BR102019021510A2 - Processo de produção, recuperação e purificação de polissacarídeo capsular poliribosil-ribitol-fosfato (prp) e uso do mesmo - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere a processos envolvidos na produção e purificação do polissacarídeo capsular Poliribosil-Ribitol-Fosfato (PRP) produzido pela bactéria Haemophilus influenzae tipo b (Hib) para se obter o polissacarídeo com pureza e massa molecular adequada para a posterior formulação de vacina conjugada de Hib. A presente invenção também se refere ao uso do polissacarídeo capsular poliribosil-ribitol-fosfato (PRP) para a preparação de vacina.

Description

PROCESSO DE PRODUÇÃO, RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE POLISSACARÍDEO CAPSULAR POLIRIBOSIL-RIBITOL-FOSFATO (PRP) E USO DO MESMO Campo da Invenção

[001] A presente invenção se refere a um processo de produção e purificação do polissacarídeo capsular Poliribosil-Ribitol-Fosfato (PRP) produzido pela bactéria Haemophilus influenzae tipo b (Hib). Mais especificamente, a presente invenção se refere a um processo de purificação do polissacarídeo (PRP) com pureza e massa molecular adequada para a posterior formulação de vacina conjugada de Hib.

Fundamentos e Antecedentes da Invenção

[002] Haemophilus influenzae são bactérias Gram- negativas, aeróbicas/microaerofílicas, apresentam morfologia coco bacilar, são imóveis, não esporulados, estando presente na nasofaringe de 75% das crianças e adultos saudáveis, constituindo, portanto, carregadores assintomáticos. Não há registro de detecção deste microrganismo em nenhuma outra espécie animal (ADA e ISAACS, 2003; KELLY et al., 2004).

[003] Foi isolado em 1890 por Pfeiffer durante uma pandemia de gripe, sendo confundido como causador da gripe. Provavelmente, H. influenzae foi um importante invasor secundário ao vírus da gripe (influenza) na pandemia de 1890 e em muitas outras que se seguiram (PITTMAN, 1931) .

[004] Por serem organismos fastidiosos, o gênero Haemophilus ("amigos do sangue") requer precursores de heme para crescimento, que estão presentes no sangue, especificamente_o fator X (i.e., hemin) e o fator V (NAD ou NADP) (HARRISON et al., 2008) que são os fatores responsáveis pelo crescimento. Esta bactéria cresce melhor entre 35 e 37 °C, com pH ótimo em torno de 7,6. Em laboratório, cresce em condições aeróbicas, com baixa tensão de CO2 (5% CO2), embora seja capaz de fazer a via glicolítica e a cadeia respiratória usando o nitrato como aceptor final de elétrons.

[005] Em 1995, H. influenzae foi o primeiro organismo a ter o genoma inteiramente sequenciado, sendo que as informações genéticas geradas evidenciaram características importantes sobre os fatores de virulência e os alvos vacinais, bem como conhecimentos sobre as diferentes rotas metabólicas desse microrganismo (ALI et al., 2002).

[006] Uma fração dos portadores assintomáticos, que corresponde de 3 a 7%, pode albergar variantes patogênicas de Haemophilus influenzae, sendo de grande importância na transmissão da bactéria. Crianças menores de cinco anos, idosos e indivíduos imunodeprimidos são os mais afetados por esta infecção, que inclui meningite, pneumonia, epiglotite, septicemia, etc. (KELLY et al., 2004).

[007] Esta espécie bacteriana pode apresentar uma estrutura externa, denominada cápsula. Dependendo da composição do polissacarídeo que a compõe, é classificada em seis sorotipos diferentes (a, b, c, d, e, f) . As não capsuladas são classificadas como não tipável (KELLY et al., 2004).

[008] Das infecções produzidas por Haemophilus, 95% são causadas pelas bactérias que apresentam cápsula polissacarídica do tipo b. A patogênese da infecção por H. influenzae tipo b não está completamente esclarecida, embora a presença da cápsula polissacarídica do tipo b, ou Poliribosil-Ribitol-Fosfato (PRP) seja considerada o principal fator de virulência, a qual é composta por monômeros contendo unidades de ribose, ribitol e fosfato (Figura 1) (CRISEL et al., 1975) .

[009] A estrutura capsular apresenta propriedades anti-fagocíticas e é incapaz de induzir a via alternativa do complemento, possibilitando que a bactéria invada a corrente sanguínea e o fluido cérebro-espinhal, sem atrair fagócitos ou provocar respostas inflamatórias e lise mediada por complemento. Por essa razão, anticorpos contra a cápsula, os quais promovem tanto fagocitose quanto lise bacteriana, são os principais fatores da defesa imune contra infecção por H. influenzae tipo b (ADA e ISAACS, 2003; ST. GEME e CUTTER, 1996 .

[0010] A maneira efetiva de prevenir as doenças causadas por H. influenzae tipo b, principalmente entre crianças menores de cinco anos, é através dos programas de vacinação pública, os quais foram implantados no Brasil em 1999 (KMETZSCH et al., 2003) . Tal estratégia gerou impactos positivos, diminuindo a incidência e a mortalidade (MIRANZI et al., 2006).

[0011] O uso de vacinas constituídas pela cápsula bacteriana é capaz apenas de induzir forte resposta primária de anticorpos, mas com pequena indução de memória imunológica. Para contornar essa característica indesejável, surgiram as vacinas conjugadas, nas quais o PRP de Hib é conjugado quimicamente a uma proteína de escolha para modificar o tipo de apresentação do antígeno e o tipo de resposta imune induzida, garantindo, assim, resposta de memória imunológica do tipo T-dependente, que é eficiente na faixa etária de maior risco (KELLY et al., 2004) .

[0012] Apesar das vacinas conjugadas já serem produzidas e comercializadas por multinacionais farmacêuticas é de interesse nacional produzi-las no Brasil, pois essas vacinas são muito caras e o país necessita de autonomia para a elaboração de tão importante agente imunizante. Assim a melhora nas condições de produção e de purificação desses compostos microbianos continua sendo importante para as políticas de saúde pública preventiva.

[0013] A produção de vacinas é compreendida por distintos processos, como o cultivo do microrganismo em biorreatores, denominado de produção e posterior inativação do mesmo; seguido da purificação. No caso particular das vacinas conjugadas, a etapa final corresponde ao processo de conjugação química do polissacarídeo purificado a uma proteína acompanhado da purificação do produto conjugado.

[0014] A produção de um determinado bioproduto, em larga escala, é realizada em biorreatores que possuem sistemas informatizados capazes de controlar a aeração, a agitação, o pH, a temperatura; além de bombas para adição de nutrientes, ácido, álcali, etc. (WARD, 1989; WARD, 1991; PACE, 1987; TAKAGI et al., 2003; TAKAGI et al., 2008).

