SK18594A3 - Method of production of capsular polysacharide without lipid and endotoxine - Google Patents

Description

Spôsob výroby kapsulárneho polysacharidu bez lipidu a endotoxínu

Oblast techniky

Vynález sa týka spôsobu výroby kapsulárneho polysacharidu, bez lipidu a endotoxínu zo surového alebo purifikovaného prípravku, obsahujúceho ako kapsulárny polysacharid bez lipidu, tak i lipo-kapsulárny polysacharid, prípravok, ktorý je získaný z baktérií, bez podstatnej straty polysacharidu.

Vynález sa predovšetkým týka spôsobu výroby kapsulárneho polysacharidu, bez lipidu, z bakteriálnych kultúr, vrátane, typového špecifického kapsulárneho polysacharidu z Gram-negatívnych baktérií. Pri spôsobe podlá vynálezu sa kapsulárny polysacharid, ktorý obsahuje kovalentne viazané glyceroldiesterové zvyšky,prevádza na volný polysacharid. V prednostnej realizácii, tohoto vynálezu sa z kapsulárneho polysacharidu, z ktorého sa odštiepuje kovalentne viazaný lipid, tiež odstraňujú lipopolysacharidy. LES alebo endotoxín.

Pri jednej aplikácii je sposob podlá tohoto vynálezu prispôsobený výrobe polyribosylribitolfosfátu (ďalej označovaného skratkou PRp), bez lipidov, čo je kapsulárny polysacharid získaný z kultúr patogénnej baktérie Haemophil.us influenzae typu B, ktorý býva tiež označovaný skratkou Hĺb. Získaný PRP je vhodný ako zložka pre výrobu očkovacích látok, ktorých účelom je vyvolat imunitnú odpoveď poskytujúcu ochranu proti vývoju chorob spôsobených Hĺb. Na základe tohoto vynálezu je možne predpokladal, že v podobne vysokom výťažku by bolo možné získaval, na základe tu uvedených znalostí, i kapsulárne polysacharidy z iných patogénnych baktérií, v ktorých je prítomná kovalentné väzba k lipiau, ako z baktérie E. coli alebo Neisseria meningitis.

Doterajší stav techniky

Patogénna baktéria, Hib, je zodpovedná za početné choroby, z ktorých najvýznamnejšia je bakteriálna meningitída a systemická bakteriálna choroba, ktorá sa vyskytuje predovšetkým u detí mladších ako pa£ rokov. Nedávno bol americkým úradom FDA udelený súhlas na použitie očkovacích látok, zameraných proti Hib u ludí (viď 1991 Physicians Desk Reference, str. 1476 až 1478 pre výrobok firmy Merck & Co. Inc., PedvaxHIB^ a str. 1174 až 1176 pre výrobok (p) firmy Lederle Hib TITER^vn .

Jeden spôsob výroby očkovacej látky proti Hib je popísaný v US patentoch č. 4 695 624 a 4 882 317. PRP,používaný pri tomto postupe bol získaný kultiváciou Haemophilus influenzae typu b, a izoláciou polysacharidovej frakcie z kultivačného média. Izolovaný PRP sa potom konjuguje s vonkajším membránovým proteínovým komplexom z Neisseria meningitis b, ktorý pôsobí ako nosič zvyšujúci imunitnú odpoveď PRP, ktorý je sám o sebe u malých detí málo imunogénny.

Podlá US patentu č. 4 695 624. sa fermentačná zmes 800L z Haemophilus influenzae typu b skoncentruje na 377 g vlhkej pasty ( viď stĺpec 16, riadok 24). PRP sa izoluje selektívnym zrážaním pri rôznych koncentráciách etanolu, za prítomnosti chloridu vápenatého. Získa sa 68 g suchého produktu (viď stĺpec 17, riadok 1), ktorý je ďalej označovaný označením pre-fenolový prášok. Ďalšie spracovanie zahŕňa extrakciu fenolom a zrážanie etanolom a získa sa pri ňom 39 g suchého produktu (viď stĺpec 17, riadok 49 ) a konečný výťažok je 34,7 g suchého produktu (viď stĺpec 1S, riadok 14) . Táto látka je daie j označovaná názvom post-fenolový prášok. Post-fenolový prášok sa môže konjugovat alebo

nu.

Endotoxín je hlavnou zložkou prispievajúcou ku zvýšeniu teploty u cicavcov po ich očkovaní imunogénmi, získanými z baktérií. Túto tzv. pyrogénnu odpoveď je možné eliminoval odstránením liposacharidov obsahujúcich lipid A, ktoré sú ďalej označované synonymnými názvami endotoxín, pyrogén alebo LPS, z tohoto imunogénu. Z dôvodu dosiahnutia tohoto ciela sa môže post-fenolový PRO, získaný spôsobom uvedeným, vyššie, ďalej purifikovat, aby bolo možné splnil regulačné normy pre pyrogén. Až do vyvinutia tohoto vynálezu bolo možné dosiahnuť tento ciel len za cenu straty približne 70 % PRP, prítomného v post-fenolovom prášku, selektívnou frakcionáciou za použitia etanolu. Tento postup zahŕňa zrážanie LPS z post-fenolového PRP pridávaním etanolu až do koncentrácie, ktorá práve postačuje pre iniciáciu zrážania, t.j. až do tzv. bodu zákalu, ako je to uvedené v US patente č. 5 039 610 a v US patentovej prihláške č, 595 722. Etanol sa pridáva až do bodu zákalu_r. t.j. do okamihu, kedy sa dosiahne približne dvojnásobný rast zákalu. Potom sa pridá ďalších 0,5 až 2 % etanolu. Tak sa získa zrazenina, ktorá až dosial predstavovala odpadný produkt a je ďalej označovaná názvom nízka frakcia, pričom PRP, bez lipidu,zostáva v roztoku. Nízka frakcia obsahuje približne 70 % PRP θ v podstate všetok LPS.

V snahe, vyhnút sa strate PRP, ku ktorej dochádza pri odstraňovaní endotoxínu selektívnou frakcionáciou za použitia etanolu, vyvinuli pôvodcovia spôsobu popísaného v US patente č. 5 019 502 spôsob odstraňovania LPS, ktorý nie je doprevádzaný podstatnou stratou PRP. Tento spôsob zahŕňa pasážovanie solubilizovaného post-fenolového prášku hydrofóbnym adsorpčným stupňom, ktoré sa prevádza diskontinuálne *

alebo kontinuálne v chromatografickej kolone a prednostne sa pri ňom používajú neionové živice , ku ktorým sa viaže endotoxín, nie však polysacharidy.

Pri použití vysoko^- porézneho styrén-divinylbenzénového kopolyméru, ako je HP2O,sa skutočne kvantitatívne odstráni v. podstate všetok endotoxín a do'siahne sa takmer kvantitatívny výťažok PRP. Táto látka je nalej označovaná názvom post-HP20 PRP. Podstatná čast PRP, produkovaného Hĺb, je však vo forme kovaientného lipo-PRP»

Možnosť, že PRP je produkovaný Haemophilus influenzae typu b, ako lipo-PRP, privýkrát zistil Kuo a ďalší ( J. Bacterio'L. 163, 769 až 773 (198?)), keď bola baktéria Haemo philus influenzae typu b pestovaná v kvapalnom médiu, doplnenom rádioaktívnym palmitátom a/alebo rádioaktívnou ribózou. Polyribozylribitolfosfát, purifikovaný zo supernatantu tejto kultúry, obsahoval eko rádioaktívnu ribózu, tak palmitát, ktoré boli zavedené do PRP v priebehu jeho biosyntézy. Zistilo sa, že spracovaním fosfolipázou (PLAj) je možné odstrániť, určitú čast rádioaktívneho palmitátu z PRP, žatia! čo metódy, ktoré sú schopné rozlomiť nekovalentnú asociáciu boLi neúspešné. Nebola uvedená štruktúra lipo-PRP, ale uvedené dáta sú konzistentné s dátami, oznámenými v staršej publikácii, kde bola navrhnutá štruktúra meningokokovej skupiny A, S, C a polysacharidov z E. coli K 92 (Gotschlich a ďalší, J. Biol. Chem. 25b, '8915 až 8921 (198i/). Pri sposobe podlá vynálezu bola na základe práce so špecifickými fosfolipázami zistená štruktúra ktorá je podrobnejšie uvedená v ďalšom popise.

Lipo-PRP sa naviaže k hydrofóbnej pryskyrici, ktorá sa používa podie US patentu č.

019 502, vdaka menším hy d r o f obny m vlastnostiam ne lipidy, v kontraste k ktoré lipo-PRP dodávajú kovelent.. . ' · t .

prevažne amonovej povsne vem velkej polysacharidovej časti molekuly. Konečný produkt získaný pri tomto postupe preto obsahoval podstatnú časí ako lipo-PRP, tak PRP bez lipidu. Tento lipo-PRP sa odstráni buď selektívnou frakcionáciou za použitia etanolu, pri ktorej dochádza približne k 70 % strate PRP alebo za použitia spôsobu tu popísaného, pri ktorom sa v podstate všetok PRP získa vo forme PRP bez lipidu.

Úlohou tohto vynálezu je teda vyvinúť spôsob získavania kapsulárneho polysacharidu bez lipo-PRP,ktorý by umožnil produkovať konjugátový produkt, nerozoznatelný od konjugátu, vyrobeného len za použitia frakcie polysacharidu bez lipidu, získaného selektívnou frakcionáciou za použitia alkoholu. Ďalšou úlohou tohto vynálezu je vyvinúť sposob produkcie

- . ·*

PRP vo vysokom výtažku, ktorý by zahŕňal konverziu lipo-PRP na PRP bez-lips,miesto toho, aby sa lipo-PRP zahadzoval.

Ďalšou úlohou tohoto vynálezu je vyvinúť spôsob, ktorý v W by bol reprodukovateľný, pokial sa týka množstva a konzisv tencie PRP, pripravitelného z kultúr baktérie Haemophilus influenzae typu b pre zaistenie reprodukovatelnosti konjugátových očkovacích látok, vyrobených z takto získaného PRP. Ďalšie úlohy, ktoré vynález rieši a výhody, ktoré prináša, sú zrejmé z ďalšieho podrobného popisu.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je spôsob výroby kapsulárneho polysacharidu z baktérií, vrátane typového špecifického kapsuiárneho polysacharidu z Gram-negatívnych baktérií, ktorého podstata spočíva v tom, že sa kapsulárny polysacharid obsahujúci kovaientné väzby k lipidu prevedie na kapsulárny polysacharid bez iipidov a odstránia sa endotoxínové nečistoty. V prednostnom prevedení sa lipo-PHP prevedie na PHP bez-lipo, získaný z kultúry Haemophilus influenzae typu b., odštiepením kovalentne viazaných lipidov od pRp pomocou fosfolipázy D v pufre obsahujúcom asi 50 % objemových organických aktivátorov enzýmu, asi 0,3 % detergentu a asi 5 mM koncentráciu katiónov dvojmocného kovu, pri teplote asi 35° C a približne neutrálnom pH, v priebehu asi 4 hodín, načo sa odstráni enzým, zvyškové lipidy a lipopolysacharidy.

Prehlad obr. na výkrese

Na obr. 1 je navrhnutá štruktúra lipo-PRP.

Na obr. 2 je uvedené porovnanie výroby PRP za použitia selektívnej frakcionácie pomocou alkoholu s výrobou PRP za použitia enzymatickej konverzie lipo-PRP, po ktorej sa odstráni enzým a LPS.

Na obr. 3 je znázornená bloková schéma opti'malizovaného postupu konverzie lipo-PRP na PRP bez-lipo a odstraňovania endotoxínu.

Nasleduje podrobný popis vynálezu.

Ako už bolo uvedené vyššie, podstatou vynálezu je sposob odštepovania kovalentne viazaného lipidu z bakteriálneho kapsulárneho polysacharidu a sposob odstraňovania Lipidových a endotoxínových nečistôt. Pre odstepovanie lipidu sa môžu používať chemické alebo enzymaticke prostriedky. Pri selektívnej frakcionácii polysacharidu s kovalentne viazaným lipidom za použitia etanolu dochádza ku strate frakcie kapsulárneho polysacharidu vo forme odpadového produktu, označovaného názvom nízka frakcia. Tým, že vynález umožňuje odstránenie kovalentne viazaného lipidu, vyhýba sa strate kapsulárneho polysacharidu, ku ktorej dochádza pri selektívnej frakcionácii za použitia alkoholu a poskytuje polysacharidový prov dukt, ktorý je užitočný pri výrobe voľných alebo konjugovaných polysacharidových očkovacích látok, ktorých úlohou je v poskytnúť ochranu proti infekcii patogánom, z ktorého bol polysacharid získaný, Kovalentne viazaný lipid sa napríklad môže odstraňovať pôsobením hydroxylamínu. Odátiepovanie kovalentne viazaného lipidu z kapsuiárneho polysacharidu sa prednostne prevádza enzymaticky. V prednostnom prevedení tohoto vynálezu sa vo vysokom výťažku produkuje polyribosylribitolfosfát, PRP (intenzívny spôsob výroby PRpj.

Spôsob podlá vynálezu je možné dobre pochopiť na základe výkladu, ktorý sa opiera o obr. L. Na obr. 1 je znázornená štruktúra lipo-PRP, navrhnutá na základe štúdií s fosfolipázami s definovonou špecifičnosťou. Štruktúra PRP bez lipidov, je rovnaká ako štruktúra znázornená na obr. 1 , len s tým rozdielom, že k fosfátovému zvyšku opakujúcich sa jednotiek PRP nie je esterifikáciou pripojený žiadny diacylglycerolový zvyšok. Prítomnosť glvnerolu v Lipo-PRP bola tiež potvrdená vysoko účinnou kvapalinovou chromatografiou Dionex HPLC. Taktiež bola potvrdená prítomnosť glukózy.

Je známe, že fosfolipáza Ä₂ (PLA₂) štiepi označenú obchodne dostupným prípravkom na bázi PLA₂ (Sigma, B'oehringer) a sleduje sa uvoľňovanie mastných kyselín pomocou analýzy plynovou chromatografiou, zaznamenáva sa zníženie obsahu palmitoolejovej kyseliny [16:L cis 9J ale nie kyseliny palmitovej 116:1] alebo kyseliny myristovej [14 :θ], z ktorých všetky sú zistiteľné v lipo-PRP.

