NO157603B

NO157603B - PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF A WATER-SUBSTANTIAL COVAL NT POLYSACCHARID DIPTERY / TOXOID CONJUGATE AND A HAPTEN, ESSENTIAL FREE OF PROTEIN AND NUCLEIC ACID.

Info

Publication number: NO157603B
Application number: NO84840818A
Authority: NO
Inventors: Lance K Gordon
Original assignee: Connaught Lab
Priority date: 1982-07-06
Filing date: 1984-03-05
Publication date: 1988-01-11
Also published as: NO157603C; NO840818L

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av et vannoppløselig kovalent polysakkarid difteritoksoid konjugat istand til å danne T-celle avhengig antistoffrespons mot polysakkarid fra Haemohilus influenzae b. med en molekylvekt mellom 140 000 og 4 500 000 dalton og med et ribose/proteinforhold mellom 0,25 og 1,0. The present invention relates to a method for the production of a water-soluble covalent polysaccharide diphtheria toxoid conjugate able to form a T-cell dependent antibody response against polysaccharide from Haemohilus influenzae b. with a molecular weight between 140,000 and 4,500,000 daltons and with a ribose/ protein ratio between 0.25 and 1.0.

Denne fremgangsmåte karakteriseres ved at den omfatter: This method is characterized by the fact that it includes:

a) oppvarming av et kapsulært polysakkarid av Haemohilus influenzae b bestående av omtrent ekvimolare mengder a) heating a capsular polysaccharide of Haemohilus influenzae b consisting of approximately equimolar amounts

ribose, ribitol og fosfat inntil mer enn 6056 av polysakkarider har en molekylstørrelse mellom 200 000 ribose, ribitol and phosphate up to more than 6056 of polysaccharides have a molecular size between 200,000

dalton og 2 000 000 dalton. daltons and 2,000,000 daltons.

b) aktivering av det resulterende størrelsesgitte polysak- b) activating the resulting sized polysac-

karid med cyanbromid; caride with cyan bromide;

c) fjerning av i det vesentlige alt ikke omsatt cyanbro- c) removal of essentially all unconverted cyanobro-

mid; og mid; and

d) omsetning av det akriverte produkt med et adipinsyre hydrazid derivatisert difteritoksoid. d) reaction of the acritated product with an adipic acid hydrazide derivatized diphtheria toxoid.

Oppfinnelsen angår også et hapten, i det vesentlige fritt for protein og nukleinsyre fremstilt fra kapsulært Haemohilus influenzae b polysakkarid, og dette hapten karakteriseres ved at det består av omtrent like mengder ribose, ribotol og fosfat, ved oppvarming inntil mindre enn 20% har en molekyl-størrelse på under 200 000 dalton med dextran standard som referanse, ved gelpermeeringskromatografi. The invention also relates to a hapten, essentially free of protein and nucleic acid produced from capsular Haemohilus influenzae b polysaccharide, and this hapten is characterized in that it consists of approximately equal amounts of ribose, ribitol and phosphate, when heated to less than 20 % has a molecular size of less than 200,000 daltons with dextran standard as reference, by gel permeation chromatography.

Fortrinnsvis er polysakkaridet tilstede som natriumsalt. Preferably, the polysaccharide is present as the sodium salt.

Det aktiverte polysakkaridet blir grundig blandet med et eksotoksoid, fortrinnsvis difteritoksoid, for å bevirke konjugasjon. Fortrinnsvis derivatiseres eksotoksoidet ved som avstandselement å benytte en bro på 4 - 8 karbonatomer, f. eks. adipinsyrehydrazidderivatet av difteritoksoidet (D-AH). Alternative derivatiserte eksotoksoider som kan benyttes omfatter tetanustoksoid (T-AH). Eksotoksoidet bindes til multiple AH enheter. The activated polysaccharide is thoroughly mixed with an exotoxoid, preferably diphtheria toxoid, to effect conjugation. Preferably, the exotoxoid is derivatized by using a bridge of 4 - 8 carbon atoms as a spacer, e.g. the adipic acid hydrazide derivative of diphtheria toxoid (D-AH). Alternative derivatized exotoxoids that can be used include tetanus toxoid (T-AH). The exotoxoid binds to multiple AH units.

Ved bruk av denne metode oppnås det en konjugatvaksine som bringer frem et T-celle avhengig respons på polysakkaridet fra Haemophilus influenzae b. By using this method, a conjugate vaccine is obtained which elicits a T-cell dependent response to the polysaccharide from Haemophilus influenzae b.

Et slikt konjugat er spesielt verdifullt for anvendelse ved prevensjon av hemofilusinfeksjoner hos spebarn og barn. Such a conjugate is particularly valuable for use in the prevention of haemophilus infections in infants and children.

Man kan ved hjelp av oppfinnelsen oppnå en konjugatvaksine som kan benyttes for immunisering mot sykdommer slik som difteri og tetanus. Potensen hos mennesker for slike konjugater er større enn den for de konvensjonelle difteri-og tetanus toksoide preparater. Fremgangsmåten tilveie-bringer ved omhyggelig kontroll og fjerning av aktivator overskudd av et polysakkarid bundet til enkelte molekyler av polysakkarid, forbundet gjennom et avstandselement, og i det vesentlige frie for kryssbundne eller polymerderivater. Formelen kan generelt angis som PRP-Xn der X er toksoiddelen og n er et helt tall mindre enn 20 idet et karakteristisk gjennomsnitt er 7 - 8. (Difteritoksoidkonjugatet angis her som PRP-D, mens tetanuskonjugatet angis som PRP-T uten angivelse av tallet n). With the help of the invention, a conjugate vaccine can be obtained which can be used for immunization against diseases such as diphtheria and tetanus. The potency in humans of such conjugates is greater than that of the conventional diphtheria and tetanus toxoid preparations. The method provides, by careful control and removal of activator, an excess of a polysaccharide bound to individual molecules of polysaccharide, connected through a spacer element, and essentially free of cross-linked or polymer derivatives. The formula can generally be stated as PRP-Xn where X is the toxoid portion and n is an integer less than 20, with a characteristic average of 7 - 8. (The diphtheria toxoid conjugate is stated here as PRP-D, while the tetanus conjugate is stated as PRP-T without specifying the number n).

Fig. 1 viser immunogeniteten for Haemohilus influenzae b kapsulært polysakkarid, det vil si anti-PRP responsen. Dette søylediagrammet viser de data som oppnås i henhold til det som fremgår av eksempel 5. Fig. 1 shows the immunogenicity for Haemohilus influenzae b capsular polysaccharide, i.e. the anti-PRP response. This bar chart shows the data obtained according to what appears in Example 5.

Utviklingen av stabil humoral immunitet krever erkjennelse av fremmedstoffer med minst to separate sett lymfocytter. Disse sett er B-lymfocyttene som er forløpere for antistoffdannende celler, og T-lymfocyttene som modulerer funksjonen av B-celler. Mens noen antigener inkludert flere polysakkarider er istand til direkte å stimulere B-celler til fremstilling av antistoffer (T-uavhengige antigener), må de fleste antigener (T-avhengige) presenteres for B-celler av en T-lymfocytt. Når det gjelder oppfinnelsens vaksiner erkjennes eksotoksoiddelen av vaksinen av T-cellesystemet. Fordi proteinet bærer både sine egne antigeniske determinanter og det kovalentbundne PRP hapten skulle begge sett av determinanter presenteres av T-celler for B-celler. Resultatet av inngivelsen av dette bærer-hapten konjugatpreparat er at PRP presenteres som et T-avhengig immunogen. En T-avhengig presentasjon av PRP induserer protektiv immunitet hos barn, den mest utsatte målgruppe. Konjugatvaksine er derfor av spesiell verdi hos små spebarn. The development of stable humoral immunity requires the recognition of foreign substances by at least two separate sets of lymphocytes. These sets are the B-lymphocytes, which are the precursors of antibody-forming cells, and the T-lymphocytes, which modulate the function of B-cells. While some antigens including several polysaccharides are able to directly stimulate B cells to produce antibodies (T-independent antigens), most antigens (T-dependent) must be presented to B cells by a T lymphocyte. In the case of the vaccines of the invention, the exotoxoid part of the vaccine is recognized by the T-cell system. Because the protein carries both its own antigenic determinants and the covalently bound PRP hapten, both sets of determinants should be presented by T cells to B cells. The result of the administration of this carrier-hapten conjugate preparation is that PRP is presented as a T-dependent immunogen. A T-dependent presentation of PRP induces protective immunity in children, the most vulnerable target group. Conjugate vaccines are therefore of particular value in young infants.

