JP2598802B2

JP2598802B2 - 菌体結合型グルコシルトランスフェラーゼ

Info

Publication number: JP2598802B2
Application number: JP1085488A
Authority: JP
Inventors: 俊雄堀越
Original assignee: 鐘紡株式会社
Priority date: 1988-01-22
Filing date: 1988-01-22
Publication date: 1997-04-09
Anticipated expiration: 2012-04-09
Also published as: JPH01187084A

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、スクロースに作用し、水に不溶性のグルカ
ンを合成する反応を触媒する菌体結合型のグルコシルト
ランスフェラーゼ及びその精製方法、並びにその製造方
法に関する。

［従来の技術］う蝕予防等の面から、う蝕の病原菌として知られてい
るストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus
mutans）の性質や該菌のう蝕の発生への関与のメカニズ
ムの解明が盛に行なわれている。

う蝕の発生に関与するS.mutansとしては、現在のとこ
ろ血清学的にａ〜ｈまでの８つの血清型に分類される菌
株が見い出されており、血清学的にｄ型菌とｇ型菌が、
またｃ型菌とｅ型菌とｆ型菌が類似しており、これらは
２つのグループに分類されている。

S.mutansがう蝕の発生に関与するメカニズムにおいて
重要な過程は、S.mutansの有するグルコシルトランスフ
ェラーゼ（以後、GTFと略称する）が関与するスクロー
スからの粘着性で水不溶性のグルカンの生成過程である
ことが既に知られている。

このS.mutansの産生するGTFは、培養上清に存在する
ものと、菌体表面に結合された状態で存在するものとに
分けることができる。

例えば、血清学的に類似しているｄ型菌またはｇ型菌
のスクロースの非存在下での培養においては、GTFのほ
とんどが培養上清に存在し、その培養上清から現在のと
ころ３種のGTF、すなわちGTF−S1、S2及びＩ（Ｓは水溶
性グルカン合成酵素、Ｉは水不溶性グルカン合成酵素で
ある）が分離・精製されている。これらの３種のGTFの
共同作用で水不溶性かつ粘着性のグルカンが合成される
［例えば、「Streptococcus mutansのグルカン合成とそ
の付着メカニズム」、古賀敏比古、日本細菌学会誌、第
41巻、第４号、679（1986）参照］。

なお、ｄ型およびｇ型菌のスクロースの存在下での培
養においては、上記３種のGTFのほとんどがグルカンを
介して菌体と結合し菌体結合型となることも知られてい
る［Hamada,S.and Slade,H.D.,Archs oral.biol.,24,39
9−402（1979）］。

一方、血清学的に類似するｃ型、ｅ型およびｆ型菌の
培養上清からも、GTF−ＳおよびGTF−Ｉが分離されてい
る［Kuramitsu,H.K.,and Wondrack,L.,Infect.Immunit
y,42:763−770（1983）］。

しかしながら、これらのGTF−ＳとGTF−Ｉの共同作用
によって水不溶性で粘着性のグルカンが合成されるとい
う報告はない。

［発明が解決しようとする課題］本発明者らは、より効果的なう蝕予防技術の確立を目
的として、ヒト口腔内に最も多く分布しヒトのう蝕の発
生に最も重要な役割を演じていると考えられるｃ型菌、
及びｃ型菌と血清学的に類似するｅ型菌、ｆ型菌に着目
し、これらのう蝕発生への関与のメカニズムを解明する
ための種々の検討を行なう過程で、これらの菌が産生す
る水不溶性のグルカンが合成される過程に関与するGTF
を分離精製し、その性質を解明することが重要であると
の見地から研究を更に進めてきた。

その結果、本発明者らはこれらの菌の産生するGTFの
なかで、特にスクロース依存性の菌体の歯面への付着に
おいて重要であると思われる菌体結合型の水不溶性グル
カン合成酵素活性を有するGTF（以後CA−GTF−Ｉと呼
ぶ）の存在を確認するに至り、該CA−GTF−Ｉの分離・
精製を試みた。

