CZ28694A3 - Process for preparing capsular polysaccharide free of lipid and endotoxin - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu výroby kapsulárního polysacharidu, prostého lipidu a endotoxinu ze surového nebo purifikovaného přípravku obsahujícího jak kapsulární polysacharid prostý lipidu, tak lipo-kapsulární polysacharid, kterýžto přípravek je získán z bakterií, bez podstatné ztráty kapsulárního polysacharidu.

Vynález se zejména týká způsobu výroby kapsulárního polysacharidu, prostého lipidu, z bakteriálních kultur, včetně typově specifického kapsulárního polysacharidu z Gram-negativních bakterií. Při způsobu podle vynálezu se kapsulární polysacharid, který obsahuje kovalentně vázané glyceroldiesterové zbytky, převádí na volný polysacharid.

V přednostním provedení tohoto vynálezu se z kapsulárního polysacharidu, z něhož se odštěpuje kovalentně vázaný lipid, také odstraňují lipopolysacharidy, LPS nebo endotoxin.

Při jednom provedení je způsob podle tohoto vynálezu přizpůsoben výrobě polyribosylribitolfosfátu (dále označovaného zkratkou PRP), prostého lipidů, což je kapsulární polysacharid získaný z kultur patogenní bakterie Haemophilus influenzae typu B, který bývá také označován zkratkou Hib. Získaný PRP je vhodný jako složka pro výrobu očkovacích látek, jejichž účelem je vyvolat imunitní odpověď poskytující ochranu proti vývoji chorob způsobených Hib. Na základě tohoto vynálezu lze předpokládat, že v podobně vysokém výtěžku by bylo možno získávat, na základě zde uvedených znalostí, í kapsulární polysacharidy z jiných patogenních bakterií, v nichž je přítomna podobná kovalentní vazba k lipidu, jako z bakterií E. coli nebo Neisseria meningitidis.

Dosavadní stav techniky

Patogenní bakterie, Hib, je zodpovědná za četné choroby, z nichž nejvýznamnější je bakteriální meningitida a systemická bakteriální choroba, která se vyskytuje především u dětí mladších než pět let. Nedávno byl americkým úřadem FDA udělen souhlas pro použití očkovacích látek zaměřených proti Hib u lidí (viz 1991 Physicians Desk Reference, str. 1476 až 1478 pro výrobek firmy Merck & Co. Inc.,

PedvaxHIB^¹*) a str. 1174 až 1176 pro výrobek firmy Lederle Hib TITER^R).

Jeden způsob výroby očkovací látky proti Hib je popsán v US patentech č. 4 695 624 a 4 882 317. PRP, používaný při tomto postupu byl získán kultivací Haemophilus influenzae typu b, a izolací pólysacharidové frakce z kultivačního media. Izolovaný PRP se potom konjuguje s vnějším membránovým proteinovým komplexem z Neisseria meningitidis b, který působí jako nosič zvyšující imunitní odpověď PRP, který je sám o sobě u malých dětí málo imunogenní.

Podle US patentu č. 4 695 624 se fermentační směs 800L z Haemophilus influenzae typu b zkoncentruje na 377 g vlhké pasty (viz sloupec 16, řádek 24). PRP se izoluje selektivním srážením při různých koncentracích ethanolu, za přítomnosti chloridu vápenatého. Získá se 68 g suchého produktu (viz sloupec 17, řádek 1), který je dále označován označením pre-fenolový prášek. Další zpracování zahrnuje extrakci fenolem a srážení ethanolem a získá se při něm 39 g suchého produktu (viz sloupec 17, řádek 49) a konečný výtěžek je 34,7 g suchého produktu (viz sloupec 18, řádek

14). Tato látka je dále označována názvem post-fenolový prášek. Post-fenolový prášek se může konjugovat nebo podrobit další purifikaci, za účelem odstranění endotoxinu.

Endotoxin je hlavní složkou přispívající ke zvýšení teploty u savců po jejich očkování imunogeny získanými z bakterií. Tuto tzv. pyrogenní odpověď je možno eliminovat odstraněním liposacharidů obsahujících lipid A, které jsou dále označovány synonymními názvy endotoxin, pyrogen nebo LPS, z tohoto imunogenu. Za účelem dosažení tohoto cíle se může post-fenolový PRP, získaný způsobem uvedeným výše, dále purifikovat, aby bylo možno splnit regulační normy pro pyrogen. Až do vyvinutí tohoto vynálezu bylo tohoto cíle možno dosáhnout jen za cenu ztráty přibližně 70 % PRP, přítomného v post-fenolovém prášku, selektivní frakcionací za použití ethanolu. Tento postup zahrnuje srážení LPS z post-fenolového PRP přidáváním ethanolu až do koncentrace, která právě postačuje pro iniciaci srážení, tj. až do tzv. bodu zákalu, jak je to uvedeno v US patentu č. 5 039 610 a v US patentové přihlášce č. 595 722. Ethanol se přidává až do bodu zákalu, tj. do okamžiku, kdy se dosáhne přibližně dvojnásobného nárůstu zákalu. Potom se přidá dalších 0,5 až 2 % ethanolu. Tak se získá sraženina, která až dosud představovala odpadní produkt a je dále označována názvem nízká frakce, přičemž PRP, prostý lipidu zůstává v roztoku. Nízká frakce obsahuje přibližně 70 % PRP a v podstatě všechen LPS.

Ve snaze vyhnout se ztrátě PRP, ke které dochází při odstraňování endotoxinu selektivní frakcionací za použití ethanolu, vyvinuli původci způsobu popsaného v US patentu č. 5 019 502 způsob odstraňování LPS, který není doprovázen podstatnou ztrátou PRP. Tento způsob zahrnuje pasážování solubilizovaného post-fenolového prášku hydrofobním adsorpčním stupněm, které se provádí diskontinuálně nebo kontinuálně v chromatografické koloně a přednostně se při něm používá neiontových pryskyřic, k nimž se váže endotoxin ale nikoliv polysacharidy.

Při použití vysoce porézního styren-divinylbenzenového kopolymerů, jako je HP20 se skutečně kvantitativně odstraní v podstatě všechen endotoxin a dosáhne se téměř kvantitativního výtěžku PRP. Tato látka je dále označována názvem post-HP20 PRP. Podstatná část PRP, produkovaného Hib, je však ve formě kovalentního lipo-PRP.

Možnost, že PRP je produkován Haemophilus influenzae typu b, jako lipo-PRP, poprvné zjistili Kuo a další (J. Bacteriol. 163, 769 až 773 (1985)), když byla bakterie Haemophilus influenzae typu b pěstována v kapalném médiu, doplněném radioaktivním palmitátem a/nebo radioaktivní ribosou. Polyribosylribitolfosfát, purifikovaný ze supernatantu této kultury, obsahoval jak radioaktivní ribosu, tak palmitát, které byly zavedeny do PRP v průběhu jeho biosyntézy. Zjistilo se, že zpracováním fosfolipasou A₂ (PLA₂) lze odstranit určitou část radioaktivního palmitátu z PRP, zatímco metody, které jsou schopny rozlomit nekovalentní asociaci byly neúspěšné. Nebyla uvedena struktura lipo-PRP, ale uvedená data jsou konsistentní s daty, oznámenými ve starší publikaci, kde byla navržena struktura meningokokové skupiny A, B, Ca polysacharidů z E. Coli K 92 (Gotschlich a další, J. Biol. Chem. 25b, 8915 až 8921 (1981)). Při způsobu podle vynálezu byla na základě práce se specifickými fosfolipasami zjištěna struktura lipo-PRP, která je podrobněji uvedena v dalším popisu.

Lipo-PRP se neváže k hydrofobní pryskyřici, které se používá podle US patentu č. 5 019 502, díky menším hydrofobním vlastnostem, které lipo-PRP dodávají kovalentní lipidy, v kontrastu k převážně aniontové povaze velmi velké polysacharidové části molekuly. Konečný produkt získaný při tomto postupu proto obsahoval podstatnou část jak lipo-PRP, tak PRP, prostého lipidu. Tento lipo-PRP se odstraní bud selektivní frakcionací za použití ethanolu, při níž dochází přibližně k 70% ztrátě PRP nebo za použití způsobu zde popsaného, při němž se v podstatě všechen PRP získá ve formě PRP, prostého lipidu.

Úkolem tohoto vynálezu je tedy vyvinout způsob získávání kapsulárního polysacharidu, prostého lipo-PRP, který by umožnil produkovat konjugátový produkt, nerozeznatelný od konjugátu, vyrobeného pouze za použití frakce polysacharidu, prostého lipidu, získaného selektivní frakcionací za použití alkoholu. Dalším úkolem tohoto vynálezu je vyvinout způsob produkce PRP ve vysokém výtěžku, který by zahrnoval konverzi lipo-PRP na lipo-prostý PRP, místo toho, aby se lipo-PRP zahazoval.

Dalším úkolem tohoto vynálezu je vyvinout způsob, který by byl reprodukovatelný, pokud se týče množství a konsistence PRP, připravitelného z kultur bakterie Haemophilus influenzae typu b pro zajištění reprodukovatelnosti konjugátových očkovacích látek, vyrobených z takto získaného PRP. Další úkoly, které vynález řeší a výhody, které přináší, jsou zřejmé z dalšího podrobného popisu.

Podstata vvnálezu

Předmětem vynálezu je způsob výroby kapsulárního polysacharidu z bakterií, včetně typově specifického kapsulárního polysacharidu z Gram-negativních bakterií, jehož podstata spočívá v tom, že se kapsulární polysacharid obsahující kovalentní vazby k lipidu převede na kapsulární polysacharid, prostý lipidů a odstraní se endotoxinové nečistoty. V přednostním provedení se lipo-PRP převede na lipo-prostý PRP, získaný z kultury Haemophilus influenzae typu b odštěpením kovalentně vázaných lipidů od PRP pomocí fosfolipasy D v pufru obsahujícím asi 50 % objemových organických aktivátorů enzymu, asi 0,3 % detergentu a asi 5mM koncentraci kationtu dvojmocného kovu, při teplotě asi 35 °C a přibližně neutrálním pH, v průběhu asi 4 hodin, načež se odstraní enzym, zbytkové lipidy a lipopolysacharidy.

Přehled obr, na výkrese

Na obr. 1 je navržená struktura lipo-PRP.

Na obr. 2 je uvedeno porovnání výroby PRP za použití selektivní frakcionace pomocí alkoholu s výrobou PRP za použití enzymatické konverze lipo-PRP na PRP, po níž se odstraní enzym a LPS.

Na obr. 3 je znázorněno blokové schéma optimalizovaného postupu konverze lipo-PRP na lipo-prostý PRP a odstraňování endotoxinu.

Následuje podrobný popis vynálezu.

Jak již bylo uvedeno výše, podstatnou vynálezu je způsob odštěpování kovalentně vázaného lipidu z bakteriálního kapsulárního polysacharidu a způsob odstraňování lipidových a endotoxinových nečistot. Pro odštěpování lipidu se může používat chemických nebo enzymatických prostředků. Při selektivní frakcionaci polysacharidu s kovalentně vázaným lipidem za použití ethanolu dochází ke ztrátě frakce kapsulárního polysacharidu ve formě odpadního produktu, označovaného názvem nízká frakce. Tím, že vynález umožňuje odstranění kovalentně vázaného lipidu, vyhýbá se ztrátě kapsulárního polysacharidu, k níž dochází při selektivní frakcionaci za použití alkoholu a poskytuje polysacharidový produkt, který je užitečný při výrobě volných nebo konjugovaných polysacharidových očkovacích látek, jejichž úkolem je poskytnout ochranu proti infekci patogenem, z něhož byl polysacharid získán. Kovalentně vázaný lipid se například může odstraňovat působením hydroxylaminu. Odštěpování kovalentně vázaného lipidu z kapsulárního polysacharidu se přednostně provádí enzymaticky. V přednostním provedení tohoto vynálezu se ve vysokém výtěžku produkuje polyribosylribitolfosfát, PRP (intenzivní způsob výroby PRP).

Způsobu podle vynálezu je možno dobře porozumět na základě výkladu, který se opírá o obr. 1. Na obr. 1 je znázorněna struktura lipo-PRP, navržená na základě studií s fosfolipasami s definovanou specifičností. Struktura PRP, prostého lipidů, je stejná jako struktura znázorněná na obr. 1, pouze s tím rozdílem, že k fosfátovému zbytku opakujících se jednotek PRP není esterifikací připojen žádný diacylglycerolový zbytek. Přítomnost glycerolu v lipo-PRP byla též potvrzena vysoce účinnou kapalinovou chromatografií Dionex HPLC. Také byla potvrzena přítomnost glukózy.

Je známo, že fosfolipasa A₂ (PLA₂) štěpí označenou sn-2-polohu diacylglycerolů. Když se nechá PRP reagovat s obchodně dostupným přípravkem na bázi PLA₂ (Sigma, Boehringer) a sleduje se uvolňování mastných kyselin pomocí analýzy plynovou chromatografií, zaznamená se snížení obsahu palmitoolejové kyseliny [16:1 cis 9] ale nikoliv kyseliny palmitové [16:1] nebo kyseliny myristové [14:0], z nichž všechny jsou zjistitelné v lipo-PRP.