Obchodne dostupná fosfolipáza E (Sigma) je schopná odstrániť určitú frakciu kyseliny pelmizovej a kyseliny palmitoolejovej, ale glukóze a glycerol sa týmto enzýmom neodstránia. Okrem toho, aktivita fosfolipázy 0 (Sigma) sa zdá byt zablokovaná, a preto je poloha glukózy taká, ako je to znázornené na obr. 1. Obchodne dostupná fosfolipáza D (Sigma, Genencor, Boehringer ) odstraňuje všetky tieto mastné kyseliny, rovnako ako glycerol a glukózu. Žiadny z týchto enzýmov však nebolo možné použiť spočiatku samotný a žiadny z týchto enzýmov neodstránil 100 % mastných kyselín z PRP pred optimalizáciou, ktorá sa dosahuje za použitia tohoto vynálezu.

Tento vynález predstavuje optimalizovaný postup, ktorým je možné dosiahnuť úplné odstránenie lipidu za použitia samotnej fosfolipázy (PLD). Okrem toho je možné však pri odstraňovaní kovalentných lipidov s výhodou používať tiež kombináciu PLD s PLA^ alebo PLB. Pri jednom prevedení tohoto vynálezu sa používa kombinácia fosfolipázy e fosfoLipázy D pri teplote okolia k úplnému odstráneniu kovalentne viazaného Lipidu z Lipo-PRP, pričom sa PRP bez lipidu konjuguje s imunogénnym proteínom, čo sa prejavilo ako účinné pre vyvolanie silnej anti-PRP imunitnej odpovede.

Znižovanie požiadavky na fosfolipázu je žiaduce, pretože tieto enzýmy sú nákladné e pretože zníženie spotreby enzýmu uľahčuje jeho odstraňovanie z produktu. Úplné odstránenie mastej kyseliny z post-fenolového práškovitého PR? s.a môže dosiahnuť za použitia 700 U fosfolipázy ( z porcínuj a 20 U fosfolipázy D (zo Štreptomyces chromofuscus) , spolu s 30 % butyléteru a 0,1 % DOC, čo sú silné stimulátory enzýmu.. V literatúre je popísané, že fosfolipázy a podobne enzýmy sú mimoriadne citlivé na reakčné prísady, ako sú detergenty a organické rozpúštad_á. Kates predovšetkým dokázal, že plastidová fosfatidáza C je vysoko stimulovaná prídavkom zmesi éteru a metanolu, o ktorých sa predpokladá, že pôsobia synergicky tým, že umožňujú substrátovej a enzýmovej fázi koaleskovať v oblasti zvýšenej aktivity enzýmu 'Can. J. Biochem. and Physiol., 35, 127 (1957 V. Pôvodcovia tohoto vynálezu mali podozrenie, že podobný mechanizmus by mohol ovládať aktivitu fosfolipázy, a preto sa venovali štúdiu účinku zmesi éteru a metanolu na aktivitu enzýmu.

Ukázalo sa, že zmes butyléteru a metanolu je velmi silným aktivátorom reakcie fosfolipázy. Pri postupe, ktorý zahŕňal reakciu post-fenolového práškovitého PRP s PLAg a PLD za prítomnosti 5 až 1 % /objemovo/ butyléteru v metanole a nasledujúce spracovanie s pryskyricou HP20, pre zníženie obsahu endotoxínu, malo za následok úplné odstránenie lipidov z PRP. Okrem toho, požiadavky na enzým boli znížené 3,5-násobne, v prípade PLAg (zo 700 na 200 U) a dvojnásobne, y prípade fosfolipázy D (z 20 na 10 U J, Prídavnou výhodou spracovania pomocou HP20 po reakcií s enzýmom je, že. hydroťóbna živica adsorbuje určité množstvo enzýmu z reakčnej zmesi a ulahcuje tak namáhavé odstraňovanie enzýmu v ňalších reakčných stupňoch.

S ohľadom na požadovaný ciel, ktorým je výroba očkovacej látky pre podávanie ľuďom, je žiadúce používať čo najmenšie množstvo enzýmu, aby bolo možné enzým úplne alebo takmer úplne odstrániť. Ďalej je žiadúce používať v enzým, pochádzajúci zo zdroja, ktorý nemá žiadnu možnosť kontaminácie cicavčími vírusmi. Použitie. PLA? z porcínu môže byť nežiadúce, pretože tu môže existoval zvýšené riziko nežiadúcej imunologickej odpovede a v poslednej dobe existujú obavy z nezistiteľných vírusov v produktoch získaných z cicavcov. PLA₉, izolovaná do Streptomyces violaceoruber bola vyhodnocovaná za rovnakých reakčných podmienok, aké sú popísané vyššie. Lipidy boli úspešne

ΙΟ odstránené za použitia kombinácie fosfolipáz zo Szreptomyces. Boli vykonané tiež ďalšie pokusy, pri ktorých sa zistilo, že minimálna požiadavka na enzým, v prípade 100 mg PRP, je v rozmedzí od 100 do 200 U PL^ zo Streptosyces a v rozmedzí od. 2 do 10 U u PLD.

Je treba zdôrazniť, že existujú mnohé rôzne zdroje enzýmov, ktoré sú označované ako fosfolipáza j alebo B. Hadie jedy sú bohatými zdrojmi PLA?, zatial čo PLD bola izolovaná z kapusty, podzemnice olejovej a Streptomyces. Voíba konkrétneho zdroja je v značnej miere, diktovaná ohiadmi, ktoré boli uvedené vyššie a špecifickou aktivitou obchodne dostupných enzymatických prípravkov. Ďalej je možné, že niektoré iné lipázy by mohli vykazovať dostatočnú sekundárnu aktivitu, podobajúcu sa aktivite fosfolipázy, aby mohli byť užitočné pri spôsobe podlá tohoto vynálezu. Použitelnosť týchto iných lipáz k tomuto účelu by mala byť zrejmá z tohoto vynálezu.

Ako sa ukázalo, enzymatické metódy používajúce buď kombinácie fosfolipáz alebo samotnú fosfolipázu D pre odštepovanie lipidov z post-fenolového práškovitého PR? sú velmi dobre, reprodukovateíné a schopné prispôsobiť sa meniacemu. sä obsahu lipidu vo fenolom alebo timerasolom inaktivovaných kultúrach Haemophilus influenzae b. Okrem toho, keď sa po enzymatickej reakcii urobí spracovanie pomocou HP20, podstatne sa zníži obsah pyrogénu zo 60 EU/ug, vo východiskovom post-fenolovom práškovom PRP, na asi 10 EU/ug. po enzymatickej reakcii a konečne až na asi 0,0125 EU/ug, po spracovaní HP20. Tento pracovný postup predstavuje výbornú schému zaisťujúcu úplné odstránenie lipidu, podstatné zníženie obsahu LPS a vysoké výťažky PRP. Samozrejme sú možné i iné schémy, ako je pridanie lipázy skôr v priebehu izolácie PRP, ako napríklad do fermenťačnej pôdy, alebo bezprostredne po usmrtení baktérií. Do rozsahu tohoto vynálezu tiež prirodzene spadajú postupy, pri ktorých je zamenené poradie rôznych stupňov.

Pri prednostnom prevedení tohoto vynálezu sa enzymatické odstraňovanie všetkých lipidov z lipo-PRp robí pomocou optimalizovanej reakcie, ktorá zahŕňa reakciu PRP len s fosfolipázou SD, získanú zo Streptomyces chromofuscus, pri pomere približne 0,3 % hmotnostného fosfolipázy D, vztiahnuté na PRP. Tento enzým bol purifikovaný až do homogenity postupom podlá Imamura a Horiuti, J. Biochem. 85, 79 až 95(1979) θ je obchodne dostupný od firmy Genencor Internátional. Ako však už bolo uvedené predtým, môžu sa používal i iné zdroje PLD.

r **

Optimalizovane podmienky pre PLD zahŕňajú prídavok povrchovo aktívnej látky Triton X-100, ktorá sa zdá byt účinnejším aktivátorom enzýmu ako deoxycholát (DOC). Okrem toho, aktivita enzýmu je tiež citlivá na množstvo vápenatých iónov, pre zvýšenie aktivity enzýmu bola pri- , daná látka Triton X-100 v 4,5mM koncentrácii a vápenaté ióny v 5mM koncentrácii, napriek tomu, že by bolo možné použil i iné katióny dvojmocných kovov, ako napríklad horčík. Prídavok vápnika do reakčnej zmesi vyvoláva potrebu používal iné ako fosfátové pufry, ako napríklad 1 0'm.M Tris pufru s pH 7,4. Množstvo organických rozpúšladiel pridaných do reakčnej zmesi bolo zvýšené na 50 % objemových a butyléter bol s ohíadom na väčšiu bezpečnosl nahradený metylterc:. butyle térom. Za použitia týchto modifikovaných podmienok pre reakciu enzýmu sa po aalšom spracovaní pomocou HP20 dosiahlo úplné odstránenie Lipidu z pre-fenolového práškovitéhc PRP. Tieto reakcie boli opakované na dvoch gramových vzorcoch dvoch rôznych dávok pre-fenolového práškovitého PRP, aby sa ukázala reprodukovateínost a účinnosl tohoto· postupu spracovania pre-fenolového práškového PRP pomocou PLD. Produkty bez lipidov boli skúmané na distribúciu veľkosti molekúl pomocou cnromatografie na Sepharose CL4B. Hodnota Kd týchto produktov Ležala v rozmedzí od asi 0,4 do asi 0,5, čo je prijateľná hodnota pre imunogenicitu PRP. Samozrejme,je pri tejv to reakciii možné použit i iné pufrovacie podmienky alebo iné detergenty. Táto skutočnosť je odborníkom, v tomto odbore zrejmá.

Intenzívny spôsob výroby PRP bol demonštrovaný v troch replikáciách vo výrobnej jednotke, v ktorej sa vyrába konjugátová očkovacia látka na bázi Haemophilus b (meningokokový proteínový konjugát). V sérii bolo použitých šest fenolom inaktivovaných fermentačných várok H. influenzae. Tieto fermentečné várky boli skúšané na čistotu kultúry, inaktiváciu H. influenzae. a obsah PRP antigénu, pričom všetky výsledky boli uspokojivé. Boli vyrobené tri várky PRP, ktoré boli použité, ako východiskové Látky pre výrobu v priemyslovom merítku troch várok konjugátovej očkovacej látky na bázi Haemophilus b ( vo forme konjugátu s meningokokovým proteínom). Výtažok produktu za použitia týchto troch várok PRP, z ktorých každá vychádzala z dvoch fermentačných kultúr, bol asi 3,5 x vyšší ako výťažok, ktorý bol dosiahnutý za použitia selektívnej frakcionácie pomocou etanolu.

Tri várky PRP, vyrobené týmto intenzívnym spôsobom výroby, boli následne použité pre výrobu konjugátovej očkovacej látky na bázi Haemophilus b Cvo forme konjugátu s meningokokovým proťeínom). Výstupná kontroLa derivatizovaného' polysacharidového produktu z Haemophilus b, t. j. konjugátového produktu na bázi Haemophilus b PRP-OMPC a konjugátovej očkovacej látky na bázi Haemophilus b ( vo forme konjugátu s meningokokovým proťeínomJ , odobratého z finálneho zásobníka, ukazuje, že všetky tieto látky sú nerozoznateľné od podobných látok, ktoré boli získané selektívnym frekcionačným postupom za použitia alkoholu.

Nízka frakcia PR? predstavuje odpadnú zrazeninu (nbsahujúcu LťS, lipo-yR? a stratený PRťý zo selektívnej frakcionácie pomocou etanolu, čo je posledný stupeň pri výrobe PRP, podlá sposobu úverejneneho v US patente č. 5 039 610. Za použitia rovnakých zlepšených reakčných podmienok, ktoré boli vyvinuté pre pre-fenolový prášok, sa po nasledujúcom spracovaní pomocou HP20 dosiahne v podstate úplné odstránenie lipidu z nízkej frakcie prášku, pričom výťažok je vyšší ako 70 % PRP.

Reakčná zmes by mala obsahovať organické rozpúšťadlo, ktoré aktivuje fosfolipázu, pričom toto rozpúšťadlo by malo prednostne tvoriť približne 30 až 60 % reakčného objemu. Ako organický aktivátor sa prednostne používa éter, ako je dietyléter alebo metylterc,butyleter. Éter je s výhodou prítomný vo forme zmesi s druhým organickým rozpúšťadlom, ako je hexan, etanol alebo metanol, v pomere éteru k druhému organickému rozpúšťadlu v rozmedzí od asi 20 : 1 do asi 5:1, pričom prednostný pomer týchto látok je približne 9:1. Pri prevedení, ktorému sa dáva vysoká prednosť, sa s jedným dielom etanolu mieša deväť dielov metylterc:. butyle téru, ktorý je menej prchavý ako dietyléter, a preto sa s ním bezpečnejšie manipuluje a vzniknutá organická zmes sa pridáva k reakčnej zmesi dosahujúcej PLD, až do dosiahnutia finálnej koncentrácie približne 50 %. Prídavok organického rozpúšťadla zrejme napomáha k dosiahnutiu maximálneho kontaktu li.pidového substrátu s enzýmom.

Okrem prídavku organického aktivátora enzýmu je žiaduce pridávať i detergent, ako je deoxycholát alebo Triton X-100 alebo podobný detergent, ktorého úlohou je napomáhať rozbíjaniu lipidických agregátov a zvyšovať interakciu medzi enzýmom a substrátom. Detergent by mal byt prítomný v koncentrácii od sa, že celkom uspokojujúci nu X-100.

asi 0,1 do asi ŕ\ x/

je prídavok asi 0,3 % TritoFosfolipáza D by sa mala pridávať v dostatočnom množstve vzhľadom k lipo-kapsulárnemu polysacharidu, aby bolo možné dosiahnuť úplnú hydrolýzu kovalentne viazaného lipidu v rozumnom časovom období. Vhodný je prídavok asi 0,01 až 10 % PLD, vzhľadom k PRP a s výhodou činí tento prídavok asi 0,1 až 0,4 %. Ked sa pridá menej enf zýmu, predĺži sa prirodzená reakčná doba, žatia! Čo pri pridaní väčšieho množstva enzýmu sa reakčná doba skráti.