なお、従来技術においては、ｃ、ｅまたはｆ型菌にお
ける菌体結合型のGTF（−Ｉ）を精製酵素タンパク質と
して分離し、その性質を充分に解明するところまで至っ
ていなかったのが現状である。

例えば、ｃ型菌の産生する菌体結合型のGTF−Ｉに関
しては、Kuramitsuの報告［Kuramitsu,H.K.,Infect.Imm
unity,10:227−235（1974）］がある。すなわち、Kuram
itsuらは、菌体から1M NaClを用いて水不溶性グルカン
合成酵素活性を有する抽出物を得、そのGTFとしての性
質を試験し、該抽出物におけるGTF活性の至適pHが6.0、
また至適温度が37℃であることなどを報告している。

しかしながら、Kuramitsuが得たこの抽出物は、その
精製に必要な脱塩処理にかけると、水に不溶性となって
しまうものであるため、該抽出物からGTF活性を有する
精製されたタンパク質を得るまでには至っていない。従
って、Kuramitsuの報告した菌体結合型のGTFに関するデ
ータは精製酵素タンパク質を用いて求めたものでないの
で、GTF活性を有する酵素を特定するには極めて不充分
なものであった。特に、菌体から抽出された抽出物に含
まれる酵素がどのような分子量や等電点などの酵素タン
パク質としての特性を有しているかについては何ら示さ
れていなかった。

一方、GTF−Ｉがｃ型菌の培養上清中に存在すること
が、KenneyらおよびKuramitsuらによって示されてい
る。

Kenneyらは、ｃ型菌の培養上清中に分子量153kダルト
ンの水不溶性多糖を合成する作用を有するGTF−I_cが存
在することを示した［A.C.Kenney and J.A.Cole,FEMS M
icrobiol.Lett.,16:159−162（1983）］。

しかしながら、KenneyらはGTF−I_cの培養上清中での
存在を示したのみにとどまり、該酵素の分離・精製につ
いて、あるいは該酵素のタンパク質としての性質を特定
するのに必要なデータは何ら示していなかった。

一方、Kuramitsuらは水溶性グルカンを合成する作用
を有するdextransucrase（DS、GTF−S_c）を含む画分
と、水不溶性グルカンを合成する作用を有するmutansyn
thetase（MS、GTF−I_c）を含む画分をｃ型金の培養上清
から分離し、これらの画分におけるGTF活性等について
各種の分析を行ない、DSとMSとが異なる酵素であること
を示した。ここで得られたMSは、DSと異なる免疫原性を
有し、更に155kダルトンの分子量及び４〜５の等電点
（pI）を有するものであった［Kuramitsu,H.K.,and Won
drack,L.,Infect.Immunity,42:763−770（1983）］。

このような状況の中で、本発明者らはCA−GTF−Ｉの
存在を明確とするために該酵素の分離精製法について鋭
意検討を重ねた結果、CA−GTF−Ｉをｃ型菌の菌体から
分離・精製することに始めて成功し、その性質について
新たな知見を得るに至り本発明を完成した。

本発明の目的は、う蝕発生のメカニズムの詳細な解明
やう蝕予防に必要なより効果的な技術あるいは各種薬剤
の開発等に有用である水不溶性グルカン合成酵素として
のCA−GTF−Ｉの提供することにある。

特に本発明のCA−GTF−Ｉは、動物に対する免疫原性
を有することが本発明者らによって明らかとされたこと
から、該酵素を用いて調製した該酵素に対する特異抗体
を利用して、う蝕予防に必要な技術の確立、該抗体を有
効成分として含むう蝕予防剤及び各種う蝕予防剤の開発
が可能となる。また、本発明のCA−GTF−Ｉは、スクロ
ースからのグルカンの製造に有効に利用できる。

本発明のCA−GTF−Ｉは、SDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（SDS−PAGE）により測定した分子量が、150
k〜165kダルトンである酵素タンパク質であり、スクロ
ースから水に不溶性のグルカンが合成される反応を触媒
とする酵素として機能する。

本発明のCA−GTF−Ｉの酵素活性の至適pHは、pH6.7〜
7.0である。

なお、この至適pHは口腔内のpHとほぼ一致するもので
あり、この点からもCA−GTF−Ｉが口腔内でのS.mutans
の挙動において重要な働きを演じていることが容易に推
定できる。

