JPS61502957A

JPS61502957A - 大腸菌のｌｔ―ｂエンテロトキシンサブユニットと莢膜ポリマーとの免疫原性結合体

Info

Publication number: JPS61502957A
Application number: JP60503270A
Authority: JP
Inventors: アンダーソン，ポーター　ダブリユー; クレメンツ，ジヨン　デイー
Original assignee: プラクシス　バイオロジツクス，インコ−ポレ−テツド
Priority date: 1984-08-10
Filing date: 1985-07-03
Publication date: 1986-12-18
Anticipated expiration: 2011-02-07
Also published as: CA1316474C; AU4458885A; ATE71533T1; DK167879B1; DE3585185D1; AU599570B2; EP0172107B1; ES8707861A1; DK364285A; DK364285D0; WO1986001228A1; EP0172107A1; IE57784B1; ES546038A0; US4808700A; IE851971L; JPH0811737B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

エシェリキア・コリＬＴ−８エンテロトキシンサブユニットと莢膜ポリマーの免疫原性複合体１、発明の分野本発明は、例えば、ヘモフィルス・インフルエンゼタイプｂ　［ＨａｅｍｏｐｈｉｌＵＳ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ　ｔｙｐｅ　ｂコ、エシェリキア・コリＦＥ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏＩ　ｉコぜナイセリア・メニンギチジス　血清グループＡおよびＣ［Ｎ　ｅｉｓｓｅｒｉａ　鱈匣５ｎｇｉｔｉｄｅｓ　ｓｅｒｏｇｒｏｕｐｓ　Ａ　ａｎｄ　Ｃコ、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型３，６，１２，１４，１９．２３および５１　［５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｒｅｕｍｏｎｉａｅ　５ｅｒｏｔｙｐｅｓ３．６，１２，１４．１９，２３ａｎｄ　５１コ、ならびにシュードモナス［ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　］などを含む細菌により引き起こされる感染および疾患に対する、ｆｒ規なワクチン組成物、その製造プロセスおよび人類を含む若い恒温動物の免疫に関する方法の分野に関連するものでおる。本発明はさらに、エシェリキア・コリのエンテロトキシン産生性株のヒト単離体からの熱不安定性エンテロトキシンの非毒性Ｂサブユニット（ＬＴ−８＞の製造に関するプロセスに関連するものである。このプロセスは、必須遺伝子配列が適当なりＮＡベクター（［ｖｅｃｔｏｒ］　、媒介体）によって非病原性微生物株中へ挿入される粗換えＤＮＡテクニックを利用するものである。方法は、ＬＴ−Ｂタンパク質の単離および精製ならびに免疫学的予防および治療に関するそれの使用を提供するものである。ＬＴ−８タンパク質に対して調製された抗血清は、エンテロトキシン誘発性下痢症［ｅｎｔｅｒＯｔＯＸｉｎ　−１ｎｄｕｃｅｄ　ｄｉａｒｒｈｅａｌ　ｄｉｓｅａｓｅ　］に対スル受身免疫に利用され得る。あるいはまた、このような抗血清は、エシェリキア・コリのまたはビブリオ・コレレ［Ｖ　１ｂｒｉｏ　ｃｂｏｌｅｒａｅｌのエンテロトギシンに特異的である免疫学的診断試験の準備に用いられ得る。２、発明の背景精製すれた微生物莢膜ポリマー（ＣＰ）は成熟したヒトおよび動物において一般的に免疫原性でおり、そして相応する全身性感染に対するワクチンとして用いられ得ることが公知である。この適用において用いられた場合、「莢膜ポリマー」なる用語は、糖のポリマー、糖酸のポリマー、アミノ糖のポリマー、多価アルコールのポリマーおよび糖リン酸塩のポリマーなとのような、糖含有ポリマーに関するものであり、アミノ酸含有ポリマーに関するものではない。これらの「莢膜ポリマー」は、グリコシド結合以外の結合および上記に列挙したような糖以外の成分を含むもの異なる細菌の莢膜ポリマーはヒトの第１年における免疫原性において広範に変化する。いくつかは、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型３ｆ足江亜座並匹匹　ｐｎｅｕｍ。口ｉａｅ　５ｅｒｏｔｙｐｅ　３　］およびナイセリア・メニンギチジス血清グループＡ　［Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ　５ｅｒｏａｒｏｕｐＡコなどのように穏健な活性である。被包性細菌［ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ　ｂａｃｔｅｒｉａコによる全身性感染に対する感性は、生命体の第１年においてより大きなものである。幼児にあける多くの細菌莢膜ポリマーに対する免疫原性応答は、年齢依存である、すなわち莢膜ポリマー（ＣＰ）に対する免疫適格性は、約第６年齢までに成人のレベルへ増加する。不活性なＣＰは、ヘモフィルス・インフルエンゼタイプｂ１ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型６および１２、ならびにナイセリア・メンニギチジス血清グループＣのものである。幼児において中間の応答を与えるＣＰの例としては、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１９および５１がある。２．１　ワクチンにおける抗原としての一一一兄金鬼入吸蚤旦ヱニーーーー−一数々の研究者がワクチンにおいてないしはワクチンとして有用でおる完全な莢膜ポリマーを単離し精製している。例えば米国特許第４．２２０．７１７号は、ヘモフィルス・インフルエンゼｂの莢膜ポリマーからの免疫学的に活性なポリリボシル　リビトール　ホスフェート（ＰＰＰ）の単離および精製に関するプロセスを述べている。ざらに、米国特許第４．２１０．６４１号は、２００．０００ドルトンより大きな見かけ分子量を有し、そして主としてガラクトース、グリコースおよびマンノースからなり、また少量のオサミンを含有するヘモフィルス・インフルエンゼの多糖抽出物に関連するものである。最大かの研究者が、よりよい免疫学的応答を達成するために、これらのおよびその他の完全な莢膜ポリマーを処方箋において利用している。例えば米国特許第４．１９６．１９２＠は、精製された完全ＰＲＰおよび完全ボルデテラ・バータラシス［Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐａｒｔｕｓｓｉｓ　］細菌を含むワクチンを開示している。免疫原性を増加させるためのこのアプローチは、若い吐乳動物において、抗ＰＲＰ抗体および抗バータッシス抗体の高められたレベルをまねくものであった。２．２　複合体を含　するワクチン他の研究者たちは、いわゆる［担体効果［Ｃａｒｒｉｅｒ　ｅｆｆｅｃｔ］により抗体形成を高める努力において、莢膜ポリマーの担体タンパク質への複合［ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　］を研究している。例えばシュネールソンら、ジャーナル　オブ　エクスペリメンタル　メディシン　１５２：３６１〜３７６（１９８０年）　［５ｃｈｎｅｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　１５２：３６１−３７６　（１９８０）］は、ヘモフィルス・インフルエンゼロポリマー−タンパク質複合体［ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　］が、ヘモフィルス・インフルエンゼｂによって引き起こされた侵入性疾患に対する免疫性を与えることを明らかにしたことを述べている。この引用文は、幼児における莢膜ポリマーの年齢に関連する免疫学的挙動を事実として提供し、また血清アルブミン、カブトガニ　ヘモシアニン［Ｌ　ｉｍｕｌｕｓ　ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎｌおよびジフテリア毒素を含む種々のタンパク質との完全莢膜ポリマーの複合によりこの年齢依存性を克服しようと努めるものである。複合の方法は、アジピン酸ジヒドラジドなどのような結合剤の使用を包含するも１７’ｌ〜２８８　（１９７９年＞　［Ｇｅｙｅｒ　ｅｔ　ａｔ、　、　Ｍｅｄ。Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６５：１７１〜２８８（１９７９）１は、還元アミノ化によっであるランプシエラ・ニューモニエ［Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ］莢膜多種フラグメントのニトロ　フェニル　エチルアミン　リンカ−への複合体を調製し、そして次に、アゾカップリングを用いてこの誘導体化された糖はタンパク質に付着された。２．３．　ハプテンに対する抗血清を製造するための担体タンパク質の使用担体タンパク質は、複合した莢膜ポリマーの免疫原性を高めることができるのみならず、これらはまたハプテンを免疫原性にする。ハプテンは、抗体おるいはリンパ球レセプターに対し特異的に結合する能力を有するが、免疫応答を誘導する能力を有しない（￥なりち、これらは免疫原性でない。）分子として定義される。免疫応答を引起こすために、一般にハプテンは最初に、通常は異種タンパク質である、より大きな分子ないしは担体と複合されなければならない。ハプテン− 担体視合体の動物中への注入は、次に、抗体のＢリンパ球による産生に上昇を与え、またその抗体のい（つかが、Ｍ離した非結合状態のハプテン分子に特異的に結合し得る。研究された最初のハプテンの中に、アニリンやＯ−アミノ安急香酸などのようなアゾ染料化合物がめった。ランドステイナーとランプ）Ｉ、ｔ　［Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｃｒ　ａｎｄ　ｌａｍｐＨ（ゼット、イムノ１＝＋ルシユ、２６　：　２９３　（１９１８４）［Ｚ、　ＩｍｍｕｎＦｏｒｓｃｈ、２６：２９３（１９１８）］）は、これらの化合物をジアゾ化によって血清タンパク質にカップリングした。これらの人為的に調製されたアゾ−タンパク質で注射された場合、ウサギは、付着した化学部分に特異的でおる沈降抗体を発現させた。ハプテン性化合物の他の例としては、ウシ面漬アルブミン市るいはウシガンマグロブリン＜ＢＧＧ）にジニトロフェニル（ＤＮＰ）Ｗとしてカップリングした場合おいて免疫原性となるジニトロフェノールや、りげルグ酸ジエチルアミドがある。ホルムアルデヒドもまた、ハプテンとじてふるまうことが示されており、産物からのあるいは研究室においてホルムアルデヒド蒸気にざらされた人々は、この化合物に対して［感作された［５ｅｎｓｉｔｉｚｅｄ］　Ｊものとなり、ル化［ｆｏｒｍｙｌａｔｉｏｎ　］を伴う。ハプテン性挙動は、小さな有機分子のみに限定されるものでなく、そして最大インスリンまでの大きさのポリペプチドホルモンは、あったとしても、しばしば乏しい免疫原性である。これらのホルモンに対する高い抗体価を得るためには、これゆえこれらを担体タンパク質に複合する（あるいはこれらのポリペプチドの多くを互いに架橋することによってより大きな分子を形成する）必要がある。担体タンパク質の掛かり合いは、担体が単なる輸送役割より以上に働くことにおいて、特に興味あることである。オバリーとベナセラフ［○ｖａｒｙ　ａｎｄ　３ｅｎａｃｅｒａｒｆコ〔ブロク、ソシ、エクスプ、パイオル、メト１１４ニア２（１９６３年）ＥＰｒｏｃ、５ＯＣ０ＥＸＩ）、Ｂｉｏｌ。Ｍｅｄ、１１４；７２　（１９６３）］）はこれをＤＮＰ−ＢＧＧでウサギを注射することによって示した。多（の免疫原性物質の動物への注射は、暴露の免疫学的「記憶」をもたらすであろう。後日２回目の注射が与えられた場合、これゆえ非常により活発な免疫応答がある。実際、オバリーとベナセラフがＤＮＰ−ＢＧＧを再度注射した場合、ＤＮＰおよびＢＧＧの双方に対して指向した抗体の顕著に上昇したレベルとなも強力な２次応答があった。しかしながら、２回目の注射がＤＮＰ−卵アルブミンで置き換えられて行なわれた場合、極めてより弱い抗ＤＮＰ抗体応答が記された。応答における違いは、担体効果と呼ばれているものによるものであり、そし−でヘルパーＴ細胞を伴うさものであ。るらしい。予備的証拠は、すべてのタンパク質がある与えられたハプテンに関して必ずしも等しく効果的な担体タンパク質でおり得るものでないことを示している。ロビンズら［Ｒｏｂｂｉｎｓ、　ｅｔ　ａｌ、　、　］　（インフエクト、イム／、主立：２４５〜２５６［Ｉｎｆｅｃｔ、　■ｍｍｕｎ、生０：２４５−２５６コ）は、同じ多糖ハプテンが異なるタンパク質担体群に複合されそしてハプテンに対する抗体応答が定量された実験的タンパク質−多糖複合体ワクチンにおけるデータを表わしている。顕著な違いが、担体に関する主たる役割を示しながら、発現した抗ハプテン抗体の間において記されている。２．４．　エンテロトキシン産生１細菌および下痢症ある細菌のエンテロキシン産生性株による小腸の一時性集落形成に帰因する急性下痢症は、世界的な重要事象の主要な健康的問題である。責任のおる細菌の中で、恐らく最も広く認識されているものは、ビブリオ・コレラでおる。よく知られている程度は低いが、実際的により重要なものは、エシェリキア・コリの特定の株であり、これらは、発展途上の熱帯の国々に住む１０００万人と見積られた幼児に各年致命的である急性下痢症の事象を、ロタウィルス（動物ＲＮＡウィルス）と共にもたらすものである〔ブラこれらのエシェリキア・コリ株はまた一般に、熱帯への旅行者を悩ます急性下痢症の高い範囲の原因となるものである。さらにまた、コーラ−［Ｋｏｈｌａｒ　］　（ジエイ、アン。ヴエト、メト、アンシ、１７３：５８８　（１９７８年）［Ｊ、　Ａｍ、Ｖｅｔ、　Ｍｅｄ、　Ａｓ５ｏｃ、　１７３　：　５８８　（１９７８）］）が、乳離れした動物の子、特に子ウシ、子ヒツジおよび子ブタは同様に冒され得ることを報告しているゆえに、これらは、家畜への大なる影響も有している。ビブリオ・コレラおよびエンテロトキシン産生性エシェリキア・コリはいずれも、これらの下痢症性効果をエンテロトキシンの産生により生じるものである。コレラエンテロトキシンは、フィンケルシュティン［Ｆ　１ｎｋｅｌｓｔｅｏｎ］〔クリト、レブ、ミクロパイオル、２　：５５３　（１９７３年）　［Ｃｒ１ｔ、Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２　：　５５３　（１９７３）コ〕によって単離されそして均質性へと精製されている。さらにまた、フィンケルシュティンとロスバリュート［Ｆｉｎｋｅｌａｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｌ　ｏｓｐａｌ　１ｕｔｏコ　〔ジエイ、エクスプ、メト。１３０：１８５　（１９６９年）　［Ｊ、　ＥＸＩ）、　Ｍｅｄ、　１３０：１８５　（１９６９）］　）は、生物学的活性が低減されたコレラ毒素からタンパク質サブユニットを分離している。これらよりあるいはその他の研究より明らかになったことは、コレラエンテロトキシンは、ＡおよびＢサブユニットからなる８４，０００ドルトンのタンパク質であるという発見である。 △ザブユニット（２８，０００ドルトン）は、毒素の生物学的効果に関し原因となるものでおるが、それのみで標的レセプターに結合することができない。Ａサブユニットは、ＳＨ試薬（スルフヒドリル試薬）の作用によって、７゜ＯＯＯドルトンおよび２１，０００ドルトンの分子サイズを有する２つのポリペプチド鎖に開裂される。Ａ１と呼ばれる、これらの鎖のうちの大きい方のみが活性なものである。５６．０００ドルトンのサイズを有するＢサブユニットは、Ａサブユニット〜の活性の表現に必須のものでおる。おそらくは、これは標的細胞へ結合によって作用し、そして次に活性な△サブユニットによる侵入を促進する。フィン４）］〕は、Ｂザブユニットが、ドデシル硫酸ナトリウムでのめるいは低いＤＨにおける尿素での活発な処理により５つのポリペプチド鎖に解離し得る非共有的に会合したサブユニットから構成されることを示している。コレラ毒素の効果は、シアーら［５ｈｃｅｒ　ｅｔ　ａｌ、１　（ガストロエンテルオロジイ　旦塁：８９５　（１９７３年）　ＥＧウサギの空腸において示されている。この系において、該毒素は、内腔への血液にナトリウムの一定方向の流れをなさせる。結果として、腸液は、標準血清レベルと比較して、タンパク質、Ｍｇ　、およびＱａ　において低いものと、またに、Ｎａ　およびＩ−（Ｇ　Ｏ３−において高いものとなる。このようなイオン変化で、血漿との浸透圧平衡維持のために、内腔への水の付随した流出がある。コレラ毒素レセプターの正確な構造は不明でみるが、糖脂質であると思われる。この観察結果は、膜へのコレラ毒素の結合が種々のグリコスフィンゴリピドによって阻止されるというキングとバンハイニンゲン［Ｋ　ｉｎｇ　ａｎｄ　ｖａｎ　Ｈ（１９７５）］　）による発見に基づくものである。調べられたこのタイプの化合物の中で、Ｇ、１（ガラク１−シルーＮ−アセチルガラクトサミニル−（シアニル）−ガラクトシルグルコシルセラミド）が最も効力のあるものでおる。コレラ毒素の結合が起こると、アデニル酸シクラーゼ活性の刺激がありそして活性化状態におけるその酵素のロッキングがある。この結果は、ある点において上記のイオン変化に上昇を与えるＣＡＭＰ（サイクリックアゾンシン３’、５’　 −−リン酸）の到胞内レベルにあける増加である。エシェリキア・コリのエンテロトキシン性株はまた、エンテロトキシンの産生により下痢症効果をもたらす。これらの毒素は、２つのタイプのものがおり、その一方は、２゜ＯＱＯドルトンの比較的低分子四種である。これは１００℃での処理にも生残るので、この種は熱安定性毒素（８丁）と呼ばれる。熱不安定性な他方の毒素（ＬＴ）は、コレラ毒素と著しく似たものである。９８１＞］）によって示されるように、エシェリキア・コリＬＴは、コレラ毒素と同様なタイプおよび数のサブユニットから溝成されており、この相当するサブユニットはほぼ同様の分子量を有している。コレラ毒素の場合のように、ＬＴのＢサブユニットは、腸管粘膜糖脂質レセプターに付着し、これゆえに、生物学的活性Ａサブユニットによる細胞の侵入が許容される。その時点後の事象の連続もまた同様のものである。最も重要なこととしては、タレメンツとフィンケルシュティン［Ｃｌｅｍｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｆ　１ｎｋｅｌｓｔｅｉｎ］〔インフエクト、イムノ、２１：１０３６　（１９７８年）［Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、　２’ｌ　：１０３６　（１９７Ｂ＞　３）は、エシェリキア・コリＬＴがコレラエンテロトキシンのΔおよびＢサブユニットの双方に免疫学的に関連していることを示している。２．５．エンテロトキシン性下痢症の予防および治療に対する免疫学的アプローチ微生物性毒素誘発性下痢症を原因とする蔓延した患者数および死亡数と闘うための最も実践的手段は、防御的予防接種であろう。エンテロトキシン産生性エシェリキア・コリ株の場合において、３つのアプローチが取られ得る。第１に、菌体抗原が免疫処置に用いられ得る。