Inngivelse av et slikt konjugat til kvinner induserer en høy andel av IgG antistoffer til vaksineantigenene, noe som trenger gjennom placentalbarrieren under svangerskapet og gir således beskyttelse for spebarnet fra fødselen. Administration of such a conjugate to women induces a high proportion of IgG antibodies to the vaccine antigens, which penetrate the placental barrier during pregnancy and thus provide protection for the infant from birth.

T-uavhengige antigener induserer B-celler for terminalt å differensiere i antistoffutskillende celler (plasmaceller), mens T-avhengige responser er betydelig mere komplekse. Etter å ha mottatt en T-avhengig stimulering trer B-celle populasjonen ikke bare inn i antistoff-fremstillingen, men også i proliferering og maturering. Dette resulterer i en økning av antallet B-celler som fremstiller antistoffer mot PRP og en økning i antallet B-celler som er istand til respons mot en andre eksponering til PRP. Gjentatt immunisering resulterer i ytterligere økning av antallet PRP spesifikke B-celler og som en konsekvens en høyere antistoff-titer, en sirkel (booster) respons. Som en oppsummering kan man si at når T-uavhengige responser er begrenset av antallet responsive B-celler resulterer T-avhenglge responser i en økning i det totale antallet antigen responsive celler. T-independent antigens induce B cells to terminally differentiate into antibody-secreting cells (plasma cells), while T-dependent responses are considerably more complex. After receiving a T-dependent stimulation, the B-cell population enters not only into antibody production, but also into proliferation and maturation. This results in an increase in the number of B cells that produce antibodies to PRP and an increase in the number of B cells that are able to respond to a second exposure to PRP. Repeated immunization results in a further increase in the number of PRP specific B cells and as a consequence a higher antibody titer, a circle (booster) response. In summary, when T-independent responses are limited by the number of responsive B cells, T-dependent responses result in an increase in the total number of antigen responsive cells.

PRP-eksotoksoid vaksinen har vist seg å virke som et T-avhengig immunogen på laboratoriedyr. Alle dyr i en gruppe kaniner som i serie ble immunisert med en standarddose PRP-D viste sirkelrespons. I tillegg ble det vist at primær immunisering med bærerproteinet som ble benyttet i konjugatet, f. eks. difteritoksoidet for PRP-D, vist å øke initialre-sponsen for PRP-komponenten i PRP-eksotoksoidkonjugatet. En tilsvarende økning for PRP-responsen ble ikke funnet hos dyr som ble preparert eller forbehandlet med et eksotoksoid annet enn det som ble benyttet i konjugatet. The PRP exotoxoid vaccine has been shown to act as a T-dependent immunogen in laboratory animals. All animals in a group of rabbits serially immunized with a standard dose of PRP-D showed circular responses. In addition, it was shown that primary immunization with the carrier protein used in the conjugate, e.g. the diphtheria toxoid for PRP-D, shown to increase the initial response to the PRP component of the PRP exotoxoid conjugate. A corresponding increase for the PRP response was not found in animals that were prepared or pretreated with an exotoxoid other than that used in the conjugate.

Vaksinen er et PRP-eksotoksoid hapten-bærer konjugat. I slike vaksiner bidrar det antigene, men svakt immunogene haptenmolekyl (PRP) til en ny antigenisk spesifisitet til sterkt immunogene bæremolekyler slik som difteri- (D) eller tetanustoksoid (T). The vaccine is a PRP exotoxoid hapten-carrier conjugate. In such vaccines, the antigenic but weakly immunogenic hapten molecule (PRP) contributes a new antigenic specificity to highly immunogenic carrier molecules such as diphtheria (D) or tetanus toxoid (T).

Det rensede difteritoksoidet (D) som benyttes som bærer ved prepareringen er et kommersielt eksotoksoid som er modifisert ( der i vat i sert ) ved tilbinding av et 4-8 karbonmolekyls avstandselement slik som adipinsyre dihydrazid (ADH), ved bruk av metoden med kondensering av vannoppløselig karbodi-imid. Det modifiserte eksotoksoid, karakteristisk adipinsyre hydrazidderivatet X-AH, befris deretter fra ikkeomsatt ADH. Dette er et oppløselig produkt, i det vesentlige fritt for kryssbinding, noe som verifiseres ved mangelen på noen vesentlig økning i molekylstørrelsen, bestemt ved gelkromato-grafi og polyakrylamidgelelektroforese. The purified diphtheria toxoid (D) that is used as a carrier in the preparation is a commercial exotoxoid that has been modified ( der i vat i sert ) by attaching a 4-8 carbon molecule spacer such as adipic acid dihydrazide (ADH), using the method of condensation of water-soluble carbodiimide. The modified exotoxoid, the characteristic adipic acid hydrazide derivative X-AH, is then released from unreacted ADH. This is a soluble product, essentially free of cross-linking, which is verified by the lack of any significant increase in molecular size, as determined by gel chromatography and polyacrylamide gel electrophoresis.

Det kasulære polysakkarid av Haemohilus influenzae b fremstilles fra kommersielle kilder slik som de som benyttes for lisensierte polysakkaridvaksiner og kan oppnås f. eks. fra Connaught Laboratories. Mens imidlertid polysakkaridet konvensjonelt renses med et kalsiumsalt unngås bruken av kalsiumioner fordi de påvirker anvendelsen av karbonatbuffer i konjugas jonsprosedyren. Molekylstørrelsen for polysakkaridet justeres deretter ved oppvarming inntil den ønskede dimensjon for haptenet er oppnådd. Karakteristisk er oppvarming av det flytende polysakkarid i 15 min. til 100°C tilstrekkelig til å sikre at mindre enn 2056 av molekylene har en molekylstørrelse mindre enn 200 000 dalton og mindre enn 2056 med en molekylstørrelse større enn 2 000 000 dalton. Denne størrelsesgivelsesoperasjon er viktig for å oppnå et riktig PRP-D- eller PRP-T-konjugat. The capsular polysaccharide of Haemohilus influenzae b is prepared from commercial sources such as those used for licensed polysaccharide vaccines and can be obtained e.g. from Connaught Laboratories. However, while the polysaccharide is conventionally purified with a calcium salt, the use of calcium ions is avoided because they affect the use of carbonate buffer in the conjugation procedure. The molecular size of the polysaccharide is then adjusted by heating until the desired dimension for the hapten is achieved. Characteristic is heating the liquid polysaccharide for 15 min. to 100°C sufficient to ensure that less than 2056 of the molecules have a molecular size less than 200,000 daltons and less than 2056 with a molecular size greater than 2,000,000 daltons. This sizing operation is important to obtain a correct PRP-D or PRP-T conjugate.