Obchodně dostupná fosfolipasa B (Sigma) je schopna odstranit určitou frakci kyseliny palmitové a kyseliny palmitoolejové, ale glukóza a glycerol se tímto enzymem neodstraní. Kromě toho, aktivita fosfolipasy C (Sigma) se zdá být zablokována, a proto je poloha glukózy taková, jak je to znázorněno na obr. 1. Obchodně dostupná fosfolipasa D (Sigma, Genencor, Boehringer) odstraňuje všechny tyto mastné kyseliny, stejně tak jako glycerol a glukózu. Žádného z těchto enzymů nebylo však možno použít zpočátku samotného a žádný z těchto enzymů neodstranil 100 % mastných kyselin z PRP před optimalizací, které se dosahuje za použití tohoto vynálezu.

Tento vynález představuje optimalizovaný postup, kterým lze dosáhnout úplného odstranění lipidu za použití samotné fosfolipasy (PLD). Kromě toho lze však při odstraňování kovalentních lipidů s výhodou používat též kombinací PLD s PLA₂ nebo PLB. Při jednom provedení tohoto vynálezu se používá kombinace fosfolipasy A₂ a fosfolipasy D při teplotě okolí k úplnému odstranění kovalentně vázaného lipidu z lipo-PRP, načež se PRP, prostý lipidu konjuguje s imunogenním proteinem, což se projevilo jako účinné pro vyvolání silné anti-PRP imunitní odpovědi.

Snižování požadavků na fosfolipasu je žádoucí, poněvadž tyto enzymy jsou nákladné a poněvadž snížení spotřeby enzymu usnadňuje jeho odstraňování z produktu. Úplného odstranění mastné kyseliny z post-fenolového práškovitého PRP se může dosáhnout za použití 700 U fosfolipasy A₂ (z porcinu) a 20 U fosfolipasy D (z Streptomyces chromofuscus), spolu s 30 % butyletheru a 0,1 % DOC, což jsou silné stimulátory enzymu. V literatuře je popsáno, že fosfolipasy a podobné enzymy jsou mimořádně citlivé na reakční přísady, jako jsou detergenty a organická rozpouštědla. Kates, zejména dokázal, že plastidová

Ci fosfatidasa C je vysoce stimulována přídavkem směsí etheru a methanolu, o nichž se předpokládá, že působí synergickytím, že umožňují substrátové a enzymové fázi koaleskovat v oblasti zvýšené aktivity enzymu [Can. J. Biochem. and Physiol., 35, 127 (1957)]. Původci tohoto vynálezu měli podezření, že podobný mechanismus by mohl ovládat aktivitu fosfolipasy, a proto se věnovali studiu účinku směsí etheru a methanolu na aktivitu enzymu.

Ukázalo se, že směs butyletheru a methanolu je velmi silným aktivátorem reakce fosfolipasy. Při postupu, který zahrnoval reakci post-fenolového práškovítého PRP s PLA₂ a PLD za přítomnosti 5 až 1% (objemově) butyletheru v methanolu a následující zpracování s pryskyřicí HP20, za účelem snížení obsahu endotoxinu, mělo za následek úplné odstranění lipidů z PRP. Kromě toho, požadavky na enzym byly sníženy 3,5-násobně, v případě PLA₂ (ze 700 na 200 U) a dvojnásobně, v případě fosfolipasy D (z 20 na 10 U). Přídavnou výhodou zpracování pomocí HP20 po reakci s enzymem je, že hydrofobní pryskyřice adsorbuje určité množství enzymu z reakční směsi a usnadňuje tak namahavé odstraňování enzymu v dalších reakčních stupních.

S ohledem na požadovaný cíl, jímž je výroba očkovací látky pro podávání lidem, je žádoucí používat co nejmenšího množství enzymu, aby bylo možno enzym úplně nebo téměř úplně odstranit. Dále je žádoucí používat enzymu, pocházejícího ze zdroje, který nemá žádnou možnost kontaminace savčími viry. Použití PLA₂ zporcinu může být nežádoucí, poněvadž zde může existovat zvýšené riziko nežádoucí imunologické odpovědi a v poslední době existují obavy z nezjistitelných virů v produktech získaných ze savců. PLA₂, izolovaná ze Streptomyces violaceoruber byla vyhodnocována za stejných reakčních podmínek, jaké jsou popsány výše. Lipidy byly úspěšně odstraněny za použití kombinace fosfolipas ze Streptomyces. Byly provedeny též další pokusy, při nichž se zjistilo, že minimální požadavek na enzym, v případě 100 mg PRP, je v rozmezí od 100 do 200 U PLA₂ ze Streptomyces a v rozmezí od 2 do 10 U u PLD.

Je třeba zdůraznit, že existují mnohé různé zdroje enzymů, které jsou označovány jako fosfolipasa A₂, D nebo B. Hadí jedy jsou bohatými zdroji PLA₂, zatímco PLD byla izolována ze zelí, podzemnice olejné a Streptomyces. Volba konkrétního zdroje je ve značné míře diktována ohledy, které byly zmíněny výše a specifickou aktivitou obchodně dostupných enzymatických přípravků. Dále je možné, že některé jiné lipasy by mohly vykazovat dostatečnou sekundární aktivitu, podobající se aktivitě fosfolipasy, aby mohly být užitečné při způsobu podle tohoto vynálezu. Použitelnost těchto jiných lipas k tomuto účelu by měla být zřejmá z tohoto vynálezu.

Jak se ukázalo, enzymatické metody používající buď kombinace fosfolipas nebo samotné fosfolipasy D pro odštěpování lipidů z post-fenolového práškovitého PRP jsou velmi dobře reprodukovatelné a schopné přizpůsobit se měnícímu se obsahu lipidu ve fenolem nebo thiraerasolem inaktivovaných kulturách Haemophilus influenzae b. Kromě toho, když se po enzymatické reakci provede zpracování pomocí HP20, podstatně se sníží obsah pyrogenu z 60 EU/^g, ve výchozím post-fenolovém práškovém PRP, na asi 10 EU/Txg, po enzymatické reakci a konečně až na asi 0,0125 EU/^g, po zpracování HP20. Tento pracovní postup představuje výborné schéma zajišťující úplné odstranění lipidu, podstatné snížení obsahu LPS a vysoké výtěžky PRP. Samozřejmě jsou možná i jiná schémata, jako je přidání lipasy dříve v průběhu izolace PRP, jako například do fermentační půdy, nebo bezprostředně po usmrcení bakterií. Do rozsahu tohoto vynálezu také přirozeně spadají postupy, při nichž je zaměněno pořadí různých stupňů.

Při přednostním provedení tohoto vynálezu se enzymatické odstraňování všech lipidů z lipo-PRP provádí pomocí optimalizované reakce, která zahrnuje reakci PRP pouze s fosfolipasou D, získanou ze Sterptomyces chromofuscus, při poměru přibližně 0,3 % hmotnostního fosfolipasy D, vztaženo na PRP. Tento enzym byl purifikován až do homogenity postupem podle Imamura a Horiuti, J. Biochem. 85, 79 až 95 (1979) a je obchodně dostupný od firmy Genencor International. Jak však již bylo uvedeno dříve, může se používat i jiných zdrojů PLD.

Optimalizované podmínky pro PLD zahrnují přídavek povrchově aktivní látky Triton X-100, která se zdá být účinnějším aktivátorem enzymu než deoxycholát (DOC).

Kromě toho, aktivita enzymu je také citlivá na množství vápenatých iontů. Pro zvýšení aktivity enzymu byla přidána látka Triton X-100 v 4,5mM koncentraci a vápenaté ionty v 5mM koncentraci, přestože by bylo možno použít i jiných kationtů dvojmocných kovů, jako například hořčíku. Přídavek vápníku do reakční směsi vyvolává potřebu používat jiných než fosfátových pufrů, jako například lOmM Tris pufru o pH 7,4. Množství organických rozpouštědel přidaných do reakční směsi bylo zvýšeno na 50 % objemových a butylether byl s ohledem na větší bezpečnost nahrazen methylterc.butyletherem. Za použití těchto modifikovaných podmínek pro reakci enzymu se po dalším zpracování pomocí HP20 dosáhlo úplného odstranění lipidu z pre-fenolového práškovítého PRP. Tyto reakce byly opakovány na dvou gramových vzorcích dvou různých dávek pre-fenolového práškovitého PRP, aby se ukázala reprodukovatelnost a účinnost tohoto postupu zpracování pre-fenolového práškového PRP pomocí PLD. Produkty prosté lipidů byly zkoumány na distribuci velikosti molekul pomocí chromatografie na Sepharose CL4B. Hodnota Kd těchto produktů ležela v rozmezí od asi 0,4 do asi 0,5, což je přijatelná hodnota pro imunogenicitu PRP. Samozřejmě je při této reakci možno použít i jiných pufrovacích podmínek nebo jiných detergentů. Tato skutečnost je odborníkům v tomto oboru zřejmá.

Intenzivní způsob výroby PRP byl demonstrován ve třech replikacích ve výrobní jednotce, v níž se vyrábí konjugátová očkovací látka na bázi Haemophilus b (meningokokový proteinový konjugát. V sérii bylo použito šesti fenolem inaktivovaných fermentačních várek H. influenzae. Tyto fermentační várky byly zkoušeny na čistotu kultury, inaktivaci H. influenzae a obsah PRP antigenu, přičemž všechny výsledky byly uspokojivé. Bylo vyrobeny tři várky PRP, kterých bylo dále použito jako výchozích látek pro výrobu v průmyslovém měřítku tří várek konjugátové očkovací látky na bázi Haemophilus b (ve formě konjugátu s meningokokovým proteinem). Výtěžek produktu za použití těchto tří várek PRP, z nichž každá vycházela ze dvou fermentačních kultur, byl asi 3,5x vyšší než výtěžek, kterého bylo dosaženo za použití selektivní frakcionace pomocí ethanolu.

Tři várky PRP, vyrobené tímto intenzivním způsobem výroby, byly následně použity pro výrobu konjugátové očkovací látky na bázi Haemophilus b (ve formě konjugátu s meningokokovým proteinem). Výstupní kontrola derivatizovaného polysacharidového produktu z Haemophilus b, tj. konjugátového produktu na bázi Haemophilus b (PRP-OMPC) a konjugátové očkovací látky na bázi Haemophilu b (ve formě konjugátu s meningokokovým proteinem), odebrané z finálního zásobníku, ukazuje, že všechny tyto látky jsou nerozeznatelné od podobných látek, které byly získány selektivním frakcionačním postupem za použití alkoholu.

Nízká frakce PRP představuje odpadní sraženinu (obsahující LPS, lipo-PRP a ztracený PRP) ze selektivní frakcionace pomocí ethanolu, což je poslední stupeň při výrobě PRP, podle způsobu zveřejněného v US patentu č. 5 039 610. Za použití stejných zlepšených reakčních podmínek, které byly vyvinuty pro pre-fenolový prášek, se po následujícím zpracování pomocí HP20 dosáhne v podstatě úplného odstranění lipidu z nízké frakce prášku, přičemž výtěžek je vyšší než 70 % PRP.

Reakční směs by měla obsahovat organická rozpouštědlo, které aktivuje fosfolipasu, přičemž toto rozpouštědlo by mělo přednostně tvořit přibližně 30 až 60 % reakčního objemu. Jako organického aktivátoru se přednostně používá etheru, jako je diethylether nebo methylterc.butylether. Ether je s výhodou přítomen ve formě směsi s druhým organickým rozpouštědlem, jako je hexan, ethanol nebo methanol, v poměru etheru ke druhému organickému rozpouštědlu v rozmezí od asi 20:1 do asi 5:1, přičemž přednostní poměr těchto látek je přibližně 9:1. Při provedení, kterému se dává vysoká přednost, se s jedním dílem ethanolu míchá devět dílů methylterc.butyletheru, který je méně těkavý než diethylether, a proto se s ním bezpečněji manipuluje a vzniklá organická směs se přidává k reakční směsi obsahující PLD, až do dosažení finální koncentrace přibližně 50 %. Přídavek organického rozpouštědla zřejmě napomáhá dosažení maximálního kontaktu lipidového substrátu s enzymem.

Kromě přídavku organického aktivátoru enzymu je žádoucí přidávat i detergent, jako je deoxycholát nebo Triton X-100 nebo podobný detergent, jehož úkolem je napomáhat rozbíjení lipidických agregátů a zvyšovat interakci mezi enzymem a substrátem. Detergent by měl být přítomen v koncentraci od asi 0,1 do asi 0,4 %. Zjistilo se, že docela uspokojující je přídavek asi 0,3 % Tritonu X-100.

Fosfolipasa D by se měla přidávat v dostatečném množství vzhledem k lipo-kapsulárnímu polysacharidu, aby bylo možno dosáhnout úplné hydrolýzy kovalentně vázaného lipidu v rozumném časovém období. Vhodný je přídavek asi 0,01 až 10 % PLD, vzhledem k PRP a s výhodou činí tento přídavek asi 0,1 až 0,4 %. Když se přidá méně enzymu, prodlouží se přirozeně reakční doba, zatímco při přidání většího množství enzymu se reakční doba zkrátí.

