DE68921908T2

DE68921908T2 - Zell-assoziierte Glucosyltransferase, Antikörper dagegen und eine diese enthaltende Zusammensetzung zur Prophylaxe von Karies.

Info

Publication number: DE68921908T2
Application number: DE68921908T
Authority: DE
Inventors: Isamu Fujita; Junichiro Hiraoka; Toshio Horikoshi; Yoshikatsu Kodama; Tohru Tokoro; Hideaki Yokoyama
Original assignee: Ghen Corp; Kanebo Ltd
Current assignee: Ghen Corp
Priority date: 1988-01-22
Filing date: 1989-01-19
Publication date: 1995-07-27
Anticipated expiration: 2009-01-20
Also published as: DE68921908D1; CN1036036A; JPH01190635A; EP0334467B1; KR940010861B1; CA1325192C; JP2641228B2; EP0334467A2; EP0334467A3; CN1033865C; KR890011996A; US5439680A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft zell-assoziierte Glucosyltransferase, die mit Sukrose reagiert und eine Reaktion zur Synthese von in Wasser unlöslichen Glukanen katalysiert. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Reinigung dieses Enzyms und ein Verfahren zur Herstellung dieses Enzyms.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem einen Antikörper mit immunologischer Aktivität gegen Streptococcus mutans, die als pathogene Bakterien, die Zahnkaries induzieren, bekannt sind. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung zur Prophylaxe von Karies der Zähne, die diesen Antikörper als wirksamen Bestandteil enthält.
Unter dem Gesichtspunkt der Prophylaxe von Zahnkaries sind eine Reihe von Untersuchungen unternommen worden, um die Eigenschaften von S. mutans, die als den Zahnkaries verursachende Bakterien bekannt sind, und den Mechanismus der Beteiligung dieser Bakterien für die Entwicklung von Zahnkaries zu ermitteln.
Was die Stämme von S. mutans betrifft, die bei der Entwicklung von Zahnkaries beteiligt sind, sind jetzt acht Stämme, die serologisch als Serotypen a bis h klassifiziert werden, gefunden worden. Von diesen Serotypen sind auf Grundlage von serologischer Analogie die Serotypen d und g in eine Gruppe und die Serotypen c, e und f in die andere Gruppe definiert worden.
Es ist bereits bekannt, dar der wesentliche Vorgang beim Mechanismus der Beteiligung von S. mutans bei der Entwicklung von Zahnkaries der Vorgang ist, aus Sukrose adhärente, in Wasser unlösliche Glukane herzustellen. Bei diesem Vorgang spielt die Glucosyltransferase (im nachfolgenden als GTF bezeichnet), die von S. mutans hergestellt wird, eine wesentliche Rolle.
Diese von S. mutans produzierte GTF kann entweder in dem Kulturüberstand oder auf der Zelloberfläche in zell-assoziierter Form gefunden werden.
Zum Beispiel ist in der Kultur von Stämmen des Serotyps d oder g, die serologisch einander analog sind, in Abwesenheit von Sukrose die GTF im wesentlichen im Kulturüberstand, aus dem drei Arten der GTF, nämlich GTF-S1, GTF-S2 und GTF-I bisher isoliert und gereinigt worden sind (S steht für ein Enzym, das ein in Wasser lösliches Glukan synthetisiert; und I steht für ein Enzym, das ein in Wasser unlösliches Glukan synthetisiert). Diese drei Arten der GTF produzieren gemeinsam adhärente, in Wasser unlösliche Glukane (siehe z.B. "Synthesis of glucans by Streptococcus mutans und adherence mechanisms", T. Koga, Jap. J. Bacteriol., 41 (4), 679, 1986).
Es ist außerdem bekannt, dar in der Kultur der Stämme der Serotypen d und g in Gegenwart von Sukrose die zuvor erwähnten drei Arten der GTF über die Bindung an Glukane an die Zellen gebunden sind, so daß sich zell-assoziierte Formen ergeben (Hamada, S. und Slade, H. D., Archs Oral. Biol. 24 399 - 402, 1979).
Andererseits sind die Formen GTF-S und GTF-I auch aus dem Kulturüberstand von Stämmen der Serotypen c, e und f, die einander serologisch analog sind (Kuramitsu, H. K. und Wondrack, L., Infect. Immun., 42, 763 - 770, 1983), isoliert worden.
Es gibt jedoch keinen einzigen Bericht darüber, dar in Wasser unlösliche, adhärente Glukane durch gemeinsame Wirkung dieser GTF-S und GTF-I synthetisiert werden können.
Außerdem sind Versuche unternommen worden, Verfahren oder Mittel zur Vermeidung von Zahnkaries zu entwicklen, wobei S. mutans zum Zielorganismus gemacht worden ist. Ein bekanntes Beispiel eines Verfahrens zur Verhinderung von Zahnkaries durch Kontrolle der Kolonisation von S. mutans in der Mundhöhle (insbesondere durch Kontrolle der Adhäsion an die Zahnoberflächen) ist das Verfahren zur Verhinderung von Zahnkaries unter Verwendung von Antikörpern, die eine immunologische Aktivität gegen S. mutans haben. Es ist nämlich ein Verfahren zur Verhinderung der Kolonisation von S. mutans in der Mundhöhle unter Verwendung von Milch beschrieben worden, die von Kühen erhalten wurde, die mit Zellen von S. mutans immunisiert worden sind (Britische Patentschrift Nr. 1 505 513). Ein prophylaktisches Mittel gegen Zahnkaries, das eine Kombination aus Antiserum und/oder Milch ist, die von einem Säugetier erhalten wird, das mit einer Fraktion wie z.B. den Zellwänden, die aus einer Kultur von S. mutans gewonnen worden ist, und einem oder mehreren Synergisten, ausgewählt aus Inhibitoren der Glucosyltransferase, Proteasen und Dextranasen, immunisiert worden ist, ist in der Beschreibung der Japanischen Offenlegungsschrift Nr. 60-38 327 beschrieben worden.
Der Effekt der Verhinderung von Zahnkaries durch Antikörper mit immunologischer Aktivität gegen S. mutans ist jedoch nicht immer zufriedenstellend. Da die Antikörper außerdem auf herkömmliche Weise aus Milch oder Antiserum von immunisierten Säugetieren hergestellt werden, werden sie in vielen Fällen auf Grund von solchen Nachteilen wie mangelnder Eignung für die Massenherstellung oder hoher Herstellungskosten gar nicht erst produziert.
Um Technologien für eine wirksamere Prophylaxe von Zahnkaries zu etablieren, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung ihre Aufmerksamkeit den Stämmen des Serotyps c wie auch den Stämmen der Serotypen e und f gewidmet. Dieser Serotyp c ist in der menschlichen Mundhöhle besonders vorherrschend und scheint bei der Entwicklung von menschlichem Zahnkaries die wesentliche Rolle zu spielen. Die Serotypen e und f sind serologisch analog zu den Stämmen des Serotyps c. Im Laufe von zahlreichen Untersuchungen zur Ermittlung der Mechanismen der Beteiligung dieser Stämme bei der Entwicklung von Zahnkaries haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung Fraktionen der GTF isoliert und gereinigt, die bei dem Verfahren, in Wasser unlösliche Glukane, die von diesen Bakterien produziert werden, zu synthetisieren, eine Rolle spielen. Die Untersuchungen sind außerdem unter dem Gesichtspunkt durchgeführt worden, dar die Ermittlung der Eigenschaften der GTF wesentlich ist.
Als Ergebnis haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung unter den von diesen Bakterien produzierten GTF-Fraktionen die Gegenwart von zell-assoziierter GTF mit einer enzymatischen Aktivität für die Synthese von in Wasser unlöslichen Glukanen (im nachfolgenden als CA-GTF-I bezeichnt), die eine wesentliche Rolle bei der Adhäsion der Bakterien an den Zahnoberflächen haben kann, insbesondere für die von Sukrose abhängige Adhäsion, bestätigt. Deshalb haben sich die Erfinder der vorliegenden Erfindung um die Isolation und Reinigung der CA-GTF- I bemüht.
Weiterhin ist mittels herkömmlicher Techniken die Isolation von zell-assoziierten Typen der GTF (-I) der Stämme der Serotypen c, e oder f als gereinigtes Enzymprotein bisher noch nicht erfolgreich durchgeführt worden, um deren Eigenschaften intensiv zu untersuchen.
Bezüglich der durch einen Stamm des Serotyps c produzierten, zell-assoziierten GTF-I gibt es einen Bericht von Kuramitsu (Kuramitsu, H. K., Infect. Immun., 10, 227 - 235, 1974). Kuramitsu et al. erhielten nämlich unter Verwendung von 1 M NaCl einen Extrakt mit enzymatischer Aktivität bezüglich der Synthese von in Wasser unlöslichem Glukan aus Zellen und untersuchten die Eigenschaften des Extraktes als GTF. Dort wird berichtet, dar für die GTF-Aktivität in dem Extrakt das PH-Optimum 6,0 und das Temperatur-Optimum 37ºC waren.
Da der von Kuramitsu erhaltene Extrakt jedoch in Wasser unlöslich wird, wenn er der für die Reinigungsvorgänge nötigen Entsalzungsbehandlung unterworfen wird, ist eine gereinigte Proteinfraktion mit GTF-Aktivität aus dem Extrakt bisher im wesentlichen nicht erfolgreich gewesen. Deshalb beruhten die von Kuramitsu zur Verfügung gestellten, die zell-assoziierte GTF- Fraktion betreffenden Daten nicht auf einer gereinigten Enzymprotein-Fraktion und wurden dementsprechend als außerordentlich ungenügend erachtet, um das Enzym mit GTF-Aktivität zu spezifizieren. Insbesondere ist das Enzym, das in der Fraktion, die aus den Zellen extrahiert worden ist, enthalten ist, überhaupt nicht als ein Enzymprotein charakterisiert worden. Insbesondere ist keine der Eigenschaften wie Molekulargewicht oder isoelektrischer Punkt bestimmt worden.
Auf der anderen Seite isst von Kenney et al. und Kuramitsu et al. gezeigt worden, daß GTF-I von Stämmen des Serotyps c in Fraktionen des Kulturüberstandes vorliegt.
Kenney et al. haben gezeigt, dar GTF-Ic mit einem Molekulargewicht von 153 kD und der Aktivität zur Synthese von in Wasser unlöslichen Polysacchariden in dem Kulturüberstand eines Stammes des Serotyps c vorliegt (A. C. Kenney und J. A. Cole, FEMS Microbiol. Lett., 16 159 - 162, 1983).
Kenney et al. haben jedoch nur die Gegenwart der GTF-Ic in dem Kulturüberstand nachgewiesen. Weder Information für die Isolierung und Reinigung des Enzyms noch Daten, die nötig sind, um Eigenschaften des Enzyms als ein Protein zu spezifizieren, sind zur Verfügung gestellt worden.
Auf der anderen Seite haben Kuramitsu et al. aus dem Kulturüberstand eines Stammes vom Typ c eine Fraktion isoliert, die Dextransukrase (DS, GTF-Sc) mit der Aktivität zur Synthese von in Wasser löslichen Glukanen, enthält. Sie haben außerdem eine Fraktion isoliert, die Mutansynthetase (MS, GTF-Ic) mit der Aktivität zur Synthese von in Wasser unlöslichen Glukanen enthält. Dann haben sie mit diesen Fraktionen verschiedene Analysen, z.B. auf GTF-Aktivität, durchgeführt, so dar sie zeigen konnten, daß DS und MS zwei verschiedene Enzyme waren. Die erhaltene MS hatte eine Immunogenizität, die von der der DS verschieden war. Sie hatte ein Molekulargewicht von 155 kD und einen isoelektrischen Punkt (pI) von 4 - 5 (Kuramitsu, H. K. und Wondrack, L., Infect. Immun., 42, 763 - 770, 1983).
Unter diesen Umständen haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung zahlreiche Anstrengungen unternommen, um ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von CA-GTF-I zu untersuchen, um die Gegenwart dieses Enzyms zu bestätigen. Als Ergebnis hatten die Erfinder der vorliegenden Erfindung zum ersten Mal Erfolg mit der Isolierung und Reinigung von CA-GTF-I aus Zellen von Bakterien des Serotyps c. Sie erhielten neue Informationen bezüglich der Eigenschaften, wodurch die vorliegende Erfindung getätigt wurde.
Außerdem haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung die Information gewonnen, dar ein Antikörper gegen derart isolierte und gereinigte CA-GTF-I genügend Wirkung hat, die Adhäsion von S. mutans auf Zahnoberflächen zu verhindern. Weiterhin haben sie herausgefunden, dar der Antikörper billig und in grobem Maßstab mittels Immunisierung von Hühnern mit der gereinigten CA-GTF-I als Antigen hergestellt werden kann, womit sie die vorliegende Erfindung vollendet haben.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin CA-GTF-I als ein Enzym zur Synthese von in Wasser unlöslichem Glukan zur Verfügung zu stellen, das für die Entwicklung von wirksameren Techniken und verschiedenen medizinischen Mitteln, die für die Ermittlung von detaillierten Mechanismen der Entwicklung von Zahnkaries oder für die Prophylaxe von Zahnkaries nötig sind, Verwendung finden können.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen Antikörper zur Verfügung zu stellen, der eine immunologische Aktivität gegen S. mutans, ausreichende prophylaktische Wirkung bezüglich der Adhäsion von S. mutans auf Zahnoberflächen hat und als ein wirksamer Bestandteil einer Zusammensetzung zur Prophylaxe von Zahnkaries zu verwenden ist.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung dieses Antikörpers zu niedrigen Preisen und in groben Mengen zur Verfügung zu stellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Zusammensetzung zur Prophylaxe von Zahnkaries zur Verfügung zu stellen, die diesen Antikörper als einen wirksamen Bestandteil enthält.
Die Figur 1 zeigt die Protein-Konzentration (A&sub2;&sub8;&sub0;), die GTF- Aktivität und die FTase (D-Fructosyltransferase)-Aktivität in den Fraktionen, die in Beispiel 3 von DEAE-Sephacel eluiert wurden.
Die Figur 2 zeigt die Protein-Konzentration (A&sub2;&sub8;&sub0;), die GTF- Aktivität und die FTase - Aktivität in den Fraktionen, die in Beispiel 3 von Hydroxyapatit eluiert wurden.
Die Figur 3 zeigt die Veränderungen des Antikörper-Titers der immunisierten Hühner in Beispiel 3.
Die isolierte zell-assoziierte Glucosyltransferase (CA-GTF-I) gemäß der vorliegenden Erfindung hat zumindest die folgenden physikochemischen Eigenschaften.

