DE69228454T2

DE69228454T2 - Verfahren zum Umwandeln von lipid-haltigen Bakterienkapseln Polysaccharide zu lipid-freien Polysacchariden

Info

Publication number: DE69228454T2
Application number: DE69228454T
Authority: DE
Inventors: Ann L. Lansdale Pa 19446 Lee; Walter E. Harleysville Pa 19438 Manger; Mark S. Lansdale Pa 19446 Rienstra; Robert D. Lafayette Hill Pa 19444 Sitrin
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1991-08-16
Filing date: 1992-08-12
Publication date: 1999-07-15
Anticipated expiration: 2012-08-13
Also published as: BG98470A; EP0528635B1; CN1071699A; CZ28694A3; AU2105492A; FI940700A0; SK18594A3; YU89692A; IL102763A0; NZ243892A; HU9400426D0; ATE176929T1; WO1993004183A1; KR930004473A; DE69228454D1; MX9204721A; CA2075681C; JPH05209002A; CA2075681A1; EP0528635A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von lipidfreiem Kapselpolysaccharid aus Bakterienkulturen, einschließlich typenspezifischem Kapselpolysaccharid aus gramnegativen Bakterien, frei von Endotoxin, ohne einen wesentlichen Verlust des Kapselpolysaccharids mit sich zu bringen. Das Verfahren überführt Kapselpolysaccharid, welches kovalent gebundene Glycerindiester-Gruppierungen aufweist, in lipidfreies Polysaccharid. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Lipopolysaccharide, LPS oder Endotoxin, ebenfalls aus dem Kapselpolysaccharid entfernt, von dem kovalentes Lipid abgespalten wurde.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Verfahren angepaßt an die Produktion von lipidfreiem Polyribosylribitphosphat, im folgenden als PRP bezeichnet, welches das Kapselpolysaccharid ist, das aus Kulturen des pathogenen Bakteriurns Haemophilus influenzae Typ b, auch als Hib bezeichnet, stammt. Das PRP-Produkt ist geeignet als Komponente zur Herstellung von Vakzinen für die Auslösung von Immunantworten, die gegen die Entwicklung von Krankheiten, welche durch Hib verursacht werden, schützen. Aufgrund dieser Erfindung läßt sich voraussagen, daß das Kapselpolysaccharid anderer pathogener Bakterien, welche ein ähnliches kovalentes Lipid aufweisen, wie z. B. in E. coli oder Neisseria meningitidis, in ähnlich hoher Ausbeute hergestellt werden könnte, indem die hier offenbarte Lehre angewandt wird.
FR-A-2316964 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von lipid- und endotoxinfreiem Kapselpolysaccharid aus Bakterien, wobei das LPS eine saure Hydrolyse bei einem pH-Wert zwischen 1 und 4 und einer Temperatur zwischen etwa 30 und 100ºC erfährt, bis sich das LPS in Lipide und Polysaccharid auftrennt, ohne das letztere in solcher Weise abzubauen, daß es seine Eigenschaften verliert, welche es gegen Bestrahlung schützen.
FR-A-2407000 offenbart ein ähnliches Verfahren, worin das Kapselpolysaccharid von Hib mit Ethanol, CetavlonTM (Hexadecyltrimethylammoniumbromid) und einem phosphat-enthaltenden Adsorbens, Hydroxylapatit, gereinigt wird.
Das pathogene Bakterium, Hib, ist für eine Reihe von Krankheiten verantwortlich, die bedeutsamsten davon sind bakterielle Meningitis und eine systemische bakterielle Erkrankung, welche hauptsächlich bei Kindern im Alter von weniger als 5 Jahren auftritt. Kürzlich wurden gegen Hib gerichtete Vakzine zur Anwendung bei Menschen durch die FDA zugelassen, siehe die Ausgabe von 1991 von "Physicians Desk Reference, S. 1476-1478 hinsichtlich PedvaxHIB® von Merck & Co., Inc. und S. 1174-1176 hinsichtlich Hib TITER® von Lederle.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Vakzins gegen Hib wird durch das in den US-Patenten 4,695,624 und 4,882,317 beschriebene Verfahren bereitgestellt. Das in jenem Verfahren eingesetzte PRP stammt aus der Kultivierung von Haemophilus influenzae Type b und der Isolierung einer Polysaccharidfraktion aus dem Kulturmedium. Das isolierte PRP wird dann mit dem Komplex des äußeren Membranproteins aus Neisseria meningitidis b konjugiert, welcher als immunverstärkender Träger für das PRP dient, welches bei Kleinkindern selbst nur ein schwaches Immunogen darstellt.
Um nun auf das US-Patent 4,695,624 einzugehen, dort wird in Spalte 16, Zeile 24, eine 800-I- Fermentation von Haemophilus influenzae Typ b auf 377 g nasse Paste konzentriert. Das PRP wird durch selektive Fällung bei verschiedenen Ethanolkoinzentrationen in Gegenwart von Calciumchlorid gewonnen. In Spalte 17, Zeile 1, werden 68 g trockenes Produkt erhalten, im folgenden als Prä-Phenol-Pulver bezeichnet. Die weitere Aufarbeitung beinhaltet Phenolextraktion und Ethanolfällung und liefert 39 g trockenes Produkt in Spalte 17, Zeile 49, und ergibt dann schließlich am Ende 34,7 g trockenes Produkt in Spalte 18, Zeile 14. Dieses Material wird hier im folgenden als Post-Phenol-Pulver bezeichnet werden. Das Post-Phenol- Pulver kann konjugiert werden oder einer weiteren Reinigung zur Entfernung von Endotoxin unterworfen werden.
Endotoxin ist ein Hauptverursacher der Temperaturerhöhung bei Säugern nach Impfung mit von Bakterien abgeleiteten Immunogenen. Diese sogenannte pyrogene Reaktion kann eliminiert werden durch Entfernung von Lipid A enthaltenden Lipopolysacchariden, im folgenden gleichbedeutend als Endotoxin, Pyrogen oder LPS bezeichnet, aus dem Immunogen. Zur Erreichung dieses Ziels kann das oben erhaltene Post-Phenol-PRP-Produkt weiter gereinigt werden, so daß die vorschriftsmäßigen Standards für Pyrogen erfüllt werden. Bis zur Entwicklung der vorliegenden Erfindung wurde dies erzielt durch den Verlust von etwa 70 des im Post-Phenol-Pulver vorhandenen PRP durch selektive Enthanolfraktionierung. Dies beinhaltet die Fällung von LPS aus dem Post-Phenol-PRP durch Zugabe von Ethanol in einer ausreichenden Konzentration, um gerade die Fällung einzuleiten, der sogenannte Trübungs punkt, wie in US-Patent 5,039,610 und U. S. S. N. 595,722 dargelegt. Ethanol wird bis zum Trübungspunkt zugegeben, an welchem Punkt eine etwa zweifache Zunahme der Trübung erhalten wird. Es werden weitere 0,5-2% Ethanol zugegeben und der Niederschlag, der bisher ein Abfallprodukt darstellte, hier im folgenden als "Low-Cut" bezeichnet, wird erhalten, während lipidfreies PRP in Lösung verbleibt. Low-Cut enthält etwa 70% des PRP und im wesentlichen das gesamte LPS.
In einem Versuch zur Vermeidung des PRP-Verlusts, welcher aus der selektiven Ethanolfraktionierung zur Endotoxinentfernung resultiert, entwickelten die Erfinder des Verfahrens von US-Patent 5,019,502 ein Verfahren zur Entfernung von LPS ohne wesentlichen Verlust an PRP. Das Verfahren beinhaltet den Durchgang von solubilisiertem Post-Phenol-Pulver durch einen hydrophoben Adsorptionsschritt, entweder in diskontinuierlichem Modus oder Säulenchromatographie-Modus und vorzugsweise unter Einsatz nicht-ionischer Harze, an welche Endotoxin bindet, Polysaccharide jedoch nicht binden.
Der Einsatz eines Harzes von hochporösem Styrol- und Divinylbenzol-Copolymer, wie z. B. HP20, entfernt in der Tat im wesentlichen das gesamte Endotoxin quantitativ, während sich eine fast quantitative Ausbeute an PRP ergibt. Dieses Material wird hier im folgenden als Post- HP20-PRP bezeichnet. Ein wesentlicher Anteil des von Hib erzeugten PRP liegt jedoch in Form eines kovalenten Lipo-PRP vor.
Die Möglichkeit, daß PRP von Haemophilus influenzae Typ b als Lipo-PRP erzeugt wird, wurde zuerst von Kuo et al., [J. Bacteriol. 163, 769-773 (1985)] erkannt, wobei Haemophilus influenzae Typ b in einem flüssigen Medium gezüchtet wurde, das mit radioaktivem Palmitat und/oder radioaktiver Ribose ergänzt war. Das aus dem Kulturüberstand gereinigte Polyribosylribitphosphat enthielt sowohl radioaktive Ribose als auch radioaktives Palmitat, welche während der Biosynthese in das PRP inkorporiert worden waren. Es wurde gezeigt, daß Phospholipase A&sub2; (PLA&sub2;)-Behandlung einen Teil des radioaktiven Palmitats aus dem PRP entfernt, wohingegen Methoden, welche eine nicht-kovalente Assoziierung aufheben würden, nicht erfolgreich waren. Eine Struktur für Lipo-PRP wurde nicht angegeben, die präsentierten Daten waren jedoch konsistent mit den Daten, die in einer früheren Veröffentlichung angegeben wurden, welche eine Struktur für die Polysaccharide der Meningokokken-Gruppen A, B, C und von E. coli K92 vorschlug [Gotschlich et al., J. Biol. Chem. 25b, 8915-8921 (1981)]. In der vorliegenden Erfindung offenbarte die Arbeit mit spezifischen Phospholipasen eine Struktur für Lipo-PRP, die mit derjenigen übereinstimmt, welche in der folgenden detaillierten Beschreibung dargestellt wird.
Lipo-PRP bindet nicht an das in der Erfindung von 5,019,502 eingesetzte hydrophobe Harz, aufgrund des untergeordneten hydrophoben Charakters, der dem Lipo-PRP durch die kovalenten Lipide verliehen wird, im Vergleich zu dem dominierenden anionischen Charakter des sehr großen Polysaccharidanteils des Moleküls. So enthielt das nach jenem Verfahren erhaltene Endprodukt einen wesentlichen Anteil von Lipo-PRP sowie lipidfreies PRP. Dieses Lipo-PRP wird entfernt, entweder durch selektive Ethanolfraktionierung, welche einen etwa 70%igen Verlust an PRP mit sich bringt, oder durch Einsatz des hier offenbarten Verfahrens, wodurch im wesentlichen das gesamte PRP als lipidfreies PRP gewonnen wird.
So ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens zur Gewinnung von lipofreiem Kapselpolysaccharid, so daß ein Konjugat-Produkt hergestellt wird, welches nicht unterscheidbar ist von Konjugat, welches unter Verwendung von lediglich der durch selektive Alkoholfraktionierung erhaltenen Fraktion von lipidfreiem Polysaccharid hergestellt wurde. Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Produktion von PRP in hoher Ausbeute, welches die Überführung von Lipo-PRP in lipofreies PRP anstatt der Verwerfung des Lipo-PRP umfaßt. Eine weitere Aufgabe ist die Bereitstellung eines Verfahrens, welches hinsichtlich der Menge und Einheitlichkeit des aus Kulturen von Haemo hilus influenzae Typ b erhältlichen PRP reproduzierbar ist, um die Einheitlichkeit des mit dem so hergestellten PRP hergestellten Konjugat-Vakzins sicherzustellen. Andere Vorteile und Aufgaben der Erfindung werden aus der folgenden vollständigen Beschreibung ersichtlich werden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit zur Herstellung von lipid- und endotoxinfreiem Kapselpolysaccharid aus einer rohen oder gereinigten Präparation, die sowohl lipidfreies Kapselpolysaccharid als auch Lipo-Kapselpolysaccharid, von Bakterien stammend, umfaßt, ohne wesentlichen Verlust des Kapselpolysaccharids, welches umfaßt, daß im wesentlichen das gesamte Lipo-Kapselpolysaccharid durch Abspaltung des Lipids von dem Lipo-Kapselpolysaccharid mittels Behandlung mit Phospholipase D allein oder in Kombination mit Phospholipase A&sub2; oder Phospholipase B in Gegenwart einer organischen Phase, die Ether als Enzymaktivator umfaßt, in lipidfreies Kapselpolysaccharid überführt wird, freies Lipid und Endotoxin-Verunreinigungen entfernt werden und das lipidfreie Kapselpolysaccharid gewonnen wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird Lipo-PRP in lipofreies PRP überführt durch Behandlung einer rohen oder gereinigten Präparation von PRP, das von einer Kultur von Haemophilus influenzae Typ b stammt, durch Abspaltung der kovalenten Lipide von PRP mit Phospholipase D in einem Puffer, der etwa 50 Volumen-% organische Enzymaktivatoren, etwa 0,3% Detergens und etwa 5 mM zweiwertiges Metallkation enthält, bei etwa 35ºC und etwa neutralem pH für etwa 30 Minuten bis etwa 4 Stunden, gefolgt von Entfernung des Enzyms, der restlichen Lipide und Lipopolysaccharide.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1. Vorgeschlagene Struktur von Lipo-PRP.
Fig. 2. Vergleich der PRP-Herstellung unter Anwendung selektiver Alkoholfraktionierung und PRP-Herstellung unter Anwendung enzymatischer Überführung von Lipo-PRP in PRP, gefolgt von der Entfernung des Enzyms und LPS-Entfernung.
