JPH11507805A - 非細胞性百日咳ワクチンおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 細胞ペーストからの線毛性凝集原の抽出と抽出物の濃縮・精製が関与する多段階手順によって、Bondetella菌株、特にB.pertussis菌株から、線毛性凝集原製剤が得られる。線毛性凝集原製剤を用いて、百日咳毒もしくはそれのトキソイド、６９ｋＤａ蛋白および線維状ヘマグルトニンならびに他のBordetella抗原などの他の百日咳抗原を含む非細胞性百日咳ワクチンを得ることができる。そのようなワクチンは、危険性のあるヒト群の７０％以上に保護を提供するものである。

Description

【発明の詳細な説明】非細胞性百日咳ワクチンおよびその製造方法 発明の属する技術分野 本発明は、細胞性百日咳ワクチン、その成分およびその製造方法に関するもの である。関連出願についての参照 本出願は、１９９５年５月４日出願の同時係属中の米国特許出願０８／４３３ ６４６号の一部継続出願である。発明の背景 百日咳は、Bordetella pertussisによって引き起こされる重度の非常に伝染性 が強い上気道感染である。世界保健機構は、年間６０００万人の百日咳患者があ り、０．５／１００万の割合でそれに関連する死者が出ていると推算している（ 参考文献１。本明細書を通じて、本発明が関係する最新技術についてより詳細に 説明することを目的として、各種参考文献が括弧を施して引用される。各引用に ついての完全な文献情報が明細書末尾の、請求の範囲の直前にある。それにより 、これらの参考文献の開示内容は、引用によって本開示に含まれる）。非予防接 種群では、百日咳の発生率は５歳以下の小児において８０％という高率である（ 参考文献２）。百日咳は一般に子供の病気と考えられているが、青少年および成 人において臨床的および無症候性の疾患であることを示す証拠が多くなっている （参考文献３、４および５）。 １９４０年代における化学的および熱的に不活化したB.pertussis微生物から なる全細胞ワクチンの導入によって、B.pertussisが原因の百日咳の発生率は大 幅に低下した。全細胞ワクチンについての効力は、患者の定義によって決まるが 、９５％以下であると推定されている（参考文献６）。B.pertussisに感染する と、一生続く免疫が得られるが、全細胞ワクチンによる免疫感作後に保護効果の 低下を示す証拠が増えている（参考文献３）。全細胞百日咳ワクチン接種、反応 原性（reactogenicity）および重篤な副作用との間の関係について言及する報告 がいくつか行われたことから、ワクチン接種が低下し、結果的に新たな流行が起 こった（参考文献７）。さらに最近では、所定成分百日咳ワクチンが開発されて いる。 所定成分百日咳ワクチン用の抗原 各種の非細胞性百日咳ワクチンが開発されており、それにはBordetella百日咳 抗原、百日咳毒（ＰＴ）、線維状ヘマグルトニン（haemagglutonin）（ＦＨＡ） 、６９ｋＤＡ外膜蛋白（ペルタクチン（pertactin））および線毛性凝集原など がある（後述の表１参照。表は明細書の末尾にある。）。 百日咳毒 百日咳毒は、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を有する細菌毒素のＡ ／Ｂ類の一種である外毒素である（参考文献８）。これら毒素のＡ部分は、ＡＤ Ｐ−リボシルトランスフェラーゼ活性を示し、Ｂ部分は毒素の宿主細胞受容体へ の結合とその作用部位へのＡの転位に介在する。ＰＴはさらに、B.pertussisの 線毛上皮細胞への付着を促進し（参考文献９）、B.pertussisによる大食細胞の 侵襲においてある役割を果たす（参考文献１０）。 非細胞性百日咳ワクチンはいずれも、主要な毒性因子であり保護抗原として提 案されているＰＴを含むものであった（参考文献１１および１２）。B.pertussi s による自然感染により、ＰＴへの体液媒介性および細胞媒介性の両方の応答が 生じる（参考文献１３および１７）。乳児は胎盤由来の抗ＰＴ抗体を持ち（参考 文献１６および１８）、抗ＰＴ抗体を有するヒト初乳は、エアロゾル感染に対す るマウスの受動保護において有効であった（参考文献１９）。非細胞性ワクチン による免疫感作後には、ＰＴサブユニットに対する細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）応 答が明らかになっており（参考文献２０）、全細胞ワクチン接種後にはＰＴに対 するＣＭＩが応答が生じている（参考文献１３）。全細胞ワクチンまたは成分ワ クチン中の化学的に不活化されたＰＴは動物モデルおよびヒトにおいて保護効果 を有する（参考文献２１）。さらに、サブユニットＳ１に特異的なモノクローナ ル抗体は、B.pertussisに対する保護を行う（参考文献２２および２３）。 ＰＴの主要な病態生理学的効果は、それのＡＤＰ−リボシルトランスフェラー ゼ活性によるものである。ＰＴはＮＡＤからＧｊグアニンヌクレオチド結合蛋白 へのＡＤＰ−リボースの転移を触媒し、それによって細胞のアデニル酸シクラー ゼ調節系を障害する（参考文献２４）。ＰＴはさらに、大食細胞およびリンパ球 の炎症部位への移動を防止し、好中球介在の食作用および殺細菌を妨害する（文 献２５）。多くのin vitroおよびin vivoのアッセイを用いて、ウシトランスジ ューシンのＡＤＰ−リボシル化（文献２６）、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃ ＨＯ）細胞の群形成アッセイ（参考文献２７）、ヒスタミン感作（文献２８）、 白血球増加症およびＮＡＤグリコヒドロラーゼなどのＳ１および／またはＰＴの 酵素活性が評価されている。ＰＴ曝露を受けると、ＣＨＯ細胞は特徴的な群形成 形態を取る。この現象は、ＰＴの結合とその後の転位およびＳ１のＡＤＰ−リボ シルトランスフェラーゼ活性に対して依存性であり、ＣＨＯ細胞群形成アッセイ はＰＴ完全毒素の完全性および毒性を調べるのに広範囲に使用されている。 線維状ヘマグルトニン 線維状ヘマグルトニンは、大きい（２２０ｋＤａ）無毒性ポリペプチドであり 、細菌のコロニー形成時におけるB.pertussisの上気道線毛細胞への付着を媒介 する（参考文献９、２９）。自然感染により、抗ＦＨＡ抗体および細胞媒介性免 疫が誘発される（参考文献１３、１５、１７、３０および３１）。抗ＦＨＡ抗体 は、ヒト初乳において認められ、やはり胎盤を通じて伝達される（参考文献１７ 、１８および１９）。全細胞性または非細胞性の百日咳ワクチンによる予防接種 により抗ＦＨＡ抗体が生じ、ＦＨＡを含む非細胞性ワクチンによってはさらに、 ＦＨＡに対するＣＭＩ応答が誘発される（参考文献２０および３２）。ＦＨＡは 、能動免疫または受動免疫後でのマウスの呼吸系攻撃モデルにおける保護抗原で ある（参考文献３３および３４）。しかしながら、ＦＨＡ単独では、マウスの脳 内攻撃力アッセイにおいて保護を示さない（参考文献２８）。 ６９ｋＤａ外膜蛋白（ペルタクチン） ６９ｋＤａ蛋白は、最初はB.bronchisepticaから確認された外膜蛋白である（ 参考文献３５）。それはB.bronchisepticaに対する保護抗原であることが明らか になっており、その後、B.pertussisおよびB.parapertussisの両方で確認されて いる。６９ｋＤａ蛋白は、真核細胞に直接結合し（参考文献３６）、B.pertussi s による自然感染によって、抗Ｐ．６９体液応答を誘発し（参考文献１４）、Ｐ ．６９も細胞介在性免疫応答を誘発する（参考文献１７、３７および３８）。全 細胞ワクチンまたは非細胞性ワクチンによる予防接種によって抗Ｐ．６９抗体が 誘発され（参考文献３２および３９）、非細胞性ワクチンによってＰ．６９ＣＭ Ｉが誘発される（参考文献３９）。ペルタクチンは、B.pertussisによるエアロ ゾル攻撃に対してマウスを保護し（参考文献４０）、ＦＨＡとの併用によって、B.pertussis に対する脳内攻撃試験において保護を示す（参考文献４１）。ポリ クローナルまたはモノクローナルの抗Ｐ．６９抗体の受動的転移によっても、エ アロゾル攻撃に対してマウスが保護される（参考文献４２）。 凝集原 B.pertussisの血清型は、その凝集性線毛によって決まる。ＷＨＯは、１型、 ２型および３型の凝集原（Ａｇｇ）が交差保護性ではないことから、全細胞ワク チンにこれらの凝集原を含ませることを推奨している（参考文献４３）。Ａｇｇ １は非線毛性であって全てのB.pertussis菌株で認められるのに対して、血清型 ２型および３型Ａｇｇは線毛性である。自然感染または全細胞性もしくは非細胞 性のワクチンによる免疫感作によって、抗Ａｇｇ抗体が誘発される（参考文献１ ５および３２）。マウスにおいて、エアロゾル感染後に、Ａｇｇ２およＡｇｇ３ によって、特異的な細胞介在性免疫応答を生じさせることができる（参考文献１ ７）。Ａｇｇ２およびＡｇｇ３は、マウスにおいて呼吸系攻撃に対する保護効果 を持ち、抗凝集原を含むヒト初乳も、このアッセイで保護を示す（参考文献１９ 、４４、４５）。 非細胞性ワクチン 最初に開発された非細胞性ワクチンは、サトウ（Sato）らの２成分ＰＴ＋ＦＨ Ａワクチン（ＪＮＩＨ６）であった（参考文献４６）。このワクチンは、B.pert ussis 株Tohamaの培養上清からのＰＴ抗原およびＦＨＡ抗原の同時精製と、それ に続くホルマリントキソイド化によって製造された。１９８１年以降、各種製造 業者からの各種成分の非細胞性ワクチンを用いて、日本の小児の百日咳に対する 免疫感作が奏功して、結果的に疾患の発生率が大幅に低下している（参考文献４ ７）。ＪＮＩＨ６ワクチンおよび単一成分ＰＴトキソイドワクチン（ＪＮＩＨ７ ）について１９８６年にスウェーデンで大規模な治験での試験が行われている。 最初の結果は、全細胞ワクチンについて報告されている効力より低い効力を示し ていたが、追跡調査試験では、血清学的方法によって診断される比較的軽い疾患 に対しては、より有効であることが明らかになっている（参考文献４８、４９、 ５０、５１）。しかしながら、これらのワクチンにおいては、ホルマリン不活化 ＰＴの毒性への復帰の現象を示す証拠があった。これらのワクチンはさらに、感 染に対してではなく、疾患に対して保護作用があることが認められている。 現在、多くの新たな非細胞性百日咳ワクチンが評価を受けており、それにはＰ Ｔ、ＦＨＡ、Ｐ．６９および／または凝集原の併用が含まれており、これらは表 １に挙げてある。化学的解毒のいくつかの方法が、ＰＴに対して行われており、 それにはホルマリン（参考文献４６）、グルタルアルデヒド（参考文献５２）、 過酸化水素（参考文献５３）およびテトラニトロメタン（参考文献５４）による 不活化などがある。 そのように、現在市販されている非細胞性百日咳ワクチンは、適切な免疫原型 の適切な抗原の適切な製剤が含まれていて、百日咳に対して感受性のヒトの群に おいて所望のレベルの効力を得ることができていない。 そこで、特定の抗原を特定の相対量で含む有効な非細胞性百日咳ワクチンなら びにその製造方法を提供することが望ましいものと考えられる。発明の概要 本発明は、非細胞性百日咳ワクチン製剤、その成分、そのようなワクチンおよ びその成分の製造方法、ならびにその使用方法に関するものである。 本発明の１態様によれば、Bordetella菌株からの凝集原製剤の製造方法におい て、 （ａ）Bordetella菌株の細胞ペーストを得る段階 （ｂ）該細胞ペーストから線毛性凝集原を選択的に抽出して、凝集原を含む第 １の上清と第１の残渣沈殿物を得る段階 （ｃ）第１の残渣沈殿から第１の上清を分離する段階； （ｄ）第１の上清を、線毛性凝集原を含む透明上清と非凝集原汚染物を含む第 ２の沈殿物を得るだけの温度および時間でインキュベーションする段階； （ｅ）透明上清を濃縮して、粗線毛性凝集原を含有する溶液を得る段階； （ｆ）粗線毛溶液から凝集原を精製して、凝集原製剤を得る段階 を有してなる方法が提供される。 