KR20020039270A - 그람-음성 박테리아의 지질화 형태의 펩티도글리칸-결합지단백질의 생산 - Google Patents
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Abstract
그람-음성 박테리아의 지질화된 형태의 펩티도글리칸-결합 단백질(PAL)의 발현이 엄격하게 조절되는 프로모터를 함유하는 플라스미드의 사용을 통해 달성된다. 박테리아 숙주 세포는 이러한 플라스미드로 형질전환, 형질도입 또는 형질감염된다. 이어서 숙주 세포는 지질화 재조합 PAL이 발현되도록 하는 조건하에서 배양된다. 지질화 재조합 PAL은 그람-음성 박테리아에 대해 면역화시키기 위해 포유류 숙주에 투여되는 항원 조성물에 포함된다.
Description
그람-음성 박테리아의 세포벽은 펩티도글리칸으로 알려진 교차-결합 잔기를 함유한다. 다수의 그람-음성 박테리아가 펩티도글리칸에 공유 결합하는 단백질을 생산한다. 이러한 단백질은 펩티도글리칸-결합 지단백질(PAL)로 언급된다. PAL은 레기오넬라 뉴모필라(관계서적 목록 1), 에스케리치아 콜라이(2), 헤모필루스 듀크레이(3), 캄필로박터 제주니(4), 수도모나스 푸티다(5), 브루셀라 아보르투스(6), 수도모나스 에어루기노사, 클레브시엘라 에어로게네스, 세르라티아 마르세센스, 프로테우스 불가리스, 살모넬라 타이피뮤리움(7), 악티노바실루스 플루로뉴모니아(8), 헬리코박터 필로리(9), 클라미디아 뉴모니아(10) 및 클라미디아 트라코마티스(11)를 포함하는, 다수의 그람-음성 박테리아에서 tol 유전자좌의 일부로 존재한다.
다른 PAL-함유 박테리아는 헤모필루스 인플루엔자(에이치. 인플루엔자) 박테리아이다. 에이치. 인플루엔자 박테리아는 두 그룹으로 세분된다. 알려져 있는 협막을 지니고 있는 이들 계통은 협막과 대조 항혈청의 혈청 반응으로 유형 분류된다. a-f 유형이 동정되었다. 임의의 대조 항혈청과 반응하지 않는 계통은 유형 분류 불가인 것으로 알려져 있다.
에이치. 인플루엔자 b형(Hib)은 미국에서 신생아 뇌막염 및 다른 침입성 감염의 가장 빈번한 원인이다(12). 아동 뇌막염은 1세 내지 5세 연령의 아동에게 주로 발병한다. Hib로 인한 이러한 뇌막염 사례의 60%가 2세 이하의 아동에게 발병한다(12).
유형 분류 불가한 에이치. 인플루엔자(NTHi)는 성인의 폐렴, 균혈증, 뇌막염, 산후 패혈증 및 급성 발열성 기관지관지염을 포함하는, 각종 질환을 일으키는 그람-음성 유기체이다(13). NTHi는 어린 아동에서 보여지는 모든 중이염 사례의 20 내지 40%를 일으키는 것으로 보고되었다(14, 15, 16). 아동은 감염이 장기 지속되는 면역을 부여하지 않기 때문에 동일한 유기체로 인한 다중 감염이 일어날 수도 있다. 만성 중이염 또는 반복 발병하는 중이염의 현 치료법은 항생제 투여 및 내이에 배액관의 삽입을 포함한다. NTHi 계통은 또한 정맥동염의 주요 원인으로 포함된다(17). 아울러, NTHi는 신생아 패혈증을 일으킨다.
현 협막계 항원 조성물은 NTHi에 대해 비효과적이다. 이러한 박테리아의 표면은 매우 다양한 주요 외막 단백질인 P1 및 P2로 인해, 항원으로서 매우 변동하기 쉬운 것으로 보여진다(18, 19). 인간에서, 혈청 살균성 항체의 존재는 감수성 NTHi 계통에 의해 발병하는 중이염의 예방과 상관관계가 있는 것으로 보고되었다(20).
NTHi에 대한 항원 조성물에 포함되기 위한 후보는 아미노산 수준으로 잘 보존되고, 표면 노출되며(특히, 외막 단백질), 살균성 항체를 도출하며, 모든 분리체에 존재해야 한다. 선행 연구는 NTHi의 P6(PBOMP-1 및 HiPAL로도 불림)(21) 단백질이 이러한 기준을 모두 만족시킴을 보여주었다. 정제된 네이티브 단백질은 살균성 항체를 도출하고(22, 23, 24, 25) 항원으로 보존되는 것으로(22, 23, 26, 27) 보인다.
P6 유전자의 유전자 서열 평가는 이들이 귀 NTHi 분리체 중에서 잘 보존되어 단백질 서열 또한 잘 보존됨을 보여준다. 네이티브 P6은 아미노-말단 시스테인에서 지질로 변형된, 지단백질, 더욱 자세히 설명하면 PAL이다. 이 단백질은 비교적 소량(전체 외막 단백질의 1% 이하)으로 에이치. 인플루엔자에 존재하여, 유용한 양으로 네이티브 유기체로부터의 정제가 다소 어렵게 한다. 따라서, 항원 조성물 중의 성분으로서 추가 개발을 위해 P6의 재조합 버전이 요구된다.
다수의 실험실이 대장균에서 지질화된 rP6을 다량으로 발현시킬 수 없었다(28, 29). 그 결과, 대장균에서 P6을 발현하는 최초 재조합 작제물은 비지질화 버전의 단백질만을 발현할 수 있었다. 이들 그룹은 에이치. 인플루엔자로부터 정제된 지질화 P6 단백질이 대장균으로부터 정제된 비지질화 rP6보다 더 면역원성이지만, 지질화 P6(28, 29)을 발현하는 DNA 벡터의 공학처리가 어렵다고; 즉, 에이치. 인플루엔자에 의해 발현되는 네이티브 P6의 저 수준보다 우수하지는 않다고 보고되었다.
지질화 rP6을 발현하기 위한 선행 시도는 trc, taq, lac 및 PL-C1857과 같은, 엄격한 전사 조절하에 있지 않는 프로모터에 의존하였다. 이러한 다소 느슨한 전사가 대장균에 지질화 단백질의 저 수준 발현에 기여하는 미묘한 효과를 유도한다고 이론화되었다. 실험 상의 증거가 단백질의 N-말단에 지질을 첨가하는 시그널 펩티다제 II의 능력은 프로세싱 P6의 저 수율에 대해서는 책임이 없음을 나타낸다(데이타 비도시).
에이치. 인플루엔자의 P6 단백질이 헤모필루스 질환에 대한 항원 조성물에 포함되기 위한 주요 후보이지만(20, 23, 24, 25, 30, 31), 에이치. 인플루엔자로부터 입수가능한 비교적 소량은 이 단백질의 재조합체 발현이 필수적이도록 한다. 상당량으로 지질화 P6 단백질을 발현하기 위한 선행 노력은 성공적이지 못했다(28, 29). 따라서, 연구자는 복합 형태의 비지질화 P6의 발현 및 정제에 촛점을 맞추었다.
비지질화 rP6에 의해 발생된 항체 반응은 뇌막염으로부터 어린 래트를 보호하고(28), 지질화 네이티브 P6(28)에 의해 도출되는 것보다는 낮은 수준으로 살균성 항체를 도출할 수 있는(28, 29), 생물학적 기능을 가진다.
따라서, 그람-음성 박테리아의 지질화 PAL을 발현하는 숙주 세포-발현 벡터 시스템을 작제할 필요가 있다. 특히, 지질화 rP6을 발현하고, 이어서 에이치. 인플루엔자에 대한 항원 조성물에 포함될 수 있는 숙주 세포-발현 벡터 시스템을 작제할 필요가 있다.
발명의 요약
따라서, 본 발명의 목적은 박테리아 숙주 세포에서 그람-음성 박테리아의 지질화 PAL을 발현할 수 있는 유전자 작제물을 개발하는 것이다.
본 발명의 특별한 목적은 박테리아 숙주 세포, 특히 대장균에서 지질화 rP6을 발현할 수 있는 유전자 작제물을 개발하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 에이치. 인플루엔자에 의해 발병하는 질환을 예방하기 위한 포유동물 투여용 항원 조성물에 이 지질화 rP6을 포함시키는 것이다.