Fig. 3. Optimiertes Verfahren zur Überführung von Lipo-PRP in lipofreies PRP und Endotoxinentfernung.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung ist ein Verfahren zur Abspaltung von kovalent gebundenem Lipid von bakteriellem Kapselpolysaccharid und Entfernung des Lipids und der Endotoxin-Verunreinigungen. Es können chemische oder enzymatische Mittel zur Entfernung des Lipids eingesetzt werden. Selektive Ethanolfraktionierung von Polysaccharid müt kovalent gebundenem Lipid führt zu einem Verlust jener Fraktion von Kapselpolysaccharid als Abfallprodukt, die als "Low- Cut" bezeichnet wird. Dadurch, daß die Entfernung von kovalent gebundenem Lipid bewirkt wird, vermeidet das vorliegende Verfahren den Verlust von Kapselpolysaccharid, den selektive Alkoholfraktionierung mit sich bringt, während ein Polysaccharid-Produkt bereitgestellt wird, welches sich eignet zur Herstellung eines freien oder konjugierten Polysaccharid-Vakzins zum Schutz gegen Infektion durch das Pathogen, von dem das Polysaccharid stammt. Kovalentes Lipid kann beispielsweise durch Behandlung mit Hydroxylamin entfernt werden. Das bevorzugte Verfahren zur Abspaltung des kovalenten Lipids von dem Kapselpolysaccharid ist enzymatisch. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Produktion von Polyribosylribitphosphat, PRP, in hoher Ausbeute erzielt (das verbesserte PRP-Verfahren).
Das Verfahren dieser Erfindung läßt sich unter Bezug auf Fig. 1 verstehen. Dargestellt ist eine vorgeschlagene Struktur für Lipo-PRP, basierend auf Studien mit Phospholipasen definierter Spezifität. Die Struktur von lipidfreiem PRP ist dieselbe wie in Fig. 1 gezeigt, mit der Ausnahme, daß keine Diacylglycerin-Gruppierung mit dem Phosphat der PRP- Wiederholungseinheit verestert ist. Ferner wurde die Anwesenheit von Glycerin in Lipo-PRP durch Dionex-HPLC bestätigt und die Anwesenheit von Glukose wurde ebenfalls bestätigt.
Phospholipase A&sub2; (PLA&sub2;) spaltet bekanntermaßen an der angezeigten sn-2-Position von Diacylglycerinen. Wird PRP mit einer Präparation von im Handel erhältlicher PLA&sub2; (Sigma, Boehringer) umgesetzt und die Freisetzung von Fettsäuren durch gaschromatographische Analyse überwacht, so wird eine Verringerung der Palmitoleinsäure [16 : 1 cis 9] jedoch nicht von Palmitinsäure [16 : 1] oder Myristinsäure [14 : 0], von denen alle in Lipo-PRP nachgewiesen werden, festgestellt.
Im Handel erhältliche Phospholipase B (Sigma) war imstande, einen Teil der Palmitin- und Palmitoleinsäuren zu entfernen, jedoch werden die Glucose und das Glycerin durch dieses Enzym nicht entfernt. Ferner schien die Aktivität von Phospholipase C (Sigma) blockiert zu sein und deshalb ist die Position von Glucose so wie in Fig. 1 zugeordnet. Im Handel erhältliche Phospholipase D (Sigma, Genencor, Boehringer) entfernt die gesamte Fettsäure sowie das Glycerin und die Glucose. Jedoch konnte keines dieser Enzyme anfangs allein eingesetzt werden und keines der Enzyme entfernte vor der Optimierung des vorliegenden Verfahrens 100% der Fettsäuren aus PRP. Die vorliegende Erfindung stellt ein optimiertes Verfahren bereit zur Erzielung vollständiger Lipidentfernung unter Verwendung von PLD allein. Darüber hinaus könnten jedoch auch Kombinationen von PLD und PLA&sub2; oder PLB vorteilhaft zur Entfernung kovalenter Lipide eingesetzt werden. In einer Ausführungsform der Erfindung werden Phospholipase A&sub2; und Phospholipase D in Kombination bei Umgebungstemperatur eingesetzt, um kovalentes Lipid vollständig aus Lipo-PRP zu entfernen, und die anschließende Konjugation des lipidfreien PRP-Produkts mit einem immunogenen Protein erweist sich als wirksam, starke Anti-PRP-Immunantworten auszulösen.
Geringere Phospholipaseanforderungen sind wünschenswert, da diese Enzyme teuer sind und da eine verminderte Enzymbeschickung die Entfernung der Enzyme aus dem Produkt erleichtert. Eine vollständige Fettsäureenffemung aus Post-Phenol-Pulver-PRP kann unter Einsatz von 700 E Phospholipase A&sub2; (aus dem Schwein) und 20 E Phospholipase D (aus Streptomyces chromofuscus) zusammen mit 30% Butylether und 0,1% DOC, welche potente Enzymstimulatoren sind, erreicht werden. Es wurde in der Literatur beschrieben, daß Phospholipasen und ähnliche Enzyme extrem empfindlich gegenüber Reaktionszusätzen wie Detergenzien und organischen Lösungsmitteln sind. Insbesondere zeigte Kates, daß Plastid- Phosphatidase C stark stimuliert wurde durch die Zugabe von Ether-Methanol-Mischungen, von denen angenommen wird, daß sie synergistisch wechselwürken, um Substrat- und Enzym- Phasen die Koaleszenz in einem Bereich erhöhter Enzymaktivität zu erlauben [Can. J. Biochem. and Physio, 35, 127 (1957)]. Wir vermuteten, daß ein ähnlicher Mechanismus die Phospholipase-Aktivität bestimmen könnte und untersuchten deshalb die Wirkung von Ether- Methanol-Mischungen auf die Enzymleistung.
Eine Butylether/Methanol-Mischung erwies sich als sehr wirkungsvoller Aktivator für die Phospholipasereaktion. Ein Schema, bestehend aus der Umsetzung von Post-Phenol-PRP- Pulver mit PLA&sub2; und PLD in Gegenwart einer 5 : 1 (Vol./Vol.)-Mischung von Butylether und Methanol, gefolgt von Behandlung mit HP20-Harz zur Verminderung von Endotoxin, resultierte in einer vollständigen Entfernung von Lipiden aus dem PRP. Darüber hinaus wurden die Enzymanforderungen um das 3,5fache für die PLA&sub2; (von 700 E auf 200 E) und das 2fache für Phospholipase D (von 20 E auf 10 E) verringert. Ein zusätzlicher Vorteil des Einsatzes der HP20-Behandlung nach der Enzymreaktion liegt darin, daß das hydrophobe Harz einen Teil des Enzyms aus der Reaktionsmischung absorbiert und somit die Mühe der nachfolgenden Enzym-Clearance erleichtert.
Angesichts des Wunsches, ein Vakzin für die Verabreichung beim Menschen herzustellen, ist es wünschenswert, so wenig Enzym wie möglich einzusetzen, um das Enzym vollständig oder so vollständig wie möglich zu entfernen, und ein Enzym einzusetzen, das aus einer Quelle stammt, welche keine Möglichkeit der Verunreinigung mit Säuger-Viren besitzt. Die Verwendung von Schweine-PLA&sub2; kann unerwünscht sein, da ein erhöhtes Risiko einer unerwünschten immunologischen Reaktion bestehen kann und in jüngster Zeit Befürchtungen aufgetreten sind hinsichtlich nicht nachweisbarer Viren in Produkten, die von Säugern stammen. PLA&sub2;, isoliert aus Streptomyces violaceoruber, wurde unter den gleichen, oben beschriebenen Reaktionsbedingungen bewertet. Die Lipide wurden erfolgreich unter Einsatz einer Kom bination der Phospholipasen von Strentomyces entfernt. Es wurden weitere Experimente durchgeführt, um festzustellen, daß die minimalen Enzymanfoirderungen für 100 mg PRP zwischen 100 und 200 E für Streptomyces-PLA&sub2; und zwischen 2 und 10 E für PLD lagen. Es ist festzuhalten, daß für die Enzyme, welche als Phospholipase A&sub2;, D oder B bezeichnet werden, viele verschiedene Quellen existieren. Schlangengifte sind reiche Quellen von PLA&sub2;, während PLD aus Kohl, Erdnuß und Streptomyces isoliert wurde. Die Wahl einer speziellen Quelle wird hauptsächlich von den oben genannten Bedenken und von der spezifischen Aktivität der im Handel erhältlichen Enzympräparate bestimmt. Ferner ist es möglich, daß andere Lipasen eine ausreichende sekundäre phospholipase-ähnliche Aktivität aufweisen könnten, um sie für unsere Anwendung geeignet zu machen. Die Anwendung dieser anderen Lipasen für diesen Zweck sollte aus dieser Erfindung ersichtlich sein.
Die enzymatischen Verfahren unter Einsatz von entweder der Kombination von Phospholipasen oder von Phospholipase D alleine, um Lipide von Post-Phenol-Pulver-PRP abzuspalten, zeigten sich als sehr reproduzierbar und imstande, sich der Variabilität des Lipidgehalts zwischen phenol- und thimerosal-inaktivierten Kulturen von Haemophilus influenzae b anzupassen. Darüber hinaus wird, wenn der enzymatischen Reaktion eine HP20- Behandlung folgt, das Pyrogen signifikant von 60 EE/pg im Post-Phenol-PRP-Ausgangspulver auf etwa 10 EE/ ug nach der enzymatischen Reaktion bis herunter auf 0,0125 EE/pg nach der HP20-Behandlung verringert. Dies scheint ein ausgezeichnetes Schema zu sein, um eine vollständige Lipidentfernung, signifikante Verringerung von LPS und eine hohe PRP-Ausbeute sicherzustellen. Andere Schemata sind natürlich möglich, wie z. B. früherer Einschluß der Lipase in das PRP-Isolierungsverfahren, wie z. B. in der Fermentationsbrühe oder unmittelbar nach Abtötung der Bakterien. Ebenso werden Änderungen in der Reihenfolge, in welcher die verschiedenen Schritte durchgeführt werden, natürlich von dieser Offenbarung umfaßt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die enzymatische Entfernung des gesamten Lipids aus Lipo-PRP in einer optimierten Reaktion erreicht, welche umfaßt die Umsetzung des PRP mit lediglich Phospholipase D, aus Strepilomvces chromofuscus stammend, bei einem Verhältnis von etwa 0,3 Gewichtsprozent Phospholipase D zu PRP. Dieses Enzym wurde von Imamura und Horiuti [J. Biochem. 85, 79-95 (1979]) bis zur Homogenität gereinigt und ist im Handel über Genencor International erhältlich, es können jedoch, wie oben erwähnt, andere PLD-Quellen eingesetzt werden.
Optimierte Bedingungen für PLD umfassen die Zugabe von Triton X-100, welches ein wirkungsvollerer Enzymaktivator als Desoxycholat, DOC, zu sein scheint. Ferner ist die Aktivität des Enzyms auch sensibel gegenüber der Menge an Ca²&spplus;. Zur Erhöhung der Aktivität des Enzyms wurden 4,5 mM Triton X-100 und Ca²&spplus; (5 mM) zulaegeben, obwohl andere zweiwertige Metallkationen, wie z. B. Magnesium, eingesetzt werden können. Die Zugabe von Calcium zur Reaktionsmischung führt zu der Notwendigkeit, einen anderen Puffer als Phosphat einzusetzen, wie z. B. 10 mM Tris bei pH 7,4. Die Menge der organischen Lösungsmittel, welche der Reaktionsmischung zugesetzt wurde, wurde auf 50% Vol./Vol. erhöht und der Butylether durch Methyl-tert.-butylether ersetzt, welcher die Sicherheitsbedenken verringert. Unter Anwendung dieser modifizierten Enzym-Reaktionsbedingungen und anschließender HP20-Behandlung wurde eine vollständige Entfernung des Lipids aus dem Prä-Phenol-Pulver-PRP erzielt. Die Reaktionen wurden mit jeweils 2 g von zwei verschiedenen Ansätzen von Prä-Phenol-Pulver-PRP wiederholt, um die Reproduzierbarkeit und Wirksamkeit der PLD-Behandlung von Prä-Phenol-Pulver-PRP zu zeigen. Die lipidfreien Produkte wurden zur Molekulargrößenbestimmung durch Sep harose CL4B-Chromatographie untersucht. Die Kd-Werte der Produkte betrugen etwa 0,4-0,5, was für die PRP-Immunogenizität akzeptabel ist. Natürlich können andere Pufferbedingungen oder ähnliche Detergenzien in der Reaktion eingesetzt werden, wie für Fachleute auf diesem Gebiet ersichtlich sein wird.
Das verbesserte PRP-Verfahren wurde in 3facher paralleler Ausführung in der Anlage zur Herstellung von Haemophilus b-Konjugat-Vakzin (Meningokokken-Protein-Konjugat) demonstriert. 6 durch Phenol inaktivierte H. influenzae-Fermentationschargen wurden in der Einheitlichkeits-Testreihe eingesetzt. Die Fermentationschargen wurden auf Kulturreinheit, H. influenzae-Inaktivierung und PRP-Antigen-Gehalt getestet und die Ergebnisse waren alle zufriedenstellend. Drei Produktionschargen von PRP wurden hergestellt und anschließend als Ausgangsmaterialien für die Herstellung von drei großtechnischen Chargen von Haemophilus b-Konjugat-Vakzin (Meningokokken-Protein-Konjugat) eingesetzt. Die Produktgewinnungsausbeuten für drei Chargen von PRP, jeweils ausgehend von zwei Fermentationskulturen, waren etwa 3,5mal höher als Ausbeuten unter Anwendung von selektiver Ethanolfraktionierung.
Drei PRP-Chargen, welche nach dem verbesserten Verfahren hergestellt worden waren, wurden anschließend zur Herstellung von Haemophilus b-Konjugat-Vakzin (Meningokokken- Protein-Konjugat) eingesetzt. Freisetzungstests der derivatisierten Haemophilus b-Poly saccharid-Hauptmenge, der Haemophilus b (PRP-OMPC)-Konjugat-Hauptmenge und des Haemophilus b-Konjugat-Vakzin (Meningokokken-Protein-Konjugat)-Endbehälters, zeigen, daß diese Materialien alle von ähnlichen Materialien aus dem Verfahren der selektiven Alkoholfraktionierung nicht unterscheidbar sind.
Low-Cut-PRP ist der Abfallniederschlag (enthaltend LPS, Lipo-PRP und verlorenes PRP) aus der selektiven Ethanolfraktionierung, welches der letzte Schritt in dem PRP-Produktionsverfahren ist, welches in US-Patent 5,039,610 offenbart wurde. Unter Anwendung derselben verbesserten Reaktionsbedingungen, welche für das Prä-Phenol-Pulver entwickelt wurden, und anschließender HP20-Behandlung wurde eine im wesentlichen vollständige Entfernung des Lipids aus Low-Cut-Pulver mit einer Ausbeute von mehr als 70% PRP erzielt.
