NO157603B - Fremgangsmÿte for fremstilling av et vannopplelig kovale nt polysakkarid difteri/toksoid konjugat samt et hapten, i det vesentlige fritt for protein og nukleinsyre. - Google Patents
Fremgangsmÿte for fremstilling av et vannopplelig kovale nt polysakkarid difteri/toksoid konjugat samt et hapten, i det vesentlige fritt for protein og nukleinsyre. Download PDFInfo
- Publication number
- NO157603B NO157603B NO84840818A NO840818A NO157603B NO 157603 B NO157603 B NO 157603B NO 84840818 A NO84840818 A NO 84840818A NO 840818 A NO840818 A NO 840818A NO 157603 B NO157603 B NO 157603B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- polysaccharide
- prp
- protein
- daltons
- ribose
- Prior art date
Links
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title claims description 63
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 6
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 62
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 60
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 claims description 19
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 claims description 19
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 claims description 17
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 9
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- ALEBYBVYXQTORU-UHFFFAOYSA-N 6-hydrazinyl-6-oxohexanoic acid Chemical compound NNC(=O)CCCCC(O)=O ALEBYBVYXQTORU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 claims description 6
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 6
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 5
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 claims description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 4
- JVWLUVNSQYXYBE-UHFFFAOYSA-N Ribitol Natural products OCC(C)C(O)C(O)CO JVWLUVNSQYXYBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 4
- HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N ribitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N 0.000 claims description 4
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims description 3
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 32
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 description 12
- 230000004044 response Effects 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 10
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 9
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 8
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 7
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 6
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 5
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- -1 cyanogen halide Chemical class 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K hemin Chemical compound CC1=C(CCC(O)=O)C(C=C2C(CCC(O)=O)=C(C)\C(N2[Fe](Cl)N23)=C\4)=N\C1=C/C2=C(C)C(C=C)=C3\C=C/1C(C)=C(C=C)C/4=N\1 BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K 0.000 description 3
- 229940025294 hemin Drugs 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 3
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 2
- IBVAQQYNSHJXBV-UHFFFAOYSA-N adipic acid dihydrazide Chemical compound NNC(=O)CCCCC(=O)NN IBVAQQYNSHJXBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N glycolonitrile Natural products N#CC#N JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L magnesium sulphate Substances [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- OIPPWFOQEKKFEE-UHFFFAOYSA-N orcinol Chemical compound CC1=CC(O)=CC(O)=C1 OIPPWFOQEKKFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IPBVNPXQWQGGJP-UHFFFAOYSA-N phenyl acetate Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1 IPBVNPXQWQGGJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002411 thermogravimetry Methods 0.000 description 2
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- VJDOAZKNBQCAGE-LMVFSUKVSA-N D-ribitol 5-phosphate Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)COP(O)(O)=O VJDOAZKNBQCAGE-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 208000036756 Diphtheria carrier Diseases 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- 206010061190 Haemophilus infection Diseases 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 208000010899 haemophilus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 1
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229940031937 polysaccharide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000013337 sub-cultivation Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical group OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Description
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av et vannoppløselig kovalent polysakkarid difteritoksoid konjugat istand til å danne T-celle avhengig antistoffrespons mot polysakkarid fra Haemo<p>hilus influenzae b. med en molekylvekt mellom 140 000 og 4 500 000 dalton og med et ribose/proteinforhold mellom 0,25 og 1,0.
Denne fremgangsmåte karakteriseres ved at den omfatter:
a) oppvarming av et kapsulært polysakkarid av Haemo<p>hilus influenzae b bestående av omtrent ekvimolare mengder
ribose, ribitol og fosfat inntil mer enn 6056 av polysakkarider har en molekylstørrelse mellom 200 000
dalton og 2 000 000 dalton.
b) aktivering av det resulterende størrelsesgitte polysak-
karid med cyanbromid;
c) fjerning av i det vesentlige alt ikke omsatt cyanbro-
mid; og
d) omsetning av det akriverte produkt med et adipinsyre hydrazid derivatisert difteritoksoid.
Oppfinnelsen angår også et hapten, i det vesentlige fritt for protein og nukleinsyre fremstilt fra kapsulært Haemo<p>hilus influenzae b polysakkarid, og dette hapten karakteriseres ved at det består av omtrent like mengder ribose, ribotol og fosfat, ved oppvarming inntil mindre enn 20% har en molekyl-størrelse på under 200 000 dalton med dextran standard som referanse, ved gelpermeeringskromatografi.
Fortrinnsvis er polysakkaridet tilstede som natriumsalt.
Det aktiverte polysakkaridet blir grundig blandet med et eksotoksoid, fortrinnsvis difteritoksoid, for å bevirke konjugasjon. Fortrinnsvis derivatiseres eksotoksoidet ved som avstandselement å benytte en bro på 4 - 8 karbonatomer, f. eks. adipinsyrehydrazidderivatet av difteritoksoidet (D-AH). Alternative derivatiserte eksotoksoider som kan benyttes omfatter tetanustoksoid (T-AH). Eksotoksoidet bindes til multiple AH enheter.
Ved bruk av denne metode oppnås det en konjugatvaksine som bringer frem et T-celle avhengig respons på polysakkaridet fra Haemophilus influenzae b.
Et slikt konjugat er spesielt verdifullt for anvendelse ved prevensjon av hemofilusinfeksjoner hos spebarn og barn.