Úplného odstranění kovalentně vázaných mastných kyselin z lipo-PRP za přibližně 30 minut až 4 hodiny reakce je možno dosáhnout v tom případě, že se reakční směs míchá, aby byly všechny reakční fáze ve vzájemném styku, použije se asi 0,1 až 0,4% (hmotnostně) koncentrace PLD, asi 0,1 až asi lOmM koncentrace kationtu dvojmocného kovu, jako například vápníku ve formě chloridu vápenatého, v pufru, který je kompatibilní se všemi výše uvedenými reakčními složkami, jako je Tris pufr o pH přibližně v rozmezí od 7,0 až 8,0 a pracuje se přibližně v rozmezí od 20 do 45, s výhodou od 30 do 40 °C.

Výše uvedené reakční podmínky byly shledány jako docela uspokojivé pro získání PRP, prostého kovalentně vázaného lipidu, z výchozích PRP přípravků, které se značně liší, pokud se týče jejich čistoty. Tak byl zpracování za těchto podmínek podroben pre-fenolový prášek, post-fenolový prášek a post-HP20 produkt a ve všech případech byl získán PRP, prostý kovalentně vázaného lipidu.

Po konverzi lipo-PRP v daném přípravku na volný PRP se fosfolipasa, která je nyní přítomna v PRP přípravku, může odstranit fenolovou extrakcí tohoto proteinového enzymu. Aby se zajistilo úplné odstranění enzymu, opakuje se extrakce fenolem přednostně jednou až asi třikrát. Při tomto zpracování se neodstraňuje jen přidaný enzym, nýbrž také všechny zbývající proteinové nečistoty, které by mohly narušovat konjugaci, prováděnou v dalších stupních, nebo které by mohly způsobovat nežádoucí imunitní odpovědi u příjemců očkovací látky.

Při enzymatickém zpracování PRP, za účelem získání PRP, prostého kovalentně vázaných mastných kyselin, se také odštěpují některé mastné kyseliny z LPS. V důsledku enzymatického zpracování se množství endotoxinu sníží přibližně třikrát. Tato úroveň však obvykle nepostačuje pro to, aby přípravek vyhověl specifikacím na pyrogenicitu, a proto jsou nutné další stupně pro eliminaci zbytkového LPS. Při dalším odstraňování endotoxinu se může použít kterékoliv z četných metod, které jsou popsány v tomto oboru, včetně selektivní frakcionace za použití ethanolu, hydrofobní adsorpce nebo jiných metod, které jsou uvedeny v US patentu Č. 5 019 502.

Jako neomezující příklady pryskyřic, které jsou užitečné při způsobu podle vynálezu, je možno uvést výrobky Boráte Avidgel (Amicon), Amberlite XAD a Amberchrome (Rohm & Haas), Octyl Cellulose (Phoenix Chem.), Silica C8 (Baker), pryskyřice serie SP a HP (například SP207, HP20, HP50) (Mitsubishi Chem.). Z těchto pryskyřic se dává přednost pryskyřicím HP20 nebo HP50, vzhledem k jejich schopnosti snižovat obsah lipopolysacharidu, snadnosti použití, dostupnosti, ceně a tendenci vyhnout se vazbě k polysacharidům. Pryskyřice se před použitím přednostně promývá apyrogenní vodou. Přednostně se před použitím pryskyřice promývá kyselým roztokem, alkalickým roztokem nebo polárním rozpouštědlem (např. ethanolem nebo methanolem), teprve potom apyrogenní vodou a potom se předběžně ekvilibruje za použití pufru obsahujícího 3 % citranu sodného a 0,5 % deoxycholátu sodného. Podobné se polysacharid přednostně solubilizuje v pufru obsahujícím asi 3 % citranu sodného a asi 0,5 % deoxycholátu sodného a vzniklý roztok se potom zpracovává hydrofobní pryskyřicí, která byla předběžně upravena výše popsaným způsobem. Aby se zabránilo fluktuacím pH, bývá robněž užitečné přidat Tris pufr o pH 8,0, až do přibližně 25mM koncentrace.

Kapsulární polysacharid, obsahující kovalentně vázaný lipid, je možno převést na volný polysacharid buď před nebo po odstranění endotoxinu. Při jednom provedení tohoto vynálezu se prášek, získaný z půdy po fermentaci H. influenzae, který obsahuje polyribosylribitolfosfát, lipopolysacharidy a různé lipidy a proteiny, solubilizuje v lOmM pufru Tris s chloridem vápenatým o 5mM koncentraci, Tritonem X-100 o 4,5mM koncentraci o pH 7,4 a potom se ke vzniklému roztoku přidá směs terč.butyletheru a ethanolu v poměru 9:1 až do koncentrace 50 %. Ke směsi se přidá asi 0,3 % hmotnostního, vztaženo na PRP, fosfolipasy D ze Streptomyces chromofuscus a nechá se proběhnout odštěpování lipidů za konstantního míchání při teplotě asi 35 °C po dobu asi 3 hodin. Reakční produkt se 4x extrahuje fenolem, aby se odstranily proteinové nečistoty, včetně přidaného enzymu.

Tak se získá post-fenolový vzorek.

Post-fenolový vzorek se potom rozpustí ve směsi detergentu a chelatačního činidla při bázické hodnotě pH.

K roztoku se přidají perly pryskyřice HP20, která byla předem zpracována stejným pufrem a směs s PRP se několik hodin promíchává v rotační třepačce při teplotě nižší než je teplota místnosti. Perly pryskyřice se potom z roztoku odfiltrují a filtrát se diafiltruje, za účelem odstranění detergentu a chelatačního činidla. Izoluje se retentát, k němuž se přidá chlorid vápenatý. PRP se z roztoku vysráží

95% ethanolem. Sraženina se odstředí a získaná peleta se trituruje s ethanolem a acetonem. Výsledný produkt se vysuší za sníženého tlaku.

Při způsobu za použití perlové hydrofobní pryskyřice se dosáhne nízké úrovně kontaminujícího endotoxinu, aniž by to bylo doprovázeno podstatnou ztrátou PRP. Snížení koncentrace endotoxinu, kterého se při tomto zpracování dosáhne, leží obvykle v rozmezí od 100-násobku do 21 000-násobku, při porovnávání výchozího a konečného prášku, v závislosti na počáteční úrovni znečištění endotoxinem. Výtěžek PRP činí obvykle přinejmenším 75 % a někdy je dokonce vyšší než 90 %, vztaženo na výchozí látku.

Pro stanovení hladiny znečištění endotoxinem se používá zkoušky s lysátera Ameobocytu Limulus (LAL), která je popsána v Guideline on validation of the LAL test as an end-product endotoxin test for human and animal parenteral drugs, biological products, and medical devices”, U.S. Department of Health and Human Services, prosinec 1987.

Při přednostním provedení tohoto vynálezu se PRP, prostý endotoxinu a lipidu, získává tak, že se po zpracování enzymem provede hydrofobní adsorpce LPS na HP20 nebo jiném vhodném porézním styren-divinylbenzenovém kopolymeru nebo podobném hydrofobním mediu, popsaném výše.

Kapsulární polysacharid Gram-negativní bakterie se získá kteroukoliv z četných známých metod, jako jsou metody uvedené v US patentu č. 4 695 624 pro Haemophilus influenzae typu b a aniontové kapsulární polysacharidy z Neisseria meningitidis, (meningokokové) polysacharidy ze skupiny A, B, C, X, Y, W135 a 29E a polysacharidy z Escherichia coli, Kl, K12, K13, K89, K92 a K100. Obzvláštní přednost se však z polysacharidů dává zejména polysacharidům, zvoleným ze souboru zahrnujícího polysacharidy Hib, které jsou například popsány v Rosenberg a další, J. Biol. Chem., 236, strana 2845 až 2849 (1961) a Zamenhof a další, J. Biol. Chem., 203, strana 695 až 704 (1953).

Při jednom provedení tohoto vynálezu se polyribosylribitolfosfát, což je kapsulární polysacharid z Haemophilus influenzae typu b izoluje fermentací tohoto patogenu způsobem popsaným v US patentu č. 4 695 624. Tento patogen se usmrtí přídavkem 1% thimerosalu nebo přídavkem přibližně 0,5% fenolu. Zbytky buněk se odstředí a surový polysacharid se zkoncentruje ultrafiltrací, přičemž se získá produkt, který je dále označován jako surový PRP. Výtěžek volného PRP se může optimalizovat převedením lipo-PRP na PRP, prostý kovalentního lipidu, enzymatickým zpracováním surového PRP výše popsaným způsobem. Může být dokonce výhodné přidávat lipasu přímo do fermentačního media nebo v jakémkoliv jiném dalším stupni.

Tak například se může zpracování enzymem odložit až po částečné purifikaci kterýmkoliv z následujících způsobů zpracování nebo jeho částí nebo po zpracování, které je ekvivalentní dále uvedeným způsobům zpracování:

1) Výroba pre-fenolového prášku, při níž se odstraňují nečistoty, které jsou nerozpustné ve 48% (objemově) ethanolu, dále se přidá ethanol až do obsahu 61 %, aby se získal polysacharid. Tento polysacharid se znovu rozpustí v přibližně 1M roztoku chloridu vápenatého a odstraní se další nečistoty, které jsou nerozpustné ve 23% (objemově) ethanolu, načež se PRP izoluje přidáním ehtanolu až do koncentrace 37 % (objemově) a nakonec se získaný produkt trituruje v absolutním ethanolu;

2) Výroba post-fenolového prášku, která se provádí tak, že se pre-fenolový prášek rozpustí v 0,448M pufru na bázi octanu sodného a vzniklý roztok se asi 4x extrahuje 72% fenolem, jehož hodnota pH je tlumena na 6,9 0,648M octanem sodným, načež se provede diafiltrace pro odstranění fenolu z vodné fáze a přídavkem chloridu vápenatého až do asi 0,05M koncentrace a přídavkem ethanolu až do koncentrace asi % se izoluje PRP ve formě sraženiny, která se dále znovu rozpustí v 0,05M roztoku chloridu vápenatého. Odstraní se nečistoty, které jsou nerozpustné ve 20% ethanolu a vzniklý post-fenolový PRP se izoluje ve formě pelety, která je nerozpustná v 37% ethanolu a nakonec se výsledný produkt trituruje v absolutním ethanolu.

3) Výroba PRP z nízké frakce pomocí zpracování fosfolipasou, po kterém se výše uvedeným způsobem odstraní protein a endotoxin.

4) Výroba PRP, prostého endotoxinu, jakýmkoliv vhodným způsobem, přednostně zpracováním pomocí pryskyřice HP20, popsaným výše a v US patentech č. 5 019 502, 5 039 610 a v patentové přihlášce USA č. 595 722.

Polysacharid, vyrobený způsobem podle tohoto vynálezu, je běžnými analytickými metodami chemický nerozlišitelný od polysacharidu, který se získá odstraněním endotoxinu a kapsulárního polysacharidu s obsahem lipidu selektivní frakcionaci za použití alkoholu. V tabulce I jsou fyzikálně-chemické vlastnosti PRP, získaného zpracováním pomocí PLD, porovnány s vlastnostmi PRP, získaného selektivní frakcionaci za použití alkoholu.

Tabulka I

	PRP, zpracovaný pomocí PLD	PRP, z frakcionace pomocí alkoholu
obsah FA (% hm.) podle plynové chromatografie	< 0,012	< 0,012
KD	0,5	0,5
endotoxin (EU/gg)	0,01	0,6

Byla provedena pečlivá studie za účelem optimalizace všech stupňů výrobního postupu PRP. Na základě těchto studií se dospělo k výrobnímu schématu, které je znázorněno na obr. 3.

A. Optimalizace reakčních podmínek při reakci s enzymem

Byla provedena serie pokusů s cílem mapovat citlivost aktivity enzymu při odstraňování lipidů z práškovité nízké frakce, v závislosti na obsahu methylterc.butyletheru, Tritonu, teplotě, koncentraci substrátu, množství enzymu a reakční době, za účelem definice vhodného rozmezí pracovních podmínek. Ve všech případech odpovídají doporučené podmínky maximální úrovni snížení obsahu mastných kyselin nebo se této úrovni blíží.

B. Optimalizace zpracování pomocí pryskyřice HP20

Byly provedeny studie s cílem zabezpečit lepší regulaci hodnoty pH v průběhu stupně odstraňování LPS pomocí

HP20, za účelem minimalizace potenciální hydrolýzy hlavního řetězce PRP. Tyto studie zahrnovaly předběžnou ekvilibraci pryskyřice dvěma objemy roztoku DOC/citrát sodný, sledování pH v průběhu kontaktování s čerstvým roztokem pufru, jakož i použití Tris-pufrovaného roztoku DOC/citrát sodný a kontinuální sledování hodnoty pH. Bez předběžné ekvilibrace nebo tlumení roztoku DOC/citrát sodný se hodnota pH v průběhu tříhodinové diskontinuální adsorpce posunula až na 9,2 až 9,5. V případě použití předběžné ekvilibrace byl posun pH omezen hodnotou 8,8. V případě použití předběžné ekvilibrace pryskyřice a také pufrování roztoku 25mM Tris-pufrem o pH 8,0, byl posun hodnoty pH ještě dále minimalizován a bylo možno v průběhu diskontinuální adsorpce udržovat dobře regulovanou hodnotu pH pod 8,5. Také byly zkoumány jiné podmínky zpracování PRP pryskyřicí KP20. Analýza mastných kyselin plynovou chromatografií, jakož i data LAL ukazují, že optimálního odstranění endotoxinu bylo dosaženo při koncentraci 5 až 10 mg PRP/ml, místo dříve používané koncentrace 2,5 mg PRP/ml. Výsledky také ukázaly, že nej lepší složení roztoku odpovídá koncentraci DOC 0,5 %, citrátu 3 % a Tris-pufru o pH 8,0 50 mmol/1. V důsledku toho byla všechna následující zpracování pomocí HP20 prováděna za použití pryskyřice předběžně ekvilibrované v 50mM

Tris-pufru, 0,5% DOC, 3% citrátu, při pH roztoku 8,0 a koncentraci PRP 5 až 10 mg/ml.

