JPH0574576B2

JPH0574576B2 -

Info

Publication number: JPH0574576B2
Application number: JP59198899A
Authority: JP
Inventors: Akihiro Ginnaga; Mitsuo Sako; Hisashi Kitagawa; Susumu Sakuma; Hiroshi Kiba; Tsukasa Nishihara; Sadahiro Hirashima
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 1984-09-22
Filing date: 1984-09-22
Publication date: 1993-10-18
Also published as: EP0175841A2; EP0175841B1; AU4245985A; AU568743B2; JPS6176422A; DE3581993D1; ATE61230T1; KR860002570A; KR920009730B1; CA1239345A; EP0175841A3

Description

【発明の詳細な説明】

〔発明の技術分野〕本発明は百日ぜきコンポーネントワクチンおよ
び百日ぜき・ジフテリア・破傷風混合ワクチンの
製造方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、
後述する特別な方法で百日ぜき菌培養物より高純
度に精製し、得られるＦ−HA（Filamentous
Hemagglutinin 線維状赤血球凝集素）またはそ
のトキソイドと、公知または後述する方法で百日
ぜき菌培養物より高純度に精製し得られるLPF
−HA（Leucooytosis−Promoting Faotor
Hemagglutinin、リンパ球増多因子赤血球凝集
素）のトキソイドとを混合することよりなる改良
された百日ぜきコーポネントワクチンの製造方法
およびこの改良された百日ぜきコーポネントワク
チンを用いた百日ぜき・ジフテリア・破傷風混合
ワクチンに関する。百日ぜきは我が国では届出伝染病に指定されて
おり、乳児〜幼児に多発する公衆衛生上重要な感
染症である。とくに乳児では重症経過をたどるこ
とが多く、時には死亡例もみられる。この疾病は
古くからワクチンによる予防が効果的であること
が知られており、原因菌である百日ぜき菌Ｉ相菌
の全菌体の不活性ワクチンが広く用いられてい
た。しかし、このような菌体不活性ワクチンは副
作用が強くそのため一時期にはワクチンの接種が
中止されていた。その一方、百日ぜきによる乳幼
児の疾病は大きな問題となつており、副作用のな
いワクチンの製造が熱望されていた。〔従来技術〕先に、佐藤らは感染防御抗原に関する基礎的研
究をもとにして画期的なコンポーネントワクチン
である沈降百日ぜき精製ワクチンの製造に成功し
た（特公昭57−5203号を参照）。このワクチンは
Ｆ−HAおよびLPF−HAを主として含んだHA
画分を主な感染防御抗原とし、全身反応としての
発熱などの副作用をほとんど示すことなく優れた
予防効果を有するものであつてすでに実用化され
ている。この実用化されているワクチンの製造には、百
日ぜきＩ相菌を適当な培地に接種し、35℃前後で
５日間精置培養し、培養液を遠心し、その上清に
硫酸アンモニウムを約50％飽和になるように加え
るかアルコール添加し、生じた沈殿を10000rpm、
30分間遠心して分離し、この沈殿を塩化ナトリウ
ム添加緩衝液にて抽出し、その抽出画分を常法に
よりシヨ糖密度勾配遠心にかけて百日ぜきHA画
分を回収し、ホルマリンで無毒化処理してワクチ
ンとしている。このワクチンはコンポーネントワ
クチンと称されているものの〔Sato Y.et.al，
The Lancet (1)，122−126（1984）〕、この文献
中にみられるように、この百日ぜきワクチン成分
は主としてＦ−HAおよびLPF−HAを含むもの
であるが、そのＦ−HAとLPF−HAのワクチン
中に含有される量比をコントロールし難く各ワク
チンメーカーで異なり、さらにそれ以外の成分も
含有され、むしろアセルラーワクチン
（Acellular vaccine）と呼ぶにふさわしいものと
考えられる。佐藤等の方法は、さらに、これにジフテリアト
キソイド、破傷風トキソイドを加え、さらに必要
にどりアルミニウムアジユバンド処理を行ない、
ゼラチン、グルコース等の安定剤を添加して沈降
精製百日ぜき、ジフテリア、破傷風混合ワクチン
としている。ところが、最近になつて、発赤、腫
脹、硬結等の局所反応についての臨床所見が少な
からず報告されており、このワクチンも必ずしも
万全なものでない（水原春郎、日本細菌学雑誌、
38(1)、1983、および川上勝朗、第15回日本小児感
染免疫学研究会抄録1983）。さらにまた、百日ぜき菌Ｉ相菌の産生する物質
又は菌体由来の感染防御抗原としてのＦ−HAお
よびLPF−HAの役割が注目され、最近の研究で
はその役割が極めて重要であることが報告されて
いる〔Sato Y.et.al，Infect.Immun.，31，1223
〜1231（1981）；Sato Y.et.al，Seminars in
Infectious Diseases IV，Bacterial Vaccine.，
380〜385（1982）〕。従つて、局所反応等副作用のない百日ぜきワク
チン成分としてのＦ−HAおよびLPF−HAは高
純度であることが重要であり、しかも工業的生産
のためには簡単かつ大量に単離精製することが望
まれている。そのようにすれば、ワクチンとして
必要十分量の抗原を所望量調合することが可能と
なる。従来知られているＦ−HAの採取精製法として
は、百日ぜき菌培養上清を硫安分画し、蔗糖密度
勾配遠心にかけ、さらにゲルろ過を２回くり返し
百日ぜき菌Ｆ−HAを得る方法がある〔Sato Y.
et.al；Infeot.Immun.9，801（1974）〕。しかしな
がらこの方法は、工程が多く複雑であり、しかも
Ｆ−HAの収率が低い等の欠点があり、工業的な
精製法としては採用し難い。また同様に百日ぜき菌Ｆ−HAを精製した例と
して、イオン交換クロマトグラフイー、ゲルろ過
による方法〔Arai，H.et.al.；Infect.Immun.，
25，460（1979）〕があるが、この方法によれば、
Ｆ−HAの収率が低いうえに、百日ぜき菌内毒素
の除去が困難であり、実用には供し難い。さらに別の例として、ハイドロキシアパタイト
吸着クロマトグラフイー、ハプトグロビアン・ア
フイニテイクロマトグラフイー、硫安分画、ゲル
ろ過を組合わせる方法〔Cowell，J.L.et.al；
Seminars in Infeetious Diseases IV，
Bacterial Vaccine.37，１（1982）〕およびハイド
ロキシアパタイト吸着クロマトグラフイー、特異
抗体・アフイニテイクロマトグラフイー、蔗糖密
度勾配超遠心分離を組合わせる方法〔渡辺ら；日
本細菌学雑誌，38，423（1983）〕があるが、これ
らの方法は工程が非常に長く複雑であるうえに、
Ｆ−HAの収率が低く、さらにハイドロキシアパ
タイトは高価であり、また上記において用いられ
ているアフイニテイクロマトグラフイゲルは市販
されておらず、これらの調製は非常に手間がかか
るうえに、原材料が非常に高価である。このよう
な種々の欠点のため、上記方法もＦ−HAの工業
的で安価な採取方法とはなり得ない。一方、LPF−HAの採取精製法では、百日ぜき
菌培養物を硫安塩析し、ついで抽出、透析したも
のを出発材料とし、これをイオン交換クロマトグ
ラフイー、ゲルろ過〔Arai.H.et.al；Biochimioa
et Biophy sica Acta，444，765（1976）〕、ある
いはシヨ糖濃度勾配遠心〔Sato.Y.et.al；Infect.
Immun.，６，897〜704，（1972）〕などによつて
精製する方法が採用されている。しかしながら、
このような方法では、電気泳動法による純度分析
で１本のバンドのLPF−HAを得ることは難し
く、またその収量も少ない。高純度のLPF−HAを比較的大量に得る方法と
して、百日ぜき菌培養上清液をハイドロキシアパ
タイトのカラムに通してLPF−HAを吸着させ、
洗浄、溶出後、コンカナバリンＡ−セフアロース
（ConA−Sepha−rose.フアルマシア社製）によ
るアフイニテイクロマトグラフイーで精製する方
法が提案されている〔Yajima.M.et.al.；J.
Biochem.83，295〜303（1978）〕。しかしなが、こ
のコンカナバリンＡをリガンドとするアフイニテ
イクロマトグラフイーは、LPF−HAのみと親和
性を有するのではなく、糖類や糖脂質さらに他の
糖蛋白質なども吸着するため、百日ぜき菌の他の
成分、たとえば、菌体膜成分なども吸着し、所望
のLPF−HAを高純度で単離することが難しい。
しかも、そのハイドロキシアパタイトのカラム操
作に長時間を要するため、LPF−HAの活性低下
の恐れがあるほかハイドロキシアパタイトが高価
であるために、LPF−HAを工業的にかつ安価に
採取するには問題があり、優れたアフイニテイク
ロマトグラフイーとはいえない。最近、ヒトハプトグロビンがLPF−HAに特異
的に結合することが発見されて以来、上記の方法
におけるコンカナバリンＡの代わりに、このヒト
ハプトグロビンをリガンドとして用いるアフイニ