Man kan ved hjelp av oppfinnelsen oppnå en konjugatvaksine som kan benyttes for immunisering mot sykdommer slik som difteri og tetanus. Potensen hos mennesker for slike konjugater er større enn den for de konvensjonelle difteri-og tetanus toksoide preparater. Fremgangsmåten tilveie-bringer ved omhyggelig kontroll og fjerning av aktivator overskudd av et polysakkarid bundet til enkelte molekyler av polysakkarid, forbundet gjennom et avstandselement, og i det vesentlige frie for kryssbundne eller polymerderivater. Formelen kan generelt angis som PRP-Xn der X er toksoiddelen og n er et helt tall mindre enn 20 idet et karakteristisk gjennomsnitt er 7 - 8. (Difteritoksoidkonjugatet angis her som PRP-D, mens tetanuskonjugatet angis som PRP-T uten angivelse av tallet n).
Fig. 1 viser immunogeniteten for Haemo<p>hilus influenzae b kapsulært polysakkarid, det vil si anti-PRP responsen. Dette søylediagrammet viser de data som oppnås i henhold til det som fremgår av eksempel 5.
Utviklingen av stabil humoral immunitet krever erkjennelse av fremmedstoffer med minst to separate sett lymfocytter. Disse sett er B-lymfocyttene som er forløpere for antistoffdannende celler, og T-lymfocyttene som modulerer funksjonen av B-celler. Mens noen antigener inkludert flere polysakkarider er istand til direkte å stimulere B-celler til fremstilling av antistoffer (T-uavhengige antigener), må de fleste antigener (T-avhengige) presenteres for B-celler av en T-lymfocytt. Når det gjelder oppfinnelsens vaksiner erkjennes eksotoksoiddelen av vaksinen av T-cellesystemet. Fordi proteinet bærer både sine egne antigeniske determinanter og det kovalentbundne PRP hapten skulle begge sett av determinanter presenteres av T-celler for B-celler. Resultatet av inngivelsen av dette bærer-hapten konjugatpreparat er at PRP presenteres som et T-avhengig immunogen. En T-avhengig presentasjon av PRP induserer protektiv immunitet hos barn, den mest utsatte målgruppe. Konjugatvaksine er derfor av spesiell verdi hos små spebarn.
Inngivelse av et slikt konjugat til kvinner induserer en høy andel av IgG antistoffer til vaksineantigenene, noe som trenger gjennom placentalbarrieren under svangerskapet og gir således beskyttelse for spebarnet fra fødselen.
T-uavhengige antigener induserer B-celler for terminalt å differensiere i antistoffutskillende celler (plasmaceller), mens T-avhengige responser er betydelig mere komplekse. Etter å ha mottatt en T-avhengig stimulering trer B-celle populasjonen ikke bare inn i antistoff-fremstillingen, men også i proliferering og maturering. Dette resulterer i en økning av antallet B-celler som fremstiller antistoffer mot PRP og en økning i antallet B-celler som er istand til respons mot en andre eksponering til PRP. Gjentatt immunisering resulterer i ytterligere økning av antallet PRP spesifikke B-celler og som en konsekvens en høyere antistoff-titer, en sirkel (booster) respons. Som en oppsummering kan man si at når T-uavhengige responser er begrenset av antallet responsive B-celler resulterer T-avhenglge responser i en økning i det totale antallet antigen responsive celler.
PRP-eksotoksoid vaksinen har vist seg å virke som et T-avhengig immunogen på laboratoriedyr. Alle dyr i en gruppe kaniner som i serie ble immunisert med en standarddose PRP-D viste sirkelrespons. I tillegg ble det vist at primær immunisering med bærerproteinet som ble benyttet i konjugatet, f. eks. difteritoksoidet for PRP-D, vist å øke initialre-sponsen for PRP-komponenten i PRP-eksotoksoidkonjugatet. En tilsvarende økning for PRP-responsen ble ikke funnet hos dyr som ble preparert eller forbehandlet med et eksotoksoid annet enn det som ble benyttet i konjugatet.
Vaksinen er et PRP-eksotoksoid hapten-bærer konjugat. I slike vaksiner bidrar det antigene, men svakt immunogene haptenmolekyl (PRP) til en ny antigenisk spesifisitet til sterkt immunogene bæremolekyler slik som difteri- (D) eller tetanustoksoid (T).
Det rensede difteritoksoidet (D) som benyttes som bærer ved prepareringen er et kommersielt eksotoksoid som er modifisert ( der i vat i sert ) ved tilbinding av et 4-8 karbonmolekyls avstandselement slik som adipinsyre dihydrazid (ADH), ved bruk av metoden med kondensering av vannoppløselig karbodi-imid. Det modifiserte eksotoksoid, karakteristisk adipinsyre hydrazidderivatet X-AH, befris deretter fra ikkeomsatt ADH. Dette er et oppløselig produkt, i det vesentlige fritt for kryssbinding, noe som verifiseres ved mangelen på noen vesentlig økning i molekylstørrelsen, bestemt ved gelkromato-grafi og polyakrylamidgelelektroforese.