Det størrelsesgitte polysakkarid som således oppnås, akti-veres med en aktivator for å danne en elektrofil gruppe på polysakkaridet slik som et cyanogen halogenid eller natrium borhydrid. En typisk aktivator som benyttes er cyanogenbromid. Ikke omsatt aktivator blir fjernet i utstrakt grad, fordi hvis det er noen vesentlig rest forårsaker dette kryssbinding av proteinet i den følgende reaksjonsblanding. Det oppnådde kryssbundne produkt fanger inn polysakkaridet, gir et lavere utbytte av vaksine og et konjugar med større molekylstørrelse som når det gjelder kjemiske egenskaper og oppløselighet skiller seg fra konjugatet som her fremstilles, og en vaksine som mangler de ønskede andeler av vaksinen ifølge oppfinnelsen. The sized polysaccharide thus obtained is activated with an activator to form an electrophilic group on the polysaccharide such as a cyanogen halide or sodium borohydride. A typical activator used is cyanogen bromide. Unreacted activator is largely removed, because if there is any significant residue this causes cross-linking of the protein in the following reaction mixture. The obtained cross-linked product captures the polysaccharide, gives a lower yield of vaccine and a conjugate with a larger molecular size which, in terms of chemical properties and solubility, differs from the conjugate produced here, and a vaccine which lacks the desired proportions of the vaccine according to the invention.

Aktivisert PRP og X-AH kombineres så, og man lar disse reagere kaldt. Noen av hydrazidgruppene på det derivatiserte eksotoksoid reagerer med aktiverte seter på PRP for å danne kovalente bindinger. Produktet er PRP som kovalent er bundet til derivatisert eksotoksoid via en 4-8 karbonatombro. Dette reaksj onsprodukt renses ved gelpermeeringkromatografi for å fjerne alt ikke-omsatt protein og forurensende elementer med lav molekylstørrelse. Den typiske molekylstørrelse for hovedfraksjonen er ca. 675 000 dalton I forhold til dextran-standarden. Et karakteristisk område for relativ molekyl-størrelse er 140 000 dalton til 4 500 000 dalton. Activated PRP and X-AH are then combined and allowed to react cold. Some of the hydrazide groups on the derivatized exotoxoid react with activated sites on PRP to form covalent bonds. The product is PRP that is covalently bound to derivatized exotoxoid via a 4-8 carbon bridge. This reaction product is purified by gel permeation chromatography to remove all unreacted protein and low molecular size contaminants. The typical molecular size for the main fraction is approx. 675,000 daltons Relative to the dextran standard. A typical range for relative molecular size is 140,000 daltons to 4,500,000 daltons.

Et konserveringsmiddel slik som timerosal tilsettes, når det gjelder timerosal til en sluttkonsentrasjon på 1:10 000. Konsentratmassen filtreres gjennem et 0,2 pm membranfilter og lagres koldt. A preservative such as thimerosal is added, in the case of thimerosal to a final concentration of 1:10,000. The concentrate mass is filtered through a 0.2 µm membrane filter and stored cold.

PRP eksotoksoid konjugasjonsproduktet er varmebestandig og vannoppløselig. Mangelen på kryssbinding verifiseres ved mangelen på noen vesentlig økning i molekylstørrelsen fra det som foreligger for utgangspolysakkaridet, bestemt ved gelpermeeringskromatografi og ved polyakrylamidgelelektroforese. Varmestabiliteten sikrer lang lagringstid og stabilt produkt selv under ugunstige klimaforhold. The PRP exotoxoid conjugation product is heat resistant and water soluble. The lack of cross-linking is verified by the lack of any significant increase in molecular size from that of the starting polysaccharide, as determined by gel permeation chromatography and by polyacrylamide gel electrophoresis. The heat stability ensures a long storage time and a stable product even under unfavorable climate conditions.

Reakslonen kan sklematisk reresenteres som to trinn: The reaction can be schematically represented as two steps:

Hvis cyanogenhalogenid fjerningen ikke gjennomføres effektivt skjer det ved siden av konjugasjonen av aktivert PRP og eksotoksoid for å danne PRP (-X)n slike ugunstige reaksjoner som f. eks. dannelse av X-X eller multiple bundne derivater slik som f. eks. If the cyanogen halide removal is not carried out effectively, adverse reactions such as e.g. formation of X-X or multiple bound derivatives such as e.g.

En typisk humandose PRP-eksotoksoidkonjugat vaksine for subkutant eller intradermal Injeksjon består av 0,5 ml inneholdende 10 mikrogram ribose eller den omtrentlilge ekvivalent av 40 mikrogram av konjugatproduktet. Ampulleopp-løsninger fremstilles ved fortynning av konsentratmassen med f osf atbuf f ret saltoppløsning ved bruk av timerosal som konserveringsmiddel. A typical human dose of PRP exotoxoid conjugate vaccine for subcutaneous or intradermal injection consists of 0.5 ml containing 10 micrograms of ribose or the approximate equivalent of 40 micrograms of the conjugate product. Ampoule solutions are prepared by diluting the concentrate mass with phosphate-buffered saline using thimerosal as a preservative.

Produktet induserer antistof f dannelse I mennesker både mot PRP- og eksotoksoidkomponenten. The product induces antibody formation in humans both against the PRP and the exotoxoid component.

De følgende eksempler skal illustrere oppfinnelsen ytterligere . The following examples will further illustrate the invention.

Eksempel 1: Fremstilling av PRP Example 1: Preparation of PRP

A. Organisme A. Organism

Kapsulært polyribosyl ribitolfosfat (PRP) av Haemohilus influenzae b ble fremstilt fra Eagan-stammen. Kulturen ble gjentatte ganger overført og det ble fremstilt et lyofilisert utgangsmaterlale . Fra dette lyofiliserte utgangsmateriale ble en ytterligere overføring gjennomført for å fremstille våtarbeidende utgangsmateriale (seeds) (lagret ved -60'C). Fermenter-andeler av bakterielle celler ble fremstilt fra dette våtarbeidende utgangsmateriale. Capsular polyribosyl ribitol phosphate (PRP) of Haemohilus influenzae b was prepared from the Eagan strain. The culture was repeatedly transferred and a lyophilized starting material was prepared. From this lyophilized starting material, a further transfer was carried out to produce wet working starting material (seeds) (stored at -60'C). Fermenter aliquots of bacterial cells were prepared from this wet-working starting material.

Kulturenheten ble bestemt ved følgende kriterier: The cultural unit was determined by the following criteria:

1. negative Gram farvende karakteristika; 2. vekt på agar inneholdende NAD (difosfopyridin nucleotid) og Hemin (storfe type I krystallinsk salt av ferrihem); 1. negative Gram staining characteristics; 2. weight of agar containing NAD (diphosphopyridine nucleotide) and Hemin (bovine type I crystalline salt of ferric heme);

3. mangelen på vekst på agar uten NAD eller Hemin; og 3. the lack of growth on agar without NAD or Hemin; and

4. agglutinering ved spesifikke antisera (type b Haemophilus influenzae b. Hyland Laboratories). 4. agglutination with specific antisera (type b Haemophilus influenzae b. Hyland Laboratories).

B. Kultivering og media B. Cultivation and media

For subkultivering av bakterien, dvs. foregående inokkulering av en fermenter, BHI Agar (pr. liter: 37 gram BHI Difco, 15 gram Bacto Agar Di f co, 0,6 ml 156 NAD Sigma-kvalitet III og 6 ml 0,256 Hemin (Sigma-Bovin Type 1) ble benyttet. Celler (20 timer) vasket fra en agaroverflate ble benyttet for å inokkulere Haemophilus Influenzae b (Hib) flytende media (1 liters andeler); disse kulturer inkuberes under rysting inntil bakterien når loggfasen av vekstcyklusen. På dette tidspunkt blir 2 1 kultur benyttet for å inokkulere hver seg 40 1 flytende Hib media i en fermenter og 300 ml 856 UCON (Union Carbide smøremiddel) tilsettes. Etter 16 til 18 timer er fermenterkulturen klar for høsting. For sub-cultivation of the bacterium, i.e. previous inoculation of a fermenter, BHI Agar (per litre: 37 grams BHI Difco, 15 grams Bacto Agar Di f co, 0.6 ml 156 NAD Sigma grade III and 6 ml 0.256 Hemin (Sigma -Bovine Type 1) was used. Cells (20 hours) washed from an agar surface were used to inoculate Haemophilus Influenzae b (Hib) liquid media (1 liter aliquots); these cultures are incubated with shaking until the bacterium reaches the log phase of the growth cycle. On this time, 2 1 cultures are used to inoculate each 40 1 liquid Hib media in a fermenter and 300 ml 856 UCON (Union Carbide lubricant) is added.After 16 to 18 hours the fermenter culture is ready for harvest.