テイクロマトグラフイーでLPF−HAを精製する
方法が試みられている〔Irons，et.al.L；
Biochimica et Biophisioa Acta，580，175〜
185（1979）〕、およびCowell.J.et.al；Seminars in
Infectious Diseases IV，Bacterial Vaccine，
371〜379（1982）〕。また、この方法の変法として、
百日ぜき菌菌体を機械的に破砕して菌体成分から
LPF−HAを抽出し、硫安分画したものを出発材
料として用い、これをハプトグロビンまたはセル
ロプラスミンなどのプラズマシアロプロテインあ
るいは唾液ムチンなどのシアロプロテイン類をリ
ガンドとするアフイニテイクロマトグラフイーに
てLPF−HAを採取する方法が提案されている
（英国公開特許第2015531号）。これらハプトグロ
ビン等をリガントするアフイニテイクロマトグラ
フイーによる方法は、現在のところ唯一の工業的
な許容できる純度のLPF−HAの精製法として期
待されている。このように、現在まで、Ｆ−HAについては満
足できる高純度製品を工業的に採取精製する方法
はなく、またLPF−HAについては上記パプトグ
ロビンリガントアフイニテイクロマトグラフイー
による方法のみが唯一の許容できる方法である。〔発明の目的〕本発明は、以下で述べる高純度に精製したＦ−
HAとLPF−HAを用いて、局所反応等の副作用
のない改善された百日ぜきコンポーネントワクチ
ンおよび百日ぜき・ジフテリア・破傷風混合ワク
チンの工業的製造方法を提供することを目的とす
る。〔発明の概要〕本発明によれば、高純度Ｆ−HAは、百日ぜき
菌培養物をセルロース硫酸エステルのゲル、デキ
ストラン硫酸が化学的に結合されたポリサツカラ
イドゲル誘導体または架橋ポリサツカライド硫酸
エステルゲルに接触せしめてＦ−HAを吸着させ
た後、ゲルから溶出することによつて得られる。
これらの方法は、本発明者等がＦ−HAを工業的
に簡単かつ高収率できわめて高純度に精製取得す
る方法として開発したもので、Ｆ−HAの精製方
法としてすでに特許出願しているものである（特
開昭59−75314号、特願昭59−84778号、特願昭59
−91631号）。すなわち、百日ぜき菌を通常の培地、たとえ
ば、コーエン・ウイラー培地や、ステナー・シヨ
ルテ培地にて、常法により静置培養、振盪培養ま
たは通気攪拌培養して得られる培養物である。こ
の培養物は、遠心分離により菌体を除去した培養
上清、あるいは菌体破壊物遠心上清、あるいはこ
れらの部分精製標品の形で本発明方法に供され
る。本発明方法によれば、塩析、抽出、超遠心分
離等の前段部分精製処理をあえて行なう必要はな
く、培養上清等をそのままセルロース硫酸エステ
ルゲル吸着クロマトグラフイーに付すことがで
き、工程がきわめて簡単である。本発明で用いられるセルロース硫酸エステルと
は、セルロースを硫酸エステル化して得られるの
であるが、好ましくは結晶セルロースあるいは、
結晶領域および非結晶領域からなるセルロースを
硫酸エステル化したものが良い。この場合、得ら
れたセルロース硫酸エステルは原料の形状、好ま
しくは球状を保持し、水性媒質に不溶性であり、
物理的安定性にすぐれ、クロマトグラフイー用ゲ
ルとして好適である。これらの原料セルロース類
はすでに市販されており例えば、アピセル（旭化
成工業社製）、セルロフアインGC−15、同GH−
25、同GC−100、同GC−200（チツソ社製）など
がある。これらのゲルを例えばピリジンなどの有
機溶媒の存在下クロルスルホン酸、無水硫酸など
を作用させることにより所望のセルロース硫酸エ
ステルのゲルが得られる。また、デキストラン硫酸−ポリサツカライドゲ
ルとは、デキストランの硫酸エステル化物をポリ
サツカライドゲル誘導体に化学的に結合させたも
のである。このゲルを調製するにあたつては、デ
キストラン硫酸は種々の製品がすでに市販されて
おり、一般的に生物関連用として用いらえている
ものを使用することができる。一方ポリサツカラ
イドゲル誘導体とは、アガロース、デキストラ
ン、セルロース等のポリサツカライドに、クロマ
トグラフイー担体として用い得るように、通常の
結晶精製処理、三次元架橋処理、形状成型処理等
を施したゲル誘導体であり、これらもすでに市販
されており、例えばアガロースゲルとしてセフア
ロース（Sepharose，フアルマシア社製）、デキ
ストランゲルとしてセフアデツクス（Sephadex，
フアルマシア社製）、セルロースゲルとしてアビ
セル（旭化成製）等がある。デキストラン硫酸とポリサツカライドゲルとを
化学的に結合させるには種々の方法があるが、例
えば臭化シアンを用いるアンデルソンらの方法
（特開昭52−114018号）や、臭化シアンを用い、
スペーサーとしてリジンを介して結合させる方法
〔Bryan M.Turnerら；Biochimioa et
Biophysica Acta，659，７〜14（1981）〕等の通
常よく用いられる方法で行なえばよい。なお、デキストラン硫酸−アガロースゲルにつ
いてはすでに市販されており、例えばデキストラ
ン硫酸−セフアロースCL4B（フアルマシア社製）
がある。さらに、架橋ポリサツカライド硫酸エステルと
は、デキストラン、セルロース類、アガロースな
どのポリサツカライドを、例えばエピクロルヒド
リン、ジクロルヒドリン、ジプロムヒドリン、エ
チレングリコールビスエポキシプロピルエーテル
等の架橋剤で架橋して得られる架橋ポリサツカラ
イドを硫酸エステル化して得られるものである。
架橋ポリサツカライドはすでに市販されており、
例えば架橋デキストランとしてセフアデツクスＧ
−10、Ｇ−25、Ｇ−50、Ｇ−100（フアルマシア社
製）などがあり、架橋アガロースとしてセフアロ
ーズCL−2B、CL−4B、CL−6B（フアルマシア
社製）などがあり、架橋セルロースとしてセルロ
フアインGCL−25、GCL−90（チツソ社製）など
がある。これらのゲルを例えばピリジンなどの有
機溶媒の存在下クロルスルホン酸、無水硫酸など
を作用させることにより所望の架橋ポリサツカラ
イド硫酸エステルゲルがえられる。本発明において、これらのゲルを用いて、百日
ぜき菌培養物中のＦ−HAを精製採取するにあた
つては、次のような方法で行なわれる。セルロース硫酸エステルゲル、デキストラン硫
酸−ポリサツカライドゲルおよび架橋ポリサツカ
ライド硫酸エステルゲルは、あらかじめ例えば
0.2M塩化ナトリウム添加0.01Mリン酸緩衝液等
の、中性付近のPH値（PH６〜９）であり、比電導
度５〜25mm／cm程度の適当な緩衝液を用いて平衡
化を行なつた後にＦ−HAの吸着操作に供する。セルロース硫酸エステルゲル等へのＦ−HAの
吸着、ゲルの洗浄、Ｆ−HAの溶出等一連お精製
操作は、バツチ法およびカラム法等の工業的に通
常よく用いられる操作方法で行なう。バツチ法で
行なう場合は、百日ぜき菌培養物中にセルロース
硫酸エステルゲル等を投入し、PH6.0〜9.0程度の
範囲において０〜30℃程度にて10〜60分程度緩く
攪拌してＦ−HAを吸着させる。この際、百日ぜ
き菌培養物の比電導度が5.0〜25.0ms／cm程度と
なるように、培養上清そのままかあるいは適宜濃
縮または希釈して吸着操作に付す。吸着終了んどち、培養物−ゲル混合液をろ過器
上に充填し、吸引ろ過してゲルとろ液を分離す
る。分離したゲルを、比電導度５〜25mn／cm程
度で、PHが5.0〜10.0程度である適当な緩衝液例
えば、0.2M塩化ナトリウム添加0.02Mマツキル
ベン（McIlvaine's）緩衝液、0.2M塩化ナトリウ
ム添加0.01Mリン酸緩衝液あるいは0.2M塩化ナ
トリウム添加0.01Mトリス塩酸緩衝液等を注ぎ吸
引して洗浄する。この後、PHが5.0〜10.0程度で、比電導度が25
〜130ms／cm程度である（上記洗浄用緩衝液の比
電導度より大）適当な緩衝液、例えば1.5M塩化
ナトリウム添加マツキルベン緩衝液、1.5M塩化
ナトリウム添加リン酸緩衝液等を注ぎ、吸着して
いるＦ−HAを溶出する。カラム法にてこの方法を実施する場合は原材料
液、洗浄用緩衝液、溶出用緩衝液の条件はバツチ
法の場合と同様でよく、これらの通液速度は、10
ml／cm²／Hr〜500ml／cm²／Hr程度に調整して行
なうとよい。本発明のこの精製法によれば、百日ぜき菌培養
物中のＦ−HAの特異的吸着能にすぐれ、Ｆ−
HAの精製度は数十倍に達し、しかもＦ−HAの
回収率は75％以上、条件により90％以上100％近
くに達する。得られる精製Ｆ−HAの比活性は約
3.7〜11×10⁴HAunit／mg蛋白質通常は４〜８×
10⁴HAunit／mg蛋白質：鶏ヒナ固定血球凝集試
験，〔Sato，Y.et al，Infect，Immun.7.929−999
（1973）〕またELISA活性で示すと0.9〜1.5×10⁵
Ｆ−HA−Ab−ELISAunit／mg蛋白質：Ｆ−
HA・ELISA測定法〔Sato Y.et al，Infect
Immun.，41，313−320（1983）〕ときわめて高
く、ポリアクリルアミドデイスク電気泳動（PH
4.5）分析において単一のバンドを形成し、百日
ぜき菌内毒素がほぼ完全に除去される。上述のとおり、本発明で用いるこの方法によれ
ば、出発材料の百日ぜき菌培養物から所望のＦ−
HAを高収率、高純度に採取することができ、そ
の操作もきわめて簡単で、またその精製用クロマ