Det kasulære polysakkarid av Haemo<p>hilus influenzae b fremstilles fra kommersielle kilder slik som de som benyttes for lisensierte polysakkaridvaksiner og kan oppnås f. eks. fra Connaught Laboratories. Mens imidlertid polysakkaridet konvensjonelt renses med et kalsiumsalt unngås bruken av kalsiumioner fordi de påvirker anvendelsen av karbonatbuffer i konjugas jonsprosedyren. Molekylstørrelsen for polysakkaridet justeres deretter ved oppvarming inntil den ønskede dimensjon for haptenet er oppnådd. Karakteristisk er oppvarming av det flytende polysakkarid i 15 min. til 100°C tilstrekkelig til å sikre at mindre enn 2056 av molekylene har en molekylstørrelse mindre enn 200 000 dalton og mindre enn 2056 med en molekylstørrelse større enn 2 000 000 dalton. Denne størrelsesgivelsesoperasjon er viktig for å oppnå et riktig PRP-D- eller PRP-T-konjugat.
Det størrelsesgitte polysakkarid som således oppnås, akti-veres med en aktivator for å danne en elektrofil gruppe på polysakkaridet slik som et cyanogen halogenid eller natrium borhydrid. En typisk aktivator som benyttes er cyanogenbromid. Ikke omsatt aktivator blir fjernet i utstrakt grad, fordi hvis det er noen vesentlig rest forårsaker dette kryssbinding av proteinet i den følgende reaksjonsblanding. Det oppnådde kryssbundne produkt fanger inn polysakkaridet, gir et lavere utbytte av vaksine og et konjugar med større molekylstørrelse som når det gjelder kjemiske egenskaper og oppløselighet skiller seg fra konjugatet som her fremstilles, og en vaksine som mangler de ønskede andeler av vaksinen ifølge oppfinnelsen.
Aktivisert PRP og X-AH kombineres så, og man lar disse reagere kaldt. Noen av hydrazidgruppene på det derivatiserte eksotoksoid reagerer med aktiverte seter på PRP for å danne kovalente bindinger. Produktet er PRP som kovalent er bundet til derivatisert eksotoksoid via en 4-8 karbonatombro. Dette reaksj onsprodukt renses ved gelpermeeringkromatografi for å fjerne alt ikke-omsatt protein og forurensende elementer med lav molekylstørrelse. Den typiske molekylstørrelse for hovedfraksjonen er ca. 675 000 dalton I forhold til dextran-standarden. Et karakteristisk område for relativ molekyl-størrelse er 140 000 dalton til 4 500 000 dalton.
Et konserveringsmiddel slik som timerosal tilsettes, når det gjelder timerosal til en sluttkonsentrasjon på 1:10 000. Konsentratmassen filtreres gjennem et 0,2 pm membranfilter og lagres koldt.
PRP eksotoksoid konjugasjonsproduktet er varmebestandig og vannoppløselig. Mangelen på kryssbinding verifiseres ved mangelen på noen vesentlig økning i molekylstørrelsen fra det som foreligger for utgangspolysakkaridet, bestemt ved gelpermeeringskromatografi og ved polyakrylamidgelelektroforese. Varmestabiliteten sikrer lang lagringstid og stabilt produkt selv under ugunstige klimaforhold.
Reakslonen kan sklematisk re<p>resenteres som to trinn:
Hvis cyanogenhalogenid fjerningen ikke gjennomføres effektivt skjer det ved siden av konjugasjonen av aktivert PRP og eksotoksoid for å danne PRP (-X)n slike ugunstige reaksjoner som f. eks. dannelse av X-X eller multiple bundne derivater slik som f. eks.
En typisk humandose PRP-eksotoksoidkonjugat vaksine for subkutant eller intradermal Injeksjon består av 0,5 ml inneholdende 10 mikrogram ribose eller den omtrentlilge ekvivalent av 40 mikrogram av konjugatproduktet. Ampulleopp-løsninger fremstilles ved fortynning av konsentratmassen med f osf atbuf f ret saltoppløsning ved bruk av timerosal som konserveringsmiddel.
Produktet induserer antistof f dannelse I mennesker både mot PRP- og eksotoksoidkomponenten.
De følgende eksempler skal illustrere oppfinnelsen ytterligere .
Eksempel 1: Fremstilling av PRP
A. Organisme
Kapsulært polyribosyl ribitolfosfat (PRP) av Haemo<p>hilus influenzae b ble fremstilt fra Eagan-stammen. Kulturen ble gjentatte ganger overført og det ble fremstilt et lyofilisert utgangsmaterlale . Fra dette lyofiliserte utgangsmateriale ble en ytterligere overføring gjennomført for å fremstille våtarbeidende utgangsmateriale (seeds) (lagret ved -60'C). Fermenter-andeler av bakterielle celler ble fremstilt fra dette våtarbeidende utgangsmateriale.
Kulturenheten ble bestemt ved følgende kriterier:
1. negative Gram farvende karakteristika; 2. vekt på agar inneholdende NAD (difosfopyridin nucleotid) og Hemin (storfe type I krystallinsk salt av ferrihem);
3. mangelen på vekst på agar uten NAD eller Hemin; og
4. agglutinering ved spesifikke antisera (type b Haemophilus influenzae b. Hyland Laboratories).
B. Kultivering og media
For subkultivering av bakterien, dvs. foregående inokkulering av en fermenter, BHI Agar (pr. liter: 37 gram BHI Difco, 15 gram Bacto Agar Di f co, 0,6 ml 156 NAD Sigma-kvalitet III og 6 ml 0,256 Hemin (Sigma-Bovin Type 1) ble benyttet. Celler (20 timer) vasket fra en agaroverflate ble benyttet for å inokkulere Haemophilus Influenzae b (Hib) flytende media (1 liters andeler); disse kulturer inkuberes under rysting inntil bakterien når loggfasen av vekstcyklusen. På dette tidspunkt blir 2 1 kultur benyttet for å inokkulere hver seg 40 1 flytende Hib media i en fermenter og 300 ml 856 UCON (Union Carbide smøremiddel) tilsettes. Etter 16 til 18 timer er fermenterkulturen klar for høsting.
