CN1071699A - 含脂细菌荚膜多糖转化为无脂多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
一种将含脂细菌荚膜多糖,如脂肪多核糖基核糖
醇磷酸盐、脂肪-PRP,转化为无脂,无内毒素的多
糖,如多核糖基核糖醇磷酸盐PRP的方法,通过将由
细菌,如流感嗜血杆菌b型的培养基中得到的含多
糖粉末溶解,由多糖中离解共价结合的脂肪酸并除去
脂类和内毒素。
Description
本发明由包括来自革兰氏阴性细菌的特定型荚膜多糖的细菌培养基中制备无脂的荚膜多糖,没有内毒素,不会遭到荚膜多糖的基本损失。该方法将具有共价结合的甘油二酯部分的荚膜多糖转化为无脂多糖。在本发明的优选方案中,脂多糖、LPS或内毒素也由荚膜多糖中除去,而共价脂已由荚膜多糖解离。
本发明的方案中,方法用于制备无脂多核糖基核糖醇磷酸酯,这里称为PRP,它是由致病的细菌流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)b型,也称为Hib,的培养基中产生的荚膜多糖。所产生的PRP是适于作为制备疫苗的组成,该疫苗用于诱导防止因Hib引起的疾病发展的免疫应答。由本发明,可以预见到,其它的具有类似共价脂的致病细菌,如大肠杆菌(E.coli)或脑膜炎双球菌(Neis-seria meningitidis)中的荚膜多糖,使用本文公开的报导,也可以按同样高产率进行生产。
致病性细菌,Hib,对许多疾病可应答,其中最重要的是细菌性脑膜炎和全身细菌性疾病,它主要发生在5岁以下的儿童中。目前,针对Hib的疫苗已由FDA许可使用于人类,参阅1991 physicians Desk Reference,pp 1476-1478(Merck & Co.Inc′s PedvaxHIB
)pp1174-1176(lederle′s Hib TITER)。
描述于美国专利US4695624和US4882317的方法提供了一种生产抗Hib的疫苗。在该方法中所用的PRP是由培养的流感嗜血杆菌b型中得来的,并由培养基分离部分多糖。然后将分离的PRP与由脑膜炎双球菌b的外膜蛋白络合物相结合,它作为PRP的免疫加强载体,而本身对幼儿是缺乏产生免疫性的。
现在涉及美国专利US4695624,将800升 b型流感嗜血杆菌发酵物浓缩(16栏24行)到377克湿膏体物。通过在有氧化钙的不同浓度的乙醇中的选择沉淀回收PRP。得到68克干产品(17栏第1行),下文称为苯酚前粉末。进一步的工作包括苯酚提取和乙醇沉淀,产生39克干产品(17栏,49行)然后最终以34.7克干产品结束(18栏14行)。这种材料下文称为苯酚后粉末。该苯酚后粉末可以结合或进行再纯化以除去内毒素。
内毒素是在以细菌衍生的免疫原接种时,哺乳动物内温度提高的主要原因。通过除去脂A的脂多糖,可以消除这种所谓的致热应答。下文认为与免疫原的内毒素、热原或LPS是同义的。为了达到这目的,上面所得苯酚后PRP产品可以进一步纯化,以致进行调节对热原的标准。在本发明研制以前,通过选择性乙醇分馏在苯酚后粉末中损失所存在的PRP约70%而达到目的。这包括通过加入足够浓度的乙醇以刚好开始沉淀,即在美国专利US5039610和U.S.S.N.595722中略述的所谓浊点而由苯酚后PRP中沉淀LPS。将乙醇加到浊点,这时在浊度方面达到约二倍的增加。再加入0.5~2%乙醇,至此得到一种废产品的沉淀,下文称为低切(low-cut),而无脂PRP留在溶液中。低切含有约70%PRP和基本全部LPS。
企图克服因除去内毒素的选择乙醇分馏所导致的PRP损失,美国专利US5019502方法的发明者研制了一种方法以除去LPS而基本不损失PRP。该方法包括将溶解的苯酚后粉末通过一增水性吸附步骤,或者按批量模式或按柱色层模式,而且最好使用一种结合内毒素而不结合多糖的非离子型树脂。
使用一种高度多孔的苯乙烯和二乙烯苯共聚体的树脂,例如HP20,果真可以基本上定量地除去全部内毒素而提供几乎定量产额的PRP。这种材料在下文称为HP20-后PRP。但是,由Hib产生的PRP的主要部分是呈共价脂肪-PRP。
由流感嗜血杆菌b型产生的PRP可能是脂肪-PRP,首先由Kuo等人[J.Bacteriol,163,769-773(1985)]所认识,其中流感嗜血杆菌b型是在加有放射性棕榈酸和/或放射性核糖的液体培养基中生长的。由培养基上清液纯化的多核糖基核糖醇磷酸脂含有放射性核糖和棕榈酸两种,它们在生物合成期间掺入PRP。表明磷脂酶A2(PLA2)处理可由PRP除去某些放射性棕榈酯,因而,破坏非共价结合的方法是不成功的。没有给出脂肪-PRP的结构,但是所列数据与早期文献中所报导的数据相一致,该文献提出了脑膜炎球菌A、B、C和大肠杆菌K92多糖的结构[Gotschlich等人,J.Biol.chem.256.8915-8921(1981)]。在本发明中,以特定的磷脂酶研究,揭示了脂肪-PRP的结构,它与下面详述所列出的一致。
与分子的非常大的多糖部分的占优势的阴离子性质相反,由于因共价类脂而在脂肪-PRP上具有较少的憎水性质,脂肪-PRP并不结合到US5019502发明中所用的憎水性树脂上。这样,由该方法得到的最终产品含有脂肪-PRP的主要部分以及无脂的PRP。除去这种脂肪-PRP,或者通过选择性乙醇分馏,它将损失约70%PRP,或者通过使用本文公开的方法,从而基本上按无脂PRP回收全部PRP。
因此,本发明的目的是提供一种方法,用于回收无脂荚膜多糖致使产生一种结合的产品,该产品与仅使用通过选择醇分馏所制得的无脂多糖部分所制备的结合物不可区别。本发明的另一目的是提供一种高产额PRP生产的方法,它包括将脂肪-PRP转化为无脂肪PRP,而不是弃去脂肪-PRP。另一目的是提供一种能重复PRP产量和一致性的生产方法,该PRP得自流感嗜血杆菌b型培养物,以保证用这样制得的PRP所生产的结合疫苗的一致性。本发明的其它优点和目的由以下完整的描述中可以更加明显。
用于由包括来自革兰氏阴性细菌的特定型荚膜多糖的细菌制备荚膜多糖的一种方法,它包括将具有共价接合到类脂的荚膜多糖转化成无脂的荚膜多糖并除去内毒素污染。在一具体方案中,通过处理粗制的或纯化的由流感嗜血杆菌b型培养基所得的PRP制剂而将脂肪-PRP转化为无脂肪PRP,通过用磷脂酶D,在含有约50%体积的有机酶活化剂、约0.3%去污剂和约5mM二价金属阳离子的缓冲液中,在约35℃和约中性PH值下离解PRP的共价脂约30分钟到约4小时,然后除去酶、残留的脂以及脂多糖。
图1,提出脂肪-PRP的结构。
图2,使用选择性醇分馏法所制备的PRP,与使用将脂肪PRP酶促转化为PRP,接着除酶和除LPS所制备的PRP的比较。
图3,用于将脂肪-PRP转化为无脂PRP和除内毒素的最佳方法。
本发明是一种方法,用于由细菌荚膜多糖离解共价结合的脂并除去脂和内毒素污染。可以使用化学或酶促方法以除去脂。具有共价结合脂的多糖的选择性乙醇分馏导致荚膜多糖馏份作为称为“低切”废产品而损失。通过有效地去除共价结合的脂,本方法避免了选择性醇分馏所遇到的荚膜多糖的损失,而提供了一种多糖产品,它可用于制备一种游离的或结合的多糖疫苗,以防止衍生多糖的病原体的感染。共价脂可以通过用例如羟胺处理而除去。由荚膜多糖离解共价脂的优选方法是酶促法。本发明的优选方案中,达到了高产额制备多核糖基核糖醇磷酸酯PRP(改进的PRP方法)。
本发明方法可以参考图1来理解。列出了脂肪-PRP的一种所推荐的结构,它取决于用限定特征的磷酯酶的研究。无脂PRP的结构与图1所示的一样,除了没有甘油二酯部分酯化到PRP重复单元的磷酸酯上以外。此外,在脂肪-PRP中存在的甘油已通过Dionex HPLC证实,存在的葡糖也已证实。
