JPH05209002A - 脂質含有のリポ莢膜ポリサッカライドを、脂質非含有のポリサッカライドに変換する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 リポＰＲＰを、高収率で脂質非含有莢膜ポリ
サッカライドに変換する。 【構成】 グラム陰性菌由来の種特異的莢膜ポリサッカ
ライドを含む、莢膜ポリサッカライドを調製する方法で
あって、脂質に共有的に結合した莢膜ポリサッカライド
を、脂質非含有莢膜ポリサッカライドに変換し、エンド
トキシン汚染物質を除去することから成る。好ましい実
施例では、Haemophilus influenzae b型の培養体由来
の、ＰＲＰの粗、または、精製標本を処置することによ
って、リポＰＲＰを脂質非含有ＰＲＰに変換する。すな
わち、ＰＲＰ由来の共有的脂質を、約３５℃で、ほぼ中
性ｐＨの、約５０容量％の有機酵素活性剤、約０．３％
の洗剤、約 5mMの２価金属陽イオンを含むバッファー中
で、約３０分から約４時間、フォスフォリパーゼＤを作
用させて分断し、その後、酵素、残留脂質、および、リ
ポポリサッカライドを除去する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、グラム陰性菌由来の種
特異的莢膜ポリサッカライドを含む細菌培養体から、脂
質非含有の、かつエンドトキシン非含有の、莢膜ポリサ
ッカライドを莢膜ポリサッカライドをほとんど損失する
ことなく製造する方法である。この方法は、グリセロー
ル・ジエステル部分に共有結合している莢膜ポリサッカ
ライドを、脂質非含有ポリサッカライドに変換する。本
発明の好ましい実施態様では、リポポリサッカライド
（ＬＰＳ）またはエンドトキシンも、共有結合脂質の分
断を受ける莢膜ポリサッカライドから除去される。

【０００２】本発明の一実施態様は、脂質非含有ポリリ
ボシル・リビトール・フォスフェート、以後ＰＲＰと呼
ぶ、の製造に用いられた。このＰＲＰは、病原性細菌Ha
emophilius influenza b型、これもＨｉｂと呼ぶことに
するが、培養体から得た莢膜ポリサッカライドである。
得られたＰＲＰは、Ｈｉｂによる病気の発症を予防する
免疫反応を誘発するためのワクチン調製用の成分として
適当である。本発明から、同じような共有結合脂質を持
つ他の病原性細菌、例えば、E. coli ないし Neisseria
meningitidis の莢膜ポリサッカライドも同様にして製
造できることが予想できる。

【０００３】病原性細菌、Ｈｉｂはいくつかの病気の原
因となるが、その中でももっとも重要なのは、主に５才
未満の小児に見られる、細菌性髄膜炎や細菌性の全身疾
患である。最近、Ｈｉｂに対抗するワクチンが、ＦＤＡ
により人への使用が許可された。1991 Physicians Desk
Reference, pp. 1476-1478 の、Merck & Co., Inc.の
PedvaxHIB, および、pp. 1174-1176 の、Lederle の Hi
b TITERを参照のこと。

【０００４】Ｈｉｂに対するワクチン製造法の一つは、
アメリカ特許 4,695,624, 4,882,317 に記載の方法に示
されている。この方法で用いられるＰＲＰは、Haemophi
lusinfluenzae b型を培養し、培養液からポリサッカラ
イド分画を単離して得る。次に、この単離ＰＲＰを、Ne
isseria meningitis b由来の、外膜タンパク複合体に複
合させる。このタンパク複合体は、それ自体は幼児に対
して免疫原性が低いＰＲＰに関して、免疫強化性搬送体
として働く。

【０００５】次に、アメリカ特許 4,695,624について述
べると、１６欄２４行記載のようにHaemophilus influe
nzae b型の８００ｌ発酵体を濃縮し、湿ペースト377gを
得る。ＰＲＰは、塩化カルシウムの存在下に、各種エタ
ノール濃度による選択的沈澱によって回収する。１７欄
１行では、68g の乾燥製品が得られている。これを、以
後、前フェノール粉と呼ぶ。その後の工程としては、フ
ェノール抽出、エタノール沈澱があり、１７欄４９行に
39g の乾燥製品が得られたことが示されている。最後
に、１８欄１４行で、34.7g の乾燥製品が得られた。こ
の物を以後後フェノール粉と呼ぶ。後フエノール粉は、
複合させてもよいし、さらに精製してエンドトキシンを
取り除いてもよい。

【０００６】エンドトキシンは、細菌由来の免疫原物質
を接種した場合、哺乳類に体温上昇をもたらす主要因子
である。この、いわゆる発熱反応は、リポポリサッカラ
イド、以後、エンドトキシン、発熱原物質、またはＬＰ
Ｓと同義的に用いることにするが、を含む脂質Ａの除去
によって回避することができる。この目的を達するた
め、上記のように獲得した後フェノール産物を、発熱原
物質規制基準に合致するように、さらに精製してもよ
い。本発明の開発までは、これは、選択的エタノール分
画法によっていたが、後フェノール粉に存在するＰＲＰ
の約７０％が失われた。このやり方では、ちょうど沈澱
を起こさせるのに十分な濃度にエタノールを加えて、後
フェノールＰＲＰからＬＰＳを沈澱させる。この濃度
は、いわゆる曇点であって、アメリカ特許 5,039,610,
U.S.S.N. 595,722に述べられている。エタノールは、曇
点まで添加する。この点は、ちょうど、濁度が２倍にな
る地点である。さらに、0.5-2%エタノールを添加する
と、従来廃棄品としていた、以後低域カットとよぶ沈澱
が得られる。一方、脂質非含有ＰＲＰは溶液中に残留す
る。低域カットは、約７０％のＰＲＰと、ほとんど全て
のＬＰＳを含む。

【０００７】エンドトキシン除去のために行なう、選択
的エタノール分画によって生じるＰＲＰの損失をカバー
する試みとして、アメリカ特許 5,019,502の製法の発明
者たちは、ＰＲＰをほとんど失うことなく、ＬＰＳを除
去する方法を開発した。この方法では、溶解した後フェ
ノール粉を、疎水性吸着工程に、バッチ法、カラム・ク
ロマトグラフ法いずれかのやり方で、通過させる。この
際、できれば、非イオン性樹脂を用いる。これには、エ
ンドトキシンが結合するが、ポリサッカライドは結合し
ない。

【０００８】多孔性スチレン・ジビニルベンゼン・コポ
リマー、例えば、ＨＰ２０のようなものを用いれば、実
際、定量的にほとんど全てのエンドトキシンを除去し、
しかも一方では、定量的にほとんど全てのＰＲＰを回収
する。この原料を以後、後-HP20 PRP と呼ぶ。しかしな
がら、Ｈｉｂによって生産されるＰＲＰの相当部分は、
共有的なリポＰＲＰの形で存在する。

【０００９】ＰＲＰが、Haemophilus influenzae b型に
よって生産されるという可能性は、最初に、Kuo et al.
[J. Bacteriol. 163, 769-773 (1985)]によって認めら
れた。この研究においては、Haemophilus influenzae b
型は、放射性パルミチン酸、および・または、放射性リ
ボースを添加した液性培地で育成した。培養上清から精
製した、ポリリボシル・リビトール・フォスフェート
は、先に、生合成中にＰＲＰに取り込まれていた、放射
性リボース、パルミチン酸の両方を含んでいた。フォス
フォリパーゼＡ₂ （ＰＬＡ₂ ）処理をすると、ＰＲＰか
ら放射性パルミチン酸の若干量が除去されることが判明
したが、非共有的会合を破壊する方法ではうまくいかな
かった。リポＰＲＰの構造は示されていないが、呈示さ
れているデータは、初期の、ある発表論文に報告されて
いるデータと一致した。この論文では、髄膜炎菌グルー
プＡ、Ｂ，Ｃ、および、E. Coli K92 のポリサッカライ
ドに対して、特定構造を提示した [Gotschlich et al.,
J. Biol. Chem. 25b, 8915-8921 (1981)]。本発明にお
いては、特定のフォスフォリパーゼで調べて見たとこ
ろ、リポＰＲＰの構造が明らかにされたが、この構造
は、下記に詳細に記載されるものと合致していた。

【００１０】リポＰＲＰは、5,019,502 発明に用いられ
た疎水性樹脂には結合しない。これは、リポＰＲＰが、
分子の大部分のポリサッカライド部分が圧倒的に陰イオ
ン性であるのに対し、共有的脂質に基づく疎水性は僅か
であるからである。したがって、本製法によって得られ
る最終製品は、脂質非含有ＰＲＰに加えて、相当部分の
脂質ＰＲＰを含む。この脂質ＰＲＰは、選択的エタノー
ル分画法か、本発明で開示される方法のいずれかで除去
されるが、前者では、ＰＲＰが約７０％失われるのに、
後者では、ＰＲＰのほとんど全てが脂質非含有ＰＲＰと
して回収される。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、脂質非含有莢膜ポリサッカライドの回収法を与
えることであり、その方法は、選択的アルコール分画法
によって得た脂質非含有ポリサッカライド分画のみを用
いて調製した複合体と変わらぬ複合体を生産する。本発
明のもう一つの目的は、ＰＲＰの高収量製法を与えるこ
とであり、この方法は、脂質ＰＲＰを廃棄するのではな
く、脂質ＰＲＰを脂質非含有ＰＲＰに変換することから
成る。もう一つの目的は、Haemophilus influenzae b型
の培養体から得たＰＲＰの量、質にたいして再現性を持
つ工程を与えることであり、これは、このようにして得
られるＰＲＰから生産される複合ワクチンの一定性を維
持するためである。本発明の、その他の利点、目的は、
下記の詳細な記載から自ずから明らかになろう。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、リポ莢膜ポリ
サッカライドから、共有的に結合している脂質を分断
し、その脂質とエンドトキシン汚染物質を除去するため
の製法である。この脂質を除去するためには、化学的、
または酵素的手段を用いてもよい。共有的に結合する脂
質を含むポリサッカライドの選択的エタノール分画は、
莢膜ポリサッカライドのその分画を、「低域カット」と
いう名の廃棄品として消失する結果を招く。共有的に結
合する脂質の除去を実行することによって、本製法は、
選択的アルコール分画法につきものの莢膜ポリサッカラ
イドの消失を回避し、また一方で、そのポリサッカライ
ドを得た病原体による感染に対して予防する、遊離ない
し複合ポリサッカライド・ワクチンの調製に有効なポリ
サッカライド製品を与える。共有的脂質は、例えば、ヒ
ドロキシラミンによる処置によって除去してもよい。莢
膜ポリサッカライドから共有的脂質を分断するための好
ましい方法は酵素を利用するものである。本発明の好ま
しい実施態様では、ポリリボシル・リビトール・フォス
フェート、ＰＲＰの高収量生産が達成される（ＰＲＰ増
強製法）。

【００１３】本発明の製法は、第１図に徴して理解する
ことができる。その特異性が明らかにされたフォスフォ
リパーゼによる研究にもとづいた、リポＰＲＰの仮定構
造が示されている。脂質非含有ＰＲＰの構造も、第１図
に示したものと同じである。ただし、ＰＲＰ反復単位の
リン酸にエステル結合するジアシルグリセロール部分は
ない。さらに、リポＰＲＰにおけるグリセロールの存在
は、Dionex HPLC で確認され、グルコースの存在も確認
されている。

【００１４】フォスフォリパーゼＡ₂ (PLA₂ ) は、ジア
シルグリセロールの図示したsn-2位置で分断することが
知られている。ＰＲＰを、市販のＰＬＡ₂ (Sigma, Boeh
ringer) 標本と反応させ、脂肪酸の放出を、ガスクロ分
析でモニターすると、パルミトレイン酸 [16:1 cis 9]
の減少はあるが、パルミチン酸[16:1]、ミリスチン酸[1
4:1]はないことが注目された。これらはいずれもリポＰ
ＲＰ中に検出されるものである。

