KR890001290B1

KR890001290B1 - 간 기능 개선제의 제조방법

Info

Publication number: KR890001290B1
Application number: KR1019860008913A
Authority: KR
Inventors: 최수부; 히로시 이또
Original assignee: 최수부; 야마사끼 나가다가
Priority date: 1986-10-24
Filing date: 1986-10-24
Publication date: 1989-04-28
Also published as: KR880005272A

Abstract

내용 없음.

Description

간 기능 개선제의 제조방법

제1도는 본 발명 시료의 IR 패턴이며,

제2도는 본 발명 시료의 GLC 패턴이며,

제3도는 사염화탄소 간장해랏트에 대한 코벡(COVEK)의 SGOT, SGPT에 미치는 영향(P〈0.05)에 대한 도표이다.

본 발명은 구멍장이 버섯과(Polyporaceae)에 속하는 구름버섯(Coriolus vers icolor) CVT-80균주(FERM P-6618) (이는 국내기탁기관 KALST에 기탁번호 KC TC 8276P로 1987년 7월 30일 재기탁되었다.)를 배양하여 얻은 균사체 및 대사산물을 열수추출 및 유기용매로 정제한 단백질이 함유된 다당체를 주성분으로 하는 간기능 개선제의 제조방법에 관한 것이다. 일반적으로 간기능이 한번 저하되면 용이하게 회복되는 것이 아니므로 장기간에 걸쳐 투약이 필요하다. 일반적으로 화학물질들은 장기간에 걸쳐 투약하면 부작용이 나타나며 간 기능을 실질적으로 개선하는 데는 부작용의 문제점이 대두된다.

본 발명의 목적은 부작용 및 독성이 전혀 발견되지 않는 간 기능 개선제를 제공하는 데 있다. 본 발명의 방법에 의하여 얻어진 단백질 함유 다당체[이하코벡(COVEK)으로 명명한다]의 성분을 분석결과 다음과 같은 성분으로 구성되었다.

표(1) 코벡(COVEK)의 분석표(%)

당(글루코스로서 페놀 황산법) 73%

단백(BSA 로서 포린법) 10.0 %

회분 9.3 %

수분 3.9 %

PH 7.4%

C 38.7%

원소분석% H 5.74%

N 2.47%

(회분)% 7.1%

[α]

C=0.2 +3.5

IR 분석 α,β

β글루칸 함량 추정 30%〈

이상의 성분비를 갖는 코벡에서 간기능 개선에 특이한 작용 효과를 나타내는 화합물은 임상적으로 다음 구조식 [l]나타내는 화합물이다.

구조식 [1]

상기한 다당체는 β -글루코시드(glucoside)결합, 즉 β (1→3) , β (1→6) 글루칸(glucan)구조를 갖는 다당체로서, 이 화합물은 구름버섯(coriolus versicolor) CVT-80균주 FERM P-6618를 본 발명의 방법에 의하여 순수배양 추출하여 얻어진다. 본 발명의 방법은 구름 버섯(Coriolus bersicolor) CVT-80보존주를 통상의 한천배지에서 글루코스, 이스트, 생장촉진제인 해조다당류, 제1인산칼륨을첨가후 20-30℃에서PH를4-5로유지시키면서 7-12일간 배양한 후 100℃의 열수로 균사체와 대사산물을 함께 진탕시켜 추출하여 추출액에 과량의 극성 유기용매(예,알콜류)를 가하여 침전시켜서 순수하게 얻어지는 것에 특징이 있으며, 균사체와 대사산물을 함께 추출하므로서 균사 분리에 따른 불편함도 없으며 대사산물이 함께 흔입되어 종래의 균사체 추출에의한 제품과 달리 대단히 우수한 약리 효과를 나타내었다. 이와같이 얻어진 코벡을 회갈색의 분말로서 물에 녹일 경우 비교적 높은 점도를 나타내는 다당 및 소량의 단백을 함유한 고분자 물질로서, 다당류와 단백질의 혼합물인 코벡을 주로 글루코스, 갈락토스, 만노스 등으로 구성되며 이외의 소량의 자일로스, 푸코스 및 리보스 등을 함유한 구성성분 및 단백질로부터 나온 아미노산 성분이 함유된 것으로서, 비교적 안정하여 실온에서는 적어도 2년간 안정하며 열에 대하여서도 121.5℃에서20분간 멸균처리하여도 생물학적 활성의 저하가 없었다. 코벡의 간기능 개선효과를 나타내는 기전은 명확치 않다. 그러나 문헌 [케미칼 앱스트랙트(Chemical Abstract) 84:54002C, 1976 ; 후지타 등(Fujita. et. al)일본 약리학지 70,571,1974 : 리, 와이 (Lee. Y)임상연구(내부자 료)1979]에 따르면 이 동속 식물의 균사체의 다당체에 간기능 개선효과가 보고되고 있으며, 현재 의학계에서 간 기능 검사에 신뢰성이 높은 GOT, GPT등의 생화학적 검사에 의하여 간 기능 개선효과를 평가할 수 있다.