Úplné odstránenie kovalentne viazaných mastných kyselín z lipo-PRP za približne 30 minút až 4 hodiny reakcie je možné dosiahnuť v tom prípade, že sa reakčná zmes mieša, aby boli všetky reakčné fáze vo vzájomnom styku, použije sa asi 0., 1 aý 0,4 % (hmotnostne) koncentrácie PLD, asi 0,1 až asi 1 OmM koncentrácie katiónu dvojmocného kovu, ako napríklad vápnik vo forme chloridu vápenatého, v pufre, ktorý je kompatibilný so všetkými vyššie uvedenými reakčnými zložkami, ako je Tris pufer s pH približne v rozmedzí od 7,0 až 8,0 a pracuje sa približne v rozmedzí od 20 do 45, s výhodou od 30 do 40° C.

Vyššie uvedené reakčné podmienky boli považované za celkom uspokojivé pre. získanie PRP bez kovalentne viazaného lipidu,z východiskových PRP prípravkov,, ktoré sa značne líšia, pokiaľ sa týka ich čistoty. Tak bol spracovaniu za týchto podmienok podrobený pre-fenoiový prášok, post-fenolový prášok a post-HP20 produkt a vo všetkých prípadoch bol získaný PRP, bez kovalentne viazaného lipidu.

Po konverzii lipo-PRp v danom prípravku na voľný PRP sa fosfolipáza, ktorá je teraz prítomná v PRP prípravku, môže odstrániť fenolovou extrakciou tohto proteínového enzýmu. Aby sa zaistilo úplné odstránenie enzýmu, opakuje sa extrakcia fenolom prednostne jedenkrát až asi trikrát. Pri tomto spracovaní sa neodstraňuje len pridaný enzým, ale tiež všetky zostávajúce proteínové nečistoty, ktoré by mohli narušovať konjugáciu, robenú v dalsích stupňoch, alebo ktoré by mohli sposobovat nežiaduce imunitné odpovede u príjemcov očkovacej látky.

Pri enzymatickom spracovaní PRP,k získaniu PRP bez kovalentne viazaných mastných kyselín, sa tiež odštiepujú niektoré mastné kyseliny z LPS. V dôsledku enzymatického spracovania sa množstvo endotoxínu zníži približne trikrát. Táto úroveň však obvykle nepostačuje preto, aby prípravok vyhovel špecifikáciám na pyrogenicitu a preto sú nutné áalšie stupne pre elimináciu zvyškového LPS. Pri ďašom odstraňovaní endotoxínu sa môže použiť ktorákoívek z početných metód, ktoré sú popísané v tomto odbore, vrátane selektívnej frakcionácie za použitia etanolu, hydrofóbnej adsorpcie alebo iných metód, ktoré sú uvedené v US patente č. 5 019 502.

Ako neobmedzujúce príklady živíc, ktoré sú užitočné pri spôsobe podlá vynálezu, je možné uviesť výrobky Borate Avidgel (Amicon) , Amberlite XAD a Amberchrome ( Rohm Haas 9, Octyl Cellulose (. Phoenix Chem.), Silica CB (Baker), pryskyrice série SP a HP (napríklad SP207, HP20, HP50) ( Mitsubishi Chem.2. Z týchto pryskyríc sa dáva prednosť živiciam HP20 alebo HP50, vzhladom k ich schopnosti znižovať obsah lípopoiysacharidu, lahkosti použitia, dostupnosti, cene a tendencii vyhnúl sa väzbe k polysacharidom. Živica sa pred použitím prednostne premýva apyrogénnou vodou. Prednostne sa pred použitím živica premýva kyslým roztokom, alkalickým roztokom alebo polárnym rozpúšťadlom napr. etanolom alebo metanolom , až potom apyrogénnou vodou a potom sa predbežne ekvilibruje za použitia pufru, obsahujúceho 3 c itranu sodného a

0,5 % deoxychoLátu sodného. Podobne sa polysacharid, prednostne solubilizuje v pufre obsahujúcom asi 3 citranu sodného a asi 0,5 % deoxychoiátu sodného a vzniknutý roztok sa potom spracováva hydrofóbnou živicou,. ktorá bola predbežne upravená vyššie popísaným sposobom. Aby sa zabránila fluktuáciám pH, býva tiež užitočné pridat Tris pufer s pH 8,0 až do približne 25mM koncentrácie.

Kapsulárny polysacharid, obsahujúci kovalentne viazaný lipid, je možné previest na voíný polysacharid bud pred alebo po odstránení endotoxínu. Pri jednom prevedení tohoto vynálezu sa prášok, získaný z pôdy po fermentácii H. influenzae, ktorý obsahuje polyribosylribitolfosfát. Lipopolysacharidy a rôzne lipidy a proteíny, solubilizuje v 1OmM pufre Tris s chloridom vápenatým s 5mM koncentráciou, Tritonom X-100 s 4,5niM koncentráciou s pH 7,4 a potom sa k vzniknutému roztoku pridá zmes terc.butyléteru a etanolu v pomere 9 : I až do koncentrácie 50 %· Ku zmesi sa pridá asi 0,3 % hmotnostného, vztiahnutého na PRP, fosfolipázy D. zo Streptomyces chromofuscus a nechá sa prebehnút odštiepovanie lipidov za konštantného miešania pri teplote asi 35° C po dobu asi 3 hodín. Reakčný produkt sa 4 x extrahuje fenolom, aby sa odstránili proteínové nečistoty, vrátane pridaného enzýmu. Tak sa získa post-fenoiová vzorka.

Post-fenolová vzorka sa potom rozpustí v zmesi detergentu a chéLatačného činidla pri bázickej, hodnote pH. K roztoku sa pridajú perly živice Hp20, ktoré boli vopred v

spracované rovnakým pufrom a zmes s PRP sa niekolko hodín premiešáva v rotačnej trepačke pri teplote nižšej ako je teplota miestnosti. Perly živice sa potom z roztoku odfiltrujú a fiitrát sa diafiltruje, z dovodu odstránenia detergentu a chelatačného činidla. Izoluje sa retentaé, ku ktorému sa pridá chlorid vápenatý. PRP sa z roztoku vyzráža 95 % etanolom. Zrazenina sa odstredí a získaná peleta sa titruje s etanolom a acetónom. Výsledný produkt sa vysuší za zníženého tlaku.

Pri spôsobe za použitia perlovej hydrofóbnej živice sa dosiahne nízka úroveň kontaminujúceho endotoxíni bez toho, aby to bolo sprevádzané podstatnou stratou PRP. Zníženie koncentrácie endotoxínu, ktorý sa pri tomto spracovaní dosiahne, leží obvykle v rozmedzí od 1 0.0-násobku do 21 UbO-násobku, pri porovnaní východiskového a konečného prášku, v závislosti na počiatočnej úrovni znečistenia endotoxínom. Výtažok PRP tvorí obvykke prinajmenšom 75 % a niekedy je dokonca vyšší ako 90%, vztiahnuté na východiskovú látku.

Pre stanovenie hladiny znečistenia endotoxínom sa používa skúška s lyzátom Ameobocytu Limulus (LAL), ktorá je popísaná v Guideline on validation of the LAL test as an end-produkt endotoxin test for human and animal parenteral drugs, biological products, and medical devices, U.S. Department of Health and Human Services, december 1987.

Pri prednostnom prevedení tohoto vynálezu sa PRP bez endotoxínu a lipidu získava tak, že sa po spracovaní enzýmom urobí hydrofóbna adsorpcia LPS na HP20 alebo inom vhodnom poréznom styrén-divinylbenzénovom kopolymére alebo podobnom hydrofóbnom médiu, popísanom vyššie.

Kapsulárny polysacharid Gram-negatívnej baktérie sa v x získa ktoroukolvek z početných známych metód, ako sú metódy uvedené v US patente č. 4 695 624 pre Haemophilus influenzae typu b a aniónové kapsulárne polysacharidy z Neisseria m-.eningitis, (meningokokové) polysacharidy zo skupiny A, B^;, C, X, Y, V/135 a 29E a polysacharidy z Escherichia coli, Kl, Kí 2, K13, K89, K92 a Kí 00. Osobitná prednost sa však z polysacharidov dáva predovšetkým polysacharidom, zvoleným zo súboru zahrňujúceho polysacharidy Hib, ktoré sú napríklad popísané v Rosenberg a další, J. Biol. Chem., 236, strana 2845 až 2849 (1961 ) a Zamenhof a další, J. Biol. Chem., 203, strana 695 až 704 (1 953?·

Pri jednom realizovaní tohoto vynálezu sa polyribosylribitolfosfát, Čo je kapsulárny polysacharid z Haemophilus influenzae typu b izoluje fermentáciou tohoto patogéna spôsobom popísaným v US patente č. 4 695 624. Tento patogén sa usmrtí pridaním 1 % timerosalu alebo pridaním približne 0,5 % fenolu. Zvyšky buniek sa odstredia a surový polysacharid sa skoncentruje ultrafiltráciiou, pričom sa získa produkt, ktorý je dalej označovaný ako surový PRP. Výťažok volného PR? sa môže optimalizovat. prevedením lipo-PRP na PRP bez kovalentného lipidu, enzymatickým spracovaním surového PRP vyššie popísaným spôsobom. Môže byt dokonca výhodné pridávat lipázu priamo do fermentačného média alebo v akomkoľvek inom ďalšom stupni.

Tak napríklad sa môže spracovanie enzýmom odložiď až po čiastočnej purifikácii ktorýmkoľvek z nasledujúcich spôsobov spracovania alebo jeho častí alebo po spracovaní, ktoré je ekvivalentné ďalej uvedeným spôsobom spracovania:

1/ Výroba pre-fenolového prášku, pri ktorej sa odstraňujú nečistoty, ktoré sú nerozpustné v 48 % ('objemovo) etanolu, ďalej sa pridá etanol až do obsahu 61 %, aby sa získal polysacharid. Tento polysacharid sa znovu rozpustí v približne IM roztoku chloridu vápenatého a odstránia sa ďalšie, nečistoty,, ktoré sú nerozpustné v 23 % (objemovo) etanolu, potom sa PRP izoluje pridaním etanolu až do koncentrácie 37 % (objemovo) a nakoniec sa získaný produkt trituruje v absolútnom etanole;

Ζ-.Ι

2/ Výroba post-fenolového prášku, ktorá sa realizuje tak, že sa pre-fenolový prášok rozpustí v C,44SM pufru na bázi octanu sodného a vzniknutý roztok sa asi 4 x extrahuje 72 % fenolom, ktorého hodnota pH je tlmená na 6,9 . 0,648M octanom sodným, potom sa realizuje diafiltrácia pre odstránenie fenolu z vodnej fáze a prídavkom chloridu • vápenatého až do asi 0,05M koncentrácie a prídavkom etanolu až do koncentrácie asi 67 % sa izoluje PRP vo forme zrazeniny, ktorá sa ďalej znovu rozpustí v 0,05M roztoku chloridu vápenatého. Odstránia sa nečistoty, ktoré sú nerozpustné v ZO % etanole a vzniknutý post-fenolový PRP sa izoluje, vo forme pelety, ktorá je nerozpustná v 3.7 % etanole a nakoniec sa výsledný produkt trituruje v absolútnom etanole.

3/ Výroba PRP z ” nízkej frakcie pomocou spracovania fosfolipázou, po ktorej sa vyššie uvedeným spôsobom odstráni proteín a endotoxín.

4/ Výroba PRP bez endotoxínu, akýmkoľvek vhodným spôsobom, prednostne spracovaním pomocou živice HP20, popísaným vyššie a v US patentoch č. 5 01 9 502, 5 039 610 a v patentovej prihláške USA č. 595 722.

Polysacharid, vyrobený spôsobom podľa tohoto vynálezu je bežnými analytickými metódami chemicky nerozlišiteľný od polysacharidu, ktorý sa získa odstránením endotoxínu ä kapsulárneho polysacharidu s obsahom lipidu selektívnou frakcionáciou za použitia alkoholu. V tabuľke I sú fyzikálno-chemické vlastnosti PRP, získaného spracovaním pomocou PLD,porovnane s vlastnosťami PRP, získaného selektívnou frakcionáciou za použitia alkoholu.

	PR? spracovaný pomocou PLD	PRP, z frakcionácie pomocou alkoholu
obsah ?A % hm. podlá plynovej chromatografie	0,012	0,012
KD	0,5	0,5
endotoxín	0,01	0,6

Bola urobená podrobná Štúdia k optimalizácii všetkých stupňov výrobného postupu PRP. Na základe týchto štúdií sa dospelo k výrnbnej schéme, ktorá je znázornená na obr. 3.

A:. Optimalizácia reakčných podmienok pri reakcii s enzýmom

Bola vykonaná séria pokusov s cielom mapoval citlivosť v

aktivity enzýmu pri odstraňovaní lipidov z práškovitej nízkej frakcie, v závislosti na obsahu metylterc.butylétéru, Tritonu, teplote, koncentrácii substrátu, množstve enzýmu a reakčnej dobe, s účelom definoval vhodné rozmedzie pracovných podmienok. Vo všetkých prípadoch zodpovedajú doporučené podmienky maximálnej úrovni zníženia obsahu mastných kyselín alebo sa k: tejto úrovni blížia.

B. Optimalizácia spracovania pomocou pryskyrice HP20

Boli vykonané štúdie s. cielom zabezpečil lepšiu reguV v láciu hodnoty pH v priebehu stupňa odstraňovania LPS pomocou HP2 0, g účelom minimalizácie potenciálnej hydrolýzy hlavného reťazca PRP. Tieto štúdie zahŕňali predbežnú ekvilibráciu živice dvoma objemami roztoku DOC/ citrát sodný, sledovanie pH v priebehu kontaktovania s čerstvým roztokom pufru, ako i použitie Tris-pufrovaného roztoku DOC/citrát sodný a kontinuálne sledovanie hodnoty pH. Bez predbežnej ekvilibrácie alebo tlmenia roztoku DOC/ citrát sodný sa hodnota pH v priebehu trojhodinovej diskontinuálnej adsorpcie posunula až na 9,2 až 9,5. V prípade použitia predbežnej ekvilibrácie bol posun pH obmedzený hodnotou 8,8. V prípade použitia predbežnej ekvilibrácie živice a tiež pufrovania roztoku 25mM Tris-pufrom s pH 8,0, bol posun hodnoty pH ešte ďalej minimalizovaný a bolo možné v priebehu diskontinuálnej adsorpcie udržovat dobre regulovanú hodnotu pH pod 8,5. Tiež boli skúmané iné podmienky spracovania PRP živicou HP20. Analýza mastných kyselín plynovou chromatografiou, ako i dáta LAL ukazujú, že optimálne odstránenie endotoxínu bolo dosiahnuté pri koncentrácii 5 až lOmg PRP/ml, namiesto predtým používanej koncentrácie 2,5 mg PRp/ml. Výsledky tiež ukázali, že najlepšie zloženie roztoku zodpovedá koncentrácii Ľ.0C 0,5 citrátu 3 % a Tris-pufra s pH 8,0 50 nnnol/1. V dôsledku toho boli všetky nasledujúce spracovania pomocou HP20 realizované za použitia živice predbežne.ekvilibrovanej v 50mM Tris-pufru, 0,5 % DOC, 3% citrátu, pri pH roztoku 8,0 a koncentrácii PRP 5 až 10 mg/ml.