C. Vyhodnocení diafiltračního stupně

Po zpracování pomocí pryskyřice HP20 je PRP produkt obsažen v roztoku, který obsahuje Tris-pufr, DOC a citran sodný a je zapotřebí provést výměnu produktu diafiltrací do čistého vodného roztoku. Při diafiltraci roztoku PRP, zpracovaného HP20 byly zkoušeny dvě jednotky Pellicon, jedna s membránou z regenerované celulózy a druhá s polysulfonovou membránou, spolu s diafiltrační patronou s polysulfonovými dutými vlákny. Membrána z regenerované celulózy vykázala větší rychlost odpuzování DOC, ve srovnání s oběma polysulfonovými membránami. Polysulfonová membrána Pellicon však vykazovala podstatně vyšší tok. Data, vztahující se k nucenému toku a odpuzování DOC naznačují, že by bylo účinnější používat jednotku Prostack místo v současné době používané technologie s membránou tvořenou dutými vlákny. Na základě porovnání plochy membrány, doby postupu a cenových nákladů byl učiněn závěr, že nej lepší výkonnost by poskytla jednotka Prostack s polysulfonovou membránou.

Výše uvedené studie intenzivního produkčního postupu pro získávání PRP vedly k vyvinutí optimalizovaného postupu zahrnujícího reakci s enzymem, 4-násobnou extrakci fenolem, zpracování pryskyřicí HP20, diafiltraci a srážení alkoholem, přičemž každý z těchto stupňů byl analyzován, za účelem nalezení vhodného rozmezí pracovních podmínek. Tento intenzivní postup je sumarizován na obr. 3.

Polysacharid vyrobený tímto způsobem je užitečný při výrobě očkovacích látek obsahujících volný nebo konjugovaný bakteriální kapsulární polysacharid. Konjugované polysacharidy, zejména konjugáty PRP/OMPC jsou vhodné pro malé děti, za účelem zabránění vzniku choroby, narozdíl od volného PRP, který nemusí vyvolat dostatečnou imunitní odpověď. Výroba konjugátu z polysacharidu, získaného způsobem podle tohoto vynálezu, se může provádět způsobem uvedeným v popisu a příkladech US patentu č. 4 695 624. Uvedená citace představuje náhradu za přenesení celého jejího obsahu do popisu tohoto vynálezu.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezuj í.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

Výroba kapsulárního polysacharidu z bakterie Haemophilus influenzae typu b

Fermentace

Stupeň A: Tvorba inokula a očkovací kultury

Obsah trubičky s lyofilizovanou bakterií Haemophilus influenzae typu b (kultivace: Ross 768, vzorek získán od university State University of New York) se suspenduje v 1 ml sterilního media pro inokulum Haemophilus (viz dále) a vzniklá suspenze se rozdělí na 19 misek s čokoládovým agarem (BBL). Po 20 hodinách inkubace při 37 °C ve svíčkové nádobě se nárůst na každé misce resuspenduje v 1 až 2 ml media pro inokulum Haemophilus a suspenze se spojí.

Složení media pro	inokulum Haemophilus (g/1)
sojový pepton	10
NaCl	5
NaH2PO4	3,1
Na2HPO4	13,7
k2hpo4	2,5
destilovaná voda	do celkového objemu

* Hodnota pH roztoku se nastaví na cílovou hodnotu 7,2 ± 0,1 (typická hodnota pH je 7,23) a roztok se sterilizuje 25 minutovým zahříváním v autoklávu na teplotu 121 °c

Stupeň B: Dvoulitrové Erlenmeyerovy baňky bez přepážek

Vždy jedné třetiny resuspendovaných bakterií ze stupně A (výše) se použije pro inokulaci jedné z celkem tří dvoulitrových baněk, z nichž každá obsahuje přibližně 1,0 1 úplného očkovacího a produkčního media Haemophilus (viz dále). Baňky se inkubují přibližně 5 hodin při 37 °C v rotační třepačce při frekvenci otáčení 200 min^-1. Na konci této inkubace se dosáhne obvykle hodnoty optické hustoty

Složení úplného očkovacího a	produkčního media Haemophilus
NaH2PO4	3,1 g/1
Na2HPO4	13,7 g/1
sojový pepton	10,0 g/1
diafiltrát kvasinkového
extraktu (1)	10,0 ml/1
k2hpo4	2,5 g/1
NaCl	5,0 g/1
glukóza (2)	5,0 g/1
nikotinamidadenindinukleotid
(NAD) (3)	2,0 mg/1
Hemin (4)	5,0 mg/1

Soli a sojový pepton se rozpustí v malých objemech horké, apyrogenní vody a každý roztok se upraví na konečný objem přídavkem další horké apyrogenní vody. Potom se sterilizují fermentory nebo baňky (asi 25 minut při 121 °C). Fermentory nebo baňky se ochladí a potom se do nich před inokulaci uvede diafiltrát kvasinkového extraktu (1), glukóza (2), NAD (3) a Hemin (4).

(1) Diafiltrát kvasinkového extraktu

100 g extraktu z pivních kvasnic (Amber) se rozpustí vil destilované vody a roztok se ultrafiltruje přes dutá vlákna Amicon DC-30 za použití patron H10X50 (vylučovací mez molekulové hmotnosti je 50000 Dalton). Filtrát se zachytí a nechá projít membránou 0,22 μπι, ve formě sterilního produktu.

(2) Glukóza se připraví ve formě sterilního 25% roztoku ve vodě, destilované ve skleněné aparatuře.

(3) Zásobní roztok NAD o koncentraci 20 mg/ml se sterilizuje filtrací přes filtr Millipore (s póry o velikosti 0,22 μηι) a přidá za aseptických podmínek těsně před inokulací.

(4) Zásobní roztok Heminu 3X se připraví rozpuštěním 200 mg této látky v 10 ml 0,lM roztoku hydroxidu sodného, přičemž objem vzniklého roztoku se upraví destilovanou sterilní vodou na 100 ml. Vzniklý roztok se 20 minut sterilizuje při 121 °C a potom se za aseptických podmínek přidá před inokulací k výslednému mediu.

Stupeň C: 70-litrový očkovací fermentor

Tří litrů produktu ze stupně B se použije pro inokulací 70-litrového fermentoru obsahujícího 41,4 1 úplného očkovacího a produkčního media Haemophilus (vyrobeného výše popsaným způsobem) a 17 ml protipěnového prostředku UCON B625. Počáteční hodnota pH je 7,4.

Fermentační směs se udržuje na teplotě 37 °C za míchání s frekvencí otáčení 100 min^-1 a sleduje se optická hustota (OD) a hodnota pH, dokud se nedosáhne typické hodnoty OD 0,39 (za asi 5,5 hodiny).

Stupeň D: 800-litrový produkční fermentor

Přibližně 40 1 produktu ze stupně C se použije pro inokulaci 800-litrového fermentoru obsahujícího 570 1 produkčního media (vyrobeného výše popsaným způsobem), upraveného na potřebný objem a 72 ml protipěnového prostředku UCON LB625.

Fermentační směs se udržuje při 37 °C za míchání s frekvencí otáčení 100 min^-1, přičemž hodnota OD a pH se zkouší přibližně každé 2 hodiny. Když se tyto hodnoty v průběhu 2 hodinové periody příliš nezmění, fermentace se zakončí (typická hodnota výsledné OD je 0,54 po 12 hodinách).

Sklizeň a inaktivace

Přibližně 600 1 výsledné směsi se inaktivuje a sklidí v zabíjecí nádrži” obsahující 12 1 1% roztoku thimerosalu.

Čiření

Po asi 8 hodinách inaktivace při 4 °C se várka odstředí v 102 mm miskových centrifugách Sharples, přičemž se udržuje takový průtok, aby se produkt udržoval čirý (průtok se mění v rozmezí od 1,3 do 3,0 1 x min^-1. Supernatant získaný při centrifugací (15000 min^-1) se použije pro izolaci produktu.

Izolace a koncentrace ultrafiltrací

Supematanty ze 2 produkčních fermentací se spojí a zkoncentrují při 2 až 8 °C v ultrafiltrační jednotce Romicon za použití 10 patron s dutými vlákny (vylučovací mez molekulové hmotnosti 50000 Dalton, plocha membrány 25,6 m²) tak, aby se přibližně po 4,5 hodiny 1200 1 zkoncentrovalo na 32,5 1. Filtrát se zlikviduje.

Srážení 48% a 61% ethanolem

K 32,5 1 retentátu z ultrafiltrační jednotky Romicon se v průběhu jedné hodiny za míchání při 4 °C přikape 30 1 95% ethanolu, přičemž konečná objemová koncentrace ethanolu je 48 %. Směs se další 2 hodiny míchá při 4 °C, aby se zajistilo úplné vysrážení a supernatant se oddělí v jediné 102 mm centrifuze Sharples, která pracuje s frekvencí otáčení 15000 min“¹. Průtok je 0,27 1 x min”¹. Nerozpustná peleta se zlikviduje a k vyčeřené tekutině se v průběhu jedné hodiny přidá 20,8 1 95% ethanolu, čímž se koncentrace ethanolu upraví na 61 %. Směs se potom ještě 3 další hodiny míchá, aby se zaručilo úplné vysrážení.

Získání druhé pelety

Vzniklá sraženina, která je rozpustná ve 48% ethanolu, ale nerozpustná v 61% ethanolu se oddělí centrifugaci ve 102 mm centrifuze Sharples pracující při frekvenci otáčení 15000 min^-1 (průtok 0,62 1 x min^-1) a 61% ethanolový supernatant se zlikviduje. Výtěžek surového produktu, který tvoří vlhkou pastu, je 0,377 kg. Tento produkt se označuje názvem surový PRP.

Extrakce chloridem vápenatým

377 g látky, která je nerozpustná v 61% ethanolu se v Daymaxově dispergační nádobě smíchá při teplotě 2 až 8 °C se 6,5 1 chladně vody, předestilované ve skleněné aparatuře. Ke vzniklé směsi se přidá 6,5 1 chladného 2M roztoku chloridu vápenatého ve vodě a směs (v níž je konečná koncentrace chloridu vápenatého 1,0 mol/1) se extrahuje při 4 °C po dobu 15 minut. Nádoba se potom propláchne 2 1 1M vodného roztoku chloridu vápenatého, čímž se konečný objem upraví na 15 1.

Srážení 23% ethanolem

Koncentrace ethanolu v 15 1 extraktu chloridu vápenatého z předchozího stupně se přikapáváním 95% ethanolu (celkem 4,48 1) za míchání, při 4 °C, v průběhu 30 minut upraví na 23 %. Po dalším 17 hodinovém míchání se směs odstředíuje po dobu 6,5 hodiny při 4 °C pomocí ultracentrifugy K2, pracující při frekvenci otáčení

25000 min^-1 (průtok 165 ml x min”¹). Supernatant se dekantuje přes gázovinu, aby se odstranila lipidovitá látka, která se v něm vznáší a nerozpustná peleta se zahodí.

Srážení 37% ethanolem a izolace surového pastovitého produktu

Koncentrace ethanolu v supernatantu, tvořeném roztokem ve 23% ethanolu, se přídavkem 4,33 1 95% ethanolu upraví na 37 %. Ethanol se přikape za míchání v průběhu 30 minut. Směs se nechá 1 hodinu stát za míchání a potom 14 hodin bez míchání, aby se zajistilo úplné vysrážení.

Výsledná směs se centrifuguje ve 102 mm odstředivce Sharples, pracující při frekvenci otáčení 15000 min”¹ (průtok 0,2 1 x min”¹) a tak se získá peleta surového polysacharidu. Tento produkt je dále označován názvem pre-fenolový prášek.

Triturace

Peleta z centrifugace se převede do mísiče Waring Blender o objemu 15,2 1, který obsahuje 1 1 absolutního alkoholu a obsah mísiče se 30 sekund mísí při nejvyšší rychlosti. V míšení se pokračuje v režimu 30 sekund zapnuto, 30 sekund vypnuto, tak dlouho, dokud se nezíská tvrdý bílý prášek. Tento prášek se oddělí na Buchnerově nálevce s teflonovým filtračním kotoučkem a postupně promyje in šitu dvěma jednolitrovými dávkami absolutního ethanolu a dvěma dvoulitrovými dávkami acetonu. Potom se vzniklá látka suší za vakua při 4 °C po dobu 24 hodin. Získá se 68 g (sušina) produktu.