(1) Spezifität von Reaktion und Subrat:

Reagiert mit Sukrose und stellt in Wasser unlösliche Glukane her.

(2) pH-Optimum:

pH 6,7 - 7,0

(3) Bereich des Temperatur-Optimums:

15 - 50ºC

(4) Bedingungen der Inaktivierung:

Wird inaktiviert durch 5minütiges Erhitzen bei 80ºC

(5) Molekulargewicht:

150 - 165 kD, gemessen mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

(6) Immunogenizität:

Ist in Tieren immunogen und induziert die Produktion von spezifischen Antikörpern gegen das Enzym.
Auch in Anbetracht der Tatsache, dar das pH-Optimum für die GTF-Aktivität von CA-GTF-I in etwa dasselbe ist wie der pH- Wert in der Mundhöhle (wie oben beschrieben), lädt sich ohne weiteres verstehen, dar CA-GTF-I eine wesentliche Rolle für das Verhalten von S. mutans in der Mundhöhle spielen kann.
Da CA-GTF-I wie oben beschrieben in Tieren immunogen sein kann, kann der spezifische Antikörper gegen das Enzym dadurch produziert werden, daß das Enzym an Tiere verabreicht wird.
Der so erhaltene Antikörper läßt sich wie oben erwähnt auf dem Gebiet der Vermeidung von Zahnkaries verwenden.
Außerdem kann CA-GTF-I wirksam für die Herstellung von Glukanen aus Sukrose verwendet werden.
Die Enzym-Aktivität von CA-GTF-I kann z.B. dadurch bestimmt werden, dar die Menge der in Glukane, die bei der Reaktion des Enzyms mit [¹&sup4;C-Glukose]-Sukrose als Substrat hergestellt werden, eingebauten Radioaktivität gemessen wird.
Eine Einheit (U) an GTase-Aktivität ist als diejenige Menge an Enzym definiert, die erforderlich ist, um 1,0 uMol pro Minute Glukose aus der Sukrose in Glukan einzubauen.
CA-GTF-I kann z.B. dadurch erhalten werden, dar in zell-assoziierter Form hergestellte GTF-I aus Zellen isoliert und gereinigt wird.
Wie es eindeutig in den anschließenden Beispielen beschrieben ist, ist CA-GTF-I verschieden von GTF-S (CF-GTF-S), die in dem Überstand einer Kultur von Bakterien des Serotyps c vorliegt.
CA-GTF-I hat die Aktivität, in Wasser lösliche Glukane zu synthetisieren.
Die CA-GTF-I gemäß der vorliegenden Erfindung kann aus Bakterien der Stämme der Serotypen c, e oder f auf unten beschriebene Weise isoliert und gereinigt werden.
Erstens werden die Zellen der Serotypen c, e oder f in einem geeignetem Medium kultiviert. Die resultierenden Zellen werden gesammelt und, wenn nötig, gewaschen.
Die Stämme des hier zu verwendenden Serotyps c sind z.B. der Stamm S. mutans MT8148, der Stamm Ingbritt und der Stamm NCTC 10449.
Diese Stämme sind öffentlich bekannt und ohne weiteres erhältlich.
Der S. mutans-Stamm MT8l48 und der Stamm Ingbritt sind z.B. erhältlich von dem Department of Dentistry, Osaka University. Der Stamm NCTC 10449 ist erhältlich von American Type Culture Collection (ATCC) als Stamm ATCC 25175. Was weiterhin die Stämme der Serotypen e und f betrifft, so können alle öffentlich bekannten, verfügbaren Stämme verwendet werden.
Was das Kulturmedium betrifft, so kann jedes Medium verwendet werden, das zumindest Glukose enthält. Zum Beispiel können die Medien TTY (ein aus Trypticase, Tryptose und Hefe-Extrakt zusammengesetztes, komplexes Medium), das Medium BHI (Brain Heart Infusion) und das Medium FMC verwendet werden.
Die Kultivierung kann in allen Temperaturbereichen, bei denen geeignetes bakterielles Wachstum und Produktion von CA-GTF-I erwartet werden kann, durchgeführt werden. Unter dem Aspekt eines ausreichenden bakteriellen Wachstums und der Produktion von CA-GTF-I kann im allgemeinen eine Temperatur von etwa 37ºC verwendet werden.
Die für die Kultivierung erforderliche Zeit ist in Abhängigkeit von den Kultivierungsbedingungen wie der Temperatur und der Art des verwendeten Mediums unterschiedlich. Die Inkubationszeit zur Erzielung einer optimalen Ausbeute an CA-GTF-I kann vorteilhafterweise ausgewählt werden. Im allgemeinen können 18 - 20 Stunden verwendet werden.
Andere Kultivierungsbedingungen können außerdem unter den oben beschriebenen Aspekten in geeigneter Weise ausgewählt werden.
Danach wird die CA-GTF-I aus den Zellen extrahiert.
Die Extraktion der CA-GTF-I aus den Zellen kann z.B. mittels eines Verfahrens ausgeführt werden, bei dem die Zellen mit der extrahierenden Lösung wie einer Harnstoff-Lösung und einer Guanidin-HCl-Lösung in Berührung gebracht werden.
Die Extraktionsbedingungen wie die Konzentration der in der extrahierenden Lösung suspendierten Zellen, die Konzentration der extrahierenden Lösung, die Temperatur und die Dauer für die Extraktion können gemäß der Art der extrahierenden Lösung auf geeignete Weise ausgewählt werden, so daß eine ausreichende Extraktion des gewünschten Enzyms möglich ist.
Um einen Extrakt mit hoher spezifischer Aktivität in hoher Ausbeute zu erhalten, wurde eine Harnstoff-Lösung von vorzugsweise 6 - 10 M, besonders bevorzugterweise von 8 M, verwendet. Die Extraktion kann vorzugsweise bei 20 - 30ºC, besonders bevorzugterweise bei 25ºC, über einen Zeitraum von etwa 15 Minuten bis 2 Stunden durchgeführt werden.
Nach der Extraktion wurden die festen Bestandteile wie die Zellen aus dem Extrakt entfernt. Dies erfolgte z.B. mittels Zentrifugation. Der resultierende Überstand wurde dann mittels bestimmter Verfahren wie Dialyse, Ultrafiltration oder Gelfiltration behandelt, so dar Harnstoff, Verunreinigungen mit einem niedrigen Molekulargewicht oder dergleichen aus dem Extrakt entfernt wurden. Dementsprechend wurde eine Zubereitung eines rohen Extraktes der CA-GTF-I erhalten.
Außerdem wurden Präzipitate, in solchen Fällen, da diese während einer Behandlung wie der Dialyse gebildet wurden, z.B. mittels Zentrifugation entfernt.
Außerdem kann die Zubereitung des rohen Extraktes gereinigt werden, so dar eine gereinigte CA-GTF-I-Zubereitung erhalten wird.
Für diese Reinigung können verschiedene Reinigungsverfahren, die allgemein für die Reinigung von Enzymen verwendet werden, angewandt werden. Zum Beispiel kann, wie es im nachfolgenden beschrieben wird, ein Verfahren einer Kombination von zwei Adsorptionsvorgängen auf vorteilhafte Weise angewendet werden, wobei der eine Vorgang mit einem Anionen-Austauscher und der andere mit Hydroxyapatit erfolgt.
Ein Beispiel für den Anionen-Austauscher, wie er für-die Reinigung der Zubereitung des rohen Extraktes verwendet wird, ist ein Anionen-Austauscher mit funktionellen Resten wie einer Diethylaminoethyl (DEAE) - Gruppe. Insbesondere kann DEAE-Sephacel (Pharmacia-LKB) verwendet werden.
Ein Beispiel für den zu verwendenden Hydroxyapatit ist Bio-Gel HTP (Bio-Rad Laboratiories).
Bei dem Reinigungsverfahren mit dem Anionen-Austauscher werden die extrahierten Bestandteile (rohe Protein-Bestandteile), die in der Zubereitung des rohen Extraktes enthalten sind, auf eine Anionen-Austauscher-Säule aufgetragen. Dann können Fraktionen, die das gewunschte Enzym enthalten, selektiv von den an den Anionen-Austauscher adsorbierten Bestandteilen eluiert werden.
Die das gewünschte Enzym enthaltenden Fraktionen können z.B. dadurch erhalten werden, daß die Salzkonzentration des Elutionsmittels kontrolliert wird.
Diese Salzkonzentration ist in Abhängigkeit von der Art des Anionen-Austauschers oder den Elutionsbedingungen unterschiedlich. Die Konzentration kann dadurch bestimmt werden, dar der Bereich ausgewählt wird, in dem die die GTF (I) enthaltenden Fraktionen selektiv fraktioniert werden können.
Für den Fall, da DEAE-Sephacel verwendet wird, kann, um ein Beispiel zu nennen, GTF (-I) mit Konzentrationen an NaCI in einem Bereich von 0,45 - 1,0 M in Phosphat-Puffer erhalten werden.
Außerdem kann die Probe, die mit dem Anionen-Austauscher in Berührung gebracht werden soll, aus der Zubereitung des rohen Extraktes derart hergestellt werden, dar eine rohe Protein- Fraktion dadurch erhalten wird, dar die Zubereitung des rohen Extraktes unter Verwendung einer Salzlösung wie Ammoniumsulfat oder eines organischen Lösungsmittels wie Ethanol präzipitiert wird. Das resultierende Präzipitat wird mittels Zentrifugation oder dergleichen wiedergewonnen, in einem geeigneten Lösungsmittel suspendiert, und dann werden Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht aus dem Präzipitat mittels eines Vorgangs wie der Dialyse entfernt, sofern dies nötig ist.
Nach der Behandlung mit dem Anionen-Austauscher werden die Fraktionen mit GTF (-I)-Aktivität zusammengegeben, z.B. mittels Dialyse entsalzt und dann auf eine Hydroxyapatit-Säule aufgetragen.
Daran anschließend wurden die CA-GTF-I-Fraktionen selektiv von der Fraktion eluiert, die an dem Hydroxyapatit adsorbiert worden war. Die Fraktionen wurden zusammengegeben und, falls nötig, einer Dialyse oder dergleichen unterworfen, so daß eine gereinigte Zubereitung der CA-GTF-I erhalten wurde.
Die gereinigte Zubereitung der CA-GTF-I, die derart erhalten wurde, ergibt eine einzelne Bande entsprechend einem Molekulargewicht von 150 - 160 kD auf einem SDS-PAGE-Gel.
An Hand der oben beschriebenen Verfahren, z.B. der Reinigung, kann das Enzym mit einer spezifischen Aktivität von 6,96 U/mg Protein erhalten werden, wie dies in den Beispielen anschließend beschrieben ist.
CA-GTF-I kann mittels der zuvor erwähnten Verfahren für die Kultivierung von Bakterien und Extraktion hergestellt werden. Der resultierende Extrakt kann solange gereinigt werden, bis die gewünschte Reinheit erhalten wird.
Ein Antikörper mit immunogener Aktivität gegen S. mutans (gegen CA-GTF-I gerichteter Antikörper) gemäß der vorliegenden Erfindung kann als ein Immunglobulin, hergestellt aus Eiern, die von Hühnern gelegt worden sind, die wie oben beschrieben mit CA-GTF-I immunisiert worden sind, erhalten werden.
