 ccaaaaggag aaaatgtggg aagtggttta ggtttgaaag atgatgctga atcaaataaa 2940 acggcactta cccctacaga tgcacaaaaa gctattgctg gtgataacaa agacggtaaa 3000 ggtggcttat tggctcaaac gggtaatgcg ttaaataatg cagcgacagt aaaagactta 3060 caagccattg cacaagcggg cttagacttg acgggtaaca acgccgatac cactgtacat 3120 cgtccattgg gtacgaagtt aaccgttgag ggtgaaggca aatggaatgg taaggactca 3180 gcggctaata acctttatgt ggaagcacaa gaggcagata acaaacttgt tgtgaaaatg 3240 aacagggatt taacgaactt aaattctgtg actttaggca ctgcgacaat gactggtgat 3300 aagaatacaa tcaaccttac tggtgcagga gagaaagtcg aggaagagtt tgttaaatgg 3360 gacccagtga ctaaacaacc tattcttgat gagaatggca atctccagaa atataaagag 3420 aaagttgatc ctcgtgtgaa actgagtggt attgctgatg gtgatatttc accaaatagt 3480 actgatgcag tgaatggtcg ccaagtttat gttttaacca atcgtatcag gttcttccac 3540 accaatgatg gtcataatgc agaggagcaa attaaccata agtcgaatac agtggactca 3600 atagcttcag gttcatactc tactgcagtt ggttacaaag ctcacgcgaa aggggataga 3660 gcggtcgcat ttggtaacag tacattagct ggcatacaat cggtggctat tggtaacgtt 3720 gcaattgctt caggcgaaaa atcgatagct attggtgata atgctaaggc tgtgggcaac 3780 caatctatct ctatcggtac gggtaacgta gtgaacggca ataactccgg tgcatttggt 3840 gacccaagtg tgattaatgc tgataactct tattctgtgg gtaacaataa tacgattgag 3900 aacgaaaatg tctttgcatt gggtaacaag attaccaata caaccaacaa ctcggtattc 3960 ttgggaacaa actcaggcta tgtggcagca ggtgcaacca ctgcgggagc gggtgcttta 4020 gaataccaag taataggtgg tgtgtataac gcttatgccg gcggtaaagc aactgaagtt 4080 gtaggcgtgg tgagcgtggg taatgtagac agtgatggca aaatggaaac tcgtcgtatt 4140
caaaacgttg cacctggttt aatctctgag caaagtaccg atgcgattaa tggtagccag
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ttgtatagct taatatctca gcacaaggtg catatgggcg atattcacaa taagatcaac
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cgtaataata aagctctgcg tgcgggtatt gcaggttcta acgccgcagc aggtttacca
4320
caggtttatc tcccaggtaa gtcaatgatt gcagcatcag cggggacttt caaaggtcaa
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tctgcattag cagtgggtta ctcaagagca tcagataacg gcaagctgat ccttaaatta
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caaggtaatg caaatactag tggtgaaatg ggcggctctg tgggggtagg ttatcagtgg
4500
<210> <211> <212> <213>
6 1500 PRT haemophilus parasuis
<400>
6
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Val Val Val Ser Glu Leu Val Lys Ser Tyr Thr Lys Thr Ser Ala Tyr 20 25 30
Thr Asp Lys Arg Ala Gln Val Cys Thr Ser Asp Tyr Phe Leu Asp Lys 35 40 45
Gln Gln Asp Lys Phe Lys Leu Ser Leu Leu Ser Leu Val Leu Leu Gly 50 55 60
Ile Phe Phe Ser Pro Val Ala Gly Ser Ile Thr Asp Ser Ser Tyr Phe 65 70 75 80
Gln His Gly Ala Thr Tyr Gly Thr Lys His Lys Ser Asp Ala Gly Thr 85 90 95
Ile Gly Ile Gly Arg Gln Ser Thr Ala Gly Pro Gly Ser Ile Ala Ile 100 105 110
Gly Gln His Thr Lys Ala Asp Gly Arg Thr Val Val Ala Ile Gly Tyr 115 120 125
Ser Ala Val Thr Thr Asp Ile Gly Ser Pro Val Ala Ile Gly Gly His 130 135 140
Thr Ser Ala Asn Gly Glu Ser Ala Ile Ala Ile Gly Leu Lys Ser Ser 145 150 155 160