トグラフイー吸着体は、安価に調製でき、しかも
くり返し使用しても劣化が殆んど無く、きわめて
経済性にすぐれている。したがつて、この方法は高純度Ｆ−HAの工業
的精製法としてきわめてすぐれた方法である。必
要ならば、この方法は従来の技術である蔗糖密度
勾配遠心分離法、あるいはイオン交換クロマトグ
ラフイー法等と組合わせることも可能である。かくして得られた精製Ｆ−HAは上述する如く
極めて高純度であるため、そのままで最終のワク
チン原料として使用できる特長を有するが、必要
ならばホルマリンを用いた通常の方法によりトキ
ソイドとして使用してもよい。本発明のワクチンのもう一方の原料である高純
度LPF−HAは、前述した英国特許等のハプトグ
ロビンをリガントしたアフイニテイクロマトグラ
フイーによる方法で精製採取した高純度品を使用
することができるが、本出願人はさらに別のより
高純度LPF−HAの精製方法を開発しており、そ
の方法を本発明において有利に使用できる。その第１の方法は、特願昭58−206598号として
すでに特許出願しているもので、百日ぜき菌培養
物からLPF−HAを“変性セルロプラスミンをリ
ガントとするアフイニテイクロマトグラフイー”
を用いることにより精製することよりなる。ここで用いられる変性セルロプラスミンとは、
ヒトまたは動物由来のセルロプラスミンを種々の
方法で変性させたものであり、例えばセルロプラ
スミンを60〜85℃にて１〜24時間程度加熱処理し
たもの、または、セルロプラスミンを硫化ナトリ
ウム、硫化アンテニウム等の硫化物、Ｌ−アスコ
ルビン酸、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、
Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、マルトー
ス、ラクトース等の還元糖、アセトアルデヒド、
ギ酸、シヨウ酸、メルカプトエタノール、ジエチ
ルジチオカルバメート等の還元剤、シアン化ナト
リウム、チオシアン酸ナトリウムまたはチオシア
ン酸カリウム等のシアン化合物、EDTA、ニト
ロトリ酢酸（NTA）、トリエチレンテトラミン
ヘキサ酢酸（TTHA）等のキレート剤等で処理
して、セルロプラスミンに含まれている銅イオン
（Cu⁺⁺）を還元するかまたは銅イオンの１部また
は全部を遊離、除去することによつて得られるも
の等が含まれる。上記の変性処理は単独でもまた２種以上の組み
合わせでもよく、また変性セルロプラスミンをマ
トリツクスに固定化した後に行つてもよい。この
ような変性処理は、通常、セルロプラスミンを
0.1〜0.5w／ｖ％濃度に生理食塩液で調製したも
の１容に対し、以下の緩衝液10〜200容に透析す
るという極めて簡単な操作によつて達成できる。
すなわち、硫化ナトリウム、硫化アンモニウム、
シアン化ナトリウム等を使う場合では、これらを
0.01〜1.0M程度を含むPH6.0〜8.0の0.01〜0.1Mリ
ン酸緩衝液を使用し、０〜60℃で１〜10時間程度
透析するとよい。Ｌ−アスコルビン酸、還元糖等を用いる場合
は、それらを0.01〜1.0M程度含を0.01〜0.1M酢
酸緩衝液（PH4.0〜6.0）に０〜15℃で24〜36時間
透析する。アセトアルデヒド、ギ酸、シユウ酸、
メルカプトエタノール、ジエチルジチオカルバメ
ート等を用いる場合は、それらを0.01〜0.1Mリ
ン酸緩衝液に０〜30℃で0.5〜３時間透析する。
チオシアン酸塩を使う場合は、それを0.1〜3.0M
含む0.01〜0.1Mリン酸緩衝液（PH6.0〜8.0）に０
〜30℃で0.5〜5.0時間透析する。EDTA、NTA、
TTHAを用いる場合は、それを0.01〜1.0M程度
含む0.01〜0.1Mのリン酸緩衝液（PH6.0〜8.0）に
０〜30℃で0.5〜5.0時間透析する。原料のセルロプラスミンは市販のものがそのま
ま用いられる。また、人血漿をアルコール分画し
たコーンのフラクシヨンのほか、ヒトもしくは
動物の血液から分離精製して得ることができる。上記変性セルロプラスミンを用いて百日ぜき菌
培養物をアフイニテイクロマトグラフイーに付す
には、下記のようにして行われる。変性セルロプラスミンを臭化シアンで活性化し
たセフアロース、アガロース、セルロース、デキ
ストラン等のマトリツクスに固定化させるAxe'n
らの方法〔Axe'n；Nature.，214，1302〜1304
（1967）〕によりアフイニテイゲルを調製し、これ
をカラム法、バツチ法等のクロマトグラフイーに
したがい、百日ぜき菌培養物と接触させてその中
に含まれるLPF−HAを吸着させ、ついで適当な
緩衝液で洗浄して他の物質を除去したのち、溶出
液でLPF−HAを溶出単離する。出発原料として用いる百日ぜき菌培養物は、前
記Ｆ−HAの精製に用いたものと同様のものが使
用でき、例えば百日ぜき菌相菌（および相
菌）を通常の培地、たとえばコーエン・ウイラー
培地やステナー・シヨルテ培地等の液状培地にて
常法により静置培養または振とうあるいは通気攪
拌培養して得られる培養液があり、好ましくは該
培養液から遠心または、ろ過によつて菌体を除去
したものである。さらに、前記Ｆ−HA精製の際
の吸着工程での素通り成分を出発原料として用い
てもよい。この第１のLPF−HAの精製方法によ
れば、塩析、抽出、透析、超遠心、濃縮、平衡化
等、公知方法にみられる種々の前段精製処理を必
要とせず、この培養液をそのまま、アフイニテイ
クロマトグラフイーに供することができる。この
ため工程がきわめて簡単である。カラム法では、カラムにアフイニテイゲルを充
填し、出発材料の百日ぜき菌培養物を流速10ml／
cm²／hr〜500ml／cm²／hrで通液させて吸着させる。バツチ法では、容器中に百日ぜき菌培養物を入
れ、これにアフイニテイゲルを直接添加し、30分
〜３時間程度、好ましくは１時間程度攪拌して吸
着させる。アフイニテイゲルの用量はとくに制限されない
が、通常、アフイニテイゲル１mlに対し10000〜
20000μｇの蛋白質のLPF−HAを吸着することが
できる。該LPF−HA吸着アフイニテイゲルの洗浄に
は、PH4.0〜9.0の緩衝液、比電導度10ms／cm〜
150ms／cmの緩衝液等が用いられる。例えば、
0.1〜1.0M塩化ナトリウムを含む0.01〜0.1Mリン
酸緩衝液（PH6.0〜8.0）を用い、カラム法では、
カラム容積の数10倍〜100倍程度の液量を流して
行う。またバツチ法ではゲル容積の数倍〜数100
倍の液量で洗浄処理が行われる。この洗浄操作に
より、出発材料中に多量に含まれる百日ぜき菌内
毒素が効果的に分離除去され、この点において
も、本方法は従来公知の方法に比べてきわめてす
ぐれた特徴を有する。上記洗浄処理後、リガンドに吸着したLPF−
HAを溶出するには、カオトロピツク塩類（例え
ば、I^-，C10^- ₄，CF₃COO^-，SCN^-，CC1₃COO^-
等のカオトロプツクイオンを放出する塩類）、エ
チレングリコール、ジオキサン、尿素、塩酸グア
ニジン、EDTA等のアフイニテイクロマトグラ
フイーにおいて一般的に用いられる溶出液を用い
て常法にしたがつて行われる。本方法のアフイニテイクロマトグラフイーによ
れば、出発材料のPHが4.0〜10.0の範囲では安定
して90％以上の収率に達する。本方法によつて得られるLPF−HAの純度は、
ポリアクリルアミドデイスク電気泳動法（PH4.5）
による分析において90％以上、条件により95％以
上もの高純度に達する。また比活性値は0.9〜1.6
×10⁵LPF−Hp−ELISAunit／mg蛋白質通常は
1.1〜1.2×10⁵LPF−Hp−ELISAunit／mg蛋白
質：LPF−HA，ELISA測定法〔佐藤等，第28回
毒素シンポジウム予稿集、141−144（1981）〕とな
り、従来公知の方法では望み得ない高品質が達成
される。このことは、得られたLPF−HAのリムラステス
トおよびウサギ発熱試験等の生物活性試験にも明
確にあらわれている。即ち、本方法の場合、内毒
素の除去はほゞ完全である。また、本方法（第１方法）は、通常ヒト血漿成
分を使用する際に遭遇する肝炎ウイルスその他の
感染因子による問題も解決できる利点も有する。例えば、本方法においては、加熱処理変性セル
ロプラスミンの場合当加熱処理によりLPF−HA
に対する特異的吸着能、吸着容量を大幅に向上さ
せるばかりでなく、肝炎ウイルスによる上記感染
等の対策も併せて実施できることは明らかであ
る。さらに、Ｌ−アスコルビン酸やシアン化ナト
リウム等により変性処理を行つた変性セルロプラ
スミンに、60℃、10〜15時間加熱処理を加えたも
のをリガンドとして用いた場合でも、加熱処理を
加えない場合と同様の精製能力がある。またあら
かじめ60℃、10時間の加熱処理を加えたセルロプ
ラスミンに上記Ｌ−アスコルビン酸変性処理ある
いはシアン化ナトリウム変性処理等を加えたもの
を用いた場合も、未加熱処理の場合と同様または
それ以上の好成績がえられる。したがつて本方法
は、肝炎ウイルス等の汚染の懸念がなく、また百
日ぜき菌内毒素の除去が充分である点でも、格段
にすぐれた方法である。上述のとおり、この本出願人の第１のLPF−
HA精製方法により提供される変性セルロプラス
ミンをリガンドとするアフイニテイクロマトグラ
フイーによれば、出発材料の百日ぜき菌培養物か
ら所望LPF−HAを高収率、高純度に採取するこ
とができ、その操作もきわめて簡単で、またその
アフイニテイゲルは数10回ないし数100回繰り返