Sammensetningen av Hib flytende media pr. 1000 ml er: The composition of Hib liquid media per 1000 ml is:

Under høsting av en fermenter bestemmes kulturrenheten ved During the harvest of a fermenter, the culture purity is determined by

egnede gram f arvings- og dyrkingsteknikker (se A 1-4 ovenfor). Cetavlon (hexadecyltrimetylammonium bromid) tilsettes til kulturen til en endelig konsentrasjon på 0, 1%. Etter 30 min., på hvilket tidspunkt bakteriene er inaktivert, blir den faste pasta samlet ved sentrifugering. Den våte pasta lagres ved -70°C inntil ytterligere behandling. suitable gram f dyeing and cultivation techniques (see A 1-4 above). Cetavlon (hexadecyltrimethylammonium bromide) is added to the culture to a final concentration of 0.1%. After 30 min., at which time the bacteria are inactivated, the solid paste is collected by centrifugation. The wet paste is stored at -70°C until further processing.

C. Renset polysakkarid C. Purified polysaccharide

Ekstraksjonen og etterfølgende rensing av PRP gjennomføres ved bruk av følgende prosedyre: The extraction and subsequent purification of PRP is carried out using the following procedure:

1. Dissosiering fra utvaskingsmidlet 1. Dissociation from the leaching agent

Pr. gram våtvekt pasta tilsettes 10 ml 0,4 M NaCl. Suspen-sjonen blandes i en kommersiell blander i 30 sek. Blandingen sentrifugeres i 15 min. ved 17 000 Xg i kold tilstand (4°C). Overstående væske samles og etanol tilsettes til en konsentrasjon på 2556. Dette materiale sentrifugeres så i to timer ved 70 000 Xg og 4°C og overstående væske samles. Etanol i en mengde av 4 ganger volumet av den overstående væske tilsettes og materialet settes hen over natt ved 4°C. 10 ml of 0.4 M NaCl is added per gram wet weight of paste. The suspension is mixed in a commercial mixer for 30 sec. The mixture is centrifuged for 15 min. at 17,000 Xg in the cold state (4°C). The supernatant is collected and ethanol is added to a concentration of 2556. This material is then centrifuged for two hours at 70,000 Xg and 4°C and the supernatant is collected. Ethanol in an amount of 4 times the volume of the supernatant liquid is added and the material is left overnight at 4°C.

2. Fjerning av nucleinsvrer 2. Removal of nucleic acids

Materialet sentrifugeres i 5 min. ved 2 800 Xg og 4°C. Sedimentet samles og suspenderes igjen i Tris-MgS04 buffer med 1/4 av det volum som opprinnelig ble benyttet for å ekstrahere pastaen. Sammensetningen av Tris-bufferen er som følger pr. liter destillert vann: The material is centrifuged for 5 min. at 2,800 Xg and 4°C. The sediment is collected and suspended again in Tris-MgSO4 buffer with 1/4 of the volume originally used to extract the paste. The composition of the Tris buffer is as follows per liter of distilled water:

pH verdien justeres til 7,0 + 0,2 med konsentrert saltsyre. The pH value is adjusted to 7.0 + 0.2 with concentrated hydrochloric acid.

1,5 mg deoksyribonuclease I (Sigma D-0876) og 0,75 mg ribonuclease-A (Sigma-type 1-AS, R-5503) pr. 100 original våtpasta tilsettes. Materialet anbringes i en dialysepose og inkuberes i 18 timer ved 37°C mot 18 liter Tris-MgS04 buffer. 1.5 mg deoxyribonuclease I (Sigma D-0876) and 0.75 mg ribonuclease-A (Sigma-type 1-AS, R-5503) per 100 original wet paste is added. The material is placed in a dialysis bag and incubated for 18 hours at 37°C against 18 liters of Tris-MgSO4 buffer.

3. Fjerning av proteiner 3. Removal of proteins

Materialet behandles ytterligere for å fjerne proteinkom-ponenter ved tilsetning av et tilsvarende volum fenol-acetat oppløsning (135 ml 1056 (vekt/volum) natriumacetat kombinert med 454 gram fenol). Materialet rystes deretter i 30 min. The material is further processed to remove protein components by adding a corresponding volume of phenol-acetate solution (135 ml of 1056 (weight/volume) sodium acetate combined with 454 grams of phenol). The material is then shaken for 30 min.

ved 4°C,5é sentrifugeres i 15 min. ved 17 000 Xg og den vandige fase samles. To ytterligere fenolekstraksjoner gjennomføres fulgt av dialyse av den siste vandige fase mot destillert vann. at 4°C, 5é is centrifuged for 15 min. at 17,000 Xg and the aqueous phase is collected. Two further phenol extractions are carried out followed by dialysis of the last aqueous phase against distilled water.

Materialet består på dette tidspunkt av massen av flytende kapsulært polysakkarid, PRP, og lagres ved -20°C inntil ytterligere behandling (avsnitt D nedenfor). The material at this point consists of the mass of liquid capsular polysaccharide, PRP, and is stored at -20°C until further processing (section D below).

4. Bedømmelse av polvsakkarldets kvalitet 4. Assessment of the quality of the floor covering

Kvaliteten av massen av PRP bedømmes basert på analysen av The quality of the mass of PRP is judged based on the analysis of

den flytende prøve som fjernes. Det tilsettes 4 volumer etanol og deretter CaCl£ til en sluttkonsentrasjon på 0.02M the liquid sample that is removed. 4 volumes of ethanol are added and then CaCl£ to a final concentration of 0.02M

og PRP felles ut. and PRP split out.

PRP sedimenteres ved sentr i fuger ing og tørkes under vakuum over et tørkemiddel. En termogravimetrisk analyse, (TGA), benyttes for å bestemme fuktighetsinnholdet. Ytterligere analyser beregnes på tørrvektsbasis. Kriterier for aksept inkluderer: PRP is sedimented at the center of joints and dried under vacuum over a desiccant. A thermogravimetric analysis (TGA) is used to determine the moisture content. Further analyzes are calculated on a dry weight basis. Criteria for acceptance include:

a) analyse av ribose, Orcinol-metoden : > 3056 a) analysis of ribose, Orcinol method : > 3056

b) analyse av protein, Lowry-metoden : < 156 b) analysis of protein, Lowry method: < 156

c) analyse av nucleinsyrer, U.V. adsorbans: < 196, og d) utfelling med spesifikke immunsera, mot immunoelektro c) analysis of nucleic acids, U.V. adsorbance: < 196, and d) precipitation with specific immune sera, against immunoelectro

f oresemetoden. the f oresis method.

I tillegg blir molekylstørrelsen bestemt ved egnet gelpermeerIngskromatografi. Polysakkaridet overvåkes på endotoksin ved Limulus Lysatprøving og ved kanin pyrogenisitetsprøving. In addition, the molecular size is determined by suitable gel permeation chromatography. The polysaccharide is monitored for endotoxin in the Limulus Lysate test and in the rabbit pyrogenicity test.