Ser Gly Gly Lys Glu Ser Ile Val Leu Gly Asn Asn Ala Asn Thr Thr 165 170 175
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Gln Ser Val Ala Ile Gly Ala Asp Thr Lys Ala Asp Gly Tyr Gly Ser 195 200 205
Ile Ser Ile Gly Gly Asp Asp Leu Lys Thr Thr Lys Tyr His Lys Gly 210 215 220
Ser His Ser Ser Thr Thr Ala Lys Gly Lys Ala Ser Val Ala Ile Gly 225 230 235 240
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Ala Ser Ala Ser His Val Glu Gly Ile Ala Ile Gly Ala Arg Ser Lys 260 265 270
Ser Thr Ala Asp Tyr Gly Ile Ala Val Gly Gly Gly Ala Thr Ala Gly 275 280 285
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Ser Ile Ala Ile Gly Asn Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ala Asp Ser Val 305 310 315 320
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Ala Ser Ala Gly Gly Arg Ser Ser Val Ala Val Gly Glu Glu Ala Lys 355 360 365
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Asn Ser Ser Ser Gly Lys Val Gly Ile Trp Asp Gly Lys Leu Glu Val 485 490 495
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Glu Glu Glu Phe Val Lys Trp Asp Pro Val Thr Lys Gln Pro Ile 1115 1120 1125
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Asn Ser Thr Asp Ala Val Asn Gly Arg Gln Val Tyr Val Leu Thr 1160 1165 1170
Asn Arg Ile Arg Phe Phe His Thr Asn Asp Gly His Asn Ala Glu 1175 1180 1185
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Gly Asn Asn Asn Thr Ile Glu Asn Glu Asn Val Phe Ala Leu Gly 1295 1300 1305
Asn Lys Ile Thr Asn Thr Thr Asn Asn Ser Val Phe Leu Gly Thr 1310 1315 1320
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<212> ADN
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ggaaatatta cgatttctac gattggtaag ttaattaaag agactaaaac cttagataat 2940 ggcgatctaa aaattaccta tacagataat acggatagca tcatcaaaaa aggtgaaaaa 3000 ggagatacag gtcctagagg tgaaacaggc cctgcgggtc cgattggtcc agtgggtcca 3060 gcaggggcta ggggtgagcg aggccctgca ggtgtagctg gacctaaggg tgagaaaggt 3120 gatccaggac caaaaggcga aactggtcca acaggtccga gggggccagt gggtccacaa 3180 ggaccgcagg gaaaagcggg tgctcaggga cagaagggtg agcgaggaga aacaggccct 3240 gcaggtgcag ttggaccaca aggtgtacct ggccctgcgg gtccagcagg gcctaggggt 3300 gagcgaggcg aaccaggaca aacgggtcca gcaggcccag cgggagagcg aggcgagcgg 3360 ggtcctaaag gagatagagg tccaaaaggt gatacaggtg agagaggtgc aactggccct 3420 gcgggtccga tgggtccagc aggcccagcg ggagagcgag gtgcacctgg tcctgcgggt 3480 ccaaaaggag atgcaggaga aaaaggcgat aagggtgccc gtggtgaagc aggaccaatg 3540 ggccctcaag gtcctagagg tgagcaaggt ctaagaggtg aacgaggccc agcgggtcct 3600 agaggcgaaa ctggtttaac aggtccgagg ggtccagtgg gaccacaagg accgcaagga 3660 acaccgggta ctccgggaca gaagggggat aaaggcgatc caggacctgc gggtccagca 3720 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<213> Haemophilus parasuis