して使用でき、コスト的にもすぐれており、しか
も百日ぜき菌内毒素もほとんど分離除去できる利
点を有する。したがつて、本方法は高純度LPF
−HAの工業的製法としてきわめてすぐれた方法
である。本方法で得られるLPF−HAは高純度で他の蛋
白質、脂質、糖類等を含まず、また内毒素もほと
んど完全に除去鵜されているため、最終の百日ぜ
きワクチンの調製に極めて有利に使用できる。さらに、LPF−HAを高純度に精製する本出願
人の第２の方法は、前記Ｆ−HAの精製に用いた
セルロース硫酸エステルゲル、デキストラン硫酸
が化学的に結合したポリサツカライド誘導体また
は架橋ポリサツカライド硫酸エステルゲルを用い
る方法である（特願昭59−150945号（特開昭61−
30528号）、特願昭59−175710号（特開昭61−
53224号）および特願昭59−190244号（特開昭61
−68422号）。即ち、百日ぜき菌培養物をLPF−
HAを吸着する条件下にLPF−HAを吸着させた
後、吸着したLPF−HAをゲルから溶出させるこ
とからなる。この第２方法で用いる出発原料として用いる百
日ぜき菌培養物は前記Ｆ−HA精製の際に用いる
出発原料あるいは第１のLPF−HAの精製の際に
用いる出発原料として挙げたのと同じ原料を使用
できる。また、吸着するのに用いるセルロース硫
酸エステル等のゲルは、前記Ｆ−HA精製に用い
るのと全く同一のものを使用してよい。この第２の方法において、セルロース硫酸エス
テル等のゲルを用いて、百日ぜき菌が産生する
LPF−HAを精製採取するにあたつては、たとえ
ば、次のような方法で行なわれる。原材料液であるLPF−HA含有液は、百日ぜき
菌培養物の遠心上清を、蒸留水または緩衝液で比
電導度が0.5〜5.0ms／cmとなるように希釈した
後、吸着操作に付すこともできるが、この上清中
にはセルロース硫酸エステル等のゲルに対して同
じく親和性を有するＦ−HAが含まれているた
め、あらかじめ、LPF−HAは吸着せずＦ−HA
を吸着する条件にて、セルロース硫酸エステル等
のゲルによるクロマトグラフイーを行ない（比電
導度5.0〜25.0ms／cm、PH５〜９の緩衝液で平衡
化されたセルロース硫酸エステル等のゲル充填カ
ラムに比電導度5.0〜25.0ms／cm、PH５〜９に調
整した原材料液を通液する）、その素通り画分で
あることろのＦ−HAを含まずLPF−HAを大量
に含んだ画分を吸着操作に付してもよい。セルロース硫酸エステル等のゲルへのLPF−
HAの吸着、ゲルの洗浄、LPF−HAの溶出等一
連の精製操作は、バツチ法およびカラム法等の工
業的に通常よく用いられる操作方法で行なうこと
ができる。カラム法の場合、セルロース硫酸エス
テル等のゲルをカラムに充填し、あらかじめ例え
ば0.02Mマツキルベン（Mcllvaine's）緩衝液
（PH5.2）等の比電導度0.5〜5.0ms／cmでPHが5.0〜
9.0程度である適当な緩衝液を通液して平衡化を
行つた後に、LPF−HAの吸着操作に移る。吸着に際しては、LPF−HAの含有液をPHが5.0
〜9.0、比電導度が0.5〜5.0になるように適宜調整
して、セルロース硫酸エステル等のゲル充填カラ
ムに通液し、LPF−HAを吸着させる。この後、
前述の平衡化に用いたのと同様の緩衝液を通液
し、ゲルを洗浄し、夾雑物質を洗い出す。 LPF−HAの溶出に際しては、PHが5.0〜9.0、
比電導度が5.0以上である適当な緩衝液を通液し
溶出を行なうが、好ましくは段階溶出または塩濃
度勾配溶出を行なう。すなわち、原材料液として
百日ぜき菌培養液の遠心上清の希釈したものをそ
のまま用いる場合は、前述の吸着条件下におい
て、LPF−HAと同時にＦ−HAも吸着されてく
るので、LPF−HAが溶出され、かつＦ−HAが
溶出されない条件下で溶出する必要がある。この
条件としてはPH５〜９において比電導度５〜
100ms／cm、好ましくは50〜60ms／cmである適
当な緩衝液（例えば0.7M塩化ナトリウム添加
0.02Mマツキルベン緩衝液）を最初に通液し、
LPF−HAを含む画分を回収する。この後に上述
の溶出用緩衝液より比電導度の大なる（100〜
300ms／cm）緩衝液を通液し、Ｆ−HAその他の
不純成分を溶出させ、セルロース硫酸エステル等
のゲルを平衡化再使用に供する。最も好ましくは、塩濃度勾配溶出を実施する。
原材料液として、あらかじめＦ−HAを分離した
LPF−HA含有液を用いる場合においても、比電
導度が0.5→300ms／cmとなるような塩濃度勾配
緩衝液（例えば塩化ナトリウム０→4.0M塩濃度
勾配・0.02Mマツキルベン緩衝液（PH5.2）を用
いて溶出を行ない、LPF−HA含有画分を分取す
れば、きわめて高純度のLPF−HAを得ることが
できる。本精製法によれば、LPF−HAの精製度は数十
倍に達し、しかもLPF−HAの回収率は80％以上
100％近くに達する。得られる精製LPF−HAの
比活性は0.9〜1.2×10⁵LPF−Hp−ELISAunit／
mg蛋白質ときわめて高く、ポリアクリルアミドデ
イスク電気泳動（PH4.5）分析において単一のバ
ンドを形成し、百日ぜき菌内毒素がほぼ完全に除
去される。上述のとおり本発明の方法によれば、出発材料
の百日ぜき菌培養物から所望のLPF−HAを高収
率、高純度に採取することができ、その操作もき
わめて簡単で、またその精製用クロマトグラフイ
ー吸着体は、安価に調製でき、しかもくり返し使
用しても劣化が殆んど無く、きわめて経済性にす
ぐれている。したがつて、この第２の方法も高純度LPF−
HAの工業的精製法としてきわめてすぐれた方法
であり、必要ならば従来の技術である蔗糖密度勾
配超遠心分離法、あるいはイオン交換クロマトグ
ラフイー法等と組合わせることも可能である。本発明の方法で得られるLPF−HAは高純度で
他の蛋白質、脂質、糖類等を含まず、また内毒素
もほぼ完全に除去されているため、最終の百日ぜ
きワクチンの調製の原料として極めて有利に使用
できる。これらの高純度精製LPF−HAは最終ワクチン
の製造に当つては、通常の例えばアミノ酸の不存
在下あるいは種々のアミノ酸存在下でのホルマリ
ン処理によるトキソイドとして使用する。本発明の百日ぜきコーポネントワクチンは、上
述の如くして得られた高純度Ｆ−HAまたはその
トキソイドと高純度LPF−HAのトキソイドとを
単に、人体に対し必要最小量の抗原量をもたらす
ような両成分の含量比をもつように任意の割合で
適当に混合することにより製造することができ
る。LPF−HAのトキソイド化はＦ−HAとの混
合前または混合後のいずれであつてもよい。例え
ば、LPF−HAまたはそのＦ−HAとの混合物に
ホルマリン0.1〜1.0％を添加し22°〜40℃に７〜35
日間静置後さらに0.2％にホルマリンを添加し室
温に１〜３日間静置し、あるいは時々振盪して毒
性を低下させる。毒性の低下を確認後適当な蛋白
濃度に調製（通常最終蛋白窒素濃度10〜20μｇ／
ml）する。しかる後、必要ならばアジユバンドと
して通常のアルミニウムアジユバンド、例えば水
酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムを添
加し、さらにゼラチン、グリコーズ、チメロサー
ル等を適当量添加してPH5.4〜7.4として最終の百
日ぜきコンポーネントワクチンとする。勿論、
LPF−HAのみをトキソイド化した場合には、前
記の高純度Ｆ−HAまたは別個にトキソイド化し
たＦ−HAを混合する。さらに、混合ワクチンを製造する場合には、通
常のジフテリアトキソイド（最終濃度30Lf／ml）
および破傷風トキソイド（最終濃度5Lf／ml）を
混合して作製する。また、かくして調製したワクチンは、凍結乾燥
標品とすることもできる。〔発明の実施例〕以下、本発明を調製例、実施例により具体的に
説明する。調製例１０℃以下の温度にてピリジン600mlにクロルス
ルホン酸117gを滴下し、混合する。滴下終了後、
混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中にセ
ルロフアインGC−15（チツソ社製）80gを加え、
攪拌下65〜70℃にて３時間反応させる。反応終了
後、冷却し、10％水酸化ナトリウム水溶液を加え
て中和する。ゲルを過分離し、0.01Mリン酸緩
衝食塩液で充分に洗浄してセルロース硫酸エステ
ルゲルを得る。このようにして調製したセルロフアインGC−
15の硫酸エステル化物をカラム（400mmφ×130
mm）に充填し、これに0.2M塩化ナトリウム添加
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.6、比電導度約
17.5ms／cm）を通液して平衡化する。このカラ
ムに百日ぜき相菌東浜株フアーメンター培養上
清300（比電導度約17.5ms／cm、PH7.6）を通液
する。通液後、上記緩衝液にて洗浄し、夾雑物質
を洗い出す。ついで、1.5M塩化ナトリウム添加
リン酸緩衝液（PH7.6）で溶出し、Ｆ−HAを含む
画分30を得る。培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ−HA
画分の分析結果を第１表に記す。Ｆ−HAの回収率は95％で、精製度（精製Ｆ−
HA画分の比活性／培養上清の比活性）は23倍に
達した。精製Ｆ−HA画分のLPF−HA活性は、
5.0LPF−Hp−ELISAunit／ml以下であつた。