En typisk andel har følgende karakteristika: A typical share has the following characteristics:

a) Proteininnhold 0,556 a) Protein content 0.556

b) Nucleinsyreinnhold 0 ,3556 b) Nucleic acid content 0.3556

c) Rest bovin antigener: Ingen forurensning av renset PRP av bovin RNA-ase og DNA-ase som benyttes ved fremstilling av polysakkaridet, mot ved radioimmunoprøving, d) Endotoksininnholdet ble målt ved Limulus Amoebocyte til c) Residual bovine antigens: No contamination of purified PRP by bovine RNAase and DNAase used in the production of the polysaccharide, against radioimmunoassay, d) The endotoxin content was measured by Limulus Amoebocyte to

Lysateprøving, LAL: 200 ng/mg PRP, Lysate testing, LAL: 200 ng/mg PRP,

e) Kd på CL-4B Sefarose: 0,30. En verdi på 0,30 tilsvarer en omtrentlig molekylvekt på 1 125 000 i forhold til e) Kd on CL-4B Sepharose: 0.30. A value of 0.30 corresponds to an approximate molecular weight of 1,125,000 relative to

dextran standarder. dextran standards.

D. Fremstilling av polysakkarid ( PRP) reagens D. Preparation of polysaccharide (PRP) reagent

Polysakkaridet blir så renset som en væske, men kalsium benyttes ikke ved renseprosedyren. (Konvensjonell polysak-karidrensing gir et kalsiumsalt, men kalsium kan avbinde med karbonatbufferen som benyttes nedenfor under konjugering for å danne en utfelling). The polysaccharide is then purified as a liquid, but calcium is not used in the purification procedure. (Conventional polysaccharide purification yields a calcium salt, but calcium may bind with the carbonate buffer used below during conjugation to form a precipitate).

Størrelsen av polysakkarider Justeres ved oppvarming til 100° C i et tidsrom proporsjonalt med graden av den størrel-sesendring som ønskes. Størrelsen av polysakkaridet justeres slik at mindre enn 2056 elueres med en Kd større enn 0,5. HovedfraksJonen har en molekylstørrelse på 200 000 til 2 000 000 dalton. The size of polysaccharides is adjusted by heating to 100° C for a period of time proportional to the degree of the desired size change. The size of the polysaccharide is adjusted so that less than 2056 is eluted with a Kd greater than 0.5. The main fraction ion has a molecular size of 200,000 to 2,000,000 daltons.

Eksempel II: Aktivering av PRP Example II: Activation of PRP

A. Dette polysakkarid avkjøles på et isbad til 4°C i en reaksjonsbeholder utstyrt med magnetisk røreverk. Det opprinnelige volum av PRP ved en konsentrasjon av 25 mg/l (område 20-30 mg/l) i destillert vann noteres. Deretter tilsettes natrimklorid til en konsentrasjon av 0,8596. A. This polysaccharide is cooled in an ice bath to 4°C in a reaction vessel equipped with a magnetic stirrer. The original volume of PRP at a concentration of 25 mg/l (range 20-30 mg/l) in distilled water is noted. Sodium chloride is then added to a concentration of 0.8596.

B. pH verdien for den resulterende oppløsning av natrium-saltet av polysakkaridet heves til 10,5 - 11,0 ved tilsetning av IN natriumhydroksyd. (Dette område velges fordi ved en lavere pH verdi er det mindre reaksjon med cyanogenbromid og ved høyere pH brytes polysakkaridet ned.) C. Tørt cyanogenbromid oppløses i 0.005N natriumbikarbonat buffer med pH 10,5 - 11,0 og tilsettes umiddelbart (innen 10 min. etter fremstilling) til reaksjonsbeholderen i en andel av 0,4 mg/ml PRP. D. pH verdien for blandingen justeres til og holdes ved 10,5 B. The pH value of the resulting solution of the sodium salt of the polysaccharide is raised to 10.5 - 11.0 by the addition of IN sodium hydroxide. (This range is chosen because at a lower pH value there is less reaction with cyanogen bromide and at higher pH the polysaccharide breaks down.) C. Dry cyanogen bromide is dissolved in 0.005N sodium bicarbonate buffer with pH 10.5 - 11.0 and added immediately (within 10 min. after preparation) to the reaction container in a proportion of 0.4 mg/ml PRP. D. The pH value of the mixture is adjusted to and maintained at 10.5

- 11,0 i 6 min. ved tilsetning av natriumhydroksyd. - 11.0 for 6 min. by adding sodium hydroxide.

E. pH verdien reduseres deretter til 6,0 med IN HC1. (Sur pH verdi stabiliserer de aktiverte seter som er dannet i polysakkaridet på grunn av cyanogenbromid. En reduksjon av pH verdien resulterer ytterligere i hydrolyse av PRP). E. The pH value is then reduced to 6.0 with IN HC1. (Acid pH value stabilizes the activated sites that are formed in the polysaccharide due to cyanogen bromide. A reduction of the pH value further results in hydrolysis of PRP).

G. Det tilsettes et likt volumsaltoppløsning med pH 6,0, forkjølt til 4°C. G. An equal volume of salt solution with pH 6.0, cooled to 4°C, is added.

H. Cyanogenbromidpolysakkaridblandingen overføres til en konsentrasjonsapparatur og konsentreres til det opprinnelige volum som er angitt 1 trinn A. I. Trinnene G og H gjentas tilsammen 10 ganger. Således fjernes ca. 99,956 ikke-forbrukt cyanogenbromid, mens polysak-karidkonsentrasjonen holdes ved 25 mg/ml. Hvis cyanogenbromid ikke fjernes reagerer dette med det difteri eksotoksoid som benyttes nedenfor. H. The cyanogen bromide polysaccharide mixture is transferred to a concentration apparatus and concentrated to the original volume indicated in 1 step A. I. Steps G and H are repeated a total of 10 times. Thus, approx. 99.956 unconsumed cyanogen bromide, while keeping the polysaccharide concentration at 25 mg/ml. If cyanogen bromide is not removed this reacts with the diphtheria exotoxoid used below.

Eksempel 3: Fremstilling av D-AH bærer Example 3: Preparation of D-AH carrier

A. Kommersielt difteri eksotoksoid (D) i destillert vann konsentreres til 20-40 mg/ml, karakteristisk 35 mg/ml, over en membran som holder tilbake molekyler over 10 000 dalton i en omrørt positiv trykkskonsentrator. A. Commercial diphtheria exotoxoid (D) in distilled water is concentrated to 20-40 mg/ml, typically 35 mg/ml, over a membrane that retains molecules above 10,000 daltons in a stirred positive pressure concentrator.

B. En tørrblanding av 8 mg adipinsyre dihydrazid (ADH), pr. mg protein og 0,75 mg l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbo-diimid (EDAC), pr. mg protein anbringes i en reaksjonsbeholder utstyrt med en effektiv rører og en pH sonde for å tillate overvåking og regulering av pH verdien. C. Difteri eksotoksoid tilsettes så til reaksjonsbeholderen der reaktantene foreligger som følger: difteri eksotoksoid = 35 mg protein/ml ADH = 8,0 mg/mg protein B. A dry mixture of 8 mg of adipic acid dihydrazide (ADH), per mg protein and 0.75 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDAC), per mg of protein is placed in a reaction vessel equipped with an efficient stirrer and a pH probe to allow monitoring and regulation of the pH value. C. Diphtheria exotoxoid is then added to the reaction vessel where the reactants are as follows: diphtheria exotoxoid = 35 mg protein/ml ADH = 8.0 mg/mg protein

EDAC = 0,75 mg/mg protein EDAC = 0.75 mg/mg protein

(bruken av acetatbuffer ved sekvensiell tilsetning av ADH og EDAC resulterer I en vedvarende flokkulentutfelling. Reaktantene har tilstrekkelig buffringskapasitet i seg selv). (the use of acetate buffer when sequentially adding ADH and EDAC results in persistent flocculent precipitation. The reactants have sufficient buffering capacity in themselves).