なお、本発明のCA−GTF−Ｉが酵素活性を示す温度
は、15〜50℃の範囲にあり、至適温度は27〜37℃の範囲
にある。

なお、該酵素のGTF活性は、80℃、５分間の処理で失
活する。

一方、本発明のCA−GTF−Ｉは、動物において免疫原
となり得るものであり、該酵素を動物に投与して、該酵
素に対する特異抗体を生成させることができる。このよ
うにして得られた抗体は、上述のように、う蝕予防の分
野等において有用である。

本発明のCA−GTF−Ｉの酵素活性は、例えば該酵素
に、［¹⁴C−グルコース］スクロース（［¹⁴C−glucos
e］sucrose）を基質として反応させた際に生成されるグ
ルカンへの放射能の取り込み量を計測することにより測
定できる。

なお、本発明においては、１分間に１μmolのグルコ
ースをグルカンに転移させる活性を１単位（Ｕ）とし
た。

本発明のCA−GTF−Ｉは、例えば、菌体に結合した状
態で生産されたGTF−Ｉを菌体から分離精製して得るこ
とができる。

本発明のCA−GTF−Ｉは、後述の実施例において明ら
かとされているように、ｃ型菌の培養上清中に存在する
水溶性グルカンを合成する作用を有するGTF−Ｓ（CF−G
TF−Ｓ）とは明確に区別される。

本発明のCA−GTF−Ｉは以下のようにしてｃ、ｅまた
はｆ型菌から分離・精製することができる。

まず、ｃ、ｅまたはｆ型菌を適当な培地で培養し、得
られた菌体を集菌し、必要に応じて洗浄する。

ここで用いるｃ型菌としては、S.mutans MT8148株、I
ngbritt株、10449株等を利用することができる。

なお、これらの菌は公知であり、容易に入手可能であ
る。

例えば、S.mutans MT8148株、Ingbritt株は大阪大学
歯学部から、10499株ナショナルコレクションオブ
タイプカルチャーズ［National Collection of Typ
e Cultures（NCTC）］から入手できる。また、ｅ型菌や
ｆ型菌についても公知の菌株を入手して用いれば良い。

また、培地としては、少なくともグルコースを含む培
地が利用でき、例えば、TTY培地（Trypticase、Tryptos
e、Yeast extractの複合培地）、BHI（Brain Heart Inf
usion）培地、FMC培地などを用いることができる。

また、培養温度は、菌体増殖が得られ、かつCA−GTF
−Ｉの生産に適した範囲内であれば良いが、良好な菌体
増殖とCA−GTF−Ｉの生産という点からは、通常37℃程
度とすると良い。

また、培養時間は、培養温度、培地の種類等の培養条
件によって異なるが、CA−GTF−Ｉの最適収量に達する
時期を選択して決定すれば良く、通常18〜20時間程度と
すれば良い。

また、その他の培養条件についても、上記の観点から
適宜選択すれば良い。

次に、菌体からCA−GTF−Ｉを抽出する。

菌体からのCA−GTF−Ｉの抽出は、尿素溶液、グアニ
ジン塩酸溶液などの抽出用溶液と菌体とを接触させる方
法などにより行なうことができる。

抽出用溶液中の懸濁菌体濃度、抽出用溶液の濃度、抽
出の温度および時間等の抽出条件は、目的とする酵素の
十分な抽出が可能であるように、用いる抽出用溶液の種
類に応じて適宜選択して設定すれば良い。

なお、高比活性の抽出物を高回収率で得るという点か
らは、好ましくは６〜10M、より好ましくは8Mの尿素溶
液を用いた、好ましくは20〜30℃、より好ましくは25℃
で、15分〜２時間程度の処理を行なうと良い。

抽出操作が終了したところで、抽出液から菌体等の固
形物を遠心分離法などの方法により除いた後、これを透
析、限外瀘過、ゲル瀘過等の手段で処理して尿素や低分
子量の不純物等を該抽出液から除去して、CA−GTF−Ｉ
粗抽出標品を得ることができる。