【表】調製例２０℃以下の温度にてピリジン600mlにクロルス
ルホン酸117gを滴下し、混合する。滴下終了後、
混合液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中に
結晶セルロースであるクロマトグラフイー用アビ
セル（旭化成工業社製）80ｇを加え、攪拌下65〜
70℃にて４時間保持する。反応終了後、冷却し、
10％水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和する。
ゲルを過分離し、0.01Mリン酸緩衝食塩液で充
分に洗浄してセルロース硫酸エステルゲルを得
る。このようにして調製したアビセルの硫酸エステ
ル化物をカラム（400mmφ×130mm）に充填し、こ
れに0.14M塩化ナトリウム添加0.01Mリン酸緩衝
液（PH7.6）を通液して平衡化する。このカラム
に、百日ぜき相菌東浜株静置培養上清300を、
比電導度焼成処理15ms／cmに希釈し、PH7.6に合
わせた液を通液する。通液終了後、上記緩衝液で
洗浄し、ついで、1.5M塩化ナトリウム添加リン
酸緩衝液（PH7.6）で溶出して精製Ｆ−HA含有画
分30を得る。培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ−HA
画分の分析結果を第２表に記す。Ｆ−HAの回収率は75％で、精製度は14倍に達
した。

【表】注：(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)は第
１表に同じ。
調製例３０〜５℃の温度にてピリジン500mlにクロルス
ルホン酸82ｇを滴下し、混合する。滴下終了後、
混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中にセ
ルロフアインGH−25（チツソ社製）80ｇを加え、
攪拌下65〜70℃にて４時間反応させる。反応終了
後、冷却し、10％水酸化ナトリウム水溶液を徐々
に加えて中和する。ゲルを過分離し、0.01Mリ
ン酸緩衝食塩液（PH7.2）で充分に洗浄してセル
ロース硫酸エステルゲルを得る。このようにして調製したセルロース硫酸エステ
ルゲルをカラム（400mmφ×130mm）に充填し、こ
れに0.2M塩化ナトリウム添加0.01Mリン酸緩衝
液（PH7.6）を通液し平衡化する。このカラムに
調製例１で用いたものと同一ロツトの百日ぜき
相菌東浜株フアーメンター培養上清300（比電
導度約17.5ms／cm、PH7.6）を通液する。通液終
了後、上記緩衝液にて洗浄し、夾雑物質を洗い出
す。ついで1.5M塩化ナトリウム添加リン酸緩衝
液（PH7.6）で溶出し、Ｆ−HAを含む画分30を
得る。培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ−HA
画分の分析結果を第３表に記す。Ｆ−HAの回収率は93.8％で、精製度は25焙に
達した。本精製品を用いて生物学的製剤基準「百日ぜき
ワクチン」（薬発第287号，1981を参照）に準じ、
マウス体重減少試験、マウス白血球増加試験、易
熱性毒素否定試験およびマウスヒスタミン増感試
験を実施したが、いずれも、生理食塩水を接種し
た対照群と同等であり、この基準における副作用
は認められなかつた。