已知磷脂酶A2(PLA2)是在所指出的二甘油酯Sn-2位置上离解。当PRP与商购的PLA2(Sigma,Boehringer)制剂反应,释放的脂肪酸由气体色谱分析监测,注意到棕榈油酸降低[16∶1 cis9]但不是棕榈酸(16∶1)或肉豆蔻酸[14∶0],其全部是在脂肪-PRP中检测到的。
商购的磷脂酶B(Sigma)可以除去某些部分的棕榈酸和棕榈油酸,但不能用这种酶除去葡糖和甘油。此外,磷脂酶C(Sigma)的活性似乎阻断,因而在图1中葡糖的位置是确定的。商购磷脂酶D(Sigma,Genencor,Boehringer)除去全部脂肪酸,以及甘油和葡糖。然而,这些酶中没有一个最初可单独使用,并且在本方法选定以前没有一个酶可由PRP除去100%脂肪酸。本发明提供了一种最佳方法,只使用PLD,而达到完全除去脂。此外,也能使用PLD和PLA2或PLB的混合物而有利于除去共价脂。在本发明的一个具体方案中,在室温下结合使用磷脂酶A2和磷脂酶D可由脂肪-PRP上完全除去共价脂,然后将无脂PRP产品与免疫原的蛋白相对合,表明在提高强抗-PRP免疫应答中是有效的。
要求降低磷脂酶的必要量,因为这些酶是昂贵的,而且因为减少酶量便于由产品中除酶。使用700U磷脂酶A(得自猪)和20U磷脂酶D[得自暗褐色链霉菌(Streptomyces chromofuscus)]和30%丁基醚以及0.1%有效酶刺激物的DOC一起,可以达到由酚苯后粉末PRP中完全去除脂肪酸。文献中已描述过,磷脂酶和类似的酶对反应添加剂如去污剂和有机溶剂是十分敏感的。特别是,Kates表明,质粒磷脂酶C因加入乙醚-甲醇混合物而大受刺激,认为它们可协同地相互作用以使基质和酶相在加强的酶活性区并生[Can.J.Biochem and physio,35,127,(1957)]我们估计,类似的机理可以控制磷脂酶活性,因而研究了醚-甲醇混合物在酶实施上的效果。
丁基醚/甲醇混合物证明是一种很有效的磷脂酶反应的活化剂。包括将苯酚后PRP粉末友有5比1(v/v)的丁基醚和甲醇混合物时与PLA2和PLD反应,接着用HP20树脂处理以降低内毒素的一种方案导致由PRP完全除去脂。再者,酶的必需量,对PLA降低到3.5倍(由700U到200U),对磷脂D降低1倍(由20U降为10U)。在酶反应后使用HP20处理的另一优点是憎水树脂吸附反应混合物中的一些酶,这样减轻下面酶清除的负担。
由于要求制备一种人类施用的疫苗,希望使用尽可能少的酶要完全除去酶或尽可能地完全,并使用一种由不可能由哺乳动物病毒污染的源产生的酶。不希望使用猪PLA2,因为有可能增加不希望的免疫应答危险性,并且可能在哺乳动物衍生的产品中有目前不可检测的病毒。在上述同样反应条件下测定了由紫色链霉菌(Streptomy-ces violaceoruber)分离的PLA2。使用由链霉菌制得的磷脂酶结合物可成功地去除脂。进行了其它实验以测定对100mgPRP所必要的最少酶量是:对链霉菌PLA2是100~200U之间,而对PLD是2~10U之间。
应注意到,称为磷脂酶A2、D或B所存在的酶有许多不同的源。蛇毒是PLA2的富源,而PLD可以由卷心菜、花生和链霉菌中分离。特定源的选择是极大地决定于上述关系和商购酶制剂的比活性。另外,其它脂酶可能呈现足够的二代类磷脂酶(secondary phospholi-pase-like)活性使得它可用于我们的应用中。用于本目的的这些其它脂酶,在本发明中是显然的。
或使用磷脂酶的结合物或只使用磷脂酶D的酶促方法,苯酚后由粉末PRP中分裂脂已表明是良好的重现性并能适应流感嗜血杆菌的苯酚和乙基汞硫代水杨酸钠失活的培养基之间的脂含量的变化。另外,当酶促反应后进行HP20处理,则热原大大降低,由苯酚后PRP起始粉末的60EU/mcg降为酶促反应后的约10EU/mcg并在HP20处理后降到0.0125EU/mcg。这似乎是一个优良的方案,保证脂的完全去除,大大降低LPS和高的PRP回收。当然,其它的方案也是可能的,例如在PRP分离方法前的脂酶掺杂,例如在发酵液体培养基中或在在灭菌后即时掺杂。其中各种步骤进行次序的变换当然也落在本发明内。
本发明的优选方案中,在最佳反应下达到由脂肪-PRP中酶促除去全部脂,它包括将PRP与得自暗褐色链酶菌的单独磷脂酶D,在其对PRP约0.3%(重量)的磷脂酶D的比例下进行反应。这种酶通过Im-amura和Horiuti[J.Biochem 85,79-95(1979)]方法纯化到均一性,并通过Genencor International商购,但如上所指出,也可使用其它的PLD源。
对PLD的最佳条件,包括加入Triton X-100,它似乎是一种比脱氧胆酸盐(DOC)更有效的酶活化剂。另外酶的活性对C2+ a量也是敏感的。为增加酶活性,加入4.5mM Triton X-100和C2+ a(5mM),虽然其它二价金属阳离子,如镁,也可以使用。在反应混合物中加入钙,提出了有必要使用非磷酸盐的缓冲剂,如PH7.4的10mM Tris.加到反应混合物的有机溶剂量增加到50%v/v,以甲基-叔丁基醚代替丁基醚,它降低了安全关系。使用这些改变的酶反应条件并接着进行HP20处理,可以达到由苯酚前粉末PRP中完全除去脂,在2克上重复反应,每个是二个不同批的苯酚前粉末PRP,表明重现性和在苯酚前粉末PRP上PLD处理的有效性。通过Sepharose CL4B色谱法测定分子大小来检测无脂产品。产品的kd约为0.4~0.5,这对PRP免疫原性是合格的。当然在反应中也可以使用其它缓冲条件或类似的去污剂,这对本领域的技术人员是可以理解的。
改进的PRP方法表明在嗜血杆菌b结合疫苗(脑膜炎球菌蛋白结合物Meningococcal Protein Conjugate)制备装置中是三重的。按连续系列使用6个苯酚-失活流感嗜血杆菌的发酵批。发酵批要测试其培养基纯度、流感嗜血杆菌的失活以及PRP抗原含量,结果是全部满意。制备三个PRP制造批并以后用作制备三个大规模嗜血杆菌b配合疫苗(脑膜炎球菌蛋白结合物)的原料。每个都由二个发酵培养基开始三批PRP的产品回收率,约以3.5倍高于使用选择乙醇分馏的产率。
用改进方法制备的三批PRP,以后用于制备嗜血杆菌b配合疫苗(Haemophilus b Conjugate Vaccine)(脑膜炎球菌蛋白结合物)。进行测试所得的嗜血杆菌b多糖材料,嗜血杆菌b(PRP-OMPC)结合材料,以及嗜血杆菌b结合疫苗(脑膜炎球菌蛋白结合物)最后容器表明,这些材料合部与由选择性醇分馏方法制得的类似物料不可区别。
低切PRP是由选择性乙醇分馏得到的废沉淀(含有LPS,脂肪-PRP和损失的PRP),这是在美国专利US5039610中公开的PRP生产方法的最后一步。使用用于苯酚前粉末的同样改进反应条件,接着用HP20处理,基本上由低切粉末完全除去脂,它是有效的并具有大于70%PRP的产额。
反应混合物含有活化磷脂酶的有机溶剂,而且其量最好为反应物体积的约30%~60%之间。有机活化剂优选的是一种醚,如二乙醚或甲基-叔丁基醚。醚有利于与第二种有机溶剂如己烷、乙醇或甲醇相混合,其比例为醚对第二种有机溶剂的比例约为20∶1~5∶1之间,而优选的是醚对第二有机溶剂之比约为9∶1。在最优选的方案中将9份比二乙醚更少挥发的甲基-叔丁醚与约1份乙醇相混,因而处理更安全,将这种有机混合物加到PLD反应中使最终有机浓度约为50%。有机溶剂的条件是要有助于使脂基质和酶呈极大的接触。
此外,有机酶活化剂的条件,要求提供一种去污剂如脱氧胆酸盐或Triton x-100,或一种类似的去污剂,以有助于打碎脂类的聚集体,并加强酶-基质相互反应。去污剂浓度可以是约0.1~0.4%之间。加入约0.3% Triton x-100,发现是十分满意的。
对于脂肪-荚膜多糖,要提供足量磷脂酶D以在适合的时间期内达到共价脂的完全水解。对于PRP、PLD的量为约0.01~10%,优选的为约0.1~0.4%是合适的。当然,加入较少量的酶需要更长的反应时间,而加入更多量的酶将缩短反应时间。