【００１５】市販のフォスフォリパーゼＢ（Sigma ）
は、ある一部のパルミチン酸、パルミトレイン酸を除去
することができたが、グルコースやグリセロールは、こ
の酵素では除去されない。さらに、フォスフォリパーゼ
Ｃ（Sigma ）の活性は、ブロックされるようであるか
ら、グルコースの位置は、第１図に示したようになる。
市販のフォスフォリパーゼＤ（Sigma, Genencor, Boehr
inger ）は、グリセロールやグルコースはもちろん、脂
肪酸をすべて除去する。しかしながら、上記の酵素のい
ずれも従来はそれだけを用いることはできなかったし、
この酵素のいずれも、本法の最適化以前に、ＰＲＰから
１００％の脂肪酸を除去することはできなかった。本法
は、ＰＬＤだけを用いて、脂質の完全除去を実現するた
めの最適法を与える。さらに、共有的脂質の除去を増進
するために、ＰＬＤと、ＰＬＡ₂ またはＰＬＢの組合せ
を用いることもできる。本発明のある実施態様では、フ
ォスフォリパーゼＡ₂ とフォスフォリパーゼＤを室温で
組み合わせて用い、リポＰＲＰから共有的脂質を完全に
除去し、さらにその後、脂質非含有ＰＲＰ製品を免疫原
性タンパクと複合させたところ、高い抗ＰＲＰ免疫応答
とするのに効果的であることが判明した。

【００１６】フォスフォリパーゼ所要量の低下は望まし
い。なぜなら、この酵素は高価であるし、また、酵素負
荷の低下は、製品からの酵素の除去を容易にするからで
ある。後フェノール粉ＰＲＰからの脂肪酸完全除去は、
700UのフォスフォリパーゼＡ₂ （ブタ由来）、20U のフ
ォスフォリパーゼＤ（Streptomyces chromofuscus 由
来）を、有力な酵素刺激剤である、３０％ブチル・エー
テル、０．１％ＤＯＣと一緒に用いて実行できる。従来
文献に記載されているところであるが、フォスフォリパ
ーゼや、それと同種の酵素は、洗剤、有機溶媒のような
添加物に極端に感受性が高い。特に、Kates の示したと
ころによれば、色素体フォスファターゼＣは、エーテル
・メタノール混合物によって大きく刺激されるが、この
混合物は、共同的に相互作用を及ぼし、基質、酵素両相
を、増強酵素活性領域に集合させると考えられている
[Can. J. Biochem. and Physio, 35, 127(1957)] 。わ
れわれは、同じような機構がフォスフォリパーゼ活性を
支配しているのではないかと考え、そのため、エーテル
／メタノール混合体の酵素機能にたいする影響を検討し
た。

【００１７】ブチル・エーテル／メタノール混合体は、
フォスフォリパーゼ反応にとってきわめて有力な活性剤
であることが判明した。反応プロトコルは、後フェノー
ルＰＲＰ粉を、ブチル・エチルとメタノールの、５対１
（ｖ／ｖ）混合物の存在下に、ＰＬＡ₂ 及びＰＬＤと反
応させ、その後、ＨＰ２０樹脂で処理してエンドトキシ
ンを減少させるのであるが、これにより、ＰＲＰから脂
質が完全に除去された。さらに、酵素所要量は、ＰＬＡ
₂ に対しては３．５倍（700Uから 200U ）、フォスフォ
リパーゼＤに対しては２倍（20U から 10U）に低下し
た。酵素反応後に、ＨＰ２０処理を用いることのもう一
つ有利な点は、疎水性樹脂が、反応混合物から酵素の若
干量を吸着すること、したがって、下流の酵素クリアラ
ンスの負荷が軽くなることである。

【００１８】人間投与用のワクチンを調製したいという
観点からすれば、できるだけ少量の酵素を用いること、
酵素を完全に、もしくは、できるだけ完全に近く除去す
ること、さらに、哺乳類ウィルスで汚染されている可能
性の無い供給源から得た酵素を用いることが望ましい。
ブタＰＬＡ₂ の使用は望ましくない。というのは、好ま
しくない免疫反応の危険性が増すことがあり、また、哺
乳類由来の製品には、検出不能のウィルスが存在すると
いう、最近指摘されている危険があるからである。Stre
ptomyces violaceoruberから単離したＰＬＡ₂ を、上記
と同じ反応条件下で評価した。脂質は、Streptomyces由
来のフォスフォリパーゼの組合せを用いて成功裡に除去
された。さらに実験を行ない、100mg ＰＲＰに対する酵
素の最少必要量は、StreptomycesＰＬＡ₂ については 1
00から 200U,ＰＬＤについては 2から 10Uであることが
認められた。

【００１９】フォスフォリパーゼＡ₂ ，Ｄ，またはＢと
表記される酵素でも、さまざまの供給源があることは注
意すべきである。蛇毒は、ＰＬＡ₂ の豊富な供給源であ
り、一方、ＰＬＤは、キャベツ、ピーナッツ、Streptom
ycesから単離されている。特定供給源の選択は、主に、
上記の事項ならびに、市販の酵素標本の比活性によって
決められる。さらに、他のリパーゼでも、十分な二次的
フォスフォリパーゼ様活性を示し、われわれの使用法に
役立つことがある。この、その他のリパーゼを、本目的
のために用いる応用法は、本発明から明白である後フェ
ノール粉ＰＲＰから脂質を分断するのに、フォスフォリ
パーゼの組合せか、または、フォスフォリパーゼＤのみ
を用いる酵素法は、きわめて再現性が高く、かつ、Haem
ophilus influenzae bの、フェノール不活性化と、チメ
ロザール不活性化両培養体に見られる脂質含有量の変動
に対処することができる。さらに、酵素反応の後にＨＰ
２０処理すると、発熱原物質は、後フェノールＰＲＰ原
料粉の 60EU/mcg から、酵素反応後の約10EU/mcgへ、さ
らに、ＨＰ２０処理後の0.0125 EU/mcg へと大きく減少
する。これからして、完全な脂質除去、ＬＰＳの際だっ
た減少、高いＰＲＰ収量を確保するに、本法は優れたプ
ロトコルであるものと思われる。もちろん、その他の反
応計画も可能である。例えば、リパーゼをＰＲＰ単離工
程のもっと初期に、例えば、発酵ブロスに入れたり、あ
るいは、殺菌の直後に組み込むことも可能である。ま
た、各種手順の実行される順序に変更を加えることも、
本開示の範囲内のことである。

【００２０】本発明の好ましい実施態様において、リポ
ＰＲＰから全脂質を酵素的に除去したが、それは以下の
最適化反応で実現した。これは、ＰＲＰを、ＰＲＰに対
し約０．３重量パーセントの比のStreptomyces chromof
uscus 由来のフォスフォリパーゼＤだけと、反応させる
ものである。この酵素は、Imamura and Horiuti [J.Bio
chem. 85, 79-95 (1979)]の方法で均一になるまで精製
され、Genencor Internationalを通じて市販されている
ものであるが、上記のように、その他の起源のＰＬＤを
用いてもよい。

【００２１】ＰＬＤの最適条件は、トリトンＸ−１００
の添加を含む。これは、デオキシコール酸、ＤＯＣより
も有効な酵素活性剤であるようである。さらに、酵素の
活性はまた、Ca²⁺の量にも依存する。酵素の活性を増す
ために、4.5mM トリトンＸ−１００とCa²⁺ (5mM)を添加
した。もっとも他の、２価の金属イオン、例えば、マグ
ネシウムを用いてもよい。反応混合物にカルシウムを添
加すると、リン酸以外のバッファー、例えば、pH 7.4の
10mMトリスを用いる必要が生じる。反応混合物に添加す
る有機溶媒の量を、50%v/vに増し、ブチル・エーテル
を、メチル・第３級ブチル・エーテルに代えると、安全
の心配は低下する。この修正酵素反応条件を用い、その
後にＨＰ２０処理を行なうことによって、前フェノール
粉ＰＲＰからの脂質の完全除去が達成された。反応は、
前フェノール粉ＰＲＰの二つの異なるバッチそれぞれに
ついて、２グラムを用いて繰り返し、前フェノール粉Ｐ
ＲＰにたいするＰＬＤ処置の再現性と、有効性を確かめ
た。脂質非含有製品について、セファローズCL4Bクロマ
トグラフィーにて分子サイズ定量を行なった。製品のＫ
d は約0.4-0.5 であり、ＰＲＰの免疫原性として受け入
れ可能であった。当然のことながら、他のバッファー条
件、あるいは、同様の洗剤を反応に用いてもよい。これ
については、本技術に熟練している人々の認める通りで
ある。

【００２２】ＰＲＰ増強製法は、Haemophilus b 複合体
ワクチン（髄膜炎菌タンパク複合体）製造施設において
３回実証された。フェノール不活性化H.influenzae発酵
の６ロットを、均一性試験に用いた。発酵ロットは、培
養体純度、H.influenzae不活性化、ＰＲＰ抗原含有量に
ついてテストした。ＰＲＰの３製造ロットを準備し、こ
れをその後、Haemophilus b 複合体ワクチン（髄膜炎タ
ンパク複合体）の、３個の大規模ロット調製のための原
料として用いた。３ロットのＰＲＰ、これは各々２個の
発酵培養体から出発したのであるが、この製品収量は、
選択的エタノール分画による収量よりも約３．５倍高か
った。

【００２３】増強法によって調製された３ロットのＰＲ
Ｐを、その後、Haemophilus b 複合体ワクチン（髄膜炎
菌タンパク複合体）の製造に用いた。誘導された Haemo
philus bポリサッカライド・バルク、Haemophilus b (P
RP-OMPC)複合体バルク、Haemophilus b 複合体ワクチン
（髄膜炎菌タンパク複合体）最終容器の放出テストを行
なったところ、上記の原料は全て、選択的アルコール分
画法によって得られた同様の製品と区別できないことが
判明した。

【００２４】低域カットＰＲＰは、選択的エタノール分
画で得られる廃棄沈澱である（ＬＰＳ，リポＰＲＰ，お
よび損失ＰＲＰを含む）。この分画法は、アメリカ特許
5,039,610に開示されているＰＲＰ生産工程の最終段階
である。前フェノール粉について開発し、その後にＨＰ
２０処理を用いる、同じ改良反応条件を用いて、低域カ
ット粉からほぼ完全に脂質を除去することができ、７０
％を越えるＰＲＰ収量が得られた。

【００２５】反応混合物は、フォスフォリパーゼを活性
化する、できれば反応容量の約３０から６０％存在する
有機溶媒を含んでいなければならない。有機活性剤はで
きれば、ジエチル・エーテルないしメチル・第３級ブチ
ル・エーテルのようなエーテルであることが望ましい。
このエーテルは、もう一つの有機溶媒、例えば、ヘキサ
ン、エタノール、ないしメタノールと、エーテルと２番
目の有機物の比が約２０：１から５：１、できればその
比が、エーテルと第２有機物の間で約９：１となるよう
な混合物として与えられると有利である。きわめて好ま
しい実施例においては、メチル・第３級ブチル・エーテ
ルの９部、これは、ジエチル・エーテルよりも揮発性が
小さいので取扱が安全であるが、これを、約１部のアル
コールと混合する。この有機混合物を、ＰＬＤ反応液に
加え、最終有機濃度約５０％とする。有機溶媒を与える
ことは、脂質基質と酵素の最大接触を助けるようであ
る。

【００２６】有機酵素活性剤を準備する他に、洗剤、例
えば、デオキシコール酸や、トリトンＸ−１００などの
洗剤を用意するのが望ましい。これは、脂質性の集合体
の分解を助けたり、酵素・基質相互作用を強化する。洗
剤は、約0.1-0.4%の濃度で存在しなければならない。ト
リトンＸ−１００の約0.3%の添加は、まったく好ましい
ものであることが判明した。

