DE3686607T2

DE3686607T2 - Hypocholesttrinaemisch und/oder hypotriglyceridaemisch aktive rns-fraktionen.

Info

Publication number: DE3686607T2
Application number: DE8686304773T
Authority: DE
Inventors: Yasuo Kawai; Kazunaga Yazawa
Original assignee: Advance KK
Current assignee: Advance KK
Priority date: 1985-07-03
Filing date: 1986-06-20
Publication date: 1993-01-21
Anticipated expiration: 2006-06-21
Also published as: EP0207700A2; US4833129A; DE3686607D1; EP0207700A3; EP0207700B1; JPS625991A; CA1276898C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue hypocholesterinämisch und/oder hypotriglyceridämisch wirkende Ribonukleinsäure (d.h, RNS)-Fraktionen, ein Verfahren zur Herstellung derselben, eine dieselbe enthaltende hypocholesterinämisch und/oder hypotriglyceridämisch wirkende pharmazeutische Zusammensetzung und ein Verfahren zur Verringerung des Blutcholesterins und -triglycerids in Säugern.
Es ist bekannt, daß verschiedene pharmazeutische Zubereitungen wie Clofibrat und seine verwandten Zubereitungen als Therapeutika für die Atherosklerose oder Hyperlipidämie vorgeschlagen wurden, welche als typische Krankheit Personen mittleren Alters oder geriatrische Krankheit angesehen werden. Jedoch sind diese bekannten Arzneimittel im Hinblick auf beispielsweise die pharmakologischen Wirkungen und Nebenwirkungen nicht völlig befriedigend, und es besteht ein starkes Bedürfnis zur Entwicklung sicherer und wirksamerer Arzneimittel.
Folglich ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, neue hypocholesterinämisch und/oder hypotriglyceridämisch wirkende RNS-Fraktionen bereitzustellen, die Säugern sicher verabreicht werden können.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung neuer hypocholesterinämisch und/oder hypotriglyceridämisch wirkender RNS-Fraktionen bereitzustellen, die fähig sind, in wirksamer Weise Blutcholesterin und -triglycerid in Säugern zu verringern.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer hypocholesterinämisch und/oder hypotriglyceridämisch wirkenden pharmazeutischen Zusammensetzung, die als aktiven Bestandteil neue RNS- Fraktionen enthält.
Ein zusätzliches Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Verringerung des Cholesterins und der Triglyceride im Blut von Säugern bereitzustellen.
Andere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden in der nachfolgend dargelegten Beschreibung offenbart.
Erfindungsgemäß werden hypocholesterinämisch und/oder hypotriglyceridämisch wirkende RNS-Fraktionen bereitgestellt, welche die folgenden Eigenschaften besitzen:
(a) Molekulargewicht durch Gelfiltration: 2.000 ± 1.000
(b) Basiszusammensetzungsverhältnis der Nukleinsäure:
Uracil : Guanin : Cytosin : Adenin
= 13,0 : 16,0 : 16,0 : 10,0
(c) Infrarotabsorptionsspektrum: in Fig. 2 gezeigt
(d) Physiologische Eigenschaften: Eine hypocholesterinämische und/oder hypotriglyceridämische Wirkung in Säugern.
Diese hypocholesterinämisch und/oder hypotriglyceridämisch wirkenden RNS-Fraktionen können durch Kultivierung eines zur Gattung Streptococcus gehörenden Mikroorganismus in einem dazu geeigeten Kulturmedium hergestellt und die hypocholesterinämisch und/oder hypotriglyceridämisch wirkenden RNS-Fraktionen aus den kultivierten Zellen des Mikroorganismus gesammelt werden. Die vorliegenden hypocholesterinämisch und/oder hypotriglyceridämisch wirkenden RNS-Fraktionen können als aktiver Bestandteil einer hypocholesterinämischen und/oder hypotriglyceridämischen pharmazeutischen Zusammensetzung gemeinsam mit einem pharmazeutisch verwendbaren Träger dafür verwendet werden, um eine zur oralen Verabreichung an Säuger geeignete hypocholesterinämische und/oder hypotriglyceridämische pharmazeutische Zusammensetzung herzustellen.
Die vorliegende Erfindung wird aus der folgend dargelegten Beschreibung unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen besser zu verstehen sein, von denen
Figur 1 das Verhältnis zwischen dem Molekulargewicht der Materialien und ihren Elutionsvolumen bei der Gelfiltration darstellt,
Figur 2 ein Infrarotabsorptionsspektrum der hypocholesterinämisch und/oder hypotriglyceridämisch wirkenden RNS-Fraktionen der vorliegenden Erfindung zeigt,
Figur 3 das Elutionsmuster der Gelfiltration der hypocholesterinämisch und/oder hypotriglyceridämisch wirkenden RNS-Fraktionen der vorliegenden Erfindung zeigt.
Es wurde gefunden, daß die neuen, aus zur Gattung Streptococcus gehörenden Mikroorganismus erhaltenen RNS-Fraktionen in wirksamer Weise Cholestrin und Triglyceride im Blut verringern und daß aus sogenannten Gastrointestinalbakterien gewonnene Bestandteile im wesentlichen untoxisch bei oraler Verabreichung sind.
Die zur Herstellung des Produkts verwendeten Mikroorganismen, das Herstellungsverfahren, die physikochemischen Eigenschaften und die pharmakologischen Wirkungen der hypocholesterinämisch und/oder hypotriglyceridämisch wirkenden RNS-Fraktionen gemäß der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend detailliert beschrieben.