Um eine antigene Flüssigkeit für die Immunisierung der Hühner herzustellen, kann z.B. eine CA-GTF-I verwendet werden, die in dem Zellextrakt oder in der rohen Zubereitung enthalten ist, wie sie mittels der zuvor erwähnten Verfahren für die Isolierung der CA-GTF-I erhalten wird. Es kann auch die als gereinigte Präparation erhaltene Flüssigkeit verwendet werden.
Der gegen CA-GTF-I gerichtete Antikörper kann aus Eiern von Hühnern, die mit der zuvor erwähnten CA-GTF-I immunisiert worden sind, hergestellt werden.
Was die zu immunisierenden Hühner betrifft, können alle Hühner verwendet werden. Unter dem Gesichtspunkt der Massenproduktion können vorzugsweise solche Sorten verwendet werden, die, wie z.B. das weihe Legehuhn, für die Eierproduktion gezüchtet worden sind.
Die Verfahren der Immunisierung mit CA-GTF-I sind gewöhnliche Verfahren wie die subkutane Injektion, die intraperitoneale Injektion, die intramuskuläre Injektion, die intranasale Injektion und das Tropfen in die Augen. Die Dosis kann geeigneterweise derart ausgewählt werden, dar der gewünschte Antikörper-Titer erhalten wird und kein nachteiliger Einfluß auf die Hühner resultiert.
Im allgemeinen kann ein Antikörper, der mit dem Antigen außerordentlich reagiert, innerhalb von mehreren Wochen nach der ersten Immunisierung in den Eiern (Eigelb) produziert werden.
Außerdem können, wenn nötig, Adjuvantien wie FCA (Freund's komplettes Adjuvans) oder FIA (Freund's unvollständiges Adjuvans) zusammen mit CA-GTF-I verwendet werden.
Der gegen CA-GTF-I gerichtete Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung kann aus den Eiern, die die Hennen gelegt haben, etwa einen Monat oder mehr nach der Immunisierung hergestellt werden.
Der Antikörper-Titer kann z.B. dadurch gemessen werden, dar ein ELISA oder ein Radioimmunassay (RIA) verwendet werden. Eine Veränderung im Antikörper-Titer kann dadurch festgestellt werden, dar der Antikörper-Titer in Intervallen von etwa 2 Wochen nach der Immunisierung gemessen wird.
In den nachfolgend erwähnten Beispielen wird die sequenzielle Veränderung der Antikörper-Titer mittels Messung mit ELISA aufgezeichnet. Die Eier werden gesammelt, wenn der Antikörper-Titer genügend hoch angestiegen ist, um den gegen CA-GTF-I gerichteten Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung herzustellen.
Im übrigen kann ein hoher Antikörper-Titer im allgemeinen über einen Zeitraum von etwa 3 Monaten aufrecht erhalten werden.
Nach der Immunisierung kann der Antikörper-Titer, wenn er abgenommen hat, durch eine zusätzliche Immunisierung, die auf geeignete Weise in geeigneten Zeitabständen verabreicht wird, erhöht werden.
Der gegen CA-GTF-I gerichtete Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung kann z.B. dadurch erhalten werden, dar Immunglobulin, das in dem Eigelb von Hühnern, die wie oben beschrieben immunisiert worden sind, enthalten ist, extrahiert und isoliert wird.
Beispiele für Verfahren, die für die Extraktion und Isolierung verwendet werden können, umfassen eine Vielzahl von üblicherweise für die Extraktion und Isolierung von Immunglobulinen verwendeten Verfahren wie Präzipitations-Verfahren unter Verwendung von Dextransulfat oder Polyethylenglycol (PEG) und Extraktionsverfahren unter Verwendung von Propanol oder Chloroform.
Der gegen CA-GTF-I gerichtete Antikörper, der wie oben beschrieben erhalten wurde, reagiert als Antikörper spezifisch mit CA-GTF-I, wie sie in zell-assoziierter Form mit den Zellen von S. mutans vorliegt. Er hat nämlich immunologische Aktivität gegen S. mutans.
Der gegen CA-GTF-I gerichtete Antikörper mit der immunologischen Aktivität gegen S. mutans hat eine die Adhäsion von S. mutans an Zahnoberflächen inhibierende Wirkung. Dementsprechend kann die Aktivität von S. mutans in der Mundhöhle durch Verabreichung des Antikörpers an die Mundhöhle kontrolliert werden, so dar die Entwicklung von Zahnkaries verhindert werden kann.
Eine Zusammensetzung zur Prophylaxe von Zahnkaries gemäß der vorliegenden Erfindung enthält den zuvor erwähnten, gegen CA- GTF-I gerichteten Antikörper als wirksamen Bestandteil und kann in verschiedenen Formen hergestellt werden, je nach Art der Verabreichung an die Mundhöhle.
Wenn der Antikörper z.B. als Mundwasser oder Zahnpasta verwendet wird, kann der gegen CA-GTF-I gerichtete Antikörper während des Reinigungsverfahrens in einer wirksamen Menge zu einer Vielzahl von Komponenten-gegeben werden.
Die Menge des gegen CA-GTF-I gerichteten Antikörpers, die der Zusammensetzung zur Prophylaxe von Zahnkaries zugesetzt werden muß, kann geeigneterweise an Hand der Menge der Dosis, die für die individuelle Art der Verabreichung geeignet ist, ausgewählt werden. Es können z.B. etwa 0,0001 - 10 Gew. % des Antikörpers mit einem Antikörper-Titer von mehr als 10³ verwendet werden.
Die Zusammensetzung zur Prophylaxe von Zahnkaries gemäß der vorliegenden Erfindung kann in verschiedenen Formen wie z.B. als Zahnputzmittel, als Mundwasser, als Atemerfrischer, als Pastille, als Kaugummi zur Verfügung gestellt werden. Die Zusammensetzung zur Prophylaxe von Zahnkaries kann dadurch hergestellt werden, dar der oben genannte, gegen CA-GTF-I gerichtete Antikörper mit verschiedenen Trägern und/oder allgemein verwendeten Additiven kombiniert wird, um die oben genannten Formen herzustellen. Für ihre Zubereitung können alle bekannten Verfahren, die für die Zubereitung dieser Formen verwendet werden, benutzt werden.
Das Mischungsverhältnis der Träger und Zusatzstoffe, die im allgemeinen für die Zubereitung dieser Formen verwendet werden, kann auch für die Zubereitung der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Eine Zahnpasta kann im allgemeinen aus einem Schleifmittel, einem Bindemittel, einem Feuchtigkeit haltenden Mittel, einem Treibmittel und einem Parfüm zusammengesetzt sein.
Beispiele für das Schleifmittel umfassen sekundäres Cälciumphosphat, Calciumcarbonat, Calciumpyrophosphat, unlösliches Natriummetaphosphat, Kieselsäureanhydrid und dergleichen. Die Zahnpasta kann im allgemeinen 10 - 95 Gew. % des Schleifmittels enthalten.
Beispiele für das Bindemittel umfassen Carboxymethylcellulose, Natriumalginat, Carrageen und dergleichen. Die Zahnpasta kann im allgemeinen 0,5 - 4 % des Bindemittels enthalten.
Beispiele für das Feuchtigkeit haltende Mittel umfassen Sorbitol, Glycerin, Propylenglycol und dergleichen. Die Zahnpasta kann im allgemeinen 5 - 30 % des Feuchtigkeit haltenden Mittels enthalten.
Beispiele für das Treibmittel umfassen anionische Aktivatoren wie Dinatrium-Laurylsulfat, Lauroylsarcosinat und Monolaurin (Laurinsäure-Monoglycerid), nicht-ionische Aktivatoren wie Fettsäureester der Sukrose, Lauryldiethanolamid und Stearinsäure-Monoglycerid und dergleichen. Die Zahnpasta kann im allgemeinen 0,5 - 2 % des Treibmittels enthalten.
Darüberhinaus hat der gegen CA-GTF-I gerichtete Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung, wie er mittels des oben beschriebenen Verfahrens unter Verwendung von Hühnern erhalten wird, die folgenden Vorteile im Vergleich zu den Antikörpern, die mittels Immunisierung von herkömmlichen Säugetieren erhalten werden:
(1) Der Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung kann in den Eiern der immunisierten Hühner produziert werden, so dar keine spezielle oder geschickte Technik nötig ist, um die Eier zu sammeln und zu handhaben und den Antikörper aus den Eiern zu erhalten. Darüberhinaus wird unter den Immunglobulinen nur der Antikörper der Klasse IgG in das Eigelb transferiert, so dar auf einfache Weise nur die Immunglobuline IgG erhalten werden können.
Im Gegensatz dazu sind in den Fällen, da die Antikörper durch Abnehmen des Blutes von immunisierten Säugetieren erhalten werden, geschickte Verfahren nötig, um das Blut zu nehmen. Außerdem ist es noch schwierig, eine große Menge an IgG aus dem Serum zu isolieren und zu reinigen.
(2) Die für die Herstellung des Antikörpers gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Hühner werden auf einfache Art und Weise hochgezogen, so dar die Kosten für das Aufziehen geringer sind als z.B. die Kosten für Ratten.
Darüberhinaus ist das Verfahren unter Verwendung von Säugetieren für die Massenproduktion von Antikörpern nicht geeignet, da es schwierig ist, Blut oder Milch von Säugetieren in groben Mengen kontinuierlich zu erhalten. Im Gegensatz dazu ermöglicht es das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, Antikörper in Mengen zu niedrigen Kosten zu produzieren, da die Hühner über einen langen Zeitraum ununterbrochen Eier legen.
(3) In vielen Fällen ist die Stabilität der Antikörper, die aus dem Blut oder der Milch von immunisierten Säugetieren hergestellt werden, nicht zufriedenstellend, so dar eine Lagerung im Serum oder sogar in gereinigter Form bei einer Temperatur von etwa -80ºC erforderlich ist.
Im Gegensatz dazu weist der Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung eine ausgezeichnete Stabilität auf und kann gut konserviert werden, so daß er z.B. in Form von Eiern 1 - 2 Monate bei 4ºC aufbewahrt werden kann.
Darüberhinaus ist bei der Herstellung eines Antikörpers unter Verwendung von Hühnern in den Fällen einiger Arten von Antigenen ein genügender Antikörper-Titer nicht zu erhalten. Wenn z.B. ein Virus als Antigen verwendet wurde, wurden ausreichende Antikörper-Titer nicht erhalten.
Dementsprechend ist nun von den Erfindern der vorliegenden Erfindung zum erstenmal gefunden worden, dar ein Antikörper mit genügend hohem Antikörper-Titer dadurch erhalten werden kann, daß Hühner mit zell-assoziierter Glucosyltransferase immunisiert werden.