Bordetella菌株は、B.pertussisであることができる。第１の上清は、約５０ ℃〜約１００℃、さらには約７５℃〜約８５℃、好ましくは約８０℃の温度でイ ンキュベーションすることができる。インキュベーション時間は、約１０分間〜 約６０分間、好ましくは約３０分間とすることができる。線毛性凝集原の細胞ペ ーストからの選択的抽出は、細胞ペーストを約１Ｍ〜約６Ｍの尿素を含む緩衝液 に分散させることで行うことができる。特定の実施態様においては、第１の上清 を濃縮してから、透明上清を得るような時間および温度でインキュベーションを 行う。 透明上清の濃縮は、透明上清からの線毛凝集原の沈殿と、得られた上清からの 線毛性凝集原の沈殿の分離と、沈殿した線毛性凝集原の可溶化などの簡便な手段 によって行うことができる。沈殿形成は、透明上清に、分子量約８０００のポリ エチレングリコールなどのポリエチレングリコールを加えることで行うことがで きる。そのような沈殿形成で使用されるポリエチレングリコールの濃度は、約３ ％〜約５％、好ましくは約４．３％〜約４．７％として、透明上清からの前記線 毛性凝集原の沈殿を行うことができる。 線毛性凝集原は、カラムクロマトグラフィーによって粗線毛溶液から精製する ことができ、カラムクロマトグラフィーには、セファデックス（Sephadex）６Ｂ および／またはＰＥＩシリカカラムクロマトグラフィー等のゲル濾過などがあり 得る。本発明の特定の態様において凝集原は、例えばカラムクロマトグラフィー からの溶出液（run-through）の無菌濾過によって滅菌された無菌凝集原製剤と して提供される。特定の実施態様においては、無菌線毛性凝集原製剤は、ミョウ バンなどの無機塩アジュバントに吸着される。 本発明の特定の態様においては、実質的に凝集原１を含まない線毛性凝集原２ （Ａｇｇ２）および線毛性凝集原３（Ａｇｇ３）を含むBordetella菌株から得ら れる線毛性凝集原製剤が提供される。凝集原１は反応原性であるB.pertussisの リポオリゴ糖（ＬＯＳ）であることが報告されていることから、実質的にＬＯＳ を含まない線毛性凝集原の提供はそれによる反応原性を低下させるものである。 Ａｇｇ２のＡｇｇ３に対する重量比は、そのような線毛性凝集原製剤では約１． ５：１〜約２：１とすることができる。本発明の特定の実施態様においては、本 発明で提供される方法によって製造される線毛性凝集原製剤が提供される。 本発明のさらに別の態様では、本発明で提供される線毛性凝集原製剤を有して なる免疫原性組成物が提供される。その免疫原性組成物は、Bordetellaによって 生じる疾患からワクチンによって免疫感作された宿主を保護するためにin vivo で使用されるワクチンとして製剤することができ、１以上の他のBordetella抗原 を含むことができる。その１以上の他のBordetella抗原は、線維状ヘマグルチニ ン、６９ｋＤａ外膜蛋白、アデニル酸シクラーゼ、Bordetellaリポオリゴ糖、外 膜蛋白ならびに百日咳毒もしくはそのトキソイドであることができ、それらの遺 伝的に解毒された類縁体も含まれる。 本発明のさらに別の態様においては、本発明で提供される免疫原性組成物は、 １以上の非Bordetella免疫原を有することができる。そのような非Bordetella免 疫原は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、Haemophilusの莢膜多糖類 、Haemophilusの外膜蛋白、Ｂ型肝炎表面抗原、小児麻痺、おたふくかぜ、はし か、および／または風疹などがあり得る。 本発明で提供される免疫原性組成物はさらにアジュバントを含有することがで き、そのようなアジュバントには、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、 クイル（Quil）Ａ、ＱＳ２１、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜 鉛、糖脂質類縁体、アミノ酸のオクタデシルエステルまたはリポ蛋白などがあり 得る。 本発明の具体的な態様によれば、B.pertussisによる感染によって生じる疾患 の場合に対して危険性のあるヒト群を保護するためのワクチン組成物であって、 その危険群の構成員の７０％以上の範囲まで保護を提供するべく選択された相対 量で、精製された形態での百日咳トキソイド、線維状ヘマグルチニン、ペルタク チンおよび凝集原を有してなるワクチン組成物が提供される。 そのようなワクチン組成物は、約５〜約３０μｇの百日咳トキソイド窒素、約 ５〜約３０μｇの線維状ヘマグルチニン窒素、約３〜約１５μｇのペルタクチン 窒素、ならびに約１〜約１０μｇの凝集原窒素を含有することができる。 ある具体的な実施態様においてワクチンは、Bordetellaの百日咳トキソイド、 線維状ヘマグルチニン、６９ｋＤａ蛋白および線毛性凝集原を、約１０：５：５ ：３の重量比で含むことができ、その場合、ヒトへの１回用量に、百日咳トキソ イド約１０μｇ、線維状ヘマグルチニン約５μｇ、６９ｋＤａ蛋白約５μｇおよ び線毛性凝集原約３μｇを含有させることができる。さらに別の特定の実施態様 においてワクチンは、百日咳トキソイド、線維状ヘマグルチニン、６９ｋＤａ蛋 白および線毛性凝集原を、約２０：２０：５：３の重量比で含むことができ、そ の場合、ヒトへの１回用量に、百日咳トキソイド約２０μｇ、線維状ヘマグルチ ニン約２０μｇ、６９ｋＤａ蛋白約５μｇおよび線毛性凝集原約３μｇを含有さ せることができる。さらに別の特定の実施態様においてワクチンは、百日咳トキ ソイド、線維状ヘマグルチニン、６９ｋＤａ蛋白および線毛性凝集原を、約２０ ：１０：１０：６の重量比で含むことができ、その場合、ヒトへの１回用量に、 百日咳トキソイド約２０μｇ、線維状ヘマグルチニン約１０μｇ、６９ｋＤａ蛋 白約１０μｇおよび線毛性凝集原約６μｇを含有させることができる。 ２１日以上の期間にわたる痙攣性の咳があって培養で確認された細菌感染のあ る患者に関しては、本発明のワクチン組成物が提供する危険性のあるヒト群に対 する保護の程度は、約８０％以上、好ましくは約８５％以上であり得る。１日以 上の期間の咳を有する軽度の百日咳患者に関しては、危険性のあるヒト群に対す る保護の程度は、約７０％以上である。 ワクチンの凝集原成分は、凝集原１を実質的に含まない線毛性凝集原２（Ａｇ ｇ２）および線毛性凝集原３（Ａｇｇ３）を含有するものである。Ａｇｇ２のＡ ｇｇ３に対する重量比は約１．５：１〜約２：１とすることができる。 本発明において提供されるワクチンには、破傷風トキソイドおよびジフテリア トキソイドを併用して、ＤＴＰワクチンを提供することができる。１実施態様に おいては、ワクチンは約１５Ｌｆのジフテリアトキソイドと約５Ｌｆの破傷風ト キソイドを含む。 さらに、ワクチンはアジュバント、特にはミョウバンを含むこともできる。 そのような特定の実施態様において、免疫原性組成物は、それに含まれる各抗 原に対してある免疫応答特性（profile）を与え、その応答特性は、全細胞百日 咳ワクチンによって得られるものと実質的に等価である。 本発明のさらに別の態様においては、Bordetellaによって生じる疾患に対して 宿主を免疫感作する方法であって、ヒトなどの宿主に対して、本発明で提供され る免疫原性組成物もしくはワクチンを免疫的に有効な量で投与する段階を有して なる方法が提供される。 本発明のさらに別の態様においては、B.pertussisによる感染によって生じる 疾患に対して、危険性のあるヒト群を免疫感作する方法であって、危険性のある ヒト群の構成員に対して、本発明で提供されるワクチン組成物を免疫的に有効な 量で投与して、危険群の構成員の約７０％以上に保護を与える方法が提供される 。 本発明の利点には、非細胞性百日咳ワクチンに含有させるのに好適な免疫原性 凝集原製剤を簡単な方法で製造して、そのようなワクチンの効力を高めることが できるというものがある。 本発明によって提供される凝集原製剤は、ワクチンによって免疫感作される宿 主をB.pertussisなどのBordetellaによって生じる疾患から保護するための非細 胞性の多成分ワクチン製剤において用途を有するものである。特に、本発明で提 供される凝集原製剤を含む免疫原性組成物は、二重盲検ヒト効力治験での評価向 けに、米国政府の国立アレルギー・感染症研究所（National Institute of Alle rgy and Infectious Diseases：NIAID）によって選択されており、それにより、 特定の当業者に対して、その組成物が対象疾患（百日咳）の予防にある程度有効 であることを示すだけの根拠が確立された。この治験は、本米国特許出願の出願 日現在で継続中である。その治験の対象（本発明で提供されるワクチン）は、有 用性がかなり予測できるものであるという要求を満足するものであった。図面の簡単な説明 本発明は、添付の図面を参照しながら、以下の詳細な説明および実施例からさ らに詳細に理解される。 図１は、本発明の１態様によるBordetella菌株からの凝集原製剤の単離手順の 図式的フローシートである。発明の詳細な説明 １態様において本発明は、Bordetella菌株からの凝集原製剤を製造するために 用いることができる新規な方法を提供する。図１について説明すると、Bordetel la 菌株からの凝集原製剤の製造方法のフローシートが示してある。図１からわか るように、B.pertussis細胞ペーストなどの凝集原を含むBordetella細胞ペース トを、１０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび４Ｍ尿素などの尿 素含有緩衝液で抽出して、細胞ペーストから凝集原を選択的に抽出することで、 凝集原を含む第１の上清（ｓｐ１）と第１の残渣沈殿物（ｐｐｔ１）を得る。第 １の上清（ｓｐ１）を、遠心分離などによって、第１の残渣沈殿物（ｐｐｔ１） から分離する。その残渣沈殿物（ｐｐｔ１）は廃棄する。次に、透明上清（ｓｐ １）を、例えば１００〜３００ｋＤａ ＮＭＷＬ膜フィルターを用いて、例えば １０ｍＭリン酸カリウム／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／０．１％トリトンＸ−１００ に対して濃縮・ダイアフィルトレーションを行うことができる。 次に、第１の上清を、凝集原を含む透明上清（ｓｐ２）と非凝集原汚染物を含 む第２の廃棄沈殿物（ｐｐｔ２）を得るだけの温度および時間でインキュベーシ ョンする。適切な温度としては、約５０℃〜約１００℃、さらには約７５℃〜約 ８５℃などがあり、適切なインキュベーション時間としては、約１分間〜約６０ 分間などがある。次に、透明上清を、例えば分子量約８０００のポリエチレング リコール（ＰＥＧ８０００）を最終濃度約４．５±０．２％となるまで加え、約 ３０分間以上ゆっくり撹拌することで濃縮して、第３の沈殿物（ｐｐｔ３）を得 て、それを遠心にて回収することができる。残った上清ｓｐ３は廃棄する。 この第３の沈殿物（ｐｐｔ３）を、例えば１０ｍＭリン酸カリウム／１５０ｍ Ｍ ＮａＣｌを含有する緩衝液で抽出して、粗線毛性凝集原含有溶液を得る。そ の粗線毛溶液に１Ｍリン酸カリウムを加えて、それをリン酸カリウムに関して約 １００ｍＭとすることができる。別法として、熱処理した線毛性凝集原の透明上 清を、セファロースＣＬ６Ｂなどのゲルを用いるゲル濾過クロマトグラフィーに よって沈殿形成を行わずに精製することができる。次に、粗溶液中の線毛性凝集 原を、ＰＥＩシリカカラムを通過させる等のカラムクロマトグラフィーによって 精製して、溶出液中の線毛性凝集原製剤を得る。 この線毛性凝集原含有溶出液をさらに、１００〜３００ｋＤａ ＮＭＷＬ膜を 使用する１０ｍＭリン酸カリウム／１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液に対して 濃縮・ダイアフィルトレーションすることができる。