[0015] No caso particular de Hib, o meio de cultura tradicional BHI (Brain Heart Infusion) resultou em 91 mg/L de polissacarídeo (CARTY et al., 1985). Anderson (1977) obteve os melhores resultados com o meio contendo casaminoácido e extrato de levedura tamponado com fosfato de potássio 0,1 M em pH 7,5, atingindo 182 mg/L de polissacarídeo. Seguindo as recomendações da OMS-WHO foi testado um meio sem componentes de origem animal (animal free). O meio contendo peptona de soja e extrato de levedura (MP aumentou a produção de PRP para 258 mg/L, O cultivo em batelada alimentada, com a cepa Eagan e meio contendo casaminoácido-extrato de levedura para a produção do polissacarídeo capsular de H. influenzae b, foi descrito por Merrit et al. (2000), obtendo-se concentração de polissacarídeo de 1.200 mg/L, bem superior ao processo em batelada no qual conseguiu-se o valor de 490 mg/L e também àqueles descritos em todas as patentes.

[0016] Takagi e colaboradores (2006) estudaram os efeitos da aeração superficial e submersa, da concentração de oxigênio dissolvido controlada a 10 e 30% da saturação de ar, e a interferência do controle de pH no crescimento celular e na produção de polissacarídeo. No estudo, utilizouse meio de cultura contendo peptona de soja e extrato de levedura como meios complexos ("animal free"). Nestas condições, verificou-se que, utilizando aeração superficial, obtiveram-se 421 mg PRP/L, enquanto que sob aeração submersa, a 10 e 30% da saturação de ar sem controle de pH, foram alcançados 550 mg PRP/L. Porém, a introdução do controle de pH foi o grande diferencial, gerando 950 mg PRP/L. A manutenção da concentração de oxigênio dissolvido a 10 ou a 30% da saturação de ar não resultou em diferenças significativas na formação de polissacarídeo. Cultivos realizados em batelada alimentada, com a mesma cepa e meio de cultura, com controle de pH e aeração submersa a 30% de saturação de ar, utilizando meio de alimentação contendo glicose-extrato de levedura na relação (C:N) de 2:1, apresentaram valor de polissacarídeo final de 2.000 mg PRP/L (TAKAGI et al., 2007).

[0017] Segundo Takagi et al. (2006), a melhora na produtividade de PRP deve-se a três importantes mudanças no protocolo de cultivo, que depende da composição do meio, da aeração e do controle do pH a 7,2. Após vários estudos, observou-se que a produção de PRP não está relacionada diretamente com o oxigênio dissolvido, já o pH pode, sim, influenciar, afetando a rota metabólica, ocasionando mudanças na composição e no tamanho do PRP, tendo em vista que o mesmo está sobre o controle de vários genes (TAKAGI et al. , 2006) .

[0018] A síntese de PRP é um dos fatores limitantes na produção das vacinas polissacarídicas, que está na ordem de 0,25-2 g/L de cultivo. Diferentemente das proteínas, ela é dependente de vários genes e, na maioria dos casos, sua rota metabólica ainda não é facilmente manipulável (BENTLEY et al., 2006; TAKAGI, 2003).

[0019] Após a finalização do cultivo, a etapa seguinte corresponde à purificação (downstream process), na qual o produto "bruto" é processado até se obter o grau de pureza requerido para seu uso, buscando maximizar sua recuperação e minimizar o custo (WARD, 1991; KASTNER e GOLKER, 1987) .

[0020] A purificação envolve uma série de passos independentes, na qual se utiliza das diferentes propriedades fisico-químicas do produto de interesse e dos contaminantes, para que, de forma progressiva, ocorra o enriquecimento da fração de interesse e a eliminação dos componentes indesejados. A etapa de purificação se baseia nas diferentes propriedades das moléculas, como solubilidade, hidrofobicidade, carga elétrica, tamanho molecular, propriedades especiais (termo-resistência), afinidade por outras moléculas; além da localização celular (intra ou extracelular) (WARD, 1989; WARD, 1991; SOFER e HAGEL, 199 7; ANSEJO e PATRICK, 1990) .

[0021] Além de buscar atingir a pureza relativa, os produtos biotecnológicos devem cumprir normas e exigências em relação à quantidade residual permitida de impurezas, como ácidos nucléicos, proteínas e substâncias pirogênicas, limites relativos à "cor", ausência de atividades enzimáticas nocivas ao produto e que possam comprometer o uso (ex: proteases, atividade hemolítica). As normas a serem cumpridas são das agências reguladoras, como a ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária), a FDA (Food and Drug Administration), a OMS (Organização Mundial da Saúde) ou pelas farmacopéias. O complexo processo de purificação desses produtos representa de 20 a 80% do custo total (SCOPES, 1994; ERSSON et al., 1998; SOFER e HAGEL, 1997).

[0022] O método tradicional de purificação de polissacarídeo é caracterizado por várias etapas de precipitação com etanol, extração por solventes orgânicos, como o fenol, e etapas de centrifugação/ultracentrifugação. Entretanto, o uso do etanol implica no emprego de uma centrífuga contínua em altas velocidades e maiores tempos, uma vez que o "pellet" muitas vezes não apresenta característica consistente. Além disso, o espaço físico deve ser apropriado, com instalações à prova de explosão, e cuidados de manipulação, o que demanda custo e tempo.

[0023] O pedido de patente BR 10 2014 021245, depositado em 27 de agosto de 2014, publicado em 08 de março de 2016 em nome de MSD WELLCOME TRUST HILLEMAN LABORATORIES PVT. LTD e intitulado: "PROCESSO RÁPIDO PARA PRODUZIR E PURIFICAR HIB-PRP descreve um processo rápido para produzir e purificar o polissacarídeo PRP de Haemophilus influenzae tipo b que satisfaz as especificações da OMS. O processo produz os polissacarídeos PRP capazes de serem usados como tais, ou de serem derivatizados ou ligados a outras moléculas para produzir uma vacina contra as infecções por Haemophilus influenzae tipo b. O processo descreve um método mais simples, rápido, eficaz em custo e escalonável, em que o PRP é purificado em um tempo significantemente reduzido à temperatura ambiente.

[0024] Embora o pedido de patente BR 10 2014 021245 revele um processo para produzir e purificar PRP, este processo possui características técnicas diferentes do processo para produzir e purificar PRP da presente invenção, tais como não se utiliza o detergente catiônico CTAB (brometo de hexadeciltrimetilamônio) e as etapas de centrifugação foram substituídas por microfiltração de fluxo tangencial.

[0025] O pedido de patente BR 11 2014 033082, depositado em 02 de julho de 2013, publicado em 27 de junho de 2017; em nome de SANOFI PASTEUR e intitulado: "PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ANTÍGENOS HAEMOPHILUS INFLUENZAE TIPO B" descreve um processo para a produção, na escala industrial, de polissacarídeo capsular de Haemophilus influenzae tipo b (PRP) destinado a fins vacinais, segundo o qual se cultiva uma cepa de Haemophilus influenzae tipo b (Hib) em um meio de cultura, se coleta o sobrenadante da cultura que se trata para daí extrair o polissacarídeo capsular, esse meio de cultura compreendendo pelo menos: uma fonte de carbono, protoporfirina, sais, aminoácidos, NAD ou NADH, vitaminas, meio de regulagem do pH, caracterizado pelo fato de esse meio de cultura ser quimicamente definido.