Beispiele

Die vorliegendle Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen genauer beschrieben.

Beispiel 1

[Untersuchung bezüglich der Lokalisation der GTF in verschiedenen Serotypen von S. mutans]

Zellen von S. mutans von verschiedenen Serotypen, die in der Tabelle 1 angegeben sind (Zellen erhalten von dem Department of Dentistry, Osaka University) wurden jeweils in 50 ml BHI-Medium und TH (Todd-Hewitt)-Mediutn 18 Stunden lang bei 37ºC inkubiert.
Nach der Inkubation wurden die Zellen und der Kulturüberstand mittels Zentrifugation getrennt. Die resultierenden Zellen wurden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen.
Dann wurden die jeweiligen GTF-Aktivitäten der Zellen und des Kulturüberstandes nach dem unten beschriebenen Verfahren gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.

Verfahren zur Messung der GTF-Aktivität:

(1) Proben für die Messung

Im Fall von Zellen:
Die gezüchteten Zellen wurden geerntet, mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, in 5 ml 10 mM Phosphat-Puffer (pH 6) suspendiert und dann mittels Ultraschallbehandlung aufgebrochen, so dar eine Zellsuspension für die Messung erhalten wurde.
Im Fall des Überstandes:
Der Kulturüberstand wurde ohne jegliche Behandlung als Probe verwendet.

(2) Messung der GTF-Aktivität:

10 ul von jeder der Proben wurden mit 10 pl 0,2 M Phosphat- Puffer (pH 6,0), der 20 mM [¹&sup4;C-Glukose]-Sukrose (0,05 Ci/Mol) als Substrat enthält, gemischt und dann 1 Stunde lang bei 37ºC umgesetzt. Nach der Reaktion wurden die Reaktionsgemische auf ein Rechteck (1,0 x 2,0 cm) eines Filterpapiers getüpfelt und mit Methanol gewaschen. Die in in Methanol unlösliche Glukane eingebaute Radioaktivität, die auf den Filterpapieren verblieb, wurde zur Berechnung der GTF-Aktivitäten gemessen. Tabelle 1 Stamm (Serotyp) Medium GTF-Aktivität Extrazellulär (EX)
Wie es aus den Ergebnissen in Tabelle 1 zu ersehen ist, ist die Masse der GTF-Aktivität, was die Bakterien des Serotyps d und g betrifft, in den Kulturen mit dem BHI-Medium, insbesondere in Abwesenheit von Sukrose, im Überstand, während die Masse der GTF-Aktivität in den Kulturen mit dem TH-Medium, insbesondere in Gegenwart von Sukrose, in den Zellen (in einer zell-assoziierten Form) gefunden wird.
Auf der anderen Seite werden keine solchen großen Unterschiede, wie sie für die Serotypen d und g beobachtet wurden, für die Bakterien des Serotyps c, e und f beobachtet.