<400> 9 atgaataaaa tatttagagt tatttggagt catgctcaac aggcttgggt ggttgtatct 60 gagttagtaa agtctcatac taaaacatcc gcttacacgg ataaaagagc tcaagtatgc 120 acctcagatt attttttaga taaacagcaa gataaattta aattaagttt tttaagtcta 180 gtattactag gtatattttt tagtccagta ggttcagcaa ggctttttct agatgaggct 240 cgtcaaggga gtgcaggagt tgacgatggt tctattggta ttggtagaga gagtaaggtt 300 gggcctggtt ctattactat tggtcagaaa tcagaagctg aaggtaggac tgctgttgcg 360 ataggttatt cagcaaagac aggttcagag cacgacaacg ctattgcgat aggcaacagc 420 tctaaagcaa ctgggcctgg aacagttacc gtggggcata gttcacaagc gaaagatagg 480 tctgttgtct taggcgcaaa cgccgagggg aaaaatgctc aaacagttgt aataggtacc 540 cttgctaaag caagtgcgtc acaatctatt gctattgggg cagataccaa agcggagggg 600 tatggctcca tatcaatcgg tggagatgat ttagatcaaa cgaaatataa cgataataat 660 agtacaaacc aaccccgcca cacaacaact gcgaaaggta aggcctctgt tgctattggg 720 ggtctgtctt tggctgaggg cgacggatct attgttgtag gtcctttagc atctgcaagt 780 gatgttgaag gcattgctat cggtgcgaga agtaagtcta ccaatgagta cggtattgcg 840 gttggtggtg gtgcaactgc tggaaaaaac gccgttgctc ttggtaggga gtcgaaaggt 900 gctgggacag attccattgc gataggtaat tctgcgagaa caacaggggc agactctgtt 960 gttgtgggtg ccaatatcga tgtgacagat gaaaaattag tggccattgg ataccaagca 1020 agtgctaaaa gtcatgctac tgccttgggt tatatggcct ctgccggtgg tatgcactct 1080 gttgctgtgg gtgaaagtgc catgacaaat gatggtgctg ctagagcaac cgcacttggt 1140 aataataccg ttgtcaccgt gggtggcggt gtggcattgg gttatggatc aagagcagaa 1200 acgagagggg gtattgaagg ggcaaaacag tcttattctg taacaacagg gacaagcagt 1260 gttgataacg gctttaaatc tacaggaagt gttgataaca attctattcc tattggtgcg 1320 gtttctgtgg gtaataacaa aatcaaacgt caaatcgtca atgtggcggc aggtaaagaa 1380 ttaaccgatg cagtaaacgt ggcacagctt aaatctttaa ccctgaaaat tgcaggcaat 1440 accagcgaac aaacacaacc agcggttggc ttatgggaag gtacgctgaa agtaatgggt 1500 acaagcggtg agattaagac ttccgcaagc ggtgatacca tcacattgaa attagatgaa 1560 acattgaaaa ataaaattaa tacgattgac aatttaggtt ggaacctgaa gattgcgaaa 1620 ggggctggtg aagcaaatcc acctaatgca gcacatctta tcaaaatgag cgatacggca 1680 accgtaacct ttaccgctgg aaataatatt aaattagaac aaacgaacgg aaatattacg 1740 atttctacga ttggtaagtt aattgcaaag actgaatggg aaaatgatgg tttgaaaatt 1800 acttatacgg atggtatgca tgacattatc aagaaaggtg aaaaaggaga tcgtggtgag 1860 cgaggtctaa gaggtgaaac aggccctgcg ggtccagcgg gtcctatggg tccagcaggg 1920 gctgctggtc tagtaggacc aatgggccct caaggtcctg cgggtccacc tggtcctgtg 1980 ggtccagcag gggctgctgg tcctaagggg gataaaggcg aaccaggaca agcgggtcca 2040 actggaccac gaggccctgc gggtcctaaa ggagatgcag gtccaaaagg tgatacaggt 2100 cagagaggtg aaactggccc tgcgggtcca gcgggaccac aaggtcctgc gggtccaacg 2160 gggcctaggg gtgacaaagg tgatacgggt ccagcaggac cacaaggccc tgcgggtcca 2220 acgggaccac aaggccctgc gggtccaacg ggatcacaag accctgcggg tccaactgga 2280 aattcggaat taaaaggcat tacctcgatt gccaatggta acgacgccac caaggcgaat 2340 ggggctaaga ttaccttgtc tgcaggttct acagataaaa cagttaatgt taatgatgcg 2400 aaaattacca atgtggcggc tggtacagca gatactgatg cggtgaatgt gagccagtta 2460 aatactaagg cagcagcggc gagaactgag gttgaagcgg gtaaaaatgt gaaagtgact 2520 tcaaaaacgg gggcaaatgg tcagaatatt tacaatgtga gcgtgtctgg agatttaagc 2580 gacattactt caattagtaa