Mikroorganismen

1. Spezies

Erfindungsgemäß zu verwendende Mikroorganismen gehören der Gattung Streptococcus an und sind vorzugsweise Streptococcus faecium, Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus avium, Streptococcus durans, Streptococcus salivarius, Streptococcus mitis, Streptococcus equinus und andere.
Typische Beispiele solcher Mikroorganismen wurden seit dem 15. Juli 1982 in dem Fermentation Research Institute (FRI) hinterlegt und dem FRI übertragen (d.h., International Depository Authority under Budapest Treaty in Japan). Die Hinterlegungsnummern sind unten in der Tabelle 1 aufgelistet. Tabelle 1 Stämme Hinterlegungsnummer Streptococcus faecium Streptococcus faecalis Streptococcus avium Streptococcus salivarius Streptococcus durans Streptococcus mitis Streptococcus equinus

2. Mikrobiologische Eigenschaften der Mikroorganismen

Allgemeine mikrobiologische Eigenschaften

Die mikrobiologischen Eigenschaften der Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung sind die gleichen wie diejenigen bekannter Mikroorganismen, die zur selben Klasse gehören. Das bedeutet, die allgemeinen mikrobiologischen Eigenschaften, Kultivierungsverfahren und andere Eigenschaften, die den in folgenden Aufsätzen beschriebenen entsprechen:
1) Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th ed., 490 - 509 (1974)
2) Int. J. Syst. Bact. 16, 114 (1966)
3) Microbiol. Immunol. 25 (3), 257 - 269 (1981)
4) J. Clin. Pathol. 33, 53 - 57 (1980)
5) J. General Microbiol. 128, 713 - 720 (1982)
6) Applied Microbiol. 23 (6), 1131 - 1139 (1972)
Typische mikrobiologische Eigenschaften der oben beispielhaft herangezogenen Stämme gemäß der vorliegenden Erfindung sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Tabelle 2 Stämme Eigenschaften FERM BP sphäroid Zellgestalt Gramfärbung Hämolyse Wachstum bei Wärmewiderstandsfähigkeit bei 30 Min. bei 60ºC Wachstum im Kulturmedium bei einem pH-Wert von 9,6 Methylenblau-Reduktion Verflüssigung von Gelatine Wachstum im NaCl (6,5 %) enthaltenden Kulturmedium Wachstum im Galle (40 %) enthaltenden Kulturmedium Ammoniakbildung Hippursäurehydrolyse Wachstum im Tellurit enthaltenden Kulturmedium Wachstum im TTC enthaltenden Kulturmedium *1 Säureproduktion aus Glucose Esculin Inulin Lactose Glycerol Arabinose Melezitose Sorbitol Antigengruppe ND*2 *1: 2, 3, 5-Triphenyltetrazoliumchlorid *2: nicht durchgeführt

3. Kultivierungsverfahren

Diese Mikroorganismen können in herkömmlicher Weise kultiviert werden. Beispielsweise können die bakteriellen Zellen durch stationäre Kultivierung in einem Rogosabrühemedium (Efthymiou, C., and Hansen, P.A. (1962) An antigenic analysis of Lactobacillus acidophilus. J. Infect. Dis. 110: 258 - 267) der folgenden Zusammensetzung gesammelt und anschließend durch Zentrifugieren geerntet werden.