[0026] O processo revelado pelo pedido de patente BR 11 2014 033082 é um processo em que se caracteriza o meio de cultura de uma cepa de Hib, o qual é um meio quimicamente definido, cuja natureza e quantidade de cada um dos componentes é perfeitamente definida. O pedido de patente BR 11 2014 033082 não descreve, muito menos sugere um processo para produzir e purificar PRP, tal como o processo descrito pela presente invenção.

[0027] A patente Norte-Americana US 4,220,717, depositada em 02 de setembro de 1980 em nome de AMERICAN CYANAMID CO e intitulada "ISOLATION AND PURIFICATION OF POLYRIBOSYL RIBITOL PHOSPHATE FROM HAEMOPHILUS INFLUENZAE TYPE B" descreve um processo para o isolamento e purificação do PRP imunologicamente ativo, o polissacarídeo capsular de Haemophilus influenzae tipo b. O PRP foi purificado com etanol, CTAB e um adsorvente contendo fosfato, hidroxilapatita [3.Ca3(PO4)2.Ca(OH)2]. Os contaminantes (ácido nucléico, proteínas e endotoxinas) são removidos para o nível mínimo por um tratamento com hidroxiapatita. Também é descrito um processo para a preparação de uma vacina combinada contendo os antígenos de H. influenzae e B. pertussis. A vacina provoca formações de anticorpos anti-PRP e anticorpo antipertussis (medido por microaglutinação) em animais jovens. Este soro com anticorpo anti-PRP exibe uma forte atividade bactericida.

[0028] Embora a patente Norte-Americana US 4,220,717 revele um processo para produzir e purificar PRP, este processo possui características técnicas diferentes do processo para produzir e purificar PRP revelado pela presente invenção, tais como no objeto de busca não se utiliza CTAB para remoção dos contaminantes, assim como não se utiliza hidroxiapatita para separação por adsorção.

[0029] A patente Norte-Americana US 7,582,459, depositada em 10 de setembro de 2004, publicada em 22 de março de 2007 em nome de NL VACCININST e intitulada: "PROCESS FOR PRODUCING A CAPSULAR POLYSACCHARIDE FOR USE IN CONJUGATE VACCINES descreve um método para produzir um polissacarídeo e uma vacina conjugada, incluindo o polissacarídeo produzido de acordo com o método. Uma etapa característica no método é que o pH do meio de cultura é mantido a um valor constante com base ou ácido até que o ajuste com base ou ácido, respectivamente, não seja mais possível.

[0030] Embora a patente Norte-Americana US 7,582,459 revele um método para produzir um polissacarídeo capsular bacteriano, este processo possui características técnicas diferentes do processo para produzir e purificar PRP da presente invenção, tais como no objeto de busca não se utiliza detergente catiônico CTAB, assim como as etapas de centrifugação foram substituídas por microfiltração de fluxo tangencial.

[0031] A patente Norte-Americana US 4,196,192, depositada em 28 de outubro de 1977, publicada em 01 de abril de 1980 em nome de AMERICAN CYANAMID e intitulada: "COMBINED HAEMOPHILUS INFLUENZAE TYPE B AND PERTUSSIS VACCINE descreve um processo para o isolamento e purificação do polirribosil-ribitol fosfato (PRP) imunologicamente ativo, o polissacarídeo capsular de Haemophilus influenzae tipo b. O PRP foi purificado com etanol, CTAB e um adsorvente hidroxilapatita. Os contaminantes (ácido nucléico, proteínas e endotoxinas) são removidos para o nível mínimo por um tratamento com hidroxiapatita. Também é descrito um processo para a preparação de uma vacina combinada contendo os antígenos de PRP (preparados como anteriormente mencionado) e B. pertussis. A vacina provoca formações de anticorpos anti-PRP e anticorpo anti-pertussis (medido por microaglutinação) em animais jovens. Este soro com anticorpo anti-PRP exibe uma forte atividade bactericida.

[0032] Embora a patente Norte-Americana US 4,196,192 revele um método para produzir um polissacarídeo capsular bacteriano, este processo possui características técnicas diferentes do processo para produzir e purificar PRP da presente invenção, tais como na presente invenção não se utiliza detergente catiônico, assim como as etapas de centrifugação foram substituídas por microfiltração de fluxo tangencial. Além disso, na presente invenção não se utiliza o CTAB para remoção dos contaminantes e nem hidroxilapatita para separação por adsorção.

[0033] A Dissertação em nome de SILVIA MARIA FERREIRA ALBANI apresentada ao Programa de Pós-Graduação lnter-unidades em Biotecnologia USP/Instituto Butantan/IPT, intitulada "MÉTODOS ALTERNATIVOS DE PURIFICAÇÃO DO POLISSACARÍDEO CAPSULAR DE HAEMOPHILUS INFLUENZAE TIPO B", em 2008 se refere à revisão bibliográfica realizada pela autora descrevendo sinteticamente o método para a purificação de PRP, onde descreve o processo clássico de purificação do PRP envolvendo várias etapas de precipitação com etanol e detergente catiônico (inflamável e poluente), extração com fenol (tóxico e corrosivo) e etapas de centrifugação/ ultracentrifugação.

[0034] Neste documento de Dissertação, a autora conclui que a melhor forma de se recuperar o PRP é através de centrifugação. Além disso, neste documento, não foram empregadas operações unitárias de microfiltração tangencial conforme revelado pela presente invenção.

[0035] No processo revelado pelo documento de dissertação em nome de SILVIA MARIA FERREIRA ALBANI são empregadas duas etapas de microfiltração tangencial 0,22 μm. Na primeira delas o solvente utilizado é etanol 30%, enquanto que na segunda etapa o solvente é etanol 80%. Essas concentrações de etanol também foram empregadas em duas etapas de precipitação. Esse método é diferente da presente invenção, em que existe apenas uma microfiltração tangencial na presença de etanol (40%) e as concentrações de etanol utilizadas nas etapas de precipitação são distintas, a saber, 40 e 60%. A alteração da concentração de etanol não é uma solução óbvia para o melhoramento do processo apresentado na referida dissertação em nome de SILVIA MARIA FERREIRA ALBANI.

[0036] O artigo em nome de Silvia Maria Ferreira Albani e colaboradores e intitulado: "POLYSACCHARIDE PURIFICATION FROM HAEMOPHILUS INFLUENZAE TYPE B THROUGH TANGENTIAL MICROFILTRATIONSILVIA", publicado na revista Carbohydrate Polymers 116 (2015) páginas 67-73 em 28 de março de 2014 revela um processo para purificação de PRP produzido por Haemophilus influenzae tipo b, desenvolvido a partir do processo de referência apresentado no documento D6. Contudo, com exceção da separação celular, as etapas de centrifugação foram substituídas por microfiltração tangencial.

[0037] Em contraste com a presente invenção, o processo apresentado no artigo em nome de Silvia Maria Ferreira Albani e colaboradores não utiliza microfiltração tangencial para a separação de células, onde essa etapa é essencial na obtenção da pureza de PRP desejada na presente invenção.