tggcgatacg aaagtatctt taggtaaaga taagcaagga 2640 aatccagttg taaatatgaa tggtgccaga attaccaacg ttggagatgg tagtgctgag 2700 ggcgatattg tgaatgttcg tcagctcaac aaagtggttt cttctgtgaa tacaggattt 2760 aatcaattat caagagatat tggtcgtgtt gatgttaatg caagagcggg gattgcttct 2820 gctggggcga tggctaattt gccacaaatt tctttaccag gtaaaagtgc tatttctgtt 2880 tctaatgcac aatatcgcgg gcaatctgcc tatgctatag gttattccag aatttctgat 2940 aatggcaaat ggcttattcg agcgtctgtt agcagtaata ctcagcggga tactatgatt 3000 ggaggagggg taggttttgt gtgg 3024
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atgaataaaa tatttagagt tatttggagt catgctcaac aggcttgggt ggttgtgtct 60 gagttagtaa agtctcacac caaaacatcc gcttacacgg ataaaagagc tcaagtatgc 120 acctcagatt attttttaga taaacagcaa gataaattta aattaagtct tttaagtcta 180 gtattactag gtatattttt tagtccatca gctgctgcta acacaacaaa taccgcaaaa 240 ccatatcttc aagatgatgc tactacatcg aataatggat atgacaacgg tactattggt 300 attggtaaag agagtaaggc ttcgtatggt gctattgcta tcggtcagta ttcaaaagct 360 gaagctaggc ataatattgc gataggttat gatacacaag caggaaacca caaagaccac 420 tcaaactctg ttgcggtagg caacaatatt aaaatagatg ggaaggaagc agttgccatc 480 gggagtgctt caaaagcggg agagggatct gttgtcttag gcagacaagc cagtgcggaa 540 aagattaatc acgcagttgt aataggtcac aatactgtag tagatgggac ggaagcagtt 600 gccatcggga aaaaatcaaa agcgggaaag ggatctgttg tcttaggctc agatgccagt 660 gcgaaaaata ttgaacaagc agttgtaata ggtcactctg ctactgcaag taagtcaaaa 720 tctattgtta tcggggcaaa tgccaaagcg gatgggtatg gctccatatc aatcggtgga 780 gatgatttaa aaacaacgaa atatcaacct gatgttacag tccaaggcca agtccaaccc 840 caaccccaaa aaacaaaaat aacaactgcg agtggtggag cctctattgc tattgggggt 900 ggttctttgg ctaagggcga aggatctatt gttttaggtg ctttagcatc tgcaagtaaa 960 gatgaaggca ttgctatcgg tgcgaatagt aagtctacca atgagtacgg tattgcggtt 1020 ggtggtagtg caactgctac tggaaactac gccgttgctc ttggttggaa ctcgaaaggt 1080 gttgggacag attccattgc gataggtaag tctgcgacaa cagcaggggc atcttctgtt 1140 gttgtgggtg cccatatcgg tgtgacaggt caaaacttag tggcagttgg aagcctagca 1200 agtgctgaaa gtcatgctac tgccttgggt tataaagcct ctgctggtgg tatgagctct 1260 gttgctgtgg gtgataatgc caaaacaaat ggtagtgctg ctagagcaac cgcacttggt 1320 aataataccg ttgtcaccgt gggtggcggt gtggcattag gttatggatc taatgcaagt 1380
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gaagctaacg gctttaaatc cacagaaaag gttgatggta ataagattgg tgcagtttct 1500 gtcggtttag caggtaataa actcatcaaa cgccaaatca ccaacgttgc tgcaggtaaa 1560 gaattaaccg atgcagtaaa cgtggcacag cttaaatcgc tcaccatgct aataggaggc 1620 gataacaaca gcagtggcaa ggtaggcatt tgggaaggta agctcactgt aaaaggagaa 1680 aatggtatta cttcctatgc tcagggcagt acgattacgg ttaaattaga gaaagatctc 1740 aaagataaaa ttgataagat tgccgctatg ggtaagttaa ttaaaagtgc ggaaaaagaa 1800 tcaaatggca atctaaaaat tacctataca gataattcgc atagcattat cgagaaaggt 1860 gaaaaaggag atcgtggcga aactggccct gcgggtccag caggtccagt aggtccagct 1920 ggaccacaag gtaaaactgg tcctgcaggt ccagcgggtc ctgctggagc aacaggacca 1980 caaggtccaa aaggacctaa