Sammensetningen av Hib flytende media pr. 1000 ml er:
Under høsting av en fermenter bestemmes kulturrenheten ved
egnede gram f arvings- og dyrkingsteknikker (se A 1-4 ovenfor). Cetavlon (hexadecyltrimetylammonium bromid) tilsettes til kulturen til en endelig konsentrasjon på 0, 1%. Etter 30 min., på hvilket tidspunkt bakteriene er inaktivert, blir den faste pasta samlet ved sentrifugering. Den våte pasta lagres ved -70°C inntil ytterligere behandling.
C. Renset polysakkarid
Ekstraksjonen og etterfølgende rensing av PRP gjennomføres ved bruk av følgende prosedyre:
1. Dissosiering fra utvaskingsmidlet
Pr. gram våtvekt pasta tilsettes 10 ml 0,4 M NaCl. Suspen-sjonen blandes i en kommersiell blander i 30 sek. Blandingen sentrifugeres i 15 min. ved 17 000 Xg i kold tilstand (4°C). Overstående væske samles og etanol tilsettes til en konsentrasjon på 2556. Dette materiale sentrifugeres så i to timer ved 70 000 Xg og 4°C og overstående væske samles. Etanol i en mengde av 4 ganger volumet av den overstående væske tilsettes og materialet settes hen over natt ved 4°C.
2. Fjerning av nucleinsvrer
Materialet sentrifugeres i 5 min. ved 2 800 Xg og 4°C. Sedimentet samles og suspenderes igjen i Tris-MgS04 buffer med 1/4 av det volum som opprinnelig ble benyttet for å ekstrahere pastaen. Sammensetningen av Tris-bufferen er som følger pr. liter destillert vann:
pH verdien justeres til 7,0 + 0,2 med konsentrert saltsyre.
1,5 mg deoksyribonuclease I (Sigma D-0876) og 0,75 mg ribonuclease-A (Sigma-type 1-AS, R-5503) pr. 100 original våtpasta tilsettes. Materialet anbringes i en dialysepose og inkuberes i 18 timer ved 37°C mot 18 liter Tris-MgS04 buffer.
3. Fjerning av proteiner
Materialet behandles ytterligere for å fjerne proteinkom-ponenter ved tilsetning av et tilsvarende volum fenol-acetat oppløsning (135 ml 1056 (vekt/volum) natriumacetat kombinert med 454 gram fenol). Materialet rystes deretter i 30 min.
ved 4°C,5é sentrifugeres i 15 min. ved 17 000 Xg og den vandige fase samles. To ytterligere fenolekstraksjoner gjennomføres fulgt av dialyse av den siste vandige fase mot destillert vann.
Materialet består på dette tidspunkt av massen av flytende kapsulært polysakkarid, PRP, og lagres ved -20°C inntil ytterligere behandling (avsnitt D nedenfor).
4. Bedømmelse av polvsakkarldets kvalitet
Kvaliteten av massen av PRP bedømmes basert på analysen av
den flytende prøve som fjernes. Det tilsettes 4 volumer etanol og deretter CaCl£ til en sluttkonsentrasjon på 0.02M
og PRP felles ut.
PRP sedimenteres ved sentr i fuger ing og tørkes under vakuum over et tørkemiddel. En termogravimetrisk analyse, (TGA), benyttes for å bestemme fuktighetsinnholdet. Ytterligere analyser beregnes på tørrvektsbasis. Kriterier for aksept inkluderer:
a) analyse av ribose, Orcinol-metoden : > 3056
b) analyse av protein, Lowry-metoden : < 156
c) analyse av nucleinsyrer, U.V. adsorbans: < 196, og d) utfelling med spesifikke immunsera, mot immunoelektro
f oresemetoden.
I tillegg blir molekylstørrelsen bestemt ved egnet gelpermeerIngskromatografi. Polysakkaridet overvåkes på endotoksin ved Limulus Lysatprøving og ved kanin pyrogenisitetsprøving.
En typisk andel har følgende karakteristika:
a) Proteininnhold 0,556
b) Nucleinsyreinnhold 0 ,3556
c) Rest bovin antigener: Ingen forurensning av renset PRP av bovin RNA-ase og DNA-ase som benyttes ved fremstilling av polysakkaridet, mot ved radioimmunoprøving, d) Endotoksininnholdet ble målt ved Limulus Amoebocyte til
Lysateprøving, LAL: 200 ng/mg PRP,
e) Kd på CL-4B Sefarose: 0,30. En verdi på 0,30 tilsvarer en omtrentlig molekylvekt på 1 125 000 i forhold til
dextran standarder.
D. Fremstilling av polysakkarid ( PRP) reagens
Polysakkaridet blir så renset som en væske, men kalsium benyttes ikke ved renseprosedyren. (Konvensjonell polysak-karidrensing gir et kalsiumsalt, men kalsium kan avbinde med karbonatbufferen som benyttes nedenfor under konjugering for å danne en utfelling).