하기에 설명된 것처럼 본 발명의 이러한 목적과 기타 목적은 발현 벡터에서 엄격하게 조절되는 프로모터의 사용을 통한 지질화 형태 PAL의 박테리아 세포에서의 클로닝 및 발현에 의해 달성된다.
본 발명은 발현 벡터에서 이러한 프로모터의 사용을 통한 지질화 형태의 재조합 에이치. 인플루엔자 P6 단백질의 박테리아 세포에서의 클로닝 및 발현에 의해 예시된다.
특히, 지질화 재조합 P6의 발현을 위해, 아라비노스 유도성 프로모터 또는 T7 프로모터를 함유하는 플라스미드가 작제되고, 여기에서 프로모터는 P6 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 분리 및 정제 DNA 서열에 작동적으로 연결되고, 상기 프로모터의 조절하에, DNA 서열은 지질화 형태로 발현된다.
이어서, 박테리아 숙주 세포가 이러한 플라스미드로 형질전환, 형질도입 또는 형질감염된 다음 숙주 세포에 의한 지질화 rP6의 발현을 허용하는 조건하에서 배양된다.
본 발명의 또다른 양태에서, 지질화 rP6은 b형 및 유형 분류 불가한 에이치. 인플루엔자를 모두 포함하는, 모든 병원성 에이치. 인플루엔자에 대한 항원 조성물에 면역원으로서 사용된다.
정제되면, 재조합 단백질은 각종 기준에 따라 지질화된 것으로 나타나고, 가장 중요한 것은 이미 사용된 비지질화 형태 P6보다 훨씬 더 면역원성이다.
시그널 펩티다제 II에 의한 아미노-말단 시스테인의 지질 변형은 단백질이 이들의 비-지질화 형태보다 더 면역원성이도록 하는 것으로 보였다(28, 29, 32). 이러한 형태가 지질화된 P6에 관해 면역원성 및 항원성에 대해 평가되었다. 모두 네이티브 지질화 단백질과 비교하여 감소된 면역원성을 보였다.
이는 훨씬 적은 투여량이 인간을 면역화시키기 위해 사용되도록 하여 지질화 rP6이 항원 조성물에 포함되기 위한 더욱 상업적인 후보이도록 한다. 이러한 증가된 역가는 인간에서, 더 적은 P6 단백질 투여량의 사용을 허용하여, 이 단백질의 생산에서 비용 절감을 제공할 것이다.
분리 및 정제된 지질화 rP6 단백질은 포유류 숙주에서 방어 면역반응을 도출하는 항원 조성물을 제조하는 데 사용된다. 항원 조성물은 하나 이상의 보조제, 희석제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 보조제의 예로는 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, StimulonTMQS-21, MPLTM, IL-12 및 콜레라 독소가 포함된다. 항원 조성물은 에이치. 인플루엔자에 의해 발병하는 질환으로부터 숙주를 보호하기에 충분한 면역원 양으로 포유류 숙주에 투여된다.
본 발명은 그람-음성 박테리아의 지질화 형태의 펩티도글리칸-결합 단백질의 발현 및 항원 조성물에 이 재조합 지질화 단백질의 사용에 관한 것이다.
도 1은 유형 분류 불가한 에이치. 인플루엔자 계통 P860295의 염색체로부터 PCR 증폭으로 네이티브 지단백질 시그널 펩타이드를 지니는 P6 단백질을 암호화하는 pal 유전자의 클로닝을 나타낸다.
도 2는 지질화 rP6의 동질성 및 본성을 나타낸다. 15% SDS-PAGE 겔에 초기 추출물에 지질화 rP6 대략 10 ㎍을 함유하는 샘플(레인 1) 및 음이온 교환 정제된 지질화 rP6의 풀(레인 2)을 로딩한다. S라고 표지된 레인은 Bio-Rad로부터의 예비염색된 저분자량 표준을 함유한다. 도 2A는 쿠마시 염색된 겔이다. 도 2B는 유사한 겔의 웨스턴 면역블롯이다.
도 3은 지질화 rP6을 정제한 분획의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 지질화 rP6의 정제 과정에서 단계의 분취량을 4-20% 구배의 겔 시스템으로 전기영동한 것이다. 레인: 1, 용해 완충액으로의 정용여과로부터의 투과물; 2, TritonTMX-100으로의 정용여과로부터의 투과물; 3, TrisTM완충액으로의 정용여과로부터의 투과물; 4, ZwittergentTM3-14로의 정용여과로부터의 투과물; 5, ZwittergentTM3-14/0.5 M NaCl로의 정용여과로부터의 투과물; 6, TrisTM완충액으로의 정용여과로부터의 투과물; 7, 사르코실로의 정용여과로부터의 투과물; 8, Mark 12 표준; 9, TrisTM완충액으로의 정용여과로부터의 투과물; 10, 실온에서 ZwittergentTM3-12로의 정용여과로부터의 투과물; 11, TrisTM완충액으로의 정용여과로부터의 투과물; 12, 농축 단계로부터의 투과물; 13, 55℃에서 ZwittergentTM3-12로의 정용여과로부터의 투과물; 14, 55℃에서 TrisTM완충액으로의 정용여과로부터의 투과물; 15, 55℃에서 ZwittergentTM3-12로의 정용여과로부터의 투과물.
적당량의 지질화 rP6과 같은, 지질화 PAL을 발현하는 데 있어서 인식된 어려움을 극복하기 위해, 엄격하게 조절되는 프로모터와 세포질 및 주변세포질 프로테아제가 결여된 숙주 계통의 사용이 관여하는 전략이 고안되었다.
상업적인 용도로 상당량의 지질화 P6 단백질을 발현하기 위한 기존의 성공하지 못한 노력은 모두 프로모터 서열의 변화 및/또는 시그널 펩티다제 II에 의해 인지된 시그널 서열의 변화에 의존하였다.
하기에 설명되는 것처럼, T7 프로모터(플라스미드 pPX4019 - 실시예 1) 및 아라비노스 유도성 프로모터(플라스미드 pPX4020 - 실시예 2)의 조절하에 P6을 암호화하는 pal 유전자를 함유하는 플라스미드가 작제된다. 예시 박테리아 계통 및 배지는 실시예 3에 설명되어 있다. pPX4019와 pPX4020은 모두 P6-특이적 단일클론 항체로의 웨스턴 블롯, 시그널 서열의 결여를 나타내는 SDS-PAGE 겔 상에서의 사이징 및 쿠마시 염색된 겔로 발현 수준의 시각적 관찰에 의해 측정되는 것처럼(참조: 실시예 4 및 도면), 시험된 대장균 계통에서 지질화 P6 단백질을 발현한다.
생산된 플라스미드 pPX4020은 대장균 계통 BL21 및 BLR에서 rP6 단백질 발현 수준을 증가시키는데, 계통 BLR에서 최고 수준이다. 따라서, 플라스미드 pPX4020이 추가 연구를 위해 선택되었다. 더 다량의 지질화 rP6을 발현하는 대장균의 성장은 숙주 계통 BLR에서 수행된다. 모든 후속 시험은 이 숙주-벡터 시스템을 이용하였다.
바람직한 양태로서 본원에서 설명된 플라스미드 작제물(pPX4020)은 각종 특이한 특징을 가지는 아라비노스 유도성 프로모터 시스템을 사용한다: 이는 엄격하게 조절되고 아라비노스가 존재하지 않고 약간의 글루코스만 존재하여도 거의 완전히 불활성이다. 이는 또한 배양 배지에 첨가되는 아라비노스가 증가함에 따라 유도 수준 증가를 보인다는 점에서 조절가능하다. 프로테아제가 많이 불충분하고 재조합이 결여된 대장균의 BLR 계통과 함께 이러한 인자는 지질화 P6 단백질의 상당한 발현을 허용한다.
지질화 rP6의 뱃치 규모 정제는 분별 원심분리, 감별 세제 추출 및 음이온 교환 크로마토그래피를 포함한다(참조: 실시예 4).