凝集原製剤は、≦０．２２ μＭ膜フィルターによる濾過によって滅菌して、線毛性凝集原２および３を含む 最終精製線毛性凝集原製剤を得ることができる。 本発明は、凝集原１を実質的に含まない線毛性凝集原２（Ａｇｇ２）および線 毛性凝集原３（Ａｇｇ３）を含むBordetella菌株からの凝集原製剤を含むもので ある。Ａｇｇ２のＡｇｇ３に対する重量比は、約１．５：１〜約２：１とするこ とができる。そのような線毛性凝集原製剤は、本発明で提供され上記で詳細に説 明した方法によって製造することができる。本発明はさらに、本発明で提供され る線毛性凝集原製剤を含む免疫原性組成物（ワクチンを含む）も含むものである 。そのようなワクチンには、線維状ヘマグルチニン、６０ｋＤａ外膜蛋白および 百日咳毒もしくはそれのトキソイド（文献６８に記載のＰＴの遺伝的に解毒した 類縁体を含む）のような他のBordetella免疫原、ならびにジフテリアトキソイド 、破傷風トキソイド、Haemophilusの莢膜多糖類、Haemophilusの外膜蛋白、Ｂ型 肝炎表面抗原、小児麻痺、おたふくかぜ、はしか、および／または風疹のような 非Bordetella免疫原などがあり得る。各Bordetella免疫原をそれぞれアジュバン ト（例：ミョウバン）に吸収させて、本発明で提供されるワクチン中に特定の相 対量で抗原を含有するワクチンを簡便かつ迅速に得る。 特定の実施態様において本発明は、以下の特性を有するワクチンを提供するも のであり（ここで使用されるμｇ蛋白は、精製濃縮物について実施されるケルダ ール試験の結果に基づくものであり、蛋白窒素のμｇ数として表現されたもので ある）、そのいずれも筋肉注射によって投与することができる。 （ａ）ＣＰ１０／５／５／３ＤＴ ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドを併用した成分百日咳ワクチン の一つの製剤を、ＣＰ１０／５／５／３ＤＴと称した。ＣＰＩ０／５／５／３Ｄ Ｔの各０．５ｍＬヒト用量を、ほぼ以下の含有量となるように製剤した。 １０μｇ 百日咳トキソイド（ＰＴ） ５μｇ 線維状ヘマグルトニン（ＦＨＡ） ５μｇ 線毛性凝集原２および３（ＦＩＭＢ） ３μｇ ６９ｋＤａ外膜蛋白 １５Ｌｆ ジフテリアトキソイド ５Ｌｆ 破傷風トキソイド １．５ｍｇ リン酸アルミニウム ０．６％ ２−フェノキシエタノール（保存剤） （ｂ）ＣＰ２０／２０／５／３ＤＴ ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドを併用した成分百日咳ワクチン の別の製剤を、ＣＰ２０／２０／５／３ＤＴと称した。ＣＰ２０／２０／５／３ ＤＴの各０．５ｍＬヒト用量を、ほぼ以下の含有量となるように製剤した。 ２０μｇ 百日咳トキソイド（ＰＴ） ２０μｇ 線維状ヘマグルトニン（ＦＨＡ） ５μｇ 線毛性凝集原２および３（ＦＩＭＢ） ３μｇ ６９ｋＤａ外膜蛋白 １５Ｌｆ ジフテリアトキソイド ５Ｌｆ 破傷風トキソイド １．５ｍｇ リン酸アルミニウム ０．６％ ２−フェノキシエタノール（保存剤） （ｃ）ＣＰ１０／５／５ＤＴ ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドを併用した成分百日咳ワクチン のある製剤を、ＣＰ１０／５／５ＤＴと称した。ＣＰ１０／５／５ＤＴの各０． ５ｍＬヒト用量を、ほぼ以下の含有量となるように製剤した。 １０μｇ 百日咳トキソイド（ＰＴ） ５μｇ 線維状ヘマグルトニン（ＦＨＡ） ５μｇ 線毛性凝集原２および３（ＦＩＭＢ） １５Ｌｆ ジフテリアトキソイド ５Ｌｆ 破傷風トキソイド １．５ｍｇ リン酸アルミニウム ０．６％ ２−フェノキシエタノール（保存剤） （ｄ）ＣＰ２０／１０／１０／６ＤＴ ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドを併用した成分百日咳ワクチン のさらに別の製剤を、ＣＰ２０／１０／１０／６ＤＴと称した。ＣＰ２０／１０ ／１０／６ＤＴの各０．５ｍＬヒト用量を、ほぼ以下の含有量となるように製剤 した。 ２０μｇ 百日咳トキソイド（ＰＴ） １０μｇ 線維状ヘマグルトニン（ＦＨＡ） １０μｇ 線毛性凝集原２および３（ＦＩＭＢ） ６μｇ ６９ｋＤａ外膜蛋白（６９ｋＤＡ） １５Ｌｆ ジフテリアトキソイド ５Ｌｆ 破傷風トキソイド １．５ｍｇ リン酸アルミニウム ０．６％ ２−フェノキシエタノール（保存剤） 他のBordetella免疫原、百日咳毒（例えば、本発明の譲受人に譲渡され引用に よって本明細書に含まれるクラインら（Klein et al.）の米国特許５０８５８６ ２号に記載のような、それの遺伝的に解毒された類縁体を含む）、ＦＨＡおよび ６９ｋＤａ蛋白は、以下に記載のような各種方法によって製造することができる 。 ＰＴの精製 ＰＴは、従来の方法を用いて、B.pertussis菌株の培養上清から単離すること ができる。例えば、セクラ（Sekura）らの方法（参考文献５５）を用いることが できる。ＰＴの単離は、最初に培養上清を色素リガンドゲル充填剤（Affi-Gel B lue；Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA）を充填したカラムに吸収させるこ とで行う。このカラムから、０．７５Ｍ塩化マグネシウムなどの高濃度の塩によ ってＰＴを溶離させ、塩を除去した後に、臭化シアンで活性化したセファロース にフェチュインを結合させた構成のフェチュイン−セファロースアフィニティ充 填剤のカラムに通す。ＰＴは、４Ｍマグネシウム塩を用いて、フェチュインカラ ムから溶離させる。 別法として、アイロンズら（Irons et al、参考文献５６）の方法を用いるこ とができる。培養上清を、予めヘパトグロビンが共有結合的に結合したＣＮＢｒ 活性化セファロース４Ｂカラムに吸収させる。ＰＴをｐＨ６．５で吸収剤に結合 させ、段階的にｐＨを１０まで変化させながら、０．１Ｍトリス／０．５Ｍ Ｎ ａＣｌ緩衝液を用いて、カラムから溶離させる。 別法として、１９８７年１１月１０日にスコット（Scott）らに与えられ、引 用によって本明細書に含まれる米国特許４７０５６８６号に記載の方法を用いる ことができる。この方法では、B.pertussisの培養上清もしくは細胞抽出物を、 内毒素は吸着するがBordetella抗原は通過させるかあるいは内毒素から分離させ るだけの能力を有するアニオン系イオン交換樹脂のカラムに通す。 別法としてＰＴは、本願の譲受人に譲渡され、引用によって本明細書に含まれ る欧州特許３３６７３６号に記載のような、パーライトクロマトグラフィーを用 いて精製することができる。 ＰＴの解毒 ＰＴを解毒して、最終ワクチンの副作用を起こし得る望ましくない活性を除去 する。各種の従来の化学的解毒法を使用することができ、それにはホルムアルデ ヒド、過酸化水素、テトラニトロメタンまたはグルタルアルデヒドによる処理な どがある。 例えば、ムノズ（Munoz）らの報告（参考文献５７）に記載の手順の変法を用 いて、グルタルアルデヒドによってＰＴを解毒することができる。この解毒方法 では、精製ＰＴを、０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水を含む溶液中でインキュベ ーションする。溶液をグルタルアルデヒド０．０５％とし、混合物を室温で２時 間インキュベーションし、Ｌ−リジンで０．０２Ｍとする。混合物をさらに室温 で２時間インキュベーションし、０．０１Ｍ ＰＢＳに対して２日間透析する。 特定の実施態様では、欧州特許３３６７３６号の解毒方法を用いることができる 。すなわち、ＰＴを以下のようにしてグルタルアルデヒドで解毒することができ る。 ０．２２Ｍで塩化ナトリウムを含む精製ＰＴの７５ｍＭリン酸カリウム溶 液（ｐＨ８．０）を等量のグリセリンで希釈して、蛋白濃度を約５０〜４００μ ｇ／ｍＬとする。溶液を加熱して３７℃とし、グルタルアルデヒドを最終濃度０ ．５％（容量基準）となるように加えて解毒を行う。混合物を３７℃で４時間経 過させ、アスパラギン酸（１．５Ｍ）を加えて、最終濃度０．２５Ｍとする。混 合物を室温で１時間インキュベーションし、０．１５Ｍで塩化ナトリウムと５％ でグリセリンを含むｐＨ８．０の１０ｍＭリン酸カリウム１０倍容量でダイアフ ィルトレーションを行って、グリセリン量を低下させ、グルタルアルデヒドを除 去する。０．２μＭ膜を通して、ＰＴトキソイドを無菌濾過する。 組換え法を用いてトキソイド化分子として使用するのに無毒かまたはほとんど 毒性を示さないＰＴ突然変異体分子を製造する場合、化学的解毒は必要ない。 ＦＨＡの精製 ＦＨＡの精製は、コーウェル（Cowell）らの報告（参考文献５８）に記載の方 法にほぼ従って、培養上清から精製することができる。メチル化β−シクロデキ ストリンなどの成長促進剤を用いて、培養上清中のＦＨＡの収量を上昇させるこ とができる。その培養上清を、ヒドロキシルアパタイトカラムに投入する。ＦＨ Ａはカラムに吸着されるが、ＰＴは吸着されない。カラムをトリトンＸ−１００ でかなり洗浄して内毒素を除去する。次に、０．５ＭでＮａＣｌを含む０．１Ｍ リン酸ナトリウム溶液を用いてＦＨＡを溶離し、必要に応じてフェチュイン−セ ファロースカラムに通して、残っているＰＴを除去する。セファロースＣＬ−６ Ｂカラムを通して、さらに精製を行うことができる。 別法として、ＦＨＡの精製を、その抗原に対するモノクローナル抗体を用いて 行うことができ、その場合、抗体をＣＮＢｒ活性化アフィニティカラムに付着さ せておく（参考文献５９）。 別法として、ＦＨＡの精製を、上記の欧州特許３３６７３６号に記載の方法に 従ってパーライトクロマトグラフィーによって行うことができる。 ６９ｋＤａ外膜蛋白（ペルタクチン）の精製 最初に、引用によって本明細書に含まれる公開欧州特許出願４８４６２１号に 記載された方法に従って、チメロサールなどの静菌剤を用いて細胞を不活化する ことで、細菌細胞から６９ｋＤａ外膜蛋白（６９Ｋまたはペルタクチン）を回収 することができる。その不活化細胞を、ＰＢＳ（ｐＨ７〜８）などの水系媒体中 に懸濁させ、高温（４５〜６０℃）で繰り返し抽出し、その後室温もしくは４℃ まで冷却する。抽出によって、細胞から６９Ｋ蛋白が放出される。６９Ｋ蛋白含 有物を沈殿によって回収し、アフィゲルブルー（Affi-gel Blue）カラムに通す 。６９Ｋ蛋白を、０．５Ｍ塩化マグネシウムなどの高濃度の塩で溶離させる。透 析後、それをクロマトフォーカシング担体に通す。 別法として、本願の譲受人の名称で出願され、引用によって本明細書に含まれ る公開ＰＣＴ出願ＷＯ９１／１５５０５号に記載の方法に従って、B.pertussis 培地の培養上清から、６９ｋＤａ蛋白を精製することができる。 B.pertussisからの６９ｋＤａ外膜蛋白の他の適切な精製方法は、ゴット（Got to）らに１９８４年１月４日に与えられた米国特許５２７６１４２号およびバー ンズ（Burns）らに１９９２年３月３１日に与えられた米国特許５１０１０１４ 号に記載されている。 本明細書に記載のような多くの治験がヒトにおいて行われて、百日咳に対する 保護向けに、本発明の方法に従って製造される線毛性凝集原を含む成分ワクチン の安全性、非反応原性および有用性が確認されている。特に、ワクチンに含まれ る各抗原に対する免疫応答（例えば、後述の表３に示したもの）が得られている 。ある特定の非細胞性百日咳ワクチンＣＰ１０／５／５／３ＤＴについて、危険 性のあるヒト群における大規模なプラシーボ対照多施設二重無作為化治験で解析 が行われ、代表的な百日咳に対するそのワクチンの効力が推算されている。 代表的百日咳疾患患者は以下のように定義された。 ２１日以上の痙攣性の咳 および 培養で確認されたB.pertussis または 対合血清でのＦＨＡもしくはＰＴに対するＥＬＩＳＡにおける１００％のＩｇ ＧもしくはＩｇＡ抗体上昇によって示されるBordetella特異的感染の血清学的証 拠 あるいは 血清学的データがない場合、治験参加小児における咳発症の前後２８日以内に 咳を発症したその家庭内の培養で確認されたB.pertussis患者とその治験参加小 児との間に接触があったこと この治験の結果から、ＣＰ１０／５／５／３ＤＴが上記のような代表的百日咳 疾患についての患者定義で定義されたような百日咳の予防に約８５％の効力を持 つことが明らかになった。同じ治験で、ＰＴおよびＦＨＡのみを含む２成分系百 日咳非細胞性ワクチンは約５８％の効力であり、全細胞百日咳ワクチンは約４８ ％の効力であった（後述の表４参照）。さらに、ＣＰ１０／５／５／３ＤＴワク チンは、１日以上の期間の咳として定義される軽度の百日咳を、約７７％の効力 で予防した。特に、得られた免疫応答特性は、百日咳に対して非常に有効である と報告されている全細胞百日咳ワクチンによる免疫感作後に得られたものと実質 的に同等であった。 ワクチン製造および使用 そこで、ワクチンとしての使用に好適な免疫原性組成物を、本願に開示の方法 に従ってBordetella免疫原から製造することができる。このワクチンは、オプソ ニン作用性または殺細菌性となり得る抗体を産生する患者において免疫応答を誘 発する。予防接種患者をB.pertussisが攻撃したとしても、そのような抗体が細 菌に結合し、不活化する。さらに、オプソニン作用性または殺細菌性の抗体は、 別の機序によって保護を与える可能性もある。 ワクチンなどの免疫原性組成物は、液剤や乳剤などの注射剤として製剤するこ とができる。Bordetella免疫原は、その免疫原と適合性である医薬的に許容され る賦形剤と混合することができる。そのような賦形剤としては、水、生理食塩水 、ブドウ糖、グリセリン、エタノールおよびそれらの組み合わせたものなどがあ り得る。免疫原性組成物およびワクチンは、湿展剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤 またはアジュバントなどの補助物質をさらに含有して、その有効性を高めること ができる。免疫原性組成物およびワクチンは、皮下注射もしくは筋肉注射によっ て、非経口的に投与することができる。免疫原性製剤およびワクチンは、その製 剤に適合する方法にて、治療上有効で、免疫原性があり、保護効果のあるような 量で投与される。投与量は、治療を受ける患者によって決まるものであり、例え ば、抗体を合成し、必要に応じて細胞介在性免疫応答を生じるその個人における 免疫系の能力によって決まる。投与に必要な有効成分の正確な量は、医師の判断 によって決まる。しかしながら、好適な用量範囲は、当業者であれば容易に決定 し得るものであり、免疫原をμｇ単位とすることになると考えられる。初期投与 および追加免疫投与における好適な投与法も変動し得るものであるが、初期投与 とそれに続く投与を行うものと考えられる。用量は投与経路によっても決まるも のであり、宿主の大きさに応じて変動する。 本発明による免疫原性組成物中の免疫原の濃度は通常、約１〜約９５％である 。１個の病原体のみの抗原材料を含むワクチンは単価ワクチンである。数種類の 病原体の抗原材料を含むワクチンは、混合ワクチンであって、これも本発明に含 まれる。そのような混合ワクチンは、例えば各種病原体からまたは同一病原体の 各種菌株から、あるいは各種病原体の組み合わせからの材料を含むものである。 抗原をアジュバントと同時に（アジュバントは通常、リン酸緩衝生理食塩水の ０．００５〜０．５％溶液として使用）抗原を投与すると、免疫原性を大幅に上 昇させることができる。アジュバントは、抗原の免疫原性を高めるが、必ずしも それ自体が免疫原性とは限らない。アジュバントは、抗原を投与部位付近に局所 的に保持することで、免疫系の細胞への抗原の緩やかな徐放を促進する貯蔵効果 を生じることで作用し得るものである。アジュバントはさらに、免疫系の細胞を 抗原貯蔵部まで引き寄せ、そのような細胞を刺激して免疫応答を誘発することが できる。 免疫刺激剤またはアジュバントは、例えばワクチンに対する宿主の免疫応答を 改善するために、長年にわたって使用されている。リポ多糖類などの内在性アジ ュバントは通常、ワクチンとして使用される死菌または弱毒化細菌の成分である 。外因性アジュバントは、代表的には共有結合的に抗原に結合する免疫調節剤で あり、宿主の免疫応答を促進するよう製剤されている。そうして、非経口的に搬 送される抗原に対する免疫応答を促進するアジュバントが確認されている。しか しながら、そのようなアジュバントの一部は有毒であり、望ましくない副作用を 起こし得るものであることから、ヒトや多くの動物で使用するには不適なものと なっている。実際、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム（総称して通 常は、ミョウバンと称される）のみがヒトワクチンおよび動物ワクチンにおける アジュバントとして常用される。ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイド に対する抗体応答上昇におけるミョウバンの効力は明らかになっており、より最 近では、ＨＢｓＡｇワクチンにミョウバンがアジュバントとして使用されている 。ミョウバンの有用性は一部の利用分野で明らかになっているが、それには制限 がある。例えば、ミョウバンはインフルエンザ予防接種には無効であり、必ずし も細胞介在性免疫応答を誘発するとは限らない。ミョウバンをアジュバントとす る抗原によって誘発される抗体は、マウスにおいては主としてＩｇＧ１アイソタ イプであり、一部のワクチン剤による保護には最適ではない可能性がある。 広範囲の外因性アジュバントが抗原に対して強力な免疫応答を起こし得る。そ れには、膜蛋白抗原と錯形成したサポニン（免疫刺激錯体）、鉱油とのプルロニ ック（pluronic）ポリマー、鉱油中の死ミコバクテリウム、完全フロイントアジ ュバント、ムラミールジペプチド（ＭＤＰ）およびリポ多糖類（ＬＰＳ）などの 細菌産生物、ならびにリピドＡおよびリポソームなどがある。 体液性免疫応答（ＨＩＲ）および細胞介在性免疫（ＣＭＩ）を効果的に誘発す るためには、多くの場合、免疫原をアジュバント中で乳化させる。多くのアジュ バントが有毒であり、症状としては、肉芽腫、急性および慢性の炎症（完全フロ イントアジュバント、ＦＣＡ）、細胞崩壊（サポニンおよびプルロニックポリマ ー）および発熱性、関節炎および前部ブドウ膜炎（ＬＰＳおよびＭＤＰ）などが ある。ＦＣＡは優れたアジュバントであり、研究で広範囲に使用されているが、 その毒性のために、ヒトワクチンや動物ワクチンでの使用には許可されていない 。 理想的なアジュバントの望ましい特性には次のものがある。 （１）毒性がないこと （２）長期間の免疫応答を刺激する能力 （３）製造が簡単で、長期保存において安定であること （４）各種経路で投与される抗原に対してＣＭＩとＨＩＲの両方を誘発できる こと （５）他のアジュバントとの相乗作用 （６）抗原提供細胞（ＡＰＣ）の群との選択的相互作用を行う能力 （７）適切なＴ_N２またはＴ_N１細胞特異的免疫応答を特異的に誘発する能力 （８）抗原に対して適切な抗体アイソタイプ濃度（例：ＩｇＡ）を選択的に上 昇させる能力 ロックホッフ（Lockhoff）らに対して１９８９年８月８日に与えられた米国特 許４８５５２８３号（引用によって本明細書に含まれる）には、Ｎ−グリシルア ミド、Ｎ−グリコシル尿素およびＮ−グリコシルカーバメート（これらはそれぞ れ、免疫調節剤またはアジュバントとしてのアミノ酸によって糖残基が置換され ている）などの糖脂質類縁体が開示されている。そこで、ロックホッフらは（米 国特許４８５５２８３号および参考文献６０）、糖スフィンゴ脂質およびグリセ ロ糖脂質などの天然糖脂質と構造的に類似しているＮ−糖脂質類縁体が単純疱疹 ウィルスワクチンおよび偽性狂犬病ウィルスワクチンの両方において強力な免疫 応答を誘発できることを報告している。糖脂質の中には、アノマー炭素原子を介 して糖と直接結合する長鎖のアルキルアミンおよび脂肪酸から合成されて、天然 脂質残基の機能を模倣するものもある。 モロニー（Moloney）に対して与えられ、本願の譲受人に対して譲渡され、引 用によって本明細書に含まれる米国特許４２５８０２９号には、オクタデシルチ ロシン塩酸塩（ＯＴＨ）が、破傷風トキソイドならびにホリマリンで不活化した Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型小児麻痺ウィルスワクチンと錯形成した場合に、ア ジュバントとして機能することが開示されている。さらに、ニクソン−ジョージ ら（Nixon-George et al、参考文献６１）は、組換えＢ型肝炎表面抗原と錯形成 した芳香族アミノ酸のオクタデシルエステルがＢ型肝炎ウィルスに対する宿主の 免疫応答を促進したと報告している。実施例 上記の開示内容は、本発明の全般を説明するものであるので、以下の具体的な 実施例を参照することで、より完全な理解を得ることができる。これら実施例は 単に説明を目的として記載されているものであって、本発明の範囲を限定するも のではない。状況から見て示唆されるかあるいは好都合なものとなる可能性があ る場合、等価なものの形態および置換に対して変更を加えることは想到されるも のである。本明細書においては具体的な用語を用いているが、そのような用語は 説明のためのものであって、本発明を限定するものではない。 本開示およびこれらの実施例において使用されているが明瞭には説明されてい ない蛋白生化学、発酵および免疫学の方法は、科学文献に広く報告されているも のであり、十分に当業者の能力の範囲内のものである。実施例１ 本実施例は、Boredetella pertussisの成長について説明するものである。 原シード Bordetella pertussis菌株の原シード培地を、凍結乾燥シードロットとして、 ２℃〜８℃で保存した。 作業シード 凍結乾燥培地をホルニブロック（Hornibrook）培地に回収し、それを用いてボ ルデー-ジャングー寒天（ＢＧＡ）平板に接種した。ホルニブロック培地は以下 の組成である。 成分 １リットル当たり量 カゼイン加水分解物（活性炭処理） 10.0g ニコチン酸??? 0.001g 塩化カルシウム 0.002g 塩化ナトリウム 5.0g 塩化マグネシウム・６水和物 0.025g 塩化カリウム 0.200g リン酸２カリウム 0.250g デンプン 1.0g 蒸留水 1.0リットルまで １％炭酸ナトリウム溶 液でｐＨを６．９±０．１に調節する。培地を試験管中に分散させ、オートクレ ーブ中で２０分間水蒸気処理し、１２１℃〜１２４℃で２０分間オートクレーブ 処理することで滅菌する。シードを、最初にＢＧＡ平板で、次に成分百日咳寒天 （ＣＰＡ）で２回継代培養した。成分百日咳寒天（ＣＰＡ）は以下の組成を有す る。 ＮａＣｌ 2.5 g/L ＫＨ２ＰＯ４ 0.5 g/L ＫＣｌ 0.2 g/L ＭｇＣｌ２（Ｈ２Ｏ）６ 0.1 g/L トリス塩基 1.5g /L カザミノ酸 10.0 g/L ＮａＨグルタミン酸 10.0 g/L 濃ＨＣｌ pH 7.2まで 寒天 15.0 g/L 成長因子（ＣＰＧＦ） 10.0 mL/L 成分百日咳成長因子（ＣＰＧＦ）−１００Ｘは以下の組成を有する。 Ｌ−システインＨＣｌ 4.0 g/L ナイアシン 0.4 g/L アスコルビン酸 40.0 g/L 還元グルタチオン 15.0 g/L Ｆｅ２ＳＯ４（Ｈ２Ｏ）７ 1.0 g/L ジメチル-β-シクロデキストリン 100 g/L ＣａＣｌ２（Ｈ２Ｏ）２ 2.0 g/L 最終培地を百日咳シード懸濁緩衝液（ＣＰＳＢ）に懸濁し、２〜４ｍＬに小分 けし、−６０℃〜−８５℃で冷凍保存した。百日咳シード懸濁緩衝液（ＰＳＳＢ ）は以下の組成を有する。 