【００２７】フォスフォリパーゼＤは、リポ莢膜ポリサ
ッカライドに対し、十分な量用意しなければならない。
これは、共有脂質を、十分短い時間内に、完全に加水分
解するためである。ＰＲＰにたいし、約0.01-10%、でき
れば、約0.1-0.4%のＰＬＤを用意するのが適当である。
当然のことながら、これより酵素の添加が少なければ、
長い反応時間を要し、一方、これよりたくさんの酵素を
添加すれば、反応時間を短縮する。

【００２８】反応に撹拌を与えて、全ての反応相が相互
の接触を維持する、すなわち、約０．１から０．４重量
パーセントのＰＬＤ，約０．１から１０ｍＭの２価の金
属イオン例えばＣａＣｌ₂ を、上記の試薬に不活性なバ
ッファー例えばトリス中で、約２０から４５℃の温度
で、できれば、３０−４０℃で反応させると、約３０分
から４時間の反応時間内に、リポＰＲＰから共有脂肪酸
の全てが完全に除去される。

【００２９】上記反応条件は、その純度のまちまちなＰ
ＲＰ標本を原料として、共有脂質を含まないＰＲＰを調
製するにはまったく満足すべきものであることが判明し
た。したがって、前フェノール粉、後フェノール粉、お
よび、後ＨＰ２０製品は全てこの条件下で処理したとこ
ろ、共有脂質を含まないＰＲＰが定常的に生産されるの
が認められた。

【００３０】さらに、ある標本中のリポＰＲＰを、遊離
ＰＲＰに変換するに当り、そのＰＲＰ標本中に存在する
フォスフォリパーゼを、今度は、タンパク様酵素のフェ
ノール抽出で除去できる。完全な除去を確保するため、
フェノール抽出はできれば少なくとも１回から約４回抽
出まで繰り返すのが望ましい。この処置により、添加し
た酵素ばかりでなく、残留タンパク様汚染物質をも除去
することができる。この汚染物質は、下流の複合に干渉
したり、ワクチン受容者にたいし、好ましくない免疫反
応を生ずることがあるからである。

【００３１】共有脂肪酸を含まないＰＲＰを生産するた
めに、ＰＲＰを酵素的に処置することは、また、ＬＰＳ
から脂肪酸の若干量を分断する。したがって、エンドト
キシンは、酵素処置の結果、約３倍減少する。しかしな
がら、この程度の減少は、通常、発熱原性規制に合致す
るには十分ではなく、残留ＬＰＳを除去するためにさら
に手順が必要である。本技術において既知のいくつかの
手段があり、その中には、アメリカ特許 5,019,502の開
示の中に概括されている、選択的エタノール分画、疎水
性吸着、その他の手段が含まれるが、そのいずれかによ
りさらにエンドトキシンを取り除くことができる。本発
明にとって有効な樹脂は、ほう酸Avidgel (Amicon), ア
ンバーライト XADとアンバークローム（Rohm & Haas
）、オクチル・セルロース（Phoenix Chem. ）、シリ
カ C8 (Baker), SP, HP 系列樹脂（例えば、SP207, HP2
0, HP50 ）（三菱化成）を含むが、これらに限定される
わけではない。上記樹脂の中では、ＨＰ２０またはＨＰ
５０が好ましい。なぜなら、リポポリサッカライドを減
少させる、使いやすい、入手しやすい、低コスト、ポリ
サッカライドへの結合を避ける傾向があるからである。
できれば、使用前にこの樹脂を、発熱物質非含有水で洗
浄するのが好ましい。さらに好ましくは、この樹脂を、
使用前に酸性溶液、アルカリ性溶液、または極性溶媒
（例えば、エタノールまたはメタノール）で洗浄し、次
に、発熱物質非含有水で洗浄し、次に、３％クエン酸ナ
トリウムと、０．５％デオキシコール酸ナトリウムから
成るバッファーであらかじめ平衡させる。同様に、でき
ればポリサッカライドを、約３％のクエン酸ナトリウム
と約０．５％のデオキシコール酸ナトリウムから成るバ
ッファーに溶解し、次に、上記のように調製した疎水性
樹脂で処理するのが望ましい。約25mMトリス pH 8.0 を
添加するのも、ｐＨの変動を防ぐのに有効である。

【００３２】共有脂質を含む莢膜ポリサッカライドは、
エンドトキシン除去の前か、後のいずれかに、遊離ポリ
サッカライドに変換することができる。本発明の一実施
態様においては、ポリリボシル・リビトール・フォスフ
ェート、リポポリサッカライド、各種脂質や蛋白を含
む、H. influenzae b 発酵ブロスから得た粉を、10mM T
ris ，5mM CaCl₂ ，4.5mM Triton X-100, pH 7.4に溶解
し、第３級ブチル・エーテル対エタノールの９：１混合
物を、５０％濃度まで加える。Streptomyces chromofus
cus 由来のフォスフォリパーゼＤを、ＰＲＰに対し約
０．３重量パーセント添加し、絶えず撹拌しながら、３
５℃で、約３時間、脂質の分断を起こさせる。反応産物
を、４回フェノール抽出し、添加酵素を含むフェノール
汚染物質を除去し、後フェノール標本を得る。

【００３３】次に、この後フェノール標本を、塩基性ｐ
Ｈの下、洗剤・キレート剤混合液に溶解する。同じバッ
ファーであらかじめ処理した、ＨＰ２０樹脂ビーズを軌
道振とう器内のＰＲＰに添加し、室温以下で数時間混合
する。次に、ビーズをろ過によって溶液から取り除き、
ろ液を逆ろ過して、洗剤とキレート剤を取り除く。ＰＲ
Ｐを、９５％エタノールにより溶液から沈澱させる。沈
澱を遠心し、ペレットを、エタノールとアセトンでトリ
チル化する。得られた産物を真空乾燥する。

【００３４】疎水性樹脂ビーズを用いる製法は、ＰＲＰ
を大きく損失することなく、汚染性のエンドトキシンも
低レベルという結果を与える。この処置によるエンドト
キシンの低下は、最初のエンドトキシン汚染レベルによ
るが、普通、原料粉と最終粉の間で、100-21,000倍であ
る。ＰＲＰ収量は、通常、少なくとも原料の７５％、時
には９０％を越えることがある。

【００３５】「人・動物非経口薬、生物薬品、医用機器
に対する、最終産物エンドトキシン・テストとしての、
ＬＡＬテストの適正化に関するガイドライン」、アメリ
カ保健省、１９８７年１２月、に記載されているカブト
ガニ・アメーバ細胞溶解産物（ＬＡＬ）テストを用い
て、エンドトキシン濃度を定量する。

【００３６】本発明の好ましい実施態様では、エンドト
キシン非含有、脂質非含有ＰＲＰは、酵素処理の後で、
ＨＰ２０ないしその他の適当な多孔性のスチレン・ジビ
ニルベンゼン・コポリマー、または、上記のような同様
に疎水性の媒体によるＬＰＳの疎水性吸着を実施して得
る。

【００３７】グラム陰性菌の莢膜ポリサッカライドは、
いくつかの既知の方法のいずれを用いても得ることがで
きる。その方法の中には、Haemophilus influenzae b型
に関するアメリカ特許 4,695,624に開示されているも
の、Neisseria meningitidis（髄膜炎菌） A, B, C, X,
Y, W135, 29E のポリサッカライド、Escherichia coli
K1, K12, K13, K89, K92, K100 のポリサッカライドが
含まれる。しかしながら、特に好ましいポリサッカライ
ドは、Ｈｉｂポリサッカライドから成るグループ、例え
ば、Rosenberg et al., J. Biol. Chem., 236, pp. 284
5-2849(1961), Zamenhof et al., J. Biol. Chem., 20
3, pp. 695-704 (1953)に記載されているようなものか
ら選んだ莢膜ポリサッカライドである。本発明の一実施
態様において、ポリリボシル・リビトール・フォスフェ
ート、これはHaemophilus influenzaeb型由来の莢膜ポ
リサッカライドであるが、これを、アメリカ特許 4,69
5,624に記載されている通りに、病原体の発酵によって
単離する。病原体は、１％チメロゾールの添加、また
は、約０．５％のフェノールの添加によって殺す。細胞
破砕物は、遠心によって除去し、粗ポリサッカライドを
超遠心により濃縮し、これによって、以後粗ＰＲＰと呼
ばれるものが得られる。遊離ＰＲＰの収量は、もしも酵
素処理が粗ＰＲＰにたいして上記酵素法に従って実施さ
れるならば、リポＰＲＰを共有脂質を持たないＰＲＰに
変換するよう最適化される。さらに、リパーゼを直接発
酵液、またはそれ以後の工程のどれかに添加するとさら
に有利なことがある。

【００３８】例えば、酵素処理は、下記の処置のいずれ
かによる部分的精製の後、下記の処置のいずれかのもの
の一部の後、または、下記の処置のいずれかの等価的な
変法の後にまで遅らせることもできる。その処置とは、
４８％エタノール（ｖ／ｖ）に不溶の汚染物質を除去し
て前フェノール粉を生産する、エタノールを６１％まで
添加して、ポリサッカライドを回収する、約 1M CaCl₂
に再度溶解し、２３％エタノール（ｖ／ｖ）に不溶の汚
染物質をさらに除去する、その後、３７％エタノール
（ｖ／ｖ）でＰＲＰを回収し、最後に、無水アルコール
でトリチル化する。もしくは、前フェノール粉を、0.44
8M酢酸ナトリウム・バッファーに溶解し、0.448M酢酸ナ
トリウム pH 6.9 でバッファーした７２％フェノールで
約４回抽出して、後フェノール粉を生産した後、逆ろ過
により水相からフェノールを除去し、次に、CaCl₂ を約
0.05M まで添加して、エタノールを約６７％まで添加し
て、ＰＲＰを沈澱として回収し、次に、0.05M CaCl₂ に
再度溶解し、２０％エタノールに不溶の汚染物質を除去
し、３７％エタノールに不溶のペレットとして後フェノ
ールＰＲＰを回収し、無水アルコールでトリチル化す
る。もしくは、ＰＲＰを「低域カット」から、フォスフ
ォリパーゼによる処理、上記のように実行するタンパ
ク、エンドトキシンの除去によって、回収してもよい。
もしくは、何らかの適当な手段、できれば、上記、なら
びに、アメリカ特許 5,019,502, 5,039,610や、U.S.S.N
595,722 に記載されているように、ＨＰ２０樹脂によ
る処置によって、エンドトキシン非含有ＰＲＰを生産し
た後であってもよい。

【００３９】本発明の製法に従って調製されるポリサッ
カライドは、現在の分析法では、選択的アルコール分画
法により、エンドトキシンおよび脂質含有莢膜ポリサッ
カライド除去によって生産されたポリサッカライドと化
学的には区別できない。

【００４０】下記の第Ｉ表で、ＰＬＤ処置によって生産
されるＰＲＰの物理化学的性質を、選択的アルコール分
画法によって生産されるＰＲＰの性質と比較する。

【００４１】

【表１】

【００４２】ＰＲＰ生産工程における手順の一つ一つに
ついて、それを最適化する綿密な研究を行なった。この
研究の結果から、第３図に示される条件が得られた。

【００４３】Ａ．酵素反応条件の最適化 一連の実験を行い、低域カット粉からの脂質除去にたい
する酵素活性の感度を、メチル・第３級ブチル・エーテ
ル含有量、トリトン量、温度、基質濃度、酵素量、反応
時間の関数として定めた。これは、作業条件において受
容可能な限界を定めるためである。いずれの場合におい
ても、望ましい条件は、脂肪酸減少の最大レベル、もし
くは、その近傍にある。