Beispiel 2

[Extraktion der CA-GTF-I aus den Zellen]

Zellen vorn Stamm S. mutans MT8148 (Serotyp c) wurden in einem Liter TTY-Medium 18 Stunden lang bei 37ºC kultiviert. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation geerntet und daraufhin zweimal mit physiologischer Kcchsalzlösung gewaschen.
Anschließend wurden Teile der Zellen in verschiedenen Extraktionslösungen suspendiert. Die resultierenden Suspensionen wurden unter Rühren der Extraktion unterworfen.
Nach Beendigung des Extraktionsvorganges wurden die Zellen mittels Zentrifugation von den Extraktionslösungen abgetrennt. Die resultierenden überstände wurden gegen 10 mM Phosphat-Puffer (pH 6,0) dialysiert.
Nach der Dialyse wurden die in den einzelnen Überständen erzeugten Verunreinigungen mittels Zentrifugation entfernt. Die GFT-Aktivitäten und die Protein-Konzentrationen in den einzelnen Überständen wurden gemessen.
Darüberhinaus wurde die GTF-Aktivität mittels des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens gemessen. Die Protein-Konzentration wurde nach dem Verfahren von Lowry et al. unter Verwendung von Rinderserumalbumin (BSA) als Standard gemessen, so dar die spezifisiche Aktivität berechnet werden konnte.
Die Tabelle 2 zeigt typische Beispiele für Extraktionslösungen und für die Bedingungen der Extraktion, wie sie in dem Extraktionsverfahren verwendet wurden, und spezifische GTF-Aktivitäten der Extrakte.
Die Zellen, die wie oben beschrieben erhalten wurden, wurden außerdem in 1 mM Phosphat-Puffer (pH 6,0) suspendiert. Die resultierenden Suspensionen wurden mittels Ultraschall-Oszillation bei 20 kHz und 200 W 3 Minuten lang aufgebrochen, um Gemische von aufgebrochenen Zellen herzustellen. Nach der Zentrifugation zur Entfernung unlöslicher Fraktionen wurden die resultierenden Überstände auf ähnliche Weise auf GTF-Aktivität untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 Extraktionsverfahren Bedingungen Spezifische Aktivität (U/mg) Ausbeute 8 M Harnstoff 6 M Guanidin-HCl Ultraschall * Ausbeute der unlöslichen Verbindung, die während der Dialyse erzeugt wird.
Wie es den in Tabelle 2 dargestellten Ergebnissen ohne weiteres zu entnehmen ist, konnten Protein-Fraktionen mit GTF-Aktivität mittels der jeweiligen Extraktionsverfahren aus den Zellen extrahiert werden. Um einen Extrakt mit hoher spezifischer Aktivität in hoher Ausbeute zu erhalten, war eine Extraktion mit einer 8 M Harnstoff-Lösung bei 25ºC über einen Zeitraum von 1 Stunde besonders geeignet.

Beispiel 3

[Herstellung von gereinigten Zubereitungen der CA-GTF-I]

Da sich das Extraktionsverfahren mit 8 M Harnstoff bei 25ºC über einen Zeitraum von 1 Stunde als das am besten geeignete erwiesen hat, wurden S. mutans MT8148-Zellen wie in Beispiel 2 beschrieben in TTY-Medium (8 Liter) kultiviert. Die erhaltenen Zellen wurden geerntet, gewaschen und dann in 300 ml 8 M Harnstoff-Lösung suspendiert. Die Menge der kultivierten Zellen war 9,7 g im Trockengewicht.
Nachfolgend wurde die Suspension einer Extraktion über einen Zeitraum von 1 Stunde bei 25ºC unter Rühren unterworfen.
Nach der Extraktion wurde der Überstand mittels Zentrifugation erhalten, so daß die Zellen von der Extraktionslösung entfernt wurden. Anschließend wurde der Überstand gegen 10 mM Phosphat- Puffer (pH 6,0) dialysiert.
Nach der Dialyse wurden die in dem Überstand erzeugten unlöslichen Substanzen mittels Zentrifugation entfernt, so dar eine rohe Zubereitung von extrahierter CA-GTF-I erhalten wurde.
Nachfolgend wurde dieser rohen Zubereitung von extrahierter CA-GTF-I Ammoniumsulfat zugegeben, so dar eine 60 %ige Sättigung und ein Ausfällen erzielt wurden. Das Präzipitat wurde in 20 ml 50 mM Phosphat-Puffer (pH 7,5) gelöst. Die resultierende Lösung wurde gegen 50 ml Phosphat-Puffer (pH 7,5) dialysiert.
Nach der Dialyse wurden unlösliche Substanzen, die während der Dialyse erzeugt worden sind, mittels Zentrifugtion aus der Lösung entfern. Der resultierende Überstand wurde auf eine Säule der Ausmasse 2,5 x 13 cm mit DEAE-Sephacel (Pharmacia) aufgetragen.
Die an der Säule adsorbierten Fraktionen wurden mit einem linearen Konzentrationsgradienten von NaCl in Phosphat-Puffer (pH 7,5) selektiv eluiert.
Jede der Fraktionen wurde mittels des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens auf GTF-Aktivität und mittels Messung der UV- Absorption bei 280 nm auf die Protein-Konzentration untersucht. Auf diese Weise wurde in den Fraktionen mit den NaCl-Konzentrationen von 0,45 - 1,0 M, wie dies in Figur 1 gezeigt wird, eine beträchtliche GTF-Aktivität gefunden.
Die eluierten Fraktionen der NaCl-Konzentrationen von 0,45 - 1,0 M wurden zusammengegeben, gegen 10 mM Phosphat-Puffer (pH 6,0) dialysiert und dann auf eine Säule (1,0 x 13 cm) Hydroxyapatit (Bio Gel HTP, Bio-Rad Laboratories), die zuvor mit 10 mM Phosphat-Puffer (pH 6,0) äquilibriert worden war, aufgetragen.
An der Säule adsorbierte Fraktionen wurden schrittweise mit 0,01 M, 0,2 M, 0,26 M und 0,5 M Phosphat-Puffer (pH 6,0) eluiert.
Jede der Fraktionen wurde wie oben beschrieben auf die GTF-Aktivität und die Protein-Konzentration untersucht. Wie es in Figur 2 dargestellt ist, wurde die GTF-Aktivität in den Fraktionen gefunden, die mit 0,5 M Phosphat-Puffer eluiert worden sind.
Anschließend wurden die Fraktionen mit hoher Aktivität, die mit 0,5 M Phosphat-Puffer eluiert worden sind, zusammengegeben und gegen 10 mM Phosphat-Puffer (pH 6,0) dialysiert, so daß eine Zubereitung des gereinigten Proteins hergestellt wurde.
Tabelle 3 zeigt die GTF-Aktivität, den Protein-Gehalt, die spezifische GTF-Aktivität und die Ausbeute an GTF-aktiven Fraktionen, die in den einzelnen Schritten der Extraktion und Reinigung wie oben beschrieben erhalten wurden. Tabelle 3 Reinigungs schritt Gesamtprotein (mg) Gesamtaktiv. (U) Ausbeute (%) Reinigung (-fach) 8M Harnstoff-Extrakt Ammoniumsulfat (60% Sättigung) DEAE-Sephacel Hydroxyapatit
Wenn diese Zubereitung des gereinigten Enzyms unter den unten beschriebenen Bedingungen auf ein SDS-PAGE (auf dem die Proteine mit Coomassie Blau gefärbt wurden) aufgetragen wurde, wurde eine einzelne Bande an der Position für ein Molekulargewicht von 156 kD beobachtet, was bestätigte, daß die Zubereitung des gereinigten Enzyms ein Protein mit einem Molekulargewicht von 156 kD ist.

Bedingungen für SDS-PAGE:

Die SDS-PAGE wurde nach dem Verfahren von Laemmli et al. durchgeführt.
Das heißt, die Zubereitung des rohen Extraktes und die Zubereitung des gereinigten Enzyms (0,2 - 35 ug) wurden jeweils mit 62,5 mM Tris-HCl-Puffer (pH 6,8), der 2 % SDS, 5 % 2-Mercaptoethanol und 20 % Glycerin enthielt, 3 Minuten lang bei 100ºC behandelt.
Die Elektrophorese wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur bei 10 mA auf einem 7,5 % Acrylamid-Trenngel, das 0,1 % SDS enthielt, und auf einem 4 % Acrylamid-Sammelgel durchgeführt.
Verwendete Standards für das Molekulargewicht waren Ferritin (220 kD), Phosphorylase (94 kD), Rinderserumalbumin (67 kD), Katalase (60 kD), Ovalbumin (43 kD) und Laktatdehydrogenase (36 kd) (alle erhalten von Pharmacia-LKB).
Die Zubereitung gereinigten Enzyms in einer Menge, die 50 mU Enzym-Aktivität entsprach, wurde zu 0,1 M Phosphat-Puffer (pH 6,0) gegeben, der 1 % Sukrose und 0,1 % Natriumazid (jeweils als Endkonzentrationen) enthielt. Dann wurde dieses Gemisch mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 3 ml gebracht. Es wurde gemischt und 18 Stunden lang bei 37ºC umgesetzt. Die enzymatische Reaktion wurde dadurch beendet, dar die Reaktionslösung mittels Eis auf 4ºC abgekühlt wurde.
Nach Beendigung der enzymatischen Reaktion wurde das Reaktionsprodukt bei 1600 x g zentrifugiert. Die präzipitierte, in Wasser unlösliche Fraktion und der überstand wurden getrennt.
Die in Wasser unlösliche Fraktion wurde zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen und dann in 3 ml destilliertem Wasser suspendiert, so dar eine in Wasser unlösliche Glukan-Zubereitung erhalten wurde.
Darüberhinaus wurden 2,5 Volumina Ethanol zu dem Überstand gegeben. Nachdem das Gemisch 1 Stunde lang bei 4ºC stehen gelassen worden war, wurde das erzeugte Präzipitat mittels Zentrifugation bei 1600 x g wiedergewonnen und in 3 ml destilliertem Wasser gelöst. Der Vorgang des Ausfällens wurde auf ähnliche Weise wiederholt, und das wiedergewonnene Präzipitat wurde wiederum in 3 ml destilliertem Wasser gelöst, so dar eine Zubereitung von in Wasser löslichem Glukan erhalten wurde.
Außerdem wurden die Glukane, die in diesen Zubereitungen enthalten waren, mittels des Anthron-Verfahrens quantitativ bestimmt. Die Art der mittels der Zubereitung des gereinigten Enzyms synthetisierten Glukane wurde untersucht. Als Ergebnis zeigte sich, dar die Zubereitung des gereinigten Enzyms CA- GTF-I mit der Fähigkeit zur Synthese von in Wasser unlöslichen Glukanen ist.
Getrennt davon wurde die obige enzymatische Reaktion wiederholt. Das Präzipitat des resultierenden, in Wasser unlöslichen Glukans wurde dann mittels Zentrifugation abgetrennt. Nach dem Waschen des Präzipitats (2 mg) wurde es nach dem Verfahren von Hakomori (Hakomori, S., J. Biochem. 55 205, 1964) vollständig methyliert und mit 90 % (v/v) Ameisensäure und anschließend mit 2 M Trifluor-Essigsäure hydrolysiert. Das resultierende Hydrolysat wurde in Gegenwart von Natriumborhydrid reduziert und in einem Gemisch aus Pyridin/Essigsäureanhydrid (1:1), (v/v) acetyliert, so dar Derivate von partiell methyliertem Alditolacetat erhalten wurden. Dann wurden die resultierenden Derivate mittels Gas-Chromatographie (Modell: GC- 14A, Shimadzu Works) in Kombination mit einer Kapillarsäule (0,25 mm x 30 m), die mit Silikon SPB-5 (Shimadzu Works) beschichtet war, analysiert. Die Derivate des Alditolacetats von Dextran T10 (Pharmacia) wurden auch nach demselben Verfahren wie oben beschrieben hergestellt und als Standardproben verwendet.
Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigten, dar das in Wasser unlösliche Glukan, das in dem oben beschriebenen Verfahren erhalten wurde, 62 Mol % alpha-1,3-verknüpfte, 28 % alpha-1,6- verknüpfte und 5 % alpha-1,3,6-verknüpfte Glukose-Reste enthielt.
Durch Veränderung der Temperatur und des pH-Wertes bei der Bestimmung der GTF-Aktivität, wie es in Beispiel 1 beschrieben worden ist, wurden außerdem das Temperatur- und das pH-Optimum der Zubereitung des gereinigten Enzyms für die Synthese von in Wasser unlöslichen Glukanen untersucht.
Außerdem wurde mittels eines gewöhnlichen Verfahrens auch der km-Wert bestimmt.
Die an Hand der oben beschriebenen Messungen und Untersuchungen erhaltenen Daten sind in Tabelle 4 dargestellt.
Zum Vergleich umfaßt Tabelle 4 auch die entsprechenden Daten für CF-GTF-S, das mittels des Verfahrens von Baba et al. (Carbohydr. Res., 158, 147 - 155, 1986) aus dem Überstand von S. mutans MT 8148-Kulturen, die in einem dialysiertes BHI enthaltenden Medium gezüchtet worden sind, erhalten worden sind. Tabelle 4 Eigenschaft Molekulargewicht (Durchschn.) pH-Optimum km-Wert für Sukrose (mM) Löslichk. d. Glukans in Wasser
* Eine Messung war auf Grund der außerordentlichen Aggregation, die sich in dem Gel bildete, nicht möglich.
Es wurde darüberhinaus mittels Immunoblot mit dem Antiserum, das aus Mäusen zubereitet worden ist, die mit CA-GTF-I gemäß der vorliegenden Erfindung immunisiert worden sind, bestätigt, dar der Antikörper, der zur Reaktion mit der CA-GTF-I gemäß der vorliegenden Erfindung befähigt ist, in dem Antiserum erhalten wurde.
Auf der anderen Seite wurden die antigenen Eigenschaften der CA-GTF-I und CF-GTF-S, erhalten in den oben beschriebenen Verfahren, unter Verwendung des ELISA-Verfahrens untersucht. Zu diesem Zweck wurde aus den Mäusen, die mittels kutaner Injektion mit der CA-GTF-I, erhalten von dem Stamm MT 8148, mit Freund s komplettem Adjuvants (FCA) und mit dem monoklonalen Antikörper, der mit dem das in Wasser lösliches Glukan synthetisierenden Enzym (das mittels des Verfahrens von Sato et al. [Sato, S., Koga, T. und Inoue, M., Carbohydr. Res., 134, 293 - 304, 1984] aus dem Überstand der Kultur des Stammes MT 8148 hergestellt worden ist) reagiert, immunisiert worden sind, das Antiserum der Maus gegen CA-GTF-I hergestellt. Auerdem wurden ein gegen IgA+IgG+IgM-Antikörper der Maus gerichteter Antikörper der Ziege, markiert mit alkalischer Phosphatase, als zweiter Antikörper und Dinatrium-p-nitrophenylphosphat als Substrat verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. Es zeigte sich nämlichl dar das Antiserum der Maus gegen CA-GTF-I mit CF-GTF-S nicht reagiert, und dar der monoklonale Antikörper gegen CF-GTF-S nicht mit CA-GTF-I reagiert. Dies zeigt, dar diese Enzyme verschiedene Antigenizitäten haben. Tabelle 5 Beschichtendes Antigen Extinktion bei 405 nm monoklonaler Antikörper gegen anti-CF-GTF-S Antiserum gegen anti-CA-GTF-I Roh Gereinigt

Beispiel 4

[Zubereitung des Antigens]

S. mutans-Zellen vom Ingbritt-Stamm (Serotyp c, erhalten von dem Department of Dentistry, Osaka University) wurden 18 Stunden lang bei 37ºC in 15 l TTY-Medium gezüchtet. Die gezüchteten Zellen, die so erhalten wurden, wurden zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen.
Dann wurden die gewaschenen Zellen in 400 ml 8 M Harnstoff-Lösung suspendiert. Die Zellsuspension wurde 1 Stunde lang bei 25ºC gerührt. Die Zellsuspension wurde dann zentrifugiert, so dar die Zellen entfernt wurden. Der resultierende überstand wurde gegen 10 mM Phosphat-Puffer (pH 6,0) dialysiert.
Nach der Dialyse wurde das in dem Überstand erzeugte Präzipitat mittels Zentrifugation entfernt. Der resultierende Überstand wurde mit Ammoniumsulfat (60 % Sättigung) präzipitiert. Das erhaltene Präzipitat wurde mittels Zentrifugation wiedergewonnen. Das Präzipitat wurde dann in 10 mM Phosphat-Puffer (pH 6,0) gelöst. Die resultierende Lösung wurde gegen denselben Puffer dialysiert. Das in der Lösung auftauchende Präzipitat wurde mittels Zentrifugation entfernt, so dar ein Überstand erhalten wurde. Der Überstand wurde als rohe (immunantigene) 'Zubereitung verwendet.
Die Protein-Konzentration und das Gesamtprotein der Zubereitung wurden nach dem CBB-G-Verfahren (Branford, M. M., Anal. Biochem., 72 248, 1976) gemessen. Es zeigte sich, daß die Protein-Konzentration 5,1 mg/ml und die Menge an Gesamtprotein 141 mg waren.
Die Zubereitung wurde außerdem einer SDS-Polyacrylamid-Gel- elektrophorese (SDS-PAGE) unterworfen, und zwar bei Bedingungen, wie sie in Beispiel 3 beschrieben sind. Das Anfärben erfolgte mit Coomassie Brilliant Blau (CBB). Als Ergebnis wurden verschiedene Banden einschließlich der Bande, die der Position für 155 kD entspricht, identifiziert.
Getrennt davon wurde die Zubereitung in Tris-HCl-Puffer bei 37ºC 30 Minuten lang behandelt und auf die gleiche Art wie oben beschrieben einer SDS-PAGE unterworfen, außer dar die Temperatur bei der Elektrophorese 4ºC war. Das resultierende Gel wurde 18 Stunden lang bei 37ºC in Phosphat-Puffer (pH 6), der 1 % Sukrose und 0,05 % Natriumazid enthält, getaucht. Dann wurde das eingetauchte Gel herausgenommen und mit PAS (Periodsäure-Schiff'sches) Reagens gefärbt. Als Ergebnis wurde eine anders gefärbte Bande an der Position von 155 kD identifiziert, was die Herstellung von Glukanen demonstriert.
Außerdem war der Gehalt an CA-GTF-I der Zubereitung, wie er an Hand der Ergebnisse der oben beschriebenen SDS-PAGE berechnet wurde, 40 Gew. %.

Beispiel 5

[Herstellung einer Zubereitung gereinigter CA-GTF-I]