간 기능의 저하는 간염, 알코을 중독 및 사염화탄소등에 의하여 일어나게 되는데, 이와 같이 간 기능이 저하된 대상 지원자에게 코벡을 주약으로 한 제제를 경구 투여한 결과 GOT, GPT등의 생화학적 간 기능 검사에 있어서 현저히 간 기능의 회복을 나타내었다. 지원자에게 투여하기 전 안전성을 확인하기 위하여 코벡의 전 임상 시험을 하였다. 그 결과 독성시험에 있어서 마우스, 랏트에 경구투여로서 가능한 최대량을 투여하여도 사망한 예는 보이지 않았다. 경구투여에 의한 LD₅₀은 구할 수 없었다. 아급성 독성시험에 있어서도 100-1000mg/kg을 투여한 바 일반 증상, 체중, 사료 및 음수 섭취량은 현저한 변화가 없었다. 뇨, 혈청, 혈액의 생화학적 검사에 있어서도 대조균과 투여균 사이에 차이가 없었다. 장기(臟器)중량변화에 있어서도 흉선 중량은 용량에 비례하여 증가한 예가 있으나, 이는 면역 기능의 항진에 의한 것으로 사료된다. 다른 장기에 있어서는 코벡에 의한것 으로 볼 수 있는 변화는 인정되지 않았다. 병리 조직학적 검사에서도 특이할만한 소견이 없었다. 체내 분포에 관한 실험을 실시하였다.

[U-l4C]아세테이트 첨가배지로 배양한구름 버섯 균사체로부터 방사사선 코벡을 조제하였다. 이 코벡을 ICR-JCL 계 마우스에 강제로 경구투여한 다음 경시적으로 혈중, 뇨분 중 농도와 각 장기내의 농도를 측정하였다. 혈중 총 방사능은 15분후에 투여량의 1%, 2시간 후에는 1.8%로 최고 값이 되고 점차 감소하여 48시간 후에는 0.3%로 저하 하였다. 장기내의 분포는 대부분 간, 신, 체, 뇌, 비장에 분포되었으며 다른 장기에의 분포는 0.1% 이하이었다. 상술한 바와 같이 코벡은 고분자 물로 체내에 축적되지 않는다. 실험적으로 사염화 탄소로 간장해가 생긴 랏트에 대한 코벡의 간 기능 개선효과에 대하여서도 실험하였다. 실험결과 간 기능 개선효과가 인정되었다. 본 발명에 있어서 코벡을 주성분으로 한 제제의 경우 투여량은 코벡으로 1일 100mg-1500mg이며, 500mg-900mg을 적정 약 용량으로 정하였다. 미량의 함유된 단백 내지 아미노산은 코벡의 흡수를 촉진하는 것으로 사료되며 경군투여의 경우 부형제를 전혀 배합하지 않고 투여하여도 가능하나, 분산제를 배합함으로서 위내에서 용이하게 분산되도록 처방을 설계하는 것이 바람직하다. 즉, 정제, 캅셀제, 산제, 세립제, 과립제 등의 형태로 제제하여 투여할 수 있다. 본 발명에 있어서 특징지어지는 것은 제조방법에 있어서 새로운 생장 촉진제로서 해조 다당류를 배합하는 것이며 생장 촉진제 제조방법을 추가한다.이하 실시예로 이 발명을 상세히 설명한다.