なお、この透析等の処理の際に沈殿が生じた場合に
は、それを遠心分離法などの手法によって除去すれば良
い。

更に、粗抽出標品を、精製してCA−GTF−Ｉ精製標品
を得ることができる。

この精製には、陰イオン交換体を用いた吸着法と、ヒ
ドロキシアパタイトを用いた吸着法を組み合せた方法が
好適に適用できる。

粗抽出標品の精製に用いる陰イオン交換体としては、
ジエチルアミノエチル［Diethylaminoethyl（DEAE）］
等の官能基を有する陰イオン交換体が利用でき、具体的
には、DEAE−セファセル（DEAE−Sephacel、ファルマシ
ア社製）などを挙げることができる。

また、ヒドロキシアパタイトとしては、Bio−Gel HTP
［バイオラッド（Bio−Rad）社製］等を用いることがで
きる。

陰イオン交換体を用いた精製処理は、粗抽出標品に含
まれる抽出物（粗タンパク質）を陰イオン交換体に接触
させた後、陰イオン交換体に吸着した画分から、目的と
する酵素を含む画分を選択的に溶出させて分画すること
によって行なうことができる。

目的とする酵素を含む画分は、例えば溶出液の塩濃度
を調節することによって得ることができる。

この塩濃度は、用いる陰イオン交換体の種類や溶出条
件等に応じて異なるが、GTF（Ｉ）活性を有する画分を
選択的に分画できる濃度範囲を選択して決定すれば良
い。

例えば、DEAE−セファセルを用いた場合には、リン酸
緩衝液中のNaCl濃度が0.45〜1.0Mの範囲でGTF（−Ｉ）
活性を有する画分を得ることができる。

なお、陰イオン交換体と接触させる試料は、粗抽出標
品から硫安、エタノール沈殿等の塩の溶液や有機溶媒を
用いた沈殿法などによって得た沈殿粗タンパク質を、遠
心分離法等により回収した後に、適当な溶媒に溶解し、
これを必要に応じて透析等で処理して該沈殿物から低分
子量の不純物を除くことによって調製することができ
る。

陰イオン交換体での処理が終了したところで、GTF
（−Ｉ）活性を有する画分を集め、これを透析等の手段
で脱塩処理した後、ヒドロキシアパタイトと接触させ
る。

次に、ヒドロキシアパタイトに吸着した画分からCA−
GTF−Ｉを選択的に分離溶出させて、CA−GTF−Ｉ画分を
得、該画分を必要に応じて透析等で処理して、CA−GTF
−Ｉ精製標品を得ることができる。

このようにして得られたCA−GTF−Ｉ精製標品は、SDS
−PAGEにおいて分子量150k〜165kダルトンに相当する位
置に単一バンドを与える。

また、上記の操作によれば、例えば後述の実施例に示
されているように、比活性で6.96U/mg・タンパク質まで
の精製が可能である。

更に、本発明のCA−GTF−Ｉは、上述の菌体培養およ
び抽出操作を行なうことによって製造することができ
る。得られた抽出物は、更に所望に応じた精製度が得ら
れるまで精製すれば良い。

［実施例］以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。

実施例１（S.mutansの各種血清型におけるGTFの局在の検討）表１に示す各血清型のS.mutansのそれぞれ（大阪大学
歯学部から入手）を個別に50mlのBHI培地およびTH（Tod
d−Hewitt）培地で37℃、18時間培養した。

培養終了後、遠心分離法によって菌体と培養上清とを
分離し、得られた菌体は生理食塩水で洗浄した。

次に、菌体と培養上清のそれぞれのGTF活性を以下の
方法にしたがって測定した。その結果を表１に示す。

GTF活性の測定方法；１）測定に供した試料菌体の場合集菌した培養菌体を生理食塩水で洗浄後、全菌量を5m
lの10mMリン酸緩衝液（pH6.0）に懸濁させ、超音波処理
で菌体を分散させて得た菌体懸濁液を試料とした。

上清の場合培養上清をそのまま試料とした。

２）GTF活性の測定各試料10μを、基質としての20mMの［¹⁴C−グルコ
ース］スクロース（［¹⁴C−glucose］sucrose、0.05 Ci
/mol）を含む0.2Mリン酸緩衝液（pH6.0）の10μと混
合し、37℃で１時間反応後、反応液全量を瀘紙（1.0×
2.0cm）にスポットし、これをメタノールで洗浄後、濾
紙上に残ったメタノールに不溶性のグルカン中に取り込
まれた放射能量を測定し、GTF活性を算出した。

表１に示した結果から明らかなように、ｄ型菌および
ｇ型菌では、BHI培地での培養、すなわちスクロースの
非存在下ではGTFのほとんどは培養上清中に存在する
が、TH培地での培養、すなわちスクロースの存在下では
GTFのほとんどが菌体結合型となっている。

一方、ｃ型、ｅ型及びｆ型菌においては、ｄ型菌およ
びｇ型菌におけるような大きな変化は認められなかっ
た。

実施例２（菌体からのCA−GTF−Ｉの抽出） S.mutans MT8148株（血清型ｃ）を、１のTTY培地
で、37℃、18時間培養し、遠心分離法により菌体を集菌
し、更に生理食塩水で集菌した菌体を２度洗浄した。

次に、各種抽出用溶液に菌体の一部を懸濁させ、得ら
れた懸濁液を撹拌しながら抽出を行なった。

抽出操作終了後、各抽出液から菌体を遠心分離法によ
り分離し、得られた上清液を10mMリン酸緩衝液（pH6.
0）に対して透析した。

透析終了後、各上清液中に生じた不溶物を遠心分離法
により除去したのち、各上清液のGTF活性と、タンパク
質含量を測定した。

なお、GTF活性は、実施例１に記載した方法を用い、
またタンパク質含量はローリー（Lowry）らの方法［牛
血清アルブミン（BSA）を標準として用いた］により測
定し、比活性を求めた。

抽出操作に用いた抽出用溶液と抽出条件、および抽出
物のGTF比活性の代表例を表２に示す。

更に、先に得た菌体を1mMのリン酸緩衝液（pH6.0）中
に懸濁し、該懸濁液を、20KHz、200W、３分間の条件の
超音波破壊処理にかけて菌体破壊物混合物を調製し、遠
心分離法により不溶画分を除いた後、その上清のGTF活
性を同様に測定した結果も表２に示した。

表２に示した結果から明らかなように、各抽出操作に
よって、菌体からGTF活性を有するタンパク質を抽出す
ることができ、高収率で高比活性の抽出物を得るには、
8M尿素溶液を用いた25℃、１時間の抽出操作が最適であ
ることが判明した。

実施例３（CA−GTF−Ｉ精製標品の調製）実施例２において8M尿素を用いた25℃、１時間の抽出
操作が最適であることが判明したので、実施例２と同様
の条件で、MT8148をTTY培地（８）で培養し、得られ
た菌体を集菌、洗浄し、それを300mlの8M尿素溶液に懸
濁した。なお、得られた培養菌体は乾燥重量で9.7gであ
った。

次に、該懸濁液を25℃、１時間撹拌して抽出を行なっ
た。

抽出終了処理後、抽出液から菌体を遠心分離法により
除去して得た上清液を、10mMリン酸緩衝液（pH6.0）に
対して透析した。

透析終了後、上清液中に生じた不溶物を遠心分離法に
より除去し、CA−GTF−Ｉ粗抽出標品を得た。

次に、粗抽出標品から60％飽和の硫安による沈殿物を
調製し、この沈殿物を更に20mlの50mMリン酸緩衝液（pH
7.5）に溶解させ、得られた溶液を50mMリン酸緩衝液（p
H7.5）に対して透析した。

透析終了後、透析処理中に生じた不溶物を溶液から遠
心分離法により除去したのち、その上清液をDEAE−セフ
ァセル（DEAE−Sephacel、ファルマシア社製）の2.5×1
3cmのカラムにかけた。