Die Zusammensetzung des Rogosabrühemediums

Trypticase 10 g (BBL Microbiology Systems)
Hefeextrakt 5g (Difco Laboratories)
Tryptose 3g (Difco Laboratories)
K&sub2;HPO&sub4; 3g
KH&sub2;PO&sub4; 3g
Triammoniumcitrat 2g
Tween 80 1g
Glucose 20 g
Cysteinehydrochlorid 0,2 g
Salzlösung 1* 5 ml
Destilliertes Wasser auf 1 Liter (pH 7, fünfzehnminütige Hitzesterilisation bei 121ºC)
*1 MgSO&sub4;-7H&sub2;O 11,5 g
FeSO&sub4;-7H&sub2;O 0,68 g
MnSO&sub4;-2H&sub2;O 2,4 g
Destilliertes Wasser 100 ml

Herstellung der hypocholesterinämisch und/oder hypotriglyceridämisch wirkenden RNS-Fraktionen

Ein Beispiel typischer Maßnahmen zur Herstellung der erfindungsgemäßen, hypocholesterinämisch und/oder hypotriglyceridämisch wirkenden RNS-Fraktionen wird nachfolgend dargestellt:

1. Sammlung der Mikroorganismen

Jeder der oben gezeigten Mikroorganismenstämme wurde in ein Rogosabrühemedium eingebracht und ohne Bewegung bei 37ºC 5 bis 15 Stunden lang inkubiert, um eine nachfolgende Kulturbrühe mit einer bestimmten lebensfähigen Bakterienzellkonzentration zu erhalten. Die Kulturbrühe wurde kontinuierlich bei 12.000 Upm zentrifugiert und die geernteten bakteriellen Zellen anschließend zwei- bis dreimal in einer Salzlösung (0,85 % NaCl) gewaschen.

2. Salzsäureextraktion

Die gewaschenen Zellen wurden in einer 0,2 N HCL-Lösung suspendiert und bei 100ºC 5 bis 15 Minuten lang in einem Wasserbad wärmebehandelt. Die wärmebehandelte Zellsuspension wurde bei 100.000 x g 15 Minuten zentrifugiert und der Überstand mit NaOH-Lösung neutralisiert und dialysiert. Die innere Flüssigkeit wurde lyophillisiert und in Trichloressigsäure (TCA) -lösung suspendiert und die Lösung 3 bis 5 Stunden bei 4ºC gehalten. Nach 10- bis 20-minütigem Zentrifugieren bei 15.000 x g wurde der Überstand mit NaOH-Lösung neutralisiert und wiederum dialysiert und die innere Flüssigkeit lyophillisiert.

3. Isolierung und Reinigung der RNS-Fraktionen

Es wurde eine Gelfiltration des obigen lyophillisierten Materials unter Verwendung von Sephadex G-75 (Pharmacia Fine Chemicals) durchgeführt und alle 10 ml ein Eluat genommen, um die Fraktionen, die gemäß dem Orcinolverfahren einen Absorptionshöchstwert (A&sub6;&sub6;&sub0; nm) haben, zu isolieren. Die isolierten Fraktionen wurden noch einmal durch Sephadex G-75 (Pharmacia Fine Chemicals) gereinigt, um die erwünschten wirksamen RNS-Fraktionen zu erhalten.
Die hypocholesterinämisch und/oder hypotriglyceridämisch wirkenden RNS-Fraktionen können im allgemeinen gemäß deren physikochemischen, unten erwähnten Eigenschaften präpariert werden, durch viele Isolierungs- und Reinigungsverfahren, die auf dem betreffenden Feld schon weit verbreitet eingesetzt werden, wie Präzipitation-Lösung und Extraktion, flüssige Extraktion, Dialyse, Säulenchromatographie, Elektrophorese, Gelfiltration oder einer Kombination dieser Verfahren. Diesbezüglich ist die vorliegende Erfindung in keiner Weise auf ein bestimmtes Verfahren beschränkt.
Das bedeutet, daß die erfindungsgemäße Zubereitung auf die Herstellungsverfahren für hypocholesterinämisch und/oder hypotriglyceridämisch wirkenden Produkte bezogen ist, die aus RNS-Fraktionen zusammengesetzt sind und aus zur Gattung Streptococcus gehörenden Mikroorganismen erhalten werden, weil die pharmakologische Aktivität in diesen RNS-Fraktionen gefunden wurde.