在反应中要保持全部反应相的搅拌以保证相互接触,其中约0.1~0.4%(重量)PLD,约0.1~约10mM二价金属阳离子,如CaCl2,在适宜于上述试剂的缓冲液中,如Tris,PH约7.0~8.0之间,温度约20℃~45℃之间,优选为30~40℃之间,可以在约30分钟-4小时的反应时间内由脂肪-PRP上完全除去共价脂肪酸。
发现上述反应条件十分适合于无共价脂的PRP制备,以十分不同纯度的PRP制剂开始。因而,苯酚前粉末、苯酚后粉末以及HP20后产品都可以在这些条件下处理,并注意到无共价脂的PRP的一致性生产。
在给定制剂中将脂肪-PRP再转化为无脂PRP,在PRP制剂中现在所存在磷脂酶可以通过蛋白酶的苯酚提取而除去。为保证完全除去,苯酚萃取最好至少重复一次到约4次提取。这种处理不仅除去加入的酶,也除去任何残留的蛋白污染而不干扰下一步的结合或在疫苗受体中的不提供不欢迎的免疫应答。
酶促处理PRP而生产无共价脂肪酸的PRP,它也由LPS离解了某些脂肪酸。因而酶促处理的结果使内毒素降低约三倍。但是这降低的水平往往不足以满足致热性的特点,需要另一步以骤以消除残余的LPS。现有技术中已知的任何许多方法,包括选择性乙醇分馏,憎水吸附或其它方法,在美国专利US5019502提供的说明书中都进行了研讨,这些都可用于进一步除去内毒素。在本发明使用的树脂包括但不限于Borate Avidgel(Amicon),Amberlite XAD和Amberch-rome(Rohm & Haas),Octyl Cellulese(Phoenix Chem),Silica C8(Baker),SP和HP系列树脂(如SP207、HP20、HP50)(Mitsubishi Chem)。在这些树脂中,优选的是HP20或HP50,因为它们具有降低脂多糖、易于使用、可达性、价低以及其避免结合到多糖的倾向。优选的是在使用前用无热原的水洗涤树脂。更优选的是在使用酸前用酸溶液、碱溶液或一种极性溶剂(如乙醇或甲醇)洗涤树脂,然后用无热原水洗涤,最后用含有3%柠檬酸钠和0.5%脱氧胆酸钠预平衡。同样,多糖最好溶于含有约3%柠檬酸钠和约0.5%脱氧胆酸钠的缓冲液中,然后用按上述制备的憎水树脂进行处理。加入约25mM TrisPH8.0也是有助于阻止PH值波动。
含有共价脂的荚膜多糖可以在除内毒素之前或之后转化为游离多糖。在本发明的方案中,将自含有多核糖基核糖醇磷酯酯、脂多糖和各种脂和蛋白的流感嗜血糖菌b的发酵液体培养基中制得的粉末溶于10mM Tris、5mM、CaCl2、4.5mM Triton X-100、PH7.4的溶液中并加入9∶1的叔丁基醚∶乙醇的混合物至50%浓度。加入相对于PRP的约0.3%(重量)的由暗褐色链霉菌制得的磷脂酶D,在恒定搅拌下35℃,进行离解脂约3小时。反应产物用苯酚提取4次以除去蛋白污染物包括加入的酶,而得到苯酚后样品。
然后将苯酚后样品在碱性PH下溶于去污剂/螯合剂的混合物中。加入用同样缓冲液预处理过的HP20树脂珠并在一轨道振荡器中与PRP溶液在室温下混合数小时。通过过滤由溶液中除去树脂珠,并渗析过滤(diafilter)滤液以除去去污剂和螯合剂。回收滞留物并加入氯化钙。PRP用95%乙醇由溶液中沉淀。离心沉淀,并将沉淀用乙醇和丙酮研制。真空干燥所得产品。
使用憎水树脂珠的方法导致内毒素沾污量低并没有明显损失PRP。由这处理内毒素降低量一般在原料和最终粉末间为100~2100倍,它取决于最初内毒素的含量。PRP的产额一般至少75%,而有时高于原料的90%。
描述于“Guideline on validation of the LAL test as anend-product endotoxin test for human and animal parenteral drags.biological products and medical devices”(美国USDepartmeat of Health and humen Services 1987年12月)的Limulus Ameobocyte lysate(LAL)试验用于测定内毒素含量。
在本发明的优选方案中,通过在酶促处理后,使用上述HP20或其它合适的多孔苯乙烯和二乙烯基二苯共聚体或类似的憎水介质进行憎水吸附LPS而得到无内毒素和无脂的PRP。
按照任何许多已知方法,制得革兰氏阳性细菌的荚膜多糖,包括列于美国专利US4695624中对流感嗜血杆菌b型的那些,以及脑膜炎双球菌(脑膜炎球菌meningoeoccal)基团A、B、C、X、Y、W135和29E多糖的阴离子荚膜多糖,以及大肠杆菌K1,K12、K13、K29、K92和K100多糖类。但特别优选的多糖是选自含有Hib多糖基团的那些荚膜多糖,例如,描述于Rosenberg等人的J.Biol.Chem.236 PP2845-2849(1961)和Zamenhof等人的J.biol.chem.203 PP695-704(1953)中的那些。在本发明的一个方案中,一种由流感嗜血杆菌b型得的荚膜多糖是多核糖基核糖醇磷酸酯,它按照描述于美国专利US4695624的方法,通过病原体发酵而分离。通过加入1%乙基汞硫代水杨酸钠或加入约0.5%苯酚杀死病原体。离心除去细胞碎片,并通过超过滤浓缩粗制多糖而提供本文所称的粗制PRP。如果按照上述酶促方法在粗制PRP上进行酶促处理而将脂肪-PRP转化为无共价脂的PRP,则可以优化游离PRP的产额,并且在发酵介质或在任何其后的步骤中直接加入脂酶,则将是有利的。
例如,酶促处理可以延迟到通过任何以下处理的部分纯化后,或者在部分任何以下处理后,或在以下处理作相当变化以后:通过除去不溶于48%乙醇(v/v)的污染而生产苯酚前粉末,加入乙醇到61%以回收多糖,再溶解于约1M CaCl2并除去不溶于23%(v/v)乙醇的另一些污染物,接着在37%乙醇中回收PRP,最后在无水乙醇中研制或通过将苯酚前粉末溶于0.448M乙酸钠缓冲液中并用0.448M乙酸钠、PH6.9缓冲的72%苯酚提取约4次,接着通过渗析过滤以由水相中移去苯酚,接着通过加入CaCl2到约0.05M和加入乙醇到约67%而以沉淀状回收PRP,接着再溶解于0.05M CaCl2中除不溶于20%乙醇的污染物,并以37%乙醇不溶沉淀回收苯酚后PRP并在无水乙醇中研制,或者通过按上述用磷脂酶处理,除去蛋白和内毒素而可由“低-切”回收PRP;或者通过任何合适方法,优选通过按上述和在美国专利US5019502、US5039610和USSN595722中所述方法用HP20树脂处理而生产无内毒素PRP之后。
按照本发明方法制备的多糖,通过目前的分析方法,与通过选择性醇分馏法除去内毒素和含脂荚膜多糖所产生的多糖,在化学上是不可区别的。在下面表1中,比较了由PLD处理而生产的PRP物理化学特性与由选择性醇分馏法所生产的PRP的特性:
表 1PLD处理的PRP 醇处理的PRP
%通过GC的FA <0.012wt% <0.012WT%
KD 0.5 0.5
内毒素EU/μg 0.01EU/mg 0.6EU/mg
在PRR生产方法中进行了认真研究以优化每一步骤。这些研究结果提出了示于图3的方案。
A 优化酶反应条件:
进行了一系列的实验,以画出在由低切粉末除脂上,酶活性敏感性随甲基-叔丁基醚含量、Triton量、温度、基质浓度、酶量以及反应时间的变化,以确定在操作条件上的适宜限量。在每个情况下,所推荐的条件是在或近于脂肪酸降低的最大量。
B 优化HP20处理:
进行了研究以在HP20 LPS去除步骤期间保持较好的PH值控制以降低主要PRP的潜在水解。这些研究包括用2体积的DOC/柠檬酸钠溶液预平衡树脂,在与新鲜缓冲溶接触时期PH漂移后,使用Tris-缓冲的DOC/柠檬酸钠溶液并继续监测PH值。没有预平衡或柠檬酸钠/DOC溶液缓冲,在3小时的批量吸附期间,PH值漂移可高达9.2-9.5。在预平衡的情况下,PH向上漂移限制到8.8。通过预平衡树脂,并也用2.5mM Tris PH8.0的溶液缓冲,则PH漂移甚至更小,并可在整个批量吸附中保持很好控制PH在<8.5。也测试了HP20处理PRP的其它条件。GC脂肪酸分析以及LAL数据提出了最佳去除内毒素是在5-10mg PRP/mL而不是以前所用的2.5mg PRP/ml。结果也表明了含有0.5%DOC、3%柠檬酸盐和50mM Tris、PH8.0是最佳的。因此,全部以后的HP20处理都用树脂预平衡,使用50mM Tris、0.5% DOC、3%柠檬酸盐PH8的溶液、在PRP浓度为5-10mg/ml的条件下进行。
C 渗析过滤步骤的评定
HP20处理后,PRP产品是在一种含有Tris、DOC和柠檬酸盐的溶液中产品需要通过渗析过滤而变成一干净的水溶液。二个Pellic-on单元,一个有再生的纤维素而另一个有一聚碱膜,它们与一聚砜空心纤维滤筒一起测试HP20-处理过的PRP溶液的渗析过滤。再生的纤维膜表明比任一聚砜膜具有更大的DOC抑止速度;但在Pellicon聚砜膜大大地显示更大的流量。令人关注的流量和DOC抑制数据提出了一种Prostack单元比目前所用的空心纤维膜工艺更为有效。在比较了膜面积、工艺时间和所需成本,认为具有聚砜膜的Prostack单元,将提供最好的实施。
由上面的研究优化了一种改进的PRP生产方法,包括酶反应、4次苯酚提取、HP20处理、渗析过滤以及醇沉淀,而且分析了每个步骤以限定其这行界限。改进的方法综合于图3。
按照本方法制备的多糖是用于制备含有游离或结合的细菌荚膜多糖的疫苗。结合的多糖,特别是PRP-OMPC结合物,可用于幼儿以防止疾病,因此游离的PRP可以不诱导足够的免疫应答。使用按本发明制备的多糖制备结合物可以通过按照美国专利US4695624的报导进行完成,列入该文作为参考,并在此提出其实施例
本发明的公开在参考以下实施例下可进一步理解,不能认为实施例是限制本公开的范围。
实施例1
制备流感嗜血杆菌b型荚膜多糖发酵
A步:接种物和种子发育
将一管装冷冻干燥的流感嗜血杆菌b型(由Ross768培养,由State University of New York得到)悬浮在1ml灭菌的嗜血杆菌接种基(参阅下面)中并将这悬浮物展开在19个巧克力琼脂盘(cbocola-te Agar plates)(BBL)上。在37℃在烛状罐中保温20小时后,在每个盘上的生长物再悬浮在1-2ml嗜血杆菌接种基并收集在一起。
嗜血杆菌接种基☆
大豆胨 10g/l
NaCl 5g/l
NaH2PO43.1g/l
Na2HPO413.7g/l
K2HPO42.5g/l
蒸馏水 到体积
☆溶液的PH值调节到7.2±0.1(通常值为PH7.23)的目的值,而且溶液通过高压灭菌器在121℃灭菌25分钟。
B步:2升无盖Erlenmeyer烧瓶
由“A步”(上面)得到的1/3部分的再悬浮细菌用于接种到3个2升烧瓶中,每个烧瓶中含有约1.0升的完全嗜血杆菌种和生产基(参阅下面)。然后将烧瓶在37℃在200rpm的旋转振荡器上保温5小时,在培养期终止时,特征的OD660值为0.37。
完全的嗜血杆菌种及生产基
NaH2PO43.1g/l
Na2HPO413.7g/l
大豆胨 10.0g/l
酵母提取物的渗析过滤液(1) 10.0ml/l
K2HPO42.5g/l
NaCl 5.0g/l
葡糖(2) 5.0g/l
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)(3) 2.0mg/l
氯化血红素(4) 5.0mg/l
盐和大豆胨是溶于少量热的无热原的水中并用另外的热的无热原水加到最终体积。然后将发酵器或烧瓶在121℃灭菌约25分钟,冷却后,在要接种前,将酵母提取物渗析过滤液(1)、葡糖(2)、NAD(3)和氯化血红素(4)无菌地加到烧瓶或发酵器中。
(1)酵母提取物渗析过滤液:将100克啤酒酵母提取物(Amber)溶于1升蒸馏水中并在有H10×50滤筒的Amicon DC-30空心纤维中进行超过滤,以除去分子量50000的分子。收集滤液并通过0.22m膜作为灭菌产物。
(2)葡萄糖制备成无菌的25%的玻璃-蒸馏水溶液。
(3)含有20mg/ml NAD的储备液,通过经一微孔滤器(0.22m)过滤而灭菌并在接种前才无菌地加入。
(4)氯化血红素3X储备液通过在10ml 0.1M NaOH中溶解200mg并且蒸馏的无菌的水调节体积到100ml而制备。溶液在121℃灭菌20分钟,并在接种前无菌地加到最终基质中。
C步:70升种子发酵器
3升“B步”的产品用于接种含有41.4升完全嗜血杆菌种和生产基质(按上述制备)以及17mlUCON B625防沫剂的70升发酵器中。PH值开始在7.4。
在37℃100rpm搅拌下保持发酵并用光密度(O.D)和PH测定监测,直到达到特征的O.DO.39为止(约5.5小时后)。
D步:800升生产发酵器
约40升“C步”产品用于接种一个含有570升生产基质(按上述制备)定标到必要的体积和72mlUCON LB625防沫剂的800升发酵器。
在37℃100rpm搅拌下保持发酵,约每2小时核对O.D和PH值,直到O.D在2小时期间是相同为止,在这时,中止发酵(12小时后特征的最后O.D.是0.54)
收集和失活
约600升批料通过收庥到一含有12升1%乙基汞硫代水杨酸钠的“死罐”而失活。
澄清
在4℃ 8小时失活后,批料在4英寸球形Sharples离心机中离心,流速调节到保持产品清彻(在1.3~3.0升/分之间变化)。离心(15000rpm)后,所得的上清液用于回收产品。
通过超过滤分离和浓缩
合并两生产发酵物的上清液并在一有10个(断流50000道尔顿)空心纤维滤筒(275英尺2膜面积)的Romicon超离心单元中,在2-8℃时浓缩,在约4.5小时后,1200升已浓缩到32.5升。弃去滤液。
48%和61%的乙醇沉淀
在32.5升Romicon滞留物中,在1小时期间,在4℃并搅拌下滴加30升95%乙醇直到乙醇的最终体积浓度为48%。混合物在4℃再搅拌2小时,以确保完全沉淀,通过一单元的4英寸Sharples离心机,按15000rpm下收集上清液(流速=0.27升/分)。弃去不溶沉淀,在1小时期间加入20.8升95%乙醇,使清彻流体的乙醇浓度为61%。再搅拌混合物3小时以确保完全沉淀。
回收第二次沉淀
通过在4英寸Sharples离心机中,在15000rpm下离心(流速=0.62升/分)而收集所得的48%乙醇溶解-61%乙醇不溶的沉淀,并弃去61%乙醇上清液。粗产品产额是0.377kg湿膏体,称为粗制PRP。
氯化钙提取
将377g 61%乙醇不溶物,在-Daymox分散容器中,在2~8℃下,与6.5升冷的玻璃-蒸馏水相混合,在这混合物中,加入65升冷的2M CaCl2″H2O,在4℃下萃取混合物(最终浓度=1.0M CaCl2)15分钟。然后用2升1M CaCl2″H2O洗出容器,得到15升的最终体积。
23%乙醇沉淀
由上面得到的15升CaCl2提取物,在搅拌下在4℃时30分钟期间按滴加入4.48升95%乙醇,使乙醇浓度为23%,在再搅拌17小时后,通过-K2超离心机在4℃25000rpm下(流速-165ml/分)将混合物离心6.5小时。上清液通过筒子纱布而倾倒以除去类脂的浮游物并弃去不溶沉淀。
37%乙醇沉淀并收集粗制膏状产品
通过在搅拌下,在30分钟期间滴加4.33升95%乙醇而将23%乙醇-溶解的上清液体提高到37%乙醇。然后将混合物搅拌放置1小时,然后不搅拌放置14小时以保证完全沉淀。然后将所得混合物在一4英寸Sharples单元中在15000rpm(流速=0.24升/分)下离心以收集沉淀的粗制多糖(下文称为苯酚前粉末)。
研制