【００４４】Ｂ．ＨＰ２０処置の最適化 ＨＰ２０によるＬＰＳ除去手順中に、どのようにしたら
ｐＨのコントロールをよりよく維持できるかについて研
究を行なった。これは、ＰＲＰバックボーン構造の加水
分解の発生をできるだけ抑えるためである。この研究で
は、樹脂を２容量のＤＯＣ／クエン酸ナトリウム溶液で
あらかじめ平衡させ、新鮮バッファー液に接触時のｐＨ
変動や、トリス・バッファーＤＯＣ／クエン酸ナトリウ
ム溶液の使用、およびｐＨの連続的モニターを含む。準
備の平衡をしなかったり、クエン酸ナトリウム／ＤＯＣ
溶液をバッファーしないと、ｐＨは３時間のバッチ吸着
の間に、9.2-9.5 という高さまで変動した。予備平衡し
た場合は、ｐＨ上昇は8.8までに止まった。樹脂を予備
平衡し、さらに溶液を25mMトリスでバッファーすること
によって、ｐＨ変動はさらに抑えられ、<8.5の十分コン
トロールされたｐＨが、バッチ吸着中ずっと維持され
た。ＰＲＰのＨＰ２０処理のその他の条件についても調
べた。脂肪酸のＧＣ分析からも、ＬＡＬデータからも、
エンドトキシン除去の最適条件は、以前用いられていた
2.5mg PRP/ml ではなく、5-10mg PRP/ml で得られた。
この結果からまた、0.5% DOC, 3%クエン酸、50mM Tris,
pH 8.0から成る溶液の方が優れていることが明らかに
なった。その結果、その後のＨＰ２０処理は全て、50mM
Tris, 0.5% DOC, 3% クエン酸、pH 8.0溶液を、ＰＲＰ
濃度 5-10mg/mlで用いて、樹脂を予備平衡させて行なっ
た。

【００４５】Ｃ．逆ろ過手順の評価 ＨＰ２０処置後、ＰＲＰ産物を、Tris, DOC,クエン酸ナ
トリウムを含む溶液に投じ、さらに、その産物を、逆ろ
過によって新たな水溶液に交換しなければならない。２
基の Pellicon 装置、一つは再生セルロースを持ち、他
方はポリスルフォン膜を持つものについて、ポリスルフ
ォン中空繊維カートリッジと共に、ＨＰ２０処理ＰＲＰ
溶液の逆ろ過に対する効果について調べた。再生セルロ
ース膜は、いずれのポリスルフォン膜よりも高い、ＤＯ
Ｃ排除率を示した。一方、Pelliconポリスルフォン膜の
方が、有意に大きい流量を示した。この流量、ＤＯＣ排
除率データから、Prostack装置の方が、現在用いられて
いる中空繊維膜技術よりも効果的であることが示唆され
た。膜面積、処理時間、要求コストを比較して、ポリス
ルフォン膜を含む Prostack 装置が、最高の性能を果た
すと結論された。

【００４６】前記の研究から、酵素反応、４Ｘフェノー
ル抽出、ＨＰ２０処理、逆ろ過、アルコール沈澱から成
る、ＰＲＰ強化製法の最適条件を求め、各手順について
分析し、その動作限界を定めた。強化法は第３図にまと
めた。

【００４７】本製法に従って調製したポリサッカライド
は、遊離ないし複合細菌莢膜ポリサッカライドを含むワ
クチンの調製に有効である。複合ポリサッカライド、特
に、PRP-OMPC複合体は、幼児の病気予防に有効である
が、一方、遊離ＰＲＰは、十分な免疫反応を惹起しな
い。本製法に従って調製したポリサッカライドを用いて
複合体を調製するのは、アメリカ特許 4,695,624の開示
と、ここに呈示される実施例に倣うことによって実行で
きる。この特許は、引用することによってここに組み込
むこととする。

【００４８】本発明の開示は、下記の実施例を参考にす
ることによってさらに理解されよう。ただし、この実施
例は、開示の範囲を限定するものと考えてはならない。

【００４９】

【実施例】実施例１ Haemophilus influenzae b型莢膜ポリサッカ
ライドの調製 発酵 段階Ａ−−接種体、および、種の開発Haemophilus influenzae b型（ニューヨーク州立大学か
ら恵与された、Ross 768から培養したもの，ATCC 9006
）の解凍試験管を、無菌の、Haemophilus 接種体培養
液（下記参照） 1ml中に懸濁し、この懸濁液を、１９個
のチョコレート寒天プレート（ＢＢＬ）に拡散する。恒
温槽で３７℃で２０時間インキュベーションの後、各プ
レートの生育物を、Haemophilus 接種体培養液 1-2mlに
再懸濁し、プールした。

【００５０】

【表２】

【００５１】段階Ｂ−−２ｌの、無障壁エーレンマイヤ
ー・フラスコ 「段階Ａ」（上記）で得られた再懸濁細菌の３分の１を
用いて、２ｌフラスコ３個に接種した。各フラスコは、
約 1.0l の Haemophilus種・生産完全培養液（下記参
照）を含んでいる。次に、このフラスコを、200 rpm の
回転撹拌器上で、３７℃で、約５時間インキュベートし
た。インキュベーション期間終了時のOD₆₆₀ 値は、通
常、0.37であった。

【００５２】

【表３】

【００５３】塩類とソイ・ペプトンは、小量の熱い発熱
物質非含有水に溶解し、熱い発熱物質非含有水を加え
て、正しい最終容量にした。次に、この発酵器ないしフ
ラスコを、約２５分１２１℃で滅菌し、冷却後、酵母抽
出逆ろ過物（１）、グルコース（２）、ＮＡＤ（３）、
ヘミン（４）を、無菌的にフラスコないし発酵器に加
え、接種に備えた。

【００５４】（１）酵母抽出逆ろ過物−−100gビール酵
母抽出物（Amber ）を、１リットルの蒸留水に溶解し、
H10X50カートリッジ付き Amicon DC-30 中空繊維で超ろ
過し、分子量 50,000 の分子を除去した。ろ過物を収集
し、0.22m 膜で濾して、滅菌産物として得た。

【００５５】（２）グルコースは、ガラス蒸留水に溶解
した、滅菌２５％溶液として調製した。

【００５６】（３）20mg/ml を含むＮＡＤ保存液を、Mi
llipore フィルター（0.22m ）でろ過して滅菌し、接種
直前に無菌的に加えた。

【００５７】（４）ヘミン３Ｘの保存液を、200mg を0.
1M NaOH に溶解して調製した。容量は、蒸留・滅菌水で
100mlにして調節した。この溶液は、１２１℃で２０分
加熱して滅菌し、最終培養液に無菌的に加え、接種に備
えた。

【００５８】段階Ｃ−−７０ｌ種発酵器 「段階Ｂ」産物３リットルを用いて、41.4l の、Haemop
hilus 種・生産完全培養液（上記のように調製）と、17
mlの UCON B625消泡剤を含む、７０リットルの発酵器に
接種する。ｐＨは、７．４からスタートした。

【００５９】発酵を、３７℃、100 rpm の撹拌により維
持し、光学密度とｐＨ定量でモニターした。これを、通
常 O.D. 0.39に達するまで続けた（約５．５時間）。

【００６０】段階Ｄ−−８００ｌ生産発酵器 「段階Ｃ」の産物、約４０リットルを用いて、必要容量
に合わせ、５７０リットルの生産培養液（上記のように
調製）と、72mlの UCON LB625 消泡剤を含む８００リッ
トル発酵器に接種した。

【００６１】発酵は、３７℃、100 rpm の撹拌で維持し
た。その間、Ｏ．Ｄ．、ｐＨレベルは、Ｏ．Ｄ．が２時
間間隔で変化しなくなるまで、約２時間に１回チェック
した。同じになった時、発酵を停止させた（最終Ｏ．
Ｄ．は、通常、１２時間後で 0.54 であった）。

【００６２】収穫と非活性化 バッチの約６００リットルを、１２リットルの 1% チメ
ロサールを含む「キル・タンク」に取り込むことによっ
て、非活性化した。

【００６３】澄明化 ４℃で８時間非活性化した後、バッチを、４インチ・ボ
ール Sharples 遠心器で遠心した。この際、流量は、産
物澄明度を維持するように調節した（1.3 から3.0 l/分
の間を変動）。遠心後（15,000 rpm）に得られた上清
を、産物回収に用いた。

【００６４】超遠心による単離と濃縮 ２個の生産発酵から得た上清液をプールし、１０本の
（50,000 ダルトン、カットオフ）中空繊維カートリッ
ジ（２７５平方フィートの膜面積）を備えた、Romicon
超ろ過装置により２−８℃で濃縮した。これにより、約
４．５時間後、１２００リットルが３２．５リットルに
濃縮された。ろ液は廃棄した。

【００６５】４８％、６１％エタノール沈澱 ３２．５リットルの Romicon保持液に、９５％エタノー
ル３０リットルを撹拌しながら４℃で１時間に渡って滴
下し、最終的に容量で４８％エタノールとした。この混
合液をさらに４℃で、２時間撹拌した。これは、完全な
沈澱を確保するためである。上清を、４インチ Sharple
s 遠心器で15,000 rpmで１回遠心して（流速＝0.27l/
分）収集した。不溶のペレットは廃棄し、澄明な液体
を、９５％エタノール、２０．８リットルを１時間に渡
り添加して、６１％エタノールとした。この混合液をさ
らに３時間撹拌し、完全な沈澱を確保した。

【００６６】第２ペレットの回収 得られた４８％エタノール溶解性、６１％エタノール不
溶性沈澱を、４インチSharples遠心器、15,000 rpm（流
速＝ 0.62l/ 分）で収集し、６１％エタノール上清液を
廃棄した。粗産物収量は、0.377kg の湿ペーストであ
り、これを粗ＰＲＰと呼ぶことにする。

【００６７】塩化カルシウム抽出 ６１％エタノール不溶性原料の 377g を、Daymax拡散容
器中で、２−８℃で、冷ガラス蒸留水６．５リットルと
混合した。この混合液に、冷 2M CaCl₂ ・ H₂O 6.5l
を加え、その混合液（最終濃度＝ 1.0M CaCl₂ ）を、４
℃で、１５分抽出した。次に、容器を、 1M CaCl₂ ・ H
₂ O 2lですすぎ、最終的に１５リットルの容量とする。

【００６８】２３％エタノール沈澱 上記のCaCl₂ 抽出物１５リットルを、９５％エタノール
４．４８リットルを撹拌しながら、４℃で、３０分に渡
り滴下して、２３％エタノールとした。さらに１７時間
撹拌後、混合液を、Ｋ２超遠心器で25,000 rpm（流速、
165ml/分）、４℃、６．５時間で遠心した。上清液を、
チーズ布で傾斜採取し、脂質様の浮遊性物質を除去し、
また、不溶のペレットは廃棄した。

【００６９】３７％エタノール沈澱と粗製品ペーストの
収集 ２３％エタノール可溶上清液を、９５％エタノールを撹
拌しながら３０分に渡り滴下して、３７％エタノールと
した。次にこの混合液を、１時間撹拌しながら放置し、
さらに、撹拌なしで１４時間放置した。これは、完全な
沈澱を確保するためである。次に、得られた混合液を、
４インチ Sharples 装置で、15,000 rpm（流速＝ 0.2l/
分）で遠心し、ペレット状の粗ポリサッカライド（以
後、前フェノール粉と呼ぶ）を収集した。

【００７０】トリチル化 遠心によって得たペレットを、１リットルの無水アルコ
ールを含む、１ガロンの Waring 混合器に移し、最高速
度で、３０秒ブレンドした。ブレンドは、３０秒実行、
３０秒休息とし、硬い、白い粉が得られるまで続けた。
この粉を、テフロン・フィルター円盤を備えたブフナー
漏斗に集め、そのままで、無水アルコール１リットルず
つ２回、アセトン２リットルずつ２回で、この順序で洗
浄した。次に、この材料を４℃で、２４時間真空乾燥
し、製品６８ｇ（乾燥重量）を得た。

【００７１】フェノール抽出 トリチル化手順で得られた、６８グラムの乾燥材料を、
0.488M酢酸ナトリウム、pH 6.9 １２リットル中に、Da
ymax拡散容器を用いて、再懸濁した。この酢酸ナトリウ
ム溶液を、直ちに、新鮮なフェノール水溶液４．４８リ
ットルで抽出した。抽出は、下記のように行なった。90
0ml の、0.488M酢酸ナトリウム pH 6.9を、２０リット
ルの圧力容器中で、フェノール（Mallinckrodt 結晶）
の５ポンド瓶に加え、完全な溶液が得られるまで混合し
た。各フェノール抽出物を、Ｋ２超遠心器（Electronuc
leonics ）で、30,000 rpmで２1/2 時間、４℃で遠心し
た。これは、乳化顆粒を分断するためである。流出水溶
液を、さらに３回、新鮮なフェノール水溶液３．２リッ
トルで、同様に抽出した。フェノール相は廃棄した。