Physikochemische Eigenschaften der hypocholesterinämisch und/oder hypotriglyceridämisch wirkenden RNS-Fraktionen

Die physikochemischen und physiologischen Eigenschaften der hypocholesterinämisch und/oder hypotriglyceridämisch wirkenden RNS-Fraktionen der vorliegenden Erfindung sind die folgenden:

1. Chemische Natur und Löslichkeit

Die lyophillisierte Probe der erfindungsgemäßen RNS-Fraktionen ist leicht gelb und löslich in Wasser, 1 N NaOH und 1 N HCL-Lösung, unlöslich in Alkohol und Äther und wenig löslich in Benzol.

2. Molekulargewicht

Eine Gelfiltration wurde mit einem 0,05 M Tris-Salzsäurepuffer (pH 7,4) als Eluierungsmittel unter Verwendung von Sephacryl S-200 (Pharmacia Fine Chemicals) durchgeführt. Die Absorption nach dem Phenol- H&sub2;SO&sub4;-Verfahren (A&sub4;&sub9;&sub0; nm), A&sub2;&sub8;&sub0; nm und A&sub2;&sub6;&sub0; nm jeder wie oben erhaltenen Fraktion wurde gemessen und in eine Glucosemenge unter Verwendung von Dextranen als Standard umgerechnet. Die Ergebnisse werden in Fig. 4 gezeigt, wo die Abszisse und die Ordinate jeweils das Elutionsvolumen (ml) und das Molekulargewicht anzeigen. Punkt A zeigt das Molekulargewicht der erfindungsgemäßen RNS-Fraktion. Die Punkte B, C und D entsprechen jeweils den Molekulargewichten 5.000, 40.000 und 70.000 der Standarddextrane.
Das Molekulargewicht der Probe wir somit auf 2.700 geschätzt.

3. Infrarotabsorptionsspektrum

Das Infrarotabsorptionsspektrum der hypocholesterinämisch und/oder hypotriglyceridämisch wirksamen RNS-Fraktionen, gemessen mittels KBr-Tablette und Infrarotspektrometer (Modell JASCO A-302, Japan Spectroscopic Co., Ltd), ist in Fig. 2 gezeigt, wo die Abszisse und die Ordinate jeweils die Wellenlänge und prozentuale Transmission zeigen.

4. Basiszusammensetzung der Nukleinsäure

Die Basiszusammensetzung der Nukleinsäure, welche mit 1 ml einer 0,3 N KOH-Lösung bei 37ºC 18 Stunden lang hydrolisiert wurde, wurde mit U (Uracil) :G (Guanin) : C (Cytosin) : A (Adenin) = 13,0 : 16,0 :16,0 : 10,0 durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie (1) ermittelt.
(1) Die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC)-Analysen wurden unter den unten gezeigten Bedingungen durchgeführt.
HPCL: Hitachi 655 Flüssigkeitschromatograph
Detektor: Hitachi 638-0410
Wellenlänge: 270 nm
Bereich: 1,28 AUFS
Säule: Partisil 1OSAX
Eluierungsmittel: 0,05 M KH&sub2;PD&sub4; Puffer (pH 3,05)
Flußgeschwindigkeit: 1,0 ml/min
Standardmaterialien: 2'(3')-AMP, free lot No. 1
2'(3')-GMP, free lot No. 40323
2'(3')-CMP, free lot No. 521
2'(3')-UMP, free lot No. 40629

5. Physiologische Eigenschaften

Die hypocholesterinämisch und/oder hypotriglyceridämisch wirkenden RNS-Fraktionen haben eine das Blutcholesterin und Bluttriglycerid verringernde Wirkung, wenn sie Säugern oral verabreicht werden.