gggcgataat ggtgatccag gaccaaaagg cgaagctggt 2040 ccaacaggtc cgaggggtcc ggcaggtcca gcgggtgctc agggcataca aggtccaaaa 2100 ggaaatgatg gagctccagg tgctagggga gagaaaggtg aaactggccc tgcgggtcca 2160 gagggaccta agggtgaaac tggccctgcg ggtccagcgg gacctaaggg tgaaccgggt 2220 cctaaaggtg aacaaggtct tccaggacct gcgggtccag caggggctaa gggtgacaaa 2280 ggtgatacgg gtccagcagg accacaagga cctacgggtc caacgggacc acaaggacct 2340 acggggccaa cgggaccaca aggacctacg gggccaacgg gaccacaagg acctgcgagt 2400 ccaacgggat cacaaggccc tgcgagtcca acgggatcac aaggacctgc gggtccaacg 2460 ggtccagcag gaccacaagg acctacgggt ccaacggggc ctgcgggtcc aacgggacca 2520 caaggacctg cgggtccagc aggaccacaa ggaccgcagg gtccagcagg accacaagga 2580 cctgcgggtc caatggggcc tgctggtcca aaaggagaaa atgtgggaag tggtttaggt 2640 ttgaaagatg atgctgaatc aaataaaacg gcacttaccc ctacagatgc acaaaaagct 2700 attgctggtg ataacaaaga cggtaaaggc ggcttattgg ctcaaacggg taatgcgtta 2760 aataatgtag cgacagtaaa agacttacaa gccattgcac aagcgggctt agacttgacg 2820 ggtaacaacg ccgataccac tgtacatcgt ccattgggta cgaagttaac cgttgagggt 2880 gaaggcaaat ggaatggtaa ggactcagcg gctaataacc tttatgtgga agcgcaagag 2940 gcagataaca aacttgttgt gaaaatgaac aaggatttaa cgaacttaaa ttctgtgact 3000 ttaggcactg cgacaatgac tggtgataag aatacaatca accttactgg tgcaggagag 3060 aaagtcgagg aagagtttgt taaatgggac ccagtgacta aacaacctat tcttgatgag 3120 aatggcaatc tccagaaata taaagagaaa gttgatcctc gtgtgaaact gagtggtatt 3180 gctgatggtg atatttcacc aaatagtact gatgcagtga atggtcgcca agtttatgtt 3240 ttaaccgatc gtatcaggtt cttccacacc aatgatggtc ataatgcaga ggagcaaatt 3300 aaccataagt cgaatacagt ggactcaaga gcttcaggtt catactctac tgcagttggt 3360 tacaaagctc acgcgaaagg ggatagagcg gtcgcatttg gtaacagtac attagctggc 3420 atacaatcgg tggctattgg taacgttgca attgcttcag gcgaaaaatc gatagctatt 3480 ggtgataatg ctaaggctgt gggcaaccaa tctatctcta tcggtacggg taacgtagtg 3540 aacggcaata actccggtgc atttggtgac ccaagtgtga ttaatgctga taactcttat 3600 tctgtgggta acaataatac gattgagaac gaaaatgtct ttgcattggg taacaagatt 3660 accaatacaa ccaacaactc ggtattcttg ggaacaaact caggctatgt ggcagcaggt 3720 gcaaccactg cgggagcggg tgctttagaa agccaagtaa caggtggtgt gtataacgct 3780 tacgcaggtg gcaaagctac tgaagtgaaa ggcgtggtga gcgtgggtaa tgtagacagt 3840 gatggcaaaa tggaaactcg tcgtattcaa aacgttgcac ctggtttaat ctctgagcaa 3900 agtaccgatg cgattaatgg tagccagttg tataatgttg cacatagatt gggtgcgaag 3960 ttagagagag aagggcgtca acttcgtgcg gggattgctg caacaacggc tatgagcaat 4020 attccacaag tgactttacc aggtaaaagc acattgggtg ctggtattgg tactttcgag 4080 ggacaaaatg cagttgctgt tggattctca agaatgtctg ataatggtcg tgtgattctt 4140 aaagtttctg caggtgcaac ttcgcaaggc aaatacaatg ctggtgcagg tattgcatta 4200 cagtgg 4206
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Lys Gly Asp Ala Gly Leu Gln Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Glu Arg 755 760 765
Gly Pro Glu Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly Glu Arg Gly Glu Pro Gly 770 775 780