【００７２】逆ろ過 上記のフェノール抽出物（１７．６リットル）から得た
水相を、冷ガラス蒸留水で希釈し、３個のH10P10カート
リッジを用いて、Amicon DC-30超ろ過器により４℃で逆
ろ過した。Amicon装置をすすぎ、すすぎ液を保持液に加
えた。これにより、最終容量は、17.5l になった。超ろ
過液は廃棄した。

【００７３】６７％エタノール沈澱 2.0M CaCl₂ の 0.438リットルを、前手順で得た透析物
17.5 リットルに加え（CaCl₂ の最終濃度は 0.05Mであ
った）、さらに、この溶液に、９５％エタノール 35,88
リットルを急速に撹拌している中に１時間に渡り滴下し
て、６７％エタノールとした。撹拌４時間後、４℃でさ
らに１２時間放置した後、澄明な上清液をサイフォンで
除去し、沈澱を、４インチ Sharples 遠心器（15,000 r
pm）で、４℃で、４５分遠心して収集した。得られたポ
リサッカライド・ペレットを、１ガロンのWaringブレン
ダーにおいて、２リットルの無水アルコールにより、３
０秒オン・３０秒オフ法を用いて、トリチル化し、これ
を、テフロン・フィルター円盤を組み込んだブフナー漏
斗に収集し、そのままで、無水アルコール１リットルず
つ４回、その後、アセトン１リットルずつ２回で洗浄し
た。次に、標本をその重量を測定した皿で、真空中で４
℃で２０時間乾燥した。産物は、３９グラムの乾燥粉
（以後後フェノール粉と呼ぶ）であった。

【００７４】実施例２ フェノール殺Haemophilus infl
uenzae b型由来粗ＰＲＰの調製 実施例１と同じ発酵工程に従う。ただし、１％チメロサ
ールの代わりに、病原体は、０．５％フェノール添加に
よって殺し、また、フェノール中での細胞のインキュベ
ーションは１時間で、その後、最低１時間、キル・タン
クに移した。以下は実施例１と同じ操作に従い、前フェ
ノール粉を得た。

【００７５】実施例３ 低域カットの調製と、それから
の脂質非含有ＰＲＰの回収 実施例１による後フェノール粉の製造に次いで、残留エ
ンドトキシンを、選択的アルコール分画によって除去
し、エンドトキシン非含有ＰＲＰ標本と、低域カットと
呼ばれるエンドトキシン含有分画を得た。これは、次の
ようにして実行した。すなわち、後フェノール粉を0.05
M CaCl₂ に、2.5g/lとなるように溶解し、エンドトキシ
ン、ＰＲＰの両方に、２価の対抗イオンを得た。次に、
アルコールを２６％（ｖ／ｖ）となるように加えた。温
度を２から４℃範囲の定常値に平衡させた後、アルコー
ルを少しずつ添加し、これをＰＲＰが沈澱し始める（曇
点）まで続けた。これにより濁度が発生したが、これを
濁度プローブによってモニターした。

【００７６】エタノール（９５％）を曇点で加え、それ
から、さらに１．９％を加えた。生じた沈澱を「低域カ
ット」と呼ぶ。このアルコールを加えたら、溶液を直ち
に遠心し、低域カットを取り出し、それからリポＰＲＰ
を本発明の製法によってさらに処理し、さらに下に記述
するやり方で脂質非含有ＰＲＰを収穫した。この上清
に、さらにアルコールを３８％（ｖ／ｖ）になるまで添
加した。所望の沈澱を、静置および・または遠心によっ
て収集し、乾燥させて、最終的に粉にした。曇点の 1.2
-2.0% 上での、この手順における通常の回収量は、後フ
ェノール粉の２５−４５％であった。ＰＲＰの残りは、
低域カットにある。

【００７７】選択的エタノール分画手順を実行した後に
得られる低域カット物質は、沈澱性のリポポリサッカラ
イド、およびリン酸ポリリボシルリビトールを含んでい
るが、これをさらに、750ml バッファー（10mM Tris ，
5mM CaCl₂ ，4.5mM Triton X-100，pH 7.4と、等容量の
メチル・第３級ブチル・エーテル対エタノールの９対１
混合物）に溶解した、低域カットの 20g/l溶液に、3000
UのフォスフォリパーゼＤを加えて反応処理した。反応
は２．５時間進行させ、その後、その材料を、水性産物
２．６部当り１部のフェノール（酢酸ナトリウムに溶解
した７２％溶液）を用いて、４回フェノール抽出した。

【００７８】ＰＬＤ処理の低域カットから、エンドトキ
シンは、０．５％デオキシコール酸ナトリウムおよび３
％クエン酸ナトリウムと、ｐＨ８で混合して、除去し
た。ＨＰ２０を、１グラムのポリサッカライドにつき３
０グラムの樹脂の割合で、加えた（この樹脂は、使用前
に、発熱物質非含有水で洗浄した）。ばらばらのビーズ
を、軌道振とう器上で、４℃、３時間、その溶液と混合
した。混合後、ビーズを、溶液からステンレス・スティ
ールのフィルター漏斗に移した。次に、ろ過物を、ポリ
サッカライド推定濃度≦2.5mg/mlを維持しながら、Pell
icone ポリスルフォン 10,000 分子量カットオフ膜（１
平方フィート表面面積）対１０倍容量発熱物質非含有水
で逆ろ過し、洗剤とキレート剤を除去した。保持液を回
収し、2M塩化カルシウムを加え、最終的に、0.05M の塩
化カルシウム濃度を得た。ポリサッカライドは、過剰な
９５％エタノールにより、溶液から沈澱させた。この沈
澱を、13,000xgで３０分遠心し、ペレットを無水アルコ
ールとアセトンでトリチル化し、さらに真空乾燥した。
最後の粉末を標本容器に移し、−７０℃に凍結した。

【００７９】樹脂で処理した材料は、下記のようなエン
ドトキシン・レベル、ポリサッカライド・レベル、リポ
ＰＲＰ（ＧＣによる脂肪酸）レベルの低下を示した。

【００８０】

【表４】

【００８１】本製法は一貫して、約６８％の製品回収率
を与える。これは、原料に対する最終産物の重量比であ
る。本産物は、物理化学的性質において、選択的アルコ
ール分画法によって得たＰＲＰ製品と区別できない。

【００８２】実施例４ 前フェノールＰＲＰ粉の脱脂質 Ａ．フォスフォリパーゼＤ反応 前フェノールＰＲＰ粉（２０グラム、実施例２ないし３
に従って調製されたもの）を、１．３３リットルの 10m
M Tris，5mM CaCl₂ ，4.5mM Triton X-100，pH7.4に溶
解した。この溶解したＰＲＰに、メチル・第３級ブチル
・エーテル対エタノールの、９：１混合物１．３３リッ
トルを加えた。フォスフォリパーゼＤ（Genencor, 合計
3,000単位、比活性 70u/mg ，15単位/100mg PRP）を加
えた。反応を、240 rpm で撹拌し、３５℃で３時間進行
させた。

【００８３】反応後、有機相と水相を、２５ー３５℃で
３０分分離させ、下の水相を保存した。有機相は、0.26
6 リットルの水で再度抽出し、３０分間静置してから最
初の抽出液と結合し、合計1.560 リットルの水容量を得
た。

【００８４】フェノール（１．５キログラムを、0.448M
酢酸ナトリウム、pH 6.9の 590mlと平衡させたもの）を
暗黒中で溶解した。この水相を、２．６部の水性後フェ
ノール標本当り１部のフェノールを用いて、４回抽出し
た。

【００８５】Ｂ．ＨＰ２０処理 ＨＰ２０（三菱化成，300g）を、50mM Tris ，0.5% DO
C，3%クエン酸ナトリウム、pH 8.0（ＨＰ２０平衡バッ
ファー）の 1300ml に予備平衡させた。後フェノール標
本の 1060ml に対して、1060mlの、100mM Tris，1% DO
C，6%クエン酸ナトリウム、pH 8.0を加え、全容量2120m
lを得た。次に、この標本を、予備平衡させたＨＰ２０
樹脂と撹拌しながら４℃で２時間混合した。樹脂をろ過
してカラムに落し、このカラムを、200ml の HP20 平衡
バッファーですすいだ。次に、ＨＰ２０の全通過量を１
リットルに濃縮し、１０リットルの冷発熱物質非含有水
に対して逆ろ過した。

【００８６】Ｃ．製品回収 この１リットル標本にたいして、25mlの 2M CaCl₂ を加
えた。４℃、３０分の遠心で沈澱を収集し、次に、ペレ
ットを１００％エタノール 20ml でトリチル化した。エ
タノールはろ過して取り去り、ＰＲＰ粉はアセトンで乾
燥し、脱リポＰＲＰ合計９．６グラムを得た。これは、
下記のような特徴を持っていた。

【００８７】

【表５】

【００８８】実施例５ フォスフォリパーゼＡ₂ ，フォ
スフォリパーゼＤ処理ＰＲＰの製造、 NEISSERIA MENINGITIDIS B の OMPC との複合、その複
合体の免疫原性 Ａ．酵素処理 ＨＰ２０処理後フェノール粉（3g）を、600ml のリン酸
バッファー、pH 7.1，0.1%デオキシコール酸、33% エー
テルに、5mg/ml PRPの濃度となるように溶解した。フォ
スフォリパーゼＡ₂ （ブタ、70 u/mg PRP,比活性 600 u
/mg ）とフォスフォリパーゼＤ（Streptomyces chromof
uscus ， 0.2u/mg PRP, 比活性 70u/mg）（いずれも Bo
ehringer Mannheim, Inc.から入手）を加え、撹拌しな
がら、２５℃で３時間反応を進行させた。有機相は廃棄
したが、水相は 300mlに濃縮し、3000mlの水に対して逆
ろ過した。この標本を 600mlおよび、CaCl₂ の最終濃度
が5mMになるように希釈し、ＰＲＰを、エタノールを４
０％まで添加して沈澱させ、2.6gのＰＲＰを得、これを
複合に用いた。

【００８９】Ｂ．ＰＬＡ₂ ／ＰＬＤ処理ＰＲＰの誘導 上記のようにＰＬＡ₂ ，ＰＬＤで処理した後ＨＰ２０Ｐ
ＲＰ（1.9g）を、57mlの滅菌水に溶解した。シュウ酸二
水化物（0.31g ）を、15.5mlの滅菌水に溶解し、先の溶
解ＰＲＰをゆっくりと加えた。４０％テトラ−ｎ−ブチ
ルアンモニウム・ヒドロキシド（5ml ）でｐＨ５に調節
し、１％テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム・ヒドロキシ
ド（2ml ）を加え、ｐＨをシュウ酸溶液にて 6.98 に調
節した。次にこの溶液をろ過し、フィルターをすすぎ、
標本全容量として178ml の PRP-Bu4N を得た。

【００９０】この溶液に67mlの DMFを加え、回転蒸留器
により容量を68mlに減らした。ＤＭＦ 67ml をさらに３
回加え、その度に67mlに濃縮した。カルボニル・ジイミ
ダゾール（0.22g ）をＤＭＦに溶解し、Ｎ₂ 雰囲気下に
ＰＲＰ溶液にゆっくりと加え、３５分熟するにまかせ
た。１，４−ブタンジアミン・ジヒドロクロリド（Ｂｕ
Ａ₂ ）（15.96g）を456ml 滅菌水に溶解し、50% NaOH,
5ml を添加してｐＨを 10.39に調節した。次に、このＢ
ｕＡ₂ をゆっくり PRP-CDZに加え、約１２℃に維持し
た。