그러나, 항원 조성물에 포함되기 위해 이용가능한 후보가 되기 위해서는, 발현된 지질화 rP6이 대규모 시험할 수 있는 방법으로 정제되어야 한다. 정용여과가 대규모 정제에 적당한 방법이다. 지질화 rP6을 추출하기 위한 정용여과법은 지질화 rP6이 펩티도글리칸과 강력하게 결합되기 때문에 복잡하다.
실시예 5에 설명된 것처럼, 지질화 rP6의 가용화는 헤모필루스(Hi-P6)로부터 수득된 네이티브 단백질처럼(33) 분별 세제 추출법에 따라 달성된다(그러나, 원심분리 대신 탄젠트 유동 정용여과 사용). 도데실말토사이드, 데옥시콜레이트, ZwittergentTM3-08, 3-12 및 3-14와 같은 세제가 모두 시험되고 지질화 rP6을 추출하기 위해 0.2-1%(w/v) 범위로 사용되면 허용가능한 것으로 밝혀졌다. 지질화 rP6은 또한 나트륨 보레이트 완충액(pH 9.5)에, 65℃에서 용해될 수 있다. 세제 선택의 융통성이 지질화 rP6을 추출하기 위해 ZwittergentTM3-12의 사용을 허용한다. ZwittergentTM3-12의 선택은 다성분 항원 조성물을 생산하는 데 필요한 성분 수를 최소화한다. 네이티브 Hi P6은 가용화 후에 본질적으로 순수한 형태로 수득되고, 반면 재조합 단백질은 각종 대장균 단백질과 함께 용해된다. 이들 단백질의 상대량은 다양할 수 있고 일부 경우에는 사용될 세제의 선택에 따라 최종 추출물에서 거의 제거된다. 지질화 rP6은 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 잔류하는 대장균 단백질로부터 분리된다(참조: 실시예 6).
이러한 PAL 추출방법은 정화와 추출 과정을 1 단위 작업으로 병합한다. 산물이 세포로부터 추출되고 단 한번의 1 연속 정용여과 과정으로 세포 파편으로부터 분리된다. 또한, PAL은 하류 프로세싱 단계를 단순하게 하는 반-정제 상태로 추출된다. 최종적으로, 이 방법은 쉽게 측정가능한데, 그 이유는 유일한 필요조건이 막의 표면적이 세포의 양에 비례하여 증가하는 것이기 때문이다. 이 추출방법은 원심분리의 사용을 회피하는데, 이 방법은 대규모 추출에 사용하기에는 바람직하지 않다. 추출 후에, 지질화 rP6은 통상의 기술로 정제된다.
지질화 rP6의 분석은 예상했던 것처럼, 지단백질로서의 재조합 단백질의 특징규명과 일치한다. MALDI-TOF 질량 분석계에 의해 측정되는 분자 크기는 정제된 재조합 단백질이 아미노산 서열만으로 예상한 것보다 큰 것으로 나타난다(참조: 실시예 7). 표 1에 상세히 설명된 아미노산 분석과 함께(참조: 실시예 8), 단백질의 크기는 시그널 서열이 제거되었고 단백질이 성숙한 형태임을 나타낸다. 아미노-말단 아미노산 분석(참조: 실시예 9)으로 확인되는 것처럼, 블로킹 아미노-말단의 존재는 또한 말단 시스테인 잔기의 변형이 일어났음을 보여준다. 이러한 결과는 종합하면, 지질화 P6(23)을 초래하는, 대장균에 의해 인지되고 프로세싱된 것으로 보여지는 시그널 서열이 제거되었고 여기에서 정제된 재조합 P6은 이의 아미노-말단에서 지질화되었음을 나타낸다.
선행 연구자는 자연 발생하는 NTHi 감염 후에 P6에 대한 항체 수준이 질환 발병과 반비례하는 상관관계를 가진다고 설명하였는데(34, 35, 36), 이는 P6에 대한 고 역가 초래가 이 항원을 사용하는 면역화 프로그램의 목표가 되게 한다. 네이티브 지질화 P6 단백질은 매우 소량(외막 단백질의 1% 이하)으로 존재하는데(33), 이는 상업적으로 이용가능한 양의 정제가 잘 해도 문제가 되도록 한다.
기존의 발현된 비-지질화 rP6에 비해 지질-변형된 rP6의 중요한 장점은 지질 변형과 관련하여 증가된 면역원성이다. 두 보고서가 비-지질화 rP6이 생물학적으로 활성인 항체를 도출할 수 있지만, 네이티브 지질화 단백질보다 덜 면역원성임을 보여주었다(28, 29).
반대로, 하기 표 2-4에 제시된 동물 면역원성 데이타(참조: 실시예 10 및 11)는 재조합 P6의 지질 변형 또한 마우스 모델에서 이 항원의 면역원성을 증가시킨다고 나타낸다. 6주 째에 기하 평균 항체 역가(GMT)의 2-로그 이하 증가가 상당히 중요하고 이는 지질화 형태의 rP6 단백질이 항원 조성물에 포함되기 위한 실용적인 후보가 되게 한다. 이는 지질화 rP6이 시험된 다른 항원에 의해 유발된 면역반응을 방해하지 않는다는 이들 실험의 결과에 의해 지지된다.
이러한 데이타는 종합하면, 지질화 rP6이 에이치. 인플루엔자에 대한 항원 조성물에 포함될 수 있다는 견해를 지지한다. NTHi로부터의 지질화 rP6으로 하기에 예시되었지만, Hib로부터의 지질화 rP6 또한 본 발명의 항원 조성물에 포함하기에 적당하다.
실시예 1-3에 상세히 설명된 것 외에, 다양한 박테리아 숙주 세포-벡터 시스템이 본 발명의 항원 조성물에 사용되는 지질화 rP6 단백질을 발현하는 데 사용하기에 적당하다.
이러한 발현 시스템은 재조합 지질화 PAL을 암호화하는 유전자를 엄격하게 조절되는 프로모터의 조절하에 둔다. 특정 조건하에서, 이들 프로모터는 재조합 PAL mRNA의 생산을 하향 조절하도록 작동하고, 그 결과 숙주 세포에 끼치는 재조합 지질화 PAL의 생산으로 인한 불리한 효과를 완화시킨다(37). 이어서 이 엄격한 조절은 숙주 세포에서 최고 재조합 지질화 PAL 발현을 허용하기 위한 특정 조건하에서 제거될 수 있다.
엄격하게 조절되는 프로모터(다른 조절 요소와 함께)로는 아라비노스 유도성 프로모터(38), nutL/N 종결억제 기능(39, 40) 또는 Mu C(41)에 의한 조절하에 변형될 수 있는 T7 프로모터, 종결억제자와 조합된 PL프로모터(42), SP6 RNA 폴리머라제 및 SP6 프로모터(43), 콜리신 프로모터(44), tetA 프로모터/오퍼레이터(45), 람노스 및 포스페이트 프로모터(46), LacR/O, tetR/O 및 AraCII-12 조절 요소(47), 및 전도될 수 있는 프로모터(48)가 포함되고, 이로 한정되지 않는다.
벡터 시스템은 사용된 숙주 세포와 상용성이다. 적당한 숙주 세포로는 통상의 기술에 의해 플라스미드 DNA, 코스미드 DNA 또는 박테리오파지 DNA로 형질전환, 형질감염 또는 형질도입된 박테리아가 포함된다. 박테리아 숙주의 예로는 대장균, 비. 서브틸리스, 살모넬라 및 시겔라가 포함된다.
이러한 벡터를 작제하기 위해, pal DNA가 엄격한 전사 조절하에 프로모터를 함유하는 플라스미드 벡터에 삽입되고, 다른 조절 요소는 벡터 내의 특정 부위에 연결되어, 플라스미드 벡터가 박테리아 숙주 세포에 삽입되면, pal DNA는 숙주 세포에 의해 발현될 수 있다.
플라스미드는 사용된 숙주 세포-벡터 시스템에 따라, 형질전환, 형질도입 또는 형질감염에 의해 숙주 세포에 도입된다. 숙주 세포는 이어서 숙주 세포에 의한 지질화 rP6 단백질의 발현을 허용하는 조건하에서 배양된다. 아라비노스 유도성 프로모터를 가지는 플라스미드를 함유하는 숙주 세포는 L-아라비노스로 유도되고, 반면 T7 프로모터를 가지는 플라스미드를 함유하는 숙주 세포는 IPTG로 유도된다.