将由离心得到的沉淀转入含有1升无水酒精的1加仑Waring Blender,并在最高速度混合30秒钟。在30秒钟开和30秒钟关时继续混合直到得到一种硬的白色粉末,在有聚四氟乙烯滤盘的Buchner漏斗上收集粉末,并用2个1升无水乙醇和2个2升丙酮依次就地洗涤。然后在4℃真空中干燥物料24小时,得到68g(干重)的产品。
苯酚提取
由研制步骤得到的68克干物在12升0.488M乙酸钠,PH6.9中用一个Daymax分散容器再悬浮。用4.88升新配制的苯酚水溶液立即萃取乙酸钠溶液,苯酚溶液配制如下:将900ml 0.488M乙酸钠,PH6.9溶液在一20升压力瓶中加到一5磅瓶装苯酚(Mallinckrodt晶体)中并混合直到实现完全的溶解。每一次苯酚提取液都在K2Ultracentr-ifuge(Electronucleonies)中,在30000rpm下离心2个半小时,以破坏乳化。水不溶液按同一方式再用3.2升新配制的苯酚水溶液提取3次。苯酚相弃去。
渗折过滤
将由上面苯酚提取的水相(17.6升)用300升冷的玻璃蒸馏水稀释并在4℃时在-Amicon DC-30超滤装置上使用3个H10P10滤筒进行渗析过滤。冲洗Amicon单元并将冲洗液加到滞留物中使最后体积为17.5升。弃去渗析滤液。
67%乙醇沉淀
将0.438升2.0M CaCl2加到由上一步得到的渗析液17.5升中(最终的CaCl2浓度为0.05M),并在1小时期间,以滴加法将35.88升95%乙醇加入迅速搅拌的溶液中,使溶液成为67%乙醇。搅拌4小时后,在4℃再放置12小时,用虹吸吸去清彻的上清液,并在4英寸Sharples离心机(15000rpm)中在4℃下离心45分钟而收集沉淀。所得的多糖沉淀在1加仑的Waring混合器中,用30秒钟开30秒钟关的方法与2升无水乙醇研制,收集在带有一聚四氟乙烯滤盘的Buchner漏斗上,并用4次1升无水水乙醇就地洗涤,接着用2次1升丙酮洗涤。样品在真空中4℃下在一配衡盘中干燥20小时。得到39克干燥粉末(称为苯酚后粉末)。
实施例2
由苯酚杀死的流感嗜血杆菌b型中制备粗制PRP
按实施例1同样的发酵方法进行,除了用加入0.5%杀死病原体代替用1%乙基汞硫代水杨酸钠失活,并在苯酚中培养细胞1小时,接着转入一死罐至少1小时。然后按实施例1每步进行以得到苯酚前粉末。
实施例3
制备“低切”并由此回收无脂PRP
按照实例1生产苯酚后粉末,通过选择性醇分馏法除去内毒素以得到无内毒素的PRP制剂和一种含有PRP部分的内毒素,称为低-切。通过将苯酚后粉末以2.5g/l浓度溶解在0.05M CaCl2以提供一种对内毒素和PRP和二价抗衡离子。然后加醇到26%(v/v)。在温度平衡到2-4℃范围的恒值后,递增地加入醇直到PRP开始沉淀(浊点),通过浊度仪监测开始的浊度。
加入乙醇(95%)达到浊点,然后再加入1.9%。沉淀称为“低切”。加入乙醇后,溶液立即离心以除去低切沉淀。按本发明的方法再处理由沉淀得到的脂肪-PRP,以得到下面所述的无脂PRP。在上清液中加入醇使达到38%(v/v)。通过澄清和/或离心收集所要求的沉淀并干燥到最终的粉末。在这一步的在浊度上1.2-2.0%时回收经常是25~40%苯酚后粉末。发现残留的PRP是在低切中。
在完成选择性醇分馏步骤后所得的低-切材料含有沉淀的脂多糖和多核糖基核糖醇磷酸盐,通过将20g/l低切溶液在750ml缓冲液(10mM Tris,5mMCaCl2,4.5mM Triton X-100,PH7.4和等体积的9∶1甲基叔丁醚∶乙醇的混合物)中加入3000U磷脂酶D进行反应而进一步处理。反应进行2.5小时,接着以每2.6分水相产品用1分苯酚(72%在乙酸钠中的溶液)进行苯酚提取物质4次。
通过用0.5%脱氧胆酸钠和3%柠檬酸钠在PH8混合而由PLD处理过的低切中除去内毒素。按每克多糖加入30克HP20树脂(树脂在用前用无热原水洗涤)。将松散的树脂珠与溶液在一轨道振荡器上在4℃混合3小时。混合后,在不锈钢过滤漏斗中由溶液中除去细珠。然后将滤液在-Pellicon聚砜10,000分子量断流膜(1英尺2表面积)中,用10体积的无热原水进行渗析过滤,保持多糖的估计浓度为≤2.5mg/ml,以除去污剂和螯合剂。回收滞留物并加入2M氯化钙以使最终氯化钙浓度达到0.05M。用过量95%乙醇由溶液中沉淀多糖。沉淀在13000xg下离心30分钟,用无水乙醇和丙酮研制沉淀,然后真空干燥。最终的粉末转到一样品容器中并在-70℃冷冻。
用树脂处理的物料,表明有以下内毒素量、多糖量以及脂肪-PRP量(用GC分析脂肪酸)的降低:
表 2LAL测试值,EU/mcg
始料 240
终粉末 0.12
多糖
始料 15g
最终粉末 10.2g
脂肪酸(%)
始料 0.4
最终粉末 0.009
该方法始终得到的产品回收率为约68%,这是最终产品对原料的比例,并在其物理化学性质方面与选择性醇分馏法所得的PRP产品是不可区别的。
实施例4
苯酚前PRP粉末的脱脂
A、磷脂酶反应:
将苯酚前PRP粉末(20g,按实施例2或实施例3制备)溶于1.33升的10mM Tris.5mM CaCl2.4.5mM Triton X-100.PH7.4中。在溶解的PRP中加入1.33升9∶1的甲基叔丁醚∶乙醇的混合物。加入磷脂酶D(Genencor,总3000单元,比活度70μ/ml,15单元/100mg PRP)。在240rpm搅拌反应物并在35℃进行3小时。
反应后,有机和水相在25-35℃分离30分钟,保留下面的水相。有机相用0.266升水再提取并澄清30分钟,然后与第一次提取液合并而得到总水相体积1.560升。
苯酚(1.5公斤,用590ml 0.448M乙酸钠平衡,PH6.9)溶于暗中。水相按每2.6份水相苯酚后样品与1份苯酚之比提取四次。
B、HP20处理
HP20(Mitsubishi Kasei,300g)在1300ml 50mM Tris,30%柠檬酸钠,PH8.0(HP20平衡缓冲液)中预平衡。在1060ml的苯酸后样品中加入1060ml的100mM Tris,1%DOC,6%柠檬酸钠,PH8.0而得到总体积为2120ml。然后将这样品与预平衡过的HP20树脂在4℃摇动混合2小时。将树脂过滤进入柱,然后用200ml HP20平衡缓冲洗。然后将全部流过的HP20浓缩到1l,并对10升冷的无热原水进行渗析过滤。
C、产品回收
在1升样品中,加入25ml 2M CaCl2,通过在4℃离心30分钟而收集沉淀,然后用20ml 100%乙醇研制沉淀。过滤掉乙醇,用丙酮干燥PRP粉末而得到共9.6g去脂PRP,具有以下的特性:
表 3LAL(EU/mg) PRP 脂肪酸
始料 2400 20g 1.9%
终料 0.48 9.6g 0.005%
实施例5
制备磷脂酶A2和磷脂酶D处理过的PRP与脑膜炎双球菌B的OMPC的结合以及该结合物的免疫性
A、酶促处理
将HP20处理的苯酚后粉末(3g)溶于600ml磷酸盐缓冲液,PH7.1,0.1%脱氧胆酸盐,33%醚中,其浓度为5mg/ml PRP。加入磷脂酶A(猪的,70μ/ml PRP,比活度600U/mg)和磷脂酶D(暗褐色链霉菌,0.2μ/mg PRP,比活度70μ/mg)(两者都得自Boehringer mannheim,Inc)并将反应在搅拌下,25℃时,进行3小时。用600ml己烷提取反应产物,接着在20℃离心30分钟。弃去有机相,而将水相浓缩到300ml并对3000ml水进行渗析过滤。样品稀释到600ml,使其最终浓度为5mM CaCl2,加入乙醇到40%而沉淀PRP,得到2.6gPRP用作配合。
B、PLA2/PLD处理PRP的衍生物
将用PLA2和PLD按上述方法处理过的后-HP20PRP(1.9克)溶于57ml无菌水中。将二水草酸(0.31g)溶于15.5ml无菌水中并慢慢加入溶解的PRP。用40%四正丁基氢氧化铵(5ml)调节PH到PH5,接着加入1%四正丁基氢氧化铵(2ml),并用草酸溶液滴定使PH到6.98。然后过滤溶液,冲洗滤器,得到178ml PRP-Bu4N的总制剂体积。