Størrelsen av polysakkarider Justeres ved oppvarming til 100° C i et tidsrom proporsjonalt med graden av den størrel-sesendring som ønskes. Størrelsen av polysakkaridet justeres slik at mindre enn 2056 elueres med en Kd større enn 0,5. HovedfraksJonen har en molekylstørrelse på 200 000 til 2 000 000 dalton.
Eksempel II: Aktivering av PRP
A. Dette polysakkarid avkjøles på et isbad til 4°C i en reaksjonsbeholder utstyrt med magnetisk røreverk. Det opprinnelige volum av PRP ved en konsentrasjon av 25 mg/l (område 20-30 mg/l) i destillert vann noteres. Deretter tilsettes natrimklorid til en konsentrasjon av 0,8596.
B. pH verdien for den resulterende oppløsning av natrium-saltet av polysakkaridet heves til 10,5 - 11,0 ved tilsetning av IN natriumhydroksyd. (Dette område velges fordi ved en lavere pH verdi er det mindre reaksjon med cyanogenbromid og ved høyere pH brytes polysakkaridet ned.) C. Tørt cyanogenbromid oppløses i 0.005N natriumbikarbonat buffer med pH 10,5 - 11,0 og tilsettes umiddelbart (innen 10 min. etter fremstilling) til reaksjonsbeholderen i en andel av 0,4 mg/ml PRP. D. pH verdien for blandingen justeres til og holdes ved 10,5
- 11,0 i 6 min. ved tilsetning av natriumhydroksyd.
E. pH verdien reduseres deretter til 6,0 med IN HC1. (Sur pH verdi stabiliserer de aktiverte seter som er dannet i polysakkaridet på grunn av cyanogenbromid. En reduksjon av pH verdien resulterer ytterligere i hydrolyse av PRP).
G. Det tilsettes et likt volumsaltoppløsning med pH 6,0, forkjølt til 4°C.
H. Cyanogenbromidpolysakkaridblandingen overføres til en konsentrasjonsapparatur og konsentreres til det opprinnelige volum som er angitt 1 trinn A. I. Trinnene G og H gjentas tilsammen 10 ganger. Således fjernes ca. 99,956 ikke-forbrukt cyanogenbromid, mens polysak-karidkonsentrasjonen holdes ved 25 mg/ml. Hvis cyanogenbromid ikke fjernes reagerer dette med det difteri eksotoksoid som benyttes nedenfor.
Eksempel 3: Fremstilling av D-AH bærer
A. Kommersielt difteri eksotoksoid (D) i destillert vann konsentreres til 20-40 mg/ml, karakteristisk 35 mg/ml, over en membran som holder tilbake molekyler over 10 000 dalton i en omrørt positiv trykkskonsentrator.
B. En tørrblanding av 8 mg adipinsyre dihydrazid (ADH), pr. mg protein og 0,75 mg l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbo-diimid (EDAC), pr. mg protein anbringes i en reaksjonsbeholder utstyrt med en effektiv rører og en pH sonde for å tillate overvåking og regulering av pH verdien. C. Difteri eksotoksoid tilsettes så til reaksjonsbeholderen der reaktantene foreligger som følger: difteri eksotoksoid = 35 mg protein/ml ADH = 8,0 mg/mg protein
EDAC = 0,75 mg/mg protein
(bruken av acetatbuffer ved sekvensiell tilsetning av ADH og EDAC resulterer I en vedvarende flokkulentutfelling. Reaktantene har tilstrekkelig buffringskapasitet i seg selv).
D. pH verdien justeres umiddelbart til 4,7 og holdes ved 4,7 +0,2 i minimum 2 timer. 1. Forløpet av den kjemiske reaksjon kan følges på skriveren til pH kontrollen. Hvis nødvendig lar man reaksjonen skride frem ut over to timer inntil pH verdien er stabil i minst 15 min. (Dvs. 15 min. uten nødvendig HC1 tilsetning for å regulere pH verdien). 2. Mengden forbrukt HC1 noteres som en prosesskon-troll. 3. Temperaturforandringer i reaksjonsbeholderen overvåkes også.
E. Reaksjonsproduktet dialyseres ved 4°C mot to forandringer av saltoppløsning, et minimum av 100 volumer og 8 timer pr. forandring.
F. Den dialyseres deretter mot to forandringer av fosfatbuffret saltoppløsning, minimalt volum, tid og temperatur som under E.
G. Produktet, (D-AH), konsentreres tilbake til 25 mg/ml protein med en positiv trykksapparatur og en membran på 10 000 MW.
H. Konsentratet filtreres sterilt (0,2 jam) og lagres ved 4°C.
Prøver på en prøve fra en typisk lott av en slik A-AH bærer viste et forhold på 38,3 mikrogram ADH/mg DT. Kromatografi av denne prøve ga en Kd verdi på CL-4B Sefarose på 0,75, noe som tilsvarte en omtrentlig molekylvekt på 139 000 i forhold til proteinstandarder.
Eksempel 4: Dannelse av kovalent polysakkarid difteritoksoid
konjugat (PRP-D)
A. Difteritoksoid adipinsyre hydrazidbæreren, (D-AH) fra eks. 3, i en konsentrasjon på 25 mg/ml, behandles med natrlumbikarbonat til en konsentrasjon på 0,5M og pH verdien Justeres til 8,5. (Signifikant lavere saltkonsentrasjoner resulterer i dannelse av en gel i den endelige reaksjonsblanding med aktivert polysakkarid).