지질화 PAL은 상응하는 박테리아에 의해 발병하는 질환으로부터 포유동물을 보호하기 위한 항원 조성물의 제조에서 유용하다. 예를 들면, 지질화 rP6 단백질은에이치. 인플루엔자에 의해 발병하는 질환으로부터 포유동물을 보호하기 위한 항원 조성물의 제조에서 유용하다.
포유류 숙주에서 방어 면역반응을 도출하는, 이러한 항원 조성물은 지질화 rP6 단백질과 같은, 분리 및 정제된 지질화 PAL을 포함한다. 다가 항원 조성물은 예를 들면, 지질화 rP6과 모락셀라 카타르할리스의 UspA2 단백질을 배합함으로써(본원에 참조로 인용되는, PCT 국제 출원 제WO98/28333호(49)에 설명), 다른 단백질, 박테리아성 중이염의 원인이 되는 제제 및 에이치. 인플루엔자의 재조합 지질화 rP4 단백질(단백질 "e"로도 알려짐)(본원에 참조로 인용되는, 미국 특허 제5,601,831호(50)에 설명)의 포함으로 제공된다.
지질화 rP6 단백질과 같은, 지질화 PAL을 함유하는 항원 조성물은 통상의 방법으로 면역학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체와 혼합되어 주사액 또는 주사 현탁액을 제조할 수 있다. 이러한 희석제 또는 담체로는 PBS, 생리 식염수, 완충된 등장액, 리포솜 및 ISCOMS가 포함되고, 이에 한정되지 않는다. 항원 조성물에 의해 도출되는 항체의 수준은 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, StimulonTMQS-21(미국 매사추세츠 프레이밍햄 소재의 Aquila Biopharmaceuticals, Inc.,), MPLTM(3-O-탈아실 모노포스포릴 지질 A; 미국 몬태나 해밀톤 소재의 RIBI ImmunoChem Research, Inc.,), IL-12(미국 매사추세츠 캠브리지 소재의 Genetics Institute), 대장균의 열-불안정 독소 및 콜레라 독소(야생형 또는 돌연변이체, 예를 들어 PCT 국제 출원 제WO 00/18434호에 따라, 아미노산 29 위치의 글루탐산이또다른 아미노산, 바람직하게는 히스티딘으로 대체)(51)와 같은 특정 보조제를 사용함으로써 향상될 수 있다.
본 발명의 항원 조성물은 인간에게 피하, 피내 또는 근육내 주사와 같이 통상의 방법으로의 주사와, 경구, 점막, 비강내 또는 질 투여에 의해 투여되어, 에이치. 인플루엔자와 같은 그람-음성 박테리아에 의해 발병하는 질환의 방어를 위해 활발한 면역반응을 유도한다. 투여되는 투여량은 당업자에게 알려진 방법으로 결정된다. 방어는 항원 조성물의 단일 투여량으로 일어날 수 있거나, 방어를 유지하기 위한 후기 부스터 투여량 외에, 투여량의 수차례 투여를 필요로 할 수도 있다.
본 발명이 더욱 잘 이해될 수 있도록, 하기의 실시예가 상술되었다. 실시예는 설명만을 목적으로 하고 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
표준 분자생물학 기술이 Sambrook et al.(52)에 의해 설명된 프로토콜에 따라 이용된다.
실시예 1
pal 유전자 및 T7 프로모터를 함유하는 플라스미드 pPX4019의 작제
도 1에 나타나 있는 것처럼, P6 단백질을 암호화하는 pal 유전자를 유형 분류 불가 에이치. 인플루엔자 계통 P860295의 염색체로부터 PCR 증폭으로 네이티브 지단백질 시그널 펩타이드로 클로닝한다. 유전자의 5' 말단에 개시 코돈을 포함하는 NdeI 제한 부위(GGAGAAATCATATGAACAAATTTG)(서열번호 1) 및 정지 코돈의 3' 영역에 HindIII 부위(GGATCCTGTTTTTCAAGCTTAGAAATACTAAG)(서열번호 2)를 초래하는 돌연변이 유발성 프라이머를 사용하여, pal 유전자를 함유하는 PCR 단편을 pCRII 발현 벡터(미국 캘리포니아 칼스바드 소재의 Invitrogen)로 클로닝하고 제한 분석으로 스크리닝한다. 생성된 플라스미드를 발현 벡터 pET27b(미국 위스콘신 매디슨 소재의 Novagen)의 NdeI 및 HindIII 부위로 클로닝된 P6에 대한 pal 유전자를 함유하는 NdeI/HindIII 단편의 공급원으로 사용한다. 이 작제방법의 계획은 P6에 대한 유전자를 T7 프로모터의 조절하에 두고 벡터에서 일치하는 리보솜 결합 부위의 장점을 취한다. 최초 클론은 제한 분석에 의해 비-허용 대장균 숙주(DH5α)에서 동정된다. 단일 플라스미드 분리체가 선택되어 pPX4019로 저장된다. 이 플라스미드는 발현 연구를 위해 허용 숙주 계통 BL21(DE3, pLysS)(Novagen)을 형질전환시키는 데 사용된다.
실시예 2
pal 유전자 및 아라비노스 유도성 프로모터를 함유하는 플라스미드 pPX4020의 작제
pal 유전자를 엄격하게 조절되는 아라비노스 유도성 프로모터의 조절하에 두는 두번째 P6 단백질 발현 플라스미드를 작제한다(38). 이 플라스미드는 pal 유전자를 함유하는 플라스미드 pPX4019로부터의 XbaI/HindIII 단편 및 pET27b로부터의 일치하는 리보솜 결합 부위를 유사하게 분해된 플라스미드 pBAD18-Cm으로 아클로닝함으로써 생성된다(참조: 도 1). 클론을 제한 분석으로 스크리닝한 다음 선택된 후보에 대해 발현 연구한다. P6 단백질을 발현하는 pBAD18-Cm 분리체 중 하나가 분해된 pPX4020이다.
실시예 3
pPX4019 및 pPX4020으로부터 지질화된 rP6의 발현
상이한 분리체, 플라스미드 작제물, 대장균 숙주 계통 및 인듀서(pPX4019 경우에는 IPTG, pPX4020 경우에는 L-아라비노스(미국 미주리 세인트 루이스 소재의 Sigma Chemical Co.,))의 농도를 비교하는 정성 발현 연구가 모두 유사한 방법으로 수행되어 비교를 위한 일관된 백그라운드를 제공한다. 단일 콜로니 분리체를 플라스미드 선별(pPX4019, 15 ㎍/㎖ 카나마이신; 및 pPX4020, 15 ㎍/㎖ 클로람페니콜)을 위해 HySoyTM배지, 1% 글루코스 및 적당한 항생제에서, 37℃에서 성장시킨다. 이들 배양액을 HySoyTM1% 글리세롤 및 항생제로 OD600= 0.5까지 희석하고, OD600= 2-4까지 37℃에서 성장시키며 유도한다. OD600= 1.0에 상당하는 샘플을 유도 직전, 감염 2시간 및 18시간 후에 취한다. 이러한 샘플을 원심분리하여 세포 펠렛을 150 ㎕ SDS-PAGE 로딩 완충액(미국 매사추세츠 나틱 소재의 ISS)에 재현탁한다. 레인마다 샘플 15 ㎕가 로딩된 쿠마시 블루 염색된 15% SDS-PAGE 겔을 비교한다.
플라스미드 pPX4019로부터 지질화 rP6을 발현하는 데 사용된 대장균 숙주 세포 계통:
플라스미드 pPX4020으로부터 지질화 rP6을 발현하는 데 사용된 대장균 숙주 세포 계통:
L-rP6을 발현하는 대장균 BLR(pPX4020)의 성장
지질화 rP6을 발현하는 재조합 대장균 세포가 후술된 것처럼 발효조에서 성장한다. 하기 물질을 함유하는 성장 배지가 준비되고 발효조 경우에는 현장에서, 플라스크 성장 경우에는 오토클레이빙으로 멸균된다.