Pharmakologische Wirkungen

1. Wie in dem folgenden Beispiel gezeigt, ist das vorliegende antiatherosklerotische Arzneimittel, das aus hypocholesterinämisch und/oder hypotriglyceridämisch wirkenden RNS-Fraktionen der vorliegenden Erfindung zusammengesetzt ist, besonders wirksam in der Verringerung des Blutcholesterinspiegels und Bluttriglyceridspiegels in Säugern. Folglich ist dieses Arzneimittel nützlich als therapeutisches oder präventives Heilmittel bei Krankheiten, mit denen diese Parameter des Serums eng verbunden sind, wie Atherosklerose, Hyperlipidämie, Cerebalatherosklerose, Hyperlipoproteinämie, Xanthomatose, Cholecystolithiasis, Hepatocholepathie, Nephropathie (Nephrosesyndrom), Hypertonie, Diabetes, Cardiopathie, endokrinologische Störungen, Hypothyriose, Adipositas und andere.
Die erfindungsgemäße Zubereitung kann Säugern oral, intraperitoneal, intravenös oder auf anderen Wegen verabreicht werden. Die Dosis beträgt vorzugsweise etwa 10 um bis 0,5 g/kg Körpergewicht. Eine orale Verabreichung von etwa 0,1 mg bis 50 mg/kg Körpergewicht ist bevorzugt. Jede Arzneimittelform der vorliegenden Erfindung kann ausgewählt werden und als Lösung in physiologischer Salzlösung und anderen, Injektionen, lyophillisierten Pudern etc., Suppositorien, dem Darm entsprechend beschichtete Tabletten, Sublingualtabletten, Granulate, Tabletten, Kapseln etc., mit geeigneten Trägern, Grundstoffen, Verdünnungsmitteln etc. benutzt werden.

2. Akute Toxizität

Wie in den nachfolgenden Beispielen gezeigt ist die LD50 der hypocholesterinämisch und/oder hypotriglyceridämisch wirkenden RNS-Fraktionen der Erfindung größer als 1,260 mg/kg Körpergewicht bei intraperitonealer Verabreichung an Mäuse. Die Substanz ist bei oraler Gabe im wesentlichen untoxisch.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird nun weiterhin durch die folgenden, in keiner Weise begrenzenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Herstellung und Reinigung der hypocholesterinämisch und/oder hypotriglyceridämisch wirkenden RNS-Fraktionen.

100 Liter des mit Streptococcus faecium ADV1009 (FERM BP-296) beimpften Rogosabrühemediums wurden 10 Stunden lang ohne Rühren bei 37ºC inkubiert. Den erhaltenen 320 g nassen Bakterienzellen wurden 0,8 1 0,2 N HCL-Lösung hinzugefügt und 10 Minuten lang bei 100ºC in einem Wasserbad wärmebehandelt. Die wärmebehandelte Zellsuspension wurde bei 100.000 x g 15 Minuten zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde mit NaOH-Lösung neutralisiert und dialysiert (Schnitt mit Molekulargewicht von 3.500) unter Verwendung einer Spektrapor Dialysemembran (Spectrum Medical Industries, Inc.). Die erhaltene innere Flüssigkeit wurde lyophillisiert, in 8 %-iger TCA-Lösung suspendiert und 4 Stunden bei 4ºC gehalten. Die behandelte Probe wurde bei 15.000 x g 15 Minuten zentrifugiert und der Überstand mit NaOH-Lösung neutralisiert und wieder dialysiert (Schnitt mit Molekulargewicht von 3.500). Nach der Lyophillisation der inneren Flüssigkeit wurde eine Gelfiltration mit 0,2 M Pyridinessigsäurepuffer (pH 5,02) als Eluierungsmittel unter Verwendung einer Sephadex G-75 Säule von 4 x 100 cm (Pharmacia Fine Chemicals) durchgeführt. Es wurden Fraktionen von etwa 10 ml der Gelfiltration der Probe genommen und mittels des Phenol-H&sub2;SO&sub4;-Verfahrens, dem Orcinolverfahren und dem Lowryverfahren untersucht. Die Ergebnisse werden in der Fig. 3 gezeigt, wo die Abszisse und die Ordinate jeweils die Fraktionsnummer und die Absorption zeigen. E zeigt die Werte des Phenol-H&sub2;SO&sub4;-Verfahrens (A&sub4;&sub9;&sub0; nm) und F die des Orcinolverfahrens (A&sub6;&sub6;&sub0; mm). Keine Absorption zeigte sich in diesen Fraktionen nach dem Lowryverfahren (A&sub7;&sub5;&sub0; mm).
Die Fraktion F wurde mittels Sephadex G-75 Gelfiltration noch einmal gereinigt und die erwünschten wirksamen RNS-Fraktionen in einer Menge von 1,84 g erhalten.
Die chemische Zusammensetzung der RNS-Fraktionen wird in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Bestandteile Protein Zucker Verfahren % Lowry Methode Phenol-H&sub2;SO&sub4; Methode Anthron-H&sub2;SO&sub4; Methode Orcinol Methode Diphenylamin Methode*Das Phenol-H&sub2;SO&sub4;-Verfahren zeigt einen höheren Wert für Zucker als das Anthron-H&sub2;SO&sub4;-Verfahren wegen der Reaktion mit den Zuckerresten der Nukleinsäuren.
Es wurde sichergestellt, daß die gleichen RNS- Fraktionen wie in Beispiel 1 auch aus anderen, in der Tabelle 1 genannten Stämmen erhalten wurden.
Die physikochemischen Eigenschaften dieser RNS- Fraktionen waren die gleichen wie oben gezeigt.