Extrakce fenolem g suché látky z trituračního stupně se resuspenduje ve 12 1 0,488M octanu sodného o pH 6,9 v Daymaxově dispergační nádobě. Roztok octanu sodného se ihned extrahuje 4,48 1 čerstvého vodného roztoku fenolu, který se připraví přidáním 900 ml 0,488M roztoku octanu sodného o pH 6,9 do 2,27 kg fenolu (krystalický produkt Mallinckrodt) ve 20 1 tlakové nádobě a směs se míchá tak dlouho, dokud se všechny látky nerozpustí. Každý fenolový extrakt se odstřeďuje 2,5 hodiny při frekvenci otáčení 30000 min^-1 a 4 °C v ultracentrifuze K2 (Electonucleonics), aby se rozbila emulze. Vytékající vodný proud se ještě 3x extrahuje stejným způsobem pomocí 2 1 čerstvého vodného roztoku fenolu. Fenolové fáze se zlikvidují.

Diafiltrace

Vodná fáze z výše uvedených extrakcí fenolem (17,6 1) se zředí 300 1 chladné vody předestilované ve skleněné aparatuře a roztok se diafiltruje při 4 °C v ultrafiltračním zařízení Amicon DC-30 za použití tří patron H10P10. Jednotka Amicon se propláchne a proplach se přidá k retentátu, takže konečný objem je 17,5 1. Ultrafiltrát se zahodí.

Srážení 67% ethanolem

K 17,5 1 dialyzátu z přechozího stupně se přidá 0,438 1 2,0M roztoku chloridu vápenatého (konečná koncentrace chloridu vápenatého je 0,05 mol/1) a koncentrace ethanolu ve vzniklé směsi se nastaví na 67 % přikapáváním 95% ethanolu (celkem 35,88 1, v průběhu 1 hodiny) k rychle míchanému roztoku. Po 4 hodinách míchání a 12 hodinách dalšího stání při 4 °C se čirý supernatant přetáhne násoskou a sraženina se při 4 °C odstředí 45 minutovým odstřeďováním v 102mm centrifuze Sharples, která pracuje při frekvenci otáčení 15000 min^-1. Výsledná polysacharidová peleta se trituruje v mísiči Waring Blender o objemu 15,2 1, který obsahuje 2 1 absolutního ethanolu v režimu 30 sekund zapnuto, 30 sekund vypnuto. Produkt se oddělí na Buchnerově nálevce s teflonovým filtračním kotoučkem a postupně promyje in šitu čtyřmi jednolitrovými dávkami absolutního ethanolu a dvěma jednolitrovými dávkami acetonu. Potom se vzniklá látka suší za vakua při 4 °C po dobu 20 hodin na vyvážené misce. Získá se 39 g suchého prášku, který je dále označován názvem post-fenolový prášek.

Příklad 2

Výroba surového PRP z fenolem usmrcených bakterií

Haemophilus influenzae typu b

Stejný fermentační postup, jaký je popsán v příkladu 1, se opakuje, pouze s tím rozdílem, že místo inaktivace pomocí 1% roztoku chimerosalu se patogen usmrtí přídavkem 0,5% roztoku fenolu. Inkubace buněk ve fenolu se provádí po dobu 1 hodiny a potom se buňky převedou do zabíjecí nádrže, kde se udržují nejméně po dobu 1 hodiny. Pre-fenolový prášek se dále vyrábí stejným postupem, jaký je popsán v příkladu 1.

Příklad 3

Výroba nízké frakce a získávání PRP, prostého lipidu z této frakce

Po výrobě post-fenolového prášku způsobem popsaným v příkladu 1 se zbývající endotoxin odstraní selektivní frakcionací alkoholem, za vzniku PRP přípravku, který neobsahuje endotoxin a PRP frakce obsahující endotoxin, která je označována termínem nízká frakce. Přitom se postupuje tak, že se post-fenolový prášek rozpustí v 0,05M roztoku chloridu vápenatého v koncentraci 2,5 g/1, čímž se zajistí dvojmocný protiion jak pro endotoxin, tak pro PRP. Potom se ke vzniklému roztoku přidá alkohol, až do dosažení objemové koncentrace 26 %. Teplota se ekvilibruje na konstantní hodnotu v rozmezí od 2 do 4 °C a alkohol se přidává po dávkách tak dlouho, dokud se PRP nezačne srážet (až do bodu zákalu). Zákal se sleduje na odebíraných vzorcích.

Ethanol (95%) se přidává až do bodu zákalu a potom se přidá ještě dalších 1,9 %. Vzniklá sraženina představuje nízkou frakci. Po přidání alkoholu se roztok ihned odstředí, aby se sražená nízká frakce odstranila. Lipo-PRP, který je obsažen v této frakci se dále zpracovává způsobem podle vynálezu, za účelem získání PRP, prostého lipidu, jak je to podrobně popsáno dále. K supernatantu se přidá další alkohol (až do 38 % objemových). Požadovaná sraženina se oddělí usazováním a/nebo centrifugací a vysuší na konečný prášek. Typický výtěžek post-fenolového prášku v tomto stupni při obsahu alkoholu 1,2 až 2,0 % nad koncentrací odpovídající bodu zákalu, je 25 až 40 %. Zbytek PRP je obsažen v nízké frakci.

Nízká frakce, získaná po provedení selektivního frakcionačního stupně za použití ethanolu, která obsahuje sražený lipopolysacharid a polyribosylribitolfosfát se dále zpracovává tak, že se k roztoku nízké frakce o koncentraci 20 g/1 v 750 ml pufru (lOmM Tris, 5mM CaCl₂, 4,5mM Triton X-100, pH 7,4, ve směsi se stejným objemem směsi methylterc.butylether/ethanol v poměru 9:1) přidá 3000 U fosfolipasy D. Reakce se nechá probíhat po dobu 2,5 hodiny a potom se látka čtyřikrát extrahuje fenolem za použití jednoho dílu fenolu (ve formě 72% roztoku v octanu sodném), vztaženo na 2,6 dílu vodného produktu.

Endotoxin se odstraní z nízké frakce zpracované PLD smícháním s 0,5% deoxycholátem sodným a 3% citrátem sodným o pH 8. Přidá se pryskyřice HP20 v množství 30 g pryskyřice na gram polysacharidů (pryskyřice se před použitím promyje apyrogenní vodou). Volné perly se míchají s roztokem v rotační třepačce po dobu 3 hodin při 4 °C. Po míchání se perly oddělí z roztoku ve filtrační nálevce z nerezové oceli. Získaný filtrát se diafiltruje přes polysulfonovou membránu Pellicon s vylučovací mezí molekulové hmotností

10000 Dalton (povrchová plocha 0,093 m²) proti apyrogenní vodě, přičemž se udržuje odhadnutá koncentrace polysacharidu na hodnotě rovné nebo nižší než 2,5 mg/ml, aby se odstranil detergent a chelatační činidlo. Získá se retentát, k němuž se přidá 2M roztok chloridu vápenatého až do konečné koncentrace 0,05M. Polysacharid se srazí z roztoku nadbytkem 95% ethanolu. Sraženina se odstřeďuje po dobu 30 minut při zrychlení 13000 x g, peleta se trituruje s absolutním ethanolem a acetonem a potom za vakua vysuší. Výsledný prášek se přenese do zásobníku na vzorky a zmrazí při - 70 °C. Látka zpracovaná pryskyřicí vykazuje snížení hladiny endotoxinu, polysacharidu a lipo-PRP [mastných kyselin podle plynové chromatografie (GC)], uvedené v tabulce 2.

Tabulka 2

Hodnota zjištěná při zkoušce LAL (EU^g) počáteční 240 konečný prášek 0,12

Polysacharid (g) počáteční 15 konečný prášek 10,2

Mastné kyseliny (%) počáteční 0,4 konečný prášek 0,009

Při tomto postupu se reprodukovatělně dosahuje výtěžku produktu přibližně 68 %, který je vyjádřen jako hmotnostní poměr finálního produktu a výchozí látky. Získaný produkt nelze na základě fyzikálně-chemických vlastností odlišit od PRP produktu, který se získá selektivní frakcionací za použití alkoholu.

Příklad 4

Delipidace pre-fenoIového PRP prášku

A. Reakce s fosfolipasou D

Pre-fenolový PRP prášek (20 g, připravený podle příkladu 2 nebo příkladu 3) se solubilizuje v 1,33 1 lOmM Tris, 5mM CaCl₂, 4,5mM Tritonu X-100 o pH 7,4. K solubilizovanému PRP se přidá 1,33 1 směsi methylterc.butylether/ethanol v poměru 9:1. Dále se přidá fosfolipasa D (Genencor, celkem 3000 jednotek, specifická aktivita 70 U/mg, 15 U/100 mg PRP). Reakčni směs se míchá při frekvenci otáčení 240 min“¹ po dobu 3 hodin při 35 °C.

Po reakci se organická fáze nechá oddělit od vodné fáze (v průběhu 30 minut při 25 až 35 °C) a spodní vodná fáze se zachytí. Organická fáze se reextrahuje 0,266 1 vody, vodná fáze se nechá 30 minut usazovat a potom se spojí s první vodnou fází, vzniklou při extrakci, takže celkový objem vodné fáze je 1,560 1.

Fenol (1,5 kg) se v temnu rozpustí ekvilibrací s 590 ml 0,468M roztoku octanu sodného (pH 6,9). Vodná fáze se extrahuje celkem 4x za použití jednoho dílu fenolu na 2,6 dílů post-fenolového vzorku, ve formě vodného produktu.

B. Zpracování pomocí pryskyřice HP20

Pryskyřice HP20 (Mitsubishi Kasei, 300 g) se předběžně ekvilibruje v 1300 ml 50mM Tris, 0,5% DOC, 3% citrátu sodném o pH 8,0 (ekvilibrační pufr pro HP20). K 1060 ml post-fenolového vzorku se přidá 1060 ml lOOmM Tris, 1% DOC, 6% citrátu sodného o pH 8,0, čímž se celkový objem upraví na 2120 ml. Vzniklý vzorek se potom 2 hodiny míchá při 4 °C třepáním s preekvilibrovanou pryskyřicí HP20. Pryskyřice se odfiltruje v koloně, která se potom propláchne 200 ml ekvilibračního pufru pro HP20. Veškerý výtok z HP20 se potom zkoncentruje na 1 1 a diafiltruje proti 10 1 chladné apyrogenní vody.

C. Izolace produktu

Kil vzorku se přidá 25 ml 2M roztoku chloridu vápenatého. Sraženina se oddělí 30 minutovou centrifugací při 4 °C a peleta se trituruje s 20 ml 100% ethanolu.

Ethanol se odfiltruje a PRP prášek se vysuší pomocí acetonu. Celkový výtěžek delipidovaného PRP je 9,6 g. Získaný produkt má vlastnosti uvedené v tabulce 3.

Tabulka 3

LAL (EU/^g)

PRP (g) mastné kyseliny (%) počáteční 2400 konečná

0,48

9,6

1,9

0,005

Příklad 5

Výroba PRP, zpracovaného fosfolipasou A₂ a fosfolipasou D, konjugace s OMP z Neisseria meningitidis B a imunogenicita vzniklého konjugátu

A. Enzymatické zpracování

Post-fenolový prášek, zpracovaný pryskyřicí HP20 (hmotnost prášku 3 g) se solubilizuje v 600 ml fosfátového pufru o pH 7,1, s obsahem 0,1 % deoxycholátu a 33 % etheru, na koncentraci PRP 5 mg/ml. K roztoku se přidá fosfolipasa A₂ (z porcinu; 70 U/mg, vztaženo na PRP; specifická aktivita 600 U/mg) a fosfolipasa D (z Streptomyces chromofuscus;

0,2 U/mg, vztaženo na PRP; specifická aktivita 70 U/mg), přičemž v obou případech se jedná o výrobky firmy Boehringer Mannheim, lne. a reakce se nechá za míchání probíhat 3 hodiny při 25 °C. Reakční produkty se extrahují 600 ml hexanu a potom se provede 30 minutové odstředění při 20 °C, Organická fáze se zahodí, zatímco vodná fáze se zkoncentruje na 300 ml a diafiltruje proti 3000 ml vody. Vzorek se zředí na 600 ml a konečnou koncentraci chloridu vápenatého 5 mmol/1 a PRP se srazí přídavkem ethanolu až do dosažení koncentrace 40 %. Získá se 2,6 g PRP pro konjugaci.

B. Derivatizace PRP, zpracovaného kombinací PLA₂ a PLD

Post-HP20 PRP (1,9 g), zpracovaný výše uvedeným způsobem pomocí kombinace PLA₂ a PLD, se solubilizuje v 57 ml sterilní vody. Dihydrát kyseliny štavelové (0,31 g) se rozpustí v 15,5 ml sterilní vody a ke vzniklému roztoku se pomalu přidá solubilizovaný PRP. Hodnota pH se nastaví na 5 pomocí 40% roztoku tetra-n-butylamoniumhydroxidu (5 ml) a potom se ke směsi přidají 2 ml 1% roztoku tetra-n-butylamoniumhydroxidu. Roztokem kyseliny štavelové se provede titrace až do pH 6,98. Vzniklý roztok se přefiltruje a filtr se propláchne, čímž se získá celkový objem přípravku 178 ml PRP-Bu4N.