Sumário da Invenção

[0038] Para solucionar os problemas acima mencionados, a presente invenção propiciará vantagens significativas em relação aos processos de produção, recuperação e purificação de PRP produzido pela bactéria Haemophilus influenzae tipo b, possibilitando um aumento do seu desempenho e apresentando uma relação custo/benefício mais favorável.

[0039] A presente invenção se refere a processos envolvidos na produção e purificação do polissacarídeo capsular Poliribosil-Ribitol-Fosfato (PRP) produzido pela bactéria Haemophilus influenzae tipo b (Hib).

[0040] O objetivo da presente invenção é obter o polissacarídeo com pureza e massa molecular adequada para a posterior formulação de vacina conjugada de Hib. Uma possível apresentação final seria a vacina pentavalente, que confere resistência a cinco doenças: DTP (difteria-tétano-pertussis), HepB (hepatite B) e Hib.

[0041] O processo revelado pela presente invenção engloba duas etapas distintas: (a) produção do polissacarídeo por fermentação e (b) recuperação e purificação do polissacarídeo.

[0042] O processo revelado pela presente invenção envolve o uso meio complexo de origem vegetal em substituição aos meios complexos de origem animal utilizados no estado da técnica. Foi adotado o preparo do lote semente e lote de trabalho para manter a homogeneidade entre os lotes de ensaios realizados, permitindo fazer o acompanhamento da viabilidade celular como critério de validade do lote. Inóculo e pré-inoculo foram realizados em meio líquido ao invés de plaqueamento para reduzir o tempo de processo. O cultivo é conduzido em regime de batelada alimentada a vazão constante, com duração menor que 24h. A concentração de PRP ao final do cultivo atinge valores superiores a 1400 mg/L, muito maiores que as concentrações atingidas pelos processos revelados no estado da técnica, menores que 500 mg/L. Em relação à purificação do polissacarídeo, este é um processo inovador, pois existem alterações significativas em relação aos processos descritos no estado da técnica.

[0043] Os processos descritos no estado da técnica utilizam os detergentes CTAB e/ou deoxicolato - DOC (origem animal) e se baseiam principalmente na precipitação de PRP ou impurezas com etanol. O processo revelado pela presente invenção também utiliza etanol, mas em diferentes etapas do processo.

[0044] Também evitou-se na presente invenção a utilização dos detergentes DOC e CTAB. Além disso, as etapas de centrifugação foram substituídas por microfiltração de fluxo tangencial.

[0045] O processo da presente invenção apresenta menor número de etapas que os processos do estado da técnica, com isso, o consumo de reagentes é muito reduzido, devido à alteração nas concentrações de etanol utilizadas em cada etapa.

[0046] O processo da presente invenção mostrou-se escalonável, sendo possível realiza-lo em escala piloto.

Breve Descrição dos Desenhos

[0047] A estrutura e operação da presente invenção, juntamente com vantagens adicionais da mesma podem ser mais bem entendidas mediante referência aos desenhos em anexo e a seguinte descrição:

[0048] A Figura 1 mostra a estrutura química da cápsula polissacarídica (PRP) de H. influenzae tipo b;

[0049] A Figura 2 refere ao processo de cultivo de Haemophilus influenzae tipo b para a produção de PRP conforme uma concretização da presente invenção;

[0050] A Figura 3 mostra o fluxograma do processo completo de clarificação do caldo fermentado por Hib e purificação do PRP da presente invenção;

[0051] A Figura 4 mostra a influência da estratégia de separação celular na recuperação e pureza do PRP. No gráfico são comparados um processo com separação celular por centrifugação e dois processos distintos por microfiltração tangencial (MF(A) e MF(B);

[0052] A Figura 5 mostra a Pureza relativa de PRP em relação a proteínas (PR Prot = gPRP/gProteína) e ácidos nucleicos (PR AN = gPRP/gácidos nucleicos) na fração sobrenadante após a precipitação do caldo fermentado com etanol 30% na presença de surfactantes selecionados. Neste experimento de seleção de aditivos, a concentração de etanol utilizada ainda era de 30%;

[0053] A Figura 6 mostra o efeito da adição de diferentes concentrações de SDS (dodecil-sulfato de sódio) na recuperação de PRP na etapa [2MF]. Neste caso, a concentração de etanol utilizada corresponde à condição otimizada do processo. A combinação de 0,5% de SDS e etanol 40% resultou em uma melhora significativa na recuperação do PRP durante a etapa de microfiltração tangencial [2MF];

[0054] A Figura 7 mostra o perfil de precipitação de PRP purificado com etanol na presença de diferentes sais de cloro. Concentração salina igual a 200 mM;

[0055] A Figura 8 mostra o efeito das concentrações de acetato de sódio e etanol na recuperação de PRP após a segunda etapa de precipitação;

[0056] A Figura 9 mostra PRprot (cinza escuro) e PRan (cinza claro) na purificação de lotes distintos de PRP. As linhas negras cruzando as barras indicam os respectivos valores encontrados no controle. Condição controle: etanol 30% e acetato de sódio 5% na primeira precipitação; etanol 80% e acetato de sódio 7% na segunda precipitação. Condição otimizada: etanol 40% na primeira precipitação; etanol 60% e acetato de sódio 7% na segunda precipitação;

[0057] A Figura 10 mostra os problemas no escalonamento. Ultrafiltração tangencial [2UF] em membrana de poro 100 kDa. Solvente etanol 40% em água;

[0058] A Figura 11 mostra o efeito da concentração de etanol na segunda etapa de ultrafiltração tangencial em membrana de poro 100 kDa. Membrana de 0,5 m2; e

[0059] A Figura 12 mostra o efeito da concentração de sal na fração aquosa da solução de Etanol 40% na segunda etapa de microfiltração do processo de purificação de PRP.

Descrição Detalhada da Invenção

[0060] Embora a presente invenção possa ser suscetível a diferentes modalidades, é mostrada nos desenhos e na seguinte discussão detalhada, uma modalidade preferida com o entendimento de que a presente modalidade deve ser considerada uma exemplificação dos princípios da invenção e não pretende limitar a presente invenção ao que foi ilustrado e descrito aqui.

[0061] A presente invenção se refere a um processo de produção e purificação do polissacarídeo capsular Poliribosil-Ribitol-Fosfato (PRP) produzido pela bactéria Haemophilus influenzae tipo b (Hib). Mais especificamente, a presente invenção se refere a um processo de produção e purificação do polissacarídeo (PRP) com pureza e massa molecular adequada para posterior conjugação química e resultar na vacina conjugada de Hib.

[0062] A Figura 1 mostra estrutura química da cápsula polissacarídica (PRP) de H. influenzae tipo b.

1. Cultivo de Haemophilus influenzae tipo b

[0063] Inicialmente são preparados os lotes de armazenamento e de trabalho a partir de liofilizado da cepa de Haemophilus influenzae tipo b GB3291, produtora do polissacarídeo capsular Poliribosil-Ribitol-Fosfato (PRP) , adquirido do Núcleo de Coleções de Cultura e Microrganismo - Instituto Adolfo Lutz - SP com avaliação da pureza pelo método de Gram e determinação visual da viabilidade celular.