Beispiel 2

Pharmakologische Wirkungen der hypocholesterinämisch und/oder hypotriglyceridämisch wirkenden RNS- Fraktionen

1. Hypocholesterinämische und/oder hypotriglyceridämische Wirkung (I)

Es wurden Lösungen, die eine Äquivalentmenge von 10 mg/kg Körpergewicht je ml der lyophillisierten hypocholesterinämisch und/oder hypotriglyceridämisch wirkenden RNS-Fraktionen enthalten, hergestellt. Diese Proben wurden oral (1 ml/Tag/Ratte) an herkömmliche Ratten (18 Wochen alt, männlich, mittleres Körpergewicht 242 g, 5 Ratten je Gruppe) und herkömmliche keimfreie Mäuse (10 Wochen alt, männlich, mittleres Körpergewicht 19,1 g, 5 Mäuse je Gruppe) verabreicht. Die Ratten und die Mäuse wurden 8 bis 12 Wochen gehalten. Arterielles Blut wurde aus der Bauchaorta dieser Tiere gesammelt und Serumproben durch Zentrifugieren vom Gesamtblut getrennt. Die Cholesterin- und Triglyceridspiegel wurden jeweils unter Verwendung von Choleskit (Kanto Chemical Co., Inc, Zurkowski method) und Triglycerid TG WAKO (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Acetylaceton-Extraktionsverfahren) bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefaßt. Die aufgelisteten Werte zeigen die Verringerung (%) gegenüber den Werten der Kontrollgruppe, denen keine Probe verabreicht wurde. Die Zusammensetzung (Gew.%) der ad libitum gegebenen Diät ist in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 4 Tiere Behandlungsdauer Cholesterin Verringerungswerte (%) Triglycerid Verringerungswerte (%) Herkömmliche Ratten (12 Wochen) Herkömmliche Mäuse (8 Wochen) Keimfreie Mäuse (8 Wochen) Tabelle 5 Zusammensetzung Gewicht (%) Milchcasein Sojabohnenöl Weizenstärke Mineralstoffe 1* Vitaminmischung 2* Gepulvertes Filterpapier (Cellulose) *1: Phillips-Hart-Salz * (Iwai Kagaku Co., Ltd.) Eisencitrat *: Phillips, P.H. und Hart, E.B., The effect of organic dietary constituents upon chronic fluorine toxicosis in the rat, J. Biol. Chem., 109, 657, (1935) *2: Panvitan Pulver (Takeda Chemical Industries, Ltd.) Cholinchlorid Calciumpantothenat Pyridoxinhydrochlorid Inositol Weizenstärke

2. Hypocholesterinämische und/oder hypotriglyceridämische Wirkung (II)

Die oben genannten Proben wurden 12 Wochen lang oral (1 ml/Tag/Ratte) an herkömmliche Ratten (18 Wochen alt, männlich, mittleres Körpergewicht 235 g, 5 Ratten je Gruppe) und an herkömmliche und keimfreie Mäuse (10 Wochen alt, männlich, mittleres Körpergewicht 23 g, 5 Mäuse je Gruppe) verabreicht. Die Blutcholesterin- und Triglyceridspiegel wurden wie oben erwähnt beschrieben. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 6 gezeigt.
Die Begriffe "cholesterinbeladen" und "fructosebeladen" in der Tabelle bedeuten jeweils die Zugabe von 1 % Cholesterin zu der oben erwähnten Diät und den Ersatz der Weizenstärke durch Fructose in der oben erwähnten Diät. Die Werte in der Tabelle zeigen die Verringerung (%) gegenüber den Werten der Kontrollgruppe ohne Verabreichung. Tabelle 6 Tiere Cholesterin Verringerungswert (%) Triglycerid Verringerungswert (%) Keimfreie Mäuse *1 Herkömmliche Mäuse *1 Herkömmliche Ratten *1 Herkömmliche Ratten *2 *1 : Cholesterinbeladene Diät *2: Fructosebeladene Diät