K tomuto roztoku se přidá 67 ml dimethylformamidu a v rotačním odpařováku se objem směsi sníží na 68 ml. Třikrát se přidá další dimethylformamid (67 ml), přičemž pokaždé se objem směsi upraví na 67 ml. Karbonyldiimidazol (0,22 g) se rozpustí v dimethyIformamidu a vzniklý roztok se pomalu přidá pod atmosférou dusíku k roztoku PRP, načež se směs nechá 35 minut stárnout. 1,4-butandiamindihydrochlorid (BuA₂) (15,96 g) se rozpustí ve 456 ml sterilní vody a pH vzniklého roztoku se přídavkem 5 ml 50% roztoku hydroxidu sodného nastaví na 10,39. Potom se BuA₂ pomalu přidá k PRP-CDZ a směs se udržuje při asi 12 °C.

Po asi 5 minutách se přidá 68% kyselina fosforečná (50 ml) a hodnota pH se přikapáním 5 ml 68% kyseliny fosforečné nastaví na 7,02. Celkový objem směsi v tomto okamžiku je 530 ml.

Vzorek se zkoncentruje na 95 ml v ultrafiltračním systému Amicon, jehož vylučovací mez molekulové hmotnosti je 10000 Dalton. Vzorek se potom diafiltruje proti 1520 ml fosfátového pufru o pH 7. Ultrafiltrační systém se promyje 3x 25ml alikvotními díly fosfátového pufru a promývací kapaliny se spojí s PRP-BuA₂ retentátem, přičemž se dosáhne celkového objemu 102 ml. Potom se k PRP-BuA₂ přidá boritan sodný (roztok o koncentraci 3,95 %, 31,8 ml).

Hodnota pH se přídavkem 2 ml 2,5N roztoku hydroxidu sodného nastaví na 9,2. Potom se přidá bromacetylchlorid (1,71 ml). Jeho přidávání se děje pomalu a hodnota pH se přitom udržuje na 9,2 pomocí 2,5N roztoku hydroxidu sodného. Potom se pH směsi nastaví 68% kyselinou fosforečnou na 7,0 (0,5 ml). Přípravek na bázi PRP-BuA₂-BrAc se zkoncentruje na ml v ultrafiltračním systému Amicon, načež se provede diafiltrace proti 1520 ml fosfátového pufru o pH 7, přičemž objem směsi se diafiltrací nastaví na 38 ml. Systém se promyje fosfátovým pufrem a promývací kapaliny se spojí s hlavním produktem. Získá se 79,5 ml přípravku na bázi

PRP-BuA₂~BrAc.

C. Příprava OMPC-SH

OMPC z Neisseria meningitidis typu b (1,16 g) se solubilizuje ve 116 ml sterilní vody a roztok se diafiltruje proti 600 ml borátového pufru. Tak se získá směs o celkovém objemu 159 ml. Kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA) (0,8 g) a dithiothreitol (DTT) (0,12 g) se rozpustí ve sterilním borátovém pufru a vzniklý roztok se přidá k solubilizovanému proteinu. N-acetylhomocysteinthiolakton (1,03 g) se rozpustí ve sterilní vodě a vzniklý roztok se přidá ke směsi proteinu, EDTA a DTT, načež se vzniklá směs nechá 22 hodin reagovat.

á

Roztok thiolovaného proteinu se potom zkoncentruje na 116 ml a diafiltruje proti 1440 ml fosfátového pufru o pH 8. Potom se vzorek zkoncentruje na výsledný objem 127 ml.

Stanovení proteinu v tomto okamžiku ukazuje, že výsledný vzorek obsahuje 6,75 mg/ml proteinu. Ellmanovým stanovením se zjistí, že na 1 mg proteinu je vázáno 0,3 pmol skupin SH. i

D. Konjugace derivatizovaného PRP a OMPC-SH

Hodnota pH roztoku PRP-BuA₂~BrAc se nastaví 2,5N roztokem hydroxidu sodného na 7,9. K 72 ml vzorku PRP-BuA₂~BrAc s upravenou hodnotou pH se přidá všechen thiolovaný OMPC, připravený podle odstavce B a pod atmosférou dusíku se nechá 19 hodin probíhat konjugace.

Konjugát se zkoncentruje na 170 ml a potom následuje diafiltrace proti 1700 ml fosfátového pufru o pH 7 a další diafiltrace proti 1640 ml fosfátového pufru o pH 8. Výsledný objem konjugátového přípravku je 231 ml.

Nezreagované bromacetylenové skupiny konjugátu se blokují přídavkem N-acetylcysteaminu (0,95 g v fosfátovém pufru o pH 8) a reakce se nechá probíhat po dobu 18 hodin. Blokovaný konjugátový přípravek se zkoncentruje na 170 ml a diafiltruje proti 2550 ml pufru TED. Konjugát se nechá stárnout přes noc a potom se diafiltruje proti druhé 2550ml dávce pufru TED. Konečný objem vzorku je 285 ml.

V paralelním experimentu se nechá 2,31 g PRP, získaného selektivní frakcionací za použití alkoholu, konjugovat výše popsaným způsobem, za vzniku 330 ml konjugátového přípravku. Při paralelně prováděných analýzách fyzikálně-chemických vlastností obou konjugátů se mezi nimi nezjistí žádné rozdíly. Provádí se analýza chromatografií SEC (size exclusion chromatography), analýza pyroge, analýza na PRP/protein a zjišťování imunogenicity.

E. Imunogenicita konjugátu u mláďat opice Rhesus

Podle stanovení, prováděném na mláďatech opice Rhesus způsoby, které popsali Vella a Ellis [Pediatrie Res. 29, 10 (1981)] a Vella a další [Pediatrics Supplement, 85, 668 (1990)] je konjugátová očkovací látka, obsahující enzymaticky zpracovaný PRP, prostý lipidu, plně imunogenní. Konjugát, prostý lipidu, vykazuje srovnatelnou imunogenicitu s kontrolními vzorky, které byly vyrobeny za použití PRP, získaného selektivní frakcionací za použití alkoholu, po 42 dnech a to jak v případě použití vodných přípravků (15 p.g), tak v případě použití přípravků s hydroxidem hlinitém (1 μg) (viz tabulky 4 a 5). Jak je zřejmé z tabulky 5, dosáhne se za použití vodné očkovací látky, na bázi produktu zpracovaného enzymem a neobsahujícího lipid, geometrického středního titru (GMT) u tří zvířat 10,9 pg/ml.

Tabulka 4

Imunogenicita Hib konjugátů, prostých lipidů, u mláďat opice Rhesus za použití kapalného přípravku adsorbovaného na hydroxidu hlinitém

Hib konjugát	Dávka (μα)	Anti-PRP (pg/ml) (GMT)
den 0 28	42
PRP, prostý lipidů, získaný zpracováním enzymem	1	< 0,1 27,4(3/3)	79,1(3/3)
PRP ze selektivní frakcionace za použití alkoholu	1	< 0,1 10,9(3/3)	74,0(3/3)

Tabulka 5

Imunogenicita Hib konjuqátu, prostých lipidů a konjugátů zpracovaných HP20 u mláďat opice Rhesus

Vodný přípravek

Hib konjugát	Dávka lig	Anti-PRP, ^g/ml) (GMT)
den 0 28	42
PRP, prostý lipidů, získaný zpracováním enzymem	15	<0,1 0,4(0/3)	10,9(3/3)
PRP ze selektivní frakcionace za použití alkoholu	15	<0,1 0,9(1/3)	6,5(2/3)

( ) Počet respondentů, u kterých se dosáhne hladiny > 1,0 μg/ml anti-PRP (RIA)

Příklad 6

Získávání PRP, prostého lipidu, z nízké frakce

Nízká frakce (15 g) se solubilizuje v 750 ml pufru (lOmM Tris, 5mM CaCl₂, 4,5mM Triton X-100, pH 7,4).

K roztoku se přidá fosfolipasa D (20 U Toyo Joso/100 mg PRP, 3000 U při specifické aktivitě 70 U/mg). Potom se přidá směs methylterc.butyletheru a ethanolu (v poměru 9:1, 750 ml) a směs se míchá při frekvenci otáčení 240 min^-*. Reakce se nechá probíhat po dobu 2,5 hodiny při 35 °C. Přidá se dalších 2964 jednotek PLD, a reakční směs se nechá rozdělit na dvě fáze (20 minut při teplotě místnosti). Vodná fáze obsahující PRP se použije na další zpracování. Organická fáze se extrahuje 150 ml vody a 156 ml oddělené spodní fáze se smíchá s první vodnou fází.

950 ml vodného přípravku obsahujícího PRP se extrahuje 4x fenolem ekvilibrováným s octanem sodným při poměru fenol:voda 1:2,6.

Na fenolem extrahovaný PRP se potom působí po dobu 2 hodin při teplotě místnosti 450 g pryskyřice HP20, která byla předem ekvilibrována s pufrovanou směsí citrát/DOC (0,5% DOC, 3% citran sodný, 5mM Tris, pH 8,0). Perly pryskyřice se odfiltrují a vodné fáze se použije při dalším postupu. S hlavním podílem vodné fáze se smíchá 292 ml pufru použitého k promývání perel pryskyřice a spojená vodná fáze se diafiltruje za použití membrány Pellicon s vylučovací mezí molekulové hmotnosti 10000 Dalton a povrchovou plochou 0,093 m². Potom se PRP přípravek zkoncentruje na 1 1 a PRP se vysráží přídavkem ethanolu, který se přidá až do koncentrace 40 %. Sraženina se oddělí centrifugací, trituruje s 95% ethanolem a vysuší acetonem.

PRP, který se získá postupem popsaným v tomto příkladu, je ve všech zkoušených parametrech srovnatelný s PRP, získaným selektivní frakcionaci pomocí ethanolu.

Příklad 7

Inaktivace bakterie Haemophilus influenzae typu b fenolem

Kultura bakterií H. influenzae, obsahující přibližně 10⁹ mikroorganismů v l ml, se inaktivuje na konci fermentačního cyklu přídavkem fenolu k fermentační kultuře, v množství přibližně 5 g/1 (konečná koncentrace). Po prověření koncentrace fenolu se kultura převede do míchané žabíječí nádrže, kde se exponuje účinkům fenolu minimálně po dobu 1 hodiny při 37 °C. Přestože laboratorní pokusy, popsané dále, ukazují, že inaktivace kultury o 8 desetinných řádů se dosáhne, za použití 0,5 % fenolu v průběhu 7 minut, v produkčním měřítku se doba inaktivace prodlouží na 1 hodinu, aby se dosáhlo vyšší úrovně bezpečnosti.

Studie inaktivace kultury v laboratorním měřítku

Kultura H. influenzae se kultivuje při 37 °C ve třepaném inkubátoru, až do dosažení stacionární fáze. Alikvotní vzorky výsledné kultury, obsahující přibližně 10⁹ buněk v 1 ml se exponují fenolu při koncentraci fenolu 2, 3, 4, 5 a 6 g/1. Koncentrace fenolu 2 a 3 g/1 má malý vliv na inaktivaci kultury v průběhu 10 minutové expozice. Při koncentraci fenolu 4 a 5 g/1 se však dosáhne významného stupně inaktivace. Za použití fenolu v koncentraci 5 g/1 se po 7 minutách nezjistí žádné živé buňky při zkoušce na miskách, přičemž mez citlivosti při měření inaktivace fenolem je přibližné 10 CFU/ml. Kinetika inaktivace jak při koncentraci fenolu 4 g/1, tak při koncentraci fenolu 5 g/1 je dvoufázová. Při koncentraci fenolu 6 g/1 je inaktivace tak rychlá, že po 30 sekundách expozice fenolu nelze zjistit žádné živé buňky.

Studie inaktivace kultury v produkčním měřítku

K produktu v reaktoru obsahujícímu přibližně 10⁹ mikroorganismů v 1 ml se přidá fenol až do koncentrace 5 g/1 a stanoví se závislost hodnoty CFU/ml na expoziční době.

Díky mechanice odběru a zpracování vzorků bylo možno provádět pouze dvě samostatná měření za minutu. V reaktoru, který vyžadoval dobu 6 minut míchání pro úplné rozdělení fenolu bylo pozorováno snížení počtu živých buněk o 7 řádů v průběhu prvních 3 minut. Po 5 minutách nelze zjistit žádné živé buňky při stanovení na miskách, přičemž mez citlivosti při měření inaktivace fenolem je přibližně 10 CFU/ml.

Příklad 8

Odstraňování fosfolipasy D

Intenzivní způsob výroby PRP se upraví tak, aby bylo možno účinně odstranit PLD z výsledného PRP prášku. Množství residuálního enzymu, který zůstává v PRP, se odhadne několika metodami, které jsou popsány dále. Tyto metody zahrnují přímé stanovení PLD a přímé stanovení aktivity enzymu ve finálních PRP přípravcích, analýzu na PLD ve vzorcích odebraných v průběhu postupu a studie izolace PLD za použití značení, prováděné v každém stupni tohoto postupu. Kromě toho byly učiněny pokusy vypěstovat protilátky proti PLD za použití imunologických stanovení. Všechny tyto metody jsou popsány dále.