カザミノ酸 10.0 g/L トリス塩基 1.5g /L 無水グリセリン 100 mL/L 濃ＨＣｌ pH 7.2まで これらのグリセリン懸濁液を、作業シード取得の原料として用いた。 培養方法 作業シードの増殖を、成分百日咳寒天ルー瓶中、３４℃〜３８℃で４〜７日間 行った。その培養後、細胞を、成分百日咳肉汁（ＣＰＢ）によって寒天から洗い 出した。サンプルについて、グラム染色により、培地の純度および不透明度を観 察した。 ＣＰＢを含む４リットル三角フラスコに細胞を移し、振盪しながら、３４℃〜 ３８℃で２０〜２６時間インキュベーションした。サンプルをグラム染色で観察 し、培地の純度を調べた。フラスコの内容物を合わせ、その懸濁液を用いて、Ｃ ＰＢを含む２個の発酵槽に接種した（容量１０リットルで、初期ＯＤ６００は０ ．１〜０．４）。シードは成長して、採取０Ｄ６００は５．０〜１０．０となっ た。サンプルについて、グラム染色によって培地の純度と、抗原特異的ＥＬＩＳ Ａによって無菌性を調べた。実施例２ この実施例では、Bordetella pertussis細胞培地からの抗原の精製について説 明する。 肉汁および細胞濃縮物の製造 細菌懸濁液を、２個の生産発酵槽で、３４℃〜３７℃で３５〜５０時間成長さ せた。発酵槽のサンプリングを行って、培地滅菌性試験を行った。この懸濁液を 連続流円板積層型遠心機（１２０００×ｇ）に送って、肉汁から細胞を分離した 。細胞を回収して、線毛成分の抽出用に待機した。透明液体を≦０．２２μｍ膜 フィルターに通した。濾過した液体を、１０〜３０ｋＤａを公称分子量限界（Ｎ ＭＷＬ）とする膜を用いる限外濾過によって濃縮した。濃縮液を保存して、百日 咳毒（ＰＴ）、線維状ヘマグルトニン（ＦＨＡ）および６９ｋＤａ（ペルタクチ ン）成分の分離・精製用に待機した。 肉汁成分の分離 上述の欧州特許３３６７３６号および出願人の公開ＰＣＴ出願ＷＯ ９１／１ ５５０５号に記載の方法にほぼ従って、肉汁成分（６９ｋＤａ，ＰＴおよびＦＨ Ａ）を、パーライトクロマトグラフィーおよび選択的溶離の段階によって分離・ 精製した。行った具体的精製操作について以下に説明する。 百日咳毒（ＰＴ） パーライトカラムを、５０ｍＭトリス緩衝液、５０ｍＭトリス／０．５％トリ トンＸ−１００緩衝液および５０ｍＭトリス緩衝液で洗浄した。５０ｍＭトリス ／０．１２Ｍ ＮａＣｌ緩衝液を用いて、パーライトカラムからＰＴの分画を溶 離させた。 パーライトクロマトグラフィーからのＰＴ分画をヒドロキシルアパタイトカラ ムに負荷し、３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液で洗浄した。ＰＴを７５ｍＭリン酸 カリウム／２２５ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液で溶離した。カラムを２００ｍＭリン酸 カリウム／０．６Ｍ ＮａＣｌで洗浄して、ＦＨＡ分画を得て、それを廃棄した 。精製ＰＴにグリセリンを５０％まで加え、混合物を２℃〜８℃で保存し、１週 間以内に解毒を行った。 線維状ヘマグルトニン（ＦＨＡ） ＦＨＡ分画を５０ｍＭトリス／０．６Ｍ ＮａＣｌでパーライトカラムから溶 離した。線維状ヘマグルチニンをヒドロキシルアパタイトでのクロマトグラフィ ーによって精製した。パーライトカラムからのＦＨＡ分画をヒドロキシルアパタ イトカラムに負荷し、０．５％トリトンＸ−１００を含む３０ｍＭリン酸カリウ ムと次に３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液で洗浄した。ＰＴ分画を８５ｍＭリン酸 カリウム緩衝液で溶離し、廃棄した。次に、２００ｍＭリン酸カリウム／０．６ Ｍ ＮａＣｌによってＦＨＡ分画を溶離し、２℃〜８℃で保存し、１週間以内に 解毒した。 ６９ｋＤａ（ペルタクチン） 肉汁濃縮液を注射用水（ＷＦＩ）で希釈して、導電率を３〜４ｍＳ／ｃｍとし 、パーライトカラムに、パーライト１ｍＬ当たり蛋白０．５〜３．５ｍｇの負荷 量で負荷した。溶出液（６９ｋＤａ成分分画）を、１０〜３９ｋＤａ ＮＭＷＬ 膜を用いる限外濾過によって濃縮した。濃縮溶出液に硫酸アンモニウムを３５± ３％（重量／容量）まで加え、得られた混合物を２℃〜８℃で４±２日間保存す るか、直ちに遠心した（７０００×ｇ）。過剰の上清を傾斜法にて除去し、沈殿 物を遠心（７０００×ｇ）によって回収した。得られた６９ｋＤａペレットを− ２０℃〜−３０℃で冷凍保存するか、あるいはトリスもしくはリン酸緩衝液に溶 かして、直ちに使用した。 濃縮パーライト溶出液の３５％（重量／容量）硫酸アンモニウムによる沈殿形 成によって得られた６９ｋＤａ外膜蛋白を用いて精製を行った。硫酸アンモニウ ム（１リットル当たり１００±５ｇ）を６９ｋＤａ分画に加え、混合物を２℃〜 ８℃で２時間以上撹拌した。混合物を遠心して（７０００×ｇ）、上清を回収し た。上清に硫酸アンモニウム（１リットル当たり１００〜１５０ｇ）を加え、混 合物を２℃〜８℃で２時間以上撹拌した。混合物を遠心して（７０００×ｇ）、 ペレットを回収し、それを１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）に溶かした。溶液の イオン強度を、１５ｍＭ硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８ ）と同等に調節した。 ６９ｋＤａ蛋白を、Ｑ−セファロースカラムと直列に連結したヒドロキシルア パタイトカラムに負荷した。６９ｋＤａ蛋白を溶出液に回収し、１５ｍＭ硫酸ア ンモニウムを含む１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）でカラムから洗い出し、溶出 液中の６９ｋＤａと一緒に蓄積した。６９ｋＤａ蛋白蓄積液を、１００〜３００ ｋＤａ ＮＭＷＬ膜で、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む６〜１０倍容量の１０ｍＭリ ン酸カリウム（ｐＨ８）でダイアフィルトレーションした。限外濾過液を回収し 、限外濾過液中の６９ｋＤａ蛋白を濃縮した。 ６９ｋＤａ蛋白について、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）による溶媒交換を 行い、Ｑ−セファロースに吸着させ、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）／５ｍＭ 硫酸アンモニウムで洗浄した。６９ｋＤａ蛋白を、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐ Ｈ８）で溶離した。６９ｋＤａ蛋白を、１０〜３０ｋＤａ ＮＭＷＬ膜で、０． １５Ｍ ＮａＣｌを含む６〜１０倍容量の１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８）で ダイアフィルトレーションした。６９ｋＤａ蛋白を、≦０．２２μｍフィルター で無菌濾過した。この無菌バルクを２℃〜８℃で保存し、３ケ月以内に吸着を行 った。 線毛性凝集原 肉汁からの分離後の細胞ペーストから、凝集原を精製した。細胞ペーストを、 １０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび４Ｍ尿素を含む緩衝液中 で細胞が０．０５容量部となるまで希釈し、３０分間混和した。細胞溶解物を遠 心（１２０００×ｇ）によって透明とし、１００〜３００ｋＤａ ＮＭＷＬ膜フ ィルターを用い、１０ｍＭリン酸カリウム／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／０．１トリ トンＸ−１００に対して濃縮・ダイアフィルトレーションを行った。 濃縮液を８０℃で３０分間加熱処理し、遠心（９０００×ｇ）によって再度透 明とした。透明上清に、最終濃度が４．５％±０．２％となるようにＰＥＧ８０ ００を加え、３０分間以上ゆっくり撹拌した。得られた沈殿を遠心（１７０００ ×ｇ）によって回収し、ペレットを１０ｍＭリン酸カリウム／１５０ｍＭ Ｎａ Ｃｌ緩衝液で抽出して、粗線毛性凝集原溶液を得た。線毛性凝集原をＰＥＩシリ カに通して精製した。粗溶液を、１Ｍリン酸カリウム緩衝液を用いてリン酸カリ ウムに関して１００ｍＭとし、ＰＥＩシリカカラムに通した。 カラムからの溶出液を、１００〜３００ｋＤａ ＮＭＷＬ膜フィルターを用い １０ｍＭリン酸カリウム／１５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液に対して濃縮・ダイアフ ィルトレーションした。この無菌バルクを２℃〜８℃で保存し、３ケ月以内に吸 着を行った。線毛性凝集原製剤は、線毛性Ａｇｇ２および線毛性Ａｇｇ３を重量 比約１．５〜約２：１で含有し、実質的にＡｇｇ１を含まないことが認められた 。実施例３ 本実施例は、精製Bordetella pertussis抗原、ＰＴおよびＦＨＡのトキソイド 化について説明するものである。 実施例２に記載の方法に従って純粋な形で得られたＰＴについて、ＰＴ溶液中 のグルタルアルデヒド濃度を０．５％±０．１％に調節し、３７℃±３℃で４時 間撹拌することでトキソイド化した。Ｌ−アスパラギン酸塩を０．２１±０．０ ２Ｍまで加えることで、反応を停止した。混合物をさらに１±０．１時間にわた り室温に維持し、次に２℃〜８℃に１〜７日保持した。 得られた混合物を、３０ｋＤａ ＮＭＷＬ膜フィルターで、１０ｍＭリン酸カ リウム／０．１５Ｍ ＮａＣｌ／５％グリセリン緩衝液に対してダイアフィルト レーションし、次に≦０．２２μｍ膜フィルターに通すことで滅菌した。この滅 菌バルクを２℃〜８℃で保存し、３ケ月以内に吸着を実施した。 実施例２に記載の方法に従って純粋な形で得られたＦＨＡ分画については、Ｌ −リジンとホルムアルデヒド濃度をそれぞれ４７±５ｍＭおよび０．２４±０． ０５％に調節し、３５℃〜３８℃で６週間インキュベーションすることでトキソ イド化した。次に、混合物を、３０ｋＤａ ＮＭＷＬ膜フィルターで、１０ｍＭ リン酸カリウム／０．５Ｍ ＮａＣｌに対してダイアフィルトレーションし、次 に膜フィルターに通すことで滅菌した。この滅菌バルクを２℃〜８℃で保存し、 ３ケ月以内に吸着を実施した。実施例４ 本実施例は精製Bordetella pertussis抗原の吸着について説明するものである 。 ＰＴ、ＦＨＡ、Ａｇｇおよび６９ｋＤａのそれぞれのリン酸アルミニウム（ミ ョウバン）への吸着用に、リン酸アルミニウムのストック液の濃度を１８．７５ ±１ｍｇ／ｍＬとした。好適な容器を準備し、いずれかの抗原を無菌的に容器中 に懸濁させた。２−フェノキシエタノールを無菌的に加えて、最終濃度０．６％ ±０．１％（容量基準）とし、均一になるまで撹拌した。適切な量のリン酸アル ミニウムを容器に無菌的に加えた。適切な容量の無菌蒸留水を加えて、リン酸ア ルミニウムの最終濃度を３ｍｇ／ｍＬとした。容器を密閉し、ラベルを施し、室 温で４日間撹拌した。それから容器を保管して、最終製剤用に待機した。実施例５ 本実施例は、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドを併用した成分百 日咳ワクチンの製剤について説明するものである。 これ以前の実施例に記載の方法に従って得たB.pertussis抗原を、ジフテリア トキソイドおよび破傷風トキソイドとともに製剤して、いくつかの成分百日咳（ ＣＰ）ワクチンを得た。 百日咳成分は、上記の実施例１〜４に詳細に記載した方法に従って深部培養で 成長させたBordetella pertussisから得た。成長終了後、培養肉汁と細菌細胞を 遠心によって分離した。各抗原をそれぞれ精製した。百日咳毒（ＰＴ）および線 維状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）を、パーライトおよびヒドロキシルアパタイトで の連続クロマトグラフィーによって肉汁から精製した。