カラムに吸着した画分は、リン酸緩衝液（pH7.5）中
のNaClの濃度勾配によって選択的に溶出させた。

溶出された各画分のGTF活性を実施例１に記載した方
法で、またタンパク質含量を280nmの紫外吸収法で測定
したところ、第１図に示したように0.45〜1.0MのNaCl濃
度画分中に顕著なGTF活性が認められた。

0.45〜1.0MのNaCl濃度による溶出画分を集め、それを
10mMリン酸緩衝液（pH6.0）に対して透析し、次いで10m
Mリン酸緩衝液（pH6.0）で平衡化したヒドロキシアパタ
イト［Bio Gel HTP、バイオラッドBio−Rad）社製］の
カラム（1.0×13cm）にかけた。

カラムに吸着した画分は、0.01M、0.2M、0.26Mおよび
0.5Mのリン酸緩衝液（pH6.0）でそれぞれ溶出させた。

各画分の、GTF活性およびタンパク質含量を上述と同
様の方法で測定した結果、第２図に示したように、0.5M
のリン酸緩衝液による画分中にGTF活性が認められた。

次に、高活性を示す0.5Mのリン酸緩衝液による溶出画
分を集め、それを10mMリン酸緩衝液（pH6.0）に対して
透析し、精製酵素標品とした。

なお、以上の抽出および精製の各段階で得られたGTF
活性を有する画分中のGTF活性、タンパク質含量、GTF比
活性、収率を表３に示す。

更に、この精製酵素標品を以下の条件のSDS−PAGE
［クマシブリリアントブルー（CBB）でタンパク質
を染色］にかけたところ、分子量156kダルトンの位置に
単一のバンドが検出され、該精製酵素標品が分子量156k
ダルトンの酵素タンパク質であることが確認された。

SDS−PAGE操作条件； SDS−PAGEはレムリー（Laemmli）らの方法により行な
った。

すなわち、粗抽出標品および精製標品（0.2〜35μ
ｇ）を個々に２％SDS、５％２−メルカプトエタノール
及び20％グルセロールを含む62.5mMのトリス塩酸緩衝液
（pH6.8）中で100℃、３分間処理した。

電気泳動は、0.1％のSDSを含む7.5％の分離ゲルと、
４％の濃縮ゲル中、室温下、10mA、２時間の条件で行な
った。

なお、分子量マーカーとしては、フェリチン（ferrit
in、220kダルトン）、ホスフォリラーゼ（phosphorylas
e、94kダルトン）、牛血清アルブミン（bovine serum a
lbumin、67kダルトン）、カタラーゼ（catalase、60kダ
ルトン）、オブアルブミン（ovalbumin、43kダルトン）
および乳酸脱水素酵素（lactate dehydrogenase、36kダ
ルトン）（いずれもファルマシア社製）を用いた。

次に、50mU酵素活性量に相当する量の精製酵素標品
を、最終濃度で１％スクロース及び0.1％のアジ化ナト
リウムを含む0.1Mのリン酸緩衝液（pH6.0）に加え、蒸
留水で3mlに容量を調整した後、混合し、37℃、18時間
酵素反応を行なわせた。なお、酸素反応は、反応溶液を
氷冷して４℃にすることにより停止させた。

酸素反応終了後、反応生成物を1600×ｇの遠心分離で
処理し、沈殿した水不溶性画分と上清液に分けた。

水不溶性画分は蒸留水で２度洗浄し、3mlの蒸留水に
懸濁して、水不溶性グルカン標品とした。

また、上清液にその2.5倍容量のエタノールを加え、
４℃で１時間放置後、生じた沈殿を1600×ｇの遠心分離
で回収し、それを3mlの蒸留水に溶解させ、更に同様の
沈殿処理を再度行なって回収された沈殿を再び3mlの蒸
留水に溶解し水溶性グルカン標品とした。

更に、これらの標品に含まれるグルカンの量をアンス
ロン法により定量分析して該精製酵素標品の作用によっ
て合成されるグルカンの種類を調べたところ、該精製酵
素標品は水不溶性グルカンを合成する作用を有するCA−
GTF−Ｉであることが明らかとなった。