【００９１】約５分後、６８％リン酸（50ml）を加え、
６８％リン酸を 5ml滴下して、ｐＨを7.02に調節した。
この点での容量は 530mlであった。

【００９２】この標本を、Amicon超ろ過装置において、
10,000 MW カットオフを用いて95mlに濃縮し、1520ml p
H7リン酸バッファーに対して逆ろ過した。超ろ過装置を
25mlずつのリン酸バッファーで３回洗い、これをPRP-Bu
A2保打液と合せ、全量102mlとした。ホウ酸ナトリウム
（3.95%,31.8ml) を、次にPRP-BuA2に加えた。

【００９３】ｐＨを、2.5N NaOH 2ml により９．２に調
節した。次に、ブロモアセチル・クロリド（1.71ml）を
ゆっくりと添加し、その間、ｐＨは2.5N NaOH を用いて
９．２に維持した。次に、ｐＨを６８％リン酸（0.5ml
）で７．０に調節した。PRP-BuA2-BrAc は、Amicon超
ろ過装置で95mlに濃縮し、次に、1520ml pH 7 リン酸バ
ッファーに対して逆ろ過を行い、容量を38mlに調節し
た。装置は、リン酸バッファーで洗い、洗浄液を合わせ
て、79.5mlのPRP-BuA2 -BrAcを得た。

【００９４】Ｃ．ＯＭＰＣ−ＳＨの調製Neisseria meningitidis b型由来の OMPC (1.16g) を、
116ml の滅菌水に溶解し、600ml のホウ酸バッファーに
対して逆ろ過し、最終容量 159mlを得た。EDTA(0.8g),
ジチオトレイトール（DTT)(0.12g) を滅菌ホウ酸バッフ
ァーに溶解し、溶解したタンパクに加えた。Ｎ−アセチ
ルホモシステイン・チオラクトン（1.03g ）を滅菌水に
溶解し、さらに、タンパク、ＥＤＴＡ、ＤＴＴの混合物
に加え、２２時間反応させた。

【００９５】次に、このチオール化タンパクを 116mlに
濃縮し、pH 8のリン酸バッファー 1440ml に対して逆ろ
過し、濃縮により最終容量 127mlとした。この時点でタ
ンパク定量すると、6.75mg/ml タンパクであり、Ellman
アッセーでは、タンパクのミリグラム当り 0.3μモルＳ
Ｈであった。

【００９６】Ｄ．誘導ＰＲＰとＯＭＰＣ−ＳＨの複合化 PRP-BuA2-BrAc 溶液のｐＨを、2.5N NaOH で７．９に調
節した。ｐＨ調節したPRP-BuA2-BrAc の72mlに、上記Ｂ
節で調製したチオール化OMPCの全てを加え、Ｎ₂ 雰囲気
下で複合化を１９時間進行させた。

【００９７】この複合体を170ml に濃縮し、 pH 7 のリ
ン酸バッファー 1700ml に対して、さらにpH 8のリン酸
バッファー 1640ml に対して逆ろ過し、複合体最終容量
231mlを得た。

【００９８】複合体上の未反応のブロモセチル基を、Ｎ
−アセチルシステアミン（pH 8のリン酸バッファーに
0.95gを溶解させたもの）を加えてキャップし、反応を
１８時間進行させた。次に、キャップした複合体を 170
mlに濃縮し、2550mlのＴＥＤバッファーに対して逆ろ過
した。複合体を一晩熟成させ、もう一度2550mlのＴＥＤ
バッファーに対して逆ろ過した。最終標本容量 285mlを
回収した。

【００９９】平行して行なった実験で、選択的アルコー
ル分画法によって製造された 2.31gのＰＲＰを、上記の
ように複合化して330ml の複合体を得た。この２個の複
合体の物理化学的性質を平行的に分析してみると、サイ
ズ排除性クロマトグラフィー、発熱物質、ＰＲＰ／タン
パク、免疫原性分析において、両者は区別できなかっ
た。

【０１００】Ｅ．アカゲザル幼児におけるこの複合体の
免疫原性 酵素処理、脂質非含有ＰＲＰ複合体ワクチンは、Vella
and Ellis [PediatricRes. 29, 10 (1981)], Vella et
al., [Pediatrics Supplement, 85, 668(1990)]の定量
法によるアカゲザル幼児に対するテストにおいて、十分
に免疫原性を持つことが判明した。この脂質非含有複合
体は、選択的アルコール分画法によって調製されたＰＲ
Ｐから調製されたものとほぼ等しい免疫原性を示した。
水性（15mcg ）、水酸化アルミニウム（1mcg）（第４、
５表）のいずれの処方においても、４２日後であった。
第５表に示したように、水性酵素処理脂質非含有ワクチ
ンは、３匹の動物において、10.9 mcg/ml というＧＭＴ
（幾何平均抗体価）をもたらした。

【０１０１】

【表６】

【０１０２】

【表７】

【０１０３】実施例６ 「低域カット」からの脂質非含有ＰＲＰの回収 低域カット（15g ）を、750ml のバッファー（10mM Tri
s ，5mM CaCl₂ ，4.5mM Triton X-100，pH 7.4）に溶解
した。フォスフォリパーゼＤ（20U 東洋醸造／100mg PR
P, 70 U/mgで3,000U）を加えた。メチル・第３級ブチル
・エーテル対エタノール（9:1 ）（750ml ）の混合物を
加え、240rpmで撹拌した。反応を、３５℃で２．５時間
進行させた。ＰＬＤをさらに2964単位加え、それから、
反応液を室温で２０分静置して、相に分離させた。ＰＲ
Ｐ水相を保持した。有機相を150ml の水で抽出し、156m
l 以下の相は最初の水相に加えた。

【０１０４】水相の 950mlを、酢酸ナトリウムで平衡さ
せたフェノールで、フェノール：水＝1:2.6 の割合で、
４回抽出した。

【０１０５】次に、このフェノール抽出ＰＲＰをクエン
酸／ＤＯＣ（0.5% DOC, 3%クエン酸ナトリウム、5mM Tr
is, pH 8.0）で予備平衡させたＨＰ２０樹脂４５０グラ
ムと、室温で２時間処理した。ビーズをろ過し、水相を
保持した。ビーズ沃液のバッファー 292mlを水相全体と
合わせ、逆ろ過した（Pellicon, １平方フィート、10,0
00 mw カットオフ膜）。このＰＲＰを１ｌに濃縮し、エ
タノールを４０％まで加えて、沈澱させた。沈澱をろ過
で収集し、９５％エタノール中でトリチル化し、アセト
ン中で乾燥した。

【０１０６】本実施例において得られたＰＲＰは、調べ
た全てのパラメータにおいて、選択的アルコール分画に
よって得られたＰＲＰと等しいことが判明した。

【０１０７】実施例７ Haemophilus influenzae b型のフェノール非活性化 １ｍｌ当り約１０⁹ 生物体を含む、H.influenzae培養体
を、発酵サイクルの終了時に、発酵培養体にフェノール
を最終濃度約０．５％（ｗ／ｖ）になるように加えて、
非活性化する。フェノール濃度の確認後、培養体を撹拌
中の「キル・タンク」に移す。ここで、培養体をフェノ
ールに３７℃で最短１時間暴露する。後述の実験室実験
では、０．５％フェノールの存在下、７分後に培養体の
活性は10 ^-8となったが、生産規模での非活性期間は、高
度の安全性を実現するために１時間に延長した。

【０１０８】培養体非活性化実験（実験室規模）H.influenzae 培養体は、３７℃の振とう培養器で、静止
相まで培養した。１ｍｌ当り約１０⁹ 個の細胞を含む培
養体を小分けし、３７℃で、0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6%
(w/v)フェノールに暴露した。0.2%, 0.3%のフェノール
濃度では、１０分間の暴露時間内に培養体を非活性化す
る効果はほとんどなかった。しかしながら、0.4%, 0.5%
フェノールでは、かなりの割合の非活性化が得られた。
0.5%フェノールでは７分後、プレート・アッセーでは、
生細胞は検出されなかった。このアッセーでは、フェノ
ール存在下に約１０ CFU/ml の下限感度を持つことが証
明されている。0.4%, 0.5%両フェノール濃度における非
活性動態は、２相性であることが判明した。０．６％フ
ェノールでは、非活性化はきわめて急速であって、フェ
ノール暴露後、３０秒後には生細胞は検出されなかっ
た。

【０１０９】生産規模における非活性化実験 １ｍｌ当り約１０⁹ 個の生物体を含む反応器を、約０．
５％フェノールにし、CFU/mlを、暴露時間の関数として
定量した。サンプリングのやり方に制限されて、１分お
きに２回の測定しかできなかった。この反応器は、フェ
ノールの完全な拡散のために、６分の混合時間を要する
が、最初の３分で、１０⁷ の減少が観察された。５分
後、プレート・アッセーで、生細胞は検出されなかっ
た。このアッセーでは、フェノール存在下に、約１０ C
FU/ml の下限感度を持つことが証明されている。

【０１１０】実施例８ フォスフォリパーゼＤの除去 ＰＲＰ強化製法は、ＰＲＰの最終粉末からＰＬＤを有効
に除去するために設けられた。ＰＲＰに存在する残留酵
素の量は、後述のいくつかの方法で推定された。その方
法の中には、最終ＰＲＰ標本における、ＰＬＤや酵素活
性の直接定量、工程処理中標本におけるＰＬＤ分析、工
程の各手順におけるＰＬＤスパイク回収実験がある。さ
らに、免疫定量に用いるために、ＰＬＤに対して抗体を
育成しようという試みもなされた。上記の方法をそれぞ
れ後述する。

【０１１１】ＰＲＰ最終粉末におけるＰＬＤの直接定量 クーマッシー染色と組み合わせた SDS-PAGE （ＰＬＤ標
本は、銀ではよく染まらない）による、ＰＲＰ最終粉末
におけるＰＬＤの直接定量により、ＰＬＤの残留濃度
は、検出限界（<250ng PLD/ レーン）よりも低いことが
明らかになった。ゲルへの負荷を最大にして、残留ＰＬ
Ｄ濃度は、<5ng/mg PRP すなわち<0.0005%に相当する。
この検出限界は、<1ng/ 用量に等しい。

【０１１２】ＰＲＰ最終粉末を、残留ＰＬＤ酵素活性に
ついても定量したが、活性は検出されなかった。酵素活
性の検出限界は、6ng PLD/ml (6x10^-4 U PLD/ml ）で、
これは、<64pg 活性ＰＬＤ/mg PRP に相当する。さらに
実験を行なって、ＰＬＤをフェノールに暴露すると、こ
の酵素は非活性化されることが明らかになった。

【０１１３】工程処理中の標本におけるＰＬＤの直接分
析 工程製造中の標本について、直接、残留ＰＬＤをクーマ
ッシー染色による SDS-PAGE によって定量した。最初の
フェノール抽出後、ＰＲＰにおけるＰＬＤ濃度は、検出
限界以下になった。この限界は、<5ng PLD/mg PRP とい
うＰＬＤ濃度に相当する。このことから直接測定によ
り、最初のフェノール抽出はＰＬＤ濃度を、ほとんど１
０³ 減少させたことが示された（反応混合液における〜
2.4mcg PLD/mg PRP から、第１フェノール抽出液におけ
る5ng PLD/mg PRP未満への減少）。さらに３回のフェノ
ール抽出で処理することによって、ＨＰ２０処理、アル
コール沈澱は、それ以上にＰＬＤ除去を実現することに
なる。もっとも、その濃度はあまりに低すぎて、直接定
量することはできなかった。

【０１１４】ＰＬＤスパイク回収実験 工程処理中の標本における残留ＰＬＤ濃度は、低すぎて
直接定量することができないので、広範なシリーズのス
パイク回収実験を実験室で行い、各分離手順当りに除去
されるＰＬＤ量を推定した。３種の異なる分離手順が、
酵素除去に有効であるとされた。