ＰＴは、グルタルアルデ ヒドによって解毒し、ＦＨＡ分画中に存在する残留ＰＴ（約１％）はホルムアル デヒドによって解毒した。線毛性凝集原（２＋３）（ＡＧＧ）は、細菌細胞から 得た。細胞を尿素で破壊して加熱処理し、線毛性凝集原をポリエチレングリコー ルによる沈殿形成およびポリエチレンイミンシリカでのクロマトグラフィーによ って精製した。６９ｋＤａ蛋白（ペルタクチン）成分を、パーライトクロマトグ ラフィー段階（実施例２）からの溶出液から硫酸アンモニウム沈殿形成によって 単離し、ヒドロキシルアパタイトおよびＱ−セファロースでの連続クロマトグラ フィーによって精製した。全ての成分を、０．２２μｍ膜フィルターによる濾過 によって滅菌した。 ジフテリアトキソイドは、標準法によって深部培養で成長させたCorynebacter ium diphtheriae から得た。ジフテリアトキソイドの製造は５段階に分けること ができる。すなわち、作業用シードの維持、Corynebacterium diphtheriaeの成 長、ジフテリア毒の回収、ジフテリア毒の解毒およびジフテリアトキソイドの濃 縮である。ジフテリアトキソイドの製造 （Ｉ）作業用シード Corynebacterium diphtheriaeを凍結乾燥シードロットとして維持した。再生 シードを35℃±２℃で１８〜２４時間にわたり、レフラースロープ（Loeffler s lope）で成長させ、ジフテリア培地のフラスコに移した。次に、培地について純 度とＬｆ含有量を調べた。残りのシードを用いて、発酵槽に接種した。 （ＩＩ）Corynebacterium diphtheriaeの成長 培地を、発酵槽中で３５℃±２℃でインキュベーション・撹拌した。培地に、 所定量の硫酸第一鉄、塩化カルシウムおよびリン酸溶液を加えた。各溶液（リン 酸塩、硫酸第一鉄、塩化カルシウム）の実際の量は、各培地ロットについて実験 的に求めた。選択した濃度は、Ｌｆ含有量が最大となったものである。成長周期 （３０〜５０時間）終了後、培地についてサンプリングを行って、純度およびＬ ｆ含有量を調べた。 重炭酸ナトリウムによってｐＨを調節し、温度を３５℃±２℃に維持しながら ０．４％トルエンで１時間処理することで培地を不活化した。次に、無菌性試験 を行って、生存C.diphtheriaeが存在しないことを確認した。 （ＩＩＩ）ジフテリア毒の回収 １個または数個の発酵槽からのトルエン処理した培地を大きい槽に蓄積した。 約０．１２％重炭酸ナトリウム、０．２５％活性炭および２３％硫酸アンモニウ ムを加え、ｐＨを調べた。 混合物を約３０分間撹拌した。珪藻土を加え、混合物をデプスフィルターにポ ンプで送った。濾液を透明になるまで循環させ、回収し、サンプリングによって Ｌｆ含有量を調べた。追加の硫酸アンモニウムを濾液に加えて、濃度を４０％と した。さらに珪藻土も加えた。この混合物を２℃〜８℃で３〜４日間維持して、 沈殿を形成させた。沈殿した毒素を回収し、０．９％生理食塩水に溶かした。珪 藻土を濾過によって除去し、毒素を０．９％生理食塩水に対して透析して、硫酸 アルミニウムを除去した。透析した毒素を蓄積し、サンプリングを行ってＬｆ含 有量および純度を調べた。 （ＩＶ）ジフテリア毒の解毒 解毒は透析直後に行う。解毒を行うには、毒素を希釈して、最終溶液に以下の ものが含有されるようにする。 ａ）ジフテリア毒１０００±１０％Ｌｆ／ｍＬ ｂ）０．５％重炭酸ナトリウム ｃ）０．５％ホルマリン ｄ）０．９％（重量／容量）Ｌ−リジン・モノ塩酸塩 この溶液を生理食塩水で規定量とし、ｐＨを７．６±０．１に調節した。 セルロース珪藻土フィルターパッドおよび／または膜前置フィルターおよび０ ．２μｍ膜フィルターでトキソイドを濾過して回収容器に取り、３４℃で５〜７ 週間インキュベーションした。サンプリングを行って、毒性を調べた。 （Ｖ）精製トキソイドの濃縮 トキソイドを蓄積し、限外濾過によって濃縮し、好適な容器に回収した。サン プリングを行って、Ｌｆ含有量および純度を調べた。保存剤（２−フェノキシエ タノール）を加えて、最終濃度０．３７５％とし、ｐＨを６．６〜７．６に調節 した。 トキソイドを前置フィルターおよび０．２μｍ膜フィルター（または相当品） によって濾過することで滅菌し、回収した。無菌トキソイドをサンプリングして 、トキソイドＬｆ含有量、保存剤含有量、純度（窒素含有量）、無菌性および毒 性の不可逆性を調べた。無菌濃縮トキソイドを２℃〜８℃で保存して、最終製剤 に備えた。 破傷風トキソイドの製造 破傷風トキソイド（Ｔ）は、深部培養で成長させたClostridium tetaniから得 た。 破傷風トキソイドの製造は、５段階に分けることができる。すなわち、作業用 シードの維持、Clostridium tetaniの成長、破傷風毒の回収、破傷風毒の解毒お よび破傷風トキソイドの精製である。 （Ｉ）作業用シード 破傷風トキソイドへの変換向けの破傷風毒素の生産に使用したClostridium te tani の菌株を、シードロットで凍結乾燥品として維持した。シードをチオグリコ レート培地に接種し、３５℃±２℃で２４時間成長させた。サンプリングを行っ て、培地の純度を調べた。 （ＩＩ）Clostridium tetaniの成長 破傷風培地を発酵槽中に分散させ、熱処理し、冷却した。次に、発酵槽に接種 を行い、培地を３４℃±２℃で４〜９日間成長させた。サンプリングを行って、 培地の純度およびＬｆ含有量を調べた。 （ＩＩＩ）破傷風毒の回収 セルロース珪藻土パッドによる濾過によって、毒素を分離し、透明毒素を膜フ ィルターを用いて濾過滅菌した。サンプリングを行って、Ｌｆ含有量と滅菌性を 調べた。毒素を、３００００ダルトンの孔径を用いて限外濾過で濃縮した。 （ＩＶ）破傷風毒の解毒 毒素をサンプリングして、Ｌｆ含有量を調べてから解毒を行った。０．５％（ 重量／容量）重炭酸ナトリウム、０．３％（容量基準）ホルマリンおよび０．９ ％（重量／容量）Ｌ−リジン・モノ塩酸塩を加えて、濃縮毒素（４７５〜５２５ Ｌｆ／ｍＬ）を解毒し、生理食塩水で規定量とした。ｐＨを７．５±０．１に調 節し、混合物を３７℃で２０〜３０日間インキュベーションした。サンプリング を行って、無菌性と毒性を調べた。 （Ｖ）トキソイドの精製 濃縮トキソイドを、前フィルターと次に０．２μｍ膜フィルターによって滅菌 した。サンプリングを行って、無菌性およびＬｆ含有量を調べた。 硫酸アンモニウムの至適濃度は、トキソイドサンプルから求めた分別「Ｓ」字 曲線に基づいたものである。第１の濃縮液をトキソイドに加えた（１９００〜２ １００Ｌｆ／ｍＬまで希釈）。混合物を２０℃〜２５℃で１時間以上維持し、上 清を回収し、高分子量分画を含む沈殿物は廃棄した。 硫酸アンモニウムの第２の濃縮液を第２の分別用の上清に加えて、低分子量不 純物を除去した。混合物を２０〜２５℃に２時間以上維持し、その後最長で３日 間、２℃〜８℃で保管することができた。純粋トキソイドである沈殿物を遠心お よび濾過によって回収した。 ＰＢＳによるアミコン（Amicon）（または相当品）限外濾過膜を用いたダイア フィルトレーションを行ってトキソイド溶液で硫酸アンモニウムが検出できなく なるようにすることで、精製トキソイドから硫酸アンモニウムを除去した。ｐＨ を６．６〜７．６に調節し、２−フェノキシエタノールを加えて、最終濃度０． ３７５％とした。トキソイドを膜濾過によって滅菌し、サンプリングを行って試 験を行った（トキソイド、Ｌｆ含有量、ｐＨ、保存剤含有量、純度、無菌性およ び毒性の不可逆性）。 ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドを併用した成分百日咳ワクチン の一つの製剤を、ＣＰ１０／５／５／３ＤＴと称した。ＣＰ１０／５／５／３Ｄ Ｔの各０．５ｍＬヒト用量を、ほぼ以下の含有量となるように製剤した。 １０μｇ 百日咳トキソイド（ＰＴ） ５μｇ 線維状ヘマグルトニン（ＦＨＡ） ５μｇ 線毛性凝集原２および３（ＦＩＭＢ） ３μｇ ６９ｋＤａ外膜蛋白 １５Ｌｆ ジフテリアトキソイド ５Ｌｆ 破傷風トキソイド １．５ｍｇ リン酸アルミニウム ０．６％ ２−フェノキシエタノール（保存剤） ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドを併用した成分百日咳ワクチン の別の製剤を、ＣＰ１０／５／５ＤＴと称した。ＣＰ１０／５／５ＤＴの各０． ５ｍＬヒト用量を、ほぼ以下の含有量となるように製剤した。 １０μｇ 百日咳トキソイド（ＰＴ） ５μｇ 線維状ヘマグルトニン（ＦＨＡ） ５μｇ 線毛性凝集原２および３（ＦＩＭＢ） １５Ｌｆ ジフテリアトキソイド ５Ｌｆ 破傷風トキソイド １．５ｍｇ リン酸アルミニウム ０．６％ ２−フェノキシエタノール（保存剤） ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドを併用した成分百日咳ワクチン のさらに別の製剤を、ＣＰ２０／２０／５／３ＤＴと称した。ＣＰ２０／２０／ ５／３ＤＴの各０．５ｍＬヒト用量を、ほぼ以下の含有量となるように製剤した 。 ２０μｇ 百日咳トキソイド（ＰＴ） ２０μｇ 線維状ヘマグルトニン（ＦＨＡ） ５μｇ 線毛性凝集原２および３（ＦＩＭＢ） ３μｇ ６９ｋＤａ外膜蛋白 １５Ｌｆ ジフテリアトキソイド ５Ｌｆ 破傷風トキソイド １．５ｍｇ リン酸アルミニウム ０．６％ ２−フェノキシエタノール（保存剤） ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドを併用した成分百日咳ワクチン のさらに別の製剤を、ＣＰ２０／１０／１０／６ＤＴと称した。ＣＰ２０／１０ ／１０／６ＤＴの各０．５ｍＬヒト用量を、ほぼ以下の含有量となるように製剤 した。 ２０μｇ 百日咳トキソイド（ＰＴ） １０μｇ 線維状ヘマグルトニン（ＦＨＡ） １０μｇ 線毛性凝集原２および３（ＦＩＭＢ） ６μｇ ６９ｋＤａ外膜蛋白（６９ｋＤＡ） １５Ｌｆ ジフテリアトキソイド ５Ｌｆ 破傷風トキソイド １．５ｍｇ リン酸アルミニウム ０．６％ ２−フェノキシエタノール（保存剤）実施例６ 本実施例は、本発明によって製造される成分非細胞性百日咳ワクチンの臨床評 価について説明するものである。 （ａ）成人での試験 成人および１６〜２０ケ月齢の小児における試験から、線毛性凝集原を含む多 成分ワクチンが安全かつ免疫原性であることが示された（表２）。 Ｉ相治験を、５成分百日咳ワクチン（ＣＰ１０／５／５／３ＤＴ）を用いてア ルバータ州カルガリーで１７〜１８月齢の小児で行ったところ、副作用が報告さ れた。３３名の小児にワクチンを投与し、さらに別の３５名に６９ｋＤａ蛋白成 分を含まない同じワクチンを投与した。 局所反応は希であった。主として過敏性である全身性の副作用が治験参加者の 約半数において認められ、それはどのワクチンを投与したかとは無関係であった 。酵素イムノアッセイによる抗ＰＴ、抗ＦＨＡ、抗線毛性凝集原および抗６９ｋ Ｄａ ＩｇＧ抗体ならびにＣＨＯ細胞中和試験での抗ＰＴ抗体において有意な抗 体上昇が測定された。抗６９ｋＤａ抗体の場合を除き、４成分（ＣＰ１０／５／ ５ＤＴ）または５成分（ＣＰ１０／５／５／３ＤＴ）を投与された小児において 、抗体応答における差は検出されなかった。６９ｋＤａ蛋白を含む５成分ワクチ ンの投与を受けた小児は、有意に高い免疫感作後抗６９ｋＤａ抗体レベルを有し ていた。 用量−応答試験がカナダのマニトバ州ウィニペグで４成分ワクチンを用いて行 なわれた。２種類のワクチン製剤、すなわちＣＰ１０／５／５／３ＤＴおよびＣ Ｐ２０／１０／１０／６ＤＴを用いた。全細胞ＤＰＴワクチンも対照として含め た。 この治験は、追加免疫百日咳投与の時点で１７〜１８ケ月齢の幼児９１名にお ける二重盲検試験であった。これらの小児は、ＣＰ１０／５／５／３ＤＴおよび ＣＰ２０／１０／１０／６ＤＴのいずれも良好に耐容した。いずれの成分ワクチ ン投与後においても、局所反応や全身反応を起こした小児の数に差は示されなか った。それとは対照的に、全細胞ワクチン投与を受けた小児では、ＣＰ２０／１ ０／１０／６ＤＴ成分ワクチン投与を受けた小児より局所および全身の反応を起 こした小児数に有意な増加があった。 幼児での治験ＩＩ相 カナダのアルバータ州カルガリーおよびブリティッシュコロンビアで、ＣＰ１ ０／５／５／３ＤＴワクチンを用いた治験が行われた。この治験では、幼児４３ ２名に成分百日咳ワクチンまたは全細胞対照ワクチンＤＰＴを２ケ月齢、４ケ月 齢および６ケ月齢で投与した。これらの小児は、ＣＰ１０／５／５／３ＤＴワク チンを良好に耐容した。局所反応は、各投与後において、全細胞ワクチンより成 分ワクチンによる方が少なかった。 成分百日咳ワクチンによる予防接種後に、全ての抗原に対する有意な抗体応答 が示された。全細胞ワクチンの投与を受けた幼児は、線毛性凝集原ＤおよびＴに 対して激しい抗体応答を示した。数ケ月後、成分ワクチン投与被験者の８２％〜 ８９％および全細胞ワクチン投与被験者の９２％で、線毛性凝集原に対する抗体 力価に４倍以上の上昇があった。それとは対照的に、ＦＨＡに対する抗体応答は 、成分ワクチン投与群で７５％〜７８％であったのに対して、全細胞投与群では ３１％であった。成分ワクチン投与群の９０％〜９３％および全細胞投与群の７ ５％で、抗６９ｋＤａ抗体の４倍上昇が認められた。成分ワクチン投与群の４０ ％〜４９％および全細胞投与群の３２％で、酵素イムノアッセイによるＰＴに対 する抗体に４倍上昇が認められた。成分ワクチン投与群の５５％〜６９％および 全細胞投与群の６％で、ＣＨＯ中和によるＰＴ抗体に４倍上昇が認められた（表 ２）。ＩＩＢ相 ２ケ月齢、４ケ月齢および６ケ月齢の幼児１００名において、ジフテリア含有 量が１５Ｌｆと比較的低い製剤とそれに対して２５Ｌｆの製剤を用いて、Ｄ１５ ＰＴを対照とする無作為盲検試験で、ＣＰ２０／１０／１０／６ＤＴワクチンお よびＣＰ１０／５／５／３ＤＴワクチンの評価を行った。２種類の成分製剤間で 、副作用の率に差は検出されず、いずれも全細胞対照より反応原性が有意に低か った。抗原含有量が高いＣＰ２０／２０／５／３ＤＴワクチンの投与を受けた群 では、酵素イムノアッセイおよびＣＨＯ中和によるＰＴとＦＨＡに対する抗体力 価が相対的に高かった。７ケ月後には、抗ＦＨＡ幾何平均力価はＣＰ２０／２０ ／５／３ＤＴ投与群では９５．０、ＣＰ１０／５／５／３ＤＴ投与群では４５． ２であったのに対して、ＣＰ１５ＤＴ投与群では８．９に過ぎなかった。抗ＰＴ 力価はそれぞれ、イムノアッセイによって１３３．３、５８．４および１０．４ であり、ＣＨＯ中和によって８２．４、３２．７および４．０であった（表２） 。 本治験により、抗原含有量の高い、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソ イドを吸着によって併用した成分百日咳ワクチンが幼児において安全かつ免疫原 性であり、抗原含有量が高いことで、反応原性の上昇を起こさずに、製造された 抗原（ＰＴおよびＦＨＡ）に対する免疫応答が大きくなることが明らかになった 。ＮＩＡＩＤのＩＩ相米国比較試験 非細胞性百日咳ワクチンについての大規模効力試験の予備試験として、国立ア レルギー・感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）による支援下に、米国でＩＩ相治験が行 われた。ジフテリアトキソイドと破傷風トキソイドを吸着させて併用した本発明 の一つの成分百日咳ワクチン（ＣＰ１０／５／５／３ＤＴ）が、他の１２種類の 非細胞性ワクチンおよび２種類の全細胞ワクチンとともにその治験に含まれてい た。安全性の結果が、ＣＰ１０／５／５／３ＤＴ成分ワクチンによって２ケ月齢 、４ケ月齢および６ケ月齢で免疫感作された小児１３７名について報告されてい る。 前述の治験からわかる通り、成分ワクチンは安全であり、低反応原性であり、 しかもワクチンに対する耐容は良好であった。 ７ケ月後において、抗ＰＴ抗体、抗ＦＨＡ抗体、抗６９ｋＤａ抗体および抗線 毛性凝集原抗体はいずれも、全細胞ワクチン投与後に得られたレベル以上であっ た（参考文献７１および表２）。小児を無作為にＣＰ２０／２０／５／３ＤＴま たはＣＰ１０／５／５／３ＤＴワクチン製剤のいずれかの投与に割り付けた二重 盲検試験が行われた。計２０５０名の幼児を米国およびカナダで登録し、幼児１ ９６１名が治験を完了した。いずれのワクチンも、これらの幼児において安全で 、低反応原性であり、免疫原性であった。免疫原性は、２９２名の小群で評価さ れた。両方のワクチン製剤により、ワクチン中に含有される全ての抗原に対して 抗体上昇が誘発された。ＣＰ２０／２０／５／３ＤＴ製剤の方がＦＨＡに対する 抗体力価誘発が大きかったが、ＰＴについてはそうではなかった。ＣＰ１０／５ ／５／３ＤＴ製剤は、線毛に対して相対的に高い力価および相対的に高い凝集原 力価を誘発した。 さらに別の安全性および免疫原性についての試験が、フランスで行われた。試 験計画は、ワクチンの投与を２ケ月齢、３ケ月齢および４ケ月齢で行った以外、 上記の北米での試験と同様であった。局所反応および全身反応は全般に軽度であ った。全体的に、この投与方法を用いたフランスでの治験参加者では、ワクチン の許容度は良好であった。幼児１００００名での、２種類の非細胞性百日咳ワクチンおよび１種類の全細胞 ワクチンについてのプラシーボ対照効力試験 ＮＩＡＩＤ ＩＩ相米国比較試験の結果を受けて、２成分および５成分の非細 胞性ワクチンが、多施設、対照、二重無作為化、プラシーボ対照効力試験向けに 選択された。治験は、百日咳の発生率が高いスウェーデンで行なわれた。２成分 ワクチンには、グリセロアルデヒドおよびホルマリン不活化ＰＴ（２５μｇ）、 ホルマリン処理ＦＨＡ（２５μｇ）およびジフテリアトキソイド１７Ｌｆおよび 破傷風トキソイド１０Ｌｆを含有させた。５成分百日咳ワクチンは、ＣＰ１０／ ５／５／３ＤＴとした。治験に向けて、スウェーデンにおけるこの年齢群の幼児 のほぼ１／２に相当する幼児１００００名を、生誕登録を利用して、１４の地理 的に決定された治験実施施設で募集した。 １９９２年の１月および２月に生まれた小児を３薬剤（armed）試験に無作為 に割り付けた。親の同意を得た後、２ケ月齢、４ケ月齢および６ケ月齢で、幼児 の２／３に対して、２種類のジフテリア−破傷風−非細胞性百日咳製剤のうちの １種類を投与した。対照群には、ＤＴのみを投与した。１９９２年５月に、米国 で特許取得された市販の全細胞ＤＴＰワクチンが導入され、１９９２年の３月か ら１２月に生まれた小児を４薬剤試験に無作為に割り付けた。親の同意を得た後 、２ケ月齢、４ケ月齢および６ケ月齢で、幼児の３／４に対して、３種類のＤＴ Ｐ製剤のうちの１種類を投与した。対照群には、ＤＴのみを投与した。 各ワクチンを約２５００名の小児に投与した。ワクチンは３回投与した。第１ 回投与は、２ケ月齢であって３ケ月齢未満の時点で行った。その後の投与は、８ 週間ずつの期間を設けて行った。ワクチンは筋肉注射にて投与した。 小児および家族について、３０ケ月間の追跡調査を行った。百日咳が疑われる 場合は、臨床データを収集し、鼻腔吸引液に対する細菌学的培養およびポリメラ ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）診断を行うことで臨床検査的に確認した。急性期および 回復期に採血を行って、血清学的診断を行った。 この治験以前では、危険性のあるヒト群（特に、新生児）における本発明の成 分百日咳ワクチンが提供するペルタクチンの程度は不明であった。特に、各種Bo rdetella 成分および選択された相対量での百日咳ワクチン中での存在のワクチン の効力に対する寄与は不明であった。 この治験の主目的は、非細胞性百日咳ワクチンと全細胞ワクチンがプラシーボ と比較して代表的な百日咳に対する保護を与える能力を推算することにあった。 第２のエンドポイントは、重度の異なる確定した百日咳感染に対するワクチン の効力を解明することにあった。 ワクチンの効力は、非予防接種小児と比較した予防接種被験者における百日咳 罹患確率のパーセント低下と定義される。 ２つのワクチン群における百日咳の相対的危険度は、その２群における疾患の 確率の比で表現される。 侵襲率とも称される百日咳罹患の確率は、各種方法によって推算することがで きる。標本数の計算においては、所定の試験群における百日咳罹患確率は、百日 咳患者の小児と治験追跡調査終了後に試験群に残っていた小児との間の率によっ て計算される。 代表的百日咳の予防における本治験での成分ワクチンＣＰ１０／５／５／３Ｄ Ｔの効力を表４に示してあり、約８５％であった。同じ治験で、ＰＴおよびＦＨ Ａのみを含む２成分百日咳比細胞性ワクチンは約５８％の効力であり、全細胞ワ クチンは約４８％の効力であった。ＣＰ１０／５／５／３ＤＴはさらに、軽度の 百日咳予防においても有効で、推定効力は約７７％であった。発明の要旨 本開示をまとめると、本発明はBordetella pertussisの線毛性凝集原の新規な 製剤とその製造方法を提供するものである。線毛性凝集原は、他のBordetella抗 原および非Bordetella抗原とともに製剤して、多くの多成分百日咳ワクチンを得 ることができる。そのようなワクチンは、ヒトにおいて安全、非反応原性、免疫 原性であって、保護効果を持つ。本発明の範囲内においては変更が可能である。 Ａ：患者定義：２１日間痙攣性咳および培養で陽性 Ｂ：患者定義：１日以上の軽度の百日咳の咳 注１：信頼限界 注２：全細胞百日咳ワクチン

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年５月２２日 【補正内容】 請求の範囲 １．Bordetella菌株から実質的に凝集原１を含まない線毛性凝集原２（Ａｇｇ ２）および線毛性凝集原３（Ａｇｇ３）を含む凝集原製剤の製造方法において、 （ａ）Bordetella菌株の細胞ペーストを得る段階 （ｂ）細胞ペーストを約１Ｍ〜約６Ｍの尿素を含む緩衝液に分散させることで 該細胞ペーストから線毛性凝集原２および３を選択的に抽出して、該凝集原２お よび３を含む第１の上清と第１の残渣沈殿物を得る段階 （ｃ）前記第１の残渣沈殿から第１の上清を分離する段階； （ｄ）前記第１の上清を約７５℃〜約８５℃の温度で約１０分間〜約６０分間 インキュベーションすることで、線毛性凝集原２および３を含む透明上清と非線 毛性凝集原汚染物を含む第２の沈殿物を得る段階； （ｅ）前記透明上清にポリエチレングリコールを加えることで該透明上清から 線毛性凝集原２および３を沈殿させ、沈殿した線毛性凝集原２および３を得られ た上清から分離し、沈殿した線毛性凝集原２および３を可溶化することにより、 該透明上清を濃縮して、粗線毛性凝集原溶液を得る段階； （ｆ）前記粗線毛性凝集原溶液から線毛性凝集原２および３を精製して、線毛 性凝集原２および３を含む線毛性凝集原製剤を得る段階 を有してなる方法。 ２．温度を約８０℃とする請求項１記載の方法。 ３．時間を約３０分間とする請求項１記載の方法。 ４．前記第１の上清を濃縮してから、インキュベーション段階（ｄ）を行う請 求項１記載の方法。 ５．前記沈殿形成を、前記透明上清に分子量約８０００のポリエチレングリコ ールを約３％〜約５％まで加えて、前記透明上清から前記凝集原を沈殿させるこ とで行う請求項１記載の方法。 ６．ポリエチレングリコールの濃度を約４．３〜約４．７重量％とする請求項 ９記載の方法。 ７．前記凝集原を、カラムクロマトグラフィーによって粗線毛性凝集原溶液か ら精製する請求項１記載の方法。 ８．前記カラムクロマトグラフィーで、セファデックス６Ｂおよび／またはＰ ＥＩシリカカラムクロマトグラフィーを行う請求項７記載の方法。 ９．前記精製段階で、前記カラムクロマトグラフィー精製からの溶出液の滅菌 によって無菌線毛性凝集原製剤を得る請求項７記載の方法。 １０．前記無菌線毛性凝集原製剤を、無機塩アジュバントに吸収させる請求項 ９記載の方法。 １１．前記無機塩アジュバントがミョウバンである請求項１０記載の方法。 １２．