C. Vyhodnotenie diafiltračného stupňa

Po spracovaní pomocou živice HP20 je PRP produkt obsiahnutý v roztoku, ktorý obsahuje Tris-pufer, DOC a, citran sodný a je potrebné urobiť výmenu produktu diafiitráciou do čistého- vodného roztoku. Pri diafiltrácii roztoku PRP, spracovaného HP20 boli skúšané dve jednotky Pellicon, jedna s membránou z regenerovanej celulózy a druf é há s polysulfonovou membránou, spolu s diafiltráciou patrónu s polysulfónovými dutými vláknami. Membrána z regenerova nej celulózy vykázala väčšiu rýchlosť odpudzovania DOC, v porovnaní s oboma polysulfónovými membránami. Polysulfónová membrána Pellicon však vykazovala podstatne vyšší tok. Dáta, vzťahujúce sa k nútenému toku a odpudzovaniu DOC naznačujú, že by bolo účinnejšie používať jednotku Prostack namiesto v súčasnej dobe používané technológie s membránou tvorenou dutými vláknami. Na základe porovnania plochy membrány, doby postupu a cenových nákladov boL urobený záver, že. najlepšiu výkonnosť by poskytla /

jednotka Prostack s polysulfonovou membránou.

Vyššie uvedené štúdie intenzívneho produkčného postupu pre získavanie PRP viedli k vyvinutiu optimalizovaného postupu zahŕňajúceho reakciu s enzýmom, 4-násobnou extrakciou fenolom, spracovanie pryskyricou HF20, diafiltráciou. a zrážanie alkoholom, pričom každý z týchto stupňov bol analyzovaný, z dôvodu, aby bolo nájdené vhodné rozmedzie pracovných podmienok. Tento intenzívny postup je sumarizovaný na obr. 3.

Polysacharid, vyrobený týmto spôsobom, je užitočný pri výrobe očkovacích látok, obsahujúcich volný alebo konjugovaný bakteriálny kapsulárny polysacharid. Konjugované polysacharidy, predovšetkým konjugáty PRP/OMPC sú vhodné pre malé deti,z dovodu, aby sa zabránilo vzniku choroby, na na rozdiel od. voíného PRP, ktorý nemusí vyvolať dostatočnú imunitnú odpoveď. Výroba konjugátu z polysacharidu, získaného spôsobom podlá tohoto vynálezu, sa môže robiť spôsobom uvedeným v popise a príkladoch US patentu č. 4 695 624. Uvedená citácia predstavuje náhradu za prenesenie celého jeho obsahu do popisu tohoto vynálezu.

Vynález je bližšie objasnený v nasledujúcich príkladoch realizácie. Tieto príklady majú výhradne ilustratívny charakter a rozsah vynálezu v žiadnom ohlade neobmedzujú.

Príklad 1

Výroba kapsula, influenzae rneho polysacharidu z baktérie Haemophilus typu b

Fermentácia

Stupeň A :

Tvorba inokula a očkovacej kultúry trubičky s lyofilizovsnou baktériou Haemophilus typu b ( kultivácia: Ross 768, vzorka získaná cd State University of New ľork) sa_i susper.duje v sterilného média pre inokulum Haemophilus (vid ďalejj suspenzia sa rozdelí na 19 misiek s čokoládoPo 20 hodinách inkubácie pri 37° C vo sa nárast na každej miske resuspenduje pre inokulum Haemophilus a suspenzia sa

Obsah ínfluenzae univerzity ml a vzniknite vým agar^m (BBL). sviečkovej nádobe v 1 až 2 ml média spoji

Zloženie	. ,. ..... . . , + média pre mozuium .-.aemocni-us i/,
sójový peptón	< n w
NaCl	C ✓
NaH2P04
:ía2HPOÄ	13,7
KjHPO^	2,5
destilovaná voda	do celkového objemu

^Hodnota pH rozotku sa nastaví na delovú hodnotu 7,2 i 0,1 (typická hodnota pH je 7,23) a roztok sa sterilizuje 25 minútovým zahrievaním v autokláve na teplotu 121° C

Stupeň B : Dvojlitrové Erlenmeyerove banky bez priehradok

Vždy jedna tretina resuspendovaných baktérií zo stupňa A (vyššie.) sa použije pre inokuláciu jednej z celkových troch dvojlitrových baniek, z ktorých každá obsahuje približne 1,0 1 úplného očkovacieho a produkčného média Haemophilus (viď ďalej) . Banky sa inkubujú približne 5 hodín pri 37° C v rotačnej trepačke pri frekvencii otáčania 200 min Ma konci tejto inkubácie sa dosiahne obvykle hodnota optickej hustoty ODggg 0,37.

Zloženie úplného očkovacieho a produkčného média Haemophilus
NaH2PO4 NaoHPOÄ. sojovy pepton	g/1 13,7 g/1	10,0	g/1
diafiltrát kvasinkového extraktu (1)		1 0,0	g/1
K2HPO4 NaCl	2,5 g/1	5,0	g/1
glukóza ( 2 )		5,0	g/i
nikot ínamidad en í nd i nukle ot id NAC ( 3 ) Hemin ( 4 )		2,0 mg/1. 5,0 mg/1

Soli a sójový peptón sa rozpustia v malých objemoch horúcej, apyrogénnej vody a každý roztok sa upraví na konečný objem prídavkom ďalšej horúcej apyrogénnej vody. Potom sa sterilizujú fermentory alebo banky asi 25 minút pri 121° C · Fermentory alebo banky sa ochladia a potom sa do nich pred inokuláciou uvedie diafiltrát kvasinkového extraktu(1) , glukóza (2). NAD (3) a Hemin (4).

►Λ (1) Diafiltrát kvasinkového extraktu

00 g extraktu z pivných kvasníc ( Amber) sa rozpustí vil destilovanej vody a roztok sa uitrafiltruje cez duté vlá-cna Amicon DC-30 za použitia patrónov HluX50 (vylučovacia hranica molekulovej hmotnosti je 50000 Dalton). Fiitrát sa zachytí a nechá prejst membránou 0,22 /um, vo forme sterilného produktu.

(2) Glukóza sa pripraví vo forme sterilného 25 % roztoku vo vode, destilovanej v sklenenej aparatúre.

( 3 ) Zásobný, roztok NAD s koncentráciou 20 mg/ml sa sterilizuje filtráciou cez filter Millipore ( s pórami velkosti 0,22/um) a pridá za aseptických podmienok tesne pred inokuláciou.

(4) Zásobný roztok Heminu 3X sa pripraví rozpustením

200 mg tejto látky v 1 0 ml. 0,1M roztoku hydroxidu sodného, pričom objem vzniknutého roztoku sa upraví destilovanou sterilnou vodou na 1 00 ml. Vzniknutý roztok sa 2o minút sterilizuje pri 121° C a potom sa za aseptických podmienok pridá pred inokuláciou k výslednému médiu.

Stupeň C : 70-litrový očkovací fermentor

Tri litre produktu zo stupňa B sa použijú pre inokuláciu 70-litrového fermentora, obsahujúceho 41,4 1 úplného očkovacieho a produkčného média Haemophilus ( vyrobeného vyššie popísaným spôsobom J a 17 .ml protipenového prostriedku UCON B625. Začiatočná hodnota pH je 7,4.

Fermentačná zmes sa udr:žuje na teplote 37° C za miešania s frekvenciou otáčania 100 min - a sleduje sa optická hustota(OD) a hodnota pH, dokiaľ sa nedosiahne typická hodnota OD 0,39 (za asi 5,5 hodiny),

Stupeň D : 800-litrový produkčný fermentor

Približne 40 1 produktu zo stup^ňa C sa použije na inokuláciu 800-iitrového fermentora, obsahujúceho 570 1 produkčného média ( vyrobeného vyššie popísaným sposobom), upraveného na potrebný objem a 72 ml protipenového prostriedku UCON LBÓ25.

Fermentačná zmes sa udržuje pri 37° C za miešania s frekvenciou otáčania 100 min \ pričom hodnota OD a v pH sa skúša približne každé 2 hodiny. Ked sa tieto hodnoty v .priebehu 2 hodinovej periódy príliš .nezmenia, fermentácia sa zakončí (typická hodnota výslednej OD je 0,54 po 1 2 hodináchý.

Zber a inaktivácia

Približne 600 1 výslednej zmesi sa inaktivuje a zbiera v zabijačej nádrži, obsahujúcej 12 11% roztoku timerosalu.

Č í r e n i e

Po asi 8 hodinách inaktivácie pri 4° C sa várka odstredí v 1 02 mm miskových centrifúgach Sharples, pričom sa udržuje taký prietok, aby sa produkt udržoval číry (prietok sa mení v rozmedzí od 1,3 do 3,0 1 x min b. Supernatant získaný pri centrifugácii (15000 min ^x ) sa použije pre izoláciu produktu.

I z o i á	c	i a a k o n a	e n t r á c ia
u	1	tra filtra	c i o u
Supernatanty z	2	produkčných ferme	ntácií sa spoja
a skoncentrujú pri 2	a	ž 8° C v ularafil	tračnej jednotke

Romic_On za použitia 10 patrónov s dutými vláknami (vylučovacia hranica molekulovej hmotnosti 50000 Dalton, plocha membrány 25,6 m } tak, aby sa približne po 4,5 hodiny 1200 1 skoncentrovalo na 32,5 1. Filtrát sa zlikviduje.

Z	r á ž a n i	e	4 8% e 6	1 %
	e t a	n	o 1 o m
32,5	1 retentátu	z	uitrafiltračnej	jednotky Ro-

micon sa v priebehu jednej hodiny za miešania pri 4° C prikvapká J0 1 95 % etanolu, pričom konečná objemová koncentrácia etanolu je 48 %. Zmes sa aalšie 2 hodiny mieSa pri 4 C, aby sa zaistilo úplné vyzr.ažanie a supernatant sa oddelí v jedinej 102 mm centrifúge Sharples, ktorá pracuje s frekvenciou otáčania 1 5000 min^-J·. Prietok je 0,27 1 x min ¹. Nerozpustná peleta sa zlikviduje a k vyčarenej tekutine, sa v priebehu jednej hodiny pridá 20,8 1 95 % etanolu, čím sa koncentrácia etanolu upraví na 6'1 %. Zmes sa potom ešte 3 aalšie hodiny mieša, aby sa zaručilo úplné vyzrážanie.

Získanie druhej p e lety

Vzniknutá zrazenina, ktorá je rozpustná v 48 % eta nole, ale nerozpustná v 61 % etanole sa oddelí centrifugáciou v 102 mm centrifúge Sharples, Dracujúcej pri frekvenčil otačania 15000 min ( prietok 0,o2 1 x mm ~ ) a 61 %etanolový supernatent ss zlikviduje. Výťažok surové ho produktu, ktorý tvorí vlhkú pastu, je 0,377 kg. Tento produkt sa označuje názvom surový PRP.

Extrakcia chloridom vápenatým

377 g látka, ktorá je nerozpustná v 61 h etanole sa v Daymaxovej dispergačnej nádobe zmieša pri teplote 2 až 8° C s 6,5 1 chladnej vody, predestilovanej v sklenenej aparatúre. Ku vzniknutej zmesi sa pridá 6,5 1 chladného 2M roztoku chloridu vápenatého vo vode a zmes f v ktorej konečn.á koncentrácia chloridu vápenatého 1,0 mol/i) sa extrahuje pri 4° C po dobu 15 minút. Nádoba sa potom prepláchne 2 1 1M vodného roztoku chloridu vápenatého, čím sa konečný objem upraví na 1 5 1.

Zrážanie 2 3% etanolom

Koncentrácia etanolu v 15 1 extraktu chloridu vápenatého z prechádzajúceho stupňa sa prikvapkávaním 95 % etanolu celkove 4,48 1 za miešania, pri 4° C, v priebehu 30 minút upraví na 23 %. Po ďalšom 17 hodinovom miešaní sa zmes odstreďuje po dobu 6,5 hodiny pri 4° C pomocou ultracentrifúgy K2, pracujúcej pri frekvencii otáčania 25000 min”^ ( prietok 165 ml x min^ ) . Supernatant. sa dekantuje cez gázovinu, aby sa odstránila lipidovitá látka, ktorá sa v ňom vznáša a nerozpustná peleta sa zahodí.

Z

r

á

ž

a

n i

e

3

7

Qi r-

e

4> U

a

n

O

1

o m a i z o

1

á

c

i

a

s

u r

0

v

α

h

0

p

a

s

x b

o v i t é h o

P

r

O

d

u

k

X U

u

Koncentrácia etanolu v supernataňte, tvorenom roztokom v 23 % etanole, sa prídavkom 4,33 1 95 % etanolu upraví na 37 %. Etanol sa prikvapká za miešania v priebehu 3u minút. Zmes sa nechá 1 hodinu štát za miešania a potom 14 hodín bez miešania, aby sa zaistilo úplné vyzrážanie. Výsledná zmes sa centrifuguje v 102 mm odstredivke Sharples, pracujúcej pri frekvencii otáčania 15OOU min (prietok 0,2 1 x min a tak sa získa peleta surového polysacharidu. Tento produkt je ďalej označovaný názvom pre-fenolóvý prášok.

Triturácia

Peleta z centrifugácie sa prevedie do miesiča Waring Blender s objemom 15,2 i, ktorý obsahuje 1 i absolútneho alkoholu a obsah miesiča sa 30 sekúnd miesi pri najvyššej rýchlosti. V miesení sa pokračuje v režime 30 sekúnd zapnuté, 30 sekúnd vypnuté, tak dlho, pokiaľ sa nezíska tvrdý biely prášok. Tento prášok sa oddelí na Buchnerovej nálevke s teflónovým filtračným kotúčikom q postupne premyje. in situ dvoma jednolitrovými dávkami absolútneho etanolu a dvoma dvojlitrovými dávkami acetónu. Potom sa vzniknutá látka suší za vákua pri 4° C po dobu 24 hodín. Získa sa 69 g (sušina) produktu.