在该溶液中加入67ml DMF并在一旋转式汽化器将体积降到68ml。再加入DMF(67ml)三次,每次使体积到67ml:羰基二咪唑(0.22g)溶于DMF并在N2气氛下慢慢加到PRP溶液中,使之老化35分钟。将1,4-丁二胺二氯化氢(BuA2)(15.96)溶于456ml无菌水中,加入50%NaOH 5ml,将PH调节到10.39。然后将BuA2慢慢加到PRP-CDZ中并保持在约12℃。
约5分钟后,加入68%磷酸(50ml),滴加5ml 68%磷酸调节PH到7.02。在这时体积为530ml。
在Amicon超过滤系统,用-10000MW断流器将样品浓缩到95ml。然后将样品对1520ml磷酸盐缓冲液PH7进行渗析过滤。用3×25ml磷酸盐缓冲液洗涤超滤系统,将缓冲洗液与PRP-BuA2滞留物合并,将总体积为102ml的硼酸钠(3.95% 31.8ml)加到PRP-BuA2中。
用2ml 25N NaOH调节PH到9.2。然后慢慢加入溴乙酰氯(1.71ml)同时用2.5N NaOH保持PH在9.2。用68%磷酸(0.5ml)调节PH到7.0。在Amicon超过滤系统中将PRP-BuA2-BrAc浓缩到95ml,接着对1520mlPH7的磷酸盐缓冲液进行渗析过滤,体积通过渗析过滤调节到38ml。用磷酸盐缓冲液洗涤系统并将洗液合并而得到79.5ml的PRP-BuA2-BrAc。
C、制备OMPC-SH
由脑膜炎双球菌b型得到的OMPC(1.16g)溶于116ml无菌水中,然后对600ml硼酸盐缓冲液进行渗析过滤,得到终体积为159ml。将EDTA(0.8g),二硫苏糖醇(DTT)(0.12g)溶于无菌的硼酸盐缓冲液中,然后加到溶解的蛋白质中。将N-乙酰基高半胱氨酸硫代内脂(1.03g)溶于无菌水中并加到蛋白、EDTA、DTT混合物中,使之反应22小时。
然后将硫醇化的蛋白浓缩到116ml后,对1440ml Ph8的磷酸盐缓冲液进行渗析过滤,接着浓缩到127ml的终体积。在这时蛋白样品中含有6.75mg/ml蛋白,而在Ellman样品中每毫克蛋白有0.3微摩尔SH。
D、衍生的PRP和OMPC-SH的结合
用2.5N NaOH调节PRP-BuA2-BrAc溶液的PH到7.9。将在上面B节制备的全部硫醇化的OMPC加到72ml PH调节过的PRP-BuA2-BrAc中,在N2气氛下进行结合19小时。
结合物浓缩到170ml,接着对1700ml pH7的磷酸盐缓冲液进行渗析过滤,再对1640ml PH8的磷酸盐缓冲液进行渗析过滤,产生终体积231ml的结合物。
在结合物上没有反应的溴乙酰基基团通过加入N-乙酰基半胱胺(0.95g在pH8的磷酸盐缓冲液中)而封闭,反应进行18小时。然后将封闭的结合物浓缩到170ml,并对2550mlTED缓冲液进行渗析过滤,使结合物老化过夜,对第二个2550ml TED进行渗析过滤,最后回收样品体积285ml。
在平行实验中,通过选择性醇分馏产生的2.31g PRP按上述结合而产生330ml结合物。二个结合物的物理化学性质的平行分析通过颗粒排阻色谱法、热原、PRP/蛋白、或免疫性分析都是不可区别的。
E、结合物在幼年罗猴中的免疫性
酶处理的无脂PRP结合疫苗,按照Vella和Ellis(Pediatric Res,29,10(1981))和Vella等人[Pediatrics Supplement 85,668(1990)]的测试方法在幼年罗猴中试验,表明是完全产生免疫性的。无脂的结合物表明与通过选择性醇分馏所制备的PRP制成的对照样品比较有类似的免疫性。在42小时后在两种水溶液制剂(15mcg)和氢氧化铝(1mcg)制剂中(表4和表5)。如表5所示含水酶处理的无脂疫苗对3个动物的GMT(几何平均滴度)为10.9mcg/ml。
表 4
“无脂”Hib结合物在幼罗猴中液体氢氧化铝吸附制剂的免疫性
Hib结合物 剂量 抗-PRP、mcg/ml(GMT)
mcg 0天 28天 42天
酶处理的无脂PRP 1 <0.1 27.4(3/3) 79.1(3/3)
由选择性醇分馏得 1 <0.1 10.9(3/3) 74.0(3/3)
的PRP
表 5
“无脂”Hib结合物和“HP20-处理”的结合物在幼罗猴中的免疫性
水性制剂
Hib结合物 剂量 抗-PRP cmg/ml(GMT)
mcg 0天 28天 42天
酶处理的无脂PRP 15 <0.1 0.4(0/3) 10.9(3/3)
选择性醇分馏的PRP 15 <0.1 0.9(1/3) 6.5(2/3)
()达到≥1.0mcg抗-PRP/ml(RIA)应答者的数目
实施例6
由“低切”回收无脂PRP
将低切(15g)溶于750ml缓冲液(10mM Tris、5mM CaCl2、4.5mM Triton X-100、PH7.4)。加入磷脂酶(20U Toyo Joso/100mg PRP,按70U/mg,3000单位)。加入甲基-叔丁基醚∶乙醇(9∶1)(750ml)混合物并以240rpm搅拌。使反应在35℃进行2.5小时,再加入2964单位PLD,使反应物在室温下分相20分钟。保留水液PRP相。有机相用150ml水提取并将156ml或更低的相加到第一水相中。
950ml水相PRP用以乙酸钠平衡过的苯酚提取4次,其按苯酚∶水之比=1∶2.6。
然后将提取PRP的苯酚用450g柠檬酸盐/DOC(0.5%DOC,3%柠檬酸盐,5mM Tris,PH8.0)预平衡的HP20树脂在室温处理2小时。过滤掉细珠而保留水相。将292ml缓冲液洗涤细珠的洗液与大量水相合并,然后进行渗断析过滤(Pellicon 1英尺2,10000的W断流膜)。然后将PRP浓缩到1升并以加入乙醇至40%而沉淀。离心收集沉淀,在95%乙醇中研制并在丙酮中干燥。
在本实施例制得的PRP,通过测试过的全部参数,发现类似于选择性乙醇分馏的PRP。
实施例7
流感嗜血杆菌b型的苯酚-失活
含有约每毫升109微生物的流感嗜血杆菌培养物,在发酵循环结束时,通过在发酵培养物中加入苯酚至约0.5%(W/V)的最终浓度,在确定苯酚浓度后,将培养物转移到搅拌的“死”罐,将培养物在37℃接触苯酚最少1小时。虽然下述的实验室试验表明,在有0.5%苯酚时,在7分钟时间后培养物的失活达到8对数级,生产规模的失活期要延伸到1小时以达到更高的安全水平。
培养物的失活研究(实验室规模)
将流感嗜血杆菌在37℃的振荡培养器中培养直到稳定态。含有约每毫升109细胞的所得培养物的等分部分在37℃与0.2、0.3、0.4、0.5和0.6%(W/v)的苯酚接触。在10分钟的接触时间内,0.2%和0.3%浓度的苯酚在培养物失活上有较小的效果。但是,在0.4和0.5%苯酚时,得到显著速率的失活。在0.5%苯酚7分钟后,在平板试验中已没有存活的细胞检出,表明在有苯酚时灵敏度达到约10CFU/ml极限。在0.4和0.5%苯酚浓度时失活动力学发现是二个阶段的。在0.6%苯酚,失活作用是如此之快,在接触苯酚30秒钟后已没有存活的细胞检测出。
生产规模的失活研究
含有每ml约109微生物的反应器,使其苯酚浓度达到约0.5%,并测定CFU/ml作为接触时间的函数。由于取样是机械的,只能做到二个测量间隔为1分钟。对于苯酚的全分布有6分钟搅拌时间的反应器,观察到在最先的3分钟期间有7对数级降低。5分钟后在平板试验中没有存活的细胞检出,在有苯酚时表现灵敏度达到约10CFU/ml极限。
实施例8
除去磷脂酶D
改进的PRP方法的目的是有效地由最终PRP粉末中消除PLD。留在PRP的残余酶量通过下述许多方法进行测定。这些方法包括对最终制剂中酶活性和PLD物直接测定,中间样品中PLD的分析,在流程每一步的PLD回收峰研究。此外,进行了试验以提高用于免疫测试的PLD的抗体。每一个这种方法描述于下。
在终PRP粉末中PLD的直接测定