Bordetella菌株がBordetella pertussis菌株である請求項１記載の方法 。 １３．実質的に凝集原１を含まない線毛性凝集原２（Ａｇｇ２）および線毛性 凝集原３（Ａｇｇ３）を含むBordetella菌株からの線毛性凝集原製剤。 １４．線毛性Ａｇｇ２の線毛性Ａｇｇ３に対する重量比が、約１．５：１〜約 ２：１である請求項１３記載の製剤。 １５．請求項１記載の方法によって製造される請求項１４記載の線毛性凝集原 製剤。 １６．請求項１３、１４または１５に記載の凝集原製剤を含有する免疫原性組 成物。 １７．Bordetellaによって生じる疾患からワクチンによって免疫感作された宿 主を保護するためにin vivoで使用されるワクチンとして製剤された請求項１６ 記載の免疫原性組成物。 １８．１以上の他のBordetella抗原をさらに含有する請求項１７記載の免疫原 性組成物。 １９．前記１以上の他のBordetella抗原が、線維状ヘマグルチニン、６９ｋＤ ａ外膜蛋白、アデニル酸シクラーゼ、Bordetellaリポオリゴ糖、外膜蛋白ならび に百日咳毒もしくはそのトキソイドからなる群から選択される請求項１８記載の 免疫原性組成物。 ２０．約２：１：１の重量比で、B.pertussisの百日咳トキソイド、線維状ヘ マグルチニンおよび線毛性凝集原を含有する請求項１９記載の免疫原性組成物。 ２１．前記重量比が、ヒト１回用量中に百日咳トキソイド約１０μｇ、線維状 ヘマグルチニン約５μｇおよび線毛性凝集原約５μｇを含有させることで得られ ている請求項２０記載の免疫原性組成物。 ２２．約１０：５：５：３の重量比で、B.pertussisの百日咳トキソイド、線 維状ヘマグルチニン、６９ｋＤａ外膜蛋白および線維状凝集原を含有する請求項 １９記載の免疫原性組成物。 ２３．前記重量比が、ヒト１回用量中に百日咳トキソイド約１０μｇ、線維状 ヘマグルチニン約５μｇ、６９ｋＤａ蛋白約５μｇおよび線毛性凝集原約３μｇ を含有させることで得られている請求項２２記載の免疫原性組成物。 ２４．約２０：２０：５：３の重量比で、B.pertussisの百日咳トキソイド、 線維状ヘマグルチニン、６９ｋＤａ蛋白および線毛性凝集原を含有する請求項１ ９記載の免疫原性組成物。 ２５．前記重量比が、ヒト１回用量中に百日咳トキソイド約２０μｇ、線維状 ヘマグルチニン約２０μｇ、６９ｋＤａ蛋白約５μｇおよび線毛性凝集原約３μ ｇを含有させることで得られている請求項２４記載の免疫原性組成物。 ２６．１以上の非Bordetella免疫原をさらに含有する請求項１９記載の免疫原 性組成物。 ２７．前記非Bordetella免疫原が、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド 、Haemophilusの莢膜多糖類、Haemophilusの外膜蛋白、Ｂ型肝炎表面抗原、小児 麻痺、おたふくかぜ、はしか、および風疹からなる群から選択される請求項２６ 記載の免疫原性組成物。 ２８．ヒト１回用量中に、ジフテリアトキソイドを約１５Ｌｆと破傷風トキソ イドを約５Ｌｆの量でさらに含有する請求項２４記載の免疫原性組成物。 ２９．さらにアジュバントを含む請求項１８記載の免疫原性組成物。 ３０．前記アジュバントが、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、クイ ル（Quil）Ａ、ＱＳ２１、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、 糖胞質類縁体、アミノ酸のオクタデシルエステルおよびリポ蛋白からなる群から 選択される請求項２９記載の免疫原性組成物。 ３１．Bordetellaによって引き起こされる疾患に対して宿主を免疫感作する方 法において、免疫学的に有効な量の請求項１６記載の免疫原性組成物を宿主に対 して投与する段階を有してなる方法。 ３２．宿主がヒトである請求項３６記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/13 Ａ６１Ｋ 39/13 39/165 39/165 39/20 39/20 39/29 39/29 39/39 39/39 Ｃ０７Ｋ 14/235 Ｃ０７Ｋ 14/235 // Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ティッファウオン、ジョン カナダ国 エム５ビー ２エイチ９ オン タリオ州 トロント カールトン ストリ ート 45 アパートメント 602 (72)発明者 バッレト、ルイス カナダ国 エル４ケー １ピー４ オンタ リオ州 コンコード クルックド スティ ック クレッセント 53 (72)発明者 ジャクソン、ゲイル イー．ディー. カナダ国 エル４シー ５ピー３ オンタ リオ州 リッチモンド ヒル アネッテ ゲイト 10 (72)発明者 タン、ラリー ユー．エル. カナダ国 エル５エル ３エヌ３ オンタ リオ州 ミシソーガ フォークウェイ ド ライヴ 2424 (72)発明者 ハーバート、アンドリュー カナダ国 エム２ピー １ティー３ オン タリオ州 ノース ヨーク アッパー カ ナダ ドライヴ 199 アパートメント 414 (72)発明者 クライン、マイケル エイチ. カナダ国 エム２ピー １ビー９ オンタ リオ州 ウイロウダール ムンロ ブール ヴァード 16

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Bordetella菌株からの凝集原製剤の製造方法において、 （ａ）Bordetella菌株の細胞ペーストを得る段階 （ｂ）該細胞ペーストから線毛性凝集原を選択的に抽出して、該凝集原を含む 第１の上清と第１の残渣沈殿物を得る段階 （ｃ）前記第１の残渣沈殿から第１の上清を分離する段階； （ｄ）前記第１の上清を、線毛性凝集原を含む透明上清と非線毛性凝集原汚染 物を含む第２の沈殿物を得るだけの温度および時間でインキュベーションする段 階； （ｅ）前記透明上清を濃縮して、粗線毛性凝集原溶液を得る段階； （ｆ）前記粗線毛性凝集原溶液から線毛性凝集原を精製して、線毛性凝集原製 剤を得る段階 を有してなる方法。 ２．前記インキュベーション段階（ｄ）を、約７５℃〜約８５℃の温度で実施 する請求項１記載の方法。 ３．温度を約８０℃とする請求項２記載の方法。 ４．前記インキュベーション段階（ｄ）を、約１０分間〜約６０分間実施する 請求項２記載の方法。 ５．時間を約３０分間とする請求項３記載の方法。 ６．線毛性凝集原の段階（ｂ）での選択的抽出を、細胞ペーストを約１Ｍ〜約 ６Ｍの尿素を含む緩衝液に分散させることで行う請求項２記載の方法。 ７．前記第１の上清を濃縮してから、インキュベーション段階（ｄ）を行う請 求項２記載の方法。 ８．濃縮段階（ｅ）を、前記透明上清から線毛性凝集原を沈殿させ、沈殿した 線毛性凝集原を得られた上清から分離し、沈殿した線毛性凝集原を可溶化するこ とで行う請求項７記載の方法。 ９．前記沈殿形成を、前記透明上清にポリエチレングリコールを加えることで 行う請求項８記載の方法。 １０．前記沈殿形成を、前記透明上清に分子量約８０００のポリエチレングリ コールを約３％〜約５％まで加えて、前記透明上清から前記凝集原を沈殿させる ことで行う請求項８記載の方法。 １１．ポリエチレングリコールの濃度を約４．３〜約４．７重量％とする請求 項１０記載の方法。 １２．前記凝集原を、カラムクロマトグラフィーによって粗線毛性凝集原溶液 から精製する請求項１記載の方法。 １３．前記カラムクロマトグラフィーで、セファデックス６Ｂおよび／または ＰＥＩシリカカラムクロマトグラフィーを行う請求項１２記載の方法。 １４．前記精製段階で、前記カラムクロマトグラフィー精製からの溶出液の滅 菌によって無菌線毛性凝集原製剤を得る請求項１２記載の方法。 １５．前記無菌線毛性凝集原製剤を、無機塩アジュバントに吸収させる請求項 １４記載の方法。 １６．前記無機塩アジュバントがミョウバンである請求項１５記載の方法。 １７．Bordetella菌株がBordetella pertussis菌株である請求項１記載の方法 。 １８．実質的に凝集原１を含まない線毛性凝集原２（Ａｇｇ２）および線毛性 凝集原３（Ａｇｇ３）を含むBordetella菌株からの線毛性凝集原製剤。 １９．線毛性Ａｇｇ２の線毛性Ａｇｇ３に対する重量比が、約１．５：１〜約 ２：１である請求項１８記載の製剤。 ２０．請求項１記載の方法によって製造される請求項１９記載の線毛性凝集原 製剤。 ２１．請求項１８、１９または２０に記載の凝集原製剤を含有する免疫原性組 成物。 ２２．Bordetellaによって生じる疾患からワクチンによって免疫感作された宿 主を保護するためにin vivoで使用されるワクチンとして製剤された請求項２１ 記載の免疫原性組成物。 ２３．１以上の他のBordetella抗原をさらに含有する請求項２２記載の免疫原 性組成物。 ２４．前記１以上の他のBordetella抗原が、線維状ヘマグルチニン、６９ｋＤ ａ外膜蛋白、アデニル酸シクラーゼ、Bordetellaリポオリゴ糖、外膜蛋白ならび に百日咳毒もしくはそのトキソイドからなる群から選択される請求項２３記載の 免疫原性組成物。 ２５．約２：１：１の重量比で、B.pertussisの百日咳トキソイド、線維状へ マグルチニンおよび線毛性凝集原を含有する請求項２４記載の免疫原性組成物。 ２６．前記重量比が、ヒト１回用量中に百日咳トキソイド約１０μｇ、線維状 ヘマグルチニン約５μｇおよび線毛性凝集原約５μｇを含有させることで得られ ている請求項２５記載の免疫原性組成物。 ２７．約１０：５：５：３の重量比で、B.pertussisの百日咳トキソイド、線 維状ヘマグルチニン、６９ｋＤａ外膜蛋白および線維状凝集原を含有する請求項 ２４記載の免疫原性組成物。 ２８．前記重量比が、ヒト１回用量中に百日咳トキソイド約１０μｇ、線維状 ヘマグルチニン約５μｇ、６９ｋＤａ蛋白約５μｇおよび線毛性凝集原約３μｇ を含有させることで得られている請求項２７記載の免疫原性組成物。 ２９．約２０：２０：５：３の重量比で、B.pertussisの百日咳トキソイド、 線維状ヘマグルチニン、６９ｋＤａ蛋白および線毛性凝集原を含有する請求項２ ４記載の免疫原性組成物。 ３０．前記重量比が、ヒト１回用量中に百日咳トキソイド約２０μｇ、線維状 ヘマグルチニン約２０μｇ、６９ｋＤａ蛋白約５μｇおよび線毛性凝集原約３μ ｇを含有させることで得られている請求項２９記載の免疫原性組成物。 ３１．１以上の非Bordetella免疫原をさらに含有する請求項２４記載の免疫原 性組成物。 ３２．前記非Bordetella免疫原が、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド 、Haemophilusの莢膜多糖類、Haemophilusの外膜蛋白、Ｂ型肝炎表面抗原、小児 麻痺、おたふくかぜ、はしか、および風疹からなる群から選択される請求項３１ 記載の免疫原性組成物。 ３３．ヒト１回用量中に、ジフテリアトキソイドを約１５Ｌｆと破傷風トキソ イドを約５Ｌｆの量でさらに含有する請求項２９記載の免疫原性組成物。 ３４．さらにアジュバントを含む請求項２３記載の免疫原性組成物。 ３５．前記アジュバントが、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、クイ ル（Quil）Ａ、ＱＳ２１、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、 糖脂質類縁体、アミノ酸のオクタデシルエステルおよびリポ蛋白からなる群から 選択される請求項３４記載の免疫原性組成物。 ３６．Bordetellaによって引き起こされる疾患に対して宿主を免疫感作する方 法において、免疫学的に有効な量の請求項２１記載の免疫原性組成物を宿主に対 して投与する段階を有してなる方法。 ３７．宿主がヒトである請求項３６記載の方法。