3. Hypocholesterinämische und/oder hypotriglyceridämische Wirkung (III)

Es wurden Lösungen, die eine Äquivalentmenge von 10 mg/kg Körpergewicht der RNS-Fraktionen enthalten, zwei Wochen lang an hyperlipidämische Ratten oral (1,0 ml/Tag/Ratte) verabreicht (8 Wochen alt, männlich, mittleres Körpergewicht 213 g, 5 Ratten je Gruppe), die mit einer cholesterinbeladenen Diät gefüttert wurden. Die Serumcholesterin- und Triglyceridspiegel wurden wie oben erwähnt bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Die Werte der Behandlungsgruppe sind die Cholesterin- und Triglyceridverringerung (%) gegenüber der nicht behandelten Kontrollgruppe. Tabelle 7 Tiere Cholesterin Verringerungswert (%) Triglycerid Verringerungswert (%) Behandelt Kontrolle

4. Dosiswirkung

Lösungen, die 0,1 mg - 20 mg/ml der hypocholesterinämisch und/oder triglyceridämisch wirkenden RNS- Fraktionen enthalten, wurden oral an herkömmliche Ratten (6 Wochen alt, männlich, mittleres Körpergewicht 207 g, 5 Ratten je Gruppe) 4 Wochen lang verabreicht (1 ml/Tag/Ratte). Die Blutcholesterin- und triglyceridspiegel wurden bestimmt wie oben beschrieben (Kontrollgruppe war eine nicht behandelte Gruppe). Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8 Dosierung (mg/Ratte) Cholesterin Verringerungswert (%) Triglycerid Verringerungswert (%) Kontrolle

5. Akute Toxizität

Proben physiologischer Salzlösung (0,5 ml/Maus), die 1, 10 und 100 mg der hypercholesterinämisch und/oder hypotriglyceridämisch wirkenden RNS-Fraktionen enthalten, wurden intraperitoneal an ICR-Mäuse (6 Wochen alt, männlich, mittleres Körpergewicht 28,4 + 0,5 g, 10 Mäuse je Gruppe) verabreicht. Die thanatobiologische Begutachtung der Maus wurde 14 Tage lang vorgenommen. Das Kontrollmaterial war physiologische Salzlösung.
Der gemäß Behrens-Kärber-Methode berechnete LD50-Wert war größer als 1,260 mg/kg Körpergewicht. Die Substanz war im wesentlichen untoxisch bei oraler Verabreichung.

6. Pharmazeutische Zubereitungen

(1) Eine Menge von 25 mg der gereinigten hypocholesterinämisch und/oder hypotriglyceridämisch wirkenden RNS-Fraktionen wurde gleichförmig mit 275 mg gereinigtem Stärkepulver gemischt und Tabletten zur oralen Verabreichung gebildet. Jede Tablette entsprach einer Dosierung von 2 x 10¹&sup0; wärmebehandelter Zellen/kg Körpergewicht für einen Erwachsenen mit einem Körpergewicht von 50 kg.
(2) Die hypocholesterinämisch und/oder hypotriglyceridämisch wirkenden RNS-Fraktionen wurden gleichförmig mit Grundstoffen wie Calciumcarbonat, Lactose etc., Schmiermitteln wie Stearinsäure, Talcum etc., und anderen Zusätzen vermischt und Tabletten zur oralen Verabreichung gebildet. Die tägliche Dosis der hypocholesterinämisch und/oder hypotriglyceridämisch wirksamen RNS-Fraktionen ist gewöhnlich 0,1 mg - 50 mg/kg Körpergewicht.
(3) Die hypocholesterinämisch und/oder hypotriglyceridämisch wirksamen RNS-Fraktionen (900 mg) wurden in destilliertem Wasser (30 ml) suspendiert und gelöst, mit Zuckersaft gesüßt und ein Sirup gebildet.