D. pH verdien justeres umiddelbart til 4,7 og holdes ved 4,7 +0,2 i minimum 2 timer. 1. Forløpet av den kjemiske reaksjon kan følges på skriveren til pH kontrollen. Hvis nødvendig lar man reaksjonen skride frem ut over to timer inntil pH verdien er stabil i minst 15 min. (Dvs. 15 min. uten nødvendig HC1 tilsetning for å regulere pH verdien). 2. Mengden forbrukt HC1 noteres som en prosesskon-troll. 3. Temperaturforandringer i reaksjonsbeholderen overvåkes også. D. The pH value is immediately adjusted to 4.7 and kept at 4.7 +0.2 for a minimum of 2 hours. 1. The course of the chemical reaction can be followed on the printer of the pH control. If necessary, the reaction is allowed to progress over two hours until the pH value is stable for at least 15 minutes. (That is, 15 min. without the necessary HC1 addition to regulate the pH value). 2. The amount of HC1 consumed is recorded as a process control. 3. Temperature changes in the reaction vessel are also monitored.

E. Reaksjonsproduktet dialyseres ved 4°C mot to forandringer av saltoppløsning, et minimum av 100 volumer og 8 timer pr. forandring. E. The reaction product is dialyzed at 4°C against two changes of salt solution, a minimum of 100 volumes and 8 hours per change.

F. Den dialyseres deretter mot to forandringer av fosfatbuffret saltoppløsning, minimalt volum, tid og temperatur som under E. F. It is then dialyzed against two changes of phosphate buffered saline, minimal volume, time and temperature as under E.

G. Produktet, (D-AH), konsentreres tilbake til 25 mg/ml protein med en positiv trykksapparatur og en membran på 10 000 MW. G. The product, (D-AH), is concentrated back to 25 mg/ml protein with a positive pressure apparatus and a 10,000 MW membrane.

H. Konsentratet filtreres sterilt (0,2 jam) og lagres ved 4°C. H. The concentrate is sterile filtered (0.2 µm) and stored at 4°C.

Prøver på en prøve fra en typisk lott av en slik A-AH bærer viste et forhold på 38,3 mikrogram ADH/mg DT. Kromatografi av denne prøve ga en Kd verdi på CL-4B Sefarose på 0,75, noe som tilsvarte en omtrentlig molekylvekt på 139 000 i forhold til proteinstandarder. Tests on a sample from a typical lot of such an A-AH carrier showed a ratio of 38.3 micrograms ADH/mg DT. Chromatography of this sample gave a Kd value on CL-4B Sepharose of 0.75, which corresponded to an approximate molecular weight of 139,000 relative to protein standards.

Eksempel 4: Dannelse av kovalent polysakkarid difteritoksoid Example 4: Formation of covalent polysaccharide diphtheria toxoid

konjugat (PRP-D) conjugate (PRP-D)

A. Difteritoksoid adipinsyre hydrazidbæreren, (D-AH) fra eks. 3, i en konsentrasjon på 25 mg/ml, behandles med natrlumbikarbonat til en konsentrasjon på 0,5M og pH verdien Justeres til 8,5. (Signifikant lavere saltkonsentrasjoner resulterer i dannelse av en gel i den endelige reaksjonsblanding med aktivert polysakkarid). A. The diphtheria toxoid adipic acid hydrazide carrier, (D-AH) from ex. 3, in a concentration of 25 mg/ml, is treated with sodium bicarbonate to a concentration of 0.5M and the pH value is adjusted to 8.5. (Significantly lower salt concentrations result in the formation of a gel in the final reaction mixture with activated polysaccharide).

B. I en reaksjonsbeholder som kan forsegles blir en lik mengde av den vaskede PRP-oppløsning som fremstilles i eks. 2 tilsatt og pH verdien bør være stabil ved 8,4 - 8,6. (Hvis CNBr ikke er fjernet vil pH verdien bevege seg hurtig nedover og det vil dannes et rikt bunnfall. Denne reaksjon inntrer selv 1 fravær av polysakkarid. Det bør ikke være noen vesentlig endring av det fysikalske utseende av reaktanten ved sammenføring). B. In a reaction container that can be sealed, an equal amount of the washed PRP solution prepared in ex. 2 added and the pH value should be stable at 8.4 - 8.6. (If CNBr is not removed, the pH value will move rapidly downwards and a rich precipitate will form. This reaction occurs even in the absence of polysaccharide. There should be no significant change in the physical appearance of the reactant when combined).

C. Reaksjonsblandingen rystes i 15 - 18 timer ved 4°C. C. The reaction mixture is shaken for 15 - 18 hours at 4°C.

D. Konjugatet renses ved gelpermeeringskromatografI på Sefakryl-300, bragt til likevekt i fosfatbuffret saltoppløs-ning for å fjerne ikke-omsatt protein og materialet med molekylstørrelse mindre enn 140 000 dalton i størrelse (hvis utgangspolysakkaridet er for lite vil det ikke være mulig å separere konjugatet fra fritt protein på denne måte). D. The conjugate is purified by gel permeation chromatography on Sefacryl-300, brought to equilibrium in phosphate-buffered saline to remove unreacted protein and the material with a molecular size smaller than 140,000 daltons in size (if the starting polysaccharide is too small it will not be possible to separate the conjugate from free protein in this way).

E. Prøver av dette rensede konjugat fjernes for kjemisk analyse, beskrevet nedenfor. E. Samples of this purified conjugate are removed for chemical analysis, described below.

F. Timerosal tilsettes til det rensede konjugat til en konsentrasjon av 1:10 000 og produktet lagres ved 4"C inntil analyse. F. Thimerosal is added to the purified conjugate to a concentration of 1:10,000 and the product is stored at 4°C until analysis.

G. Produktet blir 0,2 pm sterilfUtrert. (Hvis polysakkaridet ikke har den størrelse som beskrevet i eks. I(D), dvs. hvis et er for stort, vil det resulterende konjugat ikke være filtrerbart). G. The product is 0.2 pm sterile filtered. (If the polysaccharide does not have the size described in ex. I(D), i.e. if it is too large, the resulting conjugate will not be filterable).

Analyse. Analysis.

Prøver gjennomført på massekonsentratet fra eks. IV ga følgende resultater: Tests carried out on the pulp concentrate from e.g. IV gave the following results:

a) Riboseinnhold: 156,5 mikrogram/ml. a) Ribose content: 156.5 micrograms/ml.

(For beregning av PRP verdiene i eks. 5 ble en omdanningsfak-tor på 2 benyttet for å beregne en nominell polysakkaridkon-sentrasjon, basert på den empirisk bestemte ribosekonsentra-sjon). (For calculating the PRP values in example 5, a conversion factor of 2 was used to calculate a nominal polysaccharide concentration, based on the empirically determined ribose concentration).

b) Proteininnhold: 3 mikrogram/ml. b) Protein content: 3 micrograms/ml.

c) Ribose/proteinforhold: 0,47 (grenser 0,25-1,0). c) Ribose/protein ratio: 0.47 (limits 0.25-1.0).

d) Kromatografisk analyse på Sefarose CL-2B ga den kromatografiske profil som viser en homogen fordeling d) Chromatographic analysis on Sepharose CL-2B gave the chromatographic profile showing a homogeneous distribution

av konjugatmolekyler som et enkelt signal. of conjugate molecules as a single signal.

e) Kd (polysakkarid): 0,36 ved bruk av sefarose C1-4B, 0,77 ved bruk av C1-2B. e) Kd (polysaccharide): 0.36 using sepharose C1-4B, 0.77 using C1-2B.