[실시예 1]

(1) 코벡의 제조방법

구름버섯 (Coriolus versicolor) CVT-80 (FERM P-6618)보존주를 글루코스 5%, 이스트 0.5% 및 생장촉진제인 해조 다당류, 제1인산칼륨을 배합하여 PH를 4.2로 조정한 한천배지에서 배양온도를 27℃로 하여 배양하였다. 얻어진 활성 균사체를 취하여 글루코스 5%, 이스트 0.5%, 생장촉진제인 해조 다당류, 제1 인산칼륨을 가하여 PH를 약 4.2로 조정한 액체 배지에서 배양온도 27℃에서 진탕하면서 7일간 배양하고 다시 27℃에서 통기 교반하면서 4일간 배양하였다.

배양 종류후 물을 가하여 100℃에서 1시간 가열하여 추출하고 여과하여 여액을 농축(

)후 냉각 하고 이것에 2-3배량의 에탄올을 가하여 침전시키고 여과하여 그 잔사를 다시 물에 용해시켜 에탄올 침전시킨후 여과하여 그 잔사를 동결건조사여 코벡을 만들었다.

(2) 생장 촉진제의 제조방법

Uridaria Pinnatifida(Harrey)Suringer를 채집하여 원료 100g에 대하여 정제수 5l로 3일간 5℃에서 냉침한다.

추출액은 Visking tube를 사용하여 정제수를 외액으로 하여 투석한다. 투석내액은 포화 황산 암모늄액으로 염석하여 당단백 분획을 얻는다. 비염석 분획은 sebag 법으로 단백질을 제거한다. 여기에 4배 용량의 에탄올을 가하여 다당분획을 얻는다. 상기의 양 분획을 합쳐서 생장 촉진제로 사용한다. 당 단백분획과 다당분획의 성분 분석 결과는 다음 표(2)와 같다.

[표 2]

[실시예 2]

(1) 실험적 사염화 탄소 간장해랏트에 대한 코벡의 간기능 개선효과

가) 재료 및 방법

동물 : Wistar 계 웅성랏트(체중 약 200g)를 1군 4마리로 하여 실험하였다.

올리브유 투여군 : 5ml/kg의 올리브유 용액을 복강내에 투여.

사염화탄소 투여군 : 0.25m1/kg의 사염화탄소를 올리브 용액에 녹여 투여 용량 5ml/kg으로 복강내에 투여.

코벡-올리브유 투여군 : 1000ml/㎏/일 로 15일간 코벡을 경구 투여하여 15일 후에 올리브유를 복강내 투하고 다시 3일간 코백 투여.

코벡-사염화탄소 투여군 : 1000mg/kg/일 로 코벡을 15일간 경구 투여하여 15일째날 사염화 탄소를 복강내에 투여하고 다시 3일간 코벡을 투여.

이상의 군으로 나누어 실험하였다. 혈청 트란스 아미나제(SGOT, SGPT)활성 측정 시약은 Boehringer Mannheim 사제의 GOT, GPT칼라 테스트를 각각 사용하여 비색법으로 측정하고 Karmen 단위/ml로 나타내었다. 간의 트리글리세리트(TG)량은 간 Homogenise 0.3ml를 30초간 자비 처리하여 여기에 3.0 ml의 IPA를 가하여 잘 혼합한 다음 Van Handell 등의 방법으로 측정하였다.

나) 실험 성적 I

제3도는 SGOT, SGPT 활성의 경시 변화를 나타낸 것이다. 올리브유 투여에 의한 SGOT는 71-101, SGPT는 34-57Karmen 단위/ml 이고 활성의 경시변화는 인정되지 않았다.