B. I en reaksjonsbeholder som kan forsegles blir en lik mengde av den vaskede PRP-oppløsning som fremstilles i eks. 2 tilsatt og pH verdien bør være stabil ved 8,4 - 8,6. (Hvis CNBr ikke er fjernet vil pH verdien bevege seg hurtig nedover og det vil dannes et rikt bunnfall. Denne reaksjon inntrer selv 1 fravær av polysakkarid. Det bør ikke være noen vesentlig endring av det fysikalske utseende av reaktanten ved sammenføring).
C. Reaksjonsblandingen rystes i 15 - 18 timer ved 4°C.
D. Konjugatet renses ved gelpermeeringskromatografI på Sefakryl-300, bragt til likevekt i fosfatbuffret saltoppløs-ning for å fjerne ikke-omsatt protein og materialet med molekylstørrelse mindre enn 140 000 dalton i størrelse (hvis utgangspolysakkaridet er for lite vil det ikke være mulig å separere konjugatet fra fritt protein på denne måte).
E. Prøver av dette rensede konjugat fjernes for kjemisk analyse, beskrevet nedenfor.
F. Timerosal tilsettes til det rensede konjugat til en konsentrasjon av 1:10 000 og produktet lagres ved 4"C inntil analyse.
G. Produktet blir 0,2 pm sterilfUtrert. (Hvis polysakkaridet ikke har den størrelse som beskrevet i eks. I(D), dvs. hvis et er for stort, vil det resulterende konjugat ikke være filtrerbart).
Analyse.
Prøver gjennomført på massekonsentratet fra eks. IV ga følgende resultater:
a) Riboseinnhold: 156,5 mikrogram/ml.
(For beregning av PRP verdiene i eks. 5 ble en omdanningsfak-tor på 2 benyttet for å beregne en nominell polysakkaridkon-sentrasjon, basert på den empirisk bestemte ribosekonsentra-sjon).
b) Proteininnhold: 3 mikrogram/ml.
c) Ribose/proteinforhold: 0,47 (grenser 0,25-1,0).
d) Kromatografisk analyse på Sefarose CL-2B ga den kromatografiske profil som viser en homogen fordeling
av konjugatmolekyler som et enkelt signal.
e) Kd (polysakkarid): 0,36 ved bruk av sefarose C1-4B, 0,77 ved bruk av C1-2B.
Bestemt ved individuell fraksjonsriboseprøving for PRP. En verdi på 0,36 på C1-4B tilsvarer en omtrentlig molekylstørr-else på 674 000 i forhold til dextranstandarder. f) Kd (protein): 0,34 ved bruk av C1-4B; 0,71 ved bruk av C1-2B.
Bestemt ved individuell fraksjons Lowry prøving på protein. Forandring i Kd verdien for difteri eksotoksoidet fra 0,755 til 0,34 på C1-4B viser at konjugeringen av protein med polysakkarid gir et molekyl som er kromatografisk forskjellig fra hvert av råstoffene.
g) Fritt protein: mindre enn 556.
Fritt protein representerer derivatisert difteri bærer
protein som ikke er bundet til PRP. Det bestemmes ved sammenligning av mengden protein som elueres i posisjonen for
en difteri eksotoksoidprøve i forhold til totalt eluert protein.
h) Endotoksininnhold: 1 pg/ml.
Endotoksin ble kvantitativt bestemt ved Limulus Amoebocyte
til Lysatprøve (LAL). Endotoksininnholdet utgjorde 64 ng per 10 jjg ribose human dose PRP-D.
i) Pyrogenitet:
Massenkonsentratet møter US standarder med henblikk på ikke-pyrogenitet ved bruk av en vektekvivalent (human) dose av 0,15 jjg ribose pr. ml pr. kg kroppsvekt for kanin.
j) Polyakrylamidgelelektroforese, PAGE:
PAGE analyse ble gjennomført for å oppnå understøttende indisier på renhet og kovalent binding mellom polysakkarid og protein. Mens fri bærer går såvidt over halvveis inn i stavgelen ved omtrent posisjonen for katalase, 60 000 MV, var PRP-D konjugatet ikke istand til å trenge inn i gelen (først til posisjonen for thyroglobulin, 330 000 MW). PRP-D viste et enkelt signal som utgang.
k) Cyanogenbromid:
Mens cyanogenbromid, (CNBr), benyttes i de første trinn før fremstilling av et PRP-D konjugat, blir det deretter eksklu-dert fra produktet. Flere trinn i prosessen bidrar til reduksjon av innholdet. Til slutt fjerner en siste rensing av vaksinen ved gelpemeeringskromatografi enhver forurensning under 100 000 MW. Denne rensing forhindrer forurensning med rent spor av fritt CNBr eller nedbrytningsprodukter derav. 1) Varmestabilitet: Et studium av varmemotstandsevnen for PRP-D konjugatvaksinen ble gjennomført. Materialmassen ble konsentrert 40 ganger og tre 3ml prøver ble tatt. Den første ble holdt ved 4 ° C vannbad i 16 timer og den tredje ble oppvarmet i et 100" C vannbad i 30 min. Prøvene som ble gjennomført var på protein- og riboseinnhold, gelpermeeringskromatografi med sefarode C1-4B og SDS-polysakkridgelelektro-forese (PAGE).