Bestemt ved individuell fraksjonsriboseprøving for PRP. En verdi på 0,36 på C1-4B tilsvarer en omtrentlig molekylstørr-else på 674 000 i forhold til dextranstandarder. f) Kd (protein): 0,34 ved bruk av C1-4B; 0,71 ved bruk av C1-2B. Determined by individual fractional ribose assay for PRP. A value of 0.36 for C1-4B corresponds to an approximate molecular size of 674,000 relative to dextran standards. f) Kd (protein): 0.34 using C1-4B; 0.71 using C1-2B.

Bestemt ved individuell fraksjons Lowry prøving på protein. Forandring i Kd verdien for difteri eksotoksoidet fra 0,755 til 0,34 på C1-4B viser at konjugeringen av protein med polysakkarid gir et molekyl som er kromatografisk forskjellig fra hvert av råstoffene. Determined by individual fraction Lowry test on protein. Change in the Kd value for the diphtheria exotoxoid from 0.755 to 0.34 on C1-4B shows that the conjugation of protein with polysaccharide gives a molecule that is chromatographically different from each of the raw materials.

g) Fritt protein: mindre enn 556. g) Free protein: less than 556.

Fritt protein representerer derivatisert difteri bærer Free protein represents derivatized diphtheria carrier

protein som ikke er bundet til PRP. Det bestemmes ved sammenligning av mengden protein som elueres i posisjonen for protein that is not bound to PRP. It is determined by comparing the amount of protein eluted in the position for

en difteri eksotoksoidprøve i forhold til totalt eluert protein. a diphtheria exotoxoid sample relative to total eluted protein.

h) Endotoksininnhold: 1 pg/ml. h) Endotoxin content: 1 pg/ml.

Endotoksin ble kvantitativt bestemt ved Limulus Amoebocyte Endotoxin was quantitatively determined by Limulus Amoebocyte

til Lysatprøve (LAL). Endotoksininnholdet utgjorde 64 ng per 10 jjg ribose human dose PRP-D. for Lysate test (LAL). The endotoxin content amounted to 64 ng per 10 jjg ribose human dose of PRP-D.

i) Pyrogenitet: i) Pyrogenicity:

Massenkonsentratet møter US standarder med henblikk på ikke-pyrogenitet ved bruk av en vektekvivalent (human) dose av 0,15 jjg ribose pr. ml pr. kg kroppsvekt for kanin. The pulp concentrate meets US standards for non-pyrogenicity using a weight-equivalent (human) dose of 0.15 jjg ribose per ml per kg body weight for rabbit.

j) Polyakrylamidgelelektroforese, PAGE: j) Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE:

PAGE analyse ble gjennomført for å oppnå understøttende indisier på renhet og kovalent binding mellom polysakkarid og protein. Mens fri bærer går såvidt over halvveis inn i stavgelen ved omtrent posisjonen for katalase, 60 000 MV, var PRP-D konjugatet ikke istand til å trenge inn i gelen (først til posisjonen for thyroglobulin, 330 000 MW). PRP-D viste et enkelt signal som utgang. PAGE analysis was carried out to obtain supporting evidence of purity and covalent binding between polysaccharide and protein. While free carrier enters about halfway into the rod gel at approximately the position of catalase, 60,000 MW, the PRP-D conjugate was unable to penetrate the gel (first to the position of thyroglobulin, 330,000 MW). PRP-D showed a single signal as output.

k) Cyanogenbromid: k) Cyanogen bromide:

Mens cyanogenbromid, (CNBr), benyttes i de første trinn før fremstilling av et PRP-D konjugat, blir det deretter eksklu-dert fra produktet. Flere trinn i prosessen bidrar til reduksjon av innholdet. Til slutt fjerner en siste rensing av vaksinen ved gelpemeeringskromatografi enhver forurensning under 100 000 MW. Denne rensing forhindrer forurensning med rent spor av fritt CNBr eller nedbrytningsprodukter derav. 1) Varmestabilitet: Et studium av varmemotstandsevnen for PRP-D konjugatvaksinen ble gjennomført. Materialmassen ble konsentrert 40 ganger og tre 3ml prøver ble tatt. Den første ble holdt ved 4 ° C vannbad i 16 timer og den tredje ble oppvarmet i et 100" C vannbad i 30 min. Prøvene som ble gjennomført var på protein- og riboseinnhold, gelpermeeringskromatografi med sefarode C1-4B og SDS-polysakkridgelelektro-forese (PAGE). While cyanogen bromide (CNBr) is used in the first steps before the production of a PRP-D conjugate, it is then excluded from the product. Several steps in the process contribute to reducing the content. Finally, a final purification of the vaccine by gel permeation chromatography removes any contamination below 100,000 MW. This purification prevents contamination with pure traces of free CNBr or its decomposition products. 1) Heat stability: A study of the heat resistance of the PRP-D conjugate vaccine was carried out. The mass of material was concentrated 40 times and three 3ml samples were taken. The first was kept at 4°C water bath for 16 hours and the third was heated in a 100°C water bath for 30 min. The tests carried out were for protein and ribose content, gel permeation chromatography with sepharode C1-4B and SDS-polysaccharridge gel electrophoresis (PAGE).

Resultatene viste ingen vesentlige endringer i ribose- eller proteininnhold mellom prøvene sammenlignet med resultatene i prøvene a) og b) ovenfor. De kromatografiske analyser viste en mindre reduksjon i molekylstørrelsen av konjugatmaterlalet når betingelsene ble gjort i økende grad strengere. Ved fraksjonert analyse av disse prøver ved måling av absorbansen ved 254 nm, bibeholdt imidlertid materialet kun et signal som falt sammen med polysakkaridsignalet og det opptrådte ikke noe fritt proteinsignal; resultatene er således sammenlign-bare med de under d) og g) ovenfor. Dette viser at bindingen mellom protein og polysakkarid ikke ble brutt, men at reduk-sjonen i molekylstørrelse skyldtes oppbryting av bindinger innen det lineære polysakkarid. Dette ble ytterligere påvist ved sammenligning av PAGE analyse av disse prøver med resultatene som er beskrevet under j) ovenfor, fritt protein var ikke påvisbart i noen av prøvene, selv i nærvær av et vaskemiddel (natriumdodecylsulfat). Dette bekrefter sterkt kovalensen for den derivatisete protein-polysakkaridbinding og dennes stabilitet under høytemperaturbehandlingen. The results showed no significant changes in ribose or protein content between the samples compared to the results in samples a) and b) above. The chromatographic analyzes showed a minor reduction in the molecular size of the conjugate material when the conditions were made progressively more stringent. On fractional analysis of these samples by measuring the absorbance at 254 nm, however, the material only retained a signal that coincided with the polysaccharide signal and no free protein signal appeared; the results are thus comparable to those under d) and g) above. This shows that the bond between protein and polysaccharide was not broken, but that the reduction in molecular size was due to the breaking of bonds within the linear polysaccharide. This was further demonstrated by comparing PAGE analysis of these samples with the results described under j) above, free protein was not detectable in any of the samples, even in the presence of a detergent (sodium dodecyl sulfate). This strongly confirms the covalency of the derivative protein-polysaccharide bond and its stability during the high-temperature treatment.

Eksempel 5. PRP-D immunitetsprøver. Example 5. PRP-D immunity tests.

Dette forsøk skal vise T-celleavhengigheten påvist av: bæreravhengigheten, bærerspesifisitet, sirkelvirkning og forandring i lg klasse. Forsøket ble gjennomført i to deler: 1) en første forbehandlingssekvens med to injiseringer; This experiment will show the T-cell dependence demonstrated by: carrier dependence, carrier specificity, circular effect and change in lg class. The trial was conducted in two parts: 1) a first pretreatment sequence with two injections;

2) en utfordrersekvens med to Injiseringer. 2) a challenger sequence with two Injections.