Claims

1. Hypocholesterolemisch und/oder hypotriglyceridemisch aktive RNA-Fraktionen, die von einem Mikroorganismus der Gattung Streptococcus ableitbar sind und die nachfolgenden Eigenschaften besitzen:

(a) Molekulargewicht durch Gelfiltration:

2.000 ± 1.000

(b) Basiszusammensetzungsverhältnis der Nukleinsäure:

Uracil : Guanin : Cytosin : Adenin = 13,0 : 16,0 : 16,0 : 10,0

(c) Infrarotabsorptionsspektrum:

in Figur 2 gezeigt

(d) Zusammensetzung:

1) RNA etwa 99,1 %, bestimmt durch das Orcinol- Verfahren,

2) etwa 2,9 % DNA, bestimmt durch das Diphenylamin- Verfahren,

3) etwa 4,8 % Protein, bestimmt durch das Lowry- Verfahren und

4) etwa 18,4 % Zucker, bestimmt durch das Phenyl-H&sub2;SO&sub4;- Verfahren, und etwa 3,4 % Zucker, bestimmt durch das Anthron-H&sub2;SO&sub4;-Verfahren; und

(e) eine hypocholesteralemische und/oder hypotriglyceridemische Aktivität in Säugetieren.

2. Hypocholesterolemisch und/oder hypotriglyceridemisch aktive RNA-Fraktionen nach Anspruch 1, bei denen der Mikroorganismus mindstens einer von S. Faecium, S. Faecalis, S.Avium, S. Salivarius, S.Durans, S. Mitis oder S. Equinus ist.

3. Hypocholesterolemisch und/oder hypotriglyceridemisch aktive RNA-Fraktionen nach Anspruch 1, bei denen der Mikroorganismus mindestens einer von S. Faecium FERM BP-296, S. Faecalis FERM BP-297, S. Avium FERM BP-298, S. Salivarius FERM BP-299, S. Durans FERM BP-300, S. Mitis FERM BP-301 oder S. Equinus FERM BP-302 ist.

4. Verfahren zur Gewinnung einer hypocholesterolemisch und/oder hypotriglyceridemisch aktiven RNA-Fraktion nach Anspruch 1, das die folgenden Schritte umfaßt:

(1) Kultivieren eines Mikroorganismus, der zur Gattung Streptococcus gehört, in einem Kulturmedium;

(2) Sammeln der gezüchteten Zellen;

(3) Erhitzen der gezüchteten Zellen, die in einem sauren Medium suspendiert sind;

(4) Gewinnen der aufschwimmenden Substanz aus den wärmebehandelten Zellsuspensionen;

(5) Isolieren durch Säulenchromatagraphieverfahren einer RNA-Fraktion, die die nachfolgenden Eigenschaften besitzt:

(a) Molekulargewicht durch Gelfiltration:

2.000 ± 1.000

(b) Basiszusammensetzungsverhaltnis der Nukleinsaure:

Uracil : Guanin : Cytasin : Adenin = 13,0 : 16,0 : 16,0 : 10,0

(c) Infrarotabsorptionsspektrum:

in Figur 2 gezeigt.

(d) hypocholesterolemische und/oder hypotriglyceridemische Aktivität in Säugetieren.

5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem der Mikroorganismus mindestens einer von S. Faecium, S. Faecalis, S. Avium, S. Salivarius, S. Durans, S. Mitis oder S. Equinus ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem der Mikroorganismus mindestens einer von S. Faecium FERM BP-296, S. Faecalis FERM BP-297, S. Avium FERM BP-298, S. Salivarius FERM BP-299, S. Durans FERM BP-300, S. Mitis FERM BP-301 oder S. Equinus FERM BP-302 ist.

7. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die hypocholesterolemisch und/oder hypotriglyceridemisch aktiven RNA-Fraktionen durch Trennen von Zellen des aus der Kulturbrühe gewonnenen Mikroorganismus gesammelt und hieraus RNA-Fraktionen abgetrennt werden.

8. Hypocholesterolemische oder hypotriglyceridemische pharmazeutische Zusammensetzung mit (A) einer hypocholesterolemisch und/oder hypotriglyceridemisch wirksamen Menge von hypocholesterolemisch und/oder hypotriglyceridemisch aktiven RNA-Fraktionen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und (B) einem pharmazeutisch akzeptierbaren Träger hierfür.

9. Hypocholesterolemisch und/oder hypotriglyceridemisch wirksame RNA-Fraktionen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung bei der Herstellung einer hypocholesterolemischen oder hypotriglyceridemischen pharmazeutischen Zusammensetzung.