死化ないし弱毒化された細菌が、この目的のために用いられ得るが、このアプローチは、いくらかの危険性を伴なうものであり、また限定された効果のものとなりがちである。細胞の死化ないし弱毒化が不完全であると、臨床的疾患が発展してくる。これが起こらなかったとしても、Ｆｉ原性的に非類似な菌体血清型が認識されないだろうゆえに、防御は不完全なものとなるであろう。第２に、アキレスら［Ａｃｒｅｓ　ｅｔ　ａｌ、］　（インフエクト。イムノ、２５：１２１　（１９７９年）　［Ｉ　ｎｆｅｃｔ、　（ｍｍｕｎ。２５：１２１　（１９７９）］　）は、綿毛（ビリ）仲介固定がエンテロトキシン分泌性エシェリキア・コリのめる株による下痢症の誘発に必須条件であることを示している。これゆえ、細胞接着での干渉は予防効果を有するものであろう。このような干渉は、線毛抗原での予防接種により生じさせることができるが、このように授与された防御はまた、抗原性的に同類な細菌にのみ適用できるものでおる。モー７７１　（１９７８年＞　［Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　２２　：　７７１（１９７８）］　）は、動物およびヒトエンテロトキシン産生性エシェリキア・コリ株の中に多数の抗原性的に非類似な線毛抗原を見つけている。最後に、エンテロトキシンそれ自体で動物を予防接種することが可能でめる。このように確立された免疫は、毒素を産生する任意の関連エシェリキア・コリでの能動攻撃に対する防御を与える。その理由は明らかに理解されていないが、Ｌ丁毒素での免疫処置は、ＬＴみよびＳＨの双方な産生する株に対する防御を与えるもので必るらしい。８丁のみを産生する株に対する防御はないであろうが、これらの株は、少数派に属するものである。クリブシュティンとエンガート［Ｋ１１ｐｓｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｅｎｇｅｒｔコ　〔インフエクト。イムノ、２３：５９２　（１９７９年）　［Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　２３　：５９２　（１９７９）］　）は、Ｍ製されたＬ丁タンパク質でのラットの能動免疫を述べている。免疫は、ＬＴそれ自体の使用によって達せられ得るが、生物学的に不活性なりサブユニット（ＬＴ−８）のみの使用は、はとんど同様に効果的であり、またもちろんより安全である。このアプローチの効能は、ラットにおいて、クリブシュティンとエンガート［ＫＩｉｐｓｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｅｎｇｅｒｔ　］（インフフラクト。ムノ、Ｊユニ１４４　（１９８１年）［１ｎｆｅｃｔ、　Ｊ　ｍｍｕｎ、　３ユニ１４４　（１９８１））　）により示されている。このような免疫はまた、上記に述べたＬＴとコレラエンテロトキシンとの間の免疫学的関係ゆえに、コレラ誘発性下痢症的侵襲に対する防御も授与するものである。クリアシ１テインら［ＫＩｉｐｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、ｌはまた、ＬＴ９８１Ｎ　）あるいはしＴ−Ｂタンパク質に結合したＳＨ８（１９８３）］　］ラットを免疫処置している。このような被合体およびこれらのワクチンとしての使用に基づく特許が、クリブシュティンら［Ｋ１１ｐｓｔｃｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　］に対して発行されている〔米国特許第４，４１１，８８８号〕。２．６１組換え型ＤＮＡ技）現在における組換え型ＤＮＡ法は、宿主細胞中に複製し得る組換え型ＯＮ八へ子を形成するために、特定のＤＮＡ配列が、適当なＯＮ八へヒクル（伝播体）あるいはベクター（媒介体）中に挿入されるものである。プラスミドと呼ばれる環状二重鎖ＤＮＡがベクターとして頻繁に用いられており、そしてこのような組換え型ＤＮＡ形態の調製は、ＤＮＡを特定の塩基配列部位で切断し得る制限エンドヌクレアーゼ酵素の使用を伴うものである。プラスミドにおいておよび挿入されるべき外来のＤＮＡのセグメントにおいて制限酵素による切断が行なわれると、２つのＤＮＡ分子はりガーゼとして知られる酵素により共有結合される。このような組換え型ＤＮＡ分子の調製に関する一般的方法は、コーエンとボイヤー［Ｃ；　ｏｈｅｎ　ａｎｄ　Ｂ　ｏｙｅｒコによって米国特許第４．２３７，２２４号中に述べられている。その他の有用な一般的方法が、コリンズとホーン［Ｃｏ１１ｉｎｓ　ａｎｄ　ＩＪｏｈｎ］によって米国特許第４，３０４，８６３号中に述べられている。これらの広い利用性ゆえに、これらの特許は、関連により本明［ｌ書中に組込まれる。調製されると、組換え型ＤＮＡ分子は、幾らかの条件が合致された場合のみに、挿入された遺伝子配列により特異とされる産物を産生することに、用いられ得る。第１には、組換え型分子が宿主細胞と適合し得るものであり、そしてそれゆえに宿主細胞中に自律複製し得る要件である。最近の研究の多くは、エシェリキア・コリが広範な組換え型プラスミドと適合し得るゆえにエシェリキア・コリを宿主有機体として用いている。用いられたベクター／宿主細胞系に依存して、粗換え型ＤＮＡ分子は、形質転換、形質導入あるいはトランスフェクションによって宿主中へ持込まれる。宿主細胞中におりる組換え型プラスミドの存在の検知は、例えば抗生物質耐性などのような、プラスミド標識［ｎａｒｋｅｒｌ活性の使用により都合よく達せられ得る。これゆえ、アンピシリン分解酵素の産生に関しコードするプラスミドを負う宿主は、アンピシリンを含有する培地中で宿主を培養することによって、非変容細胞から選び出ずことができる。さらに利点は、選択された制限エレドヌクレアーゼが切断し、そして外来の遺伝子配列が挿入された部位において、プラスミドが第２の抗生物質分解活性に関しコードする抗生物質耐性標識でなもたらされる。組換え型プラスミドを適当に含有する宿主細胞は、そして、最初の抗生物質に対する耐性および第２の抗生物質に対する感受性により特徴づけられるであろう。宿主細胞への組換え型プラスミドの単なる挿入および修飾宿主の単離は、望まれる遺伝子産物の重要な量が産生されることをそれ自体において保証するものではない。これを起こすためには、外来の遺伝子配列は、プロモーターと呼ばれるＤＮＡ転写のためのプラスミド中のシグナル１Ｊ４ｔに、特有の関係において融合されなければならない。あるいはまた、外来のＤＮＡは、宿主によって認識される間、それと共にそれ自身のプロモーターを運ぶこともできる。その起源が何であっても、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合を導＜ＤＮＡ配列であり、そしてそれゆえＤＮＡのメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ＞への転写を「プロモートする」ものである。大量のｍＲＮＡを提供し得る強力なプロモーションを与えると、望まれる遺伝子産物の終局の産生は、ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳の効果に依存したものとなる。これは、いいかえれば、ｌｌｌＲＮＡへのリポソーム結合の効率に依存するもので必る。エシェリキア・コリにおいて、ｍ尺ＮΔ上のリポソーム結合部位は、開始コドン（ＡＵＧ）および上流のシャインーダルガルノ配列を含むものである。３〜９の長さのヌクレオチドを含み、そしてＡＵＧから３〜１１の長さのヌクレオチドに位置されたこの配列は、エシェリキア・コリ１６３リポソームＲＮＡ　（ｒＲＮＡ）の３゛末端に相補的でおる〔シャインとダルガルノ、ネイチｖ−２５４：３４　（１９７５年）　［５ｈｉｎｅａｎｄ　［）ａｌｇａｒｎｏ、Ｎａｔｕｒｅ　２５４：３４　（１９７５）］）。ｍＲＮＡへのリポソーム結合は、おそらく、ｍＲＮＡ中のＳＤ配列と１６ＳｒＲＮＡの３゛末端での配列との間での塩基対合により促進されている。形質発現を最大化するための観察に関しては、ロバーツとローア−、メンツズ　イン　エンザイモロジイ　旦旦：４７３　（１９７９年）　［Ｒｏｂｅｒｔｓ　ａｎｄｌ−ａＵｅｒ、　Ｍｅｔｉｌｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６旦：４７３（１９７９）コを参照のこと。ヒトおよびブタ起源のエンテロトキシン産生性エシェリキア・コリからのＬＴプラスミドの他の微生物中への導入が最近ネイルら［Ｎｅ１ｌｌ　ｅｔ　ａｌ、］　（インフエクト、イムノ。生ユニ　１０５６　（１９８３）　［Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　４ユニ１０５６　（１９８３）］　）によって示されている。この研究において、エシェリキア・コリからのしＴプラスミドは、エシェリキア・コリに−１２［旦、　Ｃｏ１１　Ｋ−１２］株中への、ならびにシゲラ・フレクスネリ［旦垣凹旦ａ　ｆｌｅｘ匹亘ｊ１シゲラ・ソンネイ「旦匝匹旦ａ　５ｏｎｎｅｉＪ、シトロバクタ −・フロインデー１’　［ＱｉｔｒＯｂａＣｔＥ！ｒ　ｄ、エンテロバクタ−中クロアカニ［Ｅ　ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａ乞コ、クレブシェラ・ニューモニエ［Ｋ　Ｉｅｂｓｉｅｌ　Ｉａ　凹皿ｍｏｎｉａｅ］およびサルモネラ・チフィムリウム［３ａｌｍｏｎｅｌ　Ｉａ　廿妨］肛並ゴの株中、への接合により移植されている。このトランスコンシュガント（被接合体）の分析は、すべての場合において、伝達されたプラスミドはこれらの宿主において安定に維持されていたことを示した。同相ラジオイムノアッセイによって計測されたＬＴ形質発現は、広く変化したが、エシェリキア・コツにおいて生起する最大のＬＴ産生を有するものであった。遺伝子工学技術がまた、ＬＴのＢサブユニットを製造するために用いられることができる。ダラス［Ｄａｌｌａｓｌ　（欧州特許出願一連番号第００６０１２９号〕は、ブタ起源のエシェリキア・コリ単層体からのＬＴ−８１，：関しコードする遺伝子のクローニングを述べている。ＬＴのＢサブユニこのＤＮＡを連結反応させることによりベクターｐＪＪＳ５００中にクローニングされた。この出願は、明白なＬＴ−Ａ汚染のないプラスミド特異化り丁−Ｂ産物がこれにより得られたこと述べている。この遺伝子産物に基づいた、この請求の範囲を支持する証拠が何ら示されていないこと、生体内［劫血］または試験管内［ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｊ研究を何らあげでいないこと、および成功した抗体産生の開示がないことは指摘されるべきである。ヤマモトら［Ｙａｍａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、］　（ジエイ、バクテリオコリ単離体からのＩＴ−８Ｍ伝子のプラスミドｐＢＲ３２２中へのクローニングを述べている。遺伝子産物のいくつかの発現は、放射線標識化アミノ酸混合物中に修ｆｓ細菌を＠養し、そして次に５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により粗細胞溶解物を分析することによって検知された。しかしながら、ＬＴ−Ｂタンパク質を精製するないし特徴ずける努力が何らなされてあらず形質発現のレベルが有意なものか否かが不明である。その他の研究において、サンチェズら［３ａｎｃｈｅｚ　ｅｔ　ａｔｌ　（１９８２）コ）はヒト単離体からベクターｐＡ　ＣＹ　Ｃ１８４中へＬＴ−Ｂｍｍ壬子クローニングした。これもまた、遺伝子産物は精製されることも特徴ずけられることもなされなかった。１−尺ｐｒｏ里Ｘ本発明は、細菌莢膜ポリマー由来の莢膜ポリマーフラグメントの細菌の毒素、トキソイドおるいは結合サブユニットへの還元アミン化による共有付着に関連するものでおる。本出願において用いられる場合、「トキソイド」なる用ｉｉＨは、毒素の抗原性を毒素の毒性なしに有している毒素の形態を意味するものである。本発明の免疫原性複合体は、莢膜ポリマーの７ラグメントにおける還元基末端を最初に形成し、そしてこれらを細菌の毒素、トキソイドあるいは結合サブユニットと還元アミン化によって反応させることによって調製される。還元末端基は、選択加水分解（例えば酸または酸素による）含む任意の適当な方法によって、あるいは酸化的ｒｉｎ裂（例え−ば過ヨウ素酸塩による）によって形成され得る。この複合体は、シアノボロハイドライド　アニオンを含有する水溶液中における還元アミン化によって好ましく達せられる。本発明の免疫原性複合体は、人類を含む若い哺乳動物において有効なレベルの抗莢膜抗体形成の有効なレベルを引き出すワクチンを製造するために、薬理学的に許容できる担体と処方され得る。このワクチンは、それぞれの被包性細菌によって引き起こされた若い哺乳動物における全身性感染に対する能動免疫を、哺乳動物に免疫原性な量の該複合体を投与することによって誘導することに利用され得る。この免疫原性複合体は、莢膜ポリマーのみよりも低い年齢依存性であることが見い出されており、また非常に若い恒温哺乳動物のそれぞれの被包性細菌による全身性感染に対する能動免疫に関して有用である。さらにまた、本発明の免疫原性複合体は、炭水化物をタンパク質に複合するのに用いられてきたアジピン酸ジヒドラジドあるいはＰ−ニトロ　フェニル　エチルアミンのような潜在的に毒性の結合剤を含まないものである。最後に、本発明の免疫原性複合体は、莢膜ポリマーのフラグメントを含むものであって、完全な莢膜ポリマーを含むものではない。莢膜ポリマーの高度な反復構造は、幼児において抗体産生のための受容力を拡大することのこれらの失敗に関する部分的責任であろう。完全な（高度に重合された）ＣＰとタンパク質の複合体は、ＣＰのみの場合の免疫学的欠点をほんの部分的に克服するにすぎないであろう。一方、担体上の莢膜ポリマーフラグメントの使用は、反復構造の欠点を迂回するものでおる。ざらにＣＰフラグメン１〜を有する複合体のＣＰ決定基は、完全ＣＰを有する複合体のＣＰ決定塁よりも概して担体により近接しており、モして担体へのこの近接は、より効果的な「担体効果」に必要とされるものでおる。タンパク質担体に関して、さらに利点は、幼児が、定型的に予防接種される、例えば破傷風おるいはジフテリアなどのような、細菌の毒素、トキソイドまたは結合サブユニットの使用において存する。選択されたタンパク質担体に対する望まれた免疫は、莢膜ポリマーに関連した病原体に対する免疫といっしょに導き出される。上述したように、パブテンに対する最適応答を生み出すことにおけるタンパク質 −ハブテン複合体ワクチンのタンパク質担体の役割は、重要なものであると思われる。抗体産生における最初のステップは、抗原の抗体産生細胞への結合を含むものであるから、高い結合能を有するタンパク質の使用は、複合体ワクチンに対する抗体応答を最適化するだろう。細菌毒素、および特にこれらのタンパク質の結合サブユニットは、哺乳動物細菌に関して例外的な結合親和性を有する。腸内細胞の熱不安定性エンテロトキシンの結合サブユニット（ＬＴ−８＞は、これらの結合サブユニットの最も研究されたものの１つである。本発明によると、これらの結合サブユニットは、複合体ワクチンにおけるハプテンの担体としてかなり効果的である。方法および組成物または、エンテロトキシン産生性エシェリキア・コリ株の熱不安定性エンテロトキシンの非毒性サブユニット（ＬＴ−８）に関してコードする遺伝子の単細胞宿主有機体におけるクローニングおよび発現を提供するものである。ＬＴ−Ｂを産生するための修飾宿主の選択および培養の方法、ならびにこの産物の単離および精製の方法もまた述べられる。このように産生されたＬＴ−Ｂは、いくつかの組型な免疫学的プロセスに関する本発明の方法によって利用され冑る。それは、家畜および人類医学にあける利用性を有するワクチンの製造に関し処方され得る。受動的投与によって、このようなワクチンからの抗体は、コレラ様エンテロトキシンの予防および／または治療に用いられ得るものである。本出願において用いられる場合、「コレラ様エンテロトキシンＪなる用５ｎは、コレラ毒素およびＬＴ、ならびにエシェリキア・コリ、ビブリオ・コレラもしくはその他のグラム陰性腸内細菌によって自然産生された免疫学的に関連したエンテロトキシン、ないしはサルモネラ［Ｓ　ａｌｍｏｎｅｌ　Ｉａｌ。エルシニア［竺肛牡旺ｕ１シュードモナス［Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓコ、シゲラ［旦ｈｉｇｅ旦ｊ、シトロバクタ−［Ｃ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ］、クレブシェラ［Ｋ　１ｅｂｓｉｅｌ　Ｉａｌおよび同様なものの株を包括する意味での任意の微生物中においてコレラ毒素、ＬＴあるいはこのような関連したエンテロトキシンをコード化する遺伝子の発現によって産生きれた免疫学的に関連したエンテロトキシンを意味するものである。完全なＬＴエンテロトキシンのそのＡｉＰ３よびＢサブユニットへの化学的分離よりあるいは遺伝子クローニングより誘導された、今までに考察されてきたすべてのその他のＬＴ−Ｂタンパク質とは異なり、本発明の産物は、非毒性で必る。この毒性効果からの一般的でない解放は、免疫処置法にあける使用に本発明が唯 −好ましいものであることを与えるものでおる。本発明のＬＴ−８をその他の方法によって産生された毒性形態と区別するために、これを非毒性り丁−Ｂ（ＬＴ −ＢＮＴ）と呼称する。４、

【図面の簡単な説明】

本発明は、」ス石の図面に関連させることによってより容易に（範驕を縮少することなく）理解されるで必ろう。第１図は、エシェリキア・コリのヒト単離体のＥｎｔプラスミドからのＬＴ遺伝子を含有する５、２Ｋｂ　フラグメントが挿入されている、ｐＢＲ３２２から誘導されたＬ丁発現プラスミドであるＩ）ＤＦ８２の製造の図式的表現である。第２図は、ＬＴ−Ｂ遺伝子を含みかつ旦１ｎｄｌＩＩ切断によってプラスミドｐＤＦ８２から誘導されたＱ、３ＫｂフラグメントのｐＢＲ３２２のシングル）− １ｉｎｄ１１１部位への挿入によるプラスミドｐＤＦ８７の構築の図式的表現である。第３図は、ＬＴ−８遺伝子を含みかつプラスミドρ０Ｆ８７から誘導されたＱ、３ＫｂフラグメントのｐＵｃ８のシングルＨｉｎｄ１１１部位中への挿入によるプラスミドｐＪＣ２１７の製造の図式的表現である。５、発明の詳細な説β 本発明の複合体は、担体タンパク質に共有結合した莢膜ポリマーの抗原決定基を得るために、莢膜ポリマーフラグメントの還元末端基を細菌毒素またはトキソイドの第１７ミノ基に反応させることによって形成される。該還元基は選択加水分解または特定の酸化的開裂によって形成され得少なくとも１つの還元末端を有する抗原性フラグメントは、個々の莢膜ポリマーの構造的特徴に依存して、種々の方法によって莢膜ポリマーから生成されることができる。過ヨウ素酸塩（あるいは関連試薬）による限定された酸化的開裂は、アルデヒド末端を残す。このようなアプローチ（よ、非環状残余物上に近接のジヒドロキシ基を有するポリマーに限られるであろう。グリコシド結合の加水分解は、還元糖末端を生成する。このような加水分解は、グリコシダーゼによって最も特異的に酸素的に行なわれ得るが、この適用は、関連するグリコシダーゼが公知である、例えばストレプトコッカス・二１−モニエ８　ＣＳ　ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　８　］などのようなかなりわずかの莢膜ポリマーに限定されるでおろう。酸による加水分解は、グリコシド結合の加水分解に一般的に用いられる。このアプローチの利用性は、ポリマーが酸感受性非グリコシド結合を有する場合あるいはポリマーが抗原特異性に重要な酸感受性分岐結合［ｂｒａｎｃｈ　ｔｉｎｋａｑｅ　］を含有する場合には限定される。複合は、シュワルツとグレイ、アーク、バイオケム。バイオフィズ、１８１：５４２〜５４９　（１９７７年）［３ｃｈｗａｒｔｚ　ａｎｄ　（３ｒａｙ　、△ｒｃｈ　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、１８１　：５４２−５４９　（１９７７）］の還元アミン化プロセスによって行なわれる。簡単に述べると、このプロセスは、還元莢膜ポリマーフラグメントと細菌毒素ないしトキソイドを、シアノボロハイドライドイオンあるいは関心対象の還元末端を低減することもまたＲＭないしトギソイド莢膜ポリマーに悪影響を及ぼすこともないその他の還元剤の存在下で反応させることを含むものである。シアノボロハイドライドイオン（あるいはその同等物）は、加水分解された莢膜ポリマーフラグメントのカルボニル基とタンパク質の７ミノ基との間で形成されるシッフ塩基［５ｃｈｉｎ　ｂａｓｅｌ中間体の緩和な選択的還元剤としてのみ作用する。これゆえに、活性な分子が最終製品の一部を形成する結合剤によって連結される従来用いられていた連結法とは異なり、本発明において利用されるシアノボロハイドライド還元アニオンは、最終製品中に取込まれない。これは最終製品の潜在的毒性を制御する見地から重要なことである。共有結合の証拠は例えばＰＰＰ部分と担体タンパク質との間の連合が、非共有結合を崩壊する極めて高い能力を有する８Ｍ尿素の存在下において、タンパク質の塩析にかかわらず持続するという事実によって示される。好ましい担体タンパク質は、若い哺乳動物への投与に間で安全でありかつ担体として免疫学的に有効なものである。安全性は、−次毒性の欠如およびアレルギー性合併症の最小化された危険性を含むものである。ジフテリアおよび破＠風トキンイドはこれらの基準を満たすものである、すなわち好ましく調製されると、これらは非毒性であり、そして、アレルギー性反応の降下は十分に実証される。アレルギー性反応の危険性が生体に関してかなり重要なものであるにもかかわらず、幼児に関しては最小化されている。「担体効果」において、弱い抗原ないしハプテンは、担体としてのより強い抗原（すなわち、異種タンパク質）に付盾されることによって、それのみで存在するよりも免疫原性なものとなる。動物が予め該担体のみで免疫されている場合、担体抗原のみならず付着したより弱い抗原に対する高められた応答に関して「準備された［ｐｒｉｎｒｅｄｌ　Ｊものとなる。幼児は破傷風およびジフテリア　トキソイドで慣例的に免疫処置される。これゆえに、彼らは、これらのトキソイドのいずれかに複合された莢膜ポリマー抗原のその後の提示に関して準備されたものであろう。通常、任意の異種タンパク質が担体抗原として与えられ得る。しかしながら、破＠風およびジフテリアなどのようないくつかの細菌毒素は、これらが２つの部分から溝成され、その一方（「結合［ｂｉｎｄｉｎｇコ」サブユニット）が、哺乳動物細胞表面へ結合するための強い親和力を有しているということにおいて付加的な利点を有する。考えられるところでは、このような「結合」タンパク質への複合は、免疫系のｌ１ｉＩ胞において、運搬される抗原により効果的な一次応答をなさせるものであろう。莢膜ポリマーが複合される担体タンパク質は、天然の毒素または脱毒化された毒素（トキソイド）であり得る。また、かなり最近の変異技術によって、毒素と抗原性的に同類でみるが、非毒性である遺伝的に変容されたタンパク質が産生されている。これらは「交差反応物質［ｃｒｏｓｓ　ｒｅａｃｔｉｎｇｍａｔｅｒｉａｌコ」またはＣＲＭと呼ばれている。ＣＲＭ１９□は、これが天然のジフテリア毒素からの単一アミノ酸変化を有するものであり、そしてそれと免疫学的に区別のつかないものであることから注目すべきものである。莢膜ポリマーの天然の毒素への複合は毒性を低減するでおろうが、有意な毒性が残存しているであろう。これゆえにさらに服毒性化が必要とされる。タンパク質毒素の周知の服毒性化は、タンパク質の遊離アミノ基と反応するフォルマリンを用いるものである。残留毒性が、ざらに考慮されるものでおる。さらにまた自発的な再毒性化が、ワクチンの任意の個々のロットであり得るものであり、そしてこのアプローチでの懸念の論争を残すものでおる。おるいはまた、天然の毒素は、莢膜ポリマーへの複合の前に、周知的なトキソイドを生成するためにフォルマリンで服毒性化され得る。しかしながら、予めの）ｔルマリン処理は、莢膜ポリマーフラグメントの還元基との反応に有効な遊離アミノ基の数を低減する。これゆえに、ＣＲＭ＠は、それらのアミノ基のいずれもフォルマリンによって占拠されていない一方、生来の毒性を有していないということにおいて重要な利点を有する。さらに利点はＣＲＭ類での作用において何ら生物災害が存在しないことである。免疫学的に天然の毒性と同一で必るＣＲＭ１９７の場合、フォルマリンでの処理（しかしながら、服毒性化する必要はない。）は免疫学的応答を極めて高めるものである。これは、からだの機構による分解に対する分子の安定化および／または架橋による凝集に起因するものでおると考えられる（粒子の免疫原性は、サイズと共に増加する）。すべての上記の理由により、破傷Ｆ９＆およびジフテリア毒素が、担体タンパク質として最良の候補であるが、さらに、また好ましいものであるその他のものもある。これらのその他のものは、ジフテリアおよび破傷風で見出された安全性の遍歴を有していないであろう、が、これらを使用するためのその他の圧倒的な理由がおるだろう。例えば、これらが、担体としてさらにより一層効果的である、あるいは製品経汎性が重要であるなどである。担体としてのその他の候補は、シュードモナス、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、百日咳菌およびエシェリキア・コリの毒性を含むものである。ワクチンを処方するための好ましい担体媒体には、リン酸ナトリウム緩衝化食塩水（ｐＨ７，４）あるいはｐＨ６でリン酸ナトリウムｔｉ化食塩水中に￥１．濁された０、１２５Ｍリン酸アルミニウム　ゲルならびのその他の周知の媒体が含まれる。一般的に、約５〜約１００μｑ、好ましくは約１０〜５０μｑを含有するワクチンが、若い恒温吐乳動物において莢膜ポリマーに対する抗体の有効なレベルを引き出すのに望ましい。もちろん、正確な投与量は、定型的な投与量／応答実験によって決定されるであろう。連続的に与えられた数回の少ない投与量が単回注射として与えられた複合体の同じ量よりも優れたものでおることが期待される。本発明のワクチンは、任意の年齢の恒温吐乳動物中へ注射によって投与され得、そして特に、ヘモフィルス、インフルエンゼ　タイプロ１エシエリキア・コリ、肺炎球菌、髄膜炎菌、ストレプトコッカスおよびシュードモナス病原体によって引き起こされる若い哺乳動物における全身性感染に対する能動免疫を誘導するために適用される。本発明はまた、エンテロトキシン産生性細菌株のエンテロトキシンの完全に非毒性の生物学的不活性なサブユニットを産生ずるための遺伝子スプライシング方法論の使用に関するものでおる。精製の債に、このＬ丁−Ｂサブユニットは、多価抗血清の製造のための免疫原として使用され１ｑる。このような抗血清は、エシェリキア・コリ、ビブリオ・コレレあるいはコレラ様エンテロ１〜キシンを産生ずるその他の細菌の株による腸内感染をその起因として有する下痢症の人類におけるあるいはその他の哺乳動物種にあける阻止および治療に適用性を有する。この抗血清はまた、このような微生物のコレラ様エンテロトキシンの存在に関する診断試験の準備に有用である。あるいはまた、Ｌ丁−Ｂ用されることができる。説明の目的のために、本発明の手法は、１つの実施例としてエシェリキア・コリの１つの特定のエンテロトキシン産生性株を用いて詳）ホされる。この微生物がヒト単離体であるという事実は、人類における使用により効力のある抗血清へと導くものでおる。しかしながら、ヒトの、ブタのあるいは他の起源のものであろうとなかろうと、多くのエンテロトキシン産生性株の毒素の匹敵するサブユニット間の強力な交差反応性がおることを強調しな（プればならない。これゆえ、本発明は、この目的のためのこれらの任意のものの潜在的使用を企図するものでおり、そして本発明中に述べられた方法はこれらすべてに均等に適用できるものである。本発明の方法は、論理的筋道において、（１）ＬＴ−８をコード化する遺伝子またはそのフラグメントの同定および単離、（２）この遺伝子またはそのフラグメントの適当なりローニングベヒクル中への挿入、（３）この遺伝子学的に変性されたクローニングベヒクルの適合性単細胞宿主有機体中への移植、（４）挿入された遺伝子配列を複製しかつ発現し得る適当に修飾されたクローニングベヒクルの選択および培養、（５）遺伝子産物の同定および精製、（６）抗体産生のための遺伝子産物の使用、ｄ３よび（７）治療学的、予防学的および診断学的目的への特異的抗体の使用を含むいくつかの段階を伴うものでおる。５．１．１Ｔ遺伝子の同定および単離ＬＴの産生に関する遺伝子およびそのサブユニットは、エンテロトキシン産生性エシェリキア・コリ株のプラスミド（Ｅｏｔ　プラスミド）上に担持される。これゆえ、エンテロトキシン誘発性下痢症に悩まされている人類あるいはその他の咄乳類種からの糞便試料は、必須な遺伝子配列の粗製の源として与えられる。これらの源からの単離体は、当業者に十分公知である標準的微生物学的技術を用いて十分な量で増殖され得る。不適当なことには、エンテロ１へキシンを生成する能力は、ｐｎｔ　プラスミドを担持し、かつエンテロトキシンを産生ずるエシェリキア・コリの株において何ら選択価を授与しない。エシェリキア・コリに−１２のような安定な研究至型株中へのＥｏｔ　プラスミドの移植を監視するために、望まれる第１段階として、おる方法においてプラスミドを標識することがこれゆえに必要である。本発明の例示される実施態様において、エシェリキア・コリＨ１０４，０７［旦、Ｃｏ１１　Ｈ１０４０７］のヒト単離体のプラスミドは、サンソネツテイら［５ａｎｓｏｎｅｔｔｉ　ａｔａｌ、’ｌ　（インフエクト、イムノ、３４　ニア５　（１９８１年）［Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　３４　：　７５　（１９８１）　１　）によって述べられたようなＦ’ｔｓ！ａｃ：　：　１”ｎ　５プラスミドからの転位によって表現型的に標識をつけられた。この標識されたプラスミドは、次に、Ｋ−１２株７１１への接合によって移植され、そしてＬ丁＝産生トランスコンシュガントが選択された。このトランスコンシュガントは、ガイルスら［Ｇｙｌｅｓ　ｅｔ　ａｌ、］　（ジエイ、インファクト、テイス、’ｌａＯ：４０（１９７４年）　［Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、　１３０：４０（１９７４）］）がＨ１０４０７においてエンテロトキでいる１つのサイズ（６Ｘ１０７ドルトン）の２つの大きなプラスミドを含むものであった。トランスコンシュガントがＬＴを産生じた事実の証明は、ＬＴに対して産生された抗体を用いて、酵素結合免疫吸着剤検定法（ＥＬＩＳＡ＞によって、および培養マウスＹ−１副腎細胞にあける形態学的変化の誘導により測定されるような生物学的活性によってなされた。このように移植されたプラスミドは、ポリバーとバックマン［Ｂｏｌｉｖａｒ　ａｎｄＢａｃｋｍａｎ　］の清澄化溶解産物技術［ｃｌｅａｒｅｄ　Ｉｙｓａｔｅ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ］　（メソッズ　イン　エンザイモロジイ　旦旦：２４５〜２６７　（１９７９年）　［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ旦旦：２４５−２６７　（１９７９）］　）によって単離され、そして特定のＬＴｍＴｍ配子配列制限エンドヌクレアーゼ切断によって単離された。　゛例示される実施態様においては、精製されたＥＮ丁プラが、ＬＴ産生（および続く１−丁−Ｂ産生）が臨界的遺伝子領域にあける切除によって破壊されない限り、いかなる制限酵素ないしこれらの組合せも用いられ得る。選択された特定の＃素は、用いられたクローニングベヒクルにおける単一切断を行なうものであることが好ましい。この第２の要求を満たすことは、多くの通常用いられるクローニングベヒクルの詳細な制限マツプが得られうるゆえに、容易に達せられる。適当な切断が、ＥＮＴプラスミドにおいておよびクローニングベヒクルにおいて（本実施例においてはプラスミドｐＢＲ３２２）Ｐｓｔ　Ｉによってなされると、１丁遺伝子フラグメントは、適当な結合酵素の使用によってクローニングベヒクルに結合された。結合酵素の代表物は、エシェリキア・コリからのおよびバクテリオファージＴ４からのＤＮＡリガーゼである。このような酵素は補因子としてのＡＴＰあるいはＮＡＤ　と共に、リン酸ジエステル結合を形成する。しＴ　ＤＮＡ　フラグメントを含むこれらの組換え型ＤＮＡ分子での宿主細菌細胞の形質転換は、必須のＤＮＡの複製の発生を与え、そしてこれは次に上記したようなＬＴの産生に関して分析され得、市るいはしＴ−８のみの産生に関しコードする特定の遺伝子フラグメントのこれに続く単離のためのプラスミドＤＮＡの源として使用され得る。しＴ　ＤＮＡ制限フラグメントのクローニングベクター中への挿入は、ＥＮＴプラスミドおよび上述のクローニングベヒクルが同じ制限酵素で切断された場合に、相補的ＤＮＡ末端がこれにより生成されるゆえに容易に達成され１ｑる。これが達成され得なかったとすると、プラント末端を生成するために一本鎖ＤＮＡを消化し返すことにより、あるいは一本鎖末端を適当なりＮＡポリメラーゼで満たすことによって同様の結果を達成することにより得られる切断末端を修飾する必要がある。この方法において、丁４リガーゼなどのような酵素でのプラント末端の連結反応が行なわれる。あるいはまた、望まれる任意の部位が、ＤＮＡ末端上にヌクレオチド配列（リンカ−）を連結させることによって生成され得る。このようなリンカ−は、制限部位認識配列をコード化する特定のオリゴヌクレオチド配列から構成される。切断されたベクターとＬＴ　ＤＮＡ　フラグメントはまた、七〇−［ＭＯＩＩＯＷ　］　（メソッズ　イン　エンザイモロジー　旦旦：３　（１９７９年＞　［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥ　ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６旦：３　（１９７９）コ〕によって述べられるような単独重合性ティリング［ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒｉｃ　ｔａｉｌｉｎｇ　３によっても修飾され得る。ＬＴＩ伝子ケミるいはそのフラグメントの単離の代用手段としては、遺伝子配列（公知である場合）の化学的合成あるいはＬＪ遺伝子をコード化するメツセンジャーＤＮＡに相補的であるＤＮＡの調製などが含まれるが、もちろんこれらに限定されるものではない。５．２．　１丁−Ｂ遺伝子の同定および単離ＬＴ−８の産生に関してコードする遺伝子フラグメントは、ＬＴ−Ａの産生に関してコードする遺伝子フラグメントに隣接しそして下流に位置する。これらの特定の遺伝子フラグメントを側面に持つＬＴ遺伝子の内にいくつかの制限エンドヌクレアーゼ部位が必る。これゆえ、制限酵素は、研究下（ＬＴ−８＞のフラグメントに関する溝道遺伝子を干渉しないものが選ばれる。同定されそして単離されると、ＬＴ−８遺伝子ないしは遺伝子フラグメントは、挿入された遺伝子配列の転写および翻訳に関する必須エレメントを含む適当な発現ベクター中へ挿入される。１丁−Ｂサブユニットに関するプロモーター領域は、通常Ａサブユニット遺伝子によって供給され、そしてこの毒性産物はなくされるべきでおるゆえに、発現ベクターは、１丁−Ｂ遺伝子を有する配列において読まれ得るそれ自身のプロモーターを含むべきである。ＬＴ−８遺伝子が挿入され得るプラスミドの多（は、このようなプロモーター領域、例えばわずか２つの例ではあるがプラスミドＩ）ＢＲ３２２のテトラサイクリン耐性遺伝子およびプラスミドｐｕｃａのラクトース遺伝子など、を含むものである。ＬＴ−Ｂ遺伝子ないし遺伝子フラグメントの十分な転写は、ざらに特定の開始信号の存在に依存する。通常用いられる１つの信号は、ＡＴＧ配列である。ＡＴＧ配列の源は、大腸菌ファージ　λ　［ｃｏｌｉｐｈａｇｅ　ｌａｍｂｄａ］のｃｒ’ｏもしくは！ｉ遺伝子およびエシェリキア・コリ　トリプトファンＥ。Ｄ、Ｃ，ＢもしくはＡ３ｍ伝子ケミを含むが、もちろん何らこれらに限定されるものではない。このような開始配列は、ＬＴ−８遺伝子ないしフラグメントが挿入され得る他の遺伝子配列の多くの中に見出され得、そしてこれらは、また合成的に製造され１ｑる。強力な翻訳は、十分なりボンーム付着を容易とするシャインーダルガルノ（ＳＤ）配列の有効性に結びつけられる。このようなＳＤ配列は、十分なメツセージ読み出しのために、プロモーターと開始信号の間にさしはさまれなければならない。ＬＴ−８タンパク質の目的とする高レベルの産生は、これゆえ、プロモーター、ＳＤおよび開始配列より下流のＬＴ−Ｂｉ伝子配列の挿入に依存する。これらの要求に合致する数多くのクローニングベヒクルが用いられ得、ＳＶ４０、アデノウィルス、酵母、λ　ｑｔ−ＷＥＳ−λＢ　シ１０ン４△および２６　［ｌａｍｂｄａ　ｇｔ　−ＷＥＳ　−ｌａｍｂｄａ　Ｂ　Ｃｈａｒｏｎ　４△ａｎｄ２８］、λ−ｇｔ−１−λＢ、例えばｐｕｃｓ、ｐＵＣ９，１）ＵＣｌ３およびｐＵＣ１９、ｐＢＩ又３１３、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２５、０へＣ’ １０５、０■Δ５］、　ｐへＣＹ１７７、　ｐＫ　ト１４７　、　ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＢｌｌｏ、　Ｉ）ＭＢ９　、Ｃｏ１Ｅ１、ｐＳＣｌｏｌ、ｌ）Ｍ　Ｌ　２１、Ｒ８Ｆ２１２４．１）ＣＲＩまたはＲＰ４などのようなＭ１３由来ベクターなどがこれに含まれるが、もちろんこれらに何ら限定されるものではない。これらのクローニングベヒクルの多くは、Ｉ）ＢＲ３２２におけるアンピリジンおよびテトラサイクリン耐性ならびにｐｕｃｓにあ（ブるアンピリジン耐性およびβ−ガラクトシダーゼ活性などのような、望まれたトランスフォーマント（被形質転換体）のために選択することに用いられ得る１ないしそれ以上の標識活性を含んでいる。選択は、このようなベクターが挿入される宿主細胞が、このような活性を全く含んでいない場合、および活性の１つがＬＴ−Ｂｍｍ壬子いしは遺伝子フラグメントの挿入によって失なわれた場合に極めて単純化される。組換え型クローニングベクターの宿主細胞中への移植は、種々の方法において実行され得る。選ばれた特定のベクター／宿主細胞系に依存して、このような移植は、形質転換、形質導入またはトランスフェクションによってもたらされる。産生されたＬＴ−８サブユニツトの質および積に依存して、１ないしそれ以上のクローンが調製されるべきである。本発明の例示される実施態様においては、ＬＴ−Ｂ遺伝子を連続して２つのプラスミドｐＢＲ，３２２中にそして最終的にプラスミドｐｕｃａ中に移植すること必要であった。この複数のクローニング連続は、すべてのクローンがしＴ−Ｂタンパク質を産生する一方、ｐＢＲ３２２組換え休がＬＴ−８の低いレベル（およそ１ｍｇ／、Ｑ）を産生じそして毒性遺伝子産物をもたらしたという事実によって必要とされた。この毒性は、上記第６．７．２節において詳述されるＹ１副腎細胞検定系における分析によって明らかにされた。この毒性の根拠は理解されていないが、毒性り丁−へザブユニットは調製物中に検知されなかった。本明細書中に述べる特定の実施態様にＪ′３いては、野生型エンテロトキシン産生性エシェリキア・コリ株中に存在するより５０倍高いレベルで最終ＬＴ−ＢＮＴ産生が達せられた。５．３．　ＬニーＢＮＴの精製エシェリキア・コリに−１２において産生きれた場合、しＴ−ＢＮＴはペリプラスム間隙にとどまる。本発明の望まれるサブユニット産物を遊離するために、外膜を破壊することがこれゆえ必要とされる。これは好ましくは、音波処理によって、あるいは、フレンチプレッシャーセル［Ｆｒｃｎｃｈ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｃｅｌｌｌなどのような他の機械的破壊手段によって達せられる。細胞破壊はまた、化学的または酵素的手段によっても達成され得る。２価カチオンが細胞膜完全性にしばしば要求されるゆえに、ＥＤＴ△ヤＥＧＴＡなどのような適当なキレート化剤での処理は、細胞よりのＬＴ−ＢＮＨの漏洩を容易とするのに十分な破壊を与えるであろう。同様に、リゾチームなどのような酵素が、ＬＴ−ＢＮＴ以外のタンパク質で同様の結果をもたらすために用いられでいる。この酵素は、＃ｌ胞壁のペプチドグリカンでの中心的支持力を加水分解する。しかしながら、以下に述べる本発明の特定の例示においては、リゾチームは回収され得るＬ丁−ＢＮＴの６０％損失をもたらした。浸透圧衝撃の適用がまた用いられＩＵる。簡単に言えば、これは、水を損失するおよび収縮することを細胞になさせる高張液中への細胞の第１の配置によって達せられる。これに続く低張「衝撃」液中への配置は、次に望まれるＬ丁−ＢＮＴの排除を伴なう細胞中への水の迅速な流入を導く。細胞から１ｍされると、Ｌ丁〜ＢＮ丁は、ＦｆＡｔｌナトリウムあるいは硫酸アンモニウムなどのような塩を用いての沈降反応、限外濾過あるいは当業者に公知でおるその他の方法によって濃縮され得る。さらに精製は、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、分離用ディスク−ゲルあるいはカーテン電気泳動法、等電点分画電気泳動法、低温有機溶媒分画法または向流分配法などを含む（もちろんこれらに限定されるわけではない。）周知のタンパク質精製技術によって達成され得る。しかしながら精製は、好ましくは、７ガロースに結合する親和性である、ＬＴ、Ｌ丁−ＢおよびＬＴ−ＢＮＴの固有の特性の利己的利用によって行なわれる。完全毒素とＢサブユニットの双方が、アガロースのガラクトシル残余物に、強固に結合する。これゆえ、Ｌ丁−ＢＮＴは、アガロースカラムを通してのＬＴ−ＢＮＴを含む溶液の通過に伴なう該サブユニットの選択的保持によって最もよく精製される。結合させそして緩衝液でカラムを洗浄して他のタンパク質を除去すると、該サブユニットは、カラムを通してガラクＩ・−ス含有溶液を通過させることにより遊離される。このアフィニティークロマトグラフィー的な技術は、エシェリキア・コリに−１２が、ラフ型細菌株でおるゆえに、これを用いて十分に作用する。野生型株は、それらの外膜中のガラクトシル残余物に産生されたＬＴ− ＢＮＴを結合し、そして該サブユニットの非常にわずかの量がこれらの株よりアガロースカラム上に回収され得る。これゆえ、この技術は野生型株を用いて特別な場合に首尾よく用いられ得るが、最良の結果は、Ｌ丁−ＢＮＴＪ伝子がケミされたエシェリキア・コリに−１２で得られる。５．４．１Ｔ−８に対する抗イの調製および使用本発明の１つの目的は、組換えＤＮＡ技術による、エンテロトキシン産生性エシェリキア・コリ細菌の熱不安定性エンテロトキシンの非毒性サブユニットの産生である。このようなザブユニットは、次にヒトにおける必るいは他の動物における細菌誘発性下痢症感染に対する防御免疫学的応答を生むためのワクチ・ンにあける免疫原として用いられ得る。ＬＴ−ＢＮ丁サブユニットが、すべてのエンテロトキシン産生性エシェリキア・コリ株のおよびビブリオ・コレレの熱不安定性エンテロトキシンに対し抗原性的に関係するゆえに、このような予防接種は広範な免疫を与える。本発明の産物が生物学的に不活性でかつ完全に非毒性であるという事実は、完全毒素あるいは微生物を用いては、たとえ後者が殺されたあるいは弱毒化されたものでめったとしても得ることのできない安全性の度合を有して用いられ得るということを保証するものである。上記の第５，３節において）ホべたような精製の後に、単離ＬＴ−ＢＮＴサブユニットは、ワクチンとして直接に用いることができ、また適当な濃度で予防接種のための７ジユバンド中に取込ませることもできる。このような適当な濃度は、当業者に公知であるか、または定型的な実験によって決定できるものである。動物の予防接種に適当なアジュバントは、フロイント完全もしくは不完全アジュバント（ヒトもしくは家畜使用には適さない。）、アジュバント６５（ビーナツツ油、マンニドモノオレエートおよびアルミニウムモノステアレートを含む）、および例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびミョウバンなどのようなミネラルゲル；例えばヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リソレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムプロミド、Ｎジエチル−プロパンジアミン）、メトキシヘキサデシルグリセロールおよび測成多価アルコール類［ｐｌｕｔｏｎｉｃ　ｐｏｌｙｏｌｓｌなどのような界面活性剤：例えば、ビラン、デキストランＦａ酸、ポリＩＣ，ポリアクリル酸、カルボポル１］などのようなポリアニオン；例えばムラミルジペプチド、ジメチルグリジン、タフトシンなどのようなペプチド；ならびに油エマルジョンを含むが、もちろんこれらに限定されるわけではない。ＬＴ−ＢＮ丁はまた、リポソームもしくは伯のマイクロキャリアー中への取込みに続いて、またはポリサッカライド、その他のタンパク質もしくはその他のポリマーへの接合の後に投与され得る。本発明の例示する実施態様は、非常に免疫原性であると判明したので、高い抗体力価はマウスにおいてアジュバントの使用なしに得られた〔下記、第６．１１．１節参照のこと。〕。この様式における能動免疫によって、家畜、その他の飼育動物および人類の防御が達成され得る。このような防御は、主として」−分な分泌型Ｉ（ＩＡ不応答発生に依存するものである。この理由のため、および最も下痢症感染を受けやすい場合にヒトおよび他の咄乳類新生児がかなり免疫学的不適格者であるゆえに、受動的免疫アプローチがとられることが好ましい。従って、抗しＴ−ＢＮＴ抗血清は、ヤギ、雌ウシ、雄ウシ、ヒツジ、ウマなどのような広範な咄乳類種において、おるいは鳥類種において製造され得、そしてＩＣＩＧ分画が血漿分離交換法あるいは他の手段によって単離された。この分画は、次に適当な担体あるいは例えば幼児処方または幼児穀物などのような幼児食物を介してヒト幼児に投与されることができた。家畜に関しては、免疫グロブリンは、家畜飼料あるいは適当な薬理学的賦形剤中への混合の後に与えられることができた。特別な関心対象の家畜は、新生子ブタ、子ウシおよび子ヒツジである。本発明の免疫グロブリンは、液体または固体の薬理学的担体のいずれとも混合されることができ、また、この組成物は、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、懸濁液または溶液の形態であり得る。この組成物はまた、適当な保存薬、着色および風味剤、あるいは徐放をもたらす試薬を含むことができる。本発明の薬理学的組成物の調製に用いられることのできる可能性のある担体としては、ゼラチンカプセル、糖、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩などのようなセルロース誘導体、ゼラチン、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ビーナツツ油などのような野菜油、グリセリン、ソルビトール、寒天および水などが含まれるが、もちろんこれらに限定されるわけではない。担体は、また便利な口中投与のための組成物の錠剤化を容易とするために結合剤として与えられる。もちろん、単クローン性抗体も、同様の結果を達成するためにこの技術によって製造され得る。Ｂ細胞などのような、抗体を産生する能力を有する体細胞が、ハイブリドーマ細胞を産生ずるために、ｅｌｌ）１骨髄腫系ｍ胞と融合される。このような細胞は、試験管内で必るいは腹水腫瘍として、大量の特異的抗体を産生ずるために定限なく＠養された。ハイブリドーマ細胞は容易にクローン化されるゆえ、数多くの細胞を迅速に産生することができ、この細胞のすべてが、共通抗原決定基に指向した同様の特異的抗体分子を産生するものである。抗体産生にあけるこの例外的な均一性は、抗体が特異的診断学試験において用いられなければならない場合に有利である。抗原の注射によって準備された動物のリンパ節および牌臓は、Ｂ，ｆｌｌＩ胞の有効な源であり、一方、これらの細胞を感作されていない動物から除去し、、これを単離の後に試験管内で準備することも等しく可能である。マウスおよびラットのＢリンパ球がハイブリドーマ産生にもつとも頻繁に用いられるが、ウサギ、ヒト、カルボまたはその伯の動物からの細胞が代わって用いられ得る。本発明の好ましい実施態様においては、試験管内でＬＴ−ＢＮＨに感作されたマウス牌臓細胞が、融合された細胞ハイブリッドを形成するために用いられる。多くの特殊骨髄腫細胞系が、ハイブリドーマ産生におＣプる使用に関して、リンパ球性腫瘍より発展してきている（コーラ−とミルスティン、ユーロツプ．ジエイ．イムツル、旦：５１］〜５１９　（１９７６年）；シ１−ルマンら、ネイチャー　２７６　：　２６９〜２７０　（１９７８年）　［Ｋ−５　１９　（１９７６）　；Ｓｈｕｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ　２７６：２６９−２７０　（１９７８）］　）。産生された多くのこのような細胞系の中で、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３／ＮＳ１／１　−ＡＱ　４　−　１、Ｓｐ２１０−Ａ（ＩＩ　１４および３１９４１５、ＸＸＯ．ＢＵ．１が頻繁に用いられている。本発明の実施例においては、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と呼称されるマウス骨髄腫細胞系が好ましい。ハイブリドーマを産生するための、抗体産生牌臓あるいはリンパ節細胞の、母髄腫細胞との融合は、代表的には、より低い割合が用いられるが２０：１程度の高さでありうる骨ｆｆＪ腫細胞よりも牌細胞またはリンパ球過剰な状態において通常行なわれる。融合は、紫外線不活化センダイウィルスまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのような融合促進剤の使用によって容易とされる。ゲッターら［Ｑｅｆｔｅｒ　ｅｔ　ａｔ．コ　〔ツマティックセル　ジエネット．３：２３１〜２３６　（１９７７年）　［３ｏｎａｔｉｃ　Ｃｅｌｌ　Ｇｅｎｅｔ、３　：２３１−２３６　（１９７７）］　）は、ジメチルスルフオキシドのＰＥＧとの組合せはざらにｉ胞隔合を高めることを報告している。例外的に高い度合の効率で細ｊノ隻を融合し得る電気的用具がまた利用できる。融合が起こると、バイブリド−７細胞は融合されなかった親細胞株より選択されなければならない。この選択プロセスは、ハイブリドーマ細胞増殖を支持するが親細胞増殖を支持しない培地中にあける細胞」Ｂ６によって容易に達成され得る。融合に用いられた体Ｂ細胞は培養にあける限定された寿命を有し、そしてこれゆえこれらが老衰および死滅を受ける時に失なわれるが、定限のない培養寿命を有する親骨髄腫細胞は、特別の選択技術によって消去されなければならない。本発明の実施例においては、ヒポキサンチンホスフォリボシルトランスフェラーゼを欠いた（＋−（ＰＲＴｉ骨髄腫細胞が用いられた。これらのＭＵ胞は、ヒボキザンチン遊離塩基の再刊用に関するスカベンジャー経路を欠き、そしてアミノプテリンなどのような阻止因子がプリン新生経路を阻害するために用いられる場合には、生存できないものである。青髄腫親細胞はこれゆえ、ヒボキサンチン／アミノプテリン／デミジン（＋−Ｉ　Ａ　Ｔ　＞培地中に融合混合物を培養することによって選択され、一方ハイブリドーマｌ１１１１ａは、抗体産生性融合親細胞によるＨＰＲＴの寄与により生存する。選択培養の期間の後、生存するハイブリドーマ細胞はクローン化され、株は標準細胞培養法によって増殖され、そしてクローンが産生する所望の特異的免疫グロブリンは、抗体が指向する抗原の使用によって、酵素結合免疫吸着剤検定法（ＥＬＩＳ△）に基づく、あるいはその他の試験によって検知される。本発明の使用によって得られうる抗ＬＴ−ＢＮＴ抗体はざらにエンテロ１〜キシン診断試験の調製のために用いられ得る。このような診断系は、遊離溶液あるいは同相におけるラジオイムノアッセイ（放射線免疫検定法）の形態を取り得る。あるいはまた、酵素結合免疫吸着剤検定法が、イムノプロット［ｉｍｍｎｏｂｌｏｔ］分析に基づく検定法と同じく作成され得る。これらの検定法は、直接のものであってもあるいは抗ＬＴ−ＢＮ丁抗体に指向する第２の抗体の適用を用いる間接のものでおってもよい。可能性のほんのわずかであるペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼなどと共に、数多くの酵素活性が抗体に結合し得る。当業者はまた、例えばいくつかの凝集試験の１つにおけるような、診断学的立場において抗り丁−ＢＮ丁抗体が利用されｌｉＪるその他の多くの用途があることを認識できよう。このような凝集検定においては、抗体と任意のコレラ様エンテロトキシン産生性細菌性エンテロトキシン（おるいはそれからの結合サブユニット）との相互作用は、粒子が抗ＬＴ−ＢＮ丁抗体で被覆されている系を用いて検知される。このような粒子は、ラテックスビーズ、リボソーム、赤血球、ポリアクリルアミドビーズ、あるいはいくつかの適当なポリマーの任意のものでおり得る。以下は、本発明のおよびＬＴ−８の典型的な免疫原性複合体の調製に関する方法、ならびにこれらのワクチンにおける使用の非限定的な実施例である。６、実施例６．１．ＰＲＰ含有還元末端基の大きな、中ぐらいのおよび小ざなフラグメントの生成ならびにヘモフィルス・インフルエンゼタイプｂの莢膜ポリマーは、繰返し単位［−３−β−Ｄ−リボシル（１−１）リビトール（５−ホスフェート）− ］　（ＰＲＰ）を有する線状ポリマーである。一般に、ＰＲＰの加水分解は、全ソボースの還元リボースに対する比が２５ないしそれ以下に下降するまで行なわれる。得られたサイズ混合フラグメントは、複合のために、望まれるサイズ範囲のフラグメントを単離するために分子ふるいカラムクロマトグラフィーによって分画される。フラグメントを得るための方法は以下の通りである。ａ、リボース２８．６ｍＱを含有するナトリウムＰＲＰ（核酸含１０．００６％）の試料が、蒸溜水で溶解されて１２５ｄ容三角フラスコにおいて全容ｆｆ１９．２ｍとされ、そして水中で冷された。ｂ、　０．１Ｎ　トＬｚ　８０４　１．０２ｍ１が加えられた。Ｃ８酸性化ＰＰＰのＯ，ＯＭの二重のサンプルが、氷上に保持された試験管へ移された（０分）。ｄ、フラスコは沸騰水浴中へ３分間移され、そして次に氷水浴中で冷された。ｅ、ステップＣが繰返された（３分サンプル）。ｆ、サンプルは、Ｄ−リボースで標準化されたアルカリ性へキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸塩によって還元力に関して検定された。ｑ、この結果（第１表参照）に基づいて、ステップｄが繰返された。ｆ９　ステップＣが繰返されたく６分サンプル）。ｉ、ステップｆが繰返された。第１表サンプル　還元リボースの　全リボース／ナノモル（平均）　還元リボース比Ｏ分　０．４２　４９３３分　６．０８　３４．０６分　９．６６　２１．４結果（第１表参照）は、加水分解の総モードが（１−１）グリコシド結合であったと仮定すると、数平均鎖長は２１゜４モノマー単位、すなわち（リビトール− ５−ホスフェート−３−リボース〉でおることを示した。ｊ、　１Ｎ　ＮａＯＨ０，１０２ｍ１がｈ口えられ、そしてｌ）Ｈが指示紙によって評価されたく約ｐｌ−１６）。ｋ、中性化加水分解物が凍結乾燥された。１、バイオ−グルＰ１０　［Ｂｉｏ　−Ｇｅｔ　ＰＩＯコ　（バイオランドインコーホレーテッド［Ｂｉｏ　−Ｒａｄ　Ｉｎｃ、コが０゜１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート中で平衡化され、そして直径’１，５ｃ＋ｎのクロマトグラフィーカラムに注がれ、９８ｃｍのゲル床高さを与えた。ｍ、凍結乾燥化された物質（ステップｋ）は、水２゜７、ｍｌで再水和され、そして１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート０．３ｄが加えられた。この溶液は該カラムへと適用されそして溶出が３．５ｍ１分画の採取を行ないながら実行された。ｎ、リボシル残余物の溶出は、Ｄ−リボースを標準として用いるオルシノール反応によるリボース含量に関するそれぞれの分画の０．００５ｍ１サンプルの検定によって測定された。０、分画は、第２表に示されるようなし１ＭおよびＳの３つのプール中へ合併され、そして該プールは全リボースおよび還元リボースに関して検定された。（以下余白） ′Ｊｉ！ｆ表昭６１−５０２９５７　（１９）第２表含まれる　全リボース　全リボース／　見積り０　分画のＶｅ／Ｖ。スニ止　分画　ミクロモル　還元リボース比　盆子数　の範囲１　１５〜１８　５７７　３１．２　１１，０００　５１．０３Ｍ　１９〜２３　７４４　１８．６　６，８００　１．０９〜１．３８３　２４〜３４１１８０　９．１　３，４００　１．３９〜１．９９“総加水分解はグリコシド的であるとの仮定の上でのものである。 ρ、該プールは凍結乾燥され、水１０Ｉｄ！で再水和され、再凍結乾燥され、そして水１．５ｍで再水和された。最後の溶液１．２ｄがマイクロ遠心分離管へ移され、そして複合反応のための調製物に凍結乾燥された。ａ、凍結乾燥されたフラグメントＬ、ＭおよびＳを含有するマイクロ遠心分離群ならびに空の遠心分離管（Ｃないしは比較対照）へ、リン酸カリウム緩衝液ｐＨ８、ＣＲＭ１９□２．７ｍｇおよびナトリウムシアノボロハイドライド４ｍ（］が添加され、そして最終容量が０．２ｍｌおよびリン酸緩衝液が０．２Ｍとなった。ｂ、咳管は不断に混合しながら３７℃でインキ１ベートされた。Ｃ３１８時間後に、該管は７０００Ｇで２分間遠心分離された。ｄ、　タンパク質の大部分が沈澱物中におるという決定の後に、沈澱物は、１ｍｌ以下の水で４回洗浄された。ｅ、洗浄された沈澱物は、尿素で８Ｍにされて、５０°Ｃにあためられ、食塩水に対して４°Ｃで１晩透析され、そして遠心分離された。上澄み液は分離されそして硫酸アンモニウムで９５％飽和したものとされ、４°Ｃで１晩保たれ、そして遠心分離された。得られた沈澱物は、９５％飽和硫酸アンモニウム０．４ｍで３回洗浄され、そして水１ｄに懸濁された。れらのコロイド状懸濁液は、それぞれＣＲＭ１９７−ＰＲＰ−Ｌ、ＣＲＭｌ、７−ＰＲＰ−Ｍ、ＣＲＭ１９７−ＰＲＰ−３およびＣＲＭｌ、７−８とラベルされた。Ｆ、　該調製物は、ウシアルブミンを標準として用いるフォリンフェノール反応［ＦＯＩｉｎ　ｐｈｅｎｏｌ　ｒｅａｃｔｒｏｎ　］によってタンパク質に関して、またＤ−リボースを標準として用いるオルシノール反応によってリボシル残余物に関して検定された。該調製物は、ＰＰＰ抗原活性に関して、ヒト抗ＰＲＰ抗体への標識された天然のＰＰＰの結合を阻止するそれらの能力（５０μＱタンパク質／／ｎＩ！の濃度において）によって検定された（第３表）。１−ｌ−に抗原活性試験された　結合した　（ｎｇＰＲＰ調製物／天然のＰＲＰ　Ｏ，５ｎｇ／ｍ　６．７　−天然のＰＲＰ　５ｎＯ／　ｄ　０．９４　−ＣＲＭ１９７−Ｃ３４，３０，０ＣＲＭ１９７−ＰＲＰ−３２，００，１ＣＲＭ１９□−ＰＲＰ−Ｍ　２．５　０．０８ＣＲＭ１９□−ＰＲＰ−Ｌ　３．９　０．００６このように０８Ｍ１９７がＰＲＰフラグメントなしにシアノボロハイドライドにさらされた比較対照調製物が思った通りに不活性でおったのに対し、ＰＲＰフラグメントとの０８Ｍ１９７の複合体の試験されたすべてのものは、抗原性的に活性であった。調製物は、高分子量精製ＰＰＰと比較して、ウサギにおける免疫抗原性に関し検定され、そして結果は第４表に示される。ＰＲＰ対照またはＣＲＭ　−Ｃ対照を与えられたウサギは、抗ＰＲＰ抗体にお（プるかろうじて検知できる増加をもたらした。３種のＣＲＭ１９□−ＰＲＰ複合体のいずれかを与えられたウサギは、それぞれの注射の後に進歩的な増加をもたらし、３度回の注射の後の力価は、免疫前よりも１ｏｏｏ倍も大きなものであった。示されない実験において、０８Ｍ１９７とＰＲＰフラグメント調製物りの単なる混合物がウサギにおいて検定され、そして抗ＰＲＰ抗体を誘い出すことはないことが見出された。（以下余白）１」Ｌｋ通常のジフテリアトキソイドで予め処置された離乳ウサギ４の合されたおよび比較対照のワクチンに対する抗ＰＲＰ抗体応答１、　ＰＦ？Ｐ　（）ＩＷＩＯ５＞　＜１０　１２　２８　４０２、　ｔｔ　＜１０　＜１０　２７　２６れの第６週齢で０．０１２５　Ｍリン酸アルミニウムｐＨ６の０．５ｍｌ中に含有されたジフテリアトキソイド（マサチ１−セツチデパートメントオブパブリックヘルス［Ｈａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　Ｄｅｐｔ、　ｏｆ　Ｐｕｂｌ　ｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ］　４０Ｌ　ｆで皮下注射された。 ″”　ＰＲＰワクチンは食塩水０．１ｍｌ中に含まれた３０Ａ１ｇＰＲＰロッド７であった。他のワクチンは０．０１２５　Ｍリン酸アルミニウムｐＨ６の０．５ｍｌ中に含まれたタンパク賀２５μってあった。る放射線抗原により測定された、それぞれの力価である。複合体によって誘導された抗ＰＲＰ抗体の防御能は、第４表のウサギ血清の殺菌活性を試験することによって評価された。殺菌価は、アンダーソンら、ジャーナル　オブク１ノニカル　インベスティゲーション　第６５巻、第８８５〜８９１頁（１９８０年）　［Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、　Ｖｏｌｕｍｅ　６５．　ｐａｇｅｓ８８５−８９１（１９８０）コの方は、予防接種前は、血清は最近を殺すことができないものであった（逆数力価〈２）ことを示す。３回の注射の後、ＣＲＭ　１９□−ＰＰＰ複合体を与えられたウサギの逆数力価は１６ないしそれ以上に上昇したが、一方ＣＲＭ１９１対照を与えられたウサギの力価は２未満にとどまった。（以下余白）第５表ＰＲＰ（７）オ’ＪｊｌＳ、Ｍ＃よびＬと（７）ＣＲＭ１ｇ７　（７）複合体の０８Ｍ１９７で予防接種“された離乳ウサギの血清のへモフィルス・インフルエンザｂａＥａｑに対する細菌価９０％を超える殺菌のための血清希釈の逆数予防　３回皇竺工　与えられたワクチン　接種前　注射後３　ＣＲＭ　１９７対照　〈２〈２４　０８Ｍ１９７対照　＜２＜２５　０８Ｍ１９７−ＰＲＰ−３＜２　１２８６　ＣＲＭ１ｇ７−ＰＰＰ−３＜２　≧２５６７　ＣＲＭ１ｇ７−　ＰＰＰ−Ｍ　＜２　１６８　ＣＲＭ１ｇ７−　ＰＲＰ−Ｍ　＜２　６４９　０８Ｍ１９７−ＰＲＰ−Ｌ　＜２　６４１０　０８Ｍ１９７−ＰＲＰ−Ｌ　＜２　３２“第４表において述べたものと同様の予防接種。この実施例において、ＣＲＭｌ、７に対するＰＲＰフラグメントＳの比率は変化され、そしてＣＲＭ１９７成分の抗原活性′−”：　ｌ　ｌ　＜　ｐ成分への添加において調べられた。ａ、マイクロ遠心分離管ＡおよびＢに、上記で述べた（すなわちステップＯおよびｐ）フラグメントＳの溶液０゜１５ｍ１がそれぞれ加えられた。該溶液は凍結乾燥された。ｂ、管Ａは、２Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ８の０゜０１°、１．／、０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液１）＋７中の５ｍｏ／＊のＣＲＭｌ、７の０．　１ｍ１および２００ｍＭｔｄす１〜リウムシアノボロハイドライドの０．０］！ｌｄを与えられＩこ　。Ｃ３管Ｂは該ｐＨ８の緩衝液０．００２ｍおよび該ＣＲＭ１９７溶液０．１ｄを与えられた。得られた溶液は凍結乾燥された。この固体は、水０．０１５ｄで懸濁され、そして該ｐｔ−（８の緩衝液０．００２ｍ１がハ１１えられた。ｄ、管△およびＢは３７°Ｃで１３日間インギ１ベートされた。管Ｂに対してシアノボロハイドライド０．００２威がさらに添加された。双方の管は、３７°Ｃでざらに３日間イン；１：ユベートされた。（減少した反応容量によって、已におりる反応物の濃度はへのものよりも高くなったことをしるす。）ｅ、△に対し、水０．０６威および飽和硫酸アンモニウム（ＳＡＳ）０．８ｄが加えられた。Ｂに対しては、水０．１７５ｍ１および５Ａ３０．８ｍｌが加えられた。ｆ、該管は、０℃で１時間インキュベートされ、そして８０００Ｇで２０分間遠心分離された。上澄み液が除去された。ｑ、沈澱物は、８Ｑ％ＳＡＳ　ｌ　ｍｅ中への懸濁、８０００Ｇで２０分間の遠心分離そして上澄み液の除去によって洗浄された。ｈ、沈澱物は、水０．１ｍで懸濁され、そして５ＡＳ０．４ｄが添加された。ｉ、ステップｆと同じ。ｊ、ステップＱと同じ。ｋ、Ｂにおける沈澱物は、９．５Ｍ隊素０．０８４ばで溶解され（最終濃度は８Ｍと見積られた。）、水０．１ｍｌおよび５Ａ３０．８ｄが添加され、そして沈澱物がステップｆにお（プるようにして単離された。この沈澱物はステップｑにおけるようにして洗）争された。１、　ＡおよびＢにあＣプる沈澱物は、水０７２ｄで懸濁された。懸濁液は８０００Ｇで３０分間の遠心分離することによって可溶性（Ｓ＞分画および不溶性（ｉ）分画へ分離され、そしてＳ分画（上澄み液）は、０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨとされそして貯蔵された。ｍ、　１分画（沈澱物）は、以下のようにしてより可溶性にされた：ｉ分画は尿素で８Ｍとされ、そしてこれは０゜０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液１）＋７に対しての透析によって段階的に除去された。得られた溶液はそれぞれのＳ分画へ再び組合させた。ｎ、調製物△およびＢは、フォリンフェノール試薬［ｒｏｌｉｎ　ｐｈｅｎｏｌ　ｒｅａｇｅｎｔ］でタンパク質含量に関して、また上記した検定法によってＰＲＰ抗原活性に関して試験された。以下に示すように、双方ともＰＲＰ活性を有するが、Ｂは八よりも約１３倍優れていた。ｎ（ＩＰＲＰ当量／調製物　μΩタンパク質ＣＲＭ１９７−ＰＲＰ−Ｓナンバー２．Ａ　Ｏ，０３８ＣＲＭ１９７−ＰＲＰ− Ｓナンバー２．Ｂ　Ｏ，５００、調製物△ｄ５よびＢは、マサチューセッツ　デパートメント　オブ　パブリック　ヘルスによって供給された精製ジフテリアトキソイドのサンプルへの抗体の結合の阻止によってＣＲＭＦｃ原性（ジフテリアトキソイド（ＤＴ）としての活性）に関しで試験された。以下に示すように、双方とも、重量にもとづいた場合、概ねＤＴと等しい活性を′＠−６−るが、巳は八よりも約４侶近く優れていた。試験された　結合した抗体、　タンパク質１μΩなしＤＴ、０．５μｇ／ｍ１　２．４３ＤＴ、５μａ／ｍｌ　２．５６ＤＴ、５０μａ／ｍ１　１．９３ナンバー２．八、５０μｇ／威ＣＲ）ｌ　−ＰＲＰ　−３１，６７２，０ナンバー２．Ｂ、　５μＣＩ／ｄｐ、調製物Ａおよび巳は、１６μｑタンパク質／ｍｌで０．０１２５Ｍリン酸アルミニウム緩衝液ｐｌ−１６中に懸濁され、そして第４表に述べられた処方（しかしながら動物は、着手時に８週齢であり、またジフテリアトキソイドの予めの注射によって準備されていなかった。）において、３回の０．５ｄ注射がウサギに与えられた。血清はステップＯにおいて調べた結合検定法において抗体に関して試験された。Ａ　（＋５よびＢの双方とも、第６表に示すように、ＤＴに対するならびにＰＲＰに対する抗体を誘導するものでおった。別個の比較対照実験は、ＣＲＭ１９□調製物で注Ｑｌされない状態において同じ宿舎の同様のウサギが抗り丁抗体価にあけるこのような増加が充用しなかったことを示しｌこ。（以下余白）第６表５　Ａ　ＰＲＰ、ｒｌ（］／ｍ１４７　６０　２１０１３．５００ＤＴ、、Ａ４ｏｏＯ，１３６０，１６８１，２８３，８１６Ａ　ＰＲＰ　２１　２５　１９　４２０ＤＴ　Ｏ，０７２０，０４Ｇ　Ｑ、２６２　３．２３７　Ａ　ＰＲＰ　＜２０　２０　２０００１０，５００ＤＴ　Ｏ，１５５０，１３４０，１５５０，６７６３Ｂ　ＰＲＰ　＜２０　２７　１６００　／１９００ＤＴ　０．０？５　０．０６１　０．２２７　２．４５８　Ｂ　ＰＲＰ　２３　＜２０　２９００２６，０００ＤＴ　Ｏ，０６５０，０２３（）、２３１　２．０７６．３．ＰＲＰの非常に小さなフラグメントのジフテリア毒素、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７およびＬＴ−ＢＮＴへの　Ａ還元未喘基を有するＰＰＰの非常に小さなフラ　メントの生成ａ、　ＰＲＰロット２０の溶液１２ｍ１が、Ｏ′ＣでＨＣＮで０．１Ｍとされ、ガラス製フラスコ中に封じ込められた（０分）。ｂ、該フラスコは沸騰水浴中に４分間移され、次に氷水浴中に冷やされた。Ｃ０微量の生成した白色のコロイドは、エーテルでの抽出によって除去され、得られた透明な溶液は凍結乾燥された。ｄ、バイオ−ゲルＰ１０（バイオ　ラット　インコーホレーテッド）はＯ，０１Ｍ酢酸アンモニウム中で平衡化されそして直径’１．５ｃｍのクロマトグラフィーカラム中に注がれ、９８ｃｍのゲル床高さを与えた。ｅ、凍結乾燥された物質は水１．５ｍｌで再水和されモしてＮＨ４ＯＨで中和された。この溶液が該カラムに適用され、溶出が行なわれた。ｆ、　２．０〜２．４のＶｅ／Ｖｏ比で溶出するフラグメントが集められ、分画ＶＳと命名された。９、分画ＶＳの供給を二倍とするために、ａ−ｆのステップが繰返された。ｈ、組合された分画ＶＳは、Ｄ−リボースで標準化されたアルカリ性へキサシアノ鉄（ｎｏａ塩法によって検定された場合に総計４７μｍｏｌの還元糖活性を含む４／Ｉｄｌの溶液を得るために、凍結乾燥され再水和された。ＰＲＰ−ＶＳフラグメントの天然ジフテリア毒素、天然ジフテリアトキソイド、０８Ｍ１９□およびＬＴ−ＢＮＴへの複合体の調製以下のタンパク質は、本実施例において担体として用いられる。（１）ＤＴｘ−精製ジフテリア毒素、ロット１マサチユーセツツ　パブリック　ヘルス　バイオロジック　ラボラトリーズ［Ｈａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｅｓ　Ｐｕｂｌｉｃ　ｔ（ｅａｌｔｈ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　］から得られた。部分的服毒毒性化がＰＲＰｖｓへの結合によって行なわれる。残余毒性はパベンヘイマーら、イムノケミストリー。の存在下におけるフォルマリン処理によって除去される。（２）ＤＴｄ−周知のく正式な）トキソイド、ロットＣＰ−２７上記マサチューセッツ　ラボラトリーズ　よりまた得られた。（３）ＣＲＭ１９７−毒素タンパク質の抗原性的に変異されたバージョン毒素と抗原性的に同一でおるが非毒性である。（４）ＬＴ−ＢＮＴ−エシェリキア・コリＬＴエンテロトキシンの精製非毒性結合ザブ１ニツト下記の第６．７節〜第６．１０節において述べるようにして調製される。複合方法は以下の通りである。ａ、　タンパク質、リン酸カリウム緩衝）侵（２５°Ｃでｐｌ−１８，０に２　Ｍ　Ｋ　Ｏ＋−（で滴定された２Ｍ　ＫＨ２ＰＯ４）およびＰＲＰＶＳが、次に示す様式においてガラス製遠心分＠管中で組み合された。旦柩　タンパク面　緩衝液　ＰＲＰＶＳ（ｔ）　３０ｍｇＤＴｘ　２４０ｕｍｏｌ　Ｐ　２Ｊｚｍｏｌ（２）　３０！Ｔｌｑ　ＤＴｄ　２４０μｍｏｌ　Ｐ　２０μｍｏｌ（３）　１０ｍｇＣＲＭ１ｇ７　８０μｍｏｌ　Ｐ　６．７μｍ０１（４）　９ｍｑ　ＬＴ−ＢＮＴ　１２０ｕｍｏｌＰ　ｌ１μｍｏｌｂ、溶液（１）〜（３）は凍結乾燥され、そして凍結乾燥物は、以下に表として示されるように、２％ｗ／ｖ　ＮａｃＮＢｆ−１３水溶液で溶解された。溶液く４）は凍結乾燥されず、ただこの述べられた成分の指示容量において調製された。溶液（４）のＤ　ｌ−（は８．０でめった。溶液　２％ＮａＣＮＢＨ３Ｃ１該管は３７°Ｃでインキュベートされた。ｄ、　１４Ｂ　（ＬＴ−ＢＮＴに関ｔ、ては３８°Ｃ’Ｔ”１８Ｂ＞後に、飽和硫酸アンモニウムの４容量当量が添加された。これらの懸濁液はＯ′Ｃで３時間保たれ、次に９０００Ｇで２０分間遠心分離された。ｅ、沈澱物は、中性の７０％飽和硫酸アンモニウム１０／Ｉｄ！をそれぞれ用いて２回洗浄された。ｆ、洗浄された沈澱物は、９．５Ｍ尿素の最小の容量で溶解されそして０．０６７Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，８に対し、で透析された。肚フォルマリン処理ａ、複合体はさらに０．０２５Ｍリシンをまた含むものであるリン酸ナトリウムＭ衝液に対してさらに透析された。少量のサンプルが、フォルマリン化の前に毒性試験のために取って置かれた。）ｂ、　フォルマリンが０．２％Ｗ／ＶのＲ終濃度まで添加された。Ｃ０約２４°Ｃで１７日間（ＬＴ−ＢＮＴに関しては７ウムに対して広範に透析された。ｄ、遠心分離が少量の不溶性物質を除去するために行ａ、等仮性リン酸ナトリウム緩衝液にあける抗原溶液（１）〜（４）は、０．２２ミクロン［ミレックス［１（ｉｌｌＣｘ］ｊフィルターユニット（ミリポア　コーポレーション［）１ｉ１１ｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、　］　）を通過させられ、そして滅菌リン酸緩衝食塩水を含有する瓶中に注入された。ｂ、調製物はローリ−法［Ｌｏｗｒｙ　ｍｅｔｈｏｄｌを用いてタンパク質に関して検定された。Ｃ９チメロサールが濾過されてそして新たに作られた１％Ｗ／Ｖ溶液の１／１００容量となるように溶液中に注入された。１０ｍのサンプルが殺菌試験のために取られた。瓶が、手動の滅菌単回使用充填具（マルチプル　アディッテイブ　セット、トラベノール　ラボラトリーズ［ｔ（ｕｌｔｉｐｌｅ八ｄｄｉｔｉへｅ　Ｓｅｔ、　Ｔｒａ−ｔｅｎｏｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓｌ　）　ヘ取付けられた。２ｒｎｌガラス瓶が満たされ、栓をされ、密封され、そして４℃で貯蔵するために迅速に移された。複合体調製物における検定ａ、タンパク質分画のリン酸エステル含量ＰＲＰはリボシル−リビトール−ホスフェートの繰返し単位から構成される。これゆえに、５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）によって沈澱可能な分画におりるリン酸エステルの比色検定は、タンパク質中のＰＲＰフラグメントの取り込みの敏感な指針である。タンパク質１００μＱを含有するサンプルが３１１ｄ！の容量において丁ＣＡ５％に作成され、氷上に２０分間保持され、そして４℃において２０００ＸＣ１で１５分間遠心分離された。沈澱物は、５％ＴＣＡの別の３ｄで洗浄され、次にエタノール５−で洗浄された。洗浄された沈澱物は、有機リン酸エステルを無機リン酸塩（Ｐｉ）に添加するために灰５６）コの方法によって定量された。結果は以下の通りである。ＰＲＰ繰返し単位／ｎ　ｍｏｌ　Ｐｉ／　タンパク質のサンプル　μｑタンパク質　暗示平均数（１）ＤＴｘ−ＰＲＰｖｓ　０．１１　６．８（２）ＤＴｄ−ＰＲＰｖｓ　０．１０　６．２（３）ＣＲＭ１９７−ＰＲＰＶＳ　０．１０　６．２（４）ＬＴ−ＢＮＴ−ＰＲＰＶＳ　０　、０３３　０　、４０ｂ、電気泳動的分析複合抗原のサンプルが、メルカプトエタノール−ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＭＥ−３ＤＳ−ＰＡＧＥ）により、それぞれの出発担体タンパク質調製物と並んで同じゲルにおいて分析された。ＤＴｄ−ＰＲＰｖｓは、ＤＴｄ、！：同様に、分子量６１．ＯＯ○ドルトンでの分散バンドを示した。これに対し、ＤＴＸ−ＰＲＰＶＳおよびＣＲＭ１９７−　ＰＲＰＶＳは、出発タンパク質とはかなり異なるものであった。これら２つの複合体のタンパク質は、堆積ゲル（４％アクリルアミド）の始めにもしくは中にあるいは分離ゲット［ｇｅｔ　］の始めに集められた。これゆえ、複合体は、恐らくフォルマリン処理からの架橋結合による、高分子凝集体に転化していると思われる。ＤＴｄ−ＰＲＰＶＳはまたいくらかの凝集した物質を含んでいる。ＬＴ−ＢＮＴ−ＰＲＰｖｓの電気泳動的分析は、本質的にすべてが凝集形態におることを示した。Ｃ，タンパク質１単位当りのＰＲＰ抗原当量抗ＰＲＰ抗体を結合するための複合体の能力が、ＰＲＰロット１っで目盛り定めされた、ヒト抗ＰＲＰ抗体による標識化ＰＰＰ結合の阻止によって測定された。（タンパク質結合ポリマーフラグメントは、高分子量ポリマーに対する重量−当量形式において抗体に結合することが仮定できないゆえに、定量的化学組成はこれらのデータから推論され得ない。）３　Ｈ−ＰＲＰ結合　ｎｇ　ＰＲＰ当徂／ＰＲＰ１９．　０．５ｎ（１／　ｍ１６．　７　−ＰＲＰ１９．　５ｎＣｌ／　ｍ１３２　−ＰＲＰ１９，５０ｎＱ／　ｍ１９０　−ＤＴＸ−ＰＲＰＶＳ、　２４　０．　５５μｑタンパク貢／ｄＤＴｄ−ＰＲＰＶＳ、　４８　２．２５μｑタンパク質／ｄＣＲＨ１９７−ＰＲＰＶＳ、　３８　１　、４５μｑタンパク質／ｍＩＬＴ−ＢＮＴ−ＰＲＰＶＳ、　１９　０　、３３５μｑタンパク質／ｍｌｄ、タンパク質１単位当りのジフテリアトキソイド１原当量抗ＤＴｄ抗体と反応する調製物の能力の維持が、ＬＴ−ＢＮＴ−ＰＲＰｖｓ複合体を除くすべてのものに関して、精製ＤＴｄが検定管（固相）に付着される酸素結合免疫吸着剤検定（ＥＬＩＳＡ）の阻止によって測定された。付着ＤＴｄへの抗体結合の阻止は、流体層において用いた同じＤＴｄによって目盛り定めされる。抗体結合　ｎｇ　ＰＲＰ当徂／サンプル　の阻止％　μｑタンパク質ＰＢＳ対照　（Ｏ）　− ＤＴｄ、　５μｇタンパク質／ｍ１２４　−ＤＴｄ、５０μｇタンパク質＃！　５０　−ＤＴｘ−ＰＲＰｖｓ、　４６　０　、６８５．０μｑタンパク質／ｄＤＴｄ−ＰＲＰｖｓ、　５８　２．　’１５０μｑタンパク質／ｍ１ＣＲＨ−ＰＲＰＶＳ、　２６　０．１１５０μ９タンパク質／ｍ１ｅ、ジフテリア毒性活性本来のＤＴＸならびにフォルマリン処理前および後の複合体ＤＴｘ−ＰＲＰｖｓが、非免疫成体ウサギの皮膚中への注射によって毒性活性に関し力価評価された。０．００２μｑおよび０．０２μｑの投与量で、ＤＴＸは予期された皮膚病変をもたらした。フォルマリン処理前のＤＴＸ　−ＰＲＰＶＳは０．２μＣ］がＤＴＸ　Ｏ，００２μＱとほぼ等しい（複合による毒性における１００倍の低減）というような投与量依存性病変をもたらした。フォルマリン処理の後、病変は２ μＱ程も高い投与量ににっでも発生しなかった（ＤＴＸと比較して少なくとも１０００倍の低減）。複合体ＤＴｄ−ＰＲＰＶＳおよびＣＲＭ　−ＰＲＰｖｓの最高２μｑまでの投与量が同様に試験されたが、病変は発生しなかった。ＬＴ−ＢＮＴ−ＰＲＰＶＳは試験されなかった。ｆ、放射線抗原結合により計測された、離乳ウサギにおける抗ＰＲＰ抗体応答の誘導抗原は、リン酸アルミニウムアジュバント（０，０１２５Ｍ　ＡＩ）、ＤＨ６）と結合され、タンパク質２５μΩを含む０．５ｍ投与量とされた。２匹のウサギ（それぞれの抗原に関して）は第７週齢で始められる３週間注射を与えられたが、該ウサギは仮定の［担体準備［ｃａｒｒｉｅｒ　ｐｒｉｍｉｎｏ］Ｊ効果のために第５週齢でＤＴｄのみでの注射をされていた。すべての動物は３回目の予防接種の後に、少なくとも１ＱμＣＪ／ｒｄの力価を有して、既往パターンにおける抗ＰＲＰ上昇を有した。抗原ＣＲＭ１ｇ７−ＰＲＰｖｓ、ＬＴ−ＢＮＴ−ＰＲＰｖｓおよびＤＴｄ−ＰＲＰｖｓは、ＤＴｄで「準備され」ていなかった２匹のウサギにおいて２５μｑのタンパク質レベルでさらに試験された。これらのウサギはこれらの抗原すべてによって「準備された」ウサギにあけるものと同様な強力な抗ＰＲＰ応答を起こした。Ｑ、ＥＬＩＳＡによって計測された、離乳ウサギにおける抗り丁ｄ抗体応答の誘導前述の分節の同様の「準備されていなかった」ウサギ（７〜１０）の抗り丁ｄ抗体応答は次の通りである：上昇は２回目の注射の後概ね１０倍および３回目の注射の後さらに２〜５倍であった。サンプルは、増殖培地としてフルイド　ヂオグリコレート［ＦＩｕｉｄ　丁ｈｉｏｇｌｙｅｏｌｌａｔｅコ　（ビービーエル　カタログ−ｊ−ンハ−１１２６０，ａットＤ４Ｄ　ＬＫＩ　［ＢＢＬ　Ｃａｔ、ｎＯ，１１２６０，ＩＯｔ　Ｄ４Ｄ　ＬＫＩＩ　＞を用いて測定された場合生殖不能であることが見出された。６．４．幼児におけるワクチンとしてのジフテリアトキソイドおよびＣＲＭ１９７に複合したＰＲＰフラグメ２トの使用−□、−−−−−４−、、−−１〜２才の年齢範囲の８人の幼児の２つのグループ、（および第１８カ月齢でジフテリアトキソイドタンパク質での定型的予防接種を受ける特に免疫される幼児）は、以下のように最初のおよび第２回目の予防接種を受けた。グリープ■は、面述の節において述べるように調製されたＣＲＭ　−ＰＲＰｖｓの注射を受け（食塩水中にタンパク質２５μ９、皮下的）、グループＩＩは、前述の節において述べるように調製されたＤＴｄ−ＰＲＰｖｓの注射を受けた（食塩水中にタンパク質２５ μ９、皮下的）。最初の臨検においては、予防接種前血液標本が採取され、幼児が予防接種され、次にアナフィラキシ−反応の徴候に関して２０分間硯観察れた。第２の臨検においては、第１の臨検における手順か繰返された。第３の臨検においては、２回目の血液標本が採取された。それぞれのグループからひとりの、２人の幼児は、親との相談の後に、ＰＲＰに対する抗体を防御レベルへ高めることを試みるために第３回目の予防接種を与えられた。予防接種の間の間隔は１±１７２力月であった。グループＩＩＩは、別の部位でのジフテリア１〜キソイドと同時にワクチンを受ける約１８カ月齢の幼児から構成されたいた。このグループは、一方がＣＲＭ１ｇ７−　Ｐ　ＲＰｖｓワクチンを受け、他方がＤＴｄ−ＰＲＰｖｓワクチンを受

【プる２人の幼児を含むものであった。徴１）工が体温の測定、全身性疾病の挙動指示の表記、および注射部位での炎症の観察によって、連続する４日の間記録された。これらの＠候は第７表に要約される。（以下余白）第７表ＰＲＰｖｓの０８Ｍ１９□および正式ジフテリアトキソイドへの複合体に対する悪性反応ＣＲ）Ｉ　１９□−ＰＰＰ熱　１／８　０／８　０／１正常でない挙動　０／８　０／８　０／１局部的炎症　１７９″’　２／９　０／１局部的痛み　１／９″　２／９　０／ＩＤＴｄ− ＰＲＰｖｓ　熱　０／８　０／８　０／１正常でない挙動　０／８　０／８　０７１局部的炎症　１／′９″　Ｏ／９　０／１局部的痛み　１７９″　０／９　０／１６同時的に別の部位でのジフテリアトキソイドタンパク質を受けたひとりの幼児を含むものでおる。局部的徴候は見られなかった。全身性徴候は、ジフテリアトキソイドタンパク質ワクチンの効果と区別することができないゆえに書留められない。ＣＲＭ１９７−　Ｐ　ＲＰｖｓ予防接種に関して、ひとりの幼児が初回予防接種の晩に、軽い熱（９９，８Ｆ”、）を有し、またそれぞれ初回の１つ、２回目の１つおよび３回目の１つの予防接種の直後に軽い局部的炎症の例がおった。ＤＴｄ−ＰＲＰｓｖに関しては、初回の１つ、２回目の１つの予防接種の直後に軽い局部的炎症の例があった。該ワクチンの投与は、他の点では悪性反応のないものであるらしかった。面清抗体応答　。ＰＲＰに対する抗体ならびにジフテリアトキソイドに対するＩＣＩＧ抗体が測定された。ＣＲＭ１ｇ７−　Ｐ　ＲＰＶＳテの予防接種に関して、−貫した抗ＰＲＰ応答パターンが見られた。第８表を参照のこと。初回の注射の後にはっきりとした上昇が、２回目の注射の債に通常わずかにより大きな上昇が、そして１つの３回目の注射の後に大きな上昇があった。最終的力価は、ＰＲＰのみでの予防接種によってもたらされるものをかなり超えた、および０．１５μＣＪ／ｄの見積り防御最小レベルをかなり超えたものであった。高められた応答は、ＰＰＰのみに対する応答が防御に関し通常不十分である１８力月齢未満の４人の幼児において特に明白で必り、そしてこれらの４人における最終力価の重量平均（８，４μ ｇ／厩）は、ＰＲＰワクチンのみでの１２〜１７力月齢幼児の予防接種後に見られるものの１７５倍でおる。ジフテリアトキソイドタンパク質での同時的な初回予防接種を受けた幼児はまた優れた応答を有した。ジフテリアトキソイドに対するＩｇＧ抗体は、８人の幼児のうち６人（ならびに、処置の一部としてジフテリアトキソイドをまた受けた第９番目の幼児）において増加した。該抗体レベルは、しばしば非常に大きく増加したので、用いられた予防接種後の血清の希釈（１／１０００）は、上昇の、最大範囲を示すのに不十分なものとなった。ＤＴｄ−ＰＲＰｖＳでの予防接種に関して、抗ＰＲＰ応答は、一般的に初回および２回目の双方の予防接種後に増加した。（第９表参照）。しかしながら、全く応答が検知されなかった２人の幼児（１２力月齢および１４力月＃Ｊ）があり、そしてひとりの幼児は、３回目の注射が与えられるまで防御的レベルに近づかなかった。ジフテリアトキソイドでの同時的な初回予防接種を受ける幼児は優れた応答を有した。ジフテリアトキソイドに対するＩｇＧ抗体における上昇はすべての幼児において見られた。この実施例は、ヘモフィルス・インフルエンゼタイプｂ莢膜ポリマーフラグメントのジフテリアトキソイドおよびＣＲＭ１９７への複合体の注射は危険性のないものらしいことを示すもので必る。ＣＲＭ１９□−ＰＲＰＶＳ予防接種は、高い力価によるもののみならず２回目の予防接種の後の上昇により察知される、担体効果による抗ＰＲＰ応答の高まりの明白な徴候を与えた。ＤＴｄ−ＰＲＰｖｓはより低い感受的高まりを有した。有望な説明は、ＣＲＭ１ｇ７−ＰＲＰｖｓが高分子凝集であるのに対し、ＤＴｄ−ＰＲＰＶＳは、本来のトキソイドと同様な単一分子形態において主に存在するということである。（以下余白）１」ＬＬ１回目後　４．５　＞１０２０２回目後　１８　＞１０２　１３力月齢　予防接種前　く０．００６　０．３８１回目（麦　０．０４０　１．７２回目後　０．３５　２．２３３回目麦　４．８　１．９３　１４力月齢　予防接種前　＜０．０２０　４．５１回目後　０．１２　３．３２回目後　２．０　４．３４　１６力月齢　予防接種前　０．０２５　０．０６１６１回目後　０．９２　５．７２回目後　２９　９．１５　２７力月齢　予防接種前　０．０２５　３．０１回目後　１０　＞１０２０２回目後　５８　＞１０６　２９力月齢　予防接種＃　０．１３　６．１１回目後　１．４　＞１０策」し清１回目後　〈０．０２０１０２回目後　〈０．０２０１０２　１２力月齢　予防接種前　０．０５５　０．０３１３１回目後　０．０８０３．１２回目１身　１．８　１０３　１３力月齢　予防接種前　＜０．００６　１．１１回目後　＜０．００６　１０２０２回目後　０．０２３１０３回目後　０．１２０１０４　１４力月齢　予防接種前　＜０．０２０　３．０１回目後　＜０．０２０　５．１２回目後　＜０．０２０　３．８５　１９力月齢　予防接種前　０．０６０　８．０１回目後　０．１２　１０２０２回目後　０．７６　１０６　２６力月齢　予防接種前　く０．０２０　６．９１回目後　０．０６０１０２回目後　０．９４’　１０７　２７力月齢　予防接種前　１．４　６．１１１回目変　７．４　１０２０２回目後　２１　１０８　２８力月齢　予防接種前　＜０．０２０　８．７１回目後　０．６３　１０２０２回目後　８．０　１０９　１８力月ｌ１ｉ８′　予防接種前　１．９　０．１１１１１回目後　２．９　１０２０２回目後　１１　１０ ’　ＤＴｄ−ＰＲＰｖｓの初回注射が、別の部位におけるジフテリアトキソイドタンパク質ワクチンと同時的に与えられた。６．５．ストレプトコッカス・ニューモニエの莢膜ポリマいくつかのその他細菌は、これらが敗血症および髄膜炎を引き起こす、特にツＬ児において引き起ずことにおいて、これらが、抗体が防御的である莢膜ポリマーを有することにおいて、そしてこれらの莢膜ボ１ツマ−が成熟したヒトにおいては免疫原性であるが乳児において免疫１京性′Ｃないことにおいて、ヘモフ、ｆルス・インノル丁ンぜｂと類似している。その重要な一例はストレブ１へコツカス・二ＸＩ−モニエ（Ｓｐ）血清型６　ｆ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　２ｎｅＩＪｍＯｎｉａｅ（Ｓｐ）　５ｅｒｏｔｙｐｅ　６］である。これは上述したような生命脅）Ｄ性感染を引き起すのみならず、幼児における中耳炎のかなり有力な原因であるａ　（グレイら、ジャーナル　オブ　インノエクシ１７ス　ｆイジイーズ、第１４２巻、第９２３へ・９３３頁、１９８０年［Ｇｒａｙ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ、　Ｖｏｌｕｍｅ　１４２．　ｐａｇｅｓ９２３−３３，１９８（＞　］　）。ＰＲＰに関して述べられたアプローチがまた、抗原特異性を維持しつつ、選択的加水分解により還元基を生成され得る任意の莢膜ポリマーに対して適用可能である。以下の非限定的実施例においては、莢膜ポリマーフラグメントは、選択的酸加水分解によって鉦、６（ストレプトコッカス・ニューモニエ　血清型６）から生成され、そしてＣＲＭ１９□へ複合された。該製品は旦２莢膜ポリマーおよびＣＲＭ１９７成分の双方に関する抗原特異性を維持していた。莢膜ポリマー（ＣＰ）からの）元−７ラグメントの生成１、　Ｓｐ、６のＣＰのサンプル（ダニツシ１　タイプ６Ａ、エリ　リリー　カンパニー［口ａｎｉｓｈ　ｔｙｐｅ　６八、［１ｉＬｉｌｌｙ　Ｃｏ、　］　）が、］Ｄ−グルコ−スで標準化されたフェノール−硫酸法によって全ヘキソースに関して、ｄ３よびＤ− グルコースでまた標準化されたアルカリ性へキサシアノ鉄＜　ＩＩＩ　）酸塩法によって還元能に関して検定された。２、パイレックス［ＰｉｌｅＸコ管が、水０．６６戒で溶ｍａれたｓ旦、６ＣＰ　３．３ｍｑを与えられた。このサンプルは０℃に冷やされ、０．１ＮＨＣΩ　０．０７３ｍｊが加えられ、そして該管は密封された。３、該管は沸騰水浴中へ１０分間浸され、次にＯ′Ｃに再び冷やされた。＠量のサンプルがステップ１で述べるような還元能に関して検定された。Ｓｐ、　６　０分　〉３５０１０分　６．５４、加水分解された調製物（検定に用いられた２％を除く）は凍結乾燥された。屹燥物は、水０．１ｄで溶解され、マイクロ遠心分離管に移され、そして再度凍結乾燥された。１、　再乾燥された加水分解物に対し、２Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＩ−１８の０．００４ｄ、およびＯ，０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液１）Ｈ７の０．２ｄ中に溶解されたＣＲＭ１９７のｌｌｌ１ｇが加えられた。得られた混合物は、凍結乾燥されそして水０．０５ｍ１に再懸濁された（見積り全容量０゜０６３ｒｒｆｌ＞。２、該管に対し、２００ｍ（］／ｒｒＪｌナトリウムシアノボロハイドライド０．００７ｍ１が加えられ、そして該調製物は３７℃で１８日間インキ１ベートされた。３、　８０％飽和硫酸アンモニウム（ＳＡＳ）０．６ｍｌ。が添加された。４、該管はＯ′Ｃで１時間インキュベートされ、そして８０００Ｇで１５分間遠心分離された。上澄み液が除去され１こ。５、沈澱物は、０．０１Ｍリン酸ナトリウムで１）Ｈ８に緩衝された８０％５Ａ３０．６ｄ中への懸濁およびこれに続＜８０００Ｇで１５分間の遠心分離によって洗浄されＩこ　。６、沈澱物は０．５Ｍ　Ｎａ２ｔ−（ＰＯｓ　０．０２ｍおよび９．５Ｍ尿素０．２ｄで懸濁された。７、　ＳΔＳ１ｍｔｌが加えられ、沈澱物がステップ４と同様にして単離されそしてステップ６と同様にして約８Ｍで尿素中に懸濁された。８、懸濁液は８０００Ｇで１５分間遠心分離された。９、上澄み液は分離されそして０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ＤＨ７に対して４℃で透析された。１０、ＣＲＭ１９１一旦旦、６と呼称される、この透析された調製物は以下に関して、すなわち、）ｔリン　フェノール反応によりタンパク質に関して、放射ｍ標識された旦且　ＣＰへの抗体の結合の阻止により旦且抗原性に関して（第３表においてＰＲＰに関して述べたものと同様）、ジフテリア１〜キソイド（ＤＴ）への抗体結合の阻止により０８Ｍ１９□抗原性に関して（ＣＲＭｌ、７−ＰＲＰ −Ｓナンバー２の記載のステップ０において述べたものと同様）、ならびにジフテリアトキソイド（ＤＴ）への抗体結合の阻止ニヨリ抗ＣＰ免疫原性ニ関シテ（ＣＲＭ１ｇ７−　ＰＲＰ　−Ｓナンバー２の記載のステップｐにおいて述べたものと同様）検定された。第７表を参照のこと。ｎｇｃｐ当ｆＡ／　ｎｇＤＴ当ｍ／ＣＲＭ１９□−且、６　０．４　０．３６第１０表比較対照および０８Ｍ１９□でのストレプトコッカス・ニューモニエ血清型６フラグメントの複合体での抗ＣＰ免疫原性応答年齢でのサンプルにおいて結合したｌ　Ｓｐ６　ＣＰ、　２５μａ　６６７７３３１）６ｉ［１１菌、２５μ０　４　１０　１２　１６５　ＣＲ）ｌ　−３ｐ６．２５μｇ４　６　３０　４９０血清ザンブルを採取する直前に皮下的に注射された。血清サンプルは第６．８ｄ３よび１０週齢で採取された。６“血清２５μΩが１４ｃ−標識化ｃｐ　２ｎＣｉとインキュベートされた。６．６．過ヨウ素酸塩酸化によるＰＰＰ−複合ワクチン２０μｍｏｌ　／ｍｌのリボース溶液３戴は、２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ８，０の０．４ｄ、および水０．６ｄ中のメタ過ヨウ素酸ナトリウムの１３ｍｇが急速に混合しながら添加された際に４°Ｃに冷却された。暗所において４°Ｃでの１晩のインキュベーションに続き、反応混合物は、１．５ｘ９０ｃｍバイオグルＰ　−１０［Ｂｉｏｐｅｌ　Ｐ −１０コカラムに適用され、そして０．２Ｍトリエチルアンモニウムアセテート、Ｉ）Ｈ８，０を用いて９ｍ／ｈｒの流速で溶出された。集められた４、２戴分画の部分標本が、オルシノール検定〔ミクロ。チミカ、アクタ２　：　１３　（１９３７年）　［）Ｉｉｃｒｏ、　Ｃｈｉｍｉｃａ、Δｃｔａ２　：　１３（１９３７）］　）によりリボースに関して、またパーク−ジョンソン［Ｐａｒｋ　−Ｊｏｈｎｓｏｎ　］検定法〔ジエイ、パイオル、ダム。二８１：　１４９（１９４９年）　［Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　１８１：１４９　（１９４９）　］　）により還元基に関して分析された。これらの分析に基づいて、６および１０（あるいはその他の望まれた価）の平均重合度（ＤＰ＞を有する分画の組がプールされ、該プールは凍結乾燥された。６．２．２．ジフテリアトキソイド−ＰＲＰＩ合ジフテリアトキソイド（水０．５１ｄ！中に８．４＋ｎｇ）の７２μ９部分標本が、ガラス製試験管中において凍結乾燥されたＤＰ６または１０プールの形態にあける還元基の１゜４μｍｏｌ　と混合された。２Ｍ、　ｐＨ８リン酸緩衝液８μρが添加され、溶液は、均質性となるまで渦動混合され、そして○、ｚＨ＋／／ｎｉ水性ナトリウムシアノポロハイドライド２μρが添加された。３７°Ｃでの５日間のインキュベーションの後、飽和硫酸アンモニウム３００μρが添加され、そして混合物は４°Ｃで一晩放置された。 −沈澱した混合物は次に４°Ｃｌ、：おいて１２０００Ｘｇで３０分間遠心分離され、上澄み流体が除去され、そしてペレットが８０％硫酸アンモニウム５００ μΩ中に懸濁された。２回目の遠心分離に続き、ペレットは食塩水溶液５００μΩ中に溶解され、そして４°Ｃで８時間食塩水溶液に対して透析された。オルシノール検定によるリボースに関するおよびローリ−ら［Ｌｏｗｒｙ　ｅｔ　ａｔ、］　（ジエイ、パイオル、ケム、１９３：　２６５（１９５１年）　［Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　１９３：２６５（１９５１）］）の方法によるタンパク質に関する透析物の分析は、ＤＰ６複合体が、タンパク質１モル当りリボース５１．５モルで、５１１ μ９のタンパク質を含むものであったことを明らかにした。同様に製造されたＤＰ１０複合体は、タンパク質１モル当りリボース５９モルで、３１５μＱのタンパク質を含むものであった６、６．３．ＬＴ−ＢＮＴ−ＰＲＰおよびＣＲＭ−ＰＰＰ複合凍結乾燥されたＬＴ−ＢＮＴ（第６．７節〜第６．１０節において述べるように調製された）おるいはＣＲＭタンパク質の１ｍＯが、水７０μΩおよびリン酸緩衝液ｐＨ８１０μΩ中に溶解され、そしてＤＰｌｏまたはＤＰ２０ＰＲＰオリゴ糖の形態にあける０、０６μｍｏｌ／μΩ還元基２５μρと組合された。混合を行ないながらの０．４ａ／ｌｎｌナトリウム　シアノボロハイドライド２μ９の添加の後に、混合物は、３７℃で３日間インキュベートされた。混合物は次に食塩水溶液２ｉ中のセントリコン［Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　３限外濾過セル（アミコン　インストルメンツ、ダンバース。マサチューセッツ州［Ａｍ１ｃｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｄａｎｖｅｒｓ、ＨａＳＳ、コ２分子数３０，０００臨界）に移され、そして４°Ｃにおいて６０００ＸＱで膜上にわずか２００μｐの溶液が残るまで遠心分離された。このプロセスは新たな２属の食塩水溶液を用いて繰返され、そして次に複合体は、濾過物がリボースに関して陰性と診断されるまで、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７，４中の５Ｍ尿素で限外濾過された。保持物は、限外濾過により０．５ｍｌ容量に濃縮されそしてリボースおよびタンパク質に関して分析された。これらの値は第１１表に見られるものである。（以下余白）匪−１１−１ＰＲ濾過ヨウ素酸塩酸化フラグメン１〜のＣＲＭへのおよｐｌエニ刀Ｎ　Ｔ　ヘ（’）　ｍ　金製品組成担体　ＰＲＰフラグ　収率　（μｇリボース／λ之バ２舅　メンｈ（ＤＰ）　（％）　蕉り之之パ皇亘）ＣＲＭ　２０　３８　５．６ＣＲＭ　１０　４８　４．１＋Ｔ−ＢＮＴ　２０　９８　１．４ＬＴ−ＢＮＴ　１０　９８　１゜２６．６．４゜ＰＲＰ−タンパク質複合体ワクチンに対する免疫応答第６．６．３節の過ヨウ素酸塩酸化複合体ワクチンＩユ、食塩水中に希釈され、そして第１２表において示す投与量において、第６〜８週齢のＢａ　ｌ　ｂ／ｃマウスあるいは第１２週齢のニューシーラント白色ウサギに皮下注射された。付加的予防接種が１週間間隔で最初の投与量で与えられ、そして最初の抗原投与の３週間復の血液サンプルが抗ＰＲＰ抗体の存在に関してラジオイムノアッセイ（第６．１節）によって調べられた。第１２表に示されるデータは、４匹の実験動物の重量平均力価値を表わすものである。第１２表過ヨウ素酸塩で製造されたＰＲＰ−タンパク質視合体ワクチンの免疫原性複合体ＰＰＰ　３週間目で担体タン　フラグメ　投与量　の抗ＰＲＰ抗体バク質　ント（ＤＰ）　（μｇ　ＰＲＰ）　種　（μＣｌ／ｄ　）ＣＲＨ１０１マウス　Ｏ，，３１ＣＲＨ１０１０マウス　１．４０ＣＲＨ２０１マウス　０．８０ＣＲＩ（２０１０マウス　２．３６１Ｔ’−ＢＮＴ　１０　１　マウス　０．１６しＴ−ＢＮＴ　１０　１０　マウス　０．１２しＴ−ＢＮＴ　２０　１　マウス　０．９１しＴ−ＢＮＴ　２０　１０　マウス　０．１６Ｃ聞　１０　２．５　ウサギ　２．０５ＣＲＨ２０２，５ウサギ　１．８０’ しＴ−ＢＮＴ　’１０　２．５　ウサギ　０．９０″にれらの対象物に関する値は、２匹の実験動物に関する重量平均力価でおり、他のすべての値は、４匹の動物からのデータに基づくものでおる。６．７１組換え型プラスミド調製物の一般的製法本発明においては、ＬＴ−ＢＮＴ遺伝子の源は、ヒトエンテロトキシン産生性単離体、Ｈ１０４０７のＬＴ−８丁プラスミドを含むに一１２トランスコンシュガントである、エシェリキア・コリア１１　（１０４０７）でめった。この株は、Ｆ’ｔｓ　Ｉａｃ　：　：　Ｔｎ　５プラスミドからの転位によりエシェリキア・コリＨ１０４０７のエンテロトキシンプラスミドを表現型標識し、そして丁ｎ５標識化プラスミドをエシェリキア・コリに一１２株７１１に接合移植することによって誘導された。このプラスミドは、ＬＴ遺伝子を含む微小なりＮＡフラグメントを得るために制限酵素によって開裂された。このＤＮＡフラグメントは、次にｐＢＲ３２２プラスミド中へ連結反応され、ＤＤＦＢ２と呼称されるプラスミドを産生じた。このプラスミドを抱くエシェリキア・コリに一１２トランスフォーマントは次に、抗生物質耐性標識を基礎として選択された。このトランスフォーマントによるＬＴ産生は、酵素結合免疫吸着剤検定および副腎細胞検定系を用いて確証された。クローン化しＴ−Ｂ　ＯＮへ領域は、同定され、その後最初にプラスミドｆ）ＤＦ８７を与えるためにｐＢＲ３２２プラスミド中へそして次にＭ１３由来クローニングベクターｐｕｃａ中へと２度再クローニングされた。得られた組換え型プラスミドｐＪＣ２１７は、エシェリキア・コリに一１２中への形質転換ならびに抗生物質耐性および酵素活性標識損失による選択ののちクローニングされた。ｐＤＦ８７および天然ＬＴ−８より免疫学的に識別されないが完全に非毒性である、ｐＪＣ２１７より回収されるＬＴ−８Ｎ丁は、次に免疫原としての使用のために宿主細胞溶解物から単離された。構成におけるそれぞれの＠階の詳細な説明は次に続く。６．７．１．制限酵素消化の条件用いられた制限酵素は、メリーランド州ガイゼルスブルグのベスエスダ　リサーチ　ラボラトリーズ、インコーホレーテッド［Ｂ　ｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｋ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉ　ｎｃ、　。Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ｊｖｌａｒｙｌａｎｄ　］の製品であツタ。酵素活性の単位は、適当な温度においておよび５０μ２の反応混合物全量において、１時間で１．０μ７のλＤＮＡを完全に消化するために必要とされる酵素の虫として定義された。消化は、緩衝液２０μρ中で３０分間３７℃でＤＮＡ２μ７を酵素１０単位とインキュベートすることによって行なわれた。反応は、７０℃に５分間加熱することで停止され、そしてこの全体にわたる条（Ｊ−ｔがベクタープラスミドＤＮＡ分子当り１つの切断をもたらした。旦旦Ｉおよび比色ｄＩＩＩに関しては、緩衝液は、５０ＩＩＩＭトリスー１−ＩＣ，ｌ２（ｐＨ８，０＞　、１０　ｍＭ　ＭＱＣＭ　２７３よび５０ｍＭＮａＣｆＪから成るものでめった。他の反応は、本質的に製造業者によって述べられるようにして行なわれた。６．７．２．ＤＮＡ消化産物の精製ｐＤＦ８７の制限酵素処理に続き、消化混合物は、４０Ｉｌ１Ｍトリス、０．２Ｍ酢酸ナトリウムおよび２ｍＭＥＤＴＡ　（ｐＨ７，８＞中に１．２％低融点アガロースを含む垂直ゲル平板において電気泳動分離にかけられた。電気泳動は、１０Ｖ／ｒａで行なわれ、そして平板は、次にポリバーとベックマン［１３ｏｌｉｖａｒａｎｄ　Ｂｅｃｋｍａｎｌ　（メソツヅ述べられるように、臭化エチジウムで染色され、紫外光下で視認化された。分離されたＤＮＡフラグメントは次に、ゲルから切り取られ、ゲルが溶融され、そしてしＴ−Ｂ　ＤＮＡフラグメントがフェノールで抽出された。６．７．３．Ｔ４．　ＤＮＡ　連結反応連結反応が、メリーランド州ガイゼルスブルグのベスエスダ　リサーチ　ラボラトリーズ、インコーホレーテッド［１３ｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、　、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ　］から得られたＴ４　ＤＮＡ　リガーゼを用いて行なわれた。Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ活性の単位は、３７° Ｃにて２０分間での１ｎｍｏｌの　ＰＰＩ　（７）［ａ／β３２Ｐ３２　・］　−ＡＴＰ中への転化を触媒するのに要求される量とじて定義される。ＤＮＡ連結反応は、４°Ｃで１８時間、ＤＮＡ１μ７当り１０！１位の酵素を用いて行なわれた。緩衝液は、Ｉ）８７　。６で６６ｍＭ　トリス−ＨＣｕ　、６．６　ｍＭ　Ｍａｃｕ　２．１０ｍＭ　ジチオトレイトールおよび６６μＭＡ丁Ｐを含むものであった。再循環化を減じるために、いくつかの場合において、プラスミドＤＢＲ３２２は、連結反応の前に、セファロース［５ｅｐｈａｒＯ３ｅｌに接合したアルカリ性ホスファターゼで５１ａ理された。用いられた酵素は、メリーランド州ガイゼルスブルグのベスエスダ　リサーチ　ラボラトリーズ、インコーホレーテッドから得られたＭＡＴＥ−ＢＡＰでめった。ＭＡＴＥ−ＢＡＰの１単位は、３７℃で３０分間において、ＡＴＰ　１ｎｍｏｌを加水分解する酵素の但で定義された。酵素は、１０ＩＩＩＭトリスート＋ｃｔｌ、ｐＨ８，０中で、ＤＮＡ１μ７当り５００単位の濃度で、６５°Ｃで１時間用いられた。反応に続いて、酵素は遠心ベレット化によって除去された。６．７．４．形質転換および組換え体の単離エシェリキア・コリに一１２株の形質転換は、ポリバーとベックマン［３ｏ１ｉｖａｒａｎｄ　３ｅｃｋｍａｎｌ　（メソツズ　イよって述べられたようにして行なわれた。細胞は、３０ｍＭ　ＣａＣｌ２中においてＯ′Ｃで２０分間インキュベートすることで受容能力あるものとされた。次に１０倍濃縮細胞の０．２ｄ部分標本は、３０　ｍＭ　ＣａＣＪｌ　２テ補足された低温連結反応緩衝液０．１戒中のＤＮＡへ添加され、そして０℃で１時間インキュベートされた。細胞は次に３７°Ｃへ２分間加熱され、１０分間室温で保たれ、そしてルリア［［υｒｉａｌブロス（Ｌブロス）４瀬中へ希釈された。１リットル当り、Ｌブロスは、すべて１Ｍ　ＮａＯＨを用いてｐＨ７，５に調整された、バクト［Ｂａｃｔｏｌ　トリプトン１Ｏｆｆ、バク１〜酵母抽出物５ＪおよびＮａＣ，ｆ）１０びを含むものである。３７°Ｃでの３時間のインキ１ベーシヨンの後、トランスフォーマントは、トリブチカーゼ　ソイ　アガール［ＴｒＶｐｔｉＣａＳｅ　ＳＯＶ　ａ（Ｊａｒ］　（ビービーエル　ミクロバイオロジイシステムス、クツキースピル　メリーランド州［ＢＢＬＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏＱＶ　ＳＶｓｔｅｍｓ、　Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ　］　）あるいはＹＴプレートにおいて、下記に述べるような適当な抗生物質または酵素活性標識を用いて選択された。６．８．ｌ　Ｔ３ｕ伝子産物分析に関する方法クローニング手順のそれぞれの段階で、エシェリキア・コリに一１２トランスフォーマントは、酵素結合免疫吸着剤検定法（ＥＬＩＳＡ）によってＬＴまたはＬＴ−Ｂ産生の質および量に関して分析された。これらの遺伝子産物の毒性を測定するため、トランスフォーマントはまた、エンテロトキシン産生性エシェリキア・コリにおるいはそれらの毒素に曝された細胞が容易に検知可能な形態学的変化を示すマウス副腎細胞検定系によって分析された。６．８．１．酵素結合免疫吸着剤検定法（ＥＬＩＳＡ＞タレメンツら［ＣＩｅｍｅｎｔｓ　ｅｔ　ａｔ、］　（インフエクト、イ分析されるべきクローンは、トリブチカーゼ　ソイ　ブロス［７ｒｙｐｔｉｃａｓｅ　ｓｏｙ　ｂｒｏｔｂコ〕　〔ビービーエル　ミクロバイオロジイ　システム、クツキースピル、メリーランド州［ＢＢＬ　ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＳｙｓｔｅｍ、Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ、ＭａｒＶｌａｎｄ　ｌ　）　２　Ｏｒｄ中に３７°Ｃで一晩培養され、遠心分離され、０．０５Ｍトリス、０．００１Ｍ　ＥＤ下Ａ、０．００３Ｍ　アジ化ナトリウムおよび０．２Ｍ　ＮａＣｆＪを含む緩衝液（ｆ）Ｈ７，５＞２ｄ中に懸濁され、そしてプランソン　ソニケータ−［Ｂｒａｎｓｏｎ　Ｓ　ｏｎｉｃａｔｏｒコを用い１００〜１５０ワツトにセットする動力で１２秒間音波処理することにより破壊された。得られた溶解物は、遠心分離によって清澄化されそして０．０５％ツクツーン２０［Ｔｗｅｅｎ２０コ、を含むｐＨ７，４リン酸綴扇化良塩水（ＰＢＳ−１−ｗｅｅｎ）中に分析のために連続的に希釈された。ＥＬＩＳＡは２つの基本的方法を用いて行なわれた。１つの方法においては、ポリスチレン微小力価プレート（コンスター、ケンブリッジ、マサチューセッシ州［ＱＯｎＳｔｅｒ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｍａｓｓ、］　）の窪み（ウェル）は、ＬＴ−Ｂサブユニットの結合を改善するために、そしてこれにより感度を増加させるために、５０μ！９／ｄの■型ガングリオシド［シグマ　ケミカル　カンパニー、セントル−イス、ミズーリー州［ＳｉｇＩＩｌａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　３ｔ、１−ｏｕｉｓ、　Ｍｏ、］で予め被覆された。微小力価窪みは、次に希釈された溶解物サンプルを含む０．２ｄ部分標本で満たされ、モして室温で１時間インキュベートされた。インキュベーションに続き、微小力価窪みは、空とされ、そしてＰ　Ｂ　Ｓ　−ＴＷｅｅｎを用いて３回洗浄された。窪みは次に、それぞれ室温にて１時間の間、ＬＴに対する単特異性ヤギ高度免疫抗血清〔クレメンツら、インフエクト、イムノ、λ９：９１（１９８０年）　Ｅ　Ｃｌｅｍｅｎｔｓ　ｅｔ　ｓｌ、、Ｉ　ｎ４ｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　２９　：９１　（１９８０）］）で、またアルカリ性ホスフ？ターゼに接合したウサギ抗 −ヤギ抗血清〔マイルス　リサーチラホラ１〜リーズ［Ｍｉｌｅｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｔｅｓ　３　）で、連続的に処理された。なお、それぞれの添加に続いて、３回のＰＢＳ−Ｗｅｅｎ洗浄が行なわれた。アルカリ性ホスフ１ターゼ分析は次に、１０％ジェタノールアミン緩衝液（ｐＨ９，８＞中の１＃＋５１／ｄｉ）−二トロフェニル　ホスフェート基質の２００ｕｍ部分標本を添加し、室温で６０分間プレートをインキニーベートし、３ＭＮ　ａ　Ｏ＋−（の２５μｇ部分標本の添加により反応を停止し、そして結果を４００ｎｍで分光８１１１光的に測定することによってなされた。いくつかの場合において、ホルムグレンとスベネルホルム［Ｈｏ１ｍｒ＋ｒｅｎ　ａｎｄ　５ｖｅｎｎｅｒｈｏｌ＋ｎ］　（スカンド、ジエイ。イムツル、旦、補遺７：１１１〜１１８（１９７８年）［３ｃａｎｄ、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｆ３．５ｕｐｐ１．７：　１１１−１１８（１９７８）１）のＥＬｒＳＡ法の変更体が代わりに用いられた。微小力価プレートは■型ガングリオシドで予め被Ｎされ、そして０．５％ゼラチンを含むＰＢＳ　（ＰＢＳ−Ｇ）中の試験されるべきサンプルの１００ｕ、Ｕ部分標本が微小力価窪みの中ヘビヘラｌ〜により入れられた。プレートは次に３７℃で４５分間インキ１べ−１〜され、窪みはＰＢＳ−Ｇで満たされ、インキ１ベーシヨンがさらに３７°Ｃで３０分間続けられ、そして、プレートはＰ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎを用いて洗浄された。窪みは次に、最初にしＴに対する抗血清を含む、そして次に西洋ワサビペルオキシダーゼに接合された抗ＬＴ免疫グロブリンに対して指向した抗血清を含むＰＢＳ−Ｇの１００μｇ部分標本を用いて３７°Ｃで４５分間の間連続的に処理された。それぞれのインキュベーション期間に続き、窪みはＰ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎを用いて３回洗浄された。西洋ワサビペルオキシダーゼ分析は、次に、基質としてのＯ−フェニレンジアミンの使用によって行なわれた。この基質は、０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５゜０１−当り　Ｏ〜フェニレンジアミン（シグマ　ケミカル　カンパニー、セントルイス、ミズーリー州［３ｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ　］　）　１１ｍを溶解することによって使用の直曲に調製された。次に、このクエン酸塩緩衝液５０ｔ１．Ｑ当り０．３％町０２を１ｍ含む溶液の等容量が添加され、０．００６％町０２の最終濃度を得た。基質２００μｇがそれぞれの窪みに添加され、プレートは、暗所において室温下３０分間インキュベートされ、そしてペルオキシダーゼ反応は、それぞれの窪みへの４Ｍ　Ｈ２ＳＱ４７５μｍの添加によって停止された。結果は、４９２ｎｍでの吸光度を計測することにより分光測光学的に測定された。西洋ワサビペルオキシダーゼを用いるＥＬＩＳＡは、アルカリ性ボスファターゼを用いるものよりもかなりより感度のよいものでおった。しかしながら、その他の点においては、この２つの系は匹敵するものでめった。６．８．２．Ｙ１副腎細ＩＹ】エンテロトキシン検定法上記、第６．８．’１節において述べたようにして調製された、清澄化細胞溶解物は、サックとサック（３ａＣｋ　ａｎｄＳａｃｋ］のマウスＹＩＲＩ腎細胞系（インフエクト、イムノ、エユ：３３４　（１９７５年＞　［Ｉ　ｎｆｅｃｔ、　Ｌ　ｍｍｕｎ、エユ：３３４　（１９７５）］　）において毒性に関して分析された。１２．５％ウマ血清、２．５％胎児ウシ血清および４０μｇ／μｊゲンタマイシンを含むハムのＦ１０培地ＥＨａｍ’ｓＦ　１０　ｍｅｄｉｕｍ　］に維持されたＹ１副腎細胞は、同じ培地を含む７５ｃｔ／を培養皿中に植継ぎされ、細胞が集密［ｃｏｎｆ’１ｕｅｎｃｙｌに達するまで３７℃でインキュベートされた。細胞が集密的となると、培地は、エシェリキア・コリＬ丁−Ｂクローン溶解物の一連に希釈された部分標本を含む新鮮な＠地によって置換えられ、そして培養株はさらにインキュベートされた。インキュベーションの１８〜２４時間後に、培養株は細胞形態に関して位相差変換顕微鏡を用いて調べられた。ＩＴ毒素の影響下においては、正常な平たい副腎細胞は丸くなる。この検定法の感度は、培地２００μｐ当り粗エシェリキア・コリ毒素０．２μＪおるいは精製しＴｌｏｐｇの程度が検知され得るようなものである。６．８．３．エンテロトキシン活性のラット回腸ループ検定法クリプステインとエンガード［Ｋ１１ｐｓｔｅｎ　ａｎｄ　Ｅｎｏｅｒｔ　］〔インフフラクト。ムノ、２３：５９２〜５９９（１９７９年＞　［Ｉｎｆｅｃｔ、）ｍｍｕｎ、　２３　：５９２−５９９　（１９７９）Ｊ〕の方法を用いて、離乳スプラーグードウーリ−［Ｓｐｒａｇｃｒｅ　−Ｄａｖｌｅｙｌラット（チャールズ　リバー　ブリーディング　ラボラトリーズ、ウィルミントン、マサチューセッツ州［Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｂｒｅｅｄｉｎｏ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉ　＋ｍｒｎｇｔｏｎ、　Ｍ　ａｓｓ、コ）は、回腸を露出しそして遠位で１０ｍループを結紮することによって外科手技的に準備された。それぞれの動物は次に、滅菌食塩水溶液○、５雇中のＬＴ、ＬＴ−８またはＬＴ −ＢＮ丁をループ中に直接接種によって抗原投与された。１８時間後に、動物は屠殺され、そしてループガ流体蓄積に関して調べられた。それぞれのエンテロトキシン濃度で５〜８匹のラットからの値から導き出されたデータは、回腸１　ｃｍ当りの流体蓄積として表わされた。回腸１　ｃｍ当り５０μｇより多い流体蓄積によって示される正の応答は、ＬＴの１μ７程度の少なざで観察された。６．９．特異的しＴ−８産生性クローンの調製および単離第−代クローンにより産生きれたしＴ−８における毒性ゆえに、ＬＴ−Ｂｍ仏子は、プラスミドｐＢＲ３２２中にそして次にＭ１３ｍｌ）７由来ｐＵｃ８プラスミド（ビエイラとメッシング、ジーン−１９：　２５９　（１９８２年）［Ｖｉｅｉｒａ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｑｅｎｅ工９　：２５９　（１９８２）１）中に連続的に移植された。６．９．１　ｐＤＦ８２の！４ｉ離ヒト単離体１−１１０４０７のＬＴ　ＳＴ　エンテロトキシン　プラスミドは、制限酵素上ｓｔｌで切断され、５．２Ｋｂ　ＤＮＡフラグメントが生じた（第１図参照）。しＴ遺伝子を含んだこのフラグメントは、次にＰｓｔｌで切断されそしてアルカリ性ホスファターゼで処理されたプラスミドｐＢＲ３２２中へ挿入された。連結反応は丁４　ＤＮＡ　リガーゼを用いて行われ、ｐＤ　Ｆ　８２と呼称される１０．４Ｋｂプラスミドを生成した。連結反応混合物は次にエシェリキア・コリＭＭ２９４［旦、並置　ＭＭ２９４］を形質転換するために用いられた。プラスミドＤＢＲ：３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性をコード化するものである。このプラスミドが制限醇素ｐｓｔ　Ｉで切断されそしてＤＮＡフラグメントが挿入された場合、アンピリジン耐性は失なわれるが、テトラサイクリン耐性は失なわれない。これらのトランスフォーマントはそれゆえ、これらの抗生物質を含む培地における増殖あるいは増殖無能により判断されるアンピリジン感性（Ａｐ　）およびテトラサイクリン耐性（Ｔｃ　＞に関するふるいわけ法によって単離された。２５μぴ／ｄテトラサイクリンを含有するトリブチカーゼ　ソイ　アガール上への平板培養化の後に、培養株は３７°Ｃで１８時間インキュベートされた。増殖集落は、次に［ブロス中にてクローニングされ、部分標本が１００μ７／或アンピシリンを含有するトリブチカーゼ　ソイ　アガール　プレート上ヘスボットされそして３７°Ｃで１８時間インキュベートされた。Ａｐ　Ｔｃ　トランスフォーマントは次に、Ｙ１副腎細ＦＭ系およびＥＬＩＳＡによってＬ丁産生に関して検定された。プラスミドＤＮＡは、ポリバーとバックマン［３ｏｆ　１ｖａｒ　ａｎｄ　Ｂａｃｋｍａｎ］の方法〔メソッズ　インエンサイモロシイ　６８　：　２４５　（１９７９年）　［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　５旦：２４５　（１９７９）］）によっていくつかのＬ丁＋トランスフォーマントから単離され、そして０゜７％アガロース中で電気泳動にかけられた。電気泳動およびＤＮＡ視認化の条件は上記第６．６．２節において述べたようなもので必る。ＤＤＦＢ２と呼称される１つの単離体は、両方の検定系に陽性であり、また電気泳動において単一プラスミドを示すのみで必った。旦旦　■での再切断の際、プラスミドｐＤ　Ｆ　８２は、４゜３Ｋｂ　ｐＢＲ３２２クローニングベクター及び５．２ＫｂＬＴコード化ＤＮＡフラグメントに一致するわずかに２つのフラグメントを生じた。Ｐｓｔ　Ｉ、ＦｃｏＲＩ、　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ、　Ｈｉｎｃ　ＩＩ、　ｌ−１ｉｎｆＩおよびΔ■　■による粗換え型プラスミドのこれに続く分析は、ＤＮＡフラグメントのサイズｐＤＦ８２からのクローン化り丁　ＤＮＡ領域が、プラスミドｐＢＲ３２２のテトラサイクリン耐性遺伝子におけ図参照）。プラスミドＤＤＦＢ２およびｐＢＲ３２２が旦ｉｎｄ　ｍで切断され、混合されそしてＴ４　ＤＮＡ　リガーゼで連結された。この連結反応混合物は、再びエシェリキア・コリＭＭ２９４中に形質転換され、そしてトランスフォーマントは、抗生物質耐性および感性に基づいて選択ざイクリン耐性を破壊し、一方アンピリシン耐性には影響をもたらさないので、ＡＩ）　 ’　ＴＣ”細胞が選択された。これは、増殖するエシェリキア・コリ細胞を殺すシクロセリンの使用によってさらに高められる選択アプローチによって達成された。５０μｇ／μΩアンピリジンを含むしブロスにおける１８時間のインキュベーションの後、培養株は４μ７／ｍ１テトラサイクリンを含む新鮮培地中へ１：１００に希釈された。４５分間のインキ１ベーシヨンの後、Ｄ−シクロセリンが１００μ９／ｍ１の濃度へと添加され、さらに２時間インキュベーションが続けられた。培養株は次に遠心分離され、モしてベレッ１〜がしブロス２０ｍ１中に再懸濁された。ざらに３時間のインキ１ベーシヨンの後、０．１ｒｒＩ１．部分標本が５０μ７／威アンピリジンを含むトリブチカーぜ　ソイ　アガール上に平板培養され、得られた集落が単離された。トランスフｔ−マントは次に、しＴ−８産生関してヒしＩｓ△により、またＬＴ−Ａの不在に関してＹ１副腎細胞検定における毒性の欠如により検定された。これらの要望にほぼ合致するが、重量換算でｐＤＦ８２よりのＬＴの毒性の１／１０００が残存する１つのクローンをＤＤＦ８７と呼称した。ポリアクリドアミドゲル電気泳動法、ＥＬＩＳＡあるいは解離状態下にお【ブるゲル濾過によっては、ｐＤＦ８７中にＬＴ−Ａを全く検知できなかったゆえに、この毒性の理由は明らかとはならなグメントすなわちｐＢＲ３２２としＴ　−８に関しコードされたより小さな（０，８Ｋｂ　）フラグメントに分ける。重質なことは、Ｌ、Ｔ−△の産生に関しコードする１、５ＫｂｐＤＦ８７からのクローン化ＬＴ−Ｂ　ＤＮＡは、クローニングベクター１）ｔＪｃ８のシングルｌ−１ｉｒｌｄ１１１部位中へ再クローニングされた（第３図参照）。ビエイラとメツシング〔ジーン　エ９　：２５９　（１９８２年）　［（３ｅｎｅ、工」−：２５９　（１９８２）１　）によって作られた、このベクターは、Ｍ１３ｍｐ７由来のものでおる。プラスミドｐＤＦ８７は、１−（ｉｎｄＩＩＩで切断され、そして０．８Ｋｂ　ＬＴ−Ｂ　ＤＮＡフラグメンｌ〜が、低融点アガロース中で電気泳動く上記、第６．１．２節参照のこと。）することによって分離され、ざらににフェノールで抽出された。ＣＩＪＣ８が次に混合され、連結反応され、そしてエシェリキア・コリに一１２中に形質転換された。ｐＵＣ８のＨｉｎｄＩＩＩ部位におけるＤＮＡフラグメントの挿入は、プラスミドにおける変化しないアンピリジン耐性と共にトランスフォーマント選択の基礎を与えるβ− ガラクトシダーゼ活性に関する溝造遺伝子を破壊するものである。トランスフ万一マントは、１００μ９／ｄアンピリジンを含む７丁　プレート（水１１当り　バクト　トリプトン［ｆ３　ａｃｔｏ　丁ｒｙｐｔｏｎｅ　］　８　ｇ、ＮａＣ１５ｇ、酵母抽出物５９；！′３よび寒天１，５び）上にて平板培養されそして、２００μ’Ｊ／ｄ　５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル− β−Ｄガラクトシダーゼ（Ｘ−ｇａｔ）で補足された。リューツエール［Ｒｕｔｈｅｒｅ、］　（モル、ジエン、ジエネット。１７８：４７５　（１９８０年）　［Ｍｏ１．　（３ｅｎ、　Ｑｅｎｅｔ、ニア８：４７５　（１９８０）］）によって述べられるように、Ｘ−ｇａｌは、β− ガラクトシダーゼ基質の１つであって、該酵素の存在において無色から青色に変化する。Ｘ−ｇａｔ−ＹＴにおいて３７℃での１８時間＠養に続いて、無色集落（プラスミド提携β−ガラクトシダーゼ活性が、挿入により不活性化されたもの）が単離された。Ａｐ　β−ガラクトシダーゼ−トランスフォーマントは、次にＬＴ−ＢＮＴ産生に関してＥ　Ｉ−Ｉ　ＳＡによって検定された。ｐＪＣ２１７と呼称される１つの正のクローンからのＬＴ−ＢＮＴは次に、Ｙ１副腎細胞において試験され、完全に非毒性であることが見出された。このプラスミドを抱く細菌は、エシェリキア・コリ株ＪＭ８３　（ｐＪＣ２１７〉と呼称された。６．１０．ＬＴ−ＢＮＴの回収６．１０．１．ＤＪＣ２１７プラスミドを含むエシェリキア・コリに−１２の増殖株ＪＭ８３　（ｐＪＣ２１７）の継代培養が、２つのタイプの集落を産出した。Ｏ型と呼称される一方のものは、形状において小さく、ふくれたそして不透明なものであった。ＴＷと呼称される他方のものは、より大きく、平らでそして半透明のものでめった。Ｔ型果落がＯ型集落に比べて５０〜１００倍も多くのＬＴ−ＢＮＴを産出するゆえに、しＴ−ＢＮＨの産生に関してＴ型集落のみを利用することが重要でおる。Ｏ型集落がＴ型渠落から自然発生し得るために、単−Ｔ型果落が選択されるべきでおる。エシェリキア・コリ株ＪＭ８３　（ｐＪＣ２１７）の繁殖のための培地の選択は、臨界的なものではなく、トリブチカーゼ　ソイ　ブロス、Ｍし培地及びエバンス［Ｅ　ＶａｎＳ］のＣＡＹＥ培地は満足できるものでおる。本発明の一実施（倶様においては、プラスミドｐＪＣ２１７により形質転換された有機体は、該プラスミドを安定化するために、１００μｑ／ｄアンピシリンを含むトリブチカーゼ　ソイ　ブロスを入れた１０Ｘ１．５０ｍ培養皿において集密的に画線培養すれた。３７℃での１８時間のインキ１ベーシヨンの後に、それぞれのプレートは、１Ｃ）Ｑの増殖培地に対する接種物として与えるのに十分な量の細胞を含んでいた。インキューベーションの後、トリブチカーゼ　ソイ　アガール　プレートからのｗＩ菌は、減菌０．８５％ＮａＣ，Ｑ５ｉで収穫され、そして０．５％グルコースを含むＣＡＹＥ培地を約１０６ＣＦＵ／ｄのレベルで接種するために用いられた。ＣＡ　Ｙ　Ｅ　＠地は、蒸留水１１当りカザミノ酸［Ｃａｓａｍｉｎｏ　Ａｃ１ｄｓｌ　２０９　、　Ｒ母抽出物６ｇ、ＮａＣｆ１２．５び、Ｋ２　ＨＰＯ４８，７１’；１１３よび極微量の塩類（５％ＭｇＳＯ４，０，５％ＭｎＣｕ２および０．５％ＦｅＣ，１Ｑ３）１ｄからなるものである。接種に続き、培養株は、３７℃で１８〜２４時間攪拌しながらインキュベーインキュベーション培地からの細胞は、４℃で２０分間、５、ｏｏｏｘｑで遠心分離することによって集められた。上澄み流体は、クロロツクス［ＣＩｏｒｏｘ　］消毒剤中に廃棄され、そして細胞ペレットは、０．０５Ｍ１〜リス、０゜００１Ｍ　ジナリウムＥＤＴＡＳ０．００３Ｍ　アジ酸ナトリウムおよび０．２Ｍ　ＮａＣｊｌを含むｍｌ液、１）８７゜５　（ＴＥＡＮ緩衝液）の最小容量中に懸濁された。これらの細胞懸濁液は次にプールされ、そして必要とされるまで−６０’Ｃで凍結保存された。細胞の凍結は、ＬＴ−ＢＮＴ回収のためのエシエリキア・コリに−１２の十分な破壊をもたらす。音波処理やフレンチプレス［Ｆ　ｅｎｃｈ　ｐｒｅｓｓ］の使用のような機械的破壊技術は、試料における熱の上昇をなくすために細心な取扱いがなされる限り適用されることができる。リゾチームは、溶解剤としてリゾチームを用いての最終ＬＴ−ＢＮＴ回収率が６０％近くまで減少したために、避けられるべきである。３７°Ｃの水浴中に保存容器を最少時間旋動させることにより、凍結細胞懸濁液は急速に解凍された。懸濁液は次に等容量のＴＥＡＮ緩衝液と合わせられ、混合するためにゆっくりと旋動され、そして次に膜および非溶解細胞を沈降させるために５．ＯＯＯｘｇで２０分間遠心分離された。この凍結解凍法の単回適用からのしＴ−ＢＮＴの代表的回収率は５０％でめった。より高い回収率が、より不応な非溶解細胞に対し、このサイクルを繰返すかあるいは他の破壊技術を適用することによって得られつる。遠心分離ステップからの上澄み分画はすべて、次にさらに精製のために合わせられた。６．１０．３．ＬＴ−ＢＮＴのアフィニティークロマトグラフィー的精製遠心分離された細胞溶解物からの透明な上澄み流体は、あらかじめ４°ＣでＴＥＡＮ緩衝液中で平衡化された２、５Ｘ　８０　ｃｍセファロース４Ｂ（ファラマシア　ファインケミカルズ、ビス力夕ウエイ、ニューシャーシー州［Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ、　Ｊ、］）の頂部に直接（緩衝液下に層状にされることはない。）適用された。カラムは次に、２８０止で監視される流出が、ベースラインレベルに達するまで、１時間当り２０ｄの流速でＴＥＡＮ緩衝液を用いて浄化された。この時点で、ＴＥＡＮＭ衝液中の０．２Ｍガラクトースが適用されそして１時間当り２０にの流速が維持され、一方、６ｍ１分画が集められた。ＬＴ−ＢＮＨの出現は、ガラクトースにわずか前方に位置する２８００ｍでの吸光度の単一ピークととして検知された。すべての操作は４℃で行なわれ、そして完了した際、ＬＴ−ＢＮＴ分画はプールされ、そして大量のＴＥＡＮ緩衝液に対して透析され、保存のために凍結乾燥された。６、１１．毒　に関する１丁−ＢＮＴの１丁、クローンｐＤＦＢ７からのＬＴ− ８、およびクローンｐＪＣ２１７からのＬＴ−ＢＮＴのサンプルが上記、第６．８．２節において述べたようなＹ１副腎細胞検定系において分析された。サンプルのタンパク質含量は、ローリ−ら［ＬＯＷＩ’Ｖ、ｅｔ　ａｌ、］の方法［ジエイ、パイオル、ケム。された。結果は第１３表に示される。第１３表エンテロトキシン活性の副腎＃１　′″″ＬＴ−Ｂ　（ｐＤＦ８７　）　３９しＴ−ＢＮＴ（ｐＪｃ２１７）　２５，０００＊活性は、５０％の細胞の丸い形状化をもたらすのに必要とされたそれぞれのｙ物のノナグラム量として　される。第１３表のデータは、しＴはしＴ−ＢＮＴよりも６５０゜０００倍も活性が大きなものであることで、ＬＴ−ＢＮＴの毒性がし王のそれと比較して相当烈しく低減されることを示すものである。しＴ−８に関する結果は、これがし王よりも実質的に低い毒性ではめるが、かなりの毒性をとどめていることを示すものである。完全しＴエンテロトキシンのそのサブユニットへのクロマトグラフィー的分離により生成されるＢサブユニットの毒性と匹敵するこの毒性は、ＬＴ−Ｂをワクチンとしての使用に不適当なものへと、通常してしまう。第６．８．３節において述べたようなラット回腸ループ検定におりる１丁およびＬＴ−ＢＮＴの分析はまた、しＴ−ＢＮＨの注目すべき非毒性の特徴を表わすものであった。結果は、それぞれの値が５〜８匹のラットからの平均値である第１４表に示される。第１４表エンテロトキシン活性のラット回腸ループ検定流体蓄積比“ ＬＴ　１００　８１８Ｌ丁−ＢＮＴ　１００　０＊５０よりも大きな流体蓄積比は、陽性の結果であると考えられる。第１４表において示されるように、ＬＴ−ＢＮＴの１００μ３最は、ラット回腸ループ検定において完全に不活性であった。これに対して、ＬＴの同量は、極小の有意レベルよりも１６倍も高い回腸ループ流体蓄積の刺激をもたらした。６．１２．ＬＴ−ＢＮＴに対する抗血清の調市“６．１２，１．マウスにおけるしＴ−ＢＮＨに対する抗血清の調製１０四の第４〜６週齢のバルブ／ラージエイ［８ａｌｂ　／Ｃｊ］雌性マウス（ジャクソン　ラボラトリーズ［ＪａＣｋＳＯｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓｌ　）のグループが、食塩水（蒸留水１ρ当りＮａｃ、１１９９）Ｏ，ｌｄを、比較対照としてそれのみであるいは、ある量のＬＴ−ＢＮＴを加えてかのいずれかで皮下注射された。いくつかの場合においては、１週間後に追加注射が投与された。ワクチン接種の直前およびその後の種々の時間で、血液標本が尾部スリッピング［ＳｎＳｎ１ｐｐｉｎによって得られ、そして血清が希釈され、上記第６．８．１節において述べたようなＥｌ、−ＩＳＡによって抗体活性について検定された。抗体活性は、吸光度曲線の直線領域に降下する吸光度をもたらすのに必要とされる全サンプル希釈として表わされる。予備実験においては、ＬＴ−ＢＮＴの種々の量でのワクチン接種の効果が観察された。結果は第１５表に示される。（以下余白）第１５表ＬＴ−ＢＮＴでのマウスのワクチン接種に４なう円滑応答ＬＴ−ＢＮＴ　抗体活性＋ＮＯ＝検知されない。＊免疫後活性は、示されたＬＴ−ＢＮＴＩでのワクチン接種１週間後の尾部スリッピング血液ザンプルにおいて、アルカリ性ホスファターゼＥＬＩＳ△により測定された。抗体活性は、吸光度曲線の直線領域に下降する４００１ｍでの吸光度をもたらすのに必要とされる全サンプル希釈として表わされる。ワクチン接種は、アジ１バントを用いることなく食塩溶液において１われた。第１５表に示したように、ＬＴ−ＢＮＴに対する抗体は、ワクチン接種前には、いずれの動物からも検知されなかった。ワクチン接種１週間後近くで、抗しＴ− ＢＮＴ抗体が検知され得た。期待したように、抗体活性は、ＬＴ−ＢＮＴへの暴露を増ずことで増ｂｏｂだ。多重ワクチン接種に対する二次抗体応答があり得るが否かを決定するために、マウスのグループは、上述したと同様にＬＴ−ＢＮＴを注射され、そして再び１週間後に等用量を注射された。結果は第１６表に示される。第１６表マウス中の抗体産生にあけるＬＴ−ＢＮＴでの２次ワクチン　種の影響抗体活性ＬＴ−ＢＮＴ　２次ワクチン −１傘艮笠且工屋呈上　免疫前　出　接種　出−ハ−ＮＤ”　ＮＤ　ＮＤｌｏ　ＮＤ　８　、＋　７．１４４１０　ＮＤ　８　３８４＋ＮＤ＝検知されない。市免疫後活性は、ＬＴ−ＢＮＴでのワクチン接種（１°）１週間後に尾部スリッピング血液サンプルにおいて、アルカリ性ホスファターゼＥＬＪＳＡによって調べられた。この時間に、２次ワクチン接種（２°）あるいは食塩溶液が投与され、そして免疫後活性が再びその１週間後に調べられた。ワクチン接種は、アジュバントを用いることなく食夏田１Ｑ江１Ｍ旦几昌−−−−−−−−−−−−−第１６表におけるデータは、抗ＬＴ−ＢＮＴ活性は、ＬＴ−ＢＮＴを注射された動物においてのみ検知され得ることを示すものである。この活性は、ＬＴ−ＢＮＴでの２次抗原投与によって顕著に増加した。これに対して、ＬＴ−ＢＮＴ追加が全く与えられなかった場合、抗体力価における増加は、実質的とはいえより低いもめであった。ＬＴ−ＢＮＴによる抗原投与に対する応答において産出される抗体活性が持続性であったということは、１０匹の１３ａｌｂ／ｃｊ　雌性マウスがアジュバントを用いず食塩水溶液中のＬＴ−ＢＮＴＩＯμびを注射された実験において示された。その後の種々の時間において、尾部スリッピング血液サンプルは、抗ＬＴ− ＢＮＴ抗体活性に関して、西洋ワサビ　ペルオキシダーゼＥＬＩＳＡによって分析された。第１７表に示すように、抗体活性は、免疫処置の２週間後にピークに達するが、２０週間後においてすら実質的に持続された。この強烈でかつ持続された応答は、追加物が投与されずまたアジュバントが用いられなかった場合ですら見（以下余白）第１７表　゛単回ＬＴ−ＢＮＴ注射に伴なうマウスにあける抗体活性の）続性ワクチン接種後２　１０．２４０＋　ＮＯ＝検知されない＊抗体活性は、４９２ｎｍでのＥＬＩＳ△吸光度曲線の直線領域における応答をもたらすために必要とぎれる抗血清希釈の度合として表わされる。６、１２．２．ヤギにおけるＬＴ−ＢＮＨに対する抗血清の調製抗血清が、標準方法を用いて精製しＴ−ＢＮＴ２／１１！ｉＦを皮下法則することによって６ｔ月齢異系交配ヤギに産生きれた。同一量の付加ワクチン接種が４週間後に与えられ、そして血液サンプルが最初のワクチン接種から１０週間後に、採収された。このように採収された血液は、凝血するまで放置され、凝塊は５，０００ｘｇで３０分間遠心分離することによって沈降させされ、そして得られた血清は、４℃で一晩５０％硫酸アンモニウムで処理された。形成された沈澱物は、１０．○ＯＯＸ！１１で５分間遠心分離することによってペレット化され、そしてこのペレットは、丁ＥＡＮ緩衝液（第６．１０．２節＞１（Ｍ中に溶解され、そして２００倍容量の同じ緩衝液に対して４°Ｃで総計２４時間の間３回透析された。得られた抗血清をしＴ−ＢＮＴに関してかなり特異的とするために、調製物は、アフィニティー　りロマトグラフィーによって２度精製された。この精製方法に関して、ＬＴ−ＢＮＴセロファースおよびＣＴ−Ｂセロファースは、製造業者の指示に従い、臭化シアン活性化セロファース４Ｂ（ファラマシア　ファイン　ケミカルズ、ビス力タウエイ、ニューシャーシー州［Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｐ　ｉｓｃａｔａｗａｙ、　Ｎ　Ｊ　）に精製されたしＴ−ＢＮＴあるいはＣＴ−８（リスト　バイオロジカル　ラボラトリーズ、インコーホレーテッド［Ｌｉ５ｔ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ。１）を共有結合することにより調製された。透析された抗血清は、ＬＴ−ＢＮＴセロファースの１．５Ｘ１８ｃｍカラムを通して最初に通過させ、これは、ＴＥＡＮ緩衝液で十分に洗浄された。固定化しＴ−ＢＮＴに結合した免疫グロブリンは次に、０．２Ｍグリシン−１−ＩＣρ緩衝液、ＤＨ３゜５を用いてカラムより溶出され、これは、採集された際に０．２５Ｍトリスで中和された。溶出された免疫グロブリンは、上記に述べたようにしてＴＥＡＮ緩衝液に対して透析され、そして次に、１　Ｘ　５　ｃｔｎＣＴ−８セフ？ロースカラムにかけられた。該カラムを通過する免疫グロブリンは採収され、そしてＥＬＩＳＡによってＬ丁＝ＢＮＴに関して特異的であるが０丁−Ｂに対して非反応的であることが示された。５．１２．３．単クローン性抗体の製造り丁−ＢＮＴに対する抗体を産生することをなさせ得るｎ臓細胞を得るために、６〜８週齢　Ｂａ１ｂ／ｃマウス（ジャクソン　ラボラトリーズ［Ｊ　ａｃｋｓｏｎ　Ｌ　ａｂｏｌ”ａｔｏＩ’ｉｅｓコ〉が屠殺されそして牌臓が無菌的に除去された。単細胞懸濁液が牌臓をワイヤーメツシュ（コレクター、イーーシーアバラタス　コーポレーション、セント　ペータースバーグ、フロリダ州［Ｃｏ１１ｅｃｔｏｒ、　Ｅ−ＣＡｐＤａｒａｔｕｓ　Ｃｏｒｌ）、、　ｓｔ、ｐｅｔｅｒ’ｓｂｕｒｇ、Ｆ１ａコ）を通して強制押出しすることによって得られた。このようにして調製された牌細胞が、４．５００ｍν弓グルコース、２０％胎児ウシ血清、１０％ＮＣＴＣ１０９，１％非必須アミノ酸類、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μ９／ｍｌストレプトマイシン、０゜３ｍＭ５−ブロモグアノシン、５Ｘ１０−５Ｍ　２−メルカプトエタノールおよび５０％胸腺細胞ならし培地（ＴＣＭ）を有する完全ダルベツコ変性イーグル培地［Ｄｕｌｂｅｃ。ｏ’　ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　］　（ＤＭＥＭ＞中の滅菌ＬＴ−ＢＮＴ１μ９／ｌｄに曝された。牌細胞の首尾よい試験管内免疫化に必要とされ、また細胞クローニングにおけるフィーダ一層の必要性を排除するＴＣＭは、４〜６週齢ＢＡＬＢ／Ｃマウスから胸腺を無菌的に除去することによって調製された。単離された胸腺は次に上述したようにして粉砕され、細胞は完全ＤＭＥＭ中で３７°Ｃで加湿された１０％ＣＯ２インキュベーターにおいて３日間培養され、そして培地は１，０ＯＯＸＱで１Ｑ分間遠心分離することにより細胞をペレット化することによって採取され、そして必要とされるまで一２０’Ｃで凍結保存された。３７°Ｃで１０％ＣＯ２において４日間培養の後、