【０１１５】先ず、フェノール抽出のＰＬＤ除去の有効
性を調べた。20mg PRP/ml に 8mg/ml から濃縮したＰＬ
Ｄ溶液に対し、４回フェノール抽出し、それぞれの水相
について、SDS-PAGEによりＰＬＤをモニターした。単一
のフェノール抽出後、ＰＬＤ濃度は、クーマッシー染色
によるSDS-PAGEによる250ng PLD/レーンという検出限界
を下回った。この限界は、８００倍の減少、すなわち、
ほぼ１０³ の除去を表す。もう一つの実験では、１バッ
チのＰＬＤをフルオレセン−５−イソチオシアネート
（ＦＩＴＣ）で蛍光的に標識した。このFITC標識ＰＬＤ
を用いて、酵素の分配係数をフェノールにおける酵素濃
度の関数として蛍光分光計によって測定した。この方法
では、ＰＬＤ検出レベルがさらに１０倍増加した。この
方法によってもまた、１回のフェノール抽出が酵素レベ
ルを少なくとも１０² 減少させることが確認された。

【０１１６】ＰＬＤ除去にたいするＨＰ２０処理の効果
を調べるために、5mg PRP/mlのＰＬＤのＨＰ２０にたい
する吸着等温式を測定した。等温式の急峻な勾配は、こ
の樹脂がＰＬＤに対して強い親和性を持つことを示して
おり、その親和性は、ＨＰ２０処理という特定の条件下
ではＰＬＤに対して少なくとも１０² の除去に相当す
る。４回のフェノール抽出に続くこの手順での残留酵素
は既にきわめて低いが、上記データからかりに何かの残
留酵素があったとしても、それはさらにＨＰ２０樹脂に
対する選択的吸着により除去されることが明かである。

【０１１７】最後に、小規模のスパイク実験では、酵素
の９０％が、アルコール沈澱により上清に残留してい
た。したがって、この最終手順はさらに１０倍除去の可
能性をもたらす。

【０１１８】上記研究から、酵素の大部分は（>99.99%
）、４回のフェノール抽出によって除去されることが
示された。ＰＲＰ存在下における水相とフェノール相間
の酵素の分配係数は１０² と定量されているので、４回
のフェノール抽出で理論的には１０⁸ 倍の除去をもたら
し得る。しかしながら、１０³ 倍除去という控えめな推
定値をこの手順に与えた。吸着等温測定に基づき、ＨＰ
２０吸着では、１０² 倍除去と推定した。１０倍ＰＬＤ
減少を、アルコール分画操作に割り当てた。以上まとめ
ると、全酵素につき１０⁶ 倍除去という内輪の推定を、
このＰＲＰ増強製法に割り当てた。実際の除去率は、理
論的には、１０¹¹という高い値を取り得る。

【０１１９】下の表は、上記除去実験の所見をまとめた
ものである。最終行は、各定量法に対し、用量当りの残
留ＰＬＤの計算値を示す。計算はすべて、300mcgのＰＲ
Ｐは、複合反応を経過して15mcg 用量を生ずるという前
提に基づいている。これは、用量当りの残留酵素量を推
定するに当り、控えめなやり方である。

【０１２０】

【表８】

【０１２１】実施例９ 増強法ＰＲＰとアルコール分画法ＰＲＰの比較分析 増強法によって製造されたＰＲＰのロットは全て、広範
な分析テストにかけた。これは選択的アルコール分画法
によって製造されたＰＲＰ標本との、化学的、物理的相
似性を調べるためである。この分析の結果は、下記に述
べる。

【０１２２】Ａ．ＮＭＲ分析 増強ＰＲＰ法によって調製されたＰＲＰの、３個の生産
レベル相当ロットと、選択的アルコール分画法によって
製造された代表的な１ロットとを、プロトンＮＭＲ分析
したところ、この標本同士はほとんど等価であることが
判明した。この標本のスペクトラムは、δＨ＝3.72から
5.2の領域で同一パターンを示した。

【０１２３】Ｂ．炭水化物組成分析 ＰＲＰ標本の組成対比を、ＰＲＰ標本中のサッカライド
成分の同一性、相対量を定量することによって評価し
た。これは、ＰＲＰ標本の酸性加水分解と、それに続く
炭水化物成分（リビトールとリボース）の定量によって
行なった。定量は、パルス式電流検出による高ｐＨアニ
オン交換クロマトで行なった。増強ＰＲＰデモ用３ロッ
ト、選択的アルコール分画法の代表的ＰＲＰ２ロットを
分析した。リビトール対リボースのピーク面積比に基づ
く両標本の比較分析から、この５ロットはほとんど同一
であることが判明した。さらに、微量成分ピークも、５
標本全てにおいてほぼ等しかった。この成分レベルは、
リビトールないしリボースに比べ、１モル％未満であっ
た。

【０１２４】Ｃ．脂肪酸分析 選択的アルコール分画製品ＰＲＰと増強法ＰＲＰ製品に
ついて、脂肪酸の比較分析を行なった。前者の製法によ
るＰＲＰ製品は、変動する少量の脂肪酸を含んでおり、
一方、増強法ＰＲＰ標本は、≦0.002% (w/w)の脂肪酸を
含んでいる。分析は、脂肪酸メチルエステルの毛細管ガ
スクロ分析によった。

【０１２５】Ｄ．分子サイズ分析 セファローズ４Ｂ分析 ＰＲＰ標本の分子サイズを、屈折率検出によるセファロ
ーズ４Ｂカラム・クロマトによってここに定量した。こ
れによって、相対的溶出量（Ｋｄ）という形で、ＰＲＰ
標本の相対的分子サイズの尺度が得られる。代表的標本
のＫｄを下に示す。この分析からは、五つのＰＲＰ標本
には、分子サイズに目立った差は認められなかった。

【０１２６】

【表９】

【０１２７】ＨＰＳＥＣ総合較正分析 セファローズ４Ｂ分析に加えて、上記ＰＲＰ標本それぞ
れの分子サイズ及び多分散性を、オンラインの比粘度、
屈折率検出による、高速サイズ排除クロマトによって調
べた。この分析は、酢酸アンモニウムを展開相とする、
TSK G4000 PWXLカラムを用いて行ない、各ＰＲＰ標本ご
とに相対的分子量（Ｍｐ）、多分散指数（ＰＩ）を計算
することができる。増強法ＰＲＰの３個のデモ用ロット
と、選択的アルコール分画法ＰＲＰの２個の代表的ロッ
トの分析によって得られたクロマトグラムを、下にまと
めた。合計２９個の選択的アルコール分画製造ＰＲＰロ
ットの分析による平均結果も表の中に示す。

【０１２８】

【表１０】

【０１２９】上記の結果から、増強法によって製造され
たＰＲＰ標本の方が、選択的アルコール分画法によって
製造されたＰＲＰ標本よりもやや大きく、多分散性も高
いとしてよいであろう。

【０１３０】上記の分析の他に、上記増強法ＰＲＰ標本
の各々に相当する誘導ＰＲＰ、ならびに、選択的アルコ
ール分画法誘導ＰＲＰの代表的標本について、分子サイ
ズを分析した。ＰＲＰ誘導体標本（ブロモアセチル・ブ
タンジアミン形）の分子サイズ、多分散性を、セファロ
ーズ４Ｂクロマトと、HPSEC-総合較正法によって調べ
た。この分析の結果を下に示す。

【０１３１】

【表１１】

【０１３２】上記の結果から、誘導によってＰＲＰのサ
イズは減少すること、増強法ＰＲＰ誘導体、選択的アル
コール分画法ＰＲＰ誘導体の分子サイズは、ほとんど等
しいことが明かである。

【０１３３】Ｅ．相対的抗原性分析 ＰＲＰ抗原含有量は、通常、比濁速度分析によって定量
する。ある標本の抗原濃度のポリサッカライド濃度に対
する比は、その標本の相対的抗原性を与える。増強ＰＲ
Ｐの３個のデモ用ロットと、選択的アルコール分画法Ｐ
ＲＰの２個の代表的ロットについて、このような分析を
行なった結果を下に示す。この５個の標本において、相
対的抗原性は実験誤差範囲内で等価であった。

【０１３４】

【表１２】

【０１３５】実施例１０ 動物免疫原性テスト結果 Ａ．アカゲザル幼児における免疫原性 アカゲザル幼児は従来から、ヒト幼児におけるH.influe
nzae複合体ワクチンの免疫原性を表す、前臨床免疫原性
モデルとして使用されている。Haemophilus b複合体ワ
クチン（髄膜炎菌タンパク複合体）は、この種において
広範に調べられており、きわめて免疫原性の高いことが
分っている（Vella et al., Pediatrics, 85, 668, 199
0; Vella and Ellis, Pediatric Research 29, 10, 199
1 ）。１年にごく少数のサルしか入手できないので、わ
れわれは、各ワクチンをテストするのに、グループ当り
３−６匹のサルを使用できるにとどまった。系統外種で
あるので、Haemophilus b 複合体ワクチン（髄膜炎菌タ
ンパク複合体）に対する、個々の幼児ザルの抗ＰＲＰレ
ベルには、約１００倍にも上る変動が観察された。グル
ープ・サイズの小さいことと、系統外種であるために、
このアカゲザル幼児は、上記ワクチンの免疫原性に関す
る、定量的というよりはむしろ定性的モデルとなる。わ
れわれは、陽性反応を投与後２回の濃度が>1mcg 抗-PRP
/ml であるとした。これは、PRP, PRP-D, またはHbOCワ
クチンでは実現できない濃度である。Haemophilus b 複
合体ワクチン（髄膜炎菌タンパク複合体）では、一貫し
てこの濃度を実現している。

【０１３６】増強ＰＲＰ法によるＰＲＰから調製したHa
emophilus b 複合体ワクチン（髄膜炎菌タンパク複合
体）に対する、アカゲザル幼児の抗ＰＲＰ反応は、もと
の研究や、定常製造ロットのもの、選択的アルコール分
画法によって調製された生産ロットのものとほぼ等しか
った。テストに用いたのは、実験室で増強法によって製
造したＰＲＰを用いて得た、実験調製複合体、増強ＰＲ
Ｐの３ロットから造られた４個の複合体ロットである。
全部で、合計２４匹のサルを、増強ＰＲＰ法由来のＰＲ
Ｐで調製した（髄膜炎菌タンパク複合体）Haemophilus
b 複合体ワクチンで免疫化した。２４匹のサル全てが、
投与後２回濃度で、>1mcg 抗-PRP/ml を実現した。上記
データから、増強法によるＰＲＰから調製した Haemoph
ilus b複合体ワクチン（髄膜炎菌タンパク複合体）と、
選択的アルコール分画法によるＰＲＰから調製したもの
とは、この定性的免疫原性モデルにおいて、免疫原的に
等しいことが証明された。

【０１３７】Ｂ．マウス免疫原性データ 増強法ＰＲＰから調製したHaemophilus b 複合体ワクチ
ン（髄膜炎菌タンパク複合体）の能力試験についても、
BALB/cマウスについて行なった。遺伝的に純系種であ
り、かつほぼ無制限に入手できるので、このマウスにお
ける能力試験は、本ワクチンの免疫原性にたいする定量
性モデルとなる。このモデルにおいて、ワクチンの連続
５倍希釈液を調製し、これを各グループ８匹、各ワクチ
ン・ロットに対して合計４０匹のマウスに注射する。５
０％マウス（ED₅₀）の血清が抗ＰＲＰに対して陽性とな
るように、血清変換するのに有効な用量を、４０匹のマ
ウスから成る各組について計算する（ED₅₀が低ければ低
いほど、能力は高い）。ＰＲＰ増強法によるＰＲＰから
調製した、Haemophilus b 複合体ワクチン（髄膜炎菌タ
ンパク複合体）の、異なる４個のロットについて得たED
₅₀値は、従来からヒト幼児において免疫原性を持つこと
が判明している、基準コントロールのHaemophilus b 複
合体ワクチン（髄膜炎菌タンパク複合体）と同一範囲に
ある。上記データから、定量性モデルにおける免疫的等
価性が証明された。