사염화탄소 투여군의 8, 24, 48시간 후의 SGOT 활성은 10.2배, 22.9배, 25.6배가 되었으며, 한편 SGPT활성은 20.2배, 53.2배, 48.9배로 되어 어느것이나 올리브유 투여군에 비하여 현저히 증가하였다. 그러나 사염화탄소 투여군의 72시간 후는 SGOT, SGPT활성이 5.7, 6.5배가 되어 감소하였다. 코벡-사염화탄소 투여군의 SGOT, SGPT활성도 유사한 경시변화를 나타내었으나 투여군의 8, 24, 48시간 후의 SGOT 활성은 5.8 배, 20.3배, 21.7배로 되고 SGPT 활성에서는 13.5배, 35.3배, 38.0배가 되어 어느 시간에 있어서도 사염화 투여군보다 유의성 있는 낮은 값을 나타내었다. (P〈0.05) 표(3)에 간 TG량의 경시변화를 나타내었다. 올리브유 투여군의 8, 24, ,48시간 후의 간 TG량은 6.9, 8.2, 7.5mg/g (습중량)이고, 코벡과 올리브유 투여군에서는 7.4, 8.1, 8.2mg/g(습중량)으로 양군 모두 비슷한 경시변화를 나타내었다. 한편, 사염화탄소 투여군에서 경시적으로 간 TG 량의 현저한 증가가 인정되었다. 코벡-사염화탄소 투여군에서도 비슷한 경시변화를 나타내나 간 TG량의 증가는 낮고 투여 24,48시간 후에 있어서 10.4, 18.2mg/g(습중량)이었고 사염화탄소 단독 투여군보다 현저히 낮은 값을 나타내었다. (P〈0.05)

[표 3] 사염화탄소 간장 해랏트에 대한 코벡이 간 트리글레세리트에 미치는 영향

비고 : 1^*: 올리브유 투여군

2^**: 코벡과 을리브유 투여군

3⁺: 사염화탄수 투여군

4

:코벡과 사염화탄소 투여군

이상의 실험결과를 보면 사염화탄소의 복강내 투여로 인한 급성 간장해에 대하여 코벡을 전, 후 경구투여하여 사염화탄소에 의한 혈청 트란스 아미나제 활성의 상승, 간 TG량의 축적을 억제하였다.

실험성적 II

간염 또는 알코올 중독에 의한 간 손상을 입은 환자에 대하여 간 기능 검사에 시행하여 GOT 및 GPT가 이상적으로 높은 환자를 대상으로 투약하였다.

상술한 방법으로 얻어진 코벡을 1회에 480mg씩 1일 3회 경구투여하고 4주간 계속 투여한 다음, 간 기능검사를 실시한 결과 GOT 및 GPT 값이 현저히 저하되었다. 한편, 만성간염 환자에게 코벡을 1일 1,440mg 씩 경구투여한 경우의 치료성적은 표(4)와 같으며, 이 발명의 결과를 충분히 설명할 수 있는 실험성적이다.

[표 4] 코벡을 투여한 임상성적 (만성간염 환자의 생화학적 검사성적) 52세남성

Claims

구름버섯(Coriolus versicolor)CVT-80 균주 FERM P-6618(KCTC 8276 P)를 한천배지에서 생장촉진제의 존재하에 산성을 유지시키면서 7-12일간 배양하여 얻은 균사체 및 대사산물을 열수처리 한후, 그 여액에 과량의 유기용매를 첨가하여서 생긴 침전물, 즉 구조식[1]의 다당류를 주요 활성 성분으로 함유하고 소량의 단백질 성분이 결합된 간 기능 개선제의 제조방법.

구조식[1]
제1항에 있어서, 구름버섯 CVT-80균주의 균사체 배양에 첨가되는 생장촉진제로는 해조다당류를 사용함을 특징으로 하는 간 기능 개선제의 제조방법.
제1항에 있어서, 구조식 [1]의 다당류는 β-글루코시드 결합으로된 β-(1→ 3),β-(1→6) 글루칸구조를 주로 함을 특징으로 하는 간 기능 개선제의 제조방법.