Resultatene viste ingen vesentlige endringer i ribose- eller proteininnhold mellom prøvene sammenlignet med resultatene i prøvene a) og b) ovenfor. De kromatografiske analyser viste en mindre reduksjon i molekylstørrelsen av konjugatmaterlalet når betingelsene ble gjort i økende grad strengere. Ved fraksjonert analyse av disse prøver ved måling av absorbansen ved 254 nm, bibeholdt imidlertid materialet kun et signal som falt sammen med polysakkaridsignalet og det opptrådte ikke noe fritt proteinsignal; resultatene er således sammenlign-bare med de under d) og g) ovenfor. Dette viser at bindingen mellom protein og polysakkarid ikke ble brutt, men at reduk-sjonen i molekylstørrelse skyldtes oppbryting av bindinger innen det lineære polysakkarid. Dette ble ytterligere påvist ved sammenligning av PAGE analyse av disse prøver med resultatene som er beskrevet under j) ovenfor, fritt protein var ikke påvisbart i noen av prøvene, selv i nærvær av et vaskemiddel (natriumdodecylsulfat). Dette bekrefter sterkt kovalensen for den derivatisete protein-polysakkaridbinding og dennes stabilitet under høytemperaturbehandlingen.
Eksempel 5. PRP-D immunitetsprøver.
Dette forsøk skal vise T-celleavhengigheten påvist av: bæreravhengigheten, bærerspesifisitet, sirkelvirkning og forandring i lg klasse. Forsøket ble gjennomført i to deler: 1) en første forbehandlingssekvens med to injiseringer;
2) en utfordrersekvens med to Injiseringer.
Materialer:
1. PRP-D bulk konsentrat, eksempel 4.
2. Tetanus toksoid (TT)
3. Difteri toksoid (DT)
4. H. influenzae b kapsulært polysakkarid, (PRP)
5. PRP/D, en blanding av 20 pg PRP (10 pg ribose) og 20 pg D.
6. PRP/D-AH, en blanding av 20 pg PRP (10 pg ribose) og
20 pg D-AH.
Fremgangsmåte
Alle immuniseringer ble inngitt uten hjelpemiddel i 1 ml volumer. Alle doser inneholdende PRP ble justert til 10 pg ribose pr. 1 ml dose. Ikke konjugert eksotoksoide doser ble justert til 20 pg pr. ml dose. En roterende plan ble benyttet med immuniseringer 14 dager fra hverandre. Hver immuniserlng ble fulgt av en tapping 10 dager senere. Alle preparater ble fortynnet i fosfatbuffret saltoppløsning inneholdende 0,0156 timerosal. Like mengder ble preparert som fire dosis ampuller og lagret ved -20°C. Tre kaniner ble immunisert i hver gruppe.
Serologi;
Sera ble prøvet ved fastfase radio immunoprøving, (SPRIA), på anti-PRP, anti-D-AH, anti-DT, og anti-TT som antydet. Antistoffnivåene ble kvantitert som mikrogram IgG og IgM pr. ml.
Protokoll
Plan:
Kaniner ble fortappet og immunisert i henhold til gruppe hver 14. dag. Hver immunisering ble fulgt av en ettertapplng 10 dager senere. De første to Injeksjoner skjedde med primær immunogenet, mens den tredje og fjerde ble gjennomført med sekundær immunogenet.
Anti-PRP respons er vist i Fig. 1. De midlere nivå for IgG stoffer mot Haemophilus influenzae b kapsulært polysakkarid i de seks eksperimentelle grupper av kaniner (tre dyr pr. gruppe) er vist grafisk. Gruppene er angitt i denne figur i henhold til resultatene ovenfor. Fortappingsnivåer var mindre enn 1 pg pr. ml for alle kaniner og er ikke vist i denne figur for tydelighetens skyld. Åpne søyler representerer nivået for IgG etter to suksessive injeksjoner med primær immunogen. Fylte søyler viser IgG nivåer etter den tredje og fjerde injeksjon som var med sekundær- eller utfordrer immunogener.
IgG responsene ble sett kun etter immunisering med PRP-D konjugat vaksine. Forbehandling av kaniner i gruppe 3 med difteritoksoid aksellererte responsen mot PRP-D mens forbehandling med tetanustoksoid (gruppe 2), ikke hadde noen virkning.
Eksempel 6. Fremstilling av T-AH bærer og dannelse av kovalent polysakkarid tetanus toksoid konjugat,
PRP-t.
I prosedyren i eksempel 3 benyttes kommersielt tetanus toksoid istedet for difteri toksoid for å oppnå adipinsyre hydrazidderivatet.
Analyse på en prøve av en typisk lott T-AH bærer viste et forhold på 53,9 mikrogram ADH/mgT. Kromatografi av prøven viste en Kd verdi på CL-4B sefarose på 0,66, noe som tilsvarte en omtrentlig molekylvekt på 227.000 i forhold til proteinstandarder.
Polysakkarid konjugater med adipinsyre hydrazidderivatet av tetanus toksoid dannes ved bruk av de samme prosedyrer som for D-AH, som beskrevet i eksempel IV.
Analyser av en typisk lott PRP-T viste 142,6 mikrogram polysakkarid og 260 mikrogram protein pr. ml. Konjugatet var oppløselig og 0,2 pm filtrerbart. Kromatograf ert på CL-4B viste proteinkomponenten en Kd verdi på 0,30 og polysakkarid komponenten en Kd verdi på 0,37.