Přímé stanovení PLD ve výsledném PRP prášku

Přímé stanovení PLD ve výsledném PRP prášku pomocí SDS-PAGE, za použití barvení pomocí Coomassie (PLD přípravek se stříbrem dobře nebarví) ukazuje, že residuální hladina PLD je nižší než mez stanovení (< 250 ng PLD/dráha). Při zvýšeném přídavku ke gelu odpovídá residuální hladina PLD hodnotě < 5 ng/mg PRP, tj. < 0,0005 %. Tato hranice detekce odpovídá množství < 1 ng/dávka.

Výsledný PRP prášek se také zkouší na residuální enzymatickou aktivitu PLD, přičemž se nezjistí žádná aktivita. Hranice detekce při enzymatickém stanovení je ng PLD/ml (6 x 10~^ U PLD/ml), což odpovídá < 64 pg účinné PLD/mg PRP. Přídavné studie ukazují, že při expozici PLD fenolu dochází k inaktivaci enzymu.

Přímá analýza na PLD ve vzorcích odebraných v průběhu postupu

Vzorky odebrané v průběhu výrobního postupu se zkoušejí přímo na residuální PLD na SDS-PAGE za použití barvení Coomassie. Hladina PLD v PRP po první extrakci fenolem je nižší než je hranice detekce, což odpovídá hladině PLD < 5 ng PLD/mg PRP. Toto přímé měření ukazuje, že při první extrakci fenolem se sníží hladina PLD o téměř 3 řády (z přibližně 2,4 μg PLD/mg PRP v reakční směsi na méně než 5 ng PLD/mg PRP v extraktu z první extrakce fenolem).

V průběhu dalšího zpracování třemi přídavnými extrakcemi fenolem, zpracování pryskyřicí HP20 a srážení alkoholem se dosáhne dalšího vyčištění od PLD, přestože hladina PLD je v těchto případech příliš nízká, než aby ji bylo možno přímo stanovit.

Analýza na PLD za použití značení a izolační studie

Vzhledem k tomu, že residuální hladina PLD ve vzorcích odebraných v průběhu postupu je příliš nízká, než aby bylo možno provést přímé měření, byla v laboratorním měřítku provedena rozsáhlá serie studií získávání PLD za použití značení, aby bylo možno odhadnout množství PLD, které by bylo možno odstranit v izolačním stupni. Jako účinné pro odstraňování enzymu se ukázaly tři různé izolační stupně.

Předně byla studována účinnost extrakcí fenolem při odstraňování PLD. Koncentrovaný roztok PLD o koncentraci 8 mg/ml ve vzorku s obsahem 20 mg PRP/ml se podrobí čtyřem ektrakcím fenolem a obsah PLD v každé vodné vrstvě se sleduje pomocí SDS-PAGE. Po jediné extrakci fenolem je hladina PLD pod mezí detekce (250 ng PLD na dráhu při SDS-PAGE, za použití barvení Coomassie, což odpovídá 800-násobnému snížení, tedy snížení téměř o 3 desetinné řády. Při dalším experimentu se dávka PLD fluorescentně označí pomocí fluorescein-5-isothiokyanátu (FITC). Za použití PLD, značeného FITC se měří rozdělovači koeficient enzymu v závislosti na jeho koncentraci ve fenolu, pomocí fluorescenční spektroskopie. Tato metoda zajišťuje dosažení desetinásobného zvýšení citlivosti při stanovení hladiny PLD. Tato metoda znovu potvrdila, že je jediná extrakce fenolem účinná pro snížení hladiny enzymu o alespoň 2 desetinné řády.

Pro stanovení účinku zpracování pryskyřicí HP20 na odstranění PLD se změří adsorpční isotherma PLD ve vzorku o koncentraci 5 mg PRP/ml na pryskyřici HP20. Strmý sklon naměřené isothermy ukazuje, že má pryskyřice silnou afinitu pro PLD, což za specifických podmínek zpracování pomocí HP20 představuje snížení koncentrace PLD, přinejmenším o 2 desetinné řády. Obsah residuálního enzymu v tomto stupni, který následuje po 4 extrakcích fenolem by byl již tak velmi malý, ale zjištěná data ukazují, že jakýkoliv residuální enzym by byl při selektivní adsorpci na pryskyřici HP20 dále eliminován.

Konečně, při značených pokusech v malém měřítku zůstalo 90 % enzymu v supernatantu po srážení alkoholem. Tento závěrečný stupeň tedy představuje potenciál pro další desetinásobné vyčištění produktu od PLD.

Tyto studie ukazují, že většina enzymu (> 99,99 %) se odstraní 4 extrakcemi fenolem. Jelikož rozdělovači koeficient enzymu mezi vodnou a fenolovou fází za přítomnosti PRP je, podle provedeného stanovení, 10², mohlo by se 4 extrakcemi fenolem teoreticky dosáhnout ΙΟθ-násobného vyčištění. Pro opatrnost se však tomuto stupni připisuje schopnost 10³-násobného vyčištění. Na základě měření s adsorpční isothermou je možno odhadnout, že při adsorpci na HP20 dochází k 10²-násobnému vyčištění. Frakcionačnímu stupni za použití alkoholu se připisuje schopnost 10-násobného snížení koncentrace PLD. Celkem vzato, dochází, při konzervativním odhadu v průběhu intenzivního způsobu výroby PRP k 10⁶-násobnému snížení koncentrace PLD, přičemž skutečná míra čištění může teoreticky odpovídat až lO^-násobku.

V tabulce, která je uvedena dále, jsou shrnuty výsledky těchto studií čištění. V posledním odstavci je uveden výsledek výpočtu obsahu zbývající PLD v dávce při každé metodě stanovení. Je třeba si všimnout, že všechny výpočty jsou založeny na předpokladu, že do konjugační reakce vstupuje 300 μg PRP a získá se 15μg dávka. Tím je zajištěn konzervativní přístup při odhadu residuálního množství enzymu v dávce.

Metoda stanovení	Vyčištění od enzymu (počet řádů)	Obsah PLD v dávce očkovací látky (ng)
bez vyčištění od PLD	0	103
LOD* při přímém měření	3	< 1
odhadnuté vyčištění
(konservativní odhad)	6	< 10”3
vypočtené theoretické
vyčištění	11	< 108

hranice detekce

Příklad 9

Srovnávací analýza intenzivního způsobu výroby PRP a frakcionačního způsobu výroby PRP za použití alkoholu

Všechny várky PRP, vyrobené intenzivním způsobem výroby se podrobí extenzivnímu analytickému zkoušení, za účelem zjištění jejich chemické a fyzikální srovnatelnosti s PRP přípravky, vyrobenými selektivním frakcionačním postupem za použití alkoholu. Výsledky těchto analýz jsou popsány dále.

A. Analýza NMR

Analýza H⁺NMR tří konsistentních várek PRP, vyrobených intenzivním způsobem výroby PRP a jedné reprezentativní várky, vyrobené selektivním frakcionačním postupem za použití alkoholu, ukázala, že tyto vzorky jsou v podstatě totožné. Spektra těchto vzorků jsou identická v oblasti od 5H = 3,72 až 5,2.

B. Analýza složení uhlohydrátu

Integrita PRP vzorků, pokud se týče jejich složení, se odhadne stanovením totožnosti a relativních množství sacharidových složek v PRP přípravcích. Stanovení se provádí kyselou hydrolýzou PRP vzorků a následujícím kvantitativním stanovením uhlohydrátových složek (ribitolu a ribosy) chromatografií na anexové pryskyřici s vysokou hodnotou pH za použití pulsní amperometrické detekce. Analýze se podrobí tři várky, získané intenzivním způsobem výroby PRP a dvě reprezentativní várky PRP, získané selektivní frakcionaci za použití alkoholu. Srovnávací analýza těchto vzorků, založená na poměru píkových oblastí ribitolu a ribosy, ukazuje, že všech pět várek je v podstatě identických. Kromě toho, i píky stopových složek jsou u všech pěti přípravků srovnatelné. Hladina těchto složek je nižší než 1 % molární, vztaženo na ribitol nebo ribosu.

C. Analýza mastných kyselin

Provede se srovnávací analýza mastných kyselin v případě produktů získaných jednak selektivní frakcionací za použití alkoholu a jednak intenzivním způsobem výroby PRP podle tohoto vynálezu. Vzorky PRP, získané prvním z uvedených postupů, obsahují měnící se malá množství mastných kyselin, zatímco vzorky PRP z intenzivního způsobu podle vynálezu obsahují < 0,002 % hmotnostního mastných kyselin, podle analýzy methylesterů těchto mastných kyselin kapilární plynovou chromatografií.

D. Analýza velikosti molekul

Analýza na Sepharose 4B

Velikost molekuly u PRP přípravku se v současné době stanovuje chromatograficky na sloupci Sepharose 4B s detekcí podle indexu lomu, což představuje měřítko relativní velikosti molekuly PRP přípravku, vyjádřené údajem o relativním elučním objemu (K_d). Hodnoty K_d reprezentativních vzorků jsou uvedeny dále. Na základě těchto analýz lze konstatovat, že neexistují žádné zjevné rozdíly ve velikosti molekul mezi pěti PRP přípravky.

Měření velikosti molekuly na základě analýzy na Sepharose 4B

Vzorek	Kd
PRP, získaný intenzivním způsobem výroby vzorek 1	0,46
vzorek 2	0,48
vzorek 3	0,45
PRP, získaný selektivní frakcionací pomocí alkoholu vzorek 1	0,46
vzorek 2	0,51

HPSEC-univerzální kalibrační analýza

Kromě alazýzy na Sepharose 4B se velikost molekul a polydisperzita každého z výše uvedených vzorků PRP zkouší vysoce výkonnou chromatografii SEC (size exclusion chromatography) s on-line detekcí specifické viskozity a indexu lomu. Tato analýza se provádí za použití sloupce TSK G4000 PWXL v mobilní fázi na bázi octanu amonného a umožňuje výpočet relativní molekulové hmotnosti (Mp) a indexu polydispersity (PI) u každého z PRP přípravků.

Chromátogramy, získané při analýze tří reprezentativních | várek, získaných intenzivním způsobem výroby PRP podle vynálezu a dvou reprezentativních várek PRP, získaných selektivní frakcionací pomocí alkoholu, jsou souhrnně uvedeny dále. V tabulce jsou také uvedeny průměrné výsledky z analýzy celkem 29 PRP várek, získaných při výrobě PRP selektivní frakcionací za použití alkoholu. I

Stanovení relativní molekulové hmotnosti (ML) a indexu polydisperzity (PI) u PRP, vyrobeného jednak intenzivním způsobem výroby a jednak selektivní frakcionací za použití alkoholu

Vzorek	«Ρ	PI
PRP, získaný intenzivním
způsobem výroby
vzorek 1	202 000	1,80
vzorek 2	183 000	1,65
vzorek 3	213 000	1,56
průměr ze 3 várek	199 000±15 000	l,67±0,12
PRP, získaný selektivní
frakcionací pomocí alkoholu
vzorek 1	165 000	1,54
vzorek 2	148 000	1,42
průměr z 29 várek	150 000±21 000	l,39±0,12

Výsledky těchto analýz představují opodstatněný důkaz, že přípravky PRP, vyrobené intenzivním způsobem výroby, mají poněkud vyšší molekulovou hmotnost a větší polydisperzitu než přípravky PRP, vyrobené selektivním frakcionačním postupem za použití alkoholu.

Kromě výše uvedených analýz byly též na velikost molekul analyzovány derivatizované PRP, odpovídající jednak přípravkům, které byly vyrobeny intenzivním způsobem výroby a jednak reprezentativní derivatizované PRP, vyrobené z PRP, získaného selektivní frakcionací za použití alkoholu. Velikost molekul a polydisperzita derivatizovaných přípravků PRP (v bromacetylbutandiaminové formě) byly zkoumány jednak chromatografii na Sepharose 4B a jednak universální kalibrací HPSEC. Výsledky těchto analýz jsou uvedeny v následující tabulce.

Měření velikosti molekul a polydisperzity derivatizovaného PRP na bázi PRP, vyrobeného jednak intenzivním způsobem výroby a jednak selektivní frakcionací za použití alkoholu

Vzorek K_d Mp PI

Derivatizovaný PRP, vyrobený intenzivním způsobem výroby

vzorek a	0,64	105	000	1,37
vzorek b	0,61	123	000	1,48
vzorek c	0,60	127	000	1,42
Průměr	0,62	118	000+12 000	l,43±0,06

Derivatizovaný PRP, vyrobený selektivní frakcionací za použití alkoholu

vzorek a	0,65	104 000	1,32
vzorek b	0,59	112 000	1,29
vzorek c	0,60	119 000	1,33
Průměr	0,61	112 000±8 000	l,31±0,02

Tyto výsledky ukazují, že v průběhu derivatizace se velikost molekul PRP zmenší a že velikost molekul derivatizovaného PRP, vyrobeného jak intenzivním způsobem výroby podle vynálezu, tak selektivní frakcionací za použití alkoholu, jsou v podstatě stejné.

E. Relativní analýza antigenicity

Obsah antigenu v PRP se obvykle stanovuje poměrnou nefelometrickou analýzou. Měřítkem relativní antigenicity vzorku je porovnání koncentrace antigenu v daném vzorku s koncentrací polysacharidu. Výsledky těchto analýz u tří demonstračních várek PRP, získaných intenzivním způsobem podle vynálezu a u dvou reprezentativních várek PRP, získaných selektivní frakcionací za použití alkoholu, jsou uvedeny v následující tabulce. U všech těchto pěti vzorků jsou hodnoty relativní antigenicity v rámci experimentální chyby stejné.

Porovnání relativní antigenicity PRP, vyrobeného jednak intenzivním způsobem výroby a jednak selektivní frakcionací za použití alkoholu

Vzorek	Relativní antigenicita (%)
PRP, získaný intenzivním způsobem výroby vzorek 1	93
vzorek 2	95
vzorek 3	101
PRP, získaný selektivní frakcionací pomocí alkoholu vzorek 1	96
vzorek 2	105

Příklad 10

Výsledky zkoušení imunogenicity na zvířatech

A. Imunogenicita na mláďatech opice Rhesus

Mláďat opice Rhesus bylo použito jako předklinického modelu imunogenicity, který koreluje s imunogenicitou konjugátová očkovací látky na bázi H. influenzae u malých dětí. U tohoto druhu opice byla již dříve v rozsáhlé míře zkoušena konjugátová očkovací látka na bázi Haemophilus b (konjugát s meningokokovým proteinem) a bylo zjištěno, že je vysoce imunogenní (Vella a další, Pediatrics, 85, 668, 1990; Vella a Ellis, Pediatrie Research 29, 10, 1991). Každý rok je pro použití k dispozici jen malý počet opic, takže pro zkoušení každé očkovací látky bylo použito tří až šesti opic ve skupině. Vzhledem k tomu, že se jedná o outbrední druh, byly u jednotlivých opičích mláďat zjištěny až asi 100-násobné rozdíly v hladině anti-PRP, jakožto odpověď na podání konjugátová očkovací látky na bázi Haemophilus b (konjugát s meningokokovým proteinem). Tyto výsledky jsou podobné rozsahu odlišností v imunitní odpovědi jednotlivých malých dětí. Z těchto důvodů, tj. zejména díky omezené velikosti skupiny a outbrednímu charakteru zvířat, představuje zkouška na opičích mláďatech Rhesus spíše kvalitativní než kvantitativní model imunogenicity těchto očkovacích látek. Za pozitivní odpověď jsou po dávce považovány 2 hladiny > 1 μα anti-PRP/ml. Tohoto výsledku se nedosáhne za použití očkovacích látek na bázi PRP, PRP-D nebo HbOC. Za použití očkovací látky na bázi Haemophilus b (konjugát s meningokokovým proteinem) se této hladiny konsistentně dosahuje.

Odpověď anti-PRP opičích mláďat Rhesus na očkovací látku na bázi Haemophilus b (konjugát s meningokokovým proteinem), vyrobenou na bázi PRP, získaného intenzivním způsobem výroby je srovnatelná s odpovědí na očkovací látku z konsistentních výzkumných a výrobních várek a z produkčních várek, vyrobených selektivním frakcionačním postupem za použití alkoholu. Na zkoušení bylo použito konjugátu, vyrobeného ve výzkumu z PRP, získaného laboratorně intenzivním způsobem výroby a čtyř konjugátových várek, vyrobených ze tří várek PRP, získaného intenzivním způsobem výroby. Celkem bylo očkováno očkovací látkou na bázi Haemophilus b (konjugát s meningokokovým proteinem), získanou z PRP, připraveného intenzivním způsobem výroby, opic. Všech 24 opic dosáhlo po dávce 2 hladin > lúg anti-PRP/ml. Tato data ukazují, že při tomto kvalitativním modelu imunogenicity existuje imunologická ekvivalence mezi očkovací látkou na bázi Haemophilus b (konjugát s meningokokovým proteinem), vyrobenou z PRP, získaného jednak intenzivním způsobem výroby podle vynálezu a jednak selektivním frakcionačním postupem za použití alkoholu.

B. Data imunogenicity na myších

Zkoušení účinnosti očkovací látky na bázi Haemophilus b (konjugát s meningokokovým proteinem), vyrobené z PRP, získaného jednak intenzivním způsobem výroby podle vynálezu a jednak selektivním frakcionačním postupem za použití alkoholu bylo též prováděno na myších BALB/c. Vzhledem k tomu, že se jedná o geneticky inbrední druh, který je dostupný vpodstatě v neomezeném počtu jedinců, představuje zkoušení účinnosti této očkovací látky na myších kvantitativní model imunogenicity. Při této modelové zkoušce byla každé skupině 8 myší vstříknuta očkovací látka při sériovém 5-násobném ředění, přičemž pro každou várku očkovací látky bylo použito celkem 40 myší. Účinná dávka pro serokonversi 50 % myší (ED₅₀) na seropositivitu vzhledem k anti-PRP byla vypočítána pro každý soubor 40 myší (čím nižší je hodnota ED₅₀, tím vyšší je účinnost). Hodnoty ED₅₀ 4 různých várek očkovací látky na bázi Haemophilus b (konjugát s meningokokovým proteinem), vyrobené z PRP, získaného intenzivním způsobem výroby podle vynálezu, jsou řádově stejné, jako hodnoty získané za použití referenční kontrolní očkovací látky na bázi Haemophilus b (konjugát s meningokokovým proteinem), která se ukázala být imunogenní u malých dětí. Tato data ukazují imunologickou srovnatelnost v kvantitativním modelu.

Příklad 11

Zkušební výsledky, zaměřené na zjištění čistoty kultury, inaktivace H. influenzae a obsahu PRP-antigenu u fermentačních várek H. influenzae, použitých při intenzivním způsobu výroby PRP podle vynálezu, byly všechny uspokojivé.

Tří várek PRP, vyrobených intenzivním způsobem výroby, bylo následně použito při výrobě očkovací látky na bázi Haemophilus b (konjugát s meningokokovým proteinem). Derivatizovaný polysacharidový blok Haemophilus b byl podroben úplnému kontrolnímu zkoušení a všechny zkušební výsledky ukazují, že tyto látky, získané intenzivním způsobem výroby PRP, jsou nerozlišitelné od podobných látek, získaných selektivním frakcionačním postupem za použití alkoholu.

Výsledky provedené na produktu, který byl odebrán z finálního zásobníku, potvrzují, že očkovací látka na bázi Haemophilus b (konjugát s meningokokovým proteinem), vyrobená z PRP, získaného intenzivním způsobem výroby, má stejnou kvalitu, jako produkt, který byl získán za použití PRP, vyrobeného frakcionací za použití alkoholu.

Claims (14)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob výroby kapsulárního polysacharidu, prostého lipidu a endotoxinu ze surového nebo přečištěného přípravku obsahujícího jednak kapsulární polysacharid prostý lipidu a jednak lipo-kapsulární polysacharid, pocházející z bakterií, při kterémžto způsobu nedochází k podstatné ztrátě kapsulárního polysacharidu, vyznačující se tím, že se v podstatě všechen lipo-kapsulární polysacharid převede na kapsulární polysacharid, prostý lipidu, odštěpením lipidu z lipo-kapsulárního polysacharidu, načež se oddělí volný lipid a endotoxinové nečistoty a izoluje se kapsulární polysacharid, prostý lipidu.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t i m , že se lipid odštěpuje z lipo-kapsulárního polysacharidu pomocí fosfolipasy.
3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se t i m , že kapsulární polysacharid je získán z kultury Haemophilus influenzae typu b, Neisseria meningitidis (meningokok) skupiny A, B, C, X, Y, W135 nebo 29E nebo Escherichia coli Kl, K12, K13, K89, K92 nebo K100.
4. 4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se t i m , že kapsulární polysacharid představuje směs obsahující PRP a lipo-PRP, získanou z kultury Haemophilus influenzae typu b.
5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se t i m , že se směs obsahující PRP a lipo-PRP zpracovává fosfolipasou D, samotnou, nebo v kombinaci s fosfolipasou A₂ nebo fosfolipasou B, za přítomnosti organické fáze, která obsahuje jako aktivátor enzymu ether.
6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se t í m , že organická fáze obsahuje směs první etherové složky, zvolené ze souboru zahrnujícího diethylether, dibutylether a methylterc.butylether a druhé složky, zvolené ze souboru zahrnujícího methanol, ethanol a hexan, přičemž první složka a druhá složka jsou přítomny ve vzájemném poměru přibližně v rozmezí od 20:1 do 5:1.
7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se t í m , že fosfolipasa je odvozena z nesavčího organismu.
8. 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se t í m , že se směs obsahující PRP a lipo-PRP zpracovává samotnou fosfolipasou D.
9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se t í m , že se směs obsahující PRP a lipo-PRP zpracovává přibližně 0,01 až 10 % hmotnostními fosfolipasy

   D.
10. 10. Způsob výroby polyribosylribitolfosfátu, PRP, prostého lipidu a endotoxinů, bez podstatné ztráty PRP, vyznačující se tím, že se lipo-PRP, přítomný v surovém nebo přečištěném polysacharidu, získaném z kultury Haemophilus influenzae typu b, nechá reagovat s fosfolipasou D, za použití přibližné 0,3 % hmotnostního fosfolipasy D, vztaženo na PRP, v reakčni směsi obsahující organickou fázi etheru a rozpouštědla v koncentraci přibližně 30 až 60 %, vztaženo na objem reakčni smési, přičemž organická fáze obsahuje směs první etherové složky, zvolené ze souboru zahrnujícího diethylether, dibutylether a methylterc.butylether a druhé složky, zvolené ze souboru zahrnujícího methanol, ethanol a hexan, za přítomnosti detergentu, zvoleného ze souboru zahrnujícího deoxycholát a Triton X-100, o koncentraci 0,1 až 0,4 % a za přídavku chloridu vápenatého, přibližně v 0,1 až lOmM koncentraci, v pufru, který je kompatibilní s výše uvedenými reakčními činidly, při pH v rozmezí od asi 7,0 do 8,0 a teplotě v rozmezí od asi 20 do 45 °C, po dobu od asi 30 minut do asi 4 hodin.
11. 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se t í m , že se jako organické fáze na bázi etheru a dalšího rozpouštědla použije směsi methylterc.butyletheru a ethanolu v poměru asi 9:1, přičemž koncentrace této směsi v celém objemu reakční směsi je přibližně 50 %.
12. 12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se t í m , že dále zahrnuje odstraňování proteinových nečistot, včetně přidané fosfolipasy D, extrakci PRP fenolem a odstranění volných lipidů a endotoxinu zpracováním PRP, před nebo po zpracování fosfolipasou D, ve stupni hydrofobní adsorpce, při němž nedochází k adsorpci PRP nebo lipo-PRP.
13. 13. Způsob výroby PRP, prostého lipidu, bez podstatné ztráty PRP, vyznačující se tím, že se

    a) kultivuje bakterie Haemophilus influenzae typu b ve vhodném kultivačním mediu;

    b) buňky Haemophilus ifluenzae typu b se usmrtí thimerosalem nebo fenolem;

    c) kultivační medium se vyčeří od usmrcených buněk Haemophilus influenzae typu b;

    d) vyčeřené kultivační medium se zkoncentruje na zpracovatelný objem;

    e) nečistoty v kultivačním mediu se vysrážejí přídavkem ethanolu až do konečné koncentrace ethanolu přibližně 48 %, za vzniku supernatantu obsahujícího PRP a pelety nečistoty, která se zahodí;

    f) vysráží se PRP přídavkem ethanolu až do konečné koncentrace ethanolu přibližně 61 %, za vzniku pelety surového PRP;

    g) peleta PRP se solubilizuje ve vodě a ke vzniklému roztoku se přidá chlorid vápenatý až do konečné 1,0M koncentrace;

    h) přidá se ethanol až do konečné koncentrace 23 %, za vzniku nerozpustné pelety nečistot a supernatantu, obsahujícího PRP;

    i) přidá se ethanol až do konečné koncentrace 37 %, aby se vysrážel PRP;

    j) peleta PRP se tri turu je s absolutním ethanolem a vysuší, čímž se získá PRP pre-fenolový prášek;

    k) solubilizovaný přípravek na bázi práškovítého PRP se extrahuje fenolem;

    l) PRP se vysráží přídavkem chloridu vápenatého až do 0,05M koncentrace a alkoholu až do asi 67% koncentrace a provede se triturace v absolutním ethanolu, za vzniku post-fenolového prášku;

    m) ze solubilizovaného post-fenolového prášku se odstraní endotoxin hydrofobní adsorpci;

    n) PRP v surovém PRP, pre-fenolovém prášku nebo post-fenolovém prášku se nechá před prováděním dalších stupňů reagovat s fosfolipasou.
14. 14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se t ί m , že se jako fosfolipasy použije fosfolipasy D, která se přidává v množství asi 0,3 % hmotnostního, vztaženo na PRP; surový PRP, pre-fenolový prásek nebo post-fenolový prášek je solubilizován v lOmM Tris, 5mM chloridu vápenatém, 45% methylterc.butyletheru, 5% ethanolu a 0,3% Tritonu X-100 a reakce se nechá probíhat při asi 35 °C po dobu rozmezí od 30 minut do asi 4 hodin.