[0064] A suspensão bacteriana é distribuída em crioviais de 1 mL, congelada a -20°C por 12 horas e depois mantida até o momento do uso em nitrogênio líquido. A produção do PRP ocorre como esquematizado na Figura 2 e detalhada a seguir.

[0065] O pré-inoculo é preparado a partir da suspensão bacteriana do lote de trabalho armazenada em nitrogênio líquido. Um volume de 500 uL da suspensão bacteriana é transferida para um frasco do tipo Erlenmeyer de 300 mL contendo 50 mL de meio complexo contendo peptonas de origem vegetal e extrato de levedura. A amostra é mantida estática a 37°C por 7 - 10 h em câmara de anaerobiose.

[0066] Após esse período é aferida a densidade ótica da amostra a 540 nm (DO540) e esta transferida ao frasco de inóculo de 2 L, em volume adequado para que 400 mL da suspensão resultante apresente DO540 igual a 0,025.

[0067] A suspensão, denominada inóculo, é agitada em agitador orbital à 250 RPM e 37°C por pelo menos 12 horas, até atingir DO540 entre 5 e 7. Transferir o volume de inóculo adequado para que a DO540 inicial do meio de cultura inicial (Tabela 1), presente no biorreator, seja de 0,1.

[0068] O cultivo bacteriano é realizado em regime de batelada simples até que ocorra a depleção total da glicose do meio. Nesse ponto inicia-se a etapa de batelada alimentada pela adição de meio de alimentação conforme mostrado na Tabela 1.
Tabela 1 - Composição dos meios de cultura e de alimentação utilizados no cultivo de Haemophilus influenzae tipo b

[0069] O processo é finalizado após 20 horas de cultivo com DO540 em torno de 20. Após a finalização do cultivo, azida sódica é adicionada a concentração final de 0,2% e em seguida inicia-se o processo de purificação do polissacarídeo.

2. Clarificação do caldo fermentado e purificação do PRP

[0070] O processo completo de clarificação e purificação do PRP da presente invenção é apresentado na Figura 3.

[0071] Esse processo foi desenvolvido com o objetivo de reduzir o número de etapas dos processos já estabelecidos do estado da técnica, além de substituir as operações unitárias de centrifugação por filtração de fluxo tangencial.

[0072] O processo da presente invenção pode ser agrupado em três blocos de operações, cada um deles com uma microfiltração de fluxo tangencial utilizando membranas de poro 0,22 μm seguido de uma ultrafiltração de fluxo tangencial utilizando membranas de poro nominal 100 kDa.

[0073] A combinação de micro e ultrafiltração torna o processo compacto em termos de espaço e mão de obra utilizada, tendo em vista que estes podem ser realizados concomitantemente, ocupando o mesmo ambiente e sendo controlado pelos mesmos operadores.

[0074] A sequência de etapas proposta, principalmente as precipitações com etanol, não condiz com os processos já estabelecidos de purificação de PRP revelados do estado da técnica. Essa sequência resultou em remoção de impurezas em etapas precoces do processo, o que possibilitou a formulação de um processo com menor número de operações unitárias.

[0075] O produto obtido apresentou massa molecular elevada (> 100 kDa) e pureza condizente com os requerimentos de órgãos internacionais. A seguir serão apresentadas cada etapa de processamento em detalhes.

2.1 Primeira microfiltração, [1MF]

[0076] A primeira microfiltração do processo da presente invenção tem como objetivo a separação entre células bacterianas e o PRP presente no meio extracelular.

[0077] Essa etapa é denominada comumente de clarificação. Tradicionalmente a clarificação do caldo fermentado é realizada por centrifugação, mas no processo desenvolvido pela presente invenção utilizou-se a microfiltração de fluxo tangencial.

[0078] A microfiltração é realizada com membrana com poros de diâmetro igual a 0,22 μm. Durante essa etapa as células são dialisadas. A solução de diálise é tampão PBS (NaCl 150 mM, NaH2PO4/Na2HPO4 10 mM, pH 6,3). A diálise é realizada a volume constante com 15 - 25 diavolumes de tampão. Na fração permeada ou microfiltrada (1MF022) contém o PRP. As células ficam presentes na fração retida pela membrana, que é descartada.

2.2 Primeira ultrafiltração, [1UF]

[0079] A fração 1MF022 é submetida à concentração e diálise por ultrafiltração utilizando membrana de corte molecular nominal de 100 kDa. O conteúdo é inicialmente concentrado de 15 a 45 vezes e então dialisado a volume constante com 6 diavolumes de tampão PBS acrescido de SDS 0,5% pH 5,8 - 6,3). A fração concentrada é denominada [1UF100] . A adição de SDS não foi relatada em outras patentes. Verificamos a necessidade desse detergente para a maior remoção de impurezas durante a primeira ultrafiltração, [1UF], e na primeira etapa de precipitação, assim como melhor desempenho da segunda etapa de microfiltração, [2MF].

2.3 Primeira precipitação com etanol 40%

[0080] A primeira precipitação com etanol é realizada pela adição de etanol (95 - 99,5%) à fração 1UF100. A concentração final de etanol é 40% (v/v). O conteúdo é então mantido sob agitação por até 16h a temperatura ambiente.

[0081] O objetivo dessa etapa é a precipitação de impurezas, principalmente proteínas e ácidos nucleicos, enquanto o PRP mantém-se solúvel. Essa é uma diferença significativa para o estado da técnica, tendo em vista que no estado da técnica a primeira precipitação tem como objetivo a concentração do PRP por precipitação. Para isso, maiores concentrações de etanol são adicionadas, geralmente em combinação com o detergente CTAB.

2.4 Segunda microfiltração, [2MF]

[0082] O conteúdo precipitado da etapa anterior é então submetido à microfiltração com membrana com poros de diâmetro igual a 0,22 μm.

[0083] O objetivo é a retenção de impurezas precipitadas, enquanto o PRP solúvel é recuperado na fração permeada. Nos processos do estado da técnica, a separação do precipitado é realizada por centrifugação.

[0084] A diálise é realizada com 5 diavolumes de etanol 40% (v/v) em NaCl 50 mM. A combinação de reagentes nessa etapa também é uma inovação no processo da presente invenção, tendo em vista que a ausência de sal inviabiliza a microfiltração, fazendo com que o PRP seja retido pela membrana. A fração permeada na membrana (2MF022) contém o PRP.

2.5 Segunda ultrafiltração, [2UF]

[0085] As concentrações de etanol nas etapas [2MF] e [2UF] são distintas, tendo em vista estabilidade das membranas e a retenção do PRP. Portanto, após a realização da microfiltração [2MF], a fraçao 2MF022 deve ser diluída 1:1 com água, para que a concentração de etanol decaia a 20% (v/v) .

[0086] Esta diluição não foi empregada em nenhum outro processo revelado no estado da técnica. Contudo, ela mostrou-se fundamental para o sucesso da concentração do PRP na etapa [2UF] .

[0087] Após a diluição, a amostra é concentrada por ultrafiltração utilizando membrana de corte molecular nominal de 100 kDa.