Der Ingbritt-Stamm wurde unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 4 in TTY-Medium (8 Liter) gezüchtet. Die resultierenden Zellen wurden geerntet, gewaschen und dann in 300 ml 8 M Harnstoff-Lösung suspendiert.
Dann wurde die Suspension 1 Stunde lang bei 25ºC zum Zweck der Extraktion gerührt.
Nach der Extraktion wurde die Extraktionslösung zentrifugiert, so daß die Zellen entfernt wurden. Der resultierende Überstand wurde gegen 10 mM Phosphat-Puffer (pH 6,0) dialysiert.
Nach der Dialyse wurde das in dem Überstand erzeugte Präzipitat entfernt, so dar eine rohe Zubereitung der extrahierten CA-GTF-I erhalten wurde.
Der rohen Zubereitung des Extrakts wurde dann Ammoniumsulfat zu einer 60 % Sättigung zugegeben, so dar ein Präzipitat erzeugt wurde. Das resultierende Präzipitat wurde außerdem in 20 ml 50 mM Phosphat-Puffer (pH 7,5) gelöst und dann gegen denselben Puffer dialysiert.
Nach der Dialyse wurde das während der Dialyse erzeugte Präzipitat mittels Zentrifugation entfernt. Der resultierende Überstand wurde auf eine Säule (2,5 x 13 cm) DEAE-Sephacel (Pharmacia-LKB) aufgetragen.
Die an die Säule adsorbierten Fraktionen wurden mit einem linearen Konzentrationsgradienten von NaCl in Phosphat-Puffer (pH 7,5) selektiv eluiert.
Die GTF-Aktivitäten aller eluierten Fraktionen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben, eluiert. Die Protein-Konzentrationen wurden mittels Messung der UV-Absorption bei 280 nm bestimmt. Als Ergebnis wurden in den Fraktionen, die mit Konzentrationen von NaCI von 0,45 - 1,0 M eluiert worden sind, deutlich höhere Aktivitäten beobachtet.
Die mit den Konzentrationen von Natriumchlorid von 0,45 - 1,0 M eluierten Fraktionen wurden dann zusammengegeben, gegen 10 mM Phosphat-Puffer (pH 6,0) dialysiert und dann auf eine Säule (1,0 x 13 cm) Hydroxyapatit (Bio Gel HTP , Bio-Rad Laboratories), die zuvor mit 10 mM Phosphat-Puffer (pH 6,0) äquilibriert worden war, aufgetragen.
An die Säule adsorbierte Fraktionen wurden schrittweise mit 0,01 M, 0,2 M, 0,26 M und 0,5 M Phosphat-Puffer (pH 6,0) eluiert.
Die GTF-Aktivität und Protein-Konzentration jeder der Fraktionen wurden mittels der oben beschriebenen Verfahren bestimmt.
Als Ergebnis wurde die GTF-Aktivität in den Fraktionen gefunden, die mit 0,5 M Phosphat-Puffer (pH 6,0) eluiert worden waren.
Dann wurden die besonders aktiven Fraktionen, die mit 0,5 M Phosphat-Puffer (pH 6,0) eluiert worden waren, zusammengegeben und gegen 10 mM Phosphat-Puffer (pH 6,0) dialysiert, so dar eine Zubereitung gereinigten Enzyms erhalten wurde.
Darüberhinaus wurde die Zubereitung des gereinigten Enzyms unter den zuvor genannten Bedingungen einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen. Die Proteine wurden mit CBB angefärbt. Als Ergebnis wurde eine einzelne Bande an einer Position entsprechend einem Molekulargewicht von 155 kD nachgewiesen. Dies bestätigte, dar die Zubereitung des gereinigten Enzyms ein Protein mit einem Molekulargewicht von 155 kD ist.
Außerdem wurden die in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen für die GTF-Messungen derart abgeändert, daß die Zubereitung des gereinigten Enzyms bezüglich des pH-Optimums der GTF-Aktivität, des optimalen Temperaturbereichs für die Reaktion und der Bedingungen für die Inaktivierung untersucht wurde. Als Ergebnis wurde bestätigt, dar die Zubereitung des gereinigten Enzyms, die erhalten wurde, die physikochemischen Eigenschaften (2) bis (4), wie sie zuvor beschrieben wurde, hatte.
Außerdem wurde die Art der Glukane, die durch die Aktivität der Zubereitung des gereinigten Enzyms synthetisiert wurden, nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren unter Verwendung der Zubereitung des gereinigten Enzyms in einer Menge, die 50 mU Enzym-Aktivität entspricht, untersucht. Als Ergebnis zeigte sich, dar die Zubereitung des gereinigten Enzyms CA- GTF-I mit der Aktivität zur Synthese von in Wasser unlöslichen Glukanen war.
Auch die Menge an Protein der resultierenden Zubereitung des gereinigten Enzyms wurde mittels des oben beschriebenen Verfahrens gemessen. Die Menge betrug 9,7 mg.

Beispiel 6

[Zubereitung des Antikörpers]

Eine Emulsion vom Typ W/O wurde durch Mischen von 0,5 ml einer Zubereitung von roher CA-GTF-I (die nach der Messung mittels des CBB-G-Verfahrens 1 mg Protein enthielt), die in Beispiel 4 hergestellt worden ist, und 0,5 ml FCA (Freundsches komplettes Adjuvants) in einem Verhältnis von 1:1 hergestellt.
Die erste Immunisierung erfolgte mittels Injektion von 0,5 ml jeder der Emulsionen in die rechten und linken Seiten des Brustmuskels von Hühnern. Anschließend wurde der Antikörper- Titer von WSF (wird nachfolgend erklärt), aus Eiern erhalten, mittels des unten beschriebenen Verfahrens bestimmt. Seine Veränderungen wurden beobachtet.

(1) Verfahren zur Isolierung von Antikörper aus Eiern:

Ein von Eiern abgetrenntes Eidotter wurde mit demselben Volumen PBS (mit Phosphat gepufferte, physiologische Kochsalzlösung, pH 7,4) und mit 2 Volumina Chloroform gemischt.
Das Gemisch wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, 20 Minuten bei 3000 U/min zentrifugiert, und dann wurde die obere Phase als WSF (in Wasser lösliche Fraktion) verwendet.

(2) Verfahren zur Bestimmung des Antikörper-Titers:

Die Messung des Antikörper-Titers erfolgte mittels ELISA.
Zunächst wurde die rohe Zubereitung des immunisierenden Antigens, die in Beispiel 1 erhalten wurde, auf ein SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen, so dar eine Protein enthaltende Fraktion von dem Bereich des SDS-Polyacrylamidgels isoliert wurde, der einem Molekulargewicht von 155 kD entsprach. Die Isolierung erfolgte mittels der Elektroelution. Dann wurde diese Fraktion auf ein SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen, und eine einzelne Bande in der Position entsprechend dem Molekulargewicht von 155 kD wurde mittels Färben des Gels mit CBB-R 250 nachgewiesen.
Die erhaltene Fraktion wurde in 50 mM Natriumcarbonat-Puffer (pH 9,6) gelöst, so dar die Protein-Konzentration von 1,25 pg/ml erhalten wurde. Aliquots von 100 ul von jeder der resultierenden Lösungen wurden in die Löcher einer 96-Loch-Microtiter-Platte (Immulon 2 , Dynateck) verteilt und über Nacht bei 4ºC inkubiert, so dar das in der Fraktion enthaltende gereinigte Antigen die Platte beschichtete.
Die Platte wurde dann 5 mal mit PBS-T (PBS, das 0,05 % Tween 20 enthielt) (pH 7,4) gewaschen.
Nach dem Waschen wurden die Löcher mit PBS (pH 7,4), das 3 % BSA (Rinderserumalbumin) enthielt, 1 Stunde lang bei 37ºC unspezifisch abgesättigt. Dann wurde die Platte 5 mal mit PBS-T gewaschen.
Anschließend wurden jeweils 100 ul der zuvor erhaltenen WSF, die in zwei Schritten mit PBS-T verdünnt worden war, in jedes der Löcher gegeben und 1 Stunde lang bei 37ºC umgesetzt.
Nach Beendigung der Reaktion wurde die Platte 5 mal mit PBS-T gewaschen, und 100 ul Peroxidase-konjugierter Anti-Hühnchen IgG-Antikörper (Proteingehalt 1,67 ug/ml) wurden in jedes Loch auf der Platte gegeben. Die Platte wurde 30 Minuten bei 25ºC inkubiert und dann 5 mal mit PBS-T gewaschen.
Dann wurden zu jedem Loch der Platte 100 ul einer Lösung gegeben, die dadurch hergestellt worden war, dar 20 mg o-Phenylendiamin und 10 ul Peroxid als Substrate in 50 ml 0,2 M Dinatriumphosphat-0,1 M Citratsäure-Puffer (pH 5,0) gelöst worden waren. Die Reaktion wurde durch 20 minütige Inkubation bei 25ºC ausgeführt und dann durch Zugabe von 100 Pl 3 N Schwefelsäure-Lösung beendet.
Nach der Reaktion wurde der Antikörper-Titer mittels der optischen Dichte (OD&sub4;&sub9;&sub2;) jedes Loches gemessen. Der Antikörper-Titer wurde an Hand des Endpunkt-Titer-Verfahrens als die Verdünnung eingeschätzt, die die optische Dichte von 0,2 ergibt.
Im Anschluß daran wurde dadurch, dar bestätigt wurde, daß der Antikörper-Titer in dem Eigelb 8 Wochen nach der ersten Immunisierung abzunehmen begann, wie es in Figur 1 gezeigt ist, die zweite Immunisierung auf dieselbe Weise wie zuvor vorgenommen.
Die Eier wurden etwa 1 Monat nach der zweiten Immunisierung gesammelt, und der Antikörper-Titer wurde mittels des oben beschriebenen Verfahrens bestimmt.
Als Ergebnis wurde 12 Wochen nach der ersten Immunisierung (4 Wochen nach der zweiten Immunisierung) eine WSF mit einem Antikörper-Titer von 8,4 x 10³ erhalten.
Die Protein-Konzentration der WSF mit dem Antikörper-Titer von 8,4 x 10³ (13 ml, hergestellt aus 13 ml Eidotter) wurde mittels des Biuret-Verfahrens gemessen. Das Ergebnis war eine Gesamtproteinmenge in der WSF von etwa 26 mg (etwa 2,0 mg/ml x 13 ml).