Extrakcia fenolom g suchej látky z trituračného stupňa sa resuspenduje v 12 1 0,488M octanu sodného s pH 6,9 v Daymaxovej dispergačnej nádobe. Roztok octanu sodného .sa ihneď pripraví pridaním 900 ml 0,488M roztoku octanu sodného s pH 6,9 do 2,27 kg fenolu (kryštalický produkt Mallinckrodt ) v 20 1 tlakovej nádobe a zmes sa mieša tak dlho, dokiaľ sa všetky látky nerozpustia. Každý fer.olový extrakt

- ‘ -1 sa odstreduje 2,5 hodiny pri frekvencii otacania 30000 mm a 4° C v ultracentrifúge K2 ( Electonucleonics) , aby sa rozbila emulzia. Vytekajúci vodný prúd sa ešte 3 x extrahuje- rovnakým spôsobom pomocou 2 1 čerstvého vodného roztoku fenolu. Fenolové fázy sa zlikvidujú.

Diafiltrácia

Vodná fáza z vyššie uvedených extrakcií fenolom (17,6 1) sa zriedi 300 1 chladnej vody predestilovanej v sklenenej aparatúre a roztok sa diafiltruje pri 4° C v ultrafiltračnom zariadení Amicon DC-30 za použitia troch patrón H10P10. Jednotka Amicon sa prepláchne a preplach sa pridá k retentátu, takže konečný objem je 17,5 1. Ultrafiltrát sa zahodí.

Zrážanie 6 7%. etanolom

K 17,5 1 dialyzátu z predchádzajúceho stupňa sa pridá 0,438 1 2,0M roztoku chloridu vápenatého (konečná koncentrácia chloridu vápenatého je 0,05 mol/1) a koncentrácia etanolu vo vzniknutej zmesi sa nastaví na 67 % prikvapkávaním 95 % etanolu ( celkove 35,88 1, v priebehu 1 hodiny? k rýchle miešanému roztoku., Po 4 hodinách miešania a 12 hodinách ďalšieho státia pri 4° C sa číry supernatant pretiahne násoskou a zrazenina sa pri 4° C odstredí 45 minútovým odstreďovaním v 102mm centrifúge Sharples, ktorá pracuje pri frekvencii otáčania 15000 min¹. Výsledná polysacharidová peleta sa trituruje v miesiči Waring Blender v objeme 15,2 1, ktorý obsahuje 2 1 absolútneho etanolu v režime 30 sekúnd zapnuté, 30 sekúnd vypnuté. Produkt sa oddelí na Buchnerovej nálevke s teflónovým filtračným kotúčikom a postupne premyje in situ štyrmi jednolitrovými dávkami absolútneho etanolu a dvoma jednolitrovými dávkami acetónu. Potom sa vzniknutá látka suší za vákua pri 4⁰ C po dobu 20 hodín na vyváženej miske. Získa sa 39 g suchého prášku, ktorý je ďalej označovaný názvom post-fenolový prášok.

J j

Príklad

Výroba surového PRP z fenolom usmrtených baktérií Haemophilus influenzae typu b

Rovnaký fermentačný postup, aký je popísaný v príklade 1, sa opakuje, len s tým rozdielom, že namiesto inaktivácie pomocou 1 % roztoku chimerosalu sa patogén usmrtí prídavkom u,5 % roztoku fenolu. Inkubácia buniek vo fenole sa robí po dobu 1 hodiny a potom sa bunky prevedú do zabíjacej nádrže, kde sa udržujú najmenej po dobu 1 hodiny. Pre-fenolový prášok sa člalej vyrába rovnakým postupom, aký je popísaný v príklade i.

Príklad J

Výroba nízkej frakcie a získavanie PRP bez lipidu z tejto frakcie.

Po výrobe post-fenolového prášku sposobom popísaným v príklade 1 sa zostávajúci endotoxín odstráni selektívnou frakcionáciou alkoholom, za vzniku PRP prípravku, ktorý neobsahuje endotoxín a PRP frakcia obsahujúca endotoxín, ktorá je označovaná termínom nízka frakcia. Pritom sa postupuje tak, že sa post-fenolový prášok rozpustí v 0,05M roztoku chloridu váoenatého v koncentrácii 2,5 g/i, čím sa zaistí dvojmocný protiión ako pre endotoxín, tak pre PRP. Potom sa ku vzniknutému roztoku pridá alkohol, až do dosiahnutia objemovej koncentrácie 26 %. Teplota sa ekvilibruje na konštantnú hodnotu v rozmedzí od 2 do 4° C a alkohol sa pridáva po dávkach tak dlho, dokiai sa PRP nezačne zrážat ( až do bodu zákalu?. Zákal sa sleduje na odoberaných vzorkách.

Etanol (95 %)sa pridáva až do bodu zákalu a potom sa pridá ešte ďalších 1,9 %. Vzniknutá zrazenina predstavuje nízku frakciu. p₀ pridaní alkoholu sa roztok hneď odstredí, a'oy sa zrazená nízka frakcia odstránila. Lipo-PRP, ktorý je obsiahnutý v tejto frakcii sa ďalej spracováva spôsobom podlá vynálezu, z dôvodu získania PRP bez lipidu, ako je to podrobne popísané ďalej. K supernatantu sa pridá ďalší alkohol (až do 3S % objemových). Požadovaná zrazenina sa oddelí usadzovaním a/alebo centrifugáciou a vysuší na konečný prášok. Typický výťažok post-fenolového prášku v tomto stupni pri obsahu alkoholu 1,2 až. 2,0 % nad koncentráciou zodpovedajúcou bodu zákalu, je 25 až 40 %. Zvyšok PRP je obsiahnutý v nízkej frakcii.

Nízka frakcia, získaná po realizácii selektívneho frakcionačného stupňa za použitia etanolu, ktorá obsahuj zrazený lipopolysacharid a polyribosylribitolfosfát sa ďalej spracováva tak, že sa k roztoku nízkej frakcie koncentrácie. 20 g/1 v 750 ml pufru (1 OmM Tris, 5mM CaC^, 4,5mSí Triton X-100, pH 7,4, v zmesi s rovnakým objemom zmesi metylterc.butyléter/etanol v pomere 9:1) pridá 3000 U fosfolipázy D. Reakcia sa nechá prebiehal po dobu 2,5 hodiny a potom sa látka štyrikrát extrahuje fenolom za použitia jedného dielu fenolu (vo forme 72 % roztoku v octane sodnom), vztiahnuté na 2,6 dielov . vodného produktu.

Endotoxín sa odstráni z nízkej frakcie spracovanej PLD zmiešaním s 0,5 % deoxycholátom sodným a 3 % citrátom sodným s pH: 8. Pridá sa živica HP20 v množstve 30 g pryskyrice na gram polysacharidu ( živica sa pred použitím premyje apyrogénnou vodou). Volné perly sa miešajú s roztokom v rotačnej trepačke po dobu 3 hodín pri 4° C. Po miešaní sa perly oddelia z roztoku vo filtračnej nálevke z nerezovej ocele. Získaný filtrát sa diafiltruje cez polysulfónovú membránu Pellicon s vylučovacou hranicou molekulovej hmotnosti 10000 Dalton (povrchová plocha 0,093 m ) proti apyrogénnej vode, pričom sa udržuje odhadnutá koncentrácia polysacharidu na hodnote rovnajúcej sa alebo nižšej ako 2,5 mg/ml, aby sa odstránil detergent a chelatačné. činidlo. Získa sa retentát, ku ktorému sa pridá 2M roztok chloridu vápenatého až do konečnej koncentrácie 0,05M. Polysacharid sa zrazí ..z roztoku nadbytkom 95 % etanolu. Zrazenina sa odstrekuje po dobu 30 minút pri zrýchlení 13000 x g, peleta sa trituruje s absolútnym etanolom a acetónom a potom sa za vákua vysuší. Výsledný prášok sa prenesie do zásobníka na vzorky a zmrazí sa pri -70^σ C. Látka spracovaná živicou vykazuje zníženie hladiny endotoxínu, polysacharidu a lipo-PRP mastných kyselín podlá plynovej chromatografie (GC), uvedenej v tabuíke 2.

Tabulka 2

Hodnota zistená pri skúške LAL (EU^ug) začiatočná konečný prášok

240

0,12

Polysacharid. (g)
začiatočný	15
konečný prášok	10,2

Mastné kyseliny (%) začiatočné konečný prášok

0,4

0,009

Pri tomto postupe sa reprodukovateľné dosahuje výťažok produktu približne 68 %, ktorý je vyjadrený ako hmotnostný pomer finálneho produktu a východiskovej látky.

Získaný produkt nie je možné na základe fyzikáino-chemických vlastností odlíšiť od PRP produktu, ktorý sa získa selektívnou frakcionáciou za použitia alkoholu.

Delipidácia pre-fenolového PRP prášku

A. Reakcia s fosfolipázou D

Pre-fenolový PRP prášok (20,g, pripravený podľa príkladu 2 alebo príkladu 3) sa solubi.lizuje v 1 ,33 1 1 OmM Tris, 5mM CaC^, 4,5mM Tritonu X-100 s pH 7,4. K solubilizovanému PRP sa pridá 1,33 1 zmesi metylterc. butyleter/etanol v pomere 9 : 1. Ďalej, sa pridá fosfolipáza D (Genencor, celkove 3000 jednotiek, špecifická, aktivita 70' U/mg, 15 U/100 mg PRP?. Reakčná zmes sa mieša pri frekvencii otáčania 240 min po dobu 3 hodín pri 35°

Po reakcii sa organická fáza nechá oddeliť od vodnej fáze (v priebehu 30 minút pri 25 až 35° C) a spodná vodná fáza sa zachytí. Organická fáza sa reextrahuje 0,266 1 vody, vodná fáza sa nechá 30 minút usadzovať a potom sa spojí s prvou vodnou fázou, ktorá vznikla pri extrakcii, takže celkový objem vodnej fáze je 1,560 1.

Fenol (1,5 kg ) sa v tme rozpustí ekvilibráciou s 590 ml 0,46'8M roztoku, octanu sodného pH 6,9 . Vodná fáza sa extrahuje celkove 4 x za použitia jedného dielu fenolu na 2,6 dielov post.-fenolovej vzorky, vo forme vodného produktu.

B. Spracovanie pomocou živice HP20

Živica HP20 (Mitsubishi Kasei, 300 g ) sa predbežne ekvilibruje v 1300 ml 50mM Tris, 0,5 % DOC, 3 % citrátu sodnom s pH 8,0 (ekvilibračný pufer pre H?20/. K 1060 ml post-fenolovéj vzorky sa pridá 1060 ml 1 OOrnM Tris, 1 % DOC, 6 % citrátu sodného s pH 8,0, čím sa celkový objem upraví na 2120 ml. Vzniknutá vzorka sa potom 2 hodiny mieša pri 4° C trepaním s preekvilibrovanou živicou HP2u. Ži vica sa odfiltruje v kolóne, ktorá sa potom prepláchne 200 ml ekvilibračného pufru pre HP20. Všetok výtok z HP20 sa potom skoncentruje na 1 1 a diafiltruje proti 1 0 I chladnej apyrogénnej vody.

C. Izolácia produktu

K 1 1 vzorky sa pridá 25 sl 2M roztoku chloridu vápenatého. Zrazenina sa oddelí 30 minútovou centrifugáciou pri 4° C a peleta sa trituruje s 20 ml 1 00 % etanolu. Etanol sa odfiltruje a PRP prášok sa vysuší pornom cou acetónu. Celkový výťažok delipidovaného PRP je 9,6 g.

v

Získaný produkt má vlastnosti uvedené v tabulke 3.

T. a b u Ϊ k a 3

	LAL (EU/ug)	PRP (b)	mastné kyseliny ( % )
počiatočná	2400	20	1,9
konečná	0,48	9,6	0,005

Výroba PRP, spracovaného fosfolipázou A2 a fosfolipázou D, konjugácia s OMP z Neisseria meningitidis B a imunogenicita vzniknutého konjugátu

A. Enzymatické spracovanie

Post-fenolový prášok, spracovaný živicou HP20 (hmotnosť prášku J g) sa solubilizuje v 600 mi fosfátového pufru s pH 7,1. s obsahom 0,1 % deoxycholátu a 33 % éteru, na koncentráciu PRP 5 mg/ml, K roztoku sa pridá fosfolipáza ( z porcínu; 70 U/mg, vztiahnuté na PRP; špecifická aktivita 600 U/mg) a fospoflipáza D (zo Streptomyces chromofuscus; 0,2 U/mg, vztiahnuté na PRP; špecifická aktivita 70 U/mg), pričom v oboch prípadoch sa jedná o výrobky firmy Boehringer Mannheim, Inc. a reakcia sa nechá za miešania prebiehať 3 hodiny pri 25° C. Reakčné produkty sa extrahujú 600 ml hexanu a potom sa urobí 30 minútové odstrelenie pri 20° C. Organická fáza sa zahodí, zalial čo vodná fáza sa skoncentruje na 300 ml a diafiltruje proti 3000 ml vody. Vzorka sa zriedi na 600 ml a konečnou koncentráciou chloridu vápenatého 5 mmol/1 a PRP sa zrazí prídavkom etanolu až do dosiahnutia koncentrácie 40'%. Získa sa 2,6 g PRP pre konjugáciu.

B. Derivatizácia PRP, spracovaného kombináciou PLA.j a PLD

Post-HP20 PRP (1,9 g), spracovaný vyššie uvedeným spôsobom pomocou kombinácie HLA? a PLD, sa solubilizuje v 57 ml sterilnej vody. Dihydrát kyseliny šťavelovej(0,31 g) sa rozpustí v 15,5 ml sterilnej vody e ku vzniknutému roztoku sa pomaly pridá solubiliz-ovaný pRp. Hodnota pH sa nastaví na 5 pomocou 40 % roztoku tetra-n-butylamóniumhydroxidu ( 5 ml-) a potom sa ku zmesi pridajú 2 ~i 1« roztoku tetra-n-butylamoniumhydroxidu. Roztokom kyseliny štave^o

- 37 ve.j sa urobí titrácia až do pH 6,93. Vzniknutý roztok sa prefiltruje a filter sa prepláchne, Čím sa získa celkový objem prípravku 178 ml PRŕ-Bu4N.