[0088] Após a concentração de 10 a 20 vezes é realizada a diálise com etanol 20% (v/v) em água. A fração concentrada que contém o PRP é denominada 2UF100.

2.6 Segunda precipitação com etanol 60%

[0089] A segunda etapa de precipitação tem como objetivo obter o PRP na fase precipitada. Para isso etanol (90 - 99,5%) e acetato de sódio (30%, pH 5,8) são adicionados à fração 2UF100, para que a concentração final seja etanol 60% (v/v) e acetato de sódio 2,8% (m/v). Considerando apenas a fase aquosa, a concentração de acetado de sódio é 7%.

[0090] O conteúdo deve ser agitado a temperatura ambiente por até 4h. Após esse período a agitação é interrompida e o PRP decanta espontaneamente.

[0091] A decantação dura até 1h e, então, o sobrenadante é removido por bombeamento. A solubilização do precipitado é realizada em tampão PBS pH 6,3, sendo o conteúdo homogeneizado de 2 a 16h a temperatura ambiente até completa solubilização. A fração solubilizada é denominada SOLUB.

2.7 Terceira microfiltração, [3MF]

[0092] A fração SOLUB é submetida novamente à microfiltração com membrana com poros de diâmetro igual a 0,22 μm.

[0093] Novamente, o objetivo do processo da presente invenção é a retenção de impurezas precipitadas, enquanto o PRP solúvel é recuperado.

[0094] A diálise é realizada a volume constante com 5 - 15 diavolumes de PBS pH 6,3. O sucesso dessa etapa depende da concentração inicial do PRP, que deve ser preferencialmente menor que 2,4 g/L. Além disso, a vazão do microfiltrado deve ser rigorosamente controlada.

[0095] A fração permeada na membrana (3MF022) contém o PRP e segue para o processamento final.

2.8 Terceira ultrafiltração, [3UF]

[0096] A última etapa de processamento é a concentração e diálise em membrana de corte molecular nominal de 100 kDa.

[0097] A fração 3MF022 é concentrada de 5 a 15 vezes e então dialisada a volume constante com 10 diavolumes de água. A fração concentrada é denominada 3UF100, ou simplesmente "PRP purificado".

[0098] Esta fração pode ser congelada a temperaturas menores que -18°C ou liofilizada para posterior processamento, visando à formulação da vacina. Etapas posteriores podem compreender a conjugação do PRP com proteínas para a formulação final da vacina.

ASPECTOS DIFERENCIAS DA PRESENTE INVENÇÃO Utilização de Microfiltração Tangencial

[0099] No processo desenvolvido pela presente invenção, verificou-se que a utilização da microfiltração tangencial foi essencial na obtenção da pureza requerida de PRP em relação a proteínas e ácidos nucleicos, a saber, superior a 100 g de PRP por grama de ácidos nucleicos (PRan) e superior a 100 g de PRP por grama de proteínas (PRProt) .

[00100] Na Figura 4 são comparados três processos de purificação completos, que diferiam apenas na etapa de separação celular. No primeiro deles, em que foi empregada centrifugação, a pureza PRan desejada não foi atingida. Nos dois outros exemplos, em que se utilizou a microfiltração tangencial para a separação celular, as purezas relativas PRan e PRProt foram atingidas e muito excedidas.

Adição de SDS na primeira ultrafiltração 100 kDa

[00101] Os Processos de purificação de PRP descritos no estado da técnica geralmente empregam um surfactante (CTAB ou DOC) para promover a precipitação de PRP.

[00102] No processo revelado pela presente invenção, outro surfactante é utilizado, a saber, dodecil-sulfato de sódio (SDS). O objetivo da adição, nesse caso, é a precipitação de impurezas e auxiliar na microfiltração [1MF] .

[00103] No processo relado pela presente invenção, o SDS é adicionado na primeira etapa de ultrafiltração com membrana de 100 kDa. A escolha do surfactante foi realizada mediante a análise da precipitação in vitro do caldo fermentado por Hib com etanol 30% (mais acetato de sódio 5%) e em seguida etanol 80% (mais acetato de sódio 7%) . Nesse experimento, o surfactante foi adicionado na primeira precipitação. Dentre os surfactantes DOC, SDS, Triton X-100, Tween 80 e betaína, SDS e Tween 80 resultaram nas maiores purezas relativas em relação a proteínas e ácidos nucleicos (Figura 5) .

[00104] Além de auxiliar na precipitação de impurezas, verificou-se que o SDS também promove a maior remoção de proteínas e ácidos nucleicos durante a primeira ultrafiltração, além de ser um poderoso auxiliar na segunda microfiltração com etanol 40%, aumentando a vazão de filtrado e a permeabilidade do PRP (Figura 6).

[00105] Como se pode verificar na Figura 6, a menor concentração de SDS inviabilizou a recuperação do PRP nas condições testadas, devido à alta retenção do PRP pela membrana na ausência ou na presença de baixas concentrações de SDS. Portanto, acreditamos que a adição de SDS durante o processo caracteriza uma inovação que não é uma combinação óbvia dos processos já descritos no estado da técnica.

Alteração da concentração de etanol durante a precipitação

[00106] Uma técnica comumente empregada na precipitação de polissacarídeos é a precipitação com etanol em duas etapas com diferentes concentrações do solvente.

[00107] No caso do processo de purificação de PRP descrito nos documentos do estado da técnica, a concentração de etanol na primeira e na segunda precipitação são 30 e 80%, respectivamente.

[00108] Essas concentrações são efetivas na precipitação de impurezas (na primeira etapa) ou do PRP (na segunda etapa), mas resultam em grande utilização do solvente orgânico e perdas significativas de PRP durante etapas de filtração tangencial.

[00109] Além disso, a precipitação nessas condições não é suficiente para a obtenção da pureza desejada, sendo necessária uma etapa de hidrólise enzimática de proteínas e ácidos nucleicos.

[00110] Estudos in vitro de precipitação do PRP purificado demostraram que a precipitação de PRP é dependente da presença de sais. Nessas condições, a precipitação ocorre de maneira abrupta com o aumento da concentração do solvente (Figura 7).

[00111] Este comportamento não havia sido observado anteriormente. Uma aplicação prática deste comportamento é que as concentrações de etanol empregadas na purificação de PRP podem ser alteradas. Essa alteração não é comumente empregada. Por exemplo, segundo o estado da técnica, a precipitação de polissacarídeos geralmente é realizada com concentrações de etanol superiores a 70% e dificilmente são alvo de otimização.

[00112] A alteração da concentração de etanol é um ponto fundamental no processo desenvolvido na presente invenção. Para isso, um estudo foi realizado para verificar a melhor condição para a precipitação nas duas etapas, pela combinação dos reagentes etanol e acetato de sódio (Figura 8) .

[00113] A partir desse estudo comprovou-se que, de fato, a precipitação do PRP ocorre em uma estreita faixa de concentração de etanol na presença de acetato de sódio.

[00114] Em conjunto com os dados de pureza do produto, estabeleceu-se uma nova condição para a precipitação do PRP: etanol 40% na primeira etapa e etanol 60% mais 7% de acetato de sódio na segunda etapa de precipitação.