용액 A.
| 물질 | g/ℓ* |
| 칼륨 포스페이트, 일염기성 | 3.0 |
| 칼륨 포스페이트, 이염기성 | 7.0 |
| 암모늄 설페이트 | 1.0 |
| 나트륨 시트레이트 2가 | 1.0 |
| 제 1 철 설페이트, 7가 | 0.09 |
| 글리세롤(첨가하기 전에 플라스크 배지 제거) | 5 ㎖/ℓ |
| 나트륨 설페이트 | 0.58 |
| 1000X 미량 미네랄 용액(하기 참조) | 1 ㎖/ℓ |
| pH 조절하지 않음 - 오토클레이브 | |
| * 달리 명시하지 않는 한 |
| 1000X 미량 미네랄 용액 | g/100 ㎖ |
| 아연 설페이트, 7가 | 3.0 |
| 구리 설페이트, 5가 | 0.9 |
| 망간 설페이트, 1가 | 0.42 |
| 코발트 클로라이드, 6가 | 0.06 |
| 몰리브덴산 | 0.15 |
예비-접종 공급 용액: MCG
| 성분 | g/ℓ |
| 글루코스 | 500 |
| 마그네슘 설페이트, 7가 | 11 |
| 칼슘 클로라이드 | 0.83 |
EDTA 용액
| 성분 | g/ℓ |
| EDTA | 186.15 |
용액 A 및 미네랄 용액을 함유하는 멸균 배지를 진탕 플라스크로 분획화하고 배지 리터당 MCG 20 ㎖를 첨가한다. 클로람페니콜을 50 ㎍/㎖까지 첨가한다. 개시배양액에 동결 스톡으로부터의 대장균 BLR(pPX4020) 200-300 ㎕를 접종한다. 세포를 16시간 동안 통기시키면서 30℃에서 성장시킨다. 상기처럼 보충된, 성장 배지를 함유하는 10 리터 발효조에 대략 0.2의 OD600까지 상기의 배양액을 접종한다.
발효조 조절 파라미터는 하기와 같이 세팅되었다:
| 온도 | 36℃ |
| pH = | 7.0 +/- 0.1 |
| D.O. = | 교반에 의해 20 내지 50% 및 순수 산소 |
| 공기 및 산소 유동 = | 로타미터로 20% |
| 소포제 | 필요시 한 방울 |
| 역압 | 0.5 bar |
하기의 용액이 시행 파라미터의 조절을 위해 사용되었고 사용하기에 앞서 멸균되었다:
필요시 발포 조절을 위해 PPG-2000-200 ㎖, 성장 중 pH 조절을 위해 40% 암모늄 하이드록사이드 1 ℓ, 글루코스 고갈로 인해 pH가 상승하기 시작하면 계속 성장시키기 위해 50% 글루코스 1 ℓ, 유도 중 pH 조절을 위해 4 N 아세트산 500 ㎖, 멸균 여과된 25% 아라비노스 용액 (250 g/ℓ) + 1% 글리세롤 250 ㎖(예비-오토클레이빙). 아라비노스/글리세롤 용액은 글루코스 고갈로 인해 pH가 상승하기 시작하면 단백질의 생산을 유도하기 위해 최종 글루코스 첨가 후에 사용된다. 아라비노스 용액은 오토클레이빙 글리세롤 스톡의 첨가에 앞서 여과 멸균된다. 용액은 10 ℓ발효를 위해 글리세롤 100 ㎖ 및 25% 아라비노스 용액 400 ㎖를 첨가함으로써 제조된다. 최종 발효조 농축물은 아라비노스 10 g/ℓ및 글리세롤 10 ㎖/ℓ를 함유한다.
발효조에 접종한 후에, 염기(나트륨 하이드록사이드)를 필요시 소포제(PPG-2000)와 함께, pH 조절을 위해 필요시 첨가한다. 순수한 산소는 800 rpm으로 공급된다. pH가 7.0 이상으로 상승하면, 50% 글루코스 900 ㎖를 배양액에 공급한다. pH가 7.1 이상이 되면, 추가의 50% 글루코스 용액 200 ㎖를 첨가한다. 이러한 조건은 대략 50의 OD600에 도달할 때까지 계속된다.
대략 50의 OD600에 도달한 후에, pH가 다시 7.0 이상으로 상승하면, 아라비노스/글리세롤 용액 500 ㎖를 첨가하여 LrP6의 발현을 유도한다. 이 시점에서, 산이 추가의 pH 조절을 위해 사용된다. 접종이 유도-후 3시간 동안 계속되고, 이어서 배양액을 500 mM EDTA 용액(pH 8)을 리터당 10 ㎖ 첨가한 후에 수확한다. 배양 액체배지를 지질화 rP6을 정제할 때까지 4℃에서 저장한다.
실시예 4
감별 세제 막 추출에 의한 지질화 rP6의 뱃치 규모 분석 정제
pPX4020으로부터 발현된 지질화 rP6의 뱃치가 후속 실험에 이용되고, 하기와 같이 감별 세제 막 추출에 의해 정제된다:
1) 대장균 막 분획의 분리: 발효로 수득된 동결 박테리아 세포 펠렛을 해동하여 동결 세포 펠렛 중량의 5배에 상당하는 용적의 완충액으로 10 mM HEPES-NaOH, pH 7.4, 1 mM Na2EDTA에 현탁시킨다. 세포 현탁액을 Microfluidics(미국 매사추세츠 소재의 Newton) 110-Y 마이크로유동화기로 균질화하여 세포를 용해시킨다. 막은 분별 원심분리(1시간 동안 300,000 ×g)로 세포 용해물로부터 수득된다. 막을 용해시키기 위해 사용된 완충액의 동일한 용적으로 2회 세척한 다음, 펠렛으로 동결한다.
2) 대장균 막으로부터 지질화 rP6의 가용화: 지질화 P6이 Zlotnick et al(33) 및 Green et al(22)에 의해 설명된 것과 유사한 감별 세제 추출을 사용하면 대장균으로부터 가용화된다. 모든 추출은 달리 명시되지 않는 한 실온에서 30분간 수행된다. 모든 원심분리는 달리 명시되지 않는 한 Beckman 45Ti 로토를 42,000 rpm으로 1시간 동안 10℃로 조절된 로토의 온도에서 사용하여 수행된다. 대장균 막을 10 mM HEPES-NaOH, pH 7.4, 1 mM MgCl2에 현탁시키고 1%(w/v)의 최종 농도로 TritonTMX-100(미국 캘리포니아 샌디에고 소재의 Calbiochem-Novabiochem International)으로 2회 추출하여 내막 성분을 제거한다. 생성된 외막 펠렛을 50 mM TrisTMHCl, pH 8, 5 mM Na2EDTA(지질화 rP6의 가용화에 앞서 펠렛을 후속 현탁시키는 데도 사용)에 현탁시킨다. 이어서 외막을 1% ZwittergentTM3-14로 2회; 1% ZwittergentTM3-14와 0.5 M NaCl로 2회; 1% N-라우릴 사르코신, Na 염으로 2회; 1% ZwittergentTM3-14로 연속 추출한다. 이러한 추출 후에 수득된 최종 펠렛을 45분간 55℃에서 간헐적으로 혼합하면서 10 mM TrisTMHCl, pH 8, 1 mM Na2EDTA 중의 0.2% ZwittergentTM3-12로 추출한 다음 적어도 1시간 동안 원심분리한다. 이 최종 추출로부터의 상등액은 지질화 rP6을 함유한다.
3) 지질화 rP6의 정제: 전술한 바와 같이 수득된 지질화 rP6-함유 추출물을DEAE 고속 유동 수지(미국 뉴저지 피스카타웨이 소재의 Amersham Pharmacia Biotech) 및 추출용으로 이용된 것과 동일한 낮은 이온 강도의 완충액을 이용하는 음이온 교환 크로마토그래피로 추가 정제한다. 가용화된 지질화 rP6은 대략 20 ㎖의 층 용적으로 DEAE 패스트 유동 컬럼에 흡착된다. 컬럼은 40분에 걸쳐서 0-0.2 M NaCl 구배로 전개된 다음, 20분간 0.2 M NaCl로 평등 용출한다. 지질화 rP6은 평등 상 발달 중에 용출된다. 다른 단백질 대부분이 컬럼에 흡착된 상태로 있고 1 M NaCl로 후에 탈착된다. 대략 100 mg이 세포 200 g으로부터 정제된다.
4) SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의한 정제된 지질화 rP6의 특징규명: 정제된 지질화 rP6의 동질성은 Laemmli 완충 시스템에서 SDS-PAGE에 이어서, 염색된 겔의 레이저 농도계로 평가된다. 조 추출물과 15% SDS-PAGE 겔 상에서 음이온 교환 정제된 풀 모두로부터 LrP6 대략 10 ㎍이 분석된다(53). 겔은 쿠마시 블루로 염색되고 레이저 농도계로 스캐닝된다. 쿠마시 염색된 겔의 레이저 농도계(도 2A, 레인 2)는 풀링 음이온 교환 분획에서 98% 이상의 동질성을 가지는 단일 피크를 나타내는데, 이는 지질화 rP6이 거의 동일한 정도로 정제되었음을 의미한다. 이러한 샘플 중의 지질화된 rP6의 확인은 동질성을 측정하기 위해 사용된 것과 동일한 샘플과 대장균의 관련 단백질과는 반응하지 않는, 헤모필루스 인플루엔자 P6에 대해 특이적인 단일클론 항체의 웨스턴 블롯 반응에 의해 입증된다(데이타 비도시). 웨스턴 블롯 분석의 결과는 도 2B에 나타나 있다. 지질화 rP6 밴드는 조 추출물(레인 1) 또는 풀링 분획(레인 2)에서 P6-특이적 단일클론 항체와 반응성인 유일한 밴드이다. 이는 정제된 단백질이 실제로, P6임을 의미한다. 분해 산물은 관찰되지 않았다.
실시예 5
감별 세제 막 추출을 사용하는 지질화 rP6의 대규모 정제
지질화 rP6을 발현하는 대장균 세포의 발효 액체배지를 10 mM EDTA로 조절하고 균질화 전에 10% 습량 세포/용적 이하로 희석한다. 이어서 세포를 고압 마이크로유동화기로 용해시키고 교차-유동 막 여과 기구를 사용하여 일련의 완충액으로 실온에서 정용여과한다. 막을 통한 가용화 단백질의 효율적인 물질 수송을 허용하기 위한 최소 막 면적은 대략 0.002 ㎡/g 습량 세포인 것으로 측정되었다. 대략 막의 1000 kD 분자량 컷-오프 등급 이하 크기의 가용화 단백질이 침투를 통해 통과하고, 반면 더 큰 분자 및 비가용화 단백질은 유지된다. 정용여과 단계의 순서는 하기와 같다:
(1) 용해된 발효 액체배지를 리텐테이트 용적의 3배에 상당하는 용적으로 10 mM Hepes/1 mM EDTA/pH 8.0(용해 완충액)으로 정용여과하여 침투를 통해 세포내 및 세포외 오염물을 제거한다.
(2) 용해물을 10 mM Hepes/1 mM MgCl2/0.2% TritonTMX-100으로 3회 정용여과하여 내막 단백질을 가용화하고 제거한다. Mg++이온은 외막을 안정화시켜, 외막 단백질은 TritonTMX-100의 존재하에 가용화되지 않는다.
(3) 용해물을 50 mM TrisTM/5 mM EDTA/0.2% ZwittergentTM3-14로 3회 정용여과하여 외막 단백질(지질화 rP6 제외)을 가용화하고 제거한다. EDTA는 단계 (2)로부터 Mg++이온을 격리하고, 단백질 가수분해를 방지하도록 소용된다.
(4) 용해물을 50 mM TrisTM/5 mM EDTA/0.5 M NaCl/0.2% ZwittergentTM3-14로 3회 정용여과하여 부가의 단백질을 가용화하고 제거한다. NaCl을 이 단계에서 완충액에 첨가하여 막 단백질과 막 간의 이온 상호반응을 파괴한다. 이 단계는 지질화 rP6이 PAL이기 때문에 수행되고, 염은 막/외막 단백질 복합체로부터 막-결합 단백질(지질화 rP6 제외)을 제거하도록 소용된다. 정용여과를 50 mM TrisTM/5 mM EDTA의 3 리텐테이트 용적으로 계속하여 리텐테이트 중의 ZwittergentTM농축물을 제거한다.
(5) 용해물을 50 mM TrisTM/5 mM EDTA/0.2% 사르코실로 3회 정용여과하여 부가의 막 결합 단백질(지질화 rP6 제외)을 제거한 다음 50 mM TrisTM/5 mM EDTA로 3회 정용여과하여 리텐테이트 중의 사르코실 농축물을 제거한다.
(6) 용해물을 10 mM 포스페이트/0.2% ZwittergentTM3-12로 3회 정용여과하여 부가의 막 결합 단백질(지질화 rP6 제외)을 제거한 다음, 10 mM 나트륨 포스페이트로 3회 정용여과하여 리텐테이트 중의 ZwittergentTM3-12 농축물을 제거한다.
(7) 용해물을 이의 원래 용적의 20%까지 농축한 다음 55℃에서 10 mM 나트륨 포스페이트/0.2% ZwittergentTM3-12로 3회 정용여과하여 침투를 통해 수집된, 지질화 rP6을 가용화한다. 농축 단계는 정용여과 전에 수행되어 투과물 중의 지질화 rP6 농도를 증가시킨다. 정용여과를 55℃에서 10 mM 나트륨 포스페이트 3 부가의 리텐테이트 용적으로 계속하여 리텐테이트 중의 ZwittergentTM3-12 농축물을 제거한다. 이 가열 단계는 (상기 단계 (4)에서처럼) 지질화 rP6이 PAL이기 때문에 수행되고, 가열은 막/막 단백질 복합체로부터 지질화 rP6을 제거하도록 소용된다. 최종적으로, 정용여과는 55℃에서 10 mM 나트륨 포스페이트의 3 리텐테이트 용적으로 마무리된다.
정용여과 단계 중에, 막횡단 압력은 대략 10 psi로 유지되고 교차 유동 속도는 대략 120-180 lmh로 유지된다. 모든 정용여과 과정은 지질화 rP6을 가용화시키기 위해 더 고온에서 시행되는, 최종 55℃ 추출 단계를 제외하고는, 실온에서 시행된다. 추출 과정을 위해 충분히 큰, 30 내지 50 lmh 범위의 침투 플럭스가 실용적이고 규모측정 가능하다.
추출 중에, 샘플을 SDS-PAGE에 의한 분석을 위해 다양한 시점에서 취하여 단백질의 추출에 끼치는 다양한 정용여과 단계의 영향을 평가한다. 샘플을 알콜을 첨가하여 침전시키고, 원심분리한 다음, SDS 샘플 제조 완충액에 원래 용적의 20%로 재가용화한다. 이러한 샘플 제조방법은 샘플을 농축하고 샘플 중의 TritonTMX-100 또는 ZwittergentTM3-12 농축물을 제거한다. TritonTMX-100 또는 ZwittergentTM3-12는 SDS의 샘플에의 결합을 방해하고 겔 상에서 밴드의 분해를 감소시킨다. 각 샘플 10 ㎕를 Novex 10% 아크릴아마이드 겔에 로딩하고 겔을 125 볼트에서 60-90분간러닝시킨다.
지질화 rP6의 추출 과정 중에 투과물 스트림으로부터 취한 샘플의 통상의 SDS-PAGE 분석은 도 2 및 3에 나타나 있다. 지질화 rP6은 이들 겔에 15 킬로달톤(kD)으로 러닝된다. 겔은 약간 오염된 단백질이 용해 완충액 및 각종 세제를 함유하는 완충액으로의 정용여과 중에 제거되었음을 보여준다. 이러한 정용여과 단계 중에는 지질화 rP6이 매우 약간 손실된다. 55℃에서의 최종 ZwittergentTM3-12 정용여과 단계 중에, 지질화 rP6은 부분적으로 정제된 상태로 추출된다. 55℃에서의 제 2 ZwittergentTM3-12 정용여과 단계 후반에, 매우 적은 지질화 rP6이 투과물 스트림에 존재한다. 이는 가용화된 지질화 rP6 대부분이 침투를 통해 회수되었음을 설명해준다. 다른 실험이 매우 적은 지질화 rP6이 정용여과 과정의 완료 후에도 리텐테이트에 불용성 상태로 있음을 보여준다. ZwittergentTM3-12/55℃ 추출물의 15 kD 밴드는 웨스턴 분석에 의해 지질화 rP6인 것으로 보여진다(데이타 비도시).