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Gln Asp Gly Ser Arg Gly Ser Thr Thr Thr Ala Gly Ser Thr Gly
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Ile Gly Gln Tyr Ser Lys Ala Glu Ala Arg His Asn Ile Ala Ile Gly 115 120 125
Tyr Asp Ser Asn Ala Gly Thr Ser Ala Asn Ser Ile Thr Ile Gly Tyr 130 135 140
Asn Thr Lys Val Ser Gly Glu Gln Ala Ile Ala Ile Gly Lys Gln Ser 145 150 155 160
Lys Ala Gly Lys Glu Ser Val Val Leu Gly Gly Gln Ala Lys Gly Glu 165 170 175
Gly Thr Gln Thr Val Val Val Gly Asn Leu Ala Ile Ala Ser Lys Leu 180 185 190
Gln Ser Ile Ala Ile Gly Ala Asn Ser Lys Ser Thr Asp Glu Tyr Gly 195 200 205
Ile Ala Val Gly Gly Ser Ala Thr Ala Thr Gly Lys Tyr Ala Val Ala 210 215 220
Leu Gly Trp Gly Ser Lys Gly Val Gly Thr Asp Ser Ile Ala Ile Gly 225 230 235 240
Lys Ser Ala Thr Thr Ala Gly Ala Asp Ser Val Val Val Gly Ala His 245 250 255
Ile Asn Val Thr Asp Gly Gln Leu Val Ala Ile Gly Arg Gln Ala Asn 260 265 270
Ala Gly Ser His Ser Thr Ala Leu Gly Tyr Lys Ala Ser Ala Gly Gly 275 280 285
Met His Ser Val Ala Val Gly Glu Glu Ala Lys Thr Asn Asp Gly Ala 290 295 300
Ala Arg Ala Thr Ala Leu Gly Asn Asn Thr Val Val Thr Val Gly Gly 305 310 315 320
Gly Val Ala Leu Gly Tyr Gly Ser Asn Ala Ser Thr Ala Gly Gly Val 325 330 335
Val Gly Leu Lys Gln Asp His Ser Val Thr Thr Gly Thr Ser Thr Glu 340 345 350
Ala Asn Gly Phe Lys Ser Thr Gln Asn Val Asp Gly Asn Asp Ile Gly 355 360 365
Ala Val Ser Val Gly Met Gly Ser Gly Asn Lys Leu Ile Lys Arg Gln 370 375 380
Ile Thr Asn Val Ala Ala Gly Lys Glu Leu Thr Asp Ala Val Asn Val 385 390 395 400
Ala Gln Leu Lys Ser Leu Thr Met Lys Ile Gly Gly Asp Thr Asn Asp 405 410 415
Asn Thr Gln Pro Lys Val Gly Leu Trp Asp Gly Lys Leu Glu Val Lys 420 425 430
Gly Thr Ser Asp Glu Ile Lys Thr Asn Ala Ser Asn Ser Thr Ile Thr 435 440 445
Ile Gly Leu Asp Gln Lys Ile Lys Asp Gln Leu Ser Glu Ile Ala Lys 450 455 460
Lys Met Ser Ser Phe Lys Ile Lys Thr Asp Asn Thr Glu Ala Thr Ile 465 470 475 480
Thr Asn Gly Asp Thr Ile Gln Phe Thr Ala Gly Asp Asn Ile Lys Ile 485 490 495
Thr Ser Asn Asn Lys Asn Leu Asn Phe Ala Leu Thr Ser Gly Asn Phe 500 505 510
Thr Val Asn Asp Gly Arg Leu Ser Arg Gln Thr Ala Gly Leu Ala Thr 515 520 525
Val Asp Thr Val Val Ser Ala Val Asn Asn Ala Gly Trp Lys Leu Ala 530 535 540
Ile Ala Ser Gly Thr Gly Gly Gln Ala Thr Asn Thr Ser Tyr Leu Ile 545 550 555 560
Lys Met Gly Asp Pro Ala Lys Phe Ile Ala Gly Asn Asn Ile Lys Leu 565 570 575
Glu Gln Thr Asn Gly Asn Ile Thr Ile Ser Thr Ile Gly Lys Leu Ile 580 585 590
Glu Lys Thr Glu Trp Lys Asp Gly Gly Leu Lys Ile Thr Tyr Thr Asp 595 600 605
Gly Thr Ser Asp Thr Ile Ala Lys Gly Lys Asp Gly Lys Asn Gly Glu 610 615 620
Lys Gly Asp Arg Gly Glu Gln Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Glu Ala 625 630 635 640
Gly Pro Arg Gly Glu Ala Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly 645 650 655
Pro Gln Gly Thr Thr Gly Ala Gln Gly Pro Lys Gly Asp Lys Gly Glu 660 665 670