K tomuto roztoku sa pridá 67 ml dimetylformamidu a v rotačnom odparovači sa objem zmesi zníži na 68 ml. Trikrát sa pridá cialáí dimetylformamid ( 67 ml ) , pričom každý raz sa objem upraví na 67 ml. KarbonyldiimičLazol (0,22 g ) sa rozpustí v dimetylformamide a vzdknutý roztok sa pomaly pridá pod atmosférou dusíka k roztoku PRP, potom sa zmes nechá 35 minút stárnu*. 1,4-butandiamíndihydrochlorid ( BuA_2?) (15,96 g) sa rozpustí v 456. ml sterilnej vody a pH vzniknutého roztoku sa pridaním 5 ml 50 % roztoku hydroxidu sodného nastaví na 10,39. Potom sa BuA₂ pomaly pridá k PRP-CDZ a zmes sa udržuje pri asi 12° C.

Po asi 5 minútach sa pridá kyselina fosforečná ( 50 ml) a hodnota pH sa prikvapkávaním 5 ml 68 % kyseliny fosforečnej nastaví na 7,02. Celkový objem zmesi v tomto okamihu je 530 ml.

Vzorka sa skoncentruje na 96 ml v ultrafiltračnom systéme Amicon, ktorého vylučovacia hranica molekulovej hmotnosti je 10000 Dalton. Vzorka sa potom diafiltruje proti 1520 ml fosfátového pufru. s pH 7. Ultrafiltračný systém sa premyje 3 x 25 ml alikvotnými dielmi fosfátového pufru a premývacie kvapaliny sa spoja s PRP-BuA₂ retentátom, pričom sa dosiahne celkový objem 102 ml. Potom sa k PRP-BuA₂ pridá boritan sodný f roztok v koncentrácii 3,95 %, 31,8 ml).

Hodnota pH sa pridaním 2 ml 2,5N roztoku hydroxidu sodného nastaví na 9,2. Potom sa pridá brómacetylchlorid (1,71 ml). Jeho pridávanie, se robí pomaly a hodnota pH sa pritom udržuje na 9,2 pomocou 2,5N roztoku hydroxidu sodného. Potom sa pH zmesi nastaví 68 % kyselinou fos-

forčnou na 7,0 f 0,5 ml). Prípravok ne bázi PKP-BuA„-BrAc sa skoncentruje na 95 ml v ultrafiltračnom systéme Amicon, potom sa urobí diafiltrácie proti 1 520 ml fosfátového pufru s pH 7, pričom objem zmesi sa diafiltráciou nastaví na 38 ml. Systém sa premyje fosfátovým pufrom a premývacie kvapaliny sa spoja s hlavným produktom. Získa sa 79,5 ml prípravku na bázi PRp-BuA2^-BrÄc.

C. Príprava OMPC-SH

OMPC z Neisseria meningitidis typu b (1,1 6 g) sa solubilizuje v 116 ml sterilnej vody a ráztok sa diafiltruje proti 600 ml borátového pufru. Tak sa získa zmes s celkovým objemom 159 ml. Kyselina etyléndiamíntetraoctová ( EDTA) (0,8 g) a ditiotreitol (DTT)(0,12 g) sa rozpustí v sterilnom borátovom pufre a vzniknutý roztok sa pridá k solubilizovanému proteínu. N-’acety lhomocysteíntio4>

lakton (1,03 g) sa rozpustí v sterilnej vode a vzniknutý roztok sa pridá ku zmesi proteínu, EDTA a DTT, potom sa vzniknutá zmes nechá 22 hodín reagovať.

Roztok tiolovaného proteínu sa potom skoncentruje na 1 16 ml a diafiltruje proti 1440 ml fosfátového pufru s pH 8. Potom sa vzorka skoncentruje na výsledný objem 127 ml. Stanovenie proteínu v tomto okamihu ukazuje, že výsledná vzorka obsahuje 6,75 mg/ml proteínu. Ellmanovým stanoveném sa zistí, že na-1 mg proteínu je viazané 0,3/imoi skupín SH.

D. Konjugácie derivatizovaného PRP a OMPC-SH

Hodnota pH roztoku PRP-BuÄ2-BrAc sa nastaví 2,5N roztokom hydroxidu sodného na 7,9. K 72 ml vzorky

PRP-BuA„-BrAc s S-	upravenou hodnotou,pH sa pridá všetok
dolovaný OwIFC,	pripravený podlá odstavca B a pod atmos
férou dusíke sa	nechá 19 hodín prebiehať konjugácia.

Konjugát sa skoncentruje na i 70 ml· a potom nasleduje, diafiltrácia proti 1700 mi fosfátového pufru s pH 7 a ďalšia diafiltrácia proti 1640 ml fosfátového pufru s pH 8. Výsledný objem konjugátového prípravku je 231 ml.

Nezreagované br óma c etylénov é skupiny konjugátu sa blokujú pridaním N-acetylcysteamínu <0,95g vo fosfátovom pufre s pH 8 ) a reakcia sa nechá prebieha! po dobu 18 hodín. Blokovaný konjugátový prípravok sa skoncentruje na 170 ml a diafiltruje proti 2550 ml pufru TED. Konjugát sa nechá stárnut cez noc a potom sa diafiltruje proti druhej 2550 ml dávke pufru TED. Konečný objem vzorky je 285 ml.

V paralelnom experimente sa nechá 2,31 g PRP získaného selektívnou frakcionáciou za použitia alkoholu, konjugovat vyššie popísaným sposobom, za vzniku 330 ml konjugátového prípravku. Pri paralelne robených analýzach fyzikálno-chemických vlastností oboch konjugátov sa medzi nimi nezistia žiadne rozdiely. Robí sa analýza chromatografiou SEC (size exclusion chromátography), analýza pyroge, analýzy na PRP/proteín a zisťovanie imunogenicity,

E. Imunogenicita konjugátu u mláďat opice Rhesus

Podlá stanovenia, robenom na mľáäatách opice Rhesus spôsobmi, ktoré popísali Velia a Ellis [pediatrie Res. 29, 10, (1981)J a Velia a ďalší [Pediatrics Supplement, 85, 658 (1990)] je konjugátová očkovacia látla ₍ obsahujúca enzymaticky spracovaný PRP bez lipidu, plne imunogénna.

v

Konjugát bez lipidu vykazuje porovnateľnú imunogenicitu s kontrolnými vzorkami, ktoré boli vyrobené za použitia PRP,získaného selektívnou frakcionáciou za použitia alkoholu, po 42 dňoch a to ako v prípade použitia vodných prípravkov (15yug), tak v prípade použitia prípravkov s hydroxi- 40 dom hlinitým (1 Mg) <viď tabuľky 4 a 5 ) · Ako je zrejmé z tabuľky 5, dosiahne sa za použitia vodnej očkovacej látky, na bázi produktu spracovaného enzýmom a neobsahujúcom lipid geometrický ·. stredný· titer (GMT) u troch zvierat 10,9/Ug/ml.

Tabuľka 4

Imunogenicita Hib konjugátov bez lipidov, “ú^mlááat opice Rhesus za použitia kvapalného prípravku adsorbovaného na hydroxide hlinitom

Hib konjugát	Dávka (/lg)	Anti-PRP den 0	í/ig/ml ? 28	f GMT) 42
PRP bez lipidov, získaný spracovaním enzýmom	1	<0,1	27,4 (3/3,)	79,1	(3/j;
PRP zo selektívnej frakcianácie za použitia alkoholu	1 1	< 0,1	10,9 (3/3,)	74,0	(3/3?

T a b u 1 k a 5

Imunogenicita Hib konjugátu bez lipidov a konjugátov spracovaných HP2 0 u mláďat opice

Rhesus

Vodný prípravok

Hib konjugát	Dávka ng	Anti-PRP, ^g/ml) den 0 28	(GMT) 42
PRPr bez lipidov získaný zpracovaním enzym°m	15	< 0>l 0,4(0/3)	10,9(3/3)
PRP zo selektívnej frakcionácie za použitia alkoholu	15	< 0,1 0,9(1/3)	6,5(2/3)

í) Počet respondentov, u ktorých sa dosiahne hladiny λ¹ ,θ ug/ml anti-PRP (RIAJ

P r í k L a d 6.

Získavanie PRP bez lipidu z nízkej frakcie.

Nízka frakcia (15 g) sa solubilizuje v 750 ml pufru(lOmM Tris, 5mM Ca01₉, 4,5mM Trit on X-100, pH 7,4j. K roztoku sa pridá fosfoiipáza D(20 U Toyo Joso/100 mg PRP, 3000 U pri špecifický aktivite 70 U/mg). Potom sa pridá zmes metylterc.butýlétéru a etanolu(v pomere 9:1, 750 mL) a zmes sa mieša pri frekvencii otáčania 240 min Reakcia sa nechá prebiehal; po dobu 2,5 hodiny pri 35° C. Pridá sa ďalších 2964 jednotiek PLD a reakčná zmes sa nechá rozdeliť na dve fáze '' 20 minút pri teplote miestnosti). Vodná fáza obsahujúca PRP sa použijena ďalšie spracovanie. Organická fáza sa extrahuje 150 ml vody a 156 ml oddelenej spodnej fáze sa zmieša s prvou vodnou fázou.

950 ml vodného prípravku obsahujúceho PRP sa extrahuje 4 x fenolom ekvilibrovaným s octanom sodným pri pomere fenol :: voda 1 : 2,6.

Na fenolom extrahovaný PRP sa potom pôsobí po dobu 2 hodín pri teplote miestnosti 450 g živice HP20, ktorá bola .vopred ekvilibrovaná s pufrovanou zmesou citrát/DOC (0,5 % DOC, 3 % citran sodný, 5mM Tris, pH 8,0?. Perly živice sa odfiltrujú a vodná fáza sa použije pri ďalšom postupe. S hlavným podielom vodnej fázy sa zmieša 292 ml pufru použitého k premývaniu perál živice a spojená vodná fáza sa diafiltruje za použitia membrány Pellicon s vylučovacou hranicou molekulovej hmotnosti 1QO00 Dalton a povr2 chovou plochou 0,093 m . Potom sa PRP prípravok skoncentruje na L 1. a PRP sa vyzráža pridaním etanolu, ktorý sa pridá až do koncentrácie 40 Zrazenina sa oddelí centrif.ugáciou, trituruje s 95 % etanolom a vysuší acetónom.

PRP, ktorý sa získa postupom popísaným v tomto príklade., je vo všetkých skúšaných parametroch porovnateľný s PRP, získaným selektívnou frakcionáciou pomocou etanolu.

Príklad?

Inaktivácia baktérie Haemophilus influenzae typu b fenolom

Kultúra baktérií H. influenzae,obsahujúca približne

0 mikroorganizmov v 1 ml, sa inaktivuje na konci fermenťačného cyklu pridaním fenolu k fermentačnej kultúre v množstve približne 5g/l konečná koncentrácia . Po preverení koncentrácie fenolu sa kultúra prevedie do' miešanej zabíjacej nádrže, kde sa exponuje účinkom fenolu minimálne po dobu 1 hodiny pri 37° C. I napriek tomu, že laboratórne pokusy, popísané ďalej ukazujú, že inaktivácia kultúry σ 8 desatinných radov sa dosiahne za použitia 0,5 % fenolu v priebehu 7 minút, v produkčnom merítku sa doba inaktivácie predĺži na 1 hodinu, aby sa dosiahla vyššia úroveň bezpečnosti.

Štúdia inaktivácie kultúry v laboratórnom merítku

Kultúra H. influenzae sa kultivuje pri 37° C v trepanom inkubátore, až do dosiahnutia stacionárnej fáze. Alikvotné vzorky výslednej kultúry, obsahujúce približne 10 buniek v 1 ml sa exponujú fenolu pri koncentrácii fenolu 2, 3, 4, 5 a 6g/l. Koncentrácia fenolu 2 a 3g/l má malý vplyv na inaktiváciu kultúry v priebehu 10 minútovej expozície. Pri koncentrácii fenolu 4 a 5g/l sa však dosiahne významný stupeň inaktivácie. Za použitia fenolu v koncentrácii 5g/l sa po 7 minútach nezistí žiadna živá bunka pri skúške na miskách, pričom hranica citlivosti pri meraní inaktivácie fenolom je približne 10 CFU/ml. Kinetika inaktivácie ako pri koncentrácií fenolu 4g/l, tak pri koncentrácii fenolu 5g/l je dvojfázová. Pri koncentrácii fenolu 6g/l je inaktivácia tak rýchla, že po 30 sekundách expozície fenolu nie je možné zistit žiadne živé bunky.

Štúdia inaktivácie kultúry v produkčnom merítku g

K produktu v reaktore obsahujúcom približne 10 mikroorganizmov vi ml sa pridá fenol až do koncentrácie 5g/l a stanoví sa závislosť hodnoty CPU/ml na expozičnej dobe, vďaka mechanike odberu a spracovanie vzoriek bolo možné realizovať len dve samostatné merania za minútu. V reaktore, ktorý vyžadoval dobu 6 minút miešania pre úplné rozdelenie fenolu bolo pozorované zníženie počtu živých buniek o 7 rádov v priebehu prvých 3 minút. Po 5 minútach nie je možné zistiť žiadne živé bunky pri stanovení na miskách, pričom hranica citlivosti pri meraní inaktivácie fenolom je približne 10 CFU/ml.

Príklad 8

Odstraňovanie fosfolipázy Ľ

Intenzívny spôsob výroby PRP sa upraví tak, aby bolo možné účinne odstrániť PLD z výsledného PRP prášku. Množstvo reziduálneho enzýmu, ktorý zostáva v PRP, sa odhadne

dy zahŕňajú priame stanovenie PLD a priame stanovenie aktivity enzýmu vo finálnych PRP prípravkoch, analýzu na PLD vo vzorkách odobraných v priebehu postupu a štúdie izcLác.ie PLD za použitia značenia, realizované v každom stupni tohoto postupu. Okrem toho boli urobené p?okusy vypestovať protilátky proti PLD za použitia imunologických stanovení. Všetky tieto metódy sú popísané ďalej.