更に、実施例１におけるGTF活性の測定法における、
温度、pHを変化させて、該精製酵素標品の水不溶性グル
カン合成酵素活性における至適温度、至適pHを求めた。

また、常法に従ってそのKm値も測定した。

以上の測定および試験において得られた結果を表４に
示す。

なお、比較のため、MT8148株のBHI透析外液培養上清
液から馬場らの方法［CarbohydrateResearch,158,147−
155（1986）］によって得たCF−GTF−Ｓにおける同様の
測定結果を表４に付記した。

更に、本発明のCA−GTF−Ｉで免疫したマウスから調
製した抗血清を用いてイムノブロッティグを行なったと
ころ、該抗血清中に本発明のCA−GTF−Ｉに反応する抗
体が得られることが確認された。

一方、上記の操作によって得られたCA−GTF−ＩとCF
−GTF−Ｓの抗原性について、CA−GTF−Ｉに対するマウ
ス抗血清［MT8148株から得たCA−GTF−ＩをFCA（フロイ
ント完全アジュバント）とともに皮下注射することによ
り免疫したマウスから調製］と、CF−GTF−Ｓに対する
モノクローナル抗体［MT8148株の培養上清液からSatoら
の方法（Sato,S.,Koga,T.and Inoue,M.,CarbohydrateRe
search,134,293−304（1984））に従って調製した水溶
性グルカン合成酵素と反応するモノクローナル抗体］を
用い、更に、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ
標識ヤギ抗マウスIgA＋IgG＋IgM抗体を、基質としてｐ
−ニトロフェニルリン酸−２−ナトリウムを使用したEL
ISA法によって検討したところ表５に示す結果を得た。
すなわち、CA−GTF−Ｉに対するマウス抗血清とCF−GTF
−Ｓとは反応せず、またCF−GTF−Ｓに対するモノクロ
ーナル抗体はCA−GTF−Ｉと反応せず、これらが異なる
抗原性を有することが判明した。

なお、上の各操作で調製した各種溶液％表示は全て重
量／容量％である。

［発明の効果］本発明によって、う蝕発生のメカニズムの解明やう蝕
予防に必要な技術あるいは各種薬剤の開発または探索等
に有用である水不溶性グルカン合成酵素活性を有する血
清型がc,eまたはｆであるS.mutansのCA−GTF−Ｉが提供
された。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例３におけるDEAE−セファセルからの各溶
出画分中のタンパク質含量（A₂₈₀）、GTF活性およびＦT
ase（Ｄ−フルクトシルトランスフェラーゼ）活性を示
したグラフであり、第２図は実施例３におけるヒドロキ
シアパタイトからの各溶出画分中のタンパク質含量（A
₂₈₀）、GTF活性およびＦTase活性を示したグラフであ
る。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記理化学的特性を有する菌体結合型グル
コシルトランスフェラーゼ。作用及び基質特異性；スクロースに作用し、水に不溶性のグルカンを合成す
る。至適pH; pH6.7〜7.0 作用適温の範囲； 15〜50℃ 失活の条件； 80℃、５分間の処理で失活する。分子量； SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した
分子量が、150k〜165kダルトンである。免疫原性；動物において免疫原となり、該酵素に対する特異抗体を
生成させ得る。
【請求項２】請求項１に記載の菌体結合型グルコシルト
ランスフェラーゼを生産する血清型がｃ、ｅまたはｆで
あるストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcu
s mutans）の培養菌体から該菌体結合型グルコシルトラ
ンスフェラーゼを抽出し、精製する過程を有することを
特徴とする請求項１に記載の菌体結合型グルコシルトラ
ンスフェラーゼの精製方法。
【請求項３】前記精製が陰イオン交換体を用いた吸着法
による精製過程と、ヒドロキシアパタイトを用いた吸着
法による精製過程とを組み合わせた処理によって行われ
る請求項２記載の方法。
【請求項４】請求項１に記載の菌体結合型グルコシルト
ランスフェラーゼを生産する血清型がｃ、ｅまたはｆで
あるストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcu
s mutans）を培養し、得られた培養菌体から該菌体結合
型グルコシルトランスフェラーゼを採取する過程を有す
ることを特徴とする請求項１に記載の菌体結合型グルコ
シルトランスフェラーゼの製造方法。