지질화 rP6의 가용화에서 ZwittergentTM3-12의 사용은 지질화 rP6 외에 각종 단백질을 함유하는 추출물을 초래한다. 이 추출물의 동질성은 대략 78%의 지질화 rP6인 것으로 측정되었다(도 2, 패널 A, 레인 1). 이것이 초기 가용화와 매우 동질하지만, 가능하면, 이러한 대장균 단백질로부터 LrP6을 분리하는 것이 바람직하다. 이는 실시예 6에 설명된 것처럼 수행된다.
실시예 6
음이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제된 지질화 rP6의 추가 정제
음이온 교환 크로마토그래피가 실시예 5에 설명된 지질화 rP6을 추가로 정제하기 위해 사용되는데, 그 이유는 이것이 비-지질화 rP6을 정제하는 데 성공적으로 사용되었기 때문이다. 지질화 rP6은 통상적으로 0.1 M NaCl로 용출되는, rP6보다 더 강력하게 DEAE 수지에 흡착된다. 0.2% ZwittergentTM중의 지질화 rP6은 탈착이 일어나기 전에 완충액 중의 0.2 M NaCl을 필요로 한다. 대장균 단백질은 지질화 rP6이 용출된 후까지 음이온 교환 수지(DEAE)에 흡착되어 있다.
0.2% ZwittergentTM3-12로 추출되고 정제된 지질화 rP6의 동질성 및 본성이 도 2에 나타나 있다. 정제된 지질화 rP6의 동질성이 98% 이상인 것으로 측정되었다(도 2, 패널 A, 레인 2).
실시예 7
MALDI-TOF 질량 분광 분석에 의한 분자량 측정
아라비노스 유도성 프로모터를 가지는 pPX4020으로부터 발현된 지질화 rP6의 정확한 분자량 측정이 Finnigan Mat LasermatTM2000 선형 질량 분석기(미국 캘리포니아 새너제이 소재의 Finnigan Mat, Ltd.,)를 사용하는 Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight(MALDI-TOF) 질량 분석계로 수행된다. LasermatTM은 샘플을 이온화하기 위해 매트릭스-보조 레이저 탈착(54) 기술을 사용하고 발생된 이온을 분석하기 위해 플라이트 시간을 사용한다. 샘플을 3,5-디메톡시-4-하이드록시-시남산(시나핀산)의 매트릭스에 매립하여 샘플의 이온화를 증가시킨다. 정제된 단백질 5-10 pmol을 함유하는 샘플 1 마이크로리터를 0.1%(v/v) 트리플루오로아세트산을 함유하는 70%(v/v) 수성 아세토니트릴에 용해된 매트릭스(10 mg/㎖) 1 ㎕와 혼합한다. 이 샘플과 매트릭스의 혼합물 1 마이크로리터를 샘플 슬라이드에 로딩하여, 건조시키고 레이저로부터의 UV선의 짧은 펄스를 조사한다. 단백질 샘플은 통상적으로 이 방법에서 비교적 간단한 스펙트럼을 발달시키는데, 그 이유는 생성된 단백질-관련 이온이 주로 하전된 상태이기 때문이다(z = +1[M+H]+및 z = +2[M+2H]2+). 분자량 12,230.9의 소 심장으로부터의 시토크롬 C(미국 미주리 세인트 루이스 소재의 Sigma Chemical Co.,)가 외부 눈금으로 사용된다.
사용된 샘플 중의 지질화 rP6의 분자량은 15,078인 것으로 측정되었다. 예상한 [M+H]+분자 이온 외에, 지질화 rP6의 [M+2H]2+분자 이온 또한 관찰되었다. 이의 N-말단에 트리팔미토일 시스테인 잔기를 함유하는 P6의 이론상의 분자량은 15,024이고 시그널 펩티다제 II에 의해 프로세싱되지 않은 P6의 예상 분자량은 16,016.66이며, 반면 시그널 펩티다제 II에 의해 절단된 비지질화 P6의 예상 분자량은 14,234.66이다. 따라서, 이러한 결과는 대장균에 의한 지질화 형태의 rP6의 발현과 일관된다.
실시예 8
아미노산 조성 분석
아미노산 분석을 위한 지질화 rP6의 샘플을 유리관에서 건조시킨 다음, 5% 페놀 및 1% 2-머캅토에탄올을 함유하는 6 N HCl 100 ㎕를 사용하여 진공하 110℃에서 22시간 동안 가수분해시킨다. 샘플을 진공하에서 후속 건조시킨 다음, 샘플 희석 완충액 Na-S(미국 캘리포니아 풀러톤 소재의 Beckman Instruments, Inc.,)에 재가용화시킨다. 아미노산 조성은 제조업자의 지시에 따라 3 단계 Na-시트레이트 구배를 사용하는 Beckman 모델 6300 아미노산 분석기(55)로 측정한다. 트레오닌 및 세린 잔기는 파괴에 대해서 보정되지 않았다. 시스테인 및 트립토판 잔기는 사용된 이 방법으로 측정되기 않기 때문에, 결과는 14,132.4(지질화 rP6이 Trp를 함유하지 않음)에 상당하는, 비지질화 rP6 - 시스테인의 이론상의 분자량을 기준으로 지질화 rP6 몰당 잔기 몰로 표시된다. 결과는 표 1에 나타나 있고 2회 측정의 평균을 나타낸다. 결과는 대장균에 의해 제거된 pal 유전자의 시그널 서열과 일치된다.
| 아미노산 | 실험상의 몰 잔기/몰 | 이론상의 성숙 몰 잔기/몰 | 이론상의 프로-펩타이드 몰 잔기/몰 |
| Asp+Asn | 16.6 | 17 | 18 |
| Thr | 6.6 | 7 | 7 |
| Ser | 7.0 | 6 | 8 |
| Glu+Gln | 12.5 | 12 | 12 |
| Pro | 2.8 | 3 | 3 |
| Gly | 16.9 | 16 | 17 |
| Ala | 18.9 | 21 | 26 |
| Val | 10.5 | 10 | 13 |
| Met | 0.2 | 0 | 1 |
| Ile | 2.9 | 3 | 3 |
| Leu | 8.4 | 9 | 12 |
| Tyr | 10.1 | 11 | 11 |
| Phe | 3.1 | 3 | 4 |
| His | 3.1 | 2 | 2 |
| Lys | 6.6 | 7 | 9 |
| Arg | 6.5 | 6 | 6 |
| Cys | ND | 1 | 1 |
| Trp | ND | 0 | 0 |
| ND = 측정되지 않음 |
실시예 9
아미노-말단 아미노산 서열 분석
아미노-말단 단백질 서열 분석이 온-라인 모델 120A PTH 분석기가 장치된 Applied Biosystems 모델 477A 단백질/펩타이드 서열분석기(미국 캘리포니아 포스터 시티 소재의 Applied Biosystems)를 사용하여 수행된다. 각 연속 아미노-말단의 절단 후에, 형성된 아닐리노티아졸리논 유도체가 64℃에서 20분간 25% 트리플루오로아세트산으로 처리함으로써 더욱 안정한 페닐티오하이단티온(PTH) 유도체로 변형된다. PTH 유도체가 분리되어 제조업자에 의해 개발된 변형된 두 용매 구배 시스템으로 Brownlee PTH C-18 컬럼(입자 크기 5 ㎛, 2.1 mm i.d. ×22 cm l,; AppliedBiosystems)을 사용하는 역상 HPLC에 의해 PTH 분석기로 확인된다(56).
지질화 rP6(400 pmol)이 아미노-말단 아미노산 서열 분석에 가해지면, 어떤 서열 데이타도 얻을 수 없다. 이는 아미노-말단 아미노산의 1급(또는 2급) 아미노 그룹이 서열분석 화학을 위해서는 이용할 수 없음을(즉, LrP6의 아미노-말단 잔기가 블로킹되었다) 설명해준다. 서열 데이타를 얻을 수 없는 것이 기기 고장으로 인한 것이 아님을 구체화하기 위해, 지질화 rP6 400 pmol과 베타-락토글로불린 200 pmol의 혼합물을 아미노-말단 서열 분석에 가하는 대조 실험을 후속 시행한다. 베타-락토글로불린의 아미노-말단 서열을 나타내는 단일 서열이 얻어졌는데, 이는 지질화 rP6의 아미노-말단 잔기가 본질적으로 블로킹되었음을 확인해준다.