Materialer: Materials:

1. PRP-D bulk konsentrat, eksempel 4. 1. PRP-D bulk concentrate, example 4.

2. Tetanus toksoid (TT) 2. Tetanus toxoid (TT)

3. Difteri toksoid (DT) 3. Diphtheria toxoid (DT)

4. H. influenzae b kapsulært polysakkarid, (PRP) 4. H. influenzae b capsular polysaccharide, (PRP)

5. PRP/D, en blanding av 20 pg PRP (10 pg ribose) og 20 pg D. 5. PRP/D, a mixture of 20 pg PRP (10 pg ribose) and 20 pg D.

6. PRP/D-AH, en blanding av 20 pg PRP (10 pg ribose) og 6. PRP/D-AH, a mixture of 20 pg PRP (10 pg ribose) and

20 pg D-AH. 20 pg D-AH.

Fremgangsmåte Approach

Alle immuniseringer ble inngitt uten hjelpemiddel i 1 ml volumer. Alle doser inneholdende PRP ble justert til 10 pg ribose pr. 1 ml dose. Ikke konjugert eksotoksoide doser ble justert til 20 pg pr. ml dose. En roterende plan ble benyttet med immuniseringer 14 dager fra hverandre. Hver immuniserlng ble fulgt av en tapping 10 dager senere. Alle preparater ble fortynnet i fosfatbuffret saltoppløsning inneholdende 0,0156 timerosal. Like mengder ble preparert som fire dosis ampuller og lagret ved -20°C. Tre kaniner ble immunisert i hver gruppe. All immunizations were administered without adjuvant in 1 ml volumes. All doses containing PRP were adjusted to 10 pg ribose per 1 ml dose. Unconjugated exotoxoid doses were adjusted to 20 pg per ml dose. A rotating schedule was used with immunizations 14 days apart. Each immunization was followed by a draw 10 days later. All preparations were diluted in phosphate-buffered saline containing 0.0156 thimerosal. Equal amounts were prepared as four dose ampoules and stored at -20°C. Three rabbits were immunized in each group.

Serologi; Serology;

Sera ble prøvet ved fastfase radio immunoprøving, (SPRIA), på anti-PRP, anti-D-AH, anti-DT, og anti-TT som antydet. Antistoffnivåene ble kvantitert som mikrogram IgG og IgM pr. ml. Sera were tested by solid phase radio immunoassay, (SPRIA), for anti-PRP, anti-D-AH, anti-DT, and anti-TT as indicated. The antibody levels were quantified as micrograms of IgG and IgM per ml.

Protokoll Protocol

Plan: Plan:

Kaniner ble fortappet og immunisert i henhold til gruppe hver 14. dag. Hver immunisering ble fulgt av en ettertapplng 10 dager senere. De første to Injeksjoner skjedde med primær immunogenet, mens den tredje og fjerde ble gjennomført med sekundær immunogenet. Rabbits were euthanized and immunized according to group every 14 days. Each immunization was followed by a booster 10 days later. The first two injections took place with the primary immunogen, while the third and fourth were carried out with the secondary immunogen.

Anti-PRP respons er vist i Fig. 1. De midlere nivå for IgG stoffer mot Haemophilus influenzae b kapsulært polysakkarid i de seks eksperimentelle grupper av kaniner (tre dyr pr. gruppe) er vist grafisk. Gruppene er angitt i denne figur i henhold til resultatene ovenfor. Fortappingsnivåer var mindre enn 1 pg pr. ml for alle kaniner og er ikke vist i denne figur for tydelighetens skyld. Åpne søyler representerer nivået for IgG etter to suksessive injeksjoner med primær immunogen. Fylte søyler viser IgG nivåer etter den tredje og fjerde injeksjon som var med sekundær- eller utfordrer immunogener. The anti-PRP response is shown in Fig. 1. The mean levels of IgG substances against Haemophilus influenzae b capsular polysaccharide in the six experimental groups of rabbits (three animals per group) are shown graphically. The groups are indicated in this figure according to the results above. Attrition levels were less than 1 pg per ml for all rabbits and is not shown in this figure for clarity. Open bars represent the level of IgG after two successive injections of primary immunogen. Filled bars show IgG levels after the third and fourth injections that were with secondary or challenge immunogens.

IgG responsene ble sett kun etter immunisering med PRP-D konjugat vaksine. Forbehandling av kaniner i gruppe 3 med difteritoksoid aksellererte responsen mot PRP-D mens forbehandling med tetanustoksoid (gruppe 2), ikke hadde noen virkning. The IgG responses were seen only after immunization with PRP-D conjugate vaccine. Pretreatment of rabbits in group 3 with diphtheria toxoid accelerated the response to PRP-D, while pretreatment with tetanus toxoid (group 2) had no effect.

Eksempel 6. Fremstilling av T-AH bærer og dannelse av kovalent polysakkarid tetanus toksoid konjugat, Example 6. Preparation of T-AH carrier and formation of covalent polysaccharide tetanus toxoid conjugate,

PRP-t. PRP-t.

I prosedyren i eksempel 3 benyttes kommersielt tetanus toksoid istedet for difteri toksoid for å oppnå adipinsyre hydrazidderivatet. In the procedure in example 3, commercial tetanus toxoid is used instead of diphtheria toxoid to obtain the adipic acid hydrazide derivative.

Analyse på en prøve av en typisk lott T-AH bærer viste et forhold på 53,9 mikrogram ADH/mgT. Kromatografi av prøven viste en Kd verdi på CL-4B sefarose på 0,66, noe som tilsvarte en omtrentlig molekylvekt på 227.000 i forhold til proteinstandarder. Analysis of a sample of a typical lot T-AH carrier showed a ratio of 53.9 micrograms ADH/mgT. Chromatography of the sample showed a Kd value on CL-4B sepharose of 0.66, which corresponded to an approximate molecular weight of 227,000 relative to protein standards.

Polysakkarid konjugater med adipinsyre hydrazidderivatet av tetanus toksoid dannes ved bruk av de samme prosedyrer som for D-AH, som beskrevet i eksempel IV. Polysaccharide conjugates with the adipic acid hydrazide derivative of tetanus toxoid are formed using the same procedures as for D-AH, as described in Example IV.

Analyser av en typisk lott PRP-T viste 142,6 mikrogram polysakkarid og 260 mikrogram protein pr. ml. Konjugatet var oppløselig og 0,2 pm filtrerbart. Kromatograf ert på CL-4B viste proteinkomponenten en Kd verdi på 0,30 og polysakkarid komponenten en Kd verdi på 0,37. Analyzes of a typical lot of PRP-T showed 142.6 micrograms of polysaccharide and 260 micrograms of protein per ml. The conjugate was soluble and 0.2 µm filterable. Chromatographed on CL-4B, the protein component showed a Kd value of 0.30 and the polysaccharide component a Kd value of 0.37.

Claims

Process for the preparation of a water-insoluble covalent polysaccharide diphtheria toxoid conjugate capable of generating a T-cell-dependent antibody response against polysaccharide from Haemophilus influenzae b, with a molecular weight between 140,000 and 4,500,000 daltons, and with a ribose/protein ratio between 0.25 and 1.0, characterized in that it comprises: a) heating a capsular polysaccharide of Haemohilus influenzae b consisting of approximately equimolar amounts of ribose, ribitol and phosphate until more than 60% of the polysaccharides have a molecular size between 200,000 daltons and 2,000,000 daltons. b) activating the resulting sized polysaccharide with cyanogen bromide; c) removal of substantially all Unreacted Cyan Bromide; and d) reacting the acrid product with an adipic acid hydrazide derivatized diphtheria toxoid.

2. The hapten, essentially free of protein and nucleic acid, characterized in that it is produced from capsular Haemohilus influenzae b polysaccharide, consisting of approximately equal amounts of ribose, ribitol and phosphate, by heating to less than 20$6 of the polysaccharides has a molecular size below 200,000 daltons with dextran standard as reference, by gel permeation chromatography.

3. The hapten according to claim 2, characterized in that polysaccharides are present as sodium salt.