Priame stanovenie PLD vo výslednom PRP prášku

Priame stanovenie PLD vo výslednom PRP prášku pomocou SDS-PAGE, za použitia farbenia pomocou Coomassie ( PLD prípravok sa striebrom dobre nefarbí ) ukazuje, že reziduálna hladina PLD je nižšia ako hranica stanovenia (< 250 ng PLD/dráha?. pri zvýšenom prídavku ku gélu zodpovedá reziduálna hladina PLD hodnote < 5 ng/mg PRP, t. j. < 0,0005 %· Táto hranica detekcie zodpovedá množstvu< 1 ng/dávka.

Výsledný PRP prášok sa tiež skúša na reziduálnu enzymatickú aktivitu PLD, pričom sa nezistí žiadna aktivita. Hranica detekcie pri enzymatickom stanovení je 6 ng PUVml (6 x 10 U PLD/ml ), čo zodpovedá < 64 pg účinnej PLD/ mg PRP. Prídavné štúdie ukazujú, že.pri expozícii PLD fenolu dochádza k inaktivácii enzýmu.

Priama analýza na PLD vo vzorkách odobraných v priebehu postupu

Vzorky odobrané v priebehu výrobného postupu sa skúšajú priamo na reziduálnu PLD na SDS-PAGĽ za použitia farbenia Coomassie. Hladina PLD v PRp po prvej extrakcii fenolom je nižšia ako- je hranica detekcie, čo zodpovedá hladine PLD< 5 ng PLD/mg PRP. Toto priame meranie ukazuje, že pri prvej extrakcii fenolom sa zníži hladina PLD o takmer 3 rády (z približne 2,4/ug PLD/mg PRP v reakčnej zmesi na menej ako 5 ng PLD/mg PRP v extrakte ,z prvej extrakcie fenolom). V priebehu ďalšieho spracovania troma prídavnými extrakciami fenolom,, spracovanie živicou HP20 a zrážania alkoholom sa dosiahne ďalšie vyčistenie od PLD, i napriek tomu, že hladina PLD je v týchto- prípadoch príliš nízka, než aby ju bolo možné priamo stanovil.

Analýza na PLD za použitia značenia a izolačnej štúdie

Vzhíadom k tomu, že reziduálna hladina PLD vo vzorkách odobraných v priebehu postupu je príliš nízka, než aby bolo možné urobit priame meranie, bola v laboratórnom merítku urobená rozsiahla séria štúdií získavania PLD za použitia znav cenia, aby bolo možne odhadnúť množstvo PLD, ktoré by bolo možné odstrániť v izolačnom stupni. Ako účinné pre odstraňovanie enzýmu sa ukázali tri rôzne izolačné stupne.

V prvom rade bola študovaná účinnosť extrakcií fenolom pri odstraňovaní PLD. Koncentrovaný roztok PLD s koncentrá ciou 8 mg/ml vo vzorke s obsahom 20 mg PRP/ml sa podrobí «>ÄUŕa«iilĽL‘iíZiijL·^ štyrom extrakciám fenolom a obsah PLD v každej vodnej vrstve sa sleduje pomocou SDS-PAGE. Po jedinej extrakcii fenolom je hladina -PLD pod hranicou detekcie ( 250 ng PLD na dráhu pri SDS-PAGE ),za použitia farbenia Coomassie, čo zodpovedá 800-násobnému zníženiu, teda zníženiu takmer o 3 desatinné rády. Pri ďalšom experimente sa dávka PLD fluorescentne označí pomocou fluoresceín-5-izotiokyanátu ( FITC). Za použitia PLD, značeného FITC sa meria rozdeľovači koeficient enzýmu v závislosti na jeho koncentrácii vo fenole, pomocou fluorescenčnej spektroskopie. Táto metóda zaisťuje dosiahnutie desaťnásobného zvýšenia citlivosti pri stanovení hladiny PLD. Táto metóda znova potvrdila, že jediná extrakcia fenolom je účinná pre zníženie hladiny enzýmu aspoň o 2 desatinné rády.

Pre stanovenie účinku spracovania živicou HP20 na odstránenie PLD sa zmeria adsorpčná izoterma PLD vo vzorke s koncentráciou 5 mg PRP/ml. na živici HP20. Strmý sklon nameranej izotermy ukazuje, že má živica silnú afinitu na PLD, Čo pri špecifických podmienkach spracovania pomocou HP20 predstavuje zníženie koncentrácie PLD, prinajmenšom o 2 desatinné rády. Obsah reziduálneho enzýmu v tomto stupni, ktorý nasleduje po 4 extrakciách fenolom by bol už tak veími malý, no zistené dáta ukazujú, že akýkoľvek reziduálny enzým by bol pri selektívnej adsorpcii na živicu HP20 ďalej eliminovaný.

Napokon, pri značených pokusoch v malom merítku zostalo 90 % enzýmu v supernatante po zrážaní alkoholom. Tento záverečný stupeň teda predstavuje potenciál pre ďalšie desaťnásobné vyčistenie produktu od PLD.

Tieto štúdie ukazujú, že väčšina enzýmu />99,99 %)

S sa odstráni 4 extrakciami fenolom. Pretože rozdeľovači koeficient enzýmu medzi vodnou a fenolovou fázou za prítomnosti PRP je podlá realizovaného stanovenia ’0“, mohlo by sa 4 extrakciami fenolom teoreticky dosiahnuť g

-násobného vyčistenia. Z opatrnosti sa však tomuto stupňu pripisuje schopnosť O^'-násobného vyčistenie. Ma základe merania s adsorpčnou izotermou je možné odhadnúť, že pri adsorpcii na HP20 dochádza k 1 (T-násobnému vyčisteniu. Frakcionačnému stupňu za použitia alkoholu sa pripisuje schopnosť 10-násobného zníženia koncentrácie PLD. Všeobecne vzaté, dochádza pri konzervatívnom odhade v priebehu intenzívneho sposobu výroby PRP k 1 0°-násobnému zníženiu koncentrácie PLD, pričom skutočná miera čistenia môže teoreticky zodpovedať až 10^-násobku.

V tabulke, ktorá je uvedená ďalej, sú zhrnuté výsledky týchto štúdií čistenia. V poslednom odstavci je uvedený výsledok výpočtu obsahu zostávajúcej PLD v dávke pri každej metóde stanovenia. Je potrebné si všimnúť, že všetky výpočty sú založené na predpoklade, že do konjugačnej reakcie vstupuje 300 /ug PRP a získa sa 150/Ug dávka. Tým je zaistený konzervatívny prístup pri odhade reziduálneho množstva enzýmu v dávke.

Metóda stanovenia

Vyčistenie od enzýmu /počet rádov)

Obsah PLD v dávke očkovacej látky (ng) bez vyčistenia od PLD *

LOD pri priamom meraní odhadnuté vyčistenie (konzervatívny odhad ) vypočítané teoretické vyčistenie

0	1 O3
3	< 1
6	< 1 o-3

<1U-⁸ hranica detekcie *

kU·

Príklad 9

Porovnávacia analýza intenzívneho spôsobu výroby PRP a frakcionačného spôsobu výroby PRP za použitia alkoholu

Všetky várky PRP, vyrobené intenzívnym spôsobom výroby sa podrobia extenzívnemu analytickému skúšaniu,aby bola zistená ich chemická a fyzikálna porovnáteínost s PRP prípravkami, vyrobenými selektívnym frakcionačným postupom za použitia alkoholu. Výsledky týchto analýz sú popísané ďalej.

A. Analýza NMR

Analýza H⁺NMR troch konzistentných várok PRP, vyrobených intenzívnym spôsobom výroby PRP a jednej reprezentatívnej várky, vyrobenej selektívnym frakcionačným postupom za použitia alkoholu ukázala, že tieto vzorky sú v podstate totožné. Spektrá týchto vzoriek sú identické v oblasti od /H = 3,72 až 5,2.

B Analýza zloženia uhľohydrátu

Integrita PRP vzoriek, z hľadiska ich zloženia, sa odhadne .stanovením totožnosti a relatívnych množstiev sacharidových zložiek v PRP prípravkoch. Stanovenie sa realizuje kyslou hydrolýzou PRP vzoriek a nasledujúcim kvantitatívnym stanovením uhlohydrátových zložiek (ribitolu a ribózy) chromátografiou na anexovej živici s vysokou hodnotou pH, pri použití pulzačnej ampérometrickej detekcie. Analýze sa podrobia tri várky, získané intenzívnym spôsobom výroby PRP a dve reprezentatívne várky PRP, získané selektívnou frakcionáciou za použitia alkoholu. Porovnávacia analýza týchto vzoriek, založená pomere pikových oblastí ribitolu a ribózy ukazuje,

i piky stopových zložiek sú u všetkých kov porovnateľné. Hladina týchto zložiek .je nižšia ako % molárna, vztiahnuté na ribitol alebo ribózu.

C. Analýza mastných kyselín

Vykoná sa porovnávacia analýza mastných kyselín v prípade produktov získaných jednak selektívnou frakcionáciou za použitia alkoholu a jednak intenzívnym spôsobom výroby PRP podľa tohoto vynálezu. Vzorky PRP, získané prvým z uvedených postupov, obsahujú meniace sa malé množstvá mastných kyselín, zatiaľ čo vzorky PRP z intenzívneho spôsobu podľa vynálezu obsahujú < 0,002 %. hmotnostného mastných kyselín, podľa analýzy metylesterov týchto mastných kyselín kapilárnou plynovou chromatograf iou.

D. Analýza veľkosti molekúl

Analýza na Sepharose 4B

Veľkosť molekuly u PRP prípravku sa v súčasnej dobe stanovuje chromatograficky na stĺpci Sepharose 4B v

s detekciou podlá indexu lomu, čo predstavuje merítko relatívnej veľkosti molekuly PRP prípravku, vyjadrené ' údajom o relatívnom elučnom objeme ()» Hodnoty reprezentatívnych vzoriek sú uvedené ďalej. Na základe týchto analýz je možné konštatoval, že neexistujú žiadne zjavné rozdiely vo veľkosti molekúl medzi piatimi PRP prípravkami.

Meranie veľkosti molekuly na základe analýzy na Sepharose 4B

Vzorka	Kd
PRP, získaný intenzívnym
spôsobom výroby
vzorka 1	0,46
vzorka 2	0,48
vzorka 3	0,45
PRP, získaný selektívnou
frakcionáciou pomocou alkoholu
vzorka 1	0,46
vzorka 2	0,51

HPSEC-univerzálna kalibračná analýza

Okrem analýzy na Sepharose 4B sa veľkosť molekúl a polydisperzita každej ' z vyššie uvedených vzoriek PRP skúša vysoko výkonnou chromatografiou SEC (size exclusion chromatography) s on-line detekciou špecifickej viskozity a indexu lomu. Táto analýza sa robí za použitia stĺpca TSK G4000 P’iVXL· v mobilnej fáze na bázi octanu amónneho a umožňuje výpočet relatívnej molekulovej hmotnosti (M ) P a indexu polydisperzity (Pi) u každého z PRP prípravkov. Chromátogramy, získané pri analýze troch reprezentatívnych várok, získaných intenzívnym spôsobom výroby PRP podľa vynálezu a dvoch reprezentatívnych várok PRP, získaných selektívnou frakcionáciou pomocou alkoholu, sú súhrnne uvedené ďalej. V tabuľke sú tiež uvedené priemerné výsledky z analýzy celkove 29 PRP várok, získaných pri výrobe PRP selektívnou frakcionáciou za použitia alkoholu.

Stanovenie relatívnej molekulovej hmotnosti polydisperzity PI u PRP, vyrobeného jednak intenzívnym spôsobom výroby a jednak selektívnou frakcionáciou za použitia alkoholu indexu

Vzorka	M p	PI
PRP, získaný intenzívnym
spôsobom výroby
vzorka 1	202 OCO	1 ,80
vzorka 2	183 000	1 ,65
vzorka J	213 000	1,56
priemer z 3 várok	199 000+15 000	1 ,67+.0,-1 2

PRP, získaný selektívnou frakcionáciou pomocou alkoholu

vzorka 1	165 000	1 ,54
vzorka 2	148 000	1,42
priemer z 29 várok	150 000+21 000	1,3910,12

Výsledky týchto analýz predstavujú opodstatnený dôkaz, že prípravky PRP, vyrobené intenzívnym spôsobom výroby, majú trochu vyššiu molekulovú hmotnosť a väčšiu polydisperzitu ako prípravky PRP, vyrobené selektívnym frakcionačným postupom za použitia alkoholu.

v

Okrem vyššie uvedených analýz boli tiež na velkost molekúl analyzované derivatizované PRP, zodpovedajúce jednak prípravkom, ktoré boli vyrobené intenzívnym spôsobom výroby a jednak reprezentatívne derivatizované PRP, vyrobené z PRP, získaného selektívnou frakcionáciou za použitia alkoholu. Velkost molekúl a polydisperzita derivatizovaných prípravkov PRP v brómacetylbutandiamínovej forme boli skúmané jednak chromatografiou na Sepharose 4B a jednak univerzálnou týchto analýz sú uvedené poiydisperzity derivatizovaného jednak intenzívnym spôsobom frakcionáciou za použitia alkalibráciou HPSEC. Výsledky v nasledujúcej tabuľke.

v>

Meranie veľkosti molekúl a PRP na bázi PRP, vyrobeného výroby a jednak selektívnou koholu

Vzorka

PI

Derivatizovaný PRP, vyrobený intenzívnym spôsobom výroby

vzorka a	0,64	105	000	1,37
vzorka b	0,61	123	000	1,48
vzorka c	0,60	127	000	1 ,42
Priemer	0,62	118	000+12 000	1 ,43+0,06

Derivatizovaný PRP, vyrobený selektívnou frakcionáciou za použitia alkoholu

vzorka a	0,65	1 04	COO	1,32
vzorka b	0,59	112	000	1 ,29
vzorka c	0,60	11 9	000	1,33
Priemer	0,61	11 2	000+8 000	1,31+0,02

Tieto výsledky ukazujú, že v priebehu derivatizácie v v v v sa velkost molekúl PRP zmenší a že velkost molekúl derivatizovaného PRP, vyrobeného ako intenzívnym spôsobom výroby pódia vynálezu, tak selektívnou frakcionáciou za použitia alkoholu, sú v podstate rovnaká.