【表】

【表】注：(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)は第
１表に同じ。
調精例４デキストラン硫酸ナトリウム塩５ｇを200mlの
0.5M炭酸ナトリウム水溶液に溶解し、この溶液
に、0.5M炭酸ナトリウム水溶液で平衡化させた
セフアロースCL−4B（フアルマシア・フアイン
ケミカルズ社製）20mlを入れゆるやかに攪拌す
る。攪拌下に、100mlの蒸留水に10ｇの臭化シア
ンを溶解した液を加える。反応液に5M水酸化ナ
トリウム水溶液を添加しつつPHを11に15分間保持
する。その後、PHを下降するに任せ、室温にて攪
拌下17時間保持する。反応終了後、グラスフイルター上でろ過し、ゲ
ルを0.15M塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液（PH
7.2）で充分に洗浄して、デキストラン硫酸−ア
ガロースゲル20mlを得る。上記のようにして調製したデキストラン硫酸ア
ガロースゲルをカラム（16mmφ×100mm）に充填
し、これに0.2M塩化ナトリウム添加0.01Mリン
酸緩衝液（PH7.6、比電導度約17.5ms／cm）を通
液して平衡化する。このカラムに百日ぜき相菌
東浜株フアーメンター培養上清800ml（比電導度
約17.5ms／cm、PH7.6）を通液する。通液後、上
記緩衝液を通液してゲルを洗浄し、さらに0.20M
塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液（PH7.6、比電
導度約17.5ms／cm）を通液し、夾雑物質を洗い
出す。ついで、1.5M塩化ナトリウム添加リン酸緩衝
液（PH7.8、比電導度約120ms／cm）を溶出し、
Ｆ−HAを含む画分29mlを得た。培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ−HA
画分の分析結果を第４表に記す。Ｆ−HAの回収率は90％で、精製度（精製Ｆ−
HA画分の比活性／培養上清の比活性）は17倍に
達した。

【表】注：(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)は第
１表に同じ。
調製例５０℃以下の温度にてピリジン200mlにクロルス
ルホン酸11mlを滴下し、混合する。滴下終了後、
混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中にエ
ピクロルヒドリン架橋デキストランであるセフア
デツクスＧ−50（フアルマシア社製）7.5ｇを加
え、攪拌下65〜70℃にて４時間保持する。反応終
了後、冷却し、水酸化ナトリウム水溶液を加えて
中和する。ゲルを過分離し、0.01Mリン酸緩衝
食塩液で充分に洗浄して架橋デキストラン硫酸エ
ステルを得る。このようにして調製したセフアデツクスＧ−50
の硫酸エステル化物をカラム（16mmφ×100mm）
に充填し、これに0.2M塩化ナトリウム添加
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.6、比電導度約
17.5ms／cm）を通液して平衡化する。このカラ
ムに百日ぜき相菌東浜株静置培養上清800mlを
希釈して、比電導度約17.5ms／cm、PH7.6に合わ
せた液を通液する。通液後、上記緩衝液にて洗浄
し、夾雑物質を洗い出す。ついで、1.5M塩化ナ
トリウム添加リン酸緩衝液（PH7.6）で溶出し、
Ｆ−HAを含む画分30mlを得る。培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ−HA
画分の分析結果を第５表に記す。Ｆ−HAの回収率は93.8％で、精製度（精製Ｆ
−HA画分の比活性／培養上清の比活性）は約20
倍に達した。

【表】注：(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)は第
１表に同じ。
調製例６調製例１においてＦ−HAをセルロース硫酸エ
ステルゲルに吸着させた時の素通り画分
（64HAunit／ml，1700 LPF−Hp−ELISAunit／
ml，0.46mg蛋白質／ml，PH7.6）5000mlを出発原
料として用いた。 “L.I.Irons et.al，Biochim.Biophys.Acta，
580，175−185，1979”記載の方法に従い、上記
原料をPH6.0の0.01Mリン酸緩衝液で平衡化した
ハイドロキシルアパタイトカラムを通してLPF
−HAを吸着させた。0.5M塩化ナトリウムを含む
0.1Mリン酸緩衝液PH7.0で溶出して蛋白画分（部
分精製LPF−HA）を得た。この蛋白画分をハプ
トグロビン−セフアロースを支持体とするアフイ
ニテイクロマトグラフイーに吸着させ、0.5M塩
化ナトリウムと3Mチオシアン酸カリウムを含む
0.05Mリン酸緩衝液、PH7.6で溶離して第６表に
示す分析結果を有する精製LPF−HAを53％の回
収率で得た。