Claims (3)
- Fremgangsmåte for fremstilling av et vannuoppløselig kovalent polysakkarid difteri-toksoid-konjugat istand til å danne T-celleavhengig antistoffrespons mot polysakkarid fra Haemophilus influenzae b, med en molekylvekt mellom 140 000 og 4 500 000 dalton, og med et ribose/proteinforhold mellom 0,25 og 1,0, karakterisert ved at den omfatter: a) oppvarming av et kapsulært polysakkarid av Haemo<p>hilus influenzae b bestående av omtrent ekvimolare mengder ribose, ribitol og fosfat inntil mer enn 60$ av polysakkarider har en molekylstørrelse mellom 200 000 dalton og 2 000 000 dalton. b) aktivering av det resulterende størrelsesgitte polysakkarid med cyanbromid; c) fjerning av i det vesentlige alt Ikke omsatt cyanbromid; og d) omsetning av det akriverte produkt med et adipinsyre hydrazid derivatisert difteritoksoid.
- 2. Hapten, i det vesentlige fritt for protein og nukleinsyre,karakterisert ved at det er fremstilt fra kapsulært Haemo<p>hilus influenzae b polysakkarid, bestående av omtrent like mengder ribose, ribitol og fosfat, ved oppvarming inntil mindre enn 20$6 av polysakkaridene har en molekyl-størrelse under 200 000 dalton med dextran standard som referanse, ved gelpermeeringskromatografi.
- 3. Hapten ifølge krav 2,karakterisert ved at polysakkarider er tilstede som natriumsalt.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US06/395,743 US4496538A (en) | 1982-07-06 | 1982-07-06 | Haemophilus influenzae b polysaccharide-diphtheria toxoid conjugate vaccine |
PCT/US1983/001007 WO1984000300A1 (en) | 1982-07-06 | 1983-07-01 | Haemophilus influenzae b polysaccharide exotoxoid conjugate vaccine |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO840818L NO840818L (no) | 1984-03-05 |
NO157603B true NO157603B (no) | 1988-01-11 |
NO157603C NO157603C (no) | 1988-04-20 |
Family
ID=26768440
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO840818A NO157603C (no) | 1982-07-06 | 1984-03-05 | Fremgangsmaate for fremstilling av et vannopploeselig kovalent polysakkarid difteri/toksoid konjugat samt et hapten, i det vesentlige fritt for protein og nukleinsyre. |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
NO (1) | NO157603C (no) |
-
1984
- 1984-03-05 NO NO840818A patent/NO157603C/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NO840818L (no) | 1984-03-05 |
NO157603C (no) | 1988-04-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4619828A (en) | Polysaccharide exotoxoid conjugate vaccines | |
EP0098581B1 (en) | Haemophilus influenzae b polysaccharide exotoxoid conjugate vaccine | |
US4644059A (en) | Haemophilus influenzae B polysaccharide-diptheria toxoid conjugate vaccine | |
EP0208375B1 (en) | Glycoproteinic conjugates having trivalent immunogenic activity | |
DK171951B1 (da) | Fremgangsmaade til solubilisering af ikke-polyanioniske polysaccharider og fremgangsmaade til modificering af de solubiliserede neutrale polysaccharider | |
US4459286A (en) | Coupled H. influenzae type B vaccine | |
Costantino et al. | Development and phase 1 clinical testing of a conjugate vaccine against meningococcus A and C | |
CA2142981C (en) | Vaccines against group c neisseria meningitidis | |
NO300759B1 (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av et kovalent konjugat av et oligosakkarid og et bærerprotein | |
JPH0565300A (ja) | 肺炎連鎖球菌多糖結合体ワクチン | |
EP0977588B1 (en) | Coupling of unmodified proteins to haloacyl or dihaloacyl derivatized polysaccharides for the preparation of protein-polysaccharide vaccines | |
JPH11507964A (ja) | 2,5−アンヒドロ−d−マンノース末端構造を持つ、抗原性グループb連鎖球菌▲ii▼型および▲iii▼型多糖断片とその複合ワクチン | |
NO319579B1 (no) | Vaksine sammensetning inneholdende hoymolekylaert polyribosylribitolfosfat, og fremgangsmate for fremstilling derav | |
JPH0561255B2 (no) | ||
EP0338265B1 (en) | Haemophilus influenzae type B polysaccharide-outer membrane protein conjugate vaccine | |
WO1993004183A1 (en) | Process for converting lipid-containing bacterial capsular polysaccharide into lipid-free polysaccharide | |
CA3000549C (en) | Haemophilus influenzae fusion protein and construction method and use thereof | |
NO157603B (no) | Fremgangsmÿte for fremstilling av et vannopplelig kovale nt polysakkarid difteri/toksoid konjugat samt et hapten, i det vesentlige fritt for protein og nukleinsyre. | |
CN104096226B (zh) | 一种增强4价流行性脑膜炎球菌多糖蛋白结合物免疫原性的方法 | |
Lugowski et al. | Enterobacterial common antigen-tetanus toxoid conjugate as immunogen | |
Kossaczka et al. | Evaluation of synthetic schemes to prepare immunogenic conjugates of Vibrio cholerae O139 capsular polysaccharide with chicken serum albumin | |
Peeters et al. | Polysaccharicb-conjugate vaccines | |
Schneerson et al. | Bacterial capsular polysaccharide conjugates. | |
CN104096224B (zh) | 一种增强流行性嗜血杆菌b型多糖蛋白结合物免疫原性的方法 | |
CN104096227B (zh) | 一种增强4价流行性脑膜炎球菌多糖蛋白结合物免疫原性的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MK1K | Patent expired |
Free format text: EXPIRED IN JULY 2003 |