Beispiel 7

[Bestätigung der Inhibition der Haftung von S. mutans an glatte Oberflächen durch Antikörper]

Als Modellversuch bezüglich der Adhäsion von S. mutans an Zahnoberflächen wurde das Experiment bezüglich der Adhäsion an Glasoberflächen durchgeführt.
Das Experiment wurde nämlich derart geplant, dar das Ausma(3 der Inhibition der Adhäsion von S. mutans an die Glasoberflächen auf Grund der Zugabe des in Beispiel 6 erhaltenen Antikörpers ermittelt wurden Das Verfahren ist unten beschrieben.
Zunächst wurden die in Beispiel 6 erhaltenen WSF mit einem Antikörper-Titer von 8,4 x 10³ und eine 10fache Verdünnung davon als Test-Lösungen verwendet.
Getrennt davon wurde die WSF aus Eiern von nicht-imrnunisierten Hühnern (Hühner derselben Art, wie sie in Beispiel 5 verwendet worden waren) auf dieselbe Weise wie in Beispiel 6 hergestellt und als eine Test-Lösung verwendet. Es wurde bestätigt, dar diese WSF nicht spezifisch mit CA-GTF-I reagiert.
Dann wurden jeweils 1 ml dieser Test-Lösungen in Test-Röhrchen (13 mm x 100 mm) verteilt. Außerdem wurden jeweils 2 ml 1,5- fach konzentrierten BHI-Mediums, das 1,5 % Sukrose enthielt, in die Test-Röhrchen gegeben.
Zu jedem der Test-Röhrchen wurden 0,1 ml der Suspension von S. mutans des Ingbritt-Stammes gegeben, der in BHI-Medium vorkultiviert worden war. Die Test-Röhrchen wurden mit einem Neigungswinkel von 30º 18 Stunden bei 37ºC statisch inkubiert.
Die Zusammensetzungen der Zubereitungen, die in jedem der Test-Röhrchen hergestellt worden sind, sind in Tabelle 6 angegeben.
Nach Beendigung der statischen Inkubation wurde jedes der Test-Röhrchen nach den unten beschriebenen Verfahren behandelt. Das Mab der Adhäsion der Zellen an die Wand der Test-Röhrchen wurde bestimmt.
Nach Beendigung der statischen Inkubation lieb man die Test- Röhrchen (im nachfolgenden als die ersten Test-Röhrchen bezeichnet) vorsichtig rotieren. Die gesamte die Zellen enthaltende Flüssigkeit, die nicht an der Wand des Test-Röhrchens haftete, wurde in einen Satz zweiter Test-Röhrchen transferiert. Dann wurden je 3 ml 50 mM Phosphat-Puffer (pH 6,8) zu den ersten Test-Röhrchen mit den an der Wand haf tenden Zellen gegeben, und man lieb die Röhrchen wiederum rotieren. Nachdem die gesamte Puffer-Lösung, die die abgelösten Zellen enthält, in einen dritten Satz Test-Röhrchen transferiert worden waren, wurden je 3 ml 50 mM Phosphat-Puffer (pH 6,8) zu den resultierenden ersten Test-Röhrchen gegeben.
Darüberhinaus wurden die ersten, zweiten und drit;ten Test-Röhrchen einer Ultrabeschallung unterworfen, so daß in allen Test-Röhrchen eine homogene Zellsuspension hergestellt wurde. Die optische Dichte (OD&sub5;&sub5;&sub0;) aller Suspensionen wurde gemessen. Die jeweilige Adhäsionsrate wurde wie folgt berechnet:
Adhäsionsrate (%) = Opt. Dichte d. l. Test-Röhrchens x 100 / Summe der opt. Dichten der 1., 2. und 3. Test-Röhrchen
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt. Tabelle 6 Zellsuspension Nr. 3/2fach konzentriertes BHI-Medium, enthaltend 1,5 % Sukrose WSF l0fach verdünnte WSF WSF aus Eiern nichtimmunisierter Hühner Bakterien-Zellen (Vorkultur d. S. mutans-Stamms Ingbritt in BHI) Adhäsionsrate (%)

Beispiel 8

Der Antikörper wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellt, außer daß die Zubereitung von gereinigtem CA-GTF-I, die in Beispiel 5 erhalten wurde, als das Antigen verwendet wurde. Als Ergebnis wurde ein Antikörper erhalten, der auf ähnliche Weise zur spezifischen Reaktion mit CA-GTF-I in der Lage war.
Außerdem wurde der erhaltene Antikörper auf seine prophylaktische Wirkung bezüglich der Haftung der Bakterien untersucht. Dies erfolgte auf die gleiche Weise wie in Beispiel 7 beschrieben, was bestätigte, daß der erhaltene Antikörper eine ähnlich ausgeprägte prophylaktische Wirkung aufwies.

Beispiel 9

Die WSF mit dem Antikörper-Titer von 8,4 x 10³, die in Beispiel 6 erhalten wurde, wurde in einer Menge von 0,5 Gew. % zu einem Gemisch der in Tabelle 7 angegebenen Zusammensetzung gegeben, so daß eine Zahnpasta hergestellt wurde. Außerdem wurde diese WSF auch zu der Lösung gegeben, die die in Tabelle 8 angegebene Zusammensetzung aufweist, so dar ein Mundwasser hergestellt wurde.
Um genauer zu sein, wurde eine Lösung, hergestellt durch Lösen von 1,2 Gew. % Carboxymethylcellulose und 0,1 Gew. % Natriumsaccharinat in destilliertem Wasser, zu 42 Gew. % Calciumpyrophosphat gegeben, so dar ein Gemisch erhalten wurde. Diesem Gemisch wurden weiterhin 15 Gew. % Glycerin, 10 Gew. % Sorbit, 2 Gew. % Natriumlaurylsulfat, 1 Gew. % Duftstoff und 0,5 Gew. % WSF zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde dann mittels einer Knetmaschine oder eines Mischrührers gemischt und gerollt, so dar eine Zusammensetzung einer Zahnpasta, wie sie in Tabelle 7 dargestellt ist, erhalten wurde. Nachdem die Blasen aus der Zusammensetzung entfernt worden waren, wurde die Zusammensetzung in Röhrchen abgefüllt.
Getrennt davon wurden 1 Gew. % Parfüm und 0,3 Gew. % Lauryldiethanolamid in 22,5 Gew. % Ethanol gelöst. Der resultierenden Lösung wurde eine Lösung zugesetzt, hergestellt durch Lösen von 0,05 Gew. % Natriumsaccharinat und 0,5 Gew. % WSF in destilliertem Wasser, so dar ein Gemisch erhalten wurde. Auerdem wurde destilliertes Wasser zu dem Gemisch gegeben, so dar ein Mundwasser mit der in Tabelle 8 dargestellten Zusammensetzung erhalten wurde. Tabelle 7 Bestandteil Konzentration (Gew. %) Calciumpyrophosphat Glycerin Sorbit (70 %) Carboxymethylcellulose Natriumsaccharinat Natriumlaurylsulfat Parfüm Wasser Rest Tabelle 8 Bestandteil Konzentration (Gew. %) Ethanol Natriumsaccharinat Lauryldiethanolamid Parfüm Wasser Rest

Claims

1. Isolat der zell-assoziierten Glucosyltransferase, das die folgenden physikochemischen Eigenschaften aufweist:

a) die Fähigkeit, bei der Synthese Wasser unlöslicher Glukane mit Sukrose zu reagieren;

b) ein pH-Optimum zwischen 6,7 und 7,0;

c) ein Temperatur-Optimum zwischen 15 und 50ºC;

d) einen Aktivitätsverlust durch 5minütige Hitzebehandlung bei 80 ºC;

e) ein Molekulargewicht von 150 bis 165 kD, ermittelt mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese; und

f) Immunogenizität gegenüber Tieren, die die Produktion spezifischer Antikörper für das Isolat herzustellen ermöglicht.

2. Vertahren zur Isolierung und Reinigung des lsolats der zell-assoziierten Glucosyltransferase nach Patentanspruch 1, das die folgenden Schritte umfaßt:

a) Streptococcus mutans - Zellen des Serotyps c, e oder f die die zell-assoziierte Glucosyltransferase haben, mit einem extrahierenden Lösungsmittel in Berührung zu bringen, so daß die zell-assoziierte Glucosyltransferase aus den Zellen freigesetzt und ein Extrakt gebildet wird, der die so freigesetzte zell-assoziierte Glucosyltransferase enthält;

b) den Extrakt mit einem Anionen-Austauscher fit Diethylaminoethyl-Gruppen als funtionelle Gruppen zur Adsorption der zell-assoziierten Glucosyltransferase auf dem Anionen-Austauscher in Berührung zu bringen und mit einem Salz-Konzentrationsgradienten von 0,45 - 1,0 M in einem Phosphat-Puffer eines pH-Wertes von etwa 7,5 eine die zell-assoziierte Glucosyltransferase enthaltende Fraktion zu eluieren;

c) die von dem Anionen-Austauscher eluierte Fraktion zur Adsorption der zell-assoziierten Glucosyltransferase auf Hydroxyapatit mit diesem in Berührung zu bringen, den Hydroxyapatit mit einem Phosphat-Puffer eines pH-Werts von etwa 6,0 und einem Konzentrationsgradienten von 0,01 M - 0,26 M zu waschen und die zell-assoziierte Glucosyltransferase mittels 0,5 M Phosphat-Puffer eines pH-Wertes von etwa 6,0 von dem Hydroxyapatit zu eluieren; und

d) die eluierte, zell-assoziierte Glucosyltransferase zu aufzufangen.

3. Verfahren zur Herstellung des Isolats der zell-assoziierten Glucosyltransferase gemäß Patentanspruch 1, die bei der Synthese von in Wasser unlöslichen Glukanen enzymatisch aktiv ist, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:

einen S. Mutans-Serotyp c, e oder f, der zur Herstellung von zell-assoziierter Glucosyltransferase, die die Synthese von in Wasser unlöslichen Glukanen aus Sukrose katalysiert, fähig ist, zu kultivieren; und das Isolat der zell-assoziierten Glucosyltransferase aus den kultivierten Zellen herzustellen.

4. Antikörper, der aus Eiern hergestellt wird, die wiederum von Hühnern gelegt worden sind, die mit dem Isolat der zell-assoziierten Glucosyltransferase gemäß Patentanspruch 1 immunisiert worden sind, und der gegenüber den S. Mutans-Serotypen c, e oder f, die den Karies der Zähne verursachen, eine immunologische Aktivität aufweist.

5. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, der gegenüber den S. Mutans-Serotypen c, e oder f die den Karies der Zähne verursachen, eine immunologische Aktivität aufweist, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:

Hühner mit einem lsolat der zell-assoziierten Glucosyltransferase gemäß Patentanspruch 1 zu immunisieren; und aus Eiern der immunisierten Hühner Immunglobuline mit immunologischer Aktivität gegen die Glucosyltransferase herzustellen.

6. Zusammensetzung zur Prophylaxe von Karies der Zähne, die einen Antikörper gemäß Patentanspruch 4 als wirksamen Bestandteil umfaßt.

7. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Prophylaxe von Karies der Zähne, das den Schritt umfaßt, einen Antikörper gemäß Patentanspruch 4 zumindest mit einem Träger zu mischen.