通过SDS-PAGE用Coomassie染色法(用银PLD制剂不能很好染色)直接测定最终PRP粉末中的PLD,表明PLD的残留量低于检测限度(<250ngPLD/道)。在凝胶上装载到最大,残留的PLD量相当于<5ng/mg PRP或<0.0005%。该检出限度是相当于<1ng/剂。
对最终PRP粉末也测定了残留PLD的酶促活性,没有检测出活性。酶促分析的检测限度是6ng PLD/ml(6×10-4uPLD/ml),相当于<64pg活性PLD/mg PRP。也进行了其它研究,表明PLD与苯酚接触就使酶失活。
在中间样品中直接分析PLD
通过SDS-PAGE用Coomassie染色法对中间生产的样品直接分析其残留的PLD,在第一次苯酚提取后,在PRP中的PLD量是低于检测限度,相当于PLD量<5ng PLD/mg PRP。通过直接测定表明第一次苯酚提取降低PLD量几乎约3对数级(从反应混合物的~2.4mcg PLD/mg PRP到第一次苯酚提取中的少于5ng PLD/mg PRP)。通过另外三次苯酚提取,HP20处理和醇沉淀的进一步处理提供了PLD的再清除,对直接测定来说其含量太低。
PLD强化和回收研究
由于在中间样品中残留PLD含量太低,不能直接测量,在实验室进行了PLD强化回收的延伸系列的研究,以检测每一分离步骤中可以除去的PLD量,三个不同分离步骤在除酶方面其效果类似。
首先,研究了苯酚提取对PLD去除的效果。将20mg PRP/ml中8mg/mlPLD的浓溶液进行4次苯酚提取,每一个水相都通过SDS-PAGE监测PLD。在一次苯酚提取后,通过SDS-PAGE用Coomassie染色分析法PLD含量低于250ng PLD/道的检出限度,这说明了下降800倍或3个对数级的清除。在另一实验中,一批PLD是用萤光素-5-异硫代氰酸盐(FITC)萤光标记。使用FITC-标记的PLD,将酶的分配系数,作为其在苯酚中的浓度函数,用萤光分光光度计测量。这技术对PLD检测量的灵敏度增加10倍。这方法再一次证实,单次苯酚萃取是有效地降低酶含量至少二个对数级。
为测定HP20处理在PLD除去上的效果,测量了5mg PRP/ml中PLD的吸附等温线。等温线的陡峭斜率说明了树脂对PLD有强的亲和力,说明在HP20处理的特定条件下,至少有2个对数级清除PLD。在四个苯酚提取后的这一步的残余酶量,已经非常低,但这些数据表明,通过HP20树脂的选择吸附,任何残余酶量都可进一步去除。
最后,在小规模的强化实验中,在醇沉淀时90%酶留在上清液。因此,最后一步提供了另外10倍清除的能力。
这些研究证实了大量酶(>99.99%)在通过4次苯酚提取中已除去。因为在有PRP存在时,在水和苯酚相之间酶的分配系数经测定是102,四次苯酚提取,在理论上可提供108倍的去除;但是,103倍的清除的估计对这步骤是保守的确定。基于等温线测量,对HP20吸附估计有102倍的清除。对醇分馏提供10倍的PLD降低。对改进PRP方法来说选定酶的总去除的保守估计为106倍,理论上真正的清除可高达1011倍。
下面表中综合了由这些清除研究的发现。最后一栏提供了对每个测定方法残余PLD/剂的计算。注意,全部计算都基于下面的前提,即300mcg PRP进入结合反应而得到15mcg剂量。这对测定每剂残余酶量的估计提供了一保守的方法。
基于几种测定方法的酶清除量的测量
测定方法 酶 PLD/剂
清除 疫苗(NG)
PLD不除去 0 103
对直接测量的LOD*3对数级 <1
测定去除量,保守的 6对数级 <10-3
理论计算的去除量 11对数级 <10-8
*检测限度
实施例9
改进方法和醇分馏法的PRP比较分析
由改进方法制备的全部各批PRP都进行了大量分析测试以测定其化学和物理性质,与选择性醇分馏法制备的PRP制剂是可以比较的。这些分析结果描述于下:
A、NMR分析
由改进PRP方法制备的三次制造一致的批量PRP和由选择性醇分馏方法制备的一代表批量,它们的质子-NMR分析表明,这些样品基本上是相当的。这些样品的光谱表明应由δH=3.72到5.2区内有同样的谱线。
B、碳水组成分析
在PRP制剂中测定组成糖的一致性和相对量,确定了PRP样品的组成的完整性。这是通过PRP样品的酸水解及以后通过用脉冲安培检测高PH阴离子交换色谱法定量碳水组成(核糖醇和核糖)而完成的。分析了三个改良方法PRP的示范批量和二个代表性的选择性醇分馏方法PRP批量。这些样品的比较分析基于核糖醇对核糖的峰面积比,表明五批都基本相同。另外在全部5个制剂中比较了痕量组成的峰。这些组成的量相对于核糖醇或核糖都小于1摩尔%。
C、脂肪酸分析
进行了选择性醇分馏生产的PRP和改进方法PRP产品的比较脂肪酸分析。通过毛细管气体色谱分析法分析脂肪酸甲基酯,以前的生产方法PRP样品含有不同小量的脂肪酸,而改进方法PRP样品含有≤0.002%(w/w)脂肪酸。
D、分子粒度的分析
Sepharose 4B分析
PRP制剂的分子大小通常是通过用折射率检测的Sepharose 4B柱色谱方法来测定,它提供了PRP制剂的相对分子大小的量度,以相对流出体积(Kd)表示。代表性样品的Kd示于下面。基于这些分析,在5个PRP制剂中分子大小没有明显区别。
基于Sepharose 4B分析测量分子大小
样品 Kd
改进PRP:
样品1 0.46
样品2 0.48
样品3 0.45
选择性醇分馏PRP:
样品1 0.46
样品2 0.51
HPSEC-通用校准分析
除了Sepharose 4B分析外,通过高效粒度排阻色谱,使用线上特定粘度和折射率检测测定了每个上面PRP制剂的分子大小和多分散性。这分析是在乙酸铵的移动相中使用了一个TSK G4000 PWXL柱对每一个PRP制剂计算相对分子量(Mp)和多分散性指数(PI)。由分析三个改进方法PRP的示范批量和二个选择性醇分馏方法PRP的代表批量所得的色谱综合于下。由总数29个选择性醇分馏生产PRP批量的分析得到平均结果也示于表中。
通过改进和选择性醇分馏制备的PRP的相对分子量(Mp)和多分散性的测定
样品 Mp PI
改进的PRP
样品1 202000 1.80
样品2 183000 1.65
样品3 213000 1.56
三批的平均值 199,000±15000 1.67±0.12
选择性醇分馏的PRP
样品1 165000 1.54
样品2 148000 1.42
29批的平均值 150000±21000 1.39±0.12
这些分析的结果提出了合理的证据,由改进方法制备的PRP制剂比由选择性醇分馏方法制备的PRP制剂是略大些并更多分散性。
除了上述分析,相当于每个上面改进方法PRP制剂的衍生PRP以及衍生的选择性醇分馏方法PRP的代表性样品也都分析了分子大小。衍生的PRP制剂(溴乙酰基丁二胺形式)的分子大小和多分散性是通过Sepharose 4B色谱分析和通过HPSEC-通用校准进行测定的。其分析结果示下下面。
改进-和选择性醇分馏方法衍生的PRP的分子大小和多分散性的测量
样品 Kd Mp PI
衍生的改进PRP
样品a 0.64 105000 1.37
样品b 0.61 123000 1.48
样品c 0.60 127000 1.42
平均值 0.62 118000±12000 1.43±0.06
衍生的选择性醇分馏PRP
样品a 0.65 104000 1.32
样品b 0.59 112000 1.29
样品c 0.60 119000 1.33
平均值 0.61 112000±8000 1.31±0.02
这些结果表明,PRP的大小在衍生作用时是降低的,而且衍生的改进方法PRP和衍生的选择性醇分馏方法PRP所得的分子大小是基本相当的。
E、相对抗原性分析
PRP抗原含量一般是用速度浊度计分析法测定。给定样品的抗原浓度与多糖浓度比较得到样品相对抗原性的量度。对改进方法PRP的三个示范批量和对二个代表性选择醇分馏方法PRP批量的这种分析结果都列于下面。对这五个样品,相对抗原性在实验误差内是相当的。