【表】

【表】調製例７特願昭58−206598号明細書の調製例１に従つて
精製した結晶ヒトセルロプラスミンを用いて、次
の各種変性セルロプラスミンを調製する。 (1) シアン化ナトリウム変性セルロプラスミン結晶セルロプラスミンの一ｗ／ｖ％水溶液50ml
をリン酸緩衝液（PH7.4，イオン強度0.2）に
0.05Mシアン化ナトリウムを含ませた緩衝液5.0
に４℃で12時間透析して、オキシダーゼ活性を
90％喪失したシアン化ナトリウム変性セルロプラ
スミンを得る。 (2) シアン化ナトリウム変性セルロプラスミンの
加熱処理 (1)と同様の方法でシアン化ナトリウム変性セル
ロプラスミンの1w／ｖ％水溶液50mlを調製した
後、この液を0.1Mリン酸緩衝液（PH7.4）5.0に
透析する。透析終了後、変性セルロプラスミン含
有液を60℃に加熱・昇温し、10時間同温度に保持
して加熱処理を行う。 (3) Ｌ−アスコルビン酸変性セルロプラスミン結晶セルロプラスミンの1w／ｖ％水溶液50ml
を酢酸緩衝液（PH5.2，イオン強度1.2）にＬ−ア
ルコルビン酸５mg／mlを加えた緩衝液5.0に４
℃で36時間透析して、オキシダーゼ活性が65.5％
となつたＬ−アスコルビン酸変性セルロプラスミ
ンを得る。 (4) 加熱処理変性セルロプラスミン結晶セルロプラスミンを5w／ｖ％含む0.1Mリ
ン酸緩衝液（PH7.5）100mlを、水溶液中で60℃、
15時間加熱処理する。 (5) 加熱処理セルロプラスミンのＬ−アスコルビ
ン酸変性人血漿をアルコール分画して得られるコーンの
フラクシヨン−１を温浴上で60℃、10時間加熱
を加える。Morell等の方法（Science，127，588
（1963）に従つて処理し、加熱処理済みの結晶セ
ルロプラスミンを得る。この加熱処理済み結晶セルロプラスミンを用
い、上記(3)と同様の処理を加えて、加熱処理セル
ロプラスミンのＬ−アスコルビン酸変性物を得
る。アフイニテイゲルの調製前記、各種変性セルロプラスミンをリガンドと
し、以下のようにしてCNBr−活性化セフアロー
ス4B（フアルマシア社製）にカツプリングさせて
アフイニテイゲルを調製する。 CNBr−活性化セフアロース4B1.5ｇを1.0mM
塩酸3.0に15分間浸漬して膨潤させたのち、ガ
ラスフイルター（G3）上で1.0mM塩酸を吸引除
去して膨潤セフアロースゲル（5.25ml）を得る。別に、リガンド（蛋白質量150mg）を0.5M塩化
ナトリウムを含む0.1M炭酸ナトリウム緩衝液
（PH8.3）75mlに溶解させ、これに上記膨潤セフア
ロースゲル52.5mlを加え、室温で隠やかに攪拌し
ながら２時間カツプリングさせる。カツプリング
終了後、上記と同じ炭酸ナトリウム緩衝液150ml
で４回洗浄したのち、1.0Mエタノールアミン水
溶液（PH8.0）150mlを加え、再び穏やかに攪拌し
ながら２時間反応させる。反応終了後、同様に炭
酸ナトリウム緩衝液150mlにて４回洗浄してエタ
ノールアミンを除去する。得られたゲルを、
1.0M塩化ナトリウムを含む0.1M酢酸緩衝液（PH
8.0）、150mlにて３回洗浄し、さらに1.0M塩化ナ
トリウムを含む0.1Mホウ酸緩衝液（PH8.0）、150
mlにて３回洗浄する。この酢酸緩衝液およびホウ
酸緩衝液による洗浄を交互に３回繰り返して、各
種のセルロプラスミン−セフアロースアフイニテ
イゲルを調製する。カラム法によるLPF−HAの精製上記で得られたアフイニテイゲル20mlを充填し
たカラム（28mmφ×32mm）に、調製例６で用いた
のと同じ出発材料5.0を室温にて150ml／hrの流
速で流す。つぎに、1.0M塩化ナトリウムを含む
リン酸緩衝液（PH7.0）、1500mlを同流速で通液し
てカラムを洗浄する。上記洗浄処理後、カラムに1.0M塩化ナトリウ
ムを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）に3.0Mチオ
シアン酸ナトリウムを加えた溶出液100mlを35.0
ml／cm²／hrの流速で流してLPF−HAを溶出す
る。これらの変性セルロプラスミンをリガンドとす
るアフイニテイゲルを用いて得られた各LPF−
HA画分の分析結果および各実験結果を第７表に
示す。これら各変性セルロプラスミンをリガンドとす
る場合には、LPF−HAの純度も高く、比活性値
も高い。

【表】注：(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)は第６表と
同じである。
調製例８前記調製例１と同様にして調製したセルロフア
インGC−15の硫酸エステルゲルをカラム（40mm
φ×200mm）に充填し、これに蒸留水1.0を通液
する。このカラムに百日ぜき相菌東浜株静置培
養液の遠心上清5000mlを蒸留水で10倍希釈した液
（比電導度約1.5ms／cm）、を通液する。約50000
mlの0.02Mマツキルベン緩衝液（PH5.2）をカラ
ムに通液し、ゲルを洗浄した後、0.02M塩化ナト
リウム添加マツキルベン緩衝液（比電導度約
2.0ms／cm、PH5.2）2000mlを用い、塩化ナトリウ
ム０→4.0Mの塩濃度勾配にて溶出を行ない約20
mlずつ分画して分取した後、LPF−HAを含有す
る画分約130mlをプールする。原材料液および精製LPF−HA画分の分析結果
および実験成績を第８表に示す。

【表】調製例９前記調製例４と同様にして調製したデキストラ
ン硫酸−アガロ−スゲルをカラム（40mmφ×200
mm）に充填し、これに蒸留水1000mlを通液する。
このカラムに調製例８と同じ培養遠心上清5000ml
を蒸留水で７倍希釈した液（比電導度約2.0ms／
cm）、を通液する。約20000mlの0.02Mマツキルベン緩衝液（PH
5.2）をカラムに通液し、ゲルを洗浄した後
0.02M塩化ナトリウム添加マツキルベン緩衝液
（比電導度約2.0ms／cm、PH5.2）2000mlを用い、
塩化ナトリウム０−4.0Mの塩濃度勾配にて溶出
を行ない、約20mlずつ分画して分取した後、
LPF−HAを含有する画分約200mlをプールする。原材料液および精製LPF−HA画分の分析結果
および実験成績を第９表に示す。

【表】調製例 10 ０℃以下の温度にてピリジン200mlにクロルス
ルホン酸11mlを滴下し、混合する。滴下終了後、
混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。このピリジ
ン−クロルスルホン酸混液に、架橋アガロースゲ
ルであるセフアロースCL−6B（フアルマシア社
製）のピリジン包含体30mlを加え、65〜70℃にて
４時間反応させる。反応終了後、冷却し、水酸化
ナトリウム水溶液を加えて中和する。ゲルを過
分離し、0.01Mリン酸緩衝食塩液で充分洗浄して
架橋アガロース硫酸エステルゲル23mlを得る。上記と同様にして調製した架橋セルロース硫酸
エステルゲルをカラム（40mlφ×200mm）に充填
し、これに蒸留水1000mlを通液する。このカラム
に調製例８と同じ培養遠心上清5000mlを蒸留水で
９倍希釈した液（比電導度約2.0ms／cm）、を通
液する。約20000mlの0.02Mマツキルベン緩衝液
（PH5.2）をカラムに通液し、ゲルを洗浄した後、
0.02M塩化ナトリウム添加マツキルベン緩衝液
（比電導度約2.0ms／cm、PH5.2）2000mlを用い、
塩化ナトリウム０→4.0Mの塩濃度勾配にて溶出
を行ない、約20mlずつ分画して分取した後、
LPF−HAを含有する画分約200mlをプールする。原材料液および精製LPF−HA画分の分析結果
および実験成績を第10表に示す。