E. Relatívna analýza antigenicity

Obsah antigénu v PRP sa obvykle stanovuje pomernou nefelometrickou analýzou. Merítkom relatívnej antigenicity vzorky je porovnanie koncentrácie antigénu v danej vzorke s koncentráciou polysacharidu. Výsledky týchto analýz u troch demonštračných várok PRP, získaných intenzívnym spôsobom podía vynálezu a u dvoch reprezentatívnych várok PR?, získaných selektívnou frakcionáciou za použitia alkoholu, sú uvedené v nasledujúcej tabulke. U všetkých týchto piatich vzoriek sú hodnoty relalívnej antigenicity v rámci experimentálnej chyby rovnaké.

Porovhanie relatívnej antigenicity PRP, vyrobeného jednak intenzívnym spôsobom výroby a jednak selektívnou frakcionáciou za použitia alkoholu

Vzorka

Relatívna antigenicita (%)

PRP, získaný intenzívnym spôsobom výroby vzorka 1 vzorka 2 vzorka 3 i 01

PRP, získaný selektívnou frakcionáciou pomocou alkoholu vzorka 1 96 vzorka 2 105

Príklad 10

Výsledky skúšania imunogenicity na zvieratách

A. Imunogenicita na mláďatách opice Rhesus

Mláďatá opice Rhesus boli použité ako predklinický model imunogenicity, ktorý koreluje s imunogenicitou konjugátovej očkovacej látky na bázi H. influenzae u malých detí. U tohoto druhu opice bola už predtým v rozsiahlej miere skúšaná kanjugátová očkovacia látka na bázi Haemophilus b ( konjugát s meningokokovým proteínom ) a bolo zistené, že je vysoko imunogénna (Velia a %ďaleí, Pediatrics, 85, 668, 1990; Velia a Ellis, Pediatrie Research 29, 10, 1991). Každý rok je pre použitie k dispozícii len malý počet opíc, takže pre skúšanie každej očkovacej látky bolo použitých tri až šest opíc v skupine. Vzhladom k tomu, že sa jedná o outbredný druh, boli u jednotlivých opičích mláďat zistené až asi 100-násobné rozdiely v hladine anti-PRP, ako'· odpoveď na podanie konjugátovej očkovacej látky na bázi Haemophilus b (konjugát s meningokokovým proteínom). Tieto výsledky sú podobné rozsahu odlišností v imunitnej odpovedi jednotlivých malých detí. Z týchto dôvodov t.j. predovšetkým vďaka obmedzenej veíkosti skupiny a outbrednému charakteru zvierat, predstavuje skúška na opičích mláďatách Rhesus skôr kvalitatívny ako kvantitatívny model imunogenicity týchto očkovacích látok. Za pozitívnu odpoveď sú po dávke požadované 2 hladiny1 /ig anti-PRP/ml. Tento výsledok sa nedosiahne pri použití očkovacích látok na bázi PRP, PRP-D alebo HbOC. Pri použití očkovacej látky na bázi Haemophilus b ( konjugát s meningokokovým proteínom ) sa táto hladina konzistentne dosahuje.

Odpoveď anti-PRP opičích mláďat Rhesus ne očkovaciu látku na bázi Haemophilus b (konjugát s meningokokovým proteínom), vyrobenú no bázi PRP, získaného intenzívnym spôsobom výroby je porovnateľná s odpovedou na očkovaciu látku z konzistentných výskumných a výrobných várok a z produkčných várok, vyrobených selektívnym frakcionačným postupom, za použitia alkoholu. Ma skúšanie bol použitý konjugát, vyrobený vo výskume z PRP, získaného laboratórne intenzívnym spôsobom výroby a štyroch konjugátových várok, vyrobených z troch várok PRP, získaného intenzívnym spôsobom výroby. Celkove bolo očkovaných očkovacou látkou na bázi. Haemophilus b (konjugát s meningokokovým proteínom), získanou z PRP, pripraveného intenzívnym spôsobom výroby, 24 opíc. Všetkých 24 opíc dosiahlo po dávke 2 hladín > 1 anti-PRP/ml. Tieto dáta ukazujú, že pri tomto kvalitatívnom modele imunogenicity existuje imunologická ekvivalencia medzi očkovacou látkou na bázi Haemophilus b f konjugát s meningokokovým proteínom ) , vyrobenou z PRP, získaného jednak intentívnym spôsobom výroby podlá vynálezu a jednak selektívnym frakcionačným postupom za použitia alkoholu.

B. Dáta imunogenicity na myšiach

Skúšanie účinnosti očkovacej látky na bázi Haemophilus b (konjugát s meningokokovým proteínom), vyrobenej z PRP, získaného jednak intenzívnym spôsobom výroby podlá vynálezu a jednak selektívnym frakcionačným postupom za použitia alkoholu bolo tiež realizované na myšiach BALB/c. Vzhľadom k tomu, že sa jedná o geneticky inbredný druh, ktorý je dostupný v podstate v neobmedzenom počte jedincov, predstavuje skúšanie účinnosti tejto očkovacej látky na myšiach kvantitatívny model imunogenicity. Pri tejto modelovej slúške bola každej skupine 8 myší vstreknutá očkovacia látka pri sériovom 5~násobnom riedení, pričom pre každú várku očkovacej látky bolo použitých celkove 40 myší. Účinná dávka pre sérokonverziu 50 % myší ( ) na séropasivitu vzhľadom k antiPRP bola vypočítaná pre každý súbor 40 myší ( čím nižšie je

- b 6 hodnota ED™, tým vyššia je účinnosť'.Hodnoty ED^_P 4 roznych várok očkovacej látky na bázi Haemophilus b (konjugát s meningokokovým proteínom), vyrobenej z PRp, získaného intenzívnym spôsobom výroby podlá vynálezu, sú rádovo rovnaké, ako hodnoty získané za použitia referenčnej očkovacej látky na bázi Haemophilus b (konjugát s meningokokovým proteínom), ktorá sa ukázala byť imunogénna u malých detí. Tieto údaje ukazujú imunologickú porovnáteínosť v kvantitatívnom modele·.

Príklad 11

Skúšobne výsledky, zamerané na zistenie čistoty kultúry, inaktivácia H. influenzae a obsahu PRP-antigénu fermentačných várok H. influenzae, použitých pri intenzívnom spôsobe výroby PRP podlá vynálezu, boli všetky uspokojivé.

Tri várky PRP, vyrobené intenzívnym spôsobom výroby, boli následne použité pri výrobe očkovacej látky na bázi Haemophilus b ( konjugát s meningokokovým proteínom). Derivatízovaný polysacharidový blok Haemophilus b bol podrobený úplnému kontrolému skúšaniu a všetky skúšobné výsledky ukazujú, že tieto látky, získané intenzívnym spôsobom výroby PRP, sú nerozlišitelné od podobných látok, získaných selektívnym frakcionecným postupom za použitia alkoholu.

Výsledky realizované na produkte, ktorý bol odobraný z finálneho zásobníka potvrdzujú, že očkovacia látka na bázi Haemophilus b ŕkonjugát s meningokokovým proteínom), vyrobená z PRp, získaného intenzívnym spôsobom výroby, má rovnakú kvalitu, ako produkt, ktorý bol získaný za použitia PRp, vyrobeného frakcionáciou za použitia alkoholu.

Claims (14)

1 . Spôsob výroby kapsulárneho polysacharidu bez lipidu a endotoxínu zo surového alebo prečisteného prípravku, obsahujúceho jednak kapsulárny polysacharid bez lipidu a jednak lipo-kapsulárny polysacharid, pochádzajúci z baktérií, kde pri tomto spôsobe nedochádza k podstatnej strate kapsulárneho polysacharidu, vyznačujúci sa tým, že sa v podstate všetok lipo-kapsulárny polysacharid prevedie n.a kapsulárny polysacharid bez lipidu, odštiepením lipidu z lipo-kapsulárneho polysacharidu, potom sa oddelí voľný lipid a endotoxínové nečistoty a izoluje sa kapsulárny polysacharid bez lipidu.

2. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že sa lipid odštiepuje z lipo-kapsulárneho polysacharidu pomocou fosfoiipázy.

3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa « t ý m, že kapsulárny polysachrid je získaný z kultúry * Haemopnilus influenzae typu b, Neisseria meningitidis ( me- * ningokok) skupiny A, B, C, X, Y, W135 alebo 29E alebo Escherichia coli ΚΙ, K12, K13, KS9, K92 alebo K100.

4. Spôsob podľa nároku 3,vyznačujúci sa tým, že kapsulárny polysacharid predstavuje zmes obsahujúcu PRP a lipo-PRp, získanú z kultúry Haemophilus influenzae typu b.

5. Spôsob podľa nároku 4,vyznačujúci sa tým, že sa zmes obsahujúca pRP a lipo-PRP spracováva fosfolipázou D, samotnou, alebo v kombinácii s fosfolipázou A2 alebo fosfolipázou B, za prítomnosti organickej fáze, ktorá obsahuje ako aktivátor enzýmu éter.

6. Spôsob podlá nároku 5, vyznačujúc i sa t ý m, že organická fáza obsahuje zmes prvej éterovej zložky, zvolenej zo súboru zahŕňajúceho dietyléter, dibutyléter a metylterc.butyléter a druhej

Z v zložky, zvolenej zo súboru zahŕňajúceho metanol, etanol a hexan, pričom prvá zložka a druhá zložka sú prítomné vo vzájomnom pomere približne v rozmedzí od 20:1 do 5:1.

7. Sposob pódia nároku 6, vyznačujúci sa t ý m, že fosfolipáza je odvodená z necicavčieho organizmu,

8. Spôsob podlá nároku 7, vyznačujúci sa t ý m, že sa zmes obsahujúce PRP a lipo-PRP spracováva samotnou fosfolipázou D,

9. Spôsob podlá nároku 8, vyznačujúci sa t ý m, že sa zmes, obsahujúca PRP a lipo-PRP spracováva približne 0,01 až 10 % hmotnostnými fosfolipázy D.

10. Spôsob výroby polyribosylribitolfosfátu, PRP, bez lipidu a endotoxínu, bez podstatnej straty PRP, vyznačujúci sa tým, že sa lipo-PRP, prítomný v surovom alebo prečistenom polysacharide, získanom z kultúry Haemophilus influenzae typu b, nechá reagovať s fosfolipázou D, za použitia približne 0,3 % hmotnostného fosfolipázy D, vztiahnuté na PRP, v reakčnej zmesi obsahujúcej organickú fázu éteru a rozpúšťadla v koncentrácii približne 30 až 60 %, vztiahnuté na objem reakčnej zmesi, pričom organická fáza obsahuje zmes prvej éterovej zložky, zvolenej zo súboru zahŕňajúcej dietyléter, dibutyéter a metylterc.butyléter a druhej zložky, zvolenej zo súboru zahŕňajúceho metanol, etanol a hexan, za prítomnosti detergentu, zvoleného zo súboru zahŕňajúceho deoxycholát e Triton X-100,· v koncentrácii 0,1 až 0,4 % a za prídavku chloridu vápenatého, približne v 0,1 až 1 Omll koncentrácii, v pufre, ktorý je kompatibilný s vyššie uvedenými reakčnými činidlami, pri : pH v rozmedzí od asi 7,0 do 8,0 a teplote v rozmedzí od asi 20 do 45° C, po dobu od asi 30 minút do asi 4 hodín.

11. Spôsob podía nároku 10, vyznačujúci sa t ý m, že sa ako organická fáza na bázi éteru a ďalšieho rozpúšťadla použije zmes metylterc.butyléter a etanol v pomere asi 9:1, pričom koncentrácia tejto zmesi v celom objeme reakčnej zmesi je približne 50

12. Spôsob podlá nároku 11, vyznačujúci sa t ý m, že ďalej zahŕňa odstraňovanie proteínových nečistôt, vrátane pridanej fosfolipázy D, extrakciu PRP fenolom a odstránenie voľných lipidov a endotoxínu spracovaním PRP, pred alebo po spracovaní fosfolipázou D, v stupni hydrofóbnej adsorpcie, pri ktorom nedochádza k adsorpcii PRP alebo lipo-PRP.

13. Spôsob, výroby PRP bez lipidu, bez podstatnej straty PRP, vyznačujúci sa tým, že sa a/ kultivuje baktéria Haemophilus influenzae typu b vo vhodnom kultivačnom médiu;

b/ bunky Haemophilus influenzae typu b sa usmrtia timerosalom alebo fenolom; .

c/ kultivačné médium sa vyčerí od usmrtených buniek Haemophilus influenzae typu b;

d/ vycerené kultivačné médium sa skoncentruje n3 spracovateíný objem;

e/ nečistoty v kultivačnom médiu sa vyzrážajú prídavkom etanolu až do konečnej koncentrácie etanolu približne 43 %, za vzniku supernatantu obsahujúceho PRP a pelety nečistoty, ktoré sa zahodia;

f/ vyzráža sa PRP prídavkom etanolu až do konečnej koncentrácie etanolu približne 61 za vzniku pelety surového PRP;

g/ peleta PRP sa solubilizuje vo vode a ku vzniknutému roztoku sa pridá chlorid vápenatý až do konečnej 1,0M koncentrácie;

h/ pridá sa etanol· až do konečnej koncentrácie 23 %, za vzniku nerozpustnej pelety nečistôt a supernatantu, obsahujúceho PRP;

i/ pridá sa etanol až do konečnej koncentrácie 37 % aby sa vyzrážal PRP;

j/ peleta PRP sa trituruje s absolútnym etanolom a vysuší, čím sa získa PRP pre-fenolový prášok;

k/ solubilizovaný prípravok na bázi práškovitého PRP sa extrahuje fenolom;

1/ PRP sa vyzráža prídavkom chloridu vápenatého až do 0,05M koncentrácie a alkoholu až do asi 67 % koncentrácie. a urobí sa triturácia v absolútnom etanole, za vzniku post-fenolového prášku;

m/ zo solubilizovaného post-fenolového prášku sa odstráni endotoxín hydrofobnou adsorpciou;

n/ PRP v surovom PRP, pre-fenolovom prášku alebo post-fenobovom prášku sa nechá pred realizáciou ďalších stupňov reagovat s fosfolipázou.

14. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa t ý m, že sa ako fosfolipáza použije fosfolipáza D, ktorá sa pridáva v množstve asi 0,3 % hmotnostného, vtziahnuté na PRP; surový PRP, pre-fenoiový prášok alebo post-fenolový prášok je soiubilizovaný v 1 9mM Tris, 5mM chloride: vápenatom , 45 % metylterc.butylétere, 5 % etanole a 0,3 % Tritone X-100 a reakcia sa nechá prebiehal pri asi 35°C po dobu v rozmedzí od 30 minút do asi 4 hodín.