改进的-和选择性醇分馏方法PRP的相对抗原性比较
样品 相对抗原性(%)
改进方法PRP
样品1 93
样品2 95
样品3 101
选择性醇分馏PRP
样品1 96
样品2 105
实施例10
动物免疫性测试结果
A、在幼罗猴中的免疫性
幼罗猴已作用临床前的免疫性模型,它与流感嗜血杆菌结合物疫苗在幼儿中的免疫性有关。嗜血杆菌b结合物疫苗(脑膜炎双球菌蛋白结合物)已在这一类中广泛测试并发现具有高的免疫产生力(Vella等人,Pediatrics,85,668,1990;Vella and Ellis,Pediatric Research 29,10,1991)。每年只能得到少量猴子来试用,这样对每种疫苗测试使用了3-6猴/组。是一种远系繁殖,我们发现,通过单个幼猴,在应答嗜血杆菌b结合物疫苗(脑膜炎双球菌蛋白配合物)中抗-PRP量的变化高达约100倍。类似于在单个幼儿免疫应答中的变化程度。由于这些组规模(group size)和远系繁殖的理由,幼罗猴对这些疫苗的免疫性是定性的模型而不是定量的模型。我们认为正应答是在>1mcg抗-PRP/ml的2倍剂量后,一个剂量不能用PRP、PRP-D或HbOC疫苗达到。我们用嗜血杆菌b配合物疫苗(脑膜炎双球菌蛋白配合物)一致地达到这剂量。
幼罗猴对由改进PRP方法的PRP制备的嗜血杆菌b配合疫苗(脑膜炎双球菌蛋白配合物)的抗-PRP应答可与原来研究和制备的稳定批量以及与由选择性醇分馏方法制备的生产批量进行比较。试验中包括的是一种用按改进方法在实验室制的PRP由研究制备的结合物,以及四个由三批改进PRP制成的结合物批量。总之,全部24个猴已用由改进PRP方法的PRP制备的嗜血杆菌b配合物疫苗(脑膜炎双球菌蛋白配合物)进行免疫,全部24猴达到>1mcg抗-PRP/ml的2剂量后。这些数据表明,在这产生免疫性的定性模型中,用由改进方法和由选择性醇分馏方法的PRP制备的嗜血杆菌b结合物疫苗(脑膜炎双球菌蛋白结合物)的免疫当量。
B、鼠的产生免疫性的数据
用由改进方法的PRP制备的嗜血杆菌b结合物疫苗(脑膜炎双球菌蛋白结合物)的效力测试也在BALB/C鼠中进行。是一种遗传的近亲繁殖的品种。并可基本上无限制地取得,在这些鼠的效力试验是对这疫苗的免疫性的定量模型。在这模型中,将5倍稀释的系列疫苗注入每组8只鼠,对每一疫苗批量共40只鼠。对每群40只鼠计算了使50%鼠(ED50)血清转化为抗-PRP血清阳性的有效剂量(ED50越低,效力愈高)。用改进PRP方法的PRP制备的4个不同批量的嗜血杆菌b结合物疫苗(脑膜炎双球菌蛋白结合物)的ED50值与已表明在幼儿中有免疫性的嗜血杆菌b结合物疫苗(脑膜炎双球菌蛋白结合物)的参考对照是在同一范围内。这些数据表明在定量模型中在免疫性上是可比较的。
实施例11
用于改进PRP方法的流感嗜血杆菌发醇批量的培养纯度、流感嗜血杆菌的失活以及PRP抗原含量的测试结果全部都是满意的。
用改进方法制备的三批PRP是以后用于制备嗜血杆菌b结合物疫苗(脑膜炎双球菌蛋白结合物)。将衍生的流感嗜血杆菌b多糖批量进行完全控制测试,而且全部测试结果表明,由改进方法PRP的这些材料与由选择性醇分馏方法的同样材料是不可区分的。
最后容器材料的测试材料确定,由改进方法的PRP制备的嗜血杆菌b结合物疫苗(脑膜炎双球菌蛋白结合物)与由醇分馏PRP所制备的产品是具有同样质量的。
Claims (14)
1、一种由粗制或纯化的包括由细菌衍生的无脂或有脂两者的荚膜多糖的制剂中制备无脂和无内毒素的荚膜多糖而基本上不损失荚膜多糖的方法,该方法包括由脂荚膜多糖分裂脂,除去无脂和内毒素的污染并回收无脂荚膜多糖,而基本上将全部脂荚膜多糖转化成多脂荚膜多糖。
2、权利要求1的方法,其中脂是通过磷脂酶而从脂荚膜多糖中离解。
3、权利要求2的方法,其中荚膜多糖是由流感嗜血杆菌b型,脑膜炎双球菌(脑膜炎球菌)群A、B、C、X、Y、W135或29E或大肠杆菌K1、K12、K13、K89、K92或K100的培养物中衍生的。
4、权利要求3的方法,其中荚膜多糖是包括由流感嗜血杆菌b型培养物衍生的PRP和脂-PRP。
5、权利要求4的方法,包括在有作为酶活化剂的含醚有机相存在下,用单独的磷脂酶D或磷脂酶D与磷酯酶A2或磷酯酶B组合物处理包括PRP和脂肪-PRP的混合物。
6、权利要求5的方法,其中有机相包括选自乙醚,丁醚、甲基叔丁醚的第一组成醚,和选自甲醇、乙醇或己烷的第二组成的混合物,其中所述第一组成和所述第二组成存在的比例为约20∶1和5∶1之间。
7、权利要求6的方法,其中磷脂酶是由非哺乳动物有机体中衍生的。
8、权利要求7的方法,其中包括用单独磷脂酶D处理含有PRP和脂肪-PRP的混合物。
9、权利要求8的方法,它包括将含有PRP和脂肪-PRP的混合物与按重量计约0.01和10%之间的磷脂酶D进行反应。
10、一种制备无脂和无内毒素的多核糖基核糖醇磷酸盐(PRP)而基本不损失PRP的方法,它包括将以由流感嗜血杆菌b型培养物得到的粗制或纯化的多糖制剂存在的脂肪-PRP按0.3%(重量)磷脂酶D对PRP的比例与磷脂酶D反应,在反应混合物中含有浓度为反应体积的30%-60%之间的醚:有机溶剂混合物,其中有机物是一种选自二乙醚、丁醚或甲基叔丁基醚的醚与一种选自己烷、乙醇或甲醇的第二有机物相混,反应是在有选自脱氧胆酸盐或Triton X-100的去污剂存在下,其浓度为约0.1%~0.4%之间,并加入约0.1~10mMCaCl2,在适宜上述试剂的缓冲溶液中,PH值在约7.0~8.0之间温度在约20℃~45℃之间,进行约30分钟~约4小时之间。
11、权利要求10的方法,其中的醚∶有机溶剂混合物是甲基叔丁基醚∶乙醇的混合物,其比例为约9∶1,混合物的浓度是反应体积的约50%。
12、权利要求11的方法,它还包括PRP的苯酚提取以除去包括所加入的磷脂酶D的蛋白的污染,并在磷脂酶D处理前或处理后,将PRP通过一不吸附PRP或脂肪-PRP的憎水吸附步骤以除去脂和内毒素。
13、一种制备无脂PRP而基本上不损失PRP的方法,它包括的步骤有:
a)在合适的培养基中培养流感嗜血杆菌b型;
b)用乙基汞硫代水杨酸钠或苯酚杀死流感嗜血杆菌b型;
c)澄清杀死流感嗜血杆菌b型的培养基;
d)浓缩澄清的培养基到得到可加工的体积;
e)通过加入乙醇使最终浓度为约48%乙醇而沉淀在培养基中的污染物以得到含PRP的上清液和要弃去的污染物沉淀;
f)通过加入乙醇使最终浓度为约61%而沉淀PRP以得到粗制PRP沉淀;
g)在PRP沉淀中加入水以溶解,接着加入氯化钙使最终浓度为1.0M;
h)加入乙醇使最终浓度为23%,以得到污染物的不溶沉淀和含PRP的上清液;
i)加入乙醇使最终浓度为37%以沉淀PRP;
j)用无水乙醇研制PRP沉淀并干燥而得到一种PRP苯酚前粉末;
k)苯酚提取一种PRP粉末的溶解制剂;
l)通过加入CaCl2至0.05M和乙醇至约67%而沉淀PRP,在无水乙醇中研制以得到苯酚后粉末。
m)通过增水吸附,由苯酚后粉末的溶解制剂中除去内毒素;
n)将在粗制PRP、苯酚前粉末或苯酚后粉末中的PRP,在进行以后步骤之前与磷脂酶反应。
14、权利要求13的方法,其中磷脂酶是磷脂酶D,它的加入量为PRP的约0.3%(重量),而粗制PRP,苯酚前粉末或苯酚后粉末是溶于10mM Tris、5mM CaCl2、45%甲基叔丁醚、5%乙醇、0.3% Triton X-100,并在约35℃反应30分钟到约4小时。
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C01 | Deemed withdrawal of patent application (patent law 1993) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |