JPH01190635A - 抗体およびそれを有効成分とするう蝕予防剤、並びにこれらの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、う蝕を誘発する病原菌であるストレプトコッ
カス・ミュータンス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕ
ｔａｎｓ）に対して免疫活性を有する抗体及び該抗体を
有効成分として含もう蝕子防剤に関する。

［従来の技術］ う蝕の発生において、Ｓ、、　ｍｕｔａｎｓの歯面への
付着過程が重要な役割を果していることが既に知られて
おり、Ｓ−、ｍｕｔａｎｓの口腔内への定着（特に歯面
への付着）を制御して、う蝕を予防しようとする種々の
試みがなされている。

例えば、Ｓ−、ｍｕｔａｎｓに対する免疫活性を有する
抗体を用いたう蝕予防方法が知られており、英国特許第
１５０５５１３号明細書には、Ｓ、　ｍｕｔａｎｓの菌
体で免疫した牛から得られた母乳をＳ、　ｍｕｔａｎｓ
の口腔内への定着の制御に用いる方法が、また特開昭６
０−３８３２７号公報には、Ｓ、　ｍｕｔａｎｓの培養
から得た細胞壁等の両分を哺乳動物に免疫することによ
って得られた抗血清及び／または乳と、グルコシルトラ
ンスフェラーゼインヒビター、プロテアーゼ及びデキス
トラナーゼからなる群より得らばれる１種以上のシネル
ギストとを組み合せたう蝕子防剤が記載されている。

［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、従来の旦、　ｍｕｔａｎｓに対する免疫
活性を有する抗体のう蝕予防効果は必ずしも十分ではな
く、また、従来の抗体は、免疫した哺乳動物の乳やその
抗血清から調製されるので、量産性に欠け、生産コスト
も高いなどの欠点を有し、実用的でない場合が多い。

本発明者らは、このような従来技術における問題を解決
すべく種々の検討を行なった結果、鶏を用いた抗体の調
製法に、後述の理化学的特性を有するＳ、　ｍｕｔａｎ
ｓの菌体結合型グルコシルトランスフェラーゼを抗原と
して組合せて用いることに−よって、Ｓ、　ｍｕｔａｎ
ｓの歯面への付着に対する十分な阻害効果を有し、上述
したような欠点のない抗体を調製し得るとの新たな知見
を得るに至り、本発明を完成した。

なお、鶏を用いた抗体の調製においては、抗原の種類に
よっては必ずしも十分な抗体価が得られるとは限らない
０例えば、ウィルスを抗原として用いたところ十分な抗
体価が得られなかった。

従って、菌体結合型グルコシルトランスフェラーゼで鶏
を免疫して、十分に高い抗体価を有する抗体が得られる
という知見は、本発明者らにより始めて得られたもので
ある。

本発明の目的は、Ｓ４．　ｍｕｔａｎｓに対する免疫活
性を示し、Ｓ、　ｍｕｔａｎｓの歯面へ付着に対する十
分な阻害効果を有し、量産性にも優れ、生産コストが低
く、う蝕子防剤の有効成分として有用な抗体及び該抗体
を含むう蝕子防剤を提供することにある。

［課題を解決するための手段］ 本発明の引ｍｕｔａｎｓに対する免疫活性を有する抗体
は、下記理化学的特性を有する血清型がｃ、　ｅまたは
ｆであるＭ、　ｍｕｔａｎｓの菌体結合型グルコシルト
ランスフェラーゼ（以後ＣＡ−ＧＴＦ−１と略称する）
を免疫した鶏が産生ずる卵より調製された免疫グロブリ
ンとして得ることができる。

■作用及び基質特異性； スクロースに作用し、水に不溶性のグルカンを合成する
。

■至適ｐＨ。

ｐＨ６，７〜７．０ ■作用適温の範囲； １５〜５０℃ ■失活の条件 ８０℃、５分間の処理で失活する。

■分子量； ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定し
た分子量が、１５０に−１６５にダルトンである。

■免疫原性； 動物において免疫原となり、該酵素に対する特異抗体を
生成させ得る。

なお、上記５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は以下の操作に従って行なったもの
である。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ操作条件： ５ＤＳ−ＰＡＧＥはレムリー（Ｌａｅｍｍｌｉｌらの方
法により行なう。

すなわち、後述の粗抽出標品または精製標品（０，２〜
３５μｇ）を個々に２％ＳＤＳ、５％２−メルカプトエ
タノール及び２０％グリセロールを含む６２．５ｍＭの
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ６，８）中で１（１０℃、３分
間処理する。

電気泳動は、０．１％のＳＤＳを含む７．５％の分離ゲ
ルと、４％の濃縮ゲル中、室温下、！ＯｍＡ、２時間の
条件で行なう、なお、分子量マーカーとしては、フェリ
チン（ｆｅｒｒｉｔｉｎ１２２０にダルトン）、ホスフ
ォリラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ　。

９４にダルトン）、牛血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅｓ
ｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ　、　６７にダルトン）、カ
タラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ、　６０にダルトン）、オ
ブアルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ　、　４３にダルト
ン）および乳酸脱水素酵素（ｌａｃｔａｔｅ　ｄｅｈｙ
ｄｒｏｇｅｎａｓｅ、３６にダルトン）（いずれもファ
ルマシア社製）を用い、バンドの検出はクマシ　ブリリ
アント　ブルー　（ＣＢＢ）による染色によって行なう
ことができる。

また、ＣＡ−ＧＴＦ−１が水不溶性グルカンを生成する
ことは、例えば以下のような操作により確認できる。

適当量（５０ｍＵ酵素活性量程度）の酵素標品を、最終
濃度で１％スクロース及び０．１％のアジ化ナトリウム
を含む０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）に加え、
蒸留水で３ｍｌに容量を調整した後、混合し、３７℃、
１８時間酵素反応を行なわせ、酵素反応を反応溶液を氷
冷して４℃にすることにより停止させる。

酵素反応終了後、反応生成物を１６００Ｘ　ｇの遠心分
離で処理し、沈殿した水不溶性画分と上清液に分ける。

次に、水不溶性画分を蒸留水で２度洗浄し、３ｍｌの蒸
留水に懸濁して、水不溶性グルカン標品とする。

また、上清液にその２．５倍容量のエタノールを加え、
４℃で１時間放置後、生じた沈殿を１６００ｘｇの遠心
分離で回収し、それを３ｍｌの蒸留水に溶解させ、更に
同様の沈殿処理を再度行なって回収された沈殿を再び３
ｍｌの蒸留水に溶解し水溶性グルカン標品とする。

次に、これらの標品に含まれるグルカンの量をアングロ
ン法により定量分析して該酵素標品の作用によって合成
されるグルカンの種類を調べて、該精製酵素標品が水不
溶性グルカンを合成する作用を有することが確認できる
。

本発明の抗体（以後抗ＣＡ−ＧＴＦ−１抗体と称する）
を得るために用いるＣＡ−ＧＴＦ−１としては、上記特
性を有する酵素であればどのようなものでも利用でき、
例えば以下のようにしてＭ、　ｍｕｔａｎｓの菌体に結
合した状態で生産されたＣＡ−ＧＴＦ−１を菌体から分
離して得ることができる。

すなわち、血清型がＣ％ｅまたはｆ型であるＳ−、ｍｕ
ｔａｎｓを適当な培地で培養し、得られた菌体を集菌し
、必要に応じて洗浄する。

ここで用いるＣ梨園としては、Ｓ、　ｍｕｔａｎｓ　Ｍ
Ｔ８１４８株、Ｉｎｇｂｒｉｔｔ株、１０４４９株等の
公知で、容易に入手可能な菌を用いることができ、例え
ば、旦、　ｍｕｔａｎｓ　Ｍ７８１４８株、Ｉｎｇｂｒ
ｉｔｔ株は大阪大学歯学部から、１０４４９株はナショ
ナル　コ　レクション　オブ　タイプ　カルチャーズ［
ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｙｐ
ｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　（ＮＣＴＣ）］から入手できる
。また、ｅ型閉やｆ梨園についても公知の菌株を同様に
入手して用いれば良い。

また、培地としては、少なくともグルコースを含む培地
が利用でき、例えば、ＴＴＹ培地（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓ
ｅ％Ｔｒｙｐｔｏｓｅ、Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔの
複合培地）　、Ｂ　ＨＩ　（Ｂｒａｉｎ　Ｈｅａｒｔ　
Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培地、ＦＭＣ培地などを用いること
ができる。

また、培養温度は、菌体増殖が得られ、かつＣＡ−ＧＴ
Ｆ−１の生産に適した範囲内であれば良いが、良好な菌
体増殖とＣＡ−ＧＴＦ−１の生産という点からは、通常
３７℃程度とすると良い。

また、培養時間は、培養温度、培地の種類等の培養条件
によって異なるが、ＣＡ−ＧＴＦ−１の最適収量に達す
る時期を選択して決定すれば良く、通常１８〜２０時間
程度とすれば良い。

また、その他の培養条件についても、上記の観点から適
宜選択すれば良い。

次に、菌体からＣＡ−ＧＴＦ−Ｉを抽出する。

菌体からのＣＡ−ＧＴＦ−１の抽出は、尿素溶液、グア
ニジン塩酸溶液などの抽出用溶液と菌体とを接触させる
方法などにより行なうことができる。

抽出用溶液中の懸濁菌体濃度、抽出用溶液の濃度、抽出
の温度および時間等の抽出条件は、目的とする酵素の十
分な抽出が可能であるように、用いる抽出用溶液の種類
等に応じて適宜選択して設定すれば良い。

なお、高比活性の抽出物を高回収率で得るという点から
は、好ましくは６〜ＩＯＭ、より好ましくは８Ｍの尿素
溶液を用いた、好ましくは２０〜３０℃、より好ましく
は２５℃で、１５分〜２時百程度の処理を行なうと良い
。

抽出操作が終了したところで、抽出液から菌体等の固形
物を遠心分離法などの方法により除いた後、これを透析
、限外濾過、ゲル濾過等の手段で処理して尿素や低分子
量の不純物等を該抽出液から除去して、ＣＡ−ＧＴＦ−
１粗抽出標品を得ることができる。

なお、この透析等の処理の際に沈殿が生じた場合には、
それを遠心分離法などの手段によって除去すれば良い。

更に、粗抽出標品な、精製してＣＡ−ＧＴＦ−１精製標
品を得ることができる。

この精製には、通常酵素の精製に用いられている各種の
精製方法を用いることができるが、例えば以下に述べる
陰イオン交換体を用いた吸着法と、ヒドロキシアパタイ
トを用いた吸着法を組み合せた方法が好適に適用できる
。

粗抽出標品の精製に用いる陰イオン交換体としては、ジ
エチルアミノエチル［Ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈ
ｙｌ（ＤＥＡＥ）　］等の官能基を有する陰イオン交換
体が利用でき、具体的には、ＤＥＡＥ−セファセル（Ｄ
ＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ、ファルマシア社製）などを
挙げることができる。

また、ヒドロキシアパタイトとしては、Ｂｌｏ−Ｇｅ１
　ＨＴＰ　　［バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　）社製
］等を用いることができる。

陰イオン交換体を用いた精製処理は、粗抽出標品に含ま
れる抽出物（粗タンパク質）を陰イオン交換体に接触さ
せた後、陰イオン交換体に吸着した画分から、目的とす
る酵素を含む両分を選択的に溶出させて分画することに
よって行なうことができる。

目的とする酵素を含む両分は、例えば溶出液の塩濃度を
調節することによって得ることができる。

この塩濃度は、用いる陰イオン交換体の種類や溶出条件
等に応じて異なるが、ＧＴＦ（−１）活性を有する両分
を選択的に分画できる濃度範囲を選択して決定すれば良
い。

例えば、ＤＥＡＥ−セファセルを用いた場合には、リン
酸緩衝液中のＮａＣ１濃度が０．４５〜１．０Ｍの範囲
でＧＴＦ（−１）活性を有する画分な得ることができる
。

なお、陰イオン交換体と接触させる試料は、粗抽出標品
から硫安、エタノール沈殿等の塩の溶液や有機溶媒を用
いた沈殿法などによって得た沈殿粗タンパク質を、遠心
分離法等により回収した後に、適当な溶媒に溶解し、こ
れを必要に応じて透析等で処理して該沈殿物から低分子
量の不純物を除くことによって調製することができる。

陰イオン交換体での処理が終了したところで、ＧＴＦ（
−１）活性を有する画分を集め、これを透析等の手段で
脱塩処理した後、ヒドロキシアパタイトと接触させる。

次に、ヒドロキシアパタイトに吸着した画分からＣＡ−
ＧＴＦ−１を選択的に分離溶出させて、ＣＡ−ＧＴＦ−
１画分を得、該画分を必要に応じて透析等で処理して、
ＣＡ−ＧＴＦ−１精製標品を得ることができる。

このようにして得られたＣＡ−ＧＴＦ−１精製標品は、
５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分子量１５０ｋＮ１６５にダ
ルトンに相当する位置に単一バンドを与える。

なお、ＣＡ−ＧＴＦ−Ｉの酵素活性は、［ＩＣ−グルコ
ース］スクロース（［”Ｃ−ｇｌｕｃｏｓｅｌｓｕｃｒ
ｏｓｅ）を基質として反応させた際に生成されるグルカ
ンへの放射能の取り込み量を計測することにより測定で
きる。

抗体を得るための抗原として、以上の操作で得られた菌
体からの抽出物もしくは粗精製標品などに含まれた状態
のＣＡ−ＧＴＦ−Ｉ　、または精製標品として得られた
ＣＡ−ＧＴＦ−Ｉ等を用いることができる。

次に、本発明の抗ＣＡ−ＧＴＦ−Ｉ抗体の調製方法につ
いて詳述する。

本発明の抗ＣＡ−ＧＴＦ−Ｉ抗体は、上述のＣＡ−ＧＴ
Ｆ−１で免疫した鶏の卵から調製することができる。

免疫される鶏としては、特に制限はないが、抗体の量産
性という点からは、白色レグホーン等の卵用種を用いる
と良い。

また、ＣＡ−ＧＴＦ−Ｉによる免疫方法としては、皮下
注射、腹腔内投与、筋肉注射等による通常の方法や、点
鼻、点眼等の方法によって行なうことができる。更に、
ＣＡ−ＧＴＦ−１の投与量は、所望の抗体価が得られ、
かつ鶏に対して悪影響を与えない量を適宜選択して用い
れば良い。

通常、初回免疫から数週間で投与抗原に対して特異的に
反応する抗体が卵（卵黄）中に得られる。

なお、必要に応じて例えばＦＣＡ　（フロイント完全ア
ジュバント）、ＦＩＡ（フロイント不完全アジュバント
）などのアジュバントをＣＡ−ＧＴＦ−１と併用しても
良い。

免疫から約１箇月以上経過した鶏から採取した卵から本
発明の抗ＣＡ−ＧＴＦ−Ｉ抗体を調製することができる
。

なお、卵黄中の抗体価は、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ
）、ラジオ身ムノアッセイ等を用いて測定することがで
き、免疫後に２週程度の間隔で抗体価を測定することに
より抗体価の推移を追跡できる。

後述の実施例においては、ＥＬＩＳＡでの測定により抗
体価の推移を追跡し、抗体価が十分に上昇した段階の卵
を採取して、本発明の抗ＣＡ−ＧＴＦ−Ｉ抗体を調製し
た。

また、通常、約３箇月間にわたって高抗体価を得ること
ができる。

なお、免疫後、抗体価の減少が見られた場合、適当な間
隔で適宜追加免疫することにより抗体価を高くすること
ができる。

本発明の抗ＣＡ−ＧＴＦ−１抗体は、例えば上記のよう
にして免疫した鶏の卵黄に含まれる免疫グロブリンを抽
出・分離することによって得ることができる。

この抽出・分離方法としては、例えば、デキストラン硫
酸やポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いた沈殿法
や、プロパツールやクロロホルムを用いた抽出法など通
常用いられている免疫グロブリンを抽出・分離できる種
々の方法等が利用できる。

以上のようにして得られた本発明の抗ＣＡ−ＧＴＦ−■
抗体は、！、　ｍｕｔａｎｓの菌体に結合して存在する
ＣＡ−ＧＴＦ−１に対して特異的に抗体として反応する
。すなわち影ｍｕｔａｎｓに対して免疫活性を有する。

影ｍｕｔａｎａに対して免疫活性を有する本発明の抗Ｃ
Ａ−ＧＴＦ−１抗体は、影ｍｕｔａｎｓの歯面への付着
を阻害する効果を有し、該抗体を口腔内に投与すること
によって、旦、　ｍｕｔａｎｓの口腔内での活動を制御
し、う蝕を予防することができる。

本発明のう蝕子防剤は、上述の抗ＣＡ−ＧＴＦ−１抗体
を有効成分として含み、その口腔への投与形態に応じて
種々の形に調製される。

例えば、マウスウォッシュや練り歯磨き等として利用す
る場合には、各種成分を用いてこれらを調製する際に、
本発明の抗ＣＡ−ＧＴＦ−１抗体の有効量を含有させれ
ば良い。

抗ＣＡ−ＧＴＦ−Ｉ抗体のう蝕子防剤への配合量は、そ
の投与形態に応じた投与量に従って適宜選択すれば良く
、例えば、１０３以上の抗体価を有する抗体を０．００
０１−１０重量％程度とすることができる。

［実施例］ 以下実施例により本発明を更に詳細に説明する。なお、
以下における％表示は、特に指定されていない場合には
、重量／容量％を示す。

実施例１ （抗原の調製） Ｓ、ｍｕｔａｎｓ　　Ｉｎｇｂｒｉｔｔ株（血清型Ｃ１
大阪大学歯学部から入手）を１５Ｉ２のＴＴＹ培地で３
７℃、１８時間培養し、得られた培養菌体を生理食塩水
で２度洗浄した。

゛　　次に、洗浄菌体を４００ｍρの８Ｍ尿素溶液に懸
濁した菌体懸濁液を、２５℃で１時間攪拌処理した。

その後、この菌体懸濁液から遠心分離法により菌体を除
去し、得られた上清液を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６
，０）に対して透析した。

透析終了後、上清液中に生じた沈殿物を遠心分離法によ
り除去した後、該上清液に対して６０％飽和の硫安沈殿
処理を行ない、得られた沈殿物を遠心分離法により回収
した０次にこの沈殿物を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６
，０）に溶解した溶液を同様の緩衝液に対して透析し、
更に該溶液中に生じた沈殿を遠心分離法により除去して
上清液を得た。この上清液を粗精製（免疫抗原）標品と
した。

該標品のタンパク質濃度及びタンパク質全量をＣＢＢ−
Ｇ法（Ｂｒａｎｆｏｒｄ、Ｍ、Ｍ、、　Ａｎａｌ、　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、。

７２．２４８　（１９７６）］により測定したところ、
タンパク質濃度が５．１ｍｇ／ｍβ、タンパク質全量力
月４１ｍｇであった。

更に、該標品を前述の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけ、クマシ　ブリリ
アント　ブルー（ＣＢＢ）での染色を行なったところ、
１５５にダルトンの位置のバンドを含む数個のバンドが
検出された。

これとは別に、該標品をトリス塩酸緩衝液中での処理を
３７℃、３０分で行ない、かつ電気泳動を４℃で行なう
以外は前述と同様の操作による５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけ
た後、ゲルを３７℃の１％スクロース及び０．０５％ア
ジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）中に
１８時間浸漬した０次に、浸漬処理したゲルをＰ　Ａ　
Ｓ　（Ｐｅｒｉｏｄｉｃａｃｉｄ　５ｃｈｉｆｆ）反応
により染色したところ、１５５にダルトンの位置にグル
カンの生成を示す顕著な染色バンドが検出された。

また、上記の５ＤＳ−ＰＡＧＥの結果から算出された該
標品中のＣＡ−ＧＴＦ−１含有率は４０重量％であった
。

実施例２ （ＣＡ−ＧＴＦ−１精製標品の調製） 実施例１と同様の条件で、Ｉｎｇｂｒｉｔｔ株をＴＴＹ
培地（８β）で培養し、得られた菌体を集菌、洗浄し、
それを３００ｍβの８Ｍ尿素溶液に懸濁した。

次に、該懸濁液を２５℃、１時間攪拌して抽出を行なっ
た。

抽出処理終了後、抽出液から菌体な遠心分離法により除
去して得た上清液を、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，
０）に対して透析した。

透析終了後、上清液中に生じた不溶物を遠心分離法によ
り除去し、ＣＡ−ＧＴＦ−１粗抽出標品を得た。

次に、粗抽出標品から６０％飽和の硫安による沈殿物を
調製し、この沈殿物を更に２０ｍＩ２の５０ｍＭリン酸
緩衝液（、ｐＨ７，５）に溶解させ、同緩衝液に対して
透析した。

透析終了後、透析処理中に生じた不溶物を溶液から遠心
分離法により除去したのち、その上清液をＤＥＡＥ−セ
ファセル（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ　、ファルマシ
ア社製）の２．５　Ｘ１３ｃｍのカラムにかけた。

カラムに吸着した両分は、リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）
中のＮａＣ１の濃度勾配によって選択的に溶出させた。

溶出された各画分のＧＴＦ活性を以下に記載した方法で
、またタンパク質含量を２８０ｎｍの紫外吸収法で測定
したところ、０．４５〜１．０ＭのＮａＣｌ濃度画分中
に顕著なＧＴＦ活性が認められた。

ＧＴＦ活性の測定； 試料ｌＯμβを、基質としての２０ｍＭの［１４（−グ
ルコース］スクロース（［Ｉ４Ｃ−ｇｌｕｃｏｓｅｌｓ
ｕｃｒｏｓｅ）（０，０５Ｃｉ／ｍｏ１）を含む０．２
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）のｌＯμβと混合し、３
７℃で１時間反応後、反応液全量を濾紙（１，ＯＸ２．
Ｏａｍ）にスポットし、これをメタノールで洗浄後、濾
紙上に残ったメタノールに不溶性のグルカン中に取り込
まれた放射能量を測定し、ＧＴＦ活性を算出し、１分間
に１μｍｏｌのグルコースをグルカンに転移させる活性
を１単位（Ｕ）とした。

次に、０．４５〜１．０ＭのＮａＣｌ濃度による溶出画
分を集め、それを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ）１６．０
）に対して透析し、次いで１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ）
１６．０）で平衡化したヒドロキシアパタイト［Ｂｉｏ
　Ｇｅｌ　ＨＴＰ　。

バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　）社製］のカラム（１
，ＯＸ　１３ｃｍ）にかけた。

カラムに吸着した画分は、０．０１Ｍ　、０．２Ｍ、　
０．２６Ｍおよび０．５Ｍのリン酸緩衝液（ｐ）１６．
０１でそれぞれ溶出させた。

各両分の、ＧＴＦ活性およびタンパク質含量を上述と同
様の方法で測定した結果、０．５Ｍのリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，０）による両分中にＧＴＦ活性が認められた。

次に、０．５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ）Ｉ６．
０）による高活性を示す溶出画分を集め、それを１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）に対して透析し、精製酵
素標品を得た。

更に、この精製酵素標品を前述の条件の５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにかけ、ＣＢＢでタンパク質を染色したところ、分子
量１５５にダルトンの位置に単一のバンドが検出され、
該精製酵素標品が分子量１５５にダルトンの酵素タンパ
ク質であることが確認された。

また、該精製酵素標品を用いて、常法により該酵素のＧ
ＴＦ活性の至適ｐＩ（、作用適温の範囲、失活の条件を
検討したところ、ＣＡ−ＧＴＦ−Ｉが先に示した理化学
的特性■〜■を有することが確認された。

更に、５０ｍυ酵素活性量に相当する量の精製酵素標品
を、最終濃度で１％スクロース及び０．１％のアジ化ナ
トリウムを含む０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）
に加え、蒸留水で３ｍｌに容量を調整した後、混合し、
３７℃、１８時間酵素反応を行なわせた。なお、酵素反
応は、反応溶液を氷冷して４℃にすることにより停止さ
せた。

酵素反応終了後、反応生成物を１６００Ｘｇの遠心分離
で処理し、沈殿した水不溶性画分と上溝液に分けた。

水不溶性画分は蒸留水で２度洗浄し、３ｍｌの蒸留水に
懸濁して、水不溶性グルカン標品とした。

また、上清液にその２．５倍容量のエタノールを加え、
４℃で１時間放置後、生じた沈殿を１６００ｘｇの遠心
分離で回収し、それを３ｍｌの蒸留水に溶解させ、更に
同様の沈殿処理を再度行なって回収された沈殿を再び３
ｍｌの蒸留水に溶解し水溶性グルカン標品とした。

更に、これらの標品に含まれるグルカンの量をアンスロ
ン法により定量分析して該精製酵素標品の作用によって
合成されるグルカンの種類を調べたところ、該精製酵素
標品は水不溶性グルカンな合成する作用を有するＣＡ−
ＧＴＦ−Ｉであることが明らかとなった。

なお、得られた該精製酵素標品のタンパク質量を上述の
方法で測定したところ、９．７ｍｇであった。

実施例３ （抗体の調製） ゛　実施例１で得た粗精製免疫抗原標品０．５ｎｌ　（
ＣＢＢ−Ｂ法で測定した場合の１ｍｇタンパク質量を含
む）とＦＣＡ　（フロイント完全アジュバント）０．５
ｍβを１：１の割合で混合してＷ２Ｏ型のエマルジョン
とした。

得られたエマルジョンを鶏の左右の胸筋に０．５ｍｇず
つ注射し、初回免疫を行なった後、下記の方法に従って
、採取した卵から得たＷＳＦ（後述）の抗体価を測定し
、その推移を観察した。

（１）卵からの抗体の取得方法； 卵から分離した卵黄とこれと同容量のＰＢＳ　（リン酸
緩衝液、ｐＨ７，４）を混合し、得られた混合溶液に更
にＰＢＳの２倍容量に相当する量のクロロホルムを加え
てこれをよく攪拌した。

攪拌終了後、混合液を室温下で３０分間放置した後、こ
れを３．００Ｏｒｐｍ　、２０分間の遠心分離にかけ、
最上層の透明画分を回収し、抗体含有画分（Ｗａｔｅｒ
　５ｏｌｕｂｌｅ　Ｆｒａｃｔｉｏｎ、　Ｗ　Ｓ　Ｆ　
）とした。

（２）抗体価の測定方法； 抗体価の測定は、ＥＬＩＳＡよって行なった。

まず、実施例１で得た粗精製免疫抗原標品を５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにかけ、得られた１５５にダルトンに相当する部
分から電気溶出法によりタンパク質を含む両分を分離し
た。なお、この画分を更に５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、Ｃ
ＢＢによる染色を行なったところ、１５５にダルトンに
相当する位置に単一のバンドが検出された。

次に、得られた該画分を、タンパク質濃度が１．２５　
　μｇ／ｍ１２となるように５０−炭酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ９，６）に溶解させて得られた溶液を、９６穴
プレート［イムロン（Ｉｍｍｕｌｏｎ　）　２　、グイ
ナテック社製］の各ウェルに１００μβずつ入れ、４℃
で一晩放置し、該画分に含まれる精製抗原をプレートに
吸着させた。

次に、プレートをＰＢＳ−Ｔ［０，０５％Ｔｗｅｅｎ−
２０含有Ｐ　Ｂ　Ｓ　（ｐ）１７．４　）　］で５回洗
浄した。

洗浄終了後、プレートを３％ＢＳＡ　（牛血清アルブミ
ン）を含むＰＢＳ（ｐＨ７，４）と３７℃で１時間接触
させて、ブロッキングを行なった後、ＰＢＳ−Ｔでプレ
ートを５回洗浄した。

ここで、先に得たＷＳＦのＰＢＳ−Ｔによる２段階希釈
液の１００μ℃を各ウェルに加え、３７℃１時間で反応
を行なわせた。

反応終了後、プレートをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、更に
、プレートに゛２次抗体としてのペルオキシダーゼ結合
抗ニワトリＩｇＧ抗体（タンパク質量１．６７μｓ／ｍ
Ｊ２）の１００ｇｊ２を各ウェルに加え２５℃で３０分
間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄した。

次に、プレートの各ウェルに０．２Ｍリン酸２ナトリウ
ム−０，１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５，０）　５０　ｍ
Ｊ！に基質である０−フェニレンジアミン２０ｍｇ及び
過酸化水素１０μ℃を溶解した溶液を１００μβ加え、
２５℃で２０分間反応させた。反応停止は３Ｎ硫酸溶液
を１００μβ加えることで行なった。

反応終了後、各ウェルの吸光度（００４゜２）を測定す
ることによって抗体価を測定した。抗体価はエンドポイ
ントタ身ター法により求め、吸光度が０．２となる希釈
倍率とした。

次に、第１図に示すように初回免疫後８週後に卵黄中の
抗体価が下がり始めたのを確認して、前回と同様にして
２次免疫を行なった。

２次免疫終了後約１箇月経過後に採卵し、上述の方法に
より抗体価を求めた。

その結果、初回免疫から１２週（２次免疫から４週）経
過後に８．４ＸＩＯ３の抗体価を有するＷＳＦが得られ
た。

なお、該８．４　ＸＩＯ’　＋７）抗体価を示すＷＳＦ
　（１３ｍ１２．１３　ｍｌｌの卵黄から調製）のタン
パク質含有濃度をビューレット法により測定し、該ＷＳ
Ｆ中の全タンパク質量を求めたところ約２６ｍｇという
値を得た（約２．０ｍｇ／　ｍ１２　Ｘ　１３　ｍβ）
。

実施例４ （抗体によるＭ、　ｍｕｔａｎｓの平滑面への付着阻害
効果の確認） 互、　ｍｕｔａｎｓの歯面への付着のモデル実験として
、ガラス面への付着実験を行なった。

すなわち、実施例３で得た抗体を加えることで、塁、　
ｍｕｔａｎｓのガラス面への付着がどの程度阻害される
かを評価するものであり、その詳細を以下に述べる。

まず、実施例３で得た抗体価８．４Ｘ１０３を示したＷ
ＳＦ及びその１０倍希釈液を試験溶液とした。

これとは別に、免疫をしていない鶏（実施例２と同様の
鶏）の卵から実施例３と同様にしてＷＳＦを調製し試験
溶液とした。なお、該ＷＳＦがＣＡ−ＧＴＦ−１に対し
て特異的に反応しないことを確認した。

次に、これらの各試験溶液を１３ｍｍφＸ１００ｍｍの
試験管に１ｍ℃分注した後、更に１．５％スクロースを
含む１．５倍濃度のＢＨＩ培地培地２奢βれぞれの試験
管に加えた。

更に、各試験管にＢＨＩ培地で前培養した冬。

ｍｕｔａｎｓ　Ｉｎｇｂｒｉｔｔ株の懸濁液０．１ｍ℃
を加えて、３０″に傾斜させた状態で、３７℃の温度下
で１８時間静置培養した。

表１に各試験管内に調製した調製物の組成を示す。

静置培養終了後、各試験管を以下の操作に従って処理し
、菌体の試験管壁への付着率を求めた。

静置培養終了後の試験管（この試験管を第１の試験管と
する）を静かに回転させ、試験管壁に付着していない菌
体を含んだ溶液の全量を第２の試験管に移した０次に、
菌体が付着している第１の試験管に５０ｍＭリン酸緩衝
液’（ｐｌ（６，８）の３　ｍｊ２を加え、これを再び
回転させ、解離した菌体含む緩衝液の全量を第３の試験
管に移した後、この第１の試験管に、５０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ６，８）の３　ｍ４を加えた。

更に、第１〜第３の試験管を超音波処理し、各試験管内
に均一な菌体浮遊液を調製し、各浮遊液の吸光度（００
１１！１０　）を測定し、以下の式に従って付着率を求
めた。

管の吸光度の総和 得られた結果を表１に示す。

表　　　１ 実施例５ 実施例２で得たＣＡ−ＧＴＦ−１精製標品を抗原として
用いる以外は実施例３と同様にして抗体の調製を行なっ
たところ、同様にＣＡ−ＧＴＦ−１と特異的に反応する
抗体が得られた。

更に、得られた抗体の菌体付着阻害効果を実施例４と同
様の方法で試験した結果、同様に優れた効果が認められ
た。

実施例６ 実施例３で得た抗体価８．４Ｘ１０’を示したＷＳＦを
表２及び表３に示す組成の組成物及び溶液に対し、０．
５重量％加えて、練り歯磨き及びマウスウォッシュを調
製した。

１００％ 表３ １００％ ［発明の効果］ 本発明により、旦、　ｍｕｔａｎｓの歯面への付着に対
する十分な阻害効果を有し、量産性にも優れ、生産コス
トが低く、う蝕子防剤の有効成分として有用な抗体及び
該抗体を含もう蝕子防剤が提供された。

特に、本発明のＳ、、　ｍｕｔａｎｓに対する免疫活性
を有する抗体は、従来の哺乳動物を免疫して得る抗体と
比較して以下のような利点を有する。

（１）本発明の抗体は、免疫した鶏の卵中に得られ、採
卵、卵の取り扱いおよび卵からの抗体の取得に特別な、
あるいは熟練した技術を必要としない、しかも、卵黄に
は免疫グロブリンのうちＩｇＧクラスしか移行しないの
で、ＩｇＧのみを容易に得ることができる。

これに対して、免疫した哺乳動物から採血により抗体を
得る場合には、採血に熟練した技術が必要とされ、しか
も血清から大量のＩｇＧを分離・精製することは未だ困
難である。

（２）本発明の抗体の調製に用いられる鶏は、管理が容
易であり、例えばラット等と比較してもその管理費用が
安い。

しかも、哺乳動物から継続的に多量の血液や乳を得るこ
とは困難であり、哺乳動物を用いる方法は抗体の量産に
は適さないが、鶏は長期間にわたって安定して卵を生み
続けるので、本発明の抗体は量産可能であり、かつ生産
コストが低い。

（３）免疫した哺乳動物の血液や乳から調製した抗体の
安定性は必ずしも良好でなく、血清中で、あるいは精製
した状態でも一８０℃程度の温度条件下での保存が必要
とされる。

本発明の抗体は、良好な安定性を有し、また保存性も良
く、例えば卵の状態で４℃カ１〜２箇月間保存できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例３における免疫した鶏の抗体価の推移
を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）う蝕誘発の病原菌としての血清型がｃ、ｅまたはｆ
   であるストレプトコッカス・ミュータンスの下記理化学
   的特性を有する菌体結合型グルコシルトランスフェラー
   ゼを免疫した鶏が産生する卵より調製された免疫グロブ
   リンであって、前記ストレプトコッカス・ミュータンス
   に対して免疫活性を有する抗体。 （１）作用及び基質特異性； スクロースに作用し、水に不溶性のグルカンを合成する
   。 （２）至適ｐＨ； ｐＨ６．７〜７．０ （３）作用適温の範囲； １５〜５０℃ （４）失活の条件 ８０℃、５分間の処理で失活する。 （５）分子量： ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定し
   た分子量が、１５０ｋ〜１６５ｋダルトンである。 （６）免疫原性； 動物において免疫原となり、該酵素に対する特異抗体を
   生成させ得る。 ２）う蝕誘発の病原菌としての血清型がｃ、ｅまたはｆ
   であるストレプトコッカス・ミュータンスの下記理化学
   的特性を有する菌体結合型グルコシルトランスフェラー
   ゼを免疫した鶏が産生する卵より調製された免疫グロブ
   リンであって、前記ストレプトコッカス・ミュータンス
   に対して免疫活性を有する抗体を有効成分として含むう
   蝕予防剤。 （１）作用及び基質特異性； スクロースに作用し、水に不溶性のグルカンを合成する
   。 （２）至適ｐＨ； ｐＨ６．７〜７．０ （３）作用適温の範囲； １５〜５０℃ （４）失活の条件 ８０℃、５分間の処理で失活する。 （５）分子量； ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定し
   た分子量が、１５０ｋ〜１６５ｋダルトンである。 （６）免疫原性； 動物において免疫原となり、該酵素に対する特異抗体を
   生成させ得る。