【表】実施例１〜７便宜上、調製例１，２，３，４および５で得た
高純度Ｆ−HAをそれぞれ、試料ａ，ｂ，ｃ，
ｄ，ｅとし、実施例６，７，８，９および10で得
た高純度LPF−HAを、それぞれ試料Ｖ，Ｗ，
Ｘ，Ｙ，Ｚとする。これらの試料を用いて、以下の如くして百日ぜ
きコンポーネントワクチンを調製した。なお、上
記試料は精製の最終工程で0.45μのメンブランフ
イルターで無菌過済である。先ず、試料Ｖ，Ｗ，Ｘ，ＹおよびＺを、それぞ
れに対して最終濃度0.02v／ｖ％ゼラチンおよび
最終濃度0.05v／ｖ％Tween80を添加したのち、
さらに最終濃度0.6v／ｖ％のホルマリンを加え、
40℃で10日間加温処理して減毒化し、各LPF−
HAトキソイドとした。ホルマリンは４℃以下で
リン酸緩衝液（PH6.7）い対して２日間透析して
除去した。次に、試料ａ，ｃ，ｅをきわめて微量残存する
LPF活性を低減させる目的で、最終濃度0.02v／
ｖ％ホルマリンを加え40度、１晩加温処理して減
毒化しＦ−HAトキソイドとしが。ホルマリンは
上記と同様にして除去した。試料ｂ，ｄは、その
まま（トキソイド化せず）に以下のワクチン調製
に供した。これらのＦ−HA試料ｂ，ｄおよびトキソイド
化Ｆ−HA試料ａ，ｃ，ｅと、トキソイド化LPF
−HA試料Ｖ，Ｗ，Ｘ，Ｙ，Ｚとを、第11表に示
すように、種々の組合せ、配合にて混合し、さら
にAl（oH）₃をアルミニウム最終濃度約0.2mg／ml、
チメロサールが0.01v／ｖ％となるように添加し、
最終PHを6.7〜6.8として７種（実施例１〜７）沈
降精製百日ぜきコンポーネントワクチンを調製し
た。

【表】次に実施例１〜７までのすべてのワクチンを国
家検定基準（生物学的製剤基準、薬発第287号、
1981）に準じて、一般性状試験、マウス毒性試
験、マウス力価試験を行つた結果、第12表の如き
結果が得られ、試験項目すべてに適合しており、
良好な結果であることが明らかである。

【表】実施例８実施例１〜７で調製したFHAトキソイドａと
LPFトキソイドＷのそれぞれの最終濃度が50μｇ
蛋白質／ml、ジフテリアトキソイドおよび破傷風
トキソイドの最終濃度が、それぞれ33Lf／ml、
5Lf／ml、さらにAl（oH）₃、ゼラチンおよびチメ
ロサールが、それぞれ、0.2mgAl／ml（アルミニ
ウム含量として）、0.02（ｗ／ｖ）％、および0.01
％となるように各成分を混合し、最終PHを6.7と
して、沈降精製百日ぜき・ジフテリア・破傷風混
合ワクチンを得た。これを前記国家検定基準に準じて自家検定を行
つた結果、第13表の如き結果が得られ、試験項目
すべてに適合していた。また、上記で調製したワクチンを凍結乾燥した
ものも上記と同等の結果を有していた。

【表】

〔発明の効果〕

以上詳述して来た如く、本発明方法は、ワクチ
ン原料たるＦ−HAおよびLPF−HAとして簡単
かつ高収率の方法で得られた極めて高純度のもの
を使用するため、局所反応等の副作用のない改善
された百日ぜきコンポーネントワクチンおよび百
日ぜき・ジフテリア・破傷風混合ワクチンを安価
に工業的に製造できるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明によるワクチンと従来のワク
チン投与後のマウス足蹠試験（惹起注射後のマウ
ス足蹠の膨隆度経時変化）の比較結果を示すグラ
フである。

Claims

【特許請求の範囲】１繊維状赤血球凝集素（以下、Ｆ−HA）含有
液をセルロース硫酸エステルのゲル、デキストラ
ン硫酸が化学的に結合されたポリサツカライドゲ
ル誘導体または架橋ポリサツカライド硫酸エステ
ルゲルに接触せしめてＦ−HAを吸着させた後、
吸着したＦ−HAをゲルから溶出して得られた精
製Ｆ−HAまたはそのトキソイドと、高純度精製
リンパ球増多因子赤血球凝集素（以下、LPF−
HA）のトキソイドとを混合することを特徴とす
る百日ぜきコンポーネントワクチンの製造方法。２セルロース硫酸エステルゲル、デキストラン
硫酸が化学的に結合されたポリサツカライドゲル
誘導体または架橋ポリサツカライド硫酸エステル
ゲルをPH6.9〜9.0、比電導度5.0〜25.0ms／cmの緩
衝液であらかじめ処理して平衡化したのちＦ−
HAの吸着処理を行なう特許請求の範囲第１項記
載の方法。３上記吸着処理を、PH6.0〜8.0、温度０〜30
℃、比電導度5.0〜25.0ms／cmの条件下で行なう
特許請求の範囲第１または第２項記載の方法。４Ｆ−HAのゲルからの溶出をPH5.0〜10.0、比
電導度25.0〜130ms／cmの緩衝液を用いて行なう
特許請求の範囲第１〜３項いずれか記載の方法。５上記溶出処理に先だつて、Ｆ−HA吸着ゲル
を、PH5.0〜10.0、比電導度5.0〜25.0ms／cmの緩
衝液で洗浄する特許請求の範囲第４項記載の方
法。６セルロース硫酸エステルが結晶セルロースま
たは結晶領域および非結晶領域からなるセルロー
スの硫酸エステルである特許請求の範囲第１項記
載の方法。７上記デキストラン硫酸が化学的に結合された
ポリサツカライドゲル誘導体が、デキストラン硫
酸−アガロースゲル、デキストラン硫酸−デキス
トランゲルおよびデキストラン硫酸−セルロース
ゲルから選ばれる特許請求の範囲第１項記載の方
法。８架橋ポリサツカライド硫酸エステルが架橋デ
キストラン硫酸エステルおよび架橋アガロース硫
酸エステルおよび架橋セルロース硫酸エステルか
ら選ばれる１種である特許請求の範囲第１項記載
の方法。９架橋デキストラン硫酸エステルがエピクロル
ヒドリン架橋デキストラン硫酸エステルである特
許請求の範囲第８項記載の方法。１０架橋アガロース硫酸エステルがエピクロル
ヒドリン架橋アガロース硫酸エステルである特許
請求の範囲第８項記載の方法。１１架橋セルロース硫酸エステルがエピクロル
ヒドリン架橋セルロース硫酸エステルである特許
請求の範囲第８項記載の方法。１２Ｆ−HA含有液をセルロース硫酸エステル
のゲル、デキストラン硫酸が化学的に結合された
ポリサツカライドゲル誘導体または架橋ポリサツ
カライド硫酸エステルゲルに接触せしめてＦ−
HAを吸着させた後、吸着したＦ−HAをゲルか
ら溶出して得られた精製Ｆ−HAまたはそのトキ
ソイドと、高純度精製LPF−HAのトキソイドと
を混合することにより得られた混合物に、さらに
ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドと
を添加することからなる百日ぜき・ジフテリア・
破傷風混合ワクチンの製造方法。