Pro Gly Gln Ala Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Pro Ala Gly Pro Lys 675 680 685
Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Asp Thr Gly Gln Arg Gly Glu Thr Gly 690 695 700
Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Gln Gly Pro Gln Gly Thr 705 710 715 720
Ala Gly Ala Gln Gly Gln Lys Gly Asp Lys Gly Glu Pro Gly Gln Ala 725 730 735
Gly Pro Lys Gly Asp Thr Gly Gln Lys Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly 740 745 750
Pro Thr Gly Pro Lys Gly Asp Lys Gly Asp Thr Gly Pro Ala Gly Ser 755 760 765
Gln Gly Pro Thr Gly Pro Thr Gly Asn Ser Glu Leu Lys Gly Ile Thr 770 775 780
Ser Ile Ala Asn Gly Asn Asp Ala Thr Lys Ala Asn Gly Ala Lys Ile 785 790 795 800
Thr Leu Ser Ala Gly Ser Thr Asp Lys Thr Val Asn Val Asn Asp Ala 805 810 815
Lys Ile Thr Asn Val Ala Ala Gly Thr Ala Asp Thr Asp Ala Val Asn 820 825 830
Val Ser Gln Leu Asn Thr Lys Ala Ala Ala Ser Lys Thr Glu Val Glu 835 840 845
Ala Gly Lys Asn Val Lys Val Thr Ser Lys Thr Gly Ala Asn Gly Gln 850 855 860
Asn Ile Tyr Asn Val Ser Val Ser Gly Asp Leu Ser Asp Ile Thr Ser 865 870 875 880
Ile Ser Asn Gly Asp Thr Lys Val Ser Leu Gly Lys Asp Lys Gln Gly 885 890 895
Asn Pro Val Val Asn Met Asn Gly Ala Arg Ile Thr Asn Val Gly Asp 900 905 910
Gly Ser Ala Glu Gly Asp Ile Val Asn Val Arg Gln Leu Asn Lys Val 915 920 925
Val Ser Ser Val Asn Thr Gly Phe Asn Gln Leu Ser Arg Asp Ile Gly 930 935 940
Arg Val Asp Val Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Ser Ala Val Ala Met 945 950 955 960
Ala Asn Leu Pro Gln Ile Ser Leu Pro Gly Lys Ser Ala Ile Ser Val 965 970 975
Ser Asn Ala Gln Tyr Arg Gly Gln Ser Ala Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser 980 985 990
Lys Ile Ser Asp Asn Gly Lys Trp Leu Ile Arg Ala Ser Val Ser Ser 995 1000 1005
Asn Thr Gln Arg Asp Thr Ala Ile Gly Gly Gly Val Gly Phe Val 1010 1015 1020
Trp
<210> 27
<211> 27
<212> ADN
<213> Sintético
<400> 27 atgaataaaa tatttagagt tatttgg 27
<210> 28
<211> 24
<212> ADN
<213> Sintético
<400> 28 ccacacaaaa cctacccctc ctcc 24
<210> 29
<211> 25
<212> ADN
<213> Sintético
<400> 29 ccactgataa cctaccccca cagag 25
<210> 30
<211> 24
<212> ADN
<213> Sintético
<400> 30 ccactgtaat gcaatacctg cacc 24
<210> 31
<211> <212> <213>
35 ADN Sintético
<400> 31 gactgatcat gaataaaata tttagagtta tttgg
35
<210> <211> <212> <213>
32 36 ADN Sintético
<400> 32 gactgacata tgaataaaat atttagagtt atttgg
36
<210> <211> <212> <213>
33 33 ADN Sintético
<400> 33 ttactcgagc cacacaaaac ctacccctcc tcc
33
<210> <211> <212> <213>
34 37 ADN Sintético
<400> 34 tagttagtcg acccactgat aacctacccc cacagag
37
<210> <211> <212> <213>
35 33 ADN Sintético
<400> 35 ttactcgagc cactgtaatg caatacctgc acc
33

Claims (18)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Polinucleótido de Haemophilus parasuis, caracterizado porque codifica un polipéptido que presenta una identidad de al menos el 70%, 80% ó 90% con un polipéptido definido por la SEC ID NO: 2.