【０１３８】実施例１１ 増強ＰＲＰ法に使用されたH. influenzae の発酵ロット
について、その培養体純度、H.influenzae非活性化、Ｐ
ＲＰ抗原含有量をテストしたが、その結果はすべて満足
すべきものであった。

【０１３９】増強法によって調製された３ロットのＰＲ
Ｐを、その後、Haemophilus b 複合体ワクチン（髄膜炎
菌タンパク複合体）の製造に用いた。誘導されたHaemop
hilus b ポリサッカライド・バルクを、完全な対照設定
テストにかけたところ、テスト結果はすべて、増強法Ｐ
ＲＰから得られた原料は、選択的アルコール分画法によ
る同様の原料と区別できないことを示した。

【０１４０】最終容器原料のテスト結果から、増強法に
よるＰＲＰから調製された、Haemophilus b 複合体ワク
チン（髄膜炎菌タンパク複合体）は、アルコール分画に
よるＰＲＰから調製した製品と同質であることが確認さ
れた。

【図面の簡単な説明】

【図１】脂質ＰＲＰの推定構造式である。（１）−
（４）フォスフォリパーゼＡ₁ ，Ａ₂ 、Ｃ，Ｄ、（５）
グルコース領域

【図２】選択的アルコール分画法によるＰＲＰ生産と、
リポＰＲＰを酵素的にＰＲＰに変換し、その後、酵素除
去、ＬＰＳ除去した場合のＰＲＰ生産を、比較した図で
ある。（１）発酵（2x650L),（２）濃縮、（３）エタノ
ール分画、（４）フェノール抽出、（５）後フェノール
粉、（６）選択的エタノール分画、（７）ＰＲＰ製品、
（８）ＰＲＰ強化製法、（９）酵素反応、（１０）フェ
ノール抽出、（１１）酵素除去、（１２）ＨＰ２０処
置、（１３）ＬＰＳ除去、（１４）ＰＲＰ製品、（１
５）低域カット製品

【図３】リポＰＲＰを脂質非含有ＰＲＰに変換し、か
つ、エンドトキシンを除去するために最適化した工程を
示す図である。（１）フェノール非活性化前フェノール
ＰＲＰ粉、（２）酵素処理反応条件−−０．３％（ｗ／
ｗＰＲＰ）フォスフォリパーゼＤ（S. chromofuscus ）
45% MTBE+ 5% EtOH，0.3%トリトン、5mM CaCl₂ ，10mM
トリス、pH 7.4，2-3 時間、３５℃、静置、傾斜採取
（３）エーテル層を除去する、（４）４回フェノール抽
出、（５）酵素を除去する、（６）HP20吸着、（７）Ｌ
ＰＳを除去する、（８）Prostack逆ろ過、（９）アルコ
ール沈澱、（１０）脂質非含有ＰＲＰ製品、（１１）収
量：＞８０％

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成４年８月２８日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００２

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００２】本発明の一実施態様は、脂質非含有ポリリ
ボシル・リビトール・フォスフェート、以後ＰＲＰと呼
ぶ、の製造に用いられた。このＰＲＰは、病原性細菌Ｈ
ａｅｍｏｐｈｉｌｉｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｂ型、
これもＨｉｂと呼ぶことにするが、培養体から得た莢膜
ポリサッカライドである。得られたＰＲＰは、Ｈｉｂに
よる病気の発症を予防する免疫反応を誘発するためのワ
クチン調製用の成分として適当である。本発明から、同
じような共有結合脂質を持つ他の病原性細菌、例えば、
Ｅ． ｃｏｌｉないしＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎ
ｇｉｔｉｄｉｓの莢膜ポリサッカライドも同様にして製
造できることが予想できる。なお、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌ
ｉｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｂ型は、ＡＴＣＣ ９７
９５，１０２１１，３１４４１，３１５１２ 又は３３
５３３ として寄託されており、入手可能である。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４９】

【実施例】実施例１ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚ
ａｅ ｂ型莢膜ポリサッカライドの調製発酵 段階Ａ−−接種体、および、種の開発Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ型
（ニューヨーク州立大学から恵与された、Ｒｏｓｓ ７
６８から培養したもの）の解凍試験管を、無菌のＨａｅ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ接種体培養液（下記参照） １ｍｌに
懸濁し、この懸濁液を、１９個のチョコレート寒天プレ
ート（ＢＢＬ）に拡散する。恒温槽で３７℃で２０時間
インキュベーションの後、各プレートの生育物を、Ｈａ
ｅｍｏｐｈｉｌｕｓ 接種体培養液１−２ｍｌに再懸濁
し、プールした。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） 7804−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｒ 1:36） 7804−4Ｂ (72)発明者 ウオルター・イー・マンガー アメリカ合衆国、ペンシルバニア・19438、 ハーレイズビル、グリーン・バンク・ウエ イ・106 (72)発明者 マーク・エス・リーンストラ アメリカ合衆国、ペンシルバニア・19446、 ランズデイル、ボニー・レイン・405 (72)発明者 ロバート・デイ・シトリン アメリカ合衆国、ペンシルバニア・19444、 ラフアイエツト・ヒル、エマーソン・ドラ イブ・237

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細菌由来の、脂質非含有のものだけでな
   く、リポ莢膜ポリサッカライドをも含む粗ないし精製標
   本から、脂質およびエンドトキシン非含有莢膜ポリサッ
   カライドを、ほとんど莢膜ポリサッカライドを失うこと
   なく調製する方法であって、ほとんど全てのリポ莢膜ポ
   リサッカライドを脂質非含有莢膜ポリサッカライドに変
   換する際、脂質をリポ莢膜ポリサッカライドから分断
   し、遊離脂質とエンドトキシン汚染物質を除去し、脂質
   非含有莢膜ポリサッカライドを回収する前記方法。
2. 【請求項２】 脂質がリポ莢膜ポリサッカライドからフ
   ォスフォリパーゼによって分断される、請求項１記載の
   方法。
3. 【請求項３】 莢膜ポリサッカライドが、Haemophilus
   influenzae b型、Neisseria meningitidis（髄膜炎菌）
   A, B, C, X, Y, W135 または 29E群、もしくは、Escher
   ichia coli K1, K12, K13, K89, K92 またはK100の培養
   体から得られる、請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 莢膜ポリサッカライドが、Haemophilus
   influenzae b型の培養体由来のＰＲＰとリポＰＲＰの混
   合物である、請求項３記載の方法。
5. 【請求項５】 ＰＲＰとリポＰＲＰを含む混合物を、フ
   ォスフォリパーゼＤ単独で、またはフォスフォリパーゼ
   Ａ₂ もしくはフォスフォリパーゼＢと共に、エーテルを
   酵素活性剤として含む有機相中で処理することから成
   る、請求項４記載の方法。
6. 【請求項６】 有機相が、エチル・エーテル、ブチル・
   エーテル、またはメチル・第３級ブチル・エーテルから
   選ばれたエーテル第１成分並びに、メタノール、エタノ
   ール、またはヘキサンから選ばれた第２成分の混合物か
   ら成り、上記第１成分と上記第２成分が、約 20:1 から
   5:1の間の比率で存在する、請求項５記載の方法。
7. 【請求項７】 フォスフォリパーゼが、非哺乳類生物か
   ら得たものである、請求項６記載の方法。
8. 【請求項８】 ＰＲＰとリポＰＲＰから成る混合物を、
   フォスフォリパーゼＤだけで処理することから成る、請
   求項７記載の方法。
9. 【請求項９】 ＰＲＰとリポＰＲＰから成る混合物を、
   重量基準で 0.01 %から 10%のフォスフォリパーゼＤと
   反応させることから成る、請求項８記載の方法。
10. 【請求項１０】 脂質非含有、エンドトキシン非含有の
    ポリリボシル・リビトール・フォスフェート（ＰＲＰ）
    を、ほとんどＰＲＰを損失することなく調製する方法で
    あって、リポＰＲＰ（Haemophilus influenzae b型培養
    体由来の粗ないし精製ポリサッカライド標本中に存在す
    る）を、フォスフォリパーゼＤ（ＰＲＰに対する、フォ
    スフォリパーゼの比率約０．３重量パーセント）と、反
    応混合液（エーテル性有機溶媒混合物を反応容量の３０
    −６０％含み、該有機溶媒は、ジエチル・エーテル、ブ
    チル・エーテル、またはメチル・第３級ブチル・エーテ
    ルから選ばれたエーテルが、第２の有機物（ヘキサン、
    エタノール、またはメタノールから選ばれたもの）と混
    在している）中で、洗剤（デオキシコール酸、またはTr
    iton X-100から選ばれ、０．１％から０．４％の間の濃
    度で存在する）の存在下に、CaCl₂ （約０．１から約10
    mM）を添加して、上記の試薬と競合しないバッファー
    （ｐＨは７．０から８．０の間）中で、２０℃から４５
    ℃の温度で、約３０分から約４時間、反応させることか
    ら成る、前記方法。
11. 【請求項１１】 エーテル性有機溶媒混合物が、約９：
    １の比率のメチル・第３級ブチル・エーテルとエタノー
    ルの混合物であり、その混合物の濃度が反応容量の約５
    ０％である、請求項１０記載の方法。
12. 【請求項１２】 ＰＲＰのフェノール抽出（これは、添
    加フォスフォリパーゼＤを含むタンパク様汚染物質を除
    去するためである）と、フォスフォリパーゼＤ処理の前
    か後で実行される（ＰＲＰやリポＰＲＰを吸収しない）
    疎水性吸着（これは、遊離脂質およびエンドトキシンを
    除去するためである）にＰＲＰを付すことからさらに成
    る、請求項１１記載の方法。
13. 【請求項１３】 ほとんどＰＲＰ損失のない、脂質非含
    有ＰＲＰの製法であって、次の諸手順から成る方法： ａ）Haemophilus influenzae b型を、適当な培養液で培
    養する、 ｂ）Haemophilus influenzae b型を、チメロサールない
    しフェノールで殺す、 ｃ）殺されたHaemophilus influenzae b型の培養液を澄
    明にする、 ｄ）澄明にした培養液を濃縮して、作業可能な容量にす
    る、 ｅ）エタノールを最終濃度約４８％エタノールになるま
    で添加して、培養液中の汚染物質を沈澱し、ＰＲＰを含
    む上清と汚染物ペレットを得、ペレットは廃棄する、 ｆ）エタノールを最終濃度約６１％まで加えて、ＰＲＰ
    を沈澱し、粗ＰＲＰペレットを得る、 ｇ）このＰＲＰペレットに水を加えて溶解し、次に、塩
    化カルシウムを最終濃度1.0Mになるまで加える、 ｈ）エタノールを最終濃度２３％まで加えて、汚染物質
    の不溶性ペレットとＰＲＰを含む上清を得る、 ｉ）エタノールを最終濃度３７％まで加えて、ＰＲＰを
    沈澱する、 ｊ）ＰＲＰペレットを無水アルコールでトリチル化し、
    乾燥してＰＲＰのフェノール処理前粉状物を得る、 ｋ）ＰＲＰ粉の可溶化試料をフェノール抽出する、 ｌ）CaCl₂ を 0.05Mに、アルコールを約６７％になるま
    で加えてＰＲＰを沈澱させ、無水アルコール中でトリチ
    ル化し、フェノール処理後粉状物を得る、 ｍ）フェノール処理後粉状物の可溶化試料から、疎水性
    吸着によりエンドトキシンを除去する、 ｎ）粗ＰＲＰ、前フェノール粉、または後フェノール粉
    中のＰＲＰを、次の手順に進行する前に、フォスフォリ
    パーゼと反応させる。
14. 【請求項１４】 フォスフォリパーゼがＰＲＰに対し約
    ０．３重量パーセントのフォスフォリパーゼＤであり、
    粗ＰＲＰ、前フェノール粉、または後フェノール粉が、
    10mM Tris ，5mM CaCl₂ ， 45%メチル・第３級ブチル・
    エーテル、5%エタノール、0.3% Triton X-100 に溶解し
    ており、これらが約３５℃で、３０分から約４時間まで
    反応させられる、請求項１３記載の方法。