Die Reaktionsmischung sollte ein organisches Lösungsmittel enthalten, welches die Phospolipase aktiviert und vorzugsweise mit zwischen etwa 30% und 60% des Reaktionsvolumens vorhanden ist. Der organische Aktivator ist vorzugsweise ein Einer wie Diethylether oder Methyl-tert.-butylether. Der Ether wird vorteilhafterweise in Mischung mit einem zweiten organischen Lösungsmittel wie Hexan, Ethanol oder Methanol in einem Verhältnis von Ether zum zweiten organischen Lösungsmittel zwischen etwa 20 : 1 und 5 : 1 bereitgestellt und ein bevorzugtes Verhältnis ist etwa 9 : 1 Ether zum zweiten organischen Lösungsmittel. In einer stark bevorzugten Ausführungsform werden 9 Teile Methyl-tert.-butylether, welcher weniger flüchtig als Diethylether und somit sicherer zu handhaben ist, mit etwa einem Teil Ethanol gemischt und diese organische Mischung wird der PLD-Reaktion bis zu einer endgültigen organischen Konzentration von etwa 50% zugegeben. Die Bereitstellung des organischen Lösungsmittels scheint einen maximalen Kontakt des Lipid-Substrats und des Enzyms zu unterstützen.
Neben der Bereitstellung des organischen Enzymaktivators ist es wünschenswert, ein Detergens, wie z. B. Desoxycholat oder Triton X-100 oder ein ähnliches Detergens, bereitzustellen, um das Aufbrechen von lipoidalen Aggregaten zu fördern und die Enzym- Substrat-Wechselwirkung zu erhöhen. Das Detergens sollte in einer Konzentration zwischen etwa 0,1% und 0,4% anwesend sein. Es wurde festgestellt, daß die Zugabe von etwa 0,3 Triton X-100 ganz zufriedenstellend ist.
Phospholipase D sollte im Verhältnis zu dem Lipo-Kapselpolysaccharid in ausreichender Menge bereitgestellt werden, um eine vollständige Hydrolyse des kovalenten Lipids innerhalb eines vernünftigen Zeitraums zu erzielen. Die Bereitstellung von zwischen etwa 0,01 und 10 PLD, bezogen auf PRP, und vorzugsweise von zwischen etwa 0,1 und 0,4%, ist geeignet. Natürlich wird die Zugabe von weniger Enzym längere Reaktionszeiten erfordern, während die Zugabe von mehr Enzym die Reaktionszeit verkürzen wird.
Die Maßnahme, für mechanische Bewegung der Reaktion zu sorgen, um alle Reaktionsphasen in Kontakt miteinander zu halten, die Bereitstellung von etwa 0,1 bis 0,4 Gewichtsprozent PLD, etwa 0,1 bis etwa 10 mM zweiwertiges Metallkation, z. B. CaCl&sub2;, in einem Puffer, der mit allen vorgenannten Reagenzien kompatibel ist, z. B. Tris, bei einem pH-Wert zwischen etwa 7,0 und 8,0 und einer Temperatur zwischen etwa 20ºC und 45ºC und vorzugsweise zwischen 30-40ºC erlaubt eine vollständige Entfernung kovalenter Fettsäuren von Lipo-PRP innerhalb von etwa 30 Minuten bis 4 Stunden Reaktionszeit.
Die oben angegebenen Reaktionsbedingungen erwiesen sich Aals ganz zufriedenstellend zur Bereitstellung von PRP, das frei von kovalentem Lipid ist, wobei von PRP-Präparationen von äußerst unterschiedlicher Reinheit ausgegangen wurde. So wurden Prä-Phenol-Pulver, Post- Phenol-Pulver und Post-HP20-Produkt alle unter diesen Bedingungen behandelt und eine einheitliche Produktion von PRP, das frei von kovalentem Lipid war, festgestellt. Weiterhin kann bei der Überführung von Lipo-PRP in einer gegebenen Präparation in freies PRP die Phospholipase, welche nun in der PRP-Präparation anwesend ist, durch Phenolextraktion des Proteinenzyms entfernt werden. Zur Sicherstellung einer vollständigen Entfernung wird die Phenolextraktion vorzugsweise mindestens einmal und bis zu etwa vier Extraktionen wiederholt. Diese Behandlung entfernt nicht nur das zugegebene Enzym, sondern auch etwaige restliche proteinhaltige Verunreinigungen, welche die folgende Konjugation stören könnten oder für unerwünschte Immunreaktionen bei Vakzin-Empfängern sorgen könnten.
Die enzymatische Behandlung des PRP, um PRP ohne kovalente Fettsäuren herzustellen, spaltet auch einige der Fettsäuren von LPS ab. Als Ergebnis der enzymatischen Behandlung wird deshalb das Endotoxin um etwa das 3fache verringert. Diese Niveau der Verringerung ist jedoch gewöhnlich nicht ausreichend, um die Pyrogenizitätsanorderungen zu erfüllen und weitere Schritte sind erforderlich, um restliches LPS zu eliminieren. Zur weiteren Entfernung des Endotoxins können beliebige einer Reihe von Mitteln angewandt werden, die im Stand der Technik bekannt sind, einschließlich selektive Ethanolfraktionierung, hydrophobe Adsorption oder andere Methoden, welche in der Offenbarung, die das US.-Patent 5,019,502 bietet, empfohlen werden. Harze, welche sich für die vorliegende Erfindung eignen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Borat-Avidgel (Amicon), Amberlite XAD und Amberchrome (Rohur & Haas), Octylcellulose (Phoenix Chem.), Silica C8 (Baker), Harze der SP- und HP- Reihen (z. B. SP207, HP20, HP50) (Mitsubishi Chem.). Von diesen Harzen sind HP20 oder HP50 bevorzugt, aufgrund der Lipopolysaccharid-Verminderung, Leichtigkeit der Anwendbarkeit, Verfügbarkeit, Kosten und deren Eigenschaft, eine Bindung an Polysaccharide zu vermeiden. Vorzugsweise wird das Harz vor der Verwendung mit pyrogenfreiem Wasser gewaschen. Noch bevorzugter wird das Harz vor der Verwendung mit saurer Lösung, einer Alkali-Lösung oder einem polaren Lösungsmittel (z. B. Ethanol oder Methanol) und dann mit pyrogenfreiem Wasser gewaschen, und anschließend mit einem Puffer, bestehend aus 3 Natriumcitrat und 0,5% Natriumdesoxycholat, voräquilibriert. Gleichermaßen wird das Polysaccharid vorzugsweise in einem Puffer solubilisiert, der etwa 3% Natriumcitrat und etwa 0,5% Natriumdesoxycholat umfaßt, und dann mit dem wie oben beschrieben präparierten hydrophoben Harz behandelt. Die Zugabe von etwa 25 mM Tris, pH 8,0, ist ebenfalls nützlich, um eine pH-Schwankung zu vermeiden.
Das Kapsel-Polysaccharid, welches kovalentes Lipid enthält, kann entweder vor oder nach der Entfernung von Endotoxin in freies Polysaccharid überführt werden. In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Pulver, das von H. influenzae b-Fermenltationsbrühe stammt, enthaltend Polyribosylribitphosphat, Lipopolysaccharide und verschiedene Lipide und Proteine, in 10 mM Tris, 5 mM CaCl&sub2;, 4, 5 mM Triton X-100, pH 7,4, solubilisiert und eine 9 : 1-Mischung von tert.-Butylether : Ethanol bis zu einer Konzentration von 50% zugegeben. Es werden etwa 0,3 Gewichtsprozent, bezogen auf PRP, an Phospholipase D aus Streptomyces chromofuscus zugegeben und die Abspaltung von Lipiden unter konstanter mechanischer Bewegung bei etwa 35ºC etwa 3 h lang stattfinden gelassen. Das Reaktionsprodukt wird zur Entfernung von proteinhaltigen Verunreinigungen, einschließlich zugesetztem Enzym, viermal mit Phenol extrahiert, um eine Post-Phenol-Probe zu ergeben.
Die Post-Phenol-Probe wird dann in einer Detergens/Chelatbildner-Mischung bei basischem pH-Wert gelöst. HP20-Harz-Perlen, die mit demselben Puffer vorbehandelt wurden, werden zugegeben und mit der PRP-Mischung in einem Orbitalschüttler mehrere Stunden unterhalb von Raumtemperatur gemischt. Die Perlen werden dann aus der Lösung durch Filtration entfernt und das Filtrat diafiltriert, um das Detergens und den Chelatbildner zu entfernen. Das Retentat wird gewonnen und Calciumchlorid zugegeben. Das PRP wird aus der Lösung mit 95%igem Ethanol gefällt. Der Niederschlag wird zentrifugiert und das Pellet mit Ethanol und Aceton trituriert. Das resultierende Produkt wird im Vakuum getrocknet.
Das Verfahren unter Verwendung hydrophober Harz-Perlen führt zu niedrigen Niveaus an kontaminierendem Endotoxin ohne signifikanten Verlust an PRP. Die aus dieser Behandlung resultierende Endotoxinverminderung beträgt typischerweise das 100-21.000fache zwischen Ausgangspulver und Endpulver, je nach dem Anfangsniveau der Endotoxin-Verunreinigung. Die PRP-Ausbeute beträgt typischerweise mindestens 75% und manchmal mehr als 90 des Ausgangsmaterials.
Der "Limulus Ameobocyte Lysat" (LAL)-Test, beschrieben in "Guideline on validation of the LAL test as an end-product endotoxin test for human and animal parenteral drugs, biological products, and medical devices", U. S. Department of Health and Human Services, Dezember 1987, wird zur Bestimmung von Endotoxin-Niveaus eingesetzt.
In einer bevorzugten Ausführung dieser Erfindung wird endotoxinfreies und lipidfreies PRP dadurch bereitgestellt, daß der enzymatischen Behandlung die hydrophobe Adsorption von LPS an HP20 oder ein anderes geeignetes poröses Styrol- und Divinyldibenzol-Copolymer oder ein ähnliches hydrophobes Medium wie oben beschrieben folgt.
Das Kapselpolysaccharid von gramnegativen Bakterien wird nach irgendeinem aus einer Reihe von bekannten Verfahren erhalten, einschließlich derjenigen, welche im US-Patent 4,695,624 für HaemoDhilus influenzae Typ b dargestellt wurden, und der anionischen Kapselpolysaccharide der Neisseria menin itidis (MeningokokN; en-)Gruppen A-, B-, C-, X-, Y-, W135- und 29E-Polysaccharide, und der Escherichia coli K1-, K12-, K13-, K89-, K92- und K100-Polysaccharide. Besonders bevorzugte Polysaccharide sind jedoch diejenigen Kapselpolysaccharide, welche ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Hib-Polysaccharid, wie z. B. beschrieben in Rosenberg et al., J. Biol. Chem., 236, S. 2845-2849 (1961) und Zamenhofet al., J. Biol. Chem., 203, S. 695-704 (1953). In eincsr Ausführungsform dieser Erfindung wird Polyribosylribitphosphat, welches das Kapselpollysaccharid von Haemonhilus influenzae Typ b ist, isoliert durch Fermentation des Pathogens wie im US-Patent 4,695,624 beschrieben. Das Pathogen wird durch Zugabe von 1% Thimerosal oder Zugabe von etwa 0,5% Phenol abgetötet. Die Zelltrümmer werden durch Zentrifugation entfernt und das rohe Polysaccharid durch Ultrafiltration konzentriert, um zu ergeben, was im folgenden als rohes PRP bezeichnet wird. Die Ausbeute an freiem PRP kann durch Überführung von Lipo-PRP in PRP, welches frei von kovalentem Lipid ist, optimiert werden, wenn die enzymatische Behandlung von rohem PRP nach dem oben beschriebenen enzymatischen Verfahren durchgeführt wird, und es kann sogar vorteilhaft sein, die Lipase direkt zum Fermentationsmedium oder bei irgendeinem nachfolgenden Schritt zuzugeben.
Beispielsweise kann die Enzymbehandlung verzögert werden bis nach der partiellen Reinigung durch eine der folgenden Behandlungen oder nach einem Teil irgendwelcher der folgenden Behandlungen oder nach irgendeiner äquivalenten Variante der folgenden Behandlungen: Herstellung von Prä-Phenol-Pulver durch Entfernung von Verunreinigungen, die bei 48% Ethanol (Vol./Vol.) unlöslich sind, Zugabe von Ethanol bis 61%, um Polysaccharid zu gewinnen, erneute Solubilisierung in etwa 1 M CaCl&sub2; und Entfernung weiterer Verunreinigungen, die bei 23% Ethanol (Vol./VoI.) unlöslich sind, gefolgt von PRP-Gewinnung bei 37% Ethanol (Vol./Vol.) und schließlich Trituration in absolutem Ethanol; oder nach Herstellung von Post-Phenol-Pulver durch Solubilisierung von Prä-Phenol-Pulver in 0,448 M Natriumacetatpuffer und etwa viermaliger Extraktion mit 72%igem Phenol, das mit 0,448 M Natriumacetat, pH 6,9, gepuffert ist, gefolgt von Diafiltration, um Phenol aus der wäßrigen Phase zu entfernen, gefolgt von der Gewinnung des PRP als Niederschlag durch Zugabe von CaCl&sub2; auf etwa 0,05 M und Zugabe von Ethanol auf etwa 67º/a, gefolgt von erneuter Solubilisierung in 0,05 M CaCl&sub2;, Entfernung von Verunreinigungen, die in 20% Ethanol unlöslich sind, und Gewinnung von Post-Phenol-PRP als ein in 37% Ethanol unlösliches Pellet und Trituration in absolutem Ethanol; oder PRP kann aus Low-Cut gewonnen werden durch Behandlung mit Phospholipase, Entfernung von Protein und Endotoxin wie oben beschrieben; oder nach Herstellung von Endotoxin-freiem PRF~ durch irgendein geeignetes Mittel, vorzugsweise durch Behandlung mit HP20-Harz wie oben und in US-Patent 5,019,502, 5,039,610 und U. S. S. N. 595,722 beschrieben.
Das nach dem Verfahren dieser Erfindung hergestellte Polysaccharid ist mit gegenwärtigen analytischen Methoden chemisch nicht unterscheidbar von Polysaccharid, welches durch Entfernung von Endotoxin und Lipid enthaltendem Kapselpolysaccharid durch selektive Alkoholfraktionierung hergestellt wird. In Tabelle I unten werden die physikalisch-chemischen Eigenschaften von durch PLD-Behandlung hergestelltem PRP mit den Eigenschaften von PRP verglichen, welches durch selektive Alkoholfraktionierung hergestellt wurde: TABELLE I
Es wurde eine sorgfältige Studie zur Optimierung eines jeden Schritts in dem PRP- Herstellungsverfahren durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Studien ergaben das in Fig. 3 dargestellte Schema.

A. Optimierung von Enzym-Reaktionsbedingungen:

Es wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, um die Sensitivität der Enzymaktivität hinsichtlich der Lipidentfernung aus Low-Cut-Pulver als Funktion von Methyl-tert.- butylether-Gehalt, Menge an Triton, Temperatur, Substratkonzentration, Enzymmenge und Reaktionszeit zu bestimmen, um akzeptable Grenzen der Arbeitsbedingungen festzulegen. In jedem Fall befindet sich die empfohlene Bedingung auf dem maximalen Niveau der Fettsäureverringerung oder in der Nähe.

B. Optimierung der HP20-Behandlung:

Es wurden Studien zur Aufrechterhaltung einer besseren Kontrolle des pH-Werts während des HP20-LPS-Entfernungsschritts durchgeführt, um eine potentielle Hydrolyse des PRP- Gerüsts zu minimieren. Diese Studien umfaßten die Voräquilibrierung des Harzes mit zwei Volumina DOC/Natriumcitrat-Lösung und Verfolgung der pH-Verschiebung während des Kontakts mit einer frischen Pufferlösung, sowie den Einsatz einer tris-gepufferten DOC- Natriumcitrat-Lösung und kontinuierliche Überwachung des pH-Werts. Ohne Voräquilibrierung oder Pufferung der NatriumcitratlDOC-Lösung verschob sich der pH-Wert während einer dreistündigen diskontinuierlichen Adsorption bis auf 9,2-9,5. Im Falle der Voräquilibrierung beschränkte sich die pH-Verschiebung nach oben auf 8, 8. Durch Voräquilibrierung des Harzes und auch Pufferung der Lösung mit 25 mM Tris, pH 8,0, wurde die pH-Verschiebung noch weiter minimiert und ein gut kontroNierter pH-Wert von < 8,5 konnte während der diskontinuierlichen Adsorption aufrechterhalten werden. Andere Bedingungen für die HP20-Behandlung von PRP wurden ebenfalls untersucht. GC- Fettsäureanalyse sowie LAL-Daten legten nahe, daß eine optimale Endotoxinentfemung mit 5-10 mg PRP/ml statt den bisher eingesetzten 2,5 mg PRP/ml erzielt wurde. Die Ergebnisse zeigten auch, daß eine Lösung, welche aus 0,5% DOC, 3% Citrat und 50 mM Tris, pH 8,0, bestand, überlegen war. Als Ergebnis wurden alle nachfolgenden HP20- Behandlungen unter Harz-Voräquilibrierung unter Verwendung einer Lösung von 50 mM Tris, 0,5% DOC, 3% Citrat, pH 8,0, bei einer PRP-Konzentration von 5-10 mg/ml durchgeführt.

C. Bewertung des Diafiltrationsschrittes:

Nach der HP20-Behandlung befindet sich das PRP-Produkt in einer Lösung, die Tris, DOC und Natriumcitrat enthält, und das Produkt muß mittels Diafiltration in eine gereinigte wäßrige Lösung ausgetauscht werden. Zwei Pellicon-Einheiten, eine mit einer Regeneratcellulose und die andere mit einer Polysulfonmembran, wurden zusammen mit einer Polysulfon-Hohlfaser-Kartusche hinsichtlich der Diafiltration der HP20-behandelten PRP- Lösung beurteilt. Die Regeneratcellulosemembran zeigte eine größere DOC-Abweisungsrate als jede der Polysulfonmembranen; jedoch zeigte die Pellicon-Polysulfonmembran einen signifikant größeren Durchfluß. Die überzeugenden Durchfluß- und DOC-Abweisungsdaten legten nahe, daß eine Prostack-Einheit effektiver als die derzeit eingesetzte Hohlfasermembran-Technologie sein würde. Ein Vergleich der Membranfläche, Verfahrenszeit und Kostenerfordernisse führte zur Schlußfolgerung, daß eine Prostack-Einheit mit Polysulfonmembran die beste Leistung ergeben würde.
Anhand der vorangegangenen Studien wurde ein verbessertes PRP-Herstellungsverfahren, bestehend aus Enzym-Reaktion, 4 x Phenolextraktion, HP20-Behandlung, Diafiltration und Alkoholfällung, optimiert und jeder der Schritte untersucht, um die Arbeitsgrenzen festzulegen. Das verbesserte Verfahren ist in Fig. 3 zusammenfassend dargestellt.
Das nach diesem Verfahren hergestellte Polysaccharid ist geeignet zur Herstellung von Vakzinen, die freies oder konjugiertes bakterielles Kapselpolysaccharid enthalten. Konjugierte Polysaccharide, insbesondere PRP-OMPC-Konjugate, sind geeignet zur Verhinderung einer Erkrankung bei Kleinkindern, wohingegen das freie PRP keine ausreichenden Immunreaktionen hervorrufen könnte. Die Herstellung von Konjugat unter Verwendung des nach diesem Verfahren hergestellten Polysaccharids kann erfolgen, indem der Offenbarung des US-Patents 4,695,624, welches hier durch die Bezugnahme mit eingeschlossen ist, und den hier angegebenen Beispielen gefolgt wird.
Die Offenbarung dieser Erfindung läßt sich noch besser anhand der folgenden Beispiele verstehen, welche nicht als Beschränkung für den Umfang der Offenbarung anzusehen sind.

BEISPIEL 1

Herstellung von Haemophilus influenzae Typ b-Kapselpolysaccharid:

Fermentation

A-Stufe: Animpfung und Impfgutentwicklung

Ein lyophilisiertes Röhrchen von Haemophilus influenzae Typ b (kultiviert von Ross 768, erhalten von der State University of New York) wurde in 1 ml sterilem Haemophilus- Impfmedium (siehe unten) suspendiert und diese Suspension auf 19 Schokoladenagar-Platten (BBL) ausgebreitet. Nach 20 h Inkubation bei 37ºC in einem Kerzengefäß wurde das Wachstum auf jeder Platte erneut in 1-2 ml Haemophilus-Impfmedium suspendiert und gepoolt.
Haemophilus-Impfmedium*
Soja-Pepton 10 g/l
NaCl 5 g/l
NaH&sub2;PO&sub4; 3,1 g/l,
Na&sub2;HPO&sub4; 13,7 g/l
K&sub2;HPO&sub4; 2,5 g/l
Destilliertes Wasser bis zur Erreichung des Volumens
* Der pH-Wert der Lösung wurde auf einen Zielwert von 7,2 ± 0,1 eingestellt (ein typischer Wert war pH 7,23) und die Lösung durch Autoklavieren bei 121ºC für 25 Minuten sterilisiert.

B-Stufe: Nicht mit Schikanen versehene 2-l-Erlenmeyerkolben

Ein-Drittel-Portionen der resuspendierten Bakterien aus "A-Stufe" (oben) wurden zur Animpfung von drei 2-l-Kolben, jeweils etwa 1,0 l vollständiges Haemophilus-Impf- und Produktionsmedium (siehe unten) enthaltend, verwendet. Die Kolben wurden dann bei 37ºC auf einem Rotationsschüttler mit 200 UpM etwa 5 h lang inkubiert. Ein typischer OD&sub6;&sub6;&sub0;-Wert am Ende der Inkubationsperiode betrug 0,37.
Vollständiges Haemophilus-Impf- und -Produktionsmedium
NaH&sub2;PO&sub4; 3,1 g/l
Na&sub2;HPO&sub4; 13,7 g/l
Soja-Pepton 10,0 g/l
Hefeextrakt-Diafiltrat (1) 10,0 ml/l
K&sub2;HPO&sub4; 2,5 g/l
NaCl 5,0 g/l
Glucose (2) 5,0 g/l
Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD) (3) 2,0 mg/l
Hämin (4) 5,0 mg/l
Die Salze und das Soja-Pepton wurden in kleinen Volumina heißen, pyrogenfreien Wassers gelöst und auf das korrekte Endvolumen mit weiterem heißen pyrogenfreien Wasser gebracht. Die Fermenter oder Kolben wurden dann etwa 25 Minuten lang bei 121ºC sterilisiert und nach dem Abkühlen wurde Hefeextrakt-Diafiltrat (1), Glucose (2), NAD (3) und Hämin (4) steril den Kolben oder Fermentern vor der Animpfung zugegeben.
(1) Hefeextrakt-Diafiltrat: 100 g Bierhefeextrakt (Amber) wurden in 1 I destilliertem Wasser gelöst und in einer Amicon DC-30-Hohlfaser mit H10x50-Kartuschen ultrafiltriert, um Moleküle mit einem Molekulargewicht von 50.000 zu entfernen.
Das Filtrat wurde gesammelt und durch eine 0,22 um-Membran als steriles Produkt geleitet.
(2) Glukose wurde als sterile 25%ige Lösung in glas-destilliertem Wasser hergestellt.
(3) Eine Stammlösung von NAD, enthaltend 20 mg/ml, wurde mittels Filtration durch ein Millipore-Filter (0,22 um) sterilisiert und steril urmittelbar vor der Animpfung zugegeben.
(4) Eine Stammlösung von Hämin · 3 wurde durch Auflösen von 200 mg in 10 ml 0,1 M NaOH hergestellt und das Volumen mit destilliertem, sterilisiertem Wasser auf 100 ml eingestellt. Die Lösung wurde 20 Minuten lang bei 121ºC sterilisiert und steril dem Endmedium vor der Animpfung zugegeben.

C-Stufe: 70-l-Impffermenter

Drei Liter des Produkts von "B-Stufe" wurden zur Animpfung eines 70-l-Fermenters, enthaltend 41,4 l vollständiges Haemophilus-Impf und -Produktionsmedium (hergestellt wie oben beschrieben) und 17 ml UCON 8625-Antischaum, eingesetzt. Der pH-Wert betrug am Anfang 7,4.
Die Fermentation wurde bei 37ºC mit 100 UpM mechanischer Bewegung aufrechterhalten und mittels Bestimmung der optischen Dichte (OD) und des pH-Werts überwacht, bis eine typische OD von 0,39 erreicht wurde (nach etwa 5,5 h).

D-Stufe: 800-l-Produktionsfermenter

Etwa 40 l des Produkts von "C-Stufe" wurden eingesetzt zur Animpfung eines 800-l- Fermenters, der 570 l Produktionsmedium (hergestellt wie oben beschrieben), im Maßstab auf das erforderliche Volumen vergrößert, und 72 ml UCON LB625-Antischaum enthielt.
Die Fermentation wurde bei 37ºC mit 100 UpM mechanischer Bewegung aufrechterhalten, wobei die OD- und pH-Niveaus etwa alle 2 h überprüft wurden, bis die OD für eine zweistündige Periode gleich war, zu welchem Zeitpunkt die Fermentation abgebrochen wurde (eine typische End-OD betrug 0,54 nach 12 h).

Ernte und Inaktivierung

Etwa 600 l des Ansatzes wurden inaktiviert durch Ernte in einen "Abtötungstank", der 12 l 1%iges Thimerosal enthielt.

Klärung

Nach 8 h Inaktivierung bei 4ºC wurde der Ansatz in 10-cm (4-Inch)-Korb-Sharples-Zentrifugen bei einer Durchflußrate zentrifugiert, die so eingestellt wurde, daß die Klarheit des Produkts erhalten blieb (variabel zwischen 1,3 und 3,0 l/min). Der nach der Zentrifugation (15.000 UpM) erhaltene Überstand wurde zur Produktgewinnung eingesetzt.

Isolierung und Konzentration durch Ultrafiltration

Die Überstandsflüssigkeit aus zwei Produktfermentationen wurde vereinigt und bei 2º-8ºC in einer Romicon-Ultrafiltrationseinheit mit 10 (50.000 Dalton Ausschluß) Hohlfaser-Kartuschen (25,5 m² (275 ft²) Membranfläche) konzentriert, so daß nach etwa 4,5 h 1200 l auf 32,5 l konzentriert worden waren. Das Filtrat wurde verworfen.

48%- und 61%-Ethanolfällung

Zu den 32,5 l des Romicon-Retentats wurden 30 l 95%iges Ethanol tropfenweise im Verlauf von 1 h unter Rühren bei 4ºC bis zu einer Endkonzentration von 48 Volumenprozent Ethanol zugegeben. Die Mischung wurde zwei weitere Stunden lang bei 4ºC gerührt, um eine vollständige Fällung sicherzustellen, und die Überstandsflüssigkeit wurde durch eine einzelne 10-cm (4-Inch)-Sharples-Zentrifuge bei 15.000 UpM (Durchflußrate = 0,27 l/min) gewonnen. Das unlösliche Pellet wurde verworfen und die geklärte Flüssigkeit durch Zugabe von 20,8 l 95%iges Ethanol im Verlauf eines Zeitraums von 1 h auf 61% Ethanol gebracht. Die Mischung wurde drei weitere Stunden gerührt, um eine vollständige Fällung sicherzustellen. Gewinnung des zweiten Pellet;
Der resultierende Niederschlag, der in 48% Ethanol löslich und in 61% Ethanol unlöslich war, wurde durch Zentrifugation in der 10-cm (4-Inch)-Sharples-Zentrifuge bei 15.000 UpM (Durchflußrate = 0,62 l/min) gewonnen und die Überstandsflüssigkeit von 61% Ethanol verworfen. Die Ausbeute an Rohprodukt betrug 0,377 kg nasser Paste, als rohes PRP bezeichnet.

Calciumchlorid-Extraktion

Die 377 g des bei 61% Ethanol unlöslichen Materials wurden in einem Daymax-Dispersionsgefäß bei 2º-8ºC mit 6,5 l kaltem, glas-destilliertem Wasser gemischt. Zu dieser Mischung wurden 6,5 l kaltes 2 M CaCl&sub2; · H&sub2;O zugegeben und die Mischung (Endkonzentration = 1,0 M CaCl&sub2;) 15 Minuten lang bei 4ºC extrahiert. Das Gefäß wurde dann mit 2 l 1 M CaCl&sub2; · H&sub2;O ausgespült, was 15 l Endvolumen ergab.

23%-Ethanolfällung

Die 15 l des obigen CaCl&sub2;-Extrakts wurden auf 23% Ethanol gebracht, indem tropfenweise unter Rühren bei 4ºC im Verlauf von 30 Minuten 4,48 l 95%iges Ethanol zugegeben wurden. Nach weiterem Rühren für 17 h wurde die Mischung durch Birne K2-Ultrazentrifuge mit 25.000 UpM (Durchflußrate - 165 ml/min) 6,5 h lang bei 4ºC zentrifugiert. Die Überstandsflüssigkeit wurde durch Gaze dekantiert, um lipidähnliches flotierendes Material zu entfernen, und das unlösliche Pellet wurde verworfen.

37% Ethanolfällung und Gewinnung von Rohproduktpaste

Die in 23% Ethanol lösliche Überstandsflüssigkeit wurde auf 37% Ethanol gebracht, indem 4,33 l 95%iges Ethanol tropfenweise unter Rühren im Verlauf von 30 Minuten zugegeben wurden. Die Mischung wurde dann unter Rühren 1 h lang stehengelassen, dann ohne Rühren 14 h lang, um eine vollständige Fällung sicherzustellen. Die resultierende Mischung wurde dann in einer 10-cm (4-Inch)-Sharples-Einheit mit 15.000 UpM (Durchflußrate = 0,2 l/min) zentrifugiert, um das pelletierte rohe Polysaccharid zu gewinnen (im folgenden hier als Prä- Phenol-Pulver bezeichnet).

Trituration

Das Pellet aus der Zentrifugation wurde in einen 1-Gallonen-Waring-Mischer überführt, der 1 l absoluten Alkohol enthielt, und 30 Sekunden lang bei der höchsten Geschwindigkeit gemischt. Das Mischen wurde mit 30 Sekunden Einschalten und 30 Sekunden Ausschalten fortgesetzt, bis ein hartes weißes Pulver resultierte. Das Pulver wurde auf einem Büchnertrichter mit einer Teflonfilterscheibe gewonnen und nacheinander in situ mit zwei 1-l-Portionen von absolutem Ethanol und zwei 2-l-Portionen Aceton gewaschen. Das Material wurde dann im Vakuum bei 4ºC 24 h lang getrocknet, was 68 g (Trockengewicht) Produkt ergab.

Phenolextraktion

Die 68 g trockenen Materials aus dem Triturationsschritt wurden in 12 l 0,488 M Natriumacetat, pH 6,9, mit Hilfe eines Daymax-Dispersionsgefäßes res~uspendiert. Die Natriumacetatlösung wurde sofort mit 4,48 l einer frischen wäßrigen Phenollösung extrahiert, die wie folgt hergestellt worden war: 900 ml 0,488 M Natriumacetat, pH 6,9, wurden zu einer 2 l/4 kg- (5-Pound)-Flasche von Phenol (Mallinckrodt, kristallin) in einem 20-l-Druckgefäß zugegeben und gemischt, bis eine vollständige Lösung erzielt war. Jeder Phenolextrakt wurde 2 l/2 h lang bei 30.000 UpM und 4ºC in der K2-Ultrazentrifuge (Electronuchleonics) zentrifugiert, um die Emulsion aufzubrechen. Der wäßrige Ausfluß wurde drei weiteire Male mit 3,2 l frischer wäßriger Phenollösung auf ähnliche Weise extrahiert. Die Phenolphasen wurden verworfen.

Diafiltration

Die wäßrige Phase aus den obigen Phenolextraktionen (17,6 l) wurde mit 300 l kaltem, glasdestilliertem Wasser verdünnt und bei 4ºC mit einem Amicon DC-30-Ultrafiltrationsgerät unter Verwendung von 3 H10P10-Kartuschen diafiltriert. Die Amicon-Einheit wurde gespült und die Spülflüssigkeit dem Retentat zugegeben, so daß das Endvolumen 17,5 l betrug. Das Ultrafiltrat wurde verworfen.

67%- Ethanolfällung

0,438 l 2,0 M CaCl&sub2; wurden den 17,5 l des Dialysats aus dem vorherigen Schritt zugegeben (die CaCl&sub2;-Endkonzentration betrug 0,05 M) und die Lösung auf 67% Ethanol gebracht, indem tropfenweise im Verlauf von 1 h 35,88 l 95%iges Ethanol zu der schnell gerührten Lösung zugegeben wurden. Nach 4 h Rühren und anschließendem Stehen für 12 weitere Stunden bei 4ºC wurde die klare Überstandsflüssigkeit abgesaugt und der Niederschlag durch Zentrifugation in der 10-cm (4-Inch)-Sharples-Zentrifuge (15.000 UpM) bei 4ºC für 45 Minuten gewonnen. Das resultierende Polysaccharid-Pellet wurde in einem 4-l (1-Gallonen)- Waring-Mischer unter Anwendung des Verfahrens mit 30 Sekunden Einschalten und 30 Sekunden Ausschalten mit 2 l absolutem Ethanol trituriert, auf einem Büchnertrichter, der mit einer Teflon-Filterscheibe versehen war, gesammelt und irr situ gewaschen mit vier 1-l- Portionen absolutem Ethanols, gefolgt von zwei 1-l-Portionen Aceton. Die Probe wurde dann in einer austarierten Schale im Vakuum 20 h lang bei 4ºC getrocknet. Die Ausbeute betrug 39 g Trockenpulver (als Post-Phenol-Pulver bezeichnet).

BEISPIEL 2

Herstellung von rohem-PRP aus mit Phenol abgetötem Haemophilus influenzae Typ b:

Es wird der gleichen Fermentationsprozedur wie in Beispiel 1 erfolgt, mit der Ausnahme, daß anstelle von 1%-Thimerosal-Inaktivierung das Pathogen abgetötet wird durch die Zugabe von 0,5% Phenol und Inkubation der Zellen in Phenol für 1 h, gefolgt von Überführung in einen Abtötungstank für ein Minimum von 1 h. Es wurde dann der gleichen Prozedur wie in Beispiel 1 gefolgt, um Prä-Phenol-Pulver zu ergeben.

BEISPIEL 3

Herstellung von Low-Cut und Rückgewinnung von lipidfreiem PRP daraus:

Nach der Herstellung von Post-Phenol-Pulver gemäß Beispiel 1 wurde restliches Endotoxin durch selektive Alkoholfraktionierung entfernt, um eine endotoxinfreie PRP-Präparation und eine Endotoxin enthaltende PRP-Fraktion mit der Bezeichnung Low-Cut zu ergeben. Dies wurde erzielt durch Solubilisierung von Post-Phenol-Pulver mit 2,5 g/l in 0,05 M CaCl&sub2;, um ein zweiwertiges Gegenion für sowohl Endotoxin als auch PRP bereitzustellen. Alkohol wurde dann bis 26% (Vol./Vol.) zugegeben. Nachdem die Temperatur auf einen konstanten Wert im Bereich von 2 bis 4ºC äquilibriert worden war, wurde zunehmend mehr Alkohol zugegeben, bis das PRP auszufallen begann (Trübungspunkt), was eine Trübung verursachte, die durch einen Trübungssensor gemessen wurde.
Ethanol (95%) wurde bis zum Trübungspunkt zugegeben und dann weitere 1,9% zugegeben. Der Niederschlag wird als Low-Cut bezeichnet. Nach der Zugabe des Alkohols wurde die Lösung sofort zentrifugiert, um Low-Cut-Niederschlag zu entfernen, aus dem Lipo-PRP nach dem Verfahren dieser Erfindung weiterbehandelt wurde, um lipidfreies PRP wie im folgenden näher beschrieben zu ergeben. Weiterer Alkohol wurde dem Überstand bis 38 (Vol./Vol.) zugegeben. Der gewünschte Niederschlag wurde mittels Absetzen und/oder Zentrifugation gewonnen und zu dem Endpulver getrocknet. Typische Ausbeuten für diesen Schritt bei 1,2-2,0% oberhalb des Trübungspunkts betrugen 25-40% des Post-Phenol- Pulvers. Der Rest des PRP wird im Low-Cut gefunden.
Das nach der Durchführung des selektiven Ethanolfraktionierungsschritts erhaltene Low-Cut- Material, enthaltend gefälltes Lipopolysaccharid und Polyribosylribitphosphat, wurde weiter behandelt durch Umsetzung einer 20 g/l-Lösung von Low-Cut in 750 ml Puffer (10 mM Tris, 5 mM CaCl&sub2;, 4,5 mM Triton X-100, pH 7,4 und ein gleiches Volumen einer 9 : 1-Mischung von Methyl-tert.-butylether : Ethanol) und Zugabe von 3000 E Phospholipase D. Die Reaktion wurde 2,5 h lang ablaufen gelassen, wonach das Material viermal phenolextrahiert wurde unter Verwendung eines Teils Phenol (72%ige Lösung in Natriumacetat) auf 2,6 Teile wäßrigen Produkts.
Endotoxin wurde aus dem PLD-behandelten Low-Cut durch Mischen mit 0,5% Natriumdesoxycholat und 3% Natriumcitrat bei pH 8 entfernt. HP20-Harz wurde mit 30 g Harz pro Gramm Polysaccharid zugegeben (das Harz wurde vor der Verwendung mit pyrogenfreiem Wasser gewaschen). Die losen Perlen wurden mit der Lösung auf einem Orbitalschüttler 3 h lang bei 4ºC gemischt. Nach dem Mischen wurden die Perlen aus der Lösung in einem Filtertrichter aus rostfreiem Stahl entfernt. Das Filtrat wurde dann in einer Pellicon-Polysulfonmembran mit einem Molekulargewichtsausschluß von 10.000 (0,1 m² (1 ft²) Oberfläche) gegen 10 Volumina pyrogenfreies Wasser diafiltriert, wobei eine geschätzte Polysaccharidkonzentration von ≤ 2,5 mg/ml aufrecht erhalten wurde, um Detergens und Chelatbildner zu entfernen. Das Retentat wurde gewonnen und 2 M Calciumchlorid zugegeben, um eine Calciumchloridendkonzentration von 0,05 M zu erreichen. Polysaccharid wurde aus der Lösung mit einem Überschuß an 95%igem Ethanol gefällt. Der Niederschlag wurde 30 Minuten lang mit 13.000 · g zentrifugiert, das Pellet mit absolutem Ethanol und Aceton trituriert und dann im Vakuum getrocknet. Das Endpulver wurde in einen Probenbehälter überführt und bei -70ºC eingefroren.
Das mit Harz behandelte Material zeigte die folgenden Verminderungen der Endotoxin- Niveaus, Polysaccharid-Niveaus und Niveaus an Lipo-PRP (Fettsäure gemäß GC):

TABELLE 2

LAL-Testwert EE/ug
Anfangspulver 240
Endpulver 0,12
Polysaccharid
Anfangspulver 15 g
Endpulver 10,2 g
Fettsäure (%)
Anfangspulver 0,4.
Endpulver 0,009
Dieses Verfahren ergibt einheitlich ein Produktgewinnungsverhältnis von etwa 68%, welches das Gewichtsverhältnis des Endprodukts zum Ausgangsmaterial ist, und dieses ist in seinen physikalisch-chemischen Eigenschaften nicht unterscheidbar von dem PRP-Produkt, welches durch selektive Alkoholfraktionierung erhalten wird.

BEISPIEL 4

Delipidierung von Prä-Phenol-PRP~-Pulver:

A. Phospholipase D-Reaktion:

Prä-Phenol-PRP-Pulver (20 g, gemäß Beispiel 2 oder Beispiel 3 hergestellt) wurde in 1,33 l 10 mM Tris, 5 mM CaCl&sub2;, 4, 5 mM Triton X-100, pH 7,4, solublilisiert. Zu dem solubilisierten PRP wurden 1,33 l einer 9 : 1-Mischung von Methyl-tert.-butylether : Ethanol zugegeben. Phospholipase D (Genencor, insgesamt 3000 Einheiten, spezifische Aktivität 70 E/mg, 15 Einheiten/100 mg PRP) wurde zugegeben. Die Reaktion wurde bei 240 UpM gerührt und 3 h lang bei 35ºC ablaufen gelassen.
Nach der Reaktion wurde den organischen und wäßrigen Phasen 30 Minuten lang die Trennung bei 25-35ºC gestattet und die untere wäßrige Phase zurückbehalten. Die organische Phase wurde erneut mit 0,266 l Wasser extrahiert, welches 30 Minuten lang absetzen gelassen wurde und dann mit der ersten Extraktion kombiniert, um ein wäßriges Gesamtvolumen von 1,560 l zu ergeben.
Phenol (1,5 Kilogramm, mit 590 ml 0,448 M Natriumacetat, pH 6,9, äquilibriert) wurde im Dunklen gelöst. Die wäßrige Phase wurde viermal extrahiert, wobei ein Teil Phenol auf 2,6 Teile wäßrige Produkt-Post-Phenol-Probe eingesetzt wurde.

B. HP20-Behandlung:

HP20 (Mitsubishi Kasei, 300 g) wurde in 1300 ml 50 mM Tris, 0,5% DOC, 3% Natriumcitrat, pH 8,0 (HP20-Äquilibrierungspuffer) voräquilibriert. Zu 1060 ml der Post-Phenol-Probe wurden 1060 ml von 100 mM Tris, 1% DOC, 6% Natriumcitrat, pH 8,0, zugegeben, um ein Gesamtvolumen von 2120 ml zu ergeben. Diese Probe wurde dann 2 h lang bei 4ºC unter Schütteln mit dem voräquilibrierten HP20-Harz gemischt. Das Harz wurde in eine Säule abfiltriert, welche dann mit 200 ml HP20-Äquilibrierungspuffer gespült wurde. Der gesamte HP20- Durchfluß wurde dann auf 1 l konzentriert und gegen 10 l kaltes, pyrogenfreies Wasser diafiltriert.

C. Produktgewinnung:

Zu der 1-l-Probe wurden 25 ml 2 M CaCl&sub2; zugegeben. Der Niederschlag wurde durch 30- minütige Zentrifugation bei 4ºC gewonnen und das Pellet dann mit 20 ml 100%igem Ethanol trituriert. Das Ethanol wurde abfiltriert und das PRP-Pulver mit Aceton getrocknet, um insgesamt 9,6 g von Lipid befreitem PRP mit den folgenden Eigenschaften zu ergeben: TABELLE 3

BEISPIEL 5

Herstellung von mit Phospholipase A&sub2; und Phospholipase D behandeltem PRP, Konjugation mit OMPC von Neisseria meningitidis b und Immunogenizität des Konjugats:

A. Enzymatische Behandlung:

Mit HP20 behandeltes Post-Phenol-Pulver (3 g) wurde in 600 ml Phosphatpuffer, pH 7,1, 0,1% Desoxycholat, 33% Ether, in einer Konzentration von 5 mg/ml PRP solubilisiert.
Phospholipase A&sub2; (vom Schwein, 70 E/mg PRP, spezifische Aktivität 600 Elmg) und Phospholipase D (Streptomyces chromofuscus, 0,2 E/mg PRP, spezifische Aktivität 70 E/mg) (beide von Boehringer Mannheim, Inc.) wurden zugegeben und die Reaktion 3 h lang bei 25ºC unter mechanischer Bewegung ablaufen gelassen. Die Reaktionsprodukte wurden mit 600 ml Hexan extrahiert, gefolgt von 30-minütiger Zentrifugation bei 20ºC. Die organische Phase wurde verworfen, während die wäßrige Phase auf 300 ml konzentriert und gegen 3000 ml Wasser diafiltriert wurde. Die Probe wurde auf 600 ml verdünnt und auf eine Endkonzentration von 5 mM CaCl&sub2; und das PRP gefällt durch Zugabe von Ethanol bis 40%, was 2,6 g PRP für die Konjugation ergab.

B. Derivatisierung des PLA&sub2;/PLD-behandelten PRP:

Post-HP20-PRP (1,9 g), wie oben beschrieben mit PLA&sub2; und PLD behandelt, wurde in 57 ml sterilem Wasser solubilisiert. Oxalsäure-Dihydrat (0,31 g) wurde in 15,5 ml sterilem Wasser gelöst und das solubilisierte PRP langsam zugegeben. Der pH-Wert wurde mit 40%igem Tetra-n-butylammoniumhydroxid (5 ml), gefolgt von 1%igem Tetra-n-butylammoniumhydroxid (2 ml) auf pH 5 eingestellt und der pH-Wert mit Oxalsäurelösung auf 6,98 titriert. Die Lösung wurde dann filtriert und das Filter gespült, was ein gesamtes Präparationsvolumen von 178 ml PRP-Bu&sub4;N ergab.
Zu dieser Lösung wurden 67 ml DMF zugegeben und das Volumen auf einem Rotationsverdampfer auf 68 ml verringert. Weiteres DMF (67 ml) wurde dreimal zugegeben, wobei das Volumen jeweils auf 67 ml gebracht wurde: Carbonyldiimidazol (0,22 g) wurde in DMF gelöst und langsam der PRP-Lösung unter einer Atmosphäre von N&sub2; zugegeben und 35 Minuten lang stehengelassen. 1,4-Butandiamin-Dihydrochlorid (BuA&sub2;) (15,96) wurde in 456 ml sterilem Wasser gelöst und der pH-Wert durch Zugabe von 5 ml 50%iger NaOH auf 10,39 eingestellt. Das BuA&sub2; wurde dann langsam dem PRP-CD&sub2; zugegeben und bei etwa 12ºC gehalten.
Nach etwa 5 Minuten wurde 68%ige Phosphorsäure (50 ml) zugegeben und der pH-Wert durch tropfenweise Zugabe von 5 ml 68%iger Phosphorsäure auf 7,02 eingestellt. Das Volumen betrug zu diesem Zeitpunkt 530 ml.
Die Proben wurden mit einem Amicon-Ultrafiltrationssystem unter Verwendung eines MG- Ausschlusses von 10.000 auf 95 ml konzentriert. Die Probe wurde dann gegen 1520 ml Phosphatpuffer, pH 7, diafiltriert. Das Ultrafiltrationssystem wurde mit 3 · 25 ml-Aliquots an Phosphatpuffer gewaschen, welche mit dem PRP-BuA&sub2;-Retentat kombiniert wurden, um ein Gesamtvolumen von 102 ml zu ergeben. Dann wurde Natriumborat (3,95%, 31,8 ml) dem PRP-BuA&sub2; zugegeben.
Der pH-Wert wurde mit 2 ml 2,5 N NaOH auf 9,2 eingestellt. Bromacetylchlorid (1,71 ml) wurde dann langsam zugegeben, während der pH-Wert unter Verwendung von 2,5 N NaOH bei 9,2 gehalten wurde. Der pH-Wert wurde dann mit 68%iger (Phosphorsäure (0,5 ml) auf 7,0 eingestellt. Das PRP-BuAz-BrAc wurde mit einem Amicon-Ultrafiltrationssystem auf 95 ml konzentriert, gefolgt von Diafiltration gegen 1520 ml Phosphatpuffer, pH 7, und das Volumen durch Diafiltration auf 38 ml eingestellt. Das System wurde mit Phosphatpuffer gewaschen und die Waschlösungen kombiniert, um 79,5 ml PRP-BuA&sub2;-BrAc zu ergeben.

C. Herstellung von OMPC-SH:

OMPC von Neisseria meningitidis Typ b (1,16 g) wurde in 116 ml sterilem Wasser solubilisiert und dann gegen 600 ml Boratpuffer diafiltriert, um ein Endvolumen von 159 ml zu ergeben. EDTA (0,8 g), Dithiothreit (DTT) (0,12 g) wurde in sterilem Boratpuffer gelöst und dann dem solubilisierten Protein zugegeben. N-Acetylhomocysteinthiolacton (1,03 g) wurde in sterilem Wasser gelöst und dann der Mischung von Protein, EDTA und DTT zugegeben und 22 h lang reagieren gelassen.
Das thiolierte Protein wurde dann auf 116 ml konzentriert und dann gegen 1440 ml Phosphatpuffer, pH 8, diafiltriert, gefolgt von Konzentration auf ein Endvolumen von 127 ml. Ein Protein- Assay zu diesem Zeitpunkt offenbarte 6,75 mg/ml Protein und ein Ellman-Assay offenbarte 0,3 umol SH pro mg Protein.
D. Konjugation von derivatisiertem PRP und OMPC-SH:
Der pH-Wert der PRP-BuA&sub2;-BrAc-Lösung wurde mit 2,5 N NaOH auf 7,9 eingestellt. Zu 72 ml des pH-eingestellten PRP-BuAz-BrAc wurde das gesamte im Unterabschnitt B oben hergestellte thiolierte OMPC zugegeben und die Konjugation 19 h lang unter einer Atmosphäre von N&sub2; ablaufen gelassen.
Das Konjugat wurde auf 170 ml konzentriert, es folgte Diafiltration gegen 1700 ml Phosphatpuffer, pH 7, dem folgte Diafiltration gegen 1640 ml Phosphatpuffer, pH 8, was ein Endvolumen von 231 ml Konjugat ergab.
Nicht umgesetzte Bromacetylgruppen auf dem Konjugat wurden durch Zugabe von N-Acetylcysteamin (0,95 g in Phosphatpuffer, pH 8) mit Endgruppen versehen und die Reaktion 18 h lang ablaufen gelassen. Das mit Endgruppen versehene Konjugat wurde dann auf 170 ml konzentriert und gegen 2550 ml TED-Puffer diafiltriert. Das Konjugat wurde über Nacht stehengelassen und gegen nochmals 2550 ml TED-Puffer diafiltriert. Es wurde ein Endprobenvolumen von 285 ml gewonnen.
In einem parallelen Experiment wurden 2,31 g PRP, hergestellt durch selektive Alkoholfraktionierung, konjugiert wie oben beschrieben, um 330 ml Konjugat zu ergeben. Parallele Analyse der physikalisch-chemischen Eigenschaften der beiden Konjugate zeigte, daß sie durch Größenausschlußchromatographie-, Pyrogen-, PRP/Protein- oder Immunogenizitäts- Analysen nicht unterscheidbar waren.

E. Immunogienizität des Konjugats bei Rhesusaffenbabys:

Von dem enzymbehandelten, lipidfreien PRP-Konjugat-Vakzin wurde gezeigt, daß es bei Rhesusaffenbabys-Tests, die nach dem Assay von Vella und Ellis [Pediatric Res. 29, 10 (1981)] und Vella et al. [Pediatrics Supplement, 85, 668 (1990)] durchgeführt wurden, voll immunogen war. Das lipidfreie Konjugat zeigte eine vergleichbare Immunogenizität wie die Kontrollproben, die mit PRP hergestellt wurden, welches durch selektive Alkoholfraktionierung präpariert worden war, nach 42 Tagen in sowohl wäßrigen (15· ug) als auch Aluminiumhydroxid (1- ug)-Formulierungen (Tabellen 4 und 5). Wie in Tabelle 5 gezeigt, ergab wäßriges enzymbehandeltes lipidfreies Vakzin einen GMT (geometrischer Mittelwerts-Titer) für drei Tiere von 10,9 ug/ml. TABELLE 4 Immunogenizität von "lipidfreien" Hib-Konjugaten bei Rhesusaffenbabys Flüssige, aluminiumhydroxid-adsorbierte Formulierung TABELLE 5 Immunogenizität von "lipidfreien" Hib-Konjugaten und "HP20-behandeltem" Konjugat bei Rhesusaffenbabys Wäßrige Formulierung
() Anzahl der reaktiven Empfänger, die > 1,0 ug Anti-PRP/ml erreichten (RIA)

BEISPIEL 6

Rückgewinnung von lipidfreiem PRP aus Low-Cut

Low-Cut (15 g) wurde in 750 ml Puffer (10 mM Tris, 5 mM CaCl&sub2;, 4, 5 mM Triton X-100, pH 7,4) solubilisiert. Phospholipase D (20 E Toyo Joso/100 mg PRP, 3000 Einheiten mit 70 E/mg) wurde zugegeben. Eine Mischung von Methyl-tert.-butylether : Ethanol (9 : 1) (750 ml) wurde zugegeben und für mechanische Bewegung mit 240 UpM gesorgt. Die Reaktion wurde 2,5 h lang bei 35ºC ablaufen gelassen. Es wurden weitere 2964 Einheiten PLD zugegeben, dann der Reaktion die Phasentrennung für 20 Minuten bei Raumtemperatur gestattet. Die wäßrige PRP-Phase wurde zurückbehalten. Die organische Phase wurde mit 150 ml Wasser extrahiert und die 156 ml der unteren Phase wurden der ersten wäßrigen Phase zugegeben.
Die 950 ml wäßriges PRP wurden viermal mit Phenol extrahiert, das mit Natriumacetat äquilibriert worden war, in einem Verhältnis von Phenol : Wasser = 1 : 2,6.
Das phenolextrahierte PRP wurde dann mit 450 g von mit Citrat/DOC (0,5% DOC, 3% Natriumcitrat, 5 mM Tris, pH 8,0) voräquilibriertem HP20-Harz 2 h lang bei Raumtemperatur behandelt. Die Perlen wurden filtriert und die wäßrige Phase zurückbehalten. 292 ml Puffer- Waschlösung der Perlen wurden mit der Hauptmenge der wäßirigen Phase kombiniert, Welche dann diafiltriert wurde (Pellicon-Membran (0,1 m² (1 ft²)) mit MC~-Ausschluß 10.000). Das PRP wurde dann auf 1 l konzentriert und durch Zugabe von Ethanol bis 40% gefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation gewonnen, in 95%igem Ethanol trituriert und in Aceton getrocknet.
Es wurde festgestellt, daß das in diesem Beispiel erhaltene PRP mit selektiv ethanolfraktioniertem PRP nach allen getesteten Parametern vergleichbar war.

BEISPIEL 7

Phenol-Inaktivierung von Haemophilus influenzae Typ b

Die H. influenzae-Kultur, enthaltend etwa 109 Organismen pro ml, wird am Ende des Fermentationszyklus inaktiviert durch Zugabe von Phenol zur Fermentationskultur bis zu einer Endkonzentration von etwa 0,5% (Gew./Vol.), Überführung der Kultur nach Überprüfung der Phenolkonzentration in einen mechanisch bewegten "Abtötung"-Tank und Aussetzen der Kultur gegenüber Phenol für einen minimalen Zeitraum von 1 h bei 37ºC. Obwohl die im folgenden beschriebenen Laborversuche demonstrieren, daß eine 8-10g-Inaktivierung der Kultur nach einem Zeitraum von 7 Minuten in Gegenwart von 0,5% Phenol erzielt wird, wurde die Inaktivierungsperiode im Produktionsmaßstab auf 1 h verlängert, um ein höheres Maß an Sicherheit zu erhalten.

Kulturinaktivierungsstudie (Labormaßstab)

Eine H. influenzae-Kultur wurde in einem Schüttelinkubator mit 37ºC bis zur stationären. Phase kultiviert. Aliquots der resultierenden Kultur, enthaltend etwa 109 Zellen pro ml, wurden 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 und 0,6% (Gew./Vol.) Phenol bei 37ºC ausgesetzt. Phenolkonzentrationen von 0,2% und 0,3% hatten wenig Wirkung hinsichtlich einer Inaktivierung der Kultur innerhalb der Expositionszeitspanne von 10 Minuten. Es wurde jedoch eine signifikante Inaktivierungsrate bei 0,4% und 0,5% Phenol erhalten. Nach 7 Minuten bei 0,5% Phenol wurden keine lebensfähigen Zellen in einem Ausplattierungs-Assay mit nachgewiesener Sensitivität bis zu einer Grenze von etwa 10 CFU/ml in Anwesenheit von Phenol nachgewiesen. Die Inaktivierungskinetiken sowohl bei 0,4% als auch 0,5% Phenolkonzentration wurden als biphasisch befunden. Bei 0,6% Phenol war die Inaktivierung so schnell, daß nach 30 Sekunden Phenolexposition keine lebensfähigen Zellen nachgewiesen wurden.

Studien der Inaktivierung im Produktionsmaßstab

Der Reaktor, welcher etwa 109 Organismen pro ml enthielt, wurde auf etwa 0,5% Phenol gebracht und die CFU/ml als Funktion der Expositionszeit bestimmt. Aufgrund der Mechanik der Probenentnahme konnten nur zwei Messungen im Abstand von einer Minute durchgeführt werden. Für den Reaktor, der eine 6-minütige Mischzeit für die vollständige Verteilung des Phenols aufwies, wurde eine 7-10g-Verringerung während der ersten drei Minuten beobachtet. Nach fünf Minuten wurden in einem Ausplattierungs-Assay mit demonstrierter Sensitivität bis zu einer Grenze von etwa 10 CFU/ml in Anwesenheit von Phenol keine lebensfähigen Zellen nachgewiesen.

BEISPIEL 8

Clearance von Phospholipase D

Das verbesserte PRP-Verfahren wurde entwickelt, um PLD aus dem PRP-Endpulver effektiv zu eliminieren. Die Menge an restlichem Enzym, welche im PR. P verblieb, wurde mit einer Reihe von methodischen Ansätzen, die im folgenden beschrieben werden, abgeschätzt. Diese Ansätze umfaßten einen direkten Assay hinsichtlich PLD und hinsichtlich Enzymaktivität in PRP-Endpräparationen, Analyse hinsichtlich PLD in Proben aufs dem Verfahren und PLD- Tracer-Rückgewinnungsstudien in jedem Schritt des Verfahrens. Darüber hinaus wurden Versuche durchgeführt, um Antikörper gegen PLD zur Verwendung in immunologischen Assays zu induzieren. Jeder dieser Asätze wird im folgenden beschrieben.

Direkter Assay von PLD in PRP-Endpulvern

Direkter Assay von PLD in den PRP-Endpulvern durch SDS-PAGE mit Coomassie-Anfärbung (die PLD-Präparation läßt sich nicht gut mit Silber anfärben) zeigte, daß das restliche Niveau an PLD weniger als die Nachweisgrenze betrug (< 250 ng PLD/Spur). Durch Maximierung der Gelbeladung entsprach das Rest-PLD-Niveau < 5 ng/mg PRP oder < 0,0005%. Diese Nachweisgrenze ist äquivalent zu < 1 ng/Dosis.
Die PRP-Endpulver wurden auch hinsichtlich enzymatischer PILD-Restaktivität untersucht und keine Aktivität nachgewiesen. Die Nachweisgrenze des enzymatischen Assays betrug 6 ng PLD/m) (6 · 10&supmin;&sup4; E PLD/ml), was < 64 pg aktiver PLD/mg PRP entsprach. Es wurden weitere Studien durchgeführt, welche zeigten, daß die Exposition von PLD gegenüber Phenol das Enzym inaktivierte.

Direkte Analyse hinsichtlich PLD in Proben aus dem Verfahren

Proben aus dem Verfahren der Herstellung wurden direkt auf restliches PLD durch SDS- PAGE mit Coomassie-Anfärbung untersucht. Das PLD-Niveau in PRP nach der ersten Phenolextraktion lag unter der Nachweisgrenze, was einem PL. D-Niveau von < 5 ng PLD/mg PRP entsprach. Dies zeigte durch direkte Messung, daß die erste Phenolextraktion das PLD-Niveau um fast drei Logarithmen reduzierte (von ~ 2,4 ug PLD/mg PRP in der Reaktionsmischung auf weniger als 5 ng PLD/mg PRP im ersten Phenolextrakt). Eine weitere Verarbeitung durch drei weitere Phenolextraküonen, HP20-Behandlung und Alkoholfällung ergab eine zusätzliche PLD-Clearance, obwohl die Niveaus zu niedrig waren, um direkt bestimmt zu werden.

PLD-Tracer- und Rückgewinnungsstudien

Da das Rest-PLD-Niveau bei den Proben aus dem Verfahren zu niedrig war, um direkt gemessen zu werden, wurde eine umfangreiche Reihe von PLD-Tracer-Rückgewinnungsstudien im Labor durchgeführt, um die Menge an PLD abzuschätzen, welche pro Isolierungsschritt entfernt werden konnte. Es wurden drei verschiedene Isolierungsschritte als wirksam zur Entfernung von Enzym identifiziert.
Zuerst wurde die Wirksamkeit der Phenolextraktionen zur Entfernung von PLD untersucht. Eine konzentrierte Lösung von PLD mit 8 mg/ml in 20 mg PRP/ml wurde vier Phenolextraktionen unterworfen und jede der wäßrigen Schichten mittels SDS-PAGE auf PLD überprüft. Nach einer einzigen Phenolextraktion lag das PLD-Niveau unterhalb der Nachweisgrenze von 250 ng PLD/Spur mittels SDS-PAGE mit Coomassie-Anfärbung, was eine 800fache Verringerung oder eine Clearance um fast drei Logarithmen darstellte. In einem weiteren Experiment wurde ein PLD-Ansatz mit Fluorescein-5-isothiocyanat (FITC) fluoreszenzmarkiert. Mit Hilfe des FITC-markierten PLD wurde der Verteilungskoeffizient des Enzyms als Funktion seiner Konzentration in Phenol mittels Fluoreszenzspektroskopie gemessen. Diese Technik ergab eine zusätzliche 10fache Erhöhung der Sensitivität im PLD- Nachweisniveau. Dieses Verfahren bestätigte wiederum, daß eine einzige Phenolextraktion eine Verringerung des Enzymniveaus um mindestens zwei Logarithmen bewirkte.
Zur Bestimmung der Wirkung einer HP20-Behandlung auf die PLD-Entfernung wurde eine Adsorptionsisotherme von PLD in 5 mg PRP/ml auf HP20-Harz gemessen. Die steile Steigung der Isotherme zeigt an, daß das Harz eine starke Affinität für PLD besitzt, was zu einer Clearance von mindestens zwei Logarithmen für PLD unter den spezifischen Bedingungen der HP20-Behandlung führt. Das Restenzym bei diesem Schritt, welcher im Anschluß an vier Phenolextraktionen erfolgt, wäre bereits sehr wenig, diese Daten zeigen jedoch, daß etwaiges Restenzym durch selektive Adsorption an das HP20-Harz weiter eliminiert würde.
Schließlich verblieb in Tracer Experimenten in kleintechnischen Maßstab 90% des Enzyms nach der Alkoholfällung im Überstand. So ergibt dieser letzte Schritt das Potential für eine weitere 10fache Clearance.
Diese Studien demonstrierten, daß die Hauptmenge des Enzyms (> 99, 99%) durch die vier Phenolextraktionen entfernt wird. Nachdem der Verteilungskoeffizient des Enzyms zwischen Wasser und der Phenolphase in Anwesenheit von PRP als 102 bestimmt wurde, könnten vier Phenolextraktionen theoretisch eine 10&sup8;-fache Clearance ergeben; es wurde jedoch eine konservative Schätzung einer 10³-fachen Clearance für diesen Schritt vorgenommen. Basierend auf den Messungen der Adsorptionsisotherme wurde eine 10²-fache Clearance für die HP20-Adsorption geschätzt. Eine 10fache PLD-Verringerung wurde dem Alkoholfraktionierungsschritt zugeschrieben. Insgesamt wurde eine konservative Schätzung einer 106- fachen Gesamt-Enzym-Clearance für das verbesserte PRP-Verfahren vorgenommen. Die tatsächliche Clearance könnte theoretisch so hoch wie 10¹¹-fach sein.
Die folgende Tabelle faßt die Befunde dieser Clearance-Studien zusammen. Die letzte Spalte bietet eine Berechnung des verbleibenden PLD/Dosis für jedes Bestimmungsverfahren. Es ist festzuhalten, daß alle Berechnungen auf der Annahme basierten, daß 300 ug PRP in die Konjugationsreaktion eingehen, um eine 15-ug-Dosis zu ergeben. Dies ergibt einen konservativen Ansatz zur Abschätzung der Menge an restlichem Enzym pro Dosis. Abschätzung der Enzym-Clearance auf der Basis von mehreren Bestimmungsverfahren
* Nachweisgrenze

BEISPIEL 9

Vergleichende Analyse von PRP des verbesserten Verfahrens und des Alkoholfraktionierungsverfahrens

Alle PRP-Chargen, welche nach dem verbesserten Verfahren hergestellt worden waren, wurden umfangreichen analytischen Tests unterworfen, um deren chemische und physikalische Vergleichbarkeit mit PRP-Präparationen, welche nach dem selektiven Alkoholfraktionierungsverfahren hergestellt worden waren, festzustellen. Die Ergebnisse dieser Analysen sind im folgenden beschrieben.

A. NMR-Analyse

Protonen-NMR-Analyse der drei Herstellungseinheitlichkeits-Chargen von PRP, hergestellt nach dem verbesserten PRP-Verfahren, und einer repräsentativen Charge, hergestellt nach dem selektiven Alkoholfraktionierungsverfahren, zeigte, daß diese Proben im wesentlichen äquivalent waren. Die Spektren dieser Proben zeigten identische Spektren im Bereich von δ H = 3,72 bis 5,2.

B. Analyse der Kohlenhydratzusammensetzung

Die Integrität der Zusammensetzung der PRP-Proben wurde beurteilt durch Bestimmung der Identität und der relativen Mengen der Saccharidkomponenten in den PRP-Präparationen. Dies wurde erzielt durch saure Hydrolyse der PRP-Proben und anschließende quantitative Bestimmung der Kohlenhydratkomponenten (Ribit und Ribose) durch Anionenaustauschchromatographie bei hohem pH mit gepulstem amperometerischem Nachweis. Drei Demonstrationschargen von PRP des verbesserten Verfahrens und zwei repräsentative Chargen von PRP des selektiven Alkoholfraktionierungsverfahrens wurden analysiert. Eine vergleichende Analyse dieser Proben, basierend auf Peakflächenverhältnissen von Ribit-zu- Ribose zeigte, daß die fünf Chargen im wesentlichen identisch sind. Darüber hinaus waren die Spurenkomponenten-Peaks in allen fünf Präparationen vergleichbar. Das Niveau dieser Komponenten betrug weniger als 1 Mol%, bezogen auf Ribit der Ribose.

C. Fettsäure-Analyse

Eine vergleichende Fettsäure-Analyse der PRP-Produkte der selektiven Alkoholfraktionierung und des verbesserten Verfahrens wurde durchgeführt. Die PRP-Proben des ersteren Herstellungsverfahrens enthalten variierende kleine Mengen an Fettsäuren, während die PRP- Proben des verbesserten Verfahrens < 0,002% (Gew./Gew.) Fettsäure gemäß kapillargaschromatographischer Analyse der Fettsäuremethylester enthalten.

D. Molekulararößen-Analyse

Sepharose 4B-Analyse

Die Molekulargröße von PRP-Präparationen wird derzeit durch Sepharose-4B-Säulenchromatographie unter Nachweis des Refraktionsindexes bestimmt, welches eine Messung der relativen Molekulargröße der PRP-Präparation, ausgedrückt als relatives Elutionsvolumen (Kd), ergibt. Die Kd-Werte für repräsentative Proben sind im folgenden gezeigt. Auf der Basis dieser Analysen gibt es keine ersichtlichen Unterschiede in den Molekulargrößen zwischen den fünf PRP-Präparationen.

Messung der Molekulargröße auf der Basis von Sepharose-4B-Analyse

Probe Kd
PRP des verbesserten Verfahrens:
Probe 1 0,46
Probe 2 0,48
Probe 3 0,45
PRP der selektiven Alkoholfraktionierung:
Probe 1 0,46
Probe 2 0,51
HPSEC-Universalkalibrierungsanalyse
Neben der Sepharose-4B-Analyse wurde die Molekulargröße und Polydispersität einer jeden der obigen PRP-Präparationen durch Hochleistungs-Größenausschlußchromatographie mit Online-Nachweis der spezifischen Viskosität und des Refraktionsindexes überprüft. Diese Analyse wird durchgeführt unter Verwendung einer TSK G4000 PWXL-Säule mit einer mobilen Ammoniumacetat-Phase und gestattet die Berechnung eines relativen Molekulargewichts (Mp) und Polydispersitätsindexes (PI) für jede PRP-Präparation. Chromatogramme, welche aus der Analyse der drei Demonstrationschargen von PRP des verbesserten Verfahrens und zwei repräsentativen Chargen von PRP des selektiven Alkohol fraktionierungsverfahrens resultierten, sind im folgenden zusammengefaßt. Die Durchschnittsergebnisse aus der Analyse von insgesamt 29 PRP-Chargen selektiver Alkoholfraktionierungsproduktion sind ebenfalls in der Tabelle gezeigt. Bestimmung des relativen Molekulargewichts (Mp) und Pollydispersitätsindexes (PI) von PRP, die nach dem verbesserten Verfahren und dem Verfahren der selektiven Alkoholfraktionierung hergestellt wurden
Die Resultate dieser Analysen ergeben plausible Hinweise, daß die PRP-Präparationen, welche nach dem verbesserten Verfahren hergestellt wurden, etwas größer und polydisperser sind als PRP-Präparationen, welche nach dem Verfahren der selektiven Alkoholfraktionierung hergestellt wurden.
Zusätzlich zu den obigen Analysen wurden die derivatisierten PRP, die einer jeden der obigen PRP-Präparationen des verbesserten Verfahrens entsprachen, und repräsentative Proben von derivatisiertem PRP des selektiven Alkoholfraktionierungsverfahrens hinsichtlich der Molekulargröße analysiert. Die Molekulargröße und Polydispersität der derivatisierten PRP- Präparationen (Bromacetylbutandiamin-Form) wurden sowohl durch Sepharose®-4B- Chromatographie als auch durch HPSEC-Universalkalibrierung überprüft. Die Ergebnisse dieser Analysen sind im folgenden dargestellt. Messung von Molekulargröße und Polydispersität von derivatisierten PRP des verbesserten Verfahrens und des selektiven Alkoholfraktionierungsverfahrens
Diese Ergebnisse zeigen an, daß das PRP während der Derivatisierung größenreduziert wird und daß die resultierenden Molekulargrößen des derivatisierten PRP des verbesserten Verfahrens und des derivatisierten PRP des selektiven Alkoholfraktionierungsverfahrens im wesentlichen äquivalent sind.

E. Analyse der relativen Antigenizität

Der PRP-Antigen-Gehalt wird typischerweise durch Geschwindigkeitsnephelometrie-Analyse bestimmt. Ein Vergleich der Antigenkonzentration einer gegebenen Probe mit der Polysaccharidkonzentration ergibt ein Maß der relativen Antigenizität der Probe. Die Ergebnisse solcher Analysen für drei Demonstrationschargen von PRP des verbesserten Verfahrens und für zwei repräsentative PRP-Chargen des selektiven Alkoholfraktionierungsverfahrens werden im folgenden angegeben. Für diese fünf Proben sind die relativen Antigenizitäten innerhalb des Versuchsfehlers äquivalent.

Vergleich der relativen Antigenizität von PRP des verbesserten Verfahrens und PRP des selektiven Alkoholfraktionierungsverfahrens

Probe relative Antigenizität (%)
PRP des verbesserten Verfahrens
Probe 1 93
Probe 2 95
Probe 3 101
PRP der selektiven Alkoholfraktionierung
Probe 1 96
Probe 2 105

BEISPIEL 10

Testergebnisse der Immunogenizität bei Tieren

A. Immunogenizität bei Rhesusaffenbabys

Rhesusaffenbabys wurden als vorklinisches Immunogenizitätsmodell eingesetzt, welches mit der Immunogenizität von H. Influenzae-Konjugat-Vakzinen bei menschlichen Kleinkindern korreliert. Haemophilus b-Konjugat-Vakzin (Meningokokken-Protein-Konjugat) wurde ausgiebig bei dieser Spezies getestet und als hochimmunogen befunden (Vella et al., Pediatrics, 85, 668, 1990; Vella und Ellis, Pediatric Research; 29, 10, 1991). Nur eine kleine Anzahl Affen stehen für den Einsatz in jedem Jahr zu Verfügung, so daß wir 3-6 Affen/Gruppe zum Test eines jeden Vakzins einsetzen. Da es sich um eine Spezies von nicht zuchtverwandten Individuen handelt, fanden wir eine Variation von bis zu etwa dem 100fachen bei den Anti-PRP-Niveaus individueller Affenbabys als Reaktion auf Haemophilus b-Konjugat- Vakzin (Meningokokken-Protein-Konjugat), ähnlich dem Variationsgrad bei der Immunreaktion individueller menschlicher Kleinkinder. Aus diesen Gründen der Gruppengröße und dem Vorliegen nicht zuchtverwandter Individuen ist das Rhesusaffenbaby eher ein qualitatives als quantitatives Modell für die Immunogenizität dieser Vakzine. Wir betrachten als positive Reaktion ein Post-Dosis-2-Niveau von > 1 ug Anti-PRP/ml, ein Niveau, das von PRP-, PRP-D- oder HbOC-Vakzinen nicht erreicht wird. Wir erreichen dieses Niveau gleichmäßig mit Haemophilus b-Konjugat-Vakzin (Meningokokken-Protein-Konjugat).
Anti-PRP-Reaktionen von Rhesusaffenbabys auf Haemophilus b-Konjugat-Vakzin (Meningokokken-Protein-Konjugat), hergestellt mit PRP aus dem verbesserten PRP- Verfahren, sind vergleichbar mit den ursprünglichen Forschungs- und Herstellungseinheitlichkeits-Chargen und einer Produktions-Charge, die nach dem Verfahren der selektiven Alkoholfraktionierung hergestellt wurde. Im Test eingeschlossen waren ein im Forschungsmaßstab hergestelltes Konjugat unter Verwendung von PRP, das im Labor nach dem verbesserten Verfahren hergestellt worden war, und vier Konjugat-Chargen, welche von drei Chargen von PRP des verbesserten Verfahrens hergestellt wurden. Insgesamt wurde eine Gesamtmenge von 24 Affen mit Haemophilus b-Konjugat-Vakzin (Meningokokken- Protein-Konjugat), hergestellt mit PRP nach dem verbesserten PRP-Verfahren, immunisiert. Alle 24 Affen erreichten Post-Dosis-2-Niveaus von > 1 ug Anti-PRP/ml. Diese Daten demonstrieren bei diesem qualitativen Modell der Immunogenizität die immunologische Äquivalenz von Haemophilus b-Konjugat-Vakzin (Meningokokken-Protein-Konjugat), das mit PRP nach dem verbesserten Verfahren und PRP nach dem selektiven Alkoholfraktionierungsverfahren hergestellt wurde.

B. Maus-Immunogenizitäts-Daten

Wirksamkeitstests des Haemophilus b-Konjugat-Vakzins (Meningokokken-Protein-Konjugat), welches mit PRP des verbesserten Verfahrens hergestellt wurde, wurden auch bei BALB/c- Mäusen durchgeführt. Da es sich bei diesen um eine genetische Inzucht-Spezies handelt und sie in praktisch unbegrenzter Anzahl zur Verfügung stehen, ist die Wirksamkeitsuntersuchung bei diesen Mäusen ein quantitatives Modell für die Immunogenizität dieses Vakzins. Bei diesem Modell werden Sfache Reihenverdünnungen von Vakzin jeder Gruppe von 8 Mäusen injiziert, bei einer Gesamtmenge von 40 Mäusen für jede Vakzin-Charge. Die effektive Dosis für eine serologische Überführung von 50% der Mäuse (ED&sub5;&sub0;) zu Seropositivität für Anti-PRP wird für jede Gruppe von 40 Mäusen berechnet de geringer der ED&sub5;&sub0;, desto höher die Wirksamkeit). Die ED&sub5;&sub0;-Werte für vier verschiedene Chargen von Haemophilus b-Konjugat-Vakzin (Meningokokken-Protein-Konjugat) hergestellt mit PRP des verbesserten PRP-Verfahrens, liegen im selben Bereich wie die Referenzkontrolle von Haemophilus b-Konjugat-Vakzin (Meningokokken-Protein-Konjugat), welche bei menschlichen Kleinkindern als immunogen nachgewiesen wurde. Diese Daten demonstrieren die immunologische Vergleichbarkeit bei einem quantitativen Modell.

BEISPIEL 11

Die Testergebnisse für die H. influenzae-Fermentationschargen, welche im verbesserten PRP- Verfahren verwendet wurden, waren hinsichtlich Kulturreinheit, H. influenzae-Inaktivierung und PRP-Antigen-Gehalt alle zufriedenstellend.
Drei Chargen von PRP, das nach dem verbesserten Verfahren hergestellt worden war, wurden anschließend zur Herstellung von Haemophilus b-Konjugat-Vakzin (Meningokokken- Protein-Konjugat), eingesetzt. Die Hauptmenge des derivatisierten Haemophilus b-Polysaccharids wurde einer vollständigen Kontrolluntersuchung unterworfen und alle Testergebnisse zeigen, daß diese Materialien aus PRP des verbesserten Verfahrens nicht unterscheidbar sind von ähnlichen Materialien aus dem selektiven Alkoholfraktionierungsverfahren.
Testergebnisse des Endbehälter-Materials bestätigen, daß dass Haemophilus b-Konjugat- Vakzin (Meningokokken-Protein-Konjugat), das mit PRP des verbesserten Verfahrens hergestellt wurde, von derselben Qualität ist wie das Produkt, das aus alkoholfraktioniertem PRP hergestellt wurde.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von lipid- und endotoxinfreiem Kapselpolysaccharid aus einer rohen oder gereinigten Präparation, die sowohl lipidfreies Kapselpolysaccharid als auch Lipo-Kapselpolysaccharid, von Bakterien stammend, umfaßt, ohne wesentlichen Verlust des Kapselpolysaccharids, welches umfallt, daß im wesentlichen das gesamte Lipo-Kapselpolysaccharid durch Abspaltung des Lipids von dem Lipo-Kapselpolysaccharid mittels Behandlung mit Phospholipase D allein oder in Kombination mit Phospholipase A&sub2; oder Phospholipase B in Gegenwart einer organischen Phase, die Ether als Enzymaktivator umfaßt, in lipidfreies Kapselpolysaccharid überführt wird, freies Lipid und Endotoxin-Verunreinigungen entfernt werden und das lipidfreie Kapselpolysaccharid gewonnen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Kapselpolysaccharid von einer Kultur von Haemophilus influenzae Typ b, den Neisseria meningitidis (Meningokokken)- Gruppen A, B, C, X, Y, W135 oder 29E oder Escherichia coli K1, K12, K13, K89, K92 oder K100 stammt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Kapselpolysaccharid eine Mischung ist, die PRP und Lipo-PRP, von einer Kultur von Haemophilus influenzae Typ b stammend, umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin die organische Phase eine Mischung aus einer ersten Komponente von Ether, ausgewählt aus Diethylether, Butylether oder Methyltert.-butylether, und einer zweiten Komponente, ausgewählt aus Methanol, Ethanol oder Hexan, umfaßt, wobei die erste Komponente und die zweite Komponente in einem Verhältnis zwischen etwa 20 : 1 und 5 : 1 vorliegen.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Phospholipase von einem Organismus stammt, welcher kein Säuger ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, umfassend die Behandlung der Mischung, die PRP und Lipo-PRP umfaßt, mit Phospholipase D allein.

7. Verfahren nach Anspruch 6, umfassend die Umsetzung der Mischung, die PRP und Lipo-PRP umfaßt, mit zwischen etwa 0,01% und 10% auf Gewichtsbasis an Phospholipase D.

8. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von lipidfreiem und endotoxinfreiem Polyribosylribitphosphat, PRP, ohne wesentlichen Verlust an PRP, umfassend die Umsetzung von Lipo-PRP, welches in einer rohen oder gereinigten Präparation von Polysaccharid, das von einer Kultur von Haemophilus influenzae Typ b stammt, vorliegt, mit Phospholipase D in einem Verhältnis von etwa 0,3 Gewichtsprozent Phospholipase D zu PRP in einer Reaktionsmischung, die eine Ether : organisches- Lösungsmittel-Mischung in einer Konzentration von zwischen 30% und 60% des Reaktionsvolumens umfaßt, wobei das organische Material ein Ether ist, ausgewählt aus Diethylether, Butylether oder Methyl-tert.-butylether, in Mischung mit einem zweiten organischen Material, das aus Hexan, Ethanol oder Methanol ausgewählt ist, in Gegenwart eines Detergens, ausgewählt aus Desoxycholat oder Triton X-100, das in einer Konzentration von zwischen 0,1% und 0,4% vorliegt, unter Zugabe von etwa 0,1 bis etwa 10 mM CaCl&sub2; in einem Puffer, der mit den vorgenannten Reagenzien kompatibel ist, bei einem pH-Wert zwischen etwa 7,0 und 8,0, einer Temperatur zwischen etwa 20ºC und 45ºC für zwischen etwa 30 Minuten und etwa 4 Stunden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die Ether : organisches-Lösungsmittel-Mischung eine Methyl-tert.-butylether : Ethanol-Mischung in einem Verhältnis von etwa 9 : 1 ist und die Konzentration der Mischung etwa 50% des Reaktionsvolumens beträgt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, umfassend ferner die Phenolextraktion des PRP, um proteinhaltige Verunreinigungen, einschließlich der zugesetzten Phospholipase D, zu entfernen, und den Durchgang des PRP, entweder vor oder nach Behandlung mit Phospholipase D, durch einen Schritt hydrophober Adsorption, welcher PRP oder Lipo-PRP nicht adsorbiert, um freie Lipide und Endotoxin zu entfernen.

11. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von lipidfreiem PRP ohne wesentlichen Verlust an PRP, umfassend die Schritte der:

a) Züchtung von Haemophilus influenzae Typ b in einem geeigneten Kulturmedium; ,

b) Abtötung des Haemophilus influenzae Typ b mit Thimerosal oder Phenol;

c) Klärung des Kulturmediums von abgetötetem Haemophilus influenzae Typ b;

d) Konzentration des geklärten Kulturmediums, um ein verarbeitbares Volumen zu erhalten;

e) Fällung von Verunreinigungen im Kulturmediurn durch Zugabe von Ethanol bis zu einer Endkonzentration von etwa 48% Ethanol, um einen PRP enthaltenden Überstand und ein Verunreinigungs-Pellet, das verworfen wird, zu erhalten;

f) Fällung des PRP durch Zugabe von Ethanol bis zu einer Endkonzentration von etwa 61%, um ein Roh-PRP-Pellet zu erhalten;

g) Zugabe von Wasser zum PRP-Pellet, um dieses zu sofubifisieren, gefolgt von der Zugabe von Calciumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 1,0 M;

h) Zugabe von Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 23%, um ein unlösliches Pellet von Verunreinigungen und einen das PRP enthaltenden Überstand zu erhalten;

i) Zugabe von Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 37%, um das PRP auszufällen;

j) Trituration des PRP-Pellets mit absolutem Ethanol und Trocknung, um ein Prä-Phenol-PRP-Pulver zu erhalten;

k) Phenolextraktion einer solubilisierten Präparation des PRP-Pulvers;

l) Fällung des PRP durch Zugabe von CaCl&sub2; bis 0,05 M und von Alkohol bis etwa 67%, Trituration in absolutem Ethanol, um Post-Phenol-Pulver zu erhalten;

m) Entfernung von Endotoxin mittels hydrophober Adsorption aus einer solubilisierten Präparation von Post-Phenol-Pulver;

n) Umsetzung des PRP in Roh-PRP, Prä-Phenol-Pulver oder Post-Phenol- Pulver mit einer Phospholipase bevor mit nachfolgenden Schritten fortgefahren wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin die Phospholipase Phospholipase D ist, welche mit etwa 0,3 Gewichtsprozent, bezogen auf PRP, zugegeben wird und das Roh-PRP, Prä-Phenol-Pulver oder Post-Phenol-Pulver in 10 mM Tris, 5 mM CaCl&sub2;, 45% Methyltert.-butylether, 5% Ethanol, 0,3% Triton X-100 solubilisiert wird und ihm 30 Minuten bis etwa 4 Stunden lang bei etwa 35ºC die Umsetzung gestattet wird.