  2. 2.
    Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado porque tiene una secuencia capaz de hibridarse, en condiciones de alta astringencia, a la secuencia SEC ID NO: 1.
  3. 3.
    Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado porque tiene la secuencia SEC ID NO: 1.
  4. 4.
    Polipéptido de Haemophilus parasuis, caracterizado porque presenta una identidad de al menos el 70%, 80% ó 90% con un polipéptido definido por la SEC ID NO: 2.
  5. 5.
    Polipéptido según la reivindicación 4, caracterizado porque tiene la secuencia SEC ID NO: 2.
  6. 6.
    Vector de expresión caracterizado porque comprende un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
  7. 7.
    Célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
  8. 8.
    Procedimiento para la preparación de los polipéptidos de las reivindicaciones 4-5, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
    a) cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión de la reivindicación 7, y b) expresar dicho polinucleótido para producir dicho polipéptido.
  9. 9.
    Uso de los polipéptidos de las reivindicaciones 4-5 para la preparación de vacunas y/o composiciones inmunogénicas para el tratamiento profiláctico o terapéutico de la infección causada por H. parasuis en un animal.
  10. 10.
    Vacuna contra H. parasuis, caracterizada porque comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un polipéptido de las reivindicaciones 4-5, y un agente auxiliar.
  11. 11.
    Uso de los polinucleótidos de las reivindicaciones 1 a 3 para determinar si una cepa de H. parasuis es virulenta o avirulenta, en el que dicha determinación se lleva a cabo mediante una amplificación in vitro.
  12. 12.-Kit para determinar si una cepa de H. parasuis es virulenta o avirulenta, caracterizado porque comprende:
    a) los productos de amplificación de los polinucleótidos con la SEC ID NO: 1, b) el oligonucleótido pADH-F (SEC ID NO: 27), c) los oligonucleótidos pADH-R1 (SEC ID NO: 28), pADH-R2 (SEC ID NO: 29), y pADH-R3 (SEC ID NO: 30), y d) los reactivos necesarios para llevar a cabo la amplificación mediante la técnica de PCR.
    FIGURA 1
    1. Cultivo de Haemophilus parasuis sobre agar chocolate
  13. 4. Purificación de fragmentos de 300 a 1.500 pb
  14. 5. Clonación en pUC19
  15. 6. Selección de clones recombinantes
  16. 7. Purificación del plásmido recombinante
  17. 8. Secuenciación de los insertos
  18. 10. Anotación de los contigs por comparación en el GenBank
    FIGURA 2
    -
    : Indica una deleción, .: Indica una identidad
    FIGURA 3 FIGURA 4
    -
    : Indica una deleción, .: Indica una identidad
    FIGURA 5A
    Ma
    Kb 10
    FIGURA 5B
    Ma
    Kb
    10 8
    FIGURA 5C
    Ma
    Kb 10
    bcdefghi j k
    bcdefghij k
    bcdef ghij k
    FIGURA 6
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