[00115] A Figuras 8 mostra a Recuperação de PRP na fase sobrenadante após a segunda precipitação.

Eficiência do processo da presente invenção

[00116] A eficiência do processo da presente invenção foi comparada com a metodologia tradicional através da precipitação sequencial do caldo fermentado nas condições descritas anteriormente.

[00117] O procedimento foi repetido quatro vezes. Verificou-se que em todos os ensaios, a pureza atingida com o processo da presente invenção foi superior à condição controle (Figura 9).

[00118] A Figura 9 mostra PRProt (cinza escuro) e PRAN (cinza claro) na purificação de lotes distintos de PRP. As linhas negras cruzando as barras indicam os respectivos valores encontrados no controle. Condição controle: etanol 30% e acetato de sódio 5% na primeira precipitação; etanol 80% e acetato de sódio 7% na segunda precipitação. Condição otimizada: etanol 40% na primeira precipitação; etanol 60% e acetato de sódio 7% na segunda precipitação.

[00119] A alteração das concentrações de etanol resultou em dificuldades nas etapas de filtração tangencial, devido à alteração da estrutura das membranas, o que resultou em perdas significativas de PRP. Por exemplo, a ultrafiltração tangencial com membranas de poro 100 kDa na presença de etanol 40% foi realizada com sucesso na escala de bancada utilizando membranas de 0,1 m2.

[00120] Contudo, ao escalonar o processo para a utilização de membranas de 0,5 m2 (dimensões do cassete 17,8 x 21cm) as perdas de PRP foram superiores a 50%, o que inviabilizaria o processo (Figura 10).

[00121] A Figura 10 mostra problema no escalonamento. Ultrafiltração tangencial em membrana de poro 100 kDa. Solvente etanol 40% em água.

[00122] Para solucionar o problema do escalonamento, foi adicionada uma etapa de diluição do material a ser ultrafiltrado, para que a concentração de etanol fosse igual a 20%. Essa concentração foi determinada de acordo com a verificação das perdas de PRP nessa etapa em função da concentração de etanol utilizada (Figura 11).

[00123] A Figura 11 mostra o efeito da concentração de etanol na segunda etapa de ultrafiltração tangencial em membrana de poro 100 kDa. Membrana de 0,5 m2.

[00124] Outra consequência da alteração da concentração de etanol é o aumento da retenção de PRP pelas membranas de microfiltração, resultando em perdas do PRP.

[00125] A solução deste problema se deu pelo aumento da concentração salina no tampão de diálise (Figura 12).

[00126] Contudo, devido à correlação entre alta concentração salina e a perda de PRP na etapa posterior, verificou-se que concentrações moderadas de NaCl (50 mM) durante a segunda microfiltração tangencial 0,22 μm resultam em recuperações elevadas do produto tanto na microfiltração, quanto na ultrafiltração posterior.

[00127] A Figura 12 mostra o efeito da concentração de sal na fração aquosa da solução de Etanol 40% na segunda etapa de microfiltração do processo de purificação de PRP.

[00128] Assim, embora tenham sido mostradas apenas algumas modalidades da presente invenção, será entendido que várias omissões, substituições e alterações no processo de produção, recuperação e purificação de polissacarídeo capsular poliribosil-ribitol-fosfato (PRP), podem ser feitas por um técnico versado no assunto, sem se afastar do espírito e escopo da presente invenção.

[00129] É expressamente previsto que todas as combinações dos elementos que desempenham a mesma função substancialmente da mesma forma para alcançar os mesmos resultados estão dentro do escopo da invenção. Substituições de elementos de uma concretização descrita para outra são também totalmente pretendidas e contempladas.

[00130] Também é preciso entender que os desenhos não estão necessariamente em escala, mas que eles são apenas de natureza conceitual. A intenção é, portanto, ser limitada, tal como indicado pelo escopo das reivindicações anexas.

Referências

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Claims (32)

1. Processo de cultivo de Haemophilus influenzae tipo b para a produção de PRP caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:

   • a) preparar lotes a partir de liofilizado da cepa de Haemophilus influenzae tipo b GB3291, produtora do polissacarídeo capsular Poliribosil-Ribitol-Fosfato (PRP),
   • b) distribuir a suspensão bacteriana em crioviais;
   • c) preparar um pré-inoculo a partir da suspensão bacteriana do lote armazenado em nitrogênio líquido;
   • d) transferir um volume da suspensão bacteriana para um frasco contendo 50 mL de meio complexo contendo peptonas de origem vegetal e extrato de levedura.
   • e) manter a amostra estática a 37°C por 7 - 10 h em câmara de anaerobiose;
   • f) transferir a amostra ao frasco de inóculo de 2 L, em volume adequado para que 400 mL da suspensão resultante apresente DO540 igual a 0,025.
   • g) Incubar e agitar a suspensão à 37°C "overnight".
   • h) Transferir o volume de suspensão adequado para que a DO540 inicial do meio de cultura inicial, presente no biorreator, seja de 0,1.
   • i) finalizar o processo após 20 horas de cultivo com DO540 em torno de 20.
   • j) Após a finalização do cultivo, inibidor de crescimento é adicionado a concentração final de 0,2% e, em seguida, inicia-se o processo de purificação do polissacarídeo.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a suspensão bacteriana é distribuída em crioviais, preferencialmente, de 1 mL, congelada a -20°C por 12 horas e depois mantida até o momento do uso em nitrogênio líquido.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que após a etapa e) é aferida a densidade ótica da amostra a 540 nm (DO540).
4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa g) a suspensão é agitada em agitador orbital à 250 RPM e 37°C por pelo menos 12 horas, até atingir DO540 entre 5 e 7.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o cultivo bacteriano é realizado em regime de batelada simples até que ocorra a depleção total da glicose do meio, e em que nesse ponto inicia-se a etapa de batelada alimentada pela adição de meio de alimentação a vazão constante.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa j) o inibidor de crescimento é selecionado do grupo de azida sódica, Timerosal (C9H9HgNaO2S), preferencialmente, o inibidor de crescimento é azida sódica.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura inicial compreende:
   10 g/l de soytone;
   5,0 g/l de extrato de levedura UF;
   5,0 g/l de glicose;
   5,0 g/l de NaCl;
   2,5 g/l de de K2HPO4;
   10 g/l de Na2HPO4;
   5,8 g/l de NaH2PO4-H2O;
   0,015 g/l de NAD; e
   0,03 g/l de Hemina.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o meio de alimentação compreende:
   10 g/l de soytone;
   100,0 g/l de extrato de levedura UF;
   200,0 g/l de glicose;
   5,0 g/l de NaCl;
   2,5 g/l de de K2HPO4;
   10 g/l de Na2HPO4;
   5,8 g/l de NaH2PO4 · H2O;
   0,015 g/l de NAD; e
   0,03 g/l de Hemina
9. Processo de clarificação e purificação do PRP conforme definido pelas reivindicações 1 a 8 caracterizado pelo fato de que o processo compreende as seguintes etapas:

   • a) 1a microfiltração do caldo fermentado utilizando membranas de poro 0,22 μm e PBS, pH 6,3 para obtenção do permeado 1MF022;
   • b) O permeado é submetido a uma 1a ultrafiltração utilizando membrana de corte molecular nominal de 100 kDa, SDS 0,5% em PBS, pH 6,3 para obtenção do concentrado 1UF100;
   • c) O concentrado 1UF100 é submetido a uma 1a precipitação pela adição de etanol (95 - 99,5%) . A concentração final de etanol é 40% (v/v).
   • d) Após a 1a precipitação é realizada a 2a microfiltração [2MF] com membrana com poros de diâmetro igual a 0,22 μm para obter o permeado 2MF022.
   • e) Diluição da fração 2MF022 a 1:1 com água para que a concentração de etanol decaia a 20% (v/v);
   • f) Após a diluição, a amostra é concentrada por um 2a ultrafiltração utilizando membrana de corte molecular nominal de 100 kDa para obtenção do concentrado 2UF100.
   • g) Após a concentração de 10 a 20 vezes é realizada a diálise com etanol 20% (v/v) em água;
   • h) O concentrado 2UF100 é submetido a uma segunda precipitação com etanol 60% e acetato de sódio 2,8% (7% na fase aquosa) e agita-se o conteúdo a temperatura ambiente por até 4 h.
   • i) Após esse período a agitação é interrompida e o PRP decanta espontaneamente;
   • j) A fase líquida contendo 60% de etanol é transferida por bombeamento e o precipitado é submetido a uma solubilização em tampão PBS pH 6,3, sendo o conteúdo homogeneizado de 2 a 16h a temperatura ambiente;
   • k) O solubilizado (SOLUB) é submetido a uma 3a microfiltração [3MF] com membrana com poros de diâmetro igual a 0,22 μm, em que PRP solúvel é recuperado 3MF022;
   • l) A fração permeada na membrana 3MF022 é submetida a 3a ultrafiltração [3UF] com concentração e diálise em membrana de corte molecular nominal de 100 kDa, em que a fração 3MF022 é concentrada de 5 a 15 vezes e então dialisada a volume constante com 10 diavolumes de água para se obter fração concentrada 3UF100, ou simplesmente "PRP purificado".
10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a primeira microfiltração separa as células bacterianas e o PRP presente no meio extracelular denominada de "clarificação".
11. Processo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a clarificação do caldo fermentado é realizada por microfiltração de fluxo tangencial.
12. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a microfiltração é realizada com membrana com poros de diâmetro igual a 0,22 μm, e em que durante essa etapa as células são dialisadas.
13. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a solução de diálise é tampão PBS pH 6,3 e, em que a diálise é realizada a volume constante com 10 - 25 diavolumes de tampão.
14. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a fração permeada ou microfiltrada 1MF022 contém o PRP, e as células ficam presentes na fração retida pela membrana, que é descartada.
15. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a fração 1MF022 é submetida à concentração e diálise por ultrafiltração utilizando membrana de corte molecular nominal de 100 kDa [1UF].
16. Processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o conteúdo é inicialmente concentrado de 15 a 45 vezes e então dialisado a volume constante com 6 diavolumes de tampão PBS pH 5,8 - 6,3 acrescido de SDS 0,5%.
17. Processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a fração concentrada é denominada 1UF100.
18. Processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que com a adição de SDS acontece maior remoção de impurezas durante a primeira ultrafiltração, [1UF], e na primeira etapa de precipitação, assim como melhor desempenho da segunda etapa de microfiltração, [2MF].
19. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a primeira precipitação com etanol é realizada pela adição de etanol (95 - 99,5%) à fração 1UF100, em que a concentração final de etanol é 40% (v/v) .
20. Processo, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o conteúdo é então mantido sob agitação por até 16h a temperatura ambiente para a precipitação de impurezas, principalmente proteínas e ácidos nucleicos, enquanto o PRP mantém-se solúvel.
21. Processo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o conteúdo precipitado da etapa anterior é então submetido à microfiltração com membrana com poros de diâmetro igual a 0,22 μm [2MF] para a retenção de impurezas precipitadas, enquanto o PRP solúvel é recuperado na fração permeada, em que a diálise é realizada com 5 diavolumes de etanol 40% (v/v) em NaCl 50 mM, e , em que a fração permeada na membrana 2MF022 contém o PRP.
22. Processo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que as concentrações de etanol nas etapas [2MF] e [2UF] são distintas, tendo em vista estabilidade das membranas e a retenção do PRP, em que após a realização da microfiltração [2MF], a fração 2MF022 deve ser diluída 1:1 com água, para que a concentração de etanol decaia a 20% (v/v).
23. Processo, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que após a diluição, a amostra é concentrada por ultrafiltração utilizando membrana de corte molecular nominal de 100 kDa, onde após a concentração de 10 a 20 vezes é realizada a diálise com etanol 20% (v/v) em água e a fração concentrada que contém o PRP é denominada 2UF100.
24. Processo, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a segunda etapa de precipitação obtém-se o PRP na fase sólida, onde, para isso, o etanol (90 - 99,5%) e acetato de sódio (30%, pH 5,8) são adicionados à fração 2UF100, para que a concentração final seja etanol 60% (v/v) e acetato de sódio 2,8% (m/v) (equivalente a 7% na fase aquosa), em que o conteúdo é agitado a temperatura ambiente por até 4h, onde após esse período a agitação é interrompida e o PRP decanta espontaneamente.
25. Processo, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a decantação dura até 1h e então o sobrenadante é removido por bombeamento, e a solubilização do precipitado é realizada em tampão PBS pH 6,3, sendo o conteúdo homogeneizado de 2 a 16h a temperatura ambiente, e a fração solubilizada é denominada SOLUB.
26. Processo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a fração SOLUB é submetida novamente à microfiltração em membrana com poros de diâmetro igual a 0,22 μm [3MF] retendo as impurezas precipitadas, enquanto o PRP solúvel é recuperado, e a diálise é realizada a volume constante com 5 - 15 diavolumes de PBS pH 6,3.
27. Processo, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a concentração inicial do PRP deve ser menor que 3,6 g/L, preferencialmente menor, que 2,4 g/L. e a vazão do microfiltrado deve ser rigorosamente controlada, a fração permeada na membrana 3MF022 contém o PRP.
28. Processo, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a fração 3MF022 é concentrada de 5 a 15 vezes e então dialisada a volume constante com 10 diavolumes de água. A fração concentrada é denominada 3UF100, ou simplesmente "PRP purificado".
29. Processo, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que esta fração pode ser congelada a temperaturas menores que -18°C ou liofilizada para posterior processamento.
30. Uso do PRP purificado obtido pelo processo conforme definido pelas reivindicações 1 a 29 caracterizado pelo fato de que é para a preparação de vacina contra H. influenzae tipo b.
31. Uso, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato da vacina ser uma vacina pentavalente, composta por cinco antígenos: DTP (difteria- tétano-pertussis), HepB (hepatite B) e Hib.
32. Uso do PRP purificado obtido pelo processo conforme definido pelas reivindicações 1 a 29 caracterizado pelo fato de ser para a conjugação do PRP com proteínas.

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