실시예 10
비-지질화 rP6과 비교한 지질화 rP6의 면역원성
정제된 지질화 재조합 P6과 비-지질화 재조합 P6의 상대 면역원성(28)이 스위스-웹스터 마우스로 비교된다. 각 단백질 5 ㎍의 투여량을 각각 AlPO4100 ㎍과 혼합하고 3-O-탈아실 모노포스포릴 지질 A(MPLTM)(미국 몬태나 헤밀톤 소재의 Ribi Immunochemicals) 50 ㎍을 0, 4 및 6주 째에 피하로 마우스를 면역화시키는 데 사용한다. 혈액 샘플을 0, 4, 6 및 8주 째에 취한다. 다른 그룹의 마우스를 비-지질화 rP6 또는 지질화 rP6과 모락셀라 카타르할리스의 UspA2 단백질의 혼합물(49), 박테리아성 중이염의 원인이 되는 제제 및 재조합 지질화 rP4(50)로 면역화한다.이들 혼합물은 또한 상기의 AlPO4및 MPLTM으로 보조된다.
마우스로부터 수득된 항혈청을 P6, P4 또는 UspA2 단백질에 대한 항체에 대해 ELISA로 분석한다. ELISA 역가(22, 28)가 풀링 혈청 또는 각 동물에 대해 측정된 다음 기하 평균 역가(GMT)가 유도된다. 결과는 표 2 및 3에 나타나 있다.
| 면역원 | 항-P6 ELISA 역가: | |||
| 0주 6주 8주 | ||||
| rP6(비-지질화)5 ㎍ | GMT | 1,369 | 17,686 | |
| 풀 | <50 | 40,715 | 147,985 | |
| rP6(지질화) 5 ㎍ | GMT | 341,987 | 780,179 | |
| 풀 | <50 | 706,826 | 786,917 | |
| rP6(비-지질화), rP4, UspA 각각 5 ㎍ | GMT | 425 | 15,015 | |
| 풀 | <50 | 692 | 64,913 | |
| rP6(지질화), rP4, UspA 각각 5 ㎍ | GMT | 251,731 | 1,052,527 | |
| 풀 | <50 | 739,896 | 1,268,527 |
| 면역원 | 항-P4 ELISA 역가 | 항-UspA2 ELISA 역가 | |
| 0주 4주 | 0주 4주 | ||
| rP6(비-지질화), rP4, UspA 각각 5 ㎍ | GMT | 84,677 | 143,285 |
| 풀 | <50 189,980 | <50 247,003 | |
| rP6(지질화), rP4, UspA 각각 5 ㎍ | GMT | 136,412 | 257,751 |
| 풀 | <50 197,361 | <50 335,548 |
지질화 rP6만 MPLTM및 AlPO4보조제와 함께 투여되면 비-지질화 rP6보다 적어도 1 로그 이상 면역원성을 가진다. rP4 및 UspA2와 함께 투여하면, 항원성이 관찰되지 않았다. 실제로, 지질화 rP6에 대한 반응은 비-지질화 rP6에 대한 반응보다 대략 1.5 로그 이상까지 증가한다.
UspA2 및 rP4 항원에 대한 면역반응의 분석은 지질화 rP6의 첨가가 비-지질화 rP6의 첨가와 비교하여 이들 항원에 대한 면역반응을 변화시키지 않음을 보여준다. 항원은 지질화 rP4 및 UspA2가 함께 혼합되었을 때 나타나는 정상 면역반응에도 영향을 끼치지 않는다. 이는 이들 항원의 상용성을 입증한다.
실시예 11
마우스 항혈청의 살균성 활성
지질화 rP6 및 지질화 rP6/rP4 혼합물에 대한 항혈청의 생물학적 활성이 시험관내 살균성 분석을 사용하여 입증된다. 이 분석은 표적으로서 유형 분류 불가한 에이치. 인플루엔자 계통 P861454를 사용하여 이미 설명된 것처럼(22, 28) 수행된다. 결과는 표 4에 나타나 있다:
| 면역원 | 6주 혈청 8주 혈청 | |||
| BC 역가 | 시간(X) 백그라운드 | BC 역가 | 시간(X) 백그라운드 | |
| rP6 | 3,200 | 8X | 12,800 | 16X |
| L-rP6 | 3,200 | 4X | 12,800 | 16X |
| rP6, rP4, UspA2 | 3,200 | 4X | 6,400 | 8X |
| L-rP6, rP4, UspA2 | 3,200 | 4X | 12,800 | 16X |
이 결과는 지질화 rP6이 이 분석에서 생물학적으로 활성인 항체를 도출함을입증한다. 절대 역가가 지질화된 항혈청과 비-지질화 항혈청 간에 상이하지 않지만, 이는 이 분석 시스템에서 최고 살균성인 항혈청 때문일 수 있고, 특히 예비면역 혈청이 이 분석에서 사용된 보완 공급원으로 높은 비특이적 사멸 정도를 보이기 때문이다. 지질화 rP6/rP4 혼합물 또한 비-지질화 rP6/rP4 혼합물로 얻어지는 것에 상당하는 역가로 살균성 항체를 도출한다. 이 분석에서 항-rP4 항체와 항-rP6 항체 간의 살균 활성을 구별할 수는 없지만, 헤모필루스 항원의 혼합물이 유형 분류 불가한 에이치. 인플루엔자에 대한 고 살균성 항혈청을 도출함이 자명하다.
관계서적
Claims (17)
- 프로모터가 그람-음성 박테리아의 펩티도글리칸-결합 지단백질(PAL)을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 분리되고 정제된 DNA 서열에 작동적으로 결합하고 DNA 서열이 프로모터의 조절하에, 지질화 형태로 발현되는, 엄격하게 조절되는 프로모터를 함유하는 플라스미드.
- 제 1 항에 있어서, PAL이 헤모필루스 인플루엔자(에이치. 인플루엔자)의 P6 단백질인 플라스미드.
- 제 2 항에 있어서, 프로모터가 아라비노스 유도성 프로모터 또는 T7 프로모터인 플라스미드.
- 제 3 항에 있어서, 프로모터가 아라비노스 유도성 프로모터인 플라스미드.
- 제 4 항에 있어서, 플라스미드가 pPX4020으로 명명되는 플라스미드.
- 제 3 항에 있어서, 프로모터가 T7 프로모터인 플라스미드.
- 제 6 항에 있어서, 플라스미드가 pPX4019로 명명되는 플라스미드.
- 제 1 항의 플라스미드로 형질전환, 형질도입 또는 형질감염된 박테리아 숙주 세포.
- 제 1 항의 플라스미드로 박테리아 숙주 세포를 형질전환, 형질도입 또는 형질감염시키고 숙주 세포에 의한 지질화 재조합 PAL의 발현을 허용하는 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 재조합 지질화 PAL의 생산방법.
- 제 9 항에 있어서, PAL이 에이치. 인플루엔자의 P6 단백질인 방법.
- 항원 조성물이 포유류 숙주에서 방어 면역반응을 도출하는, 지질화 재조합 PAL을 포함하는 항원 조성물.
- 제 11 항에 있어서, PAL이 에이치. 인플루엔자의 P6 단백질인 항원 조성물.
- 제 11 항에 있어서, 하나 이상의 희석제 또는 담체를 추가로 포함하는 항원 조성물.
- 제 11 항에 있어서, 적어도 하나의 보조제를 추가로 포함하는 항원 조성물.
- 제 14 항에 있어서, 보조제가 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, StimulonTMQS-21, 3-O-탈아실 모노포스포릴 지질 A, IL-12, 대장균의 열-불안정 독소 및 야생형 또는 돌연변이체 콜레라 독소 중 적어도 하나로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 항원 조성물.
- 제 11 항의 항원 조성물 면역원 양을 포유류 숙주에 투여하는 단계를 포함하는 그람-음성 박테리아에 대한 면역화 방법.
- 제 16 항에 있어서, 그람-음성 박테리아가 에이치. 인플루엔자이고 항원 조성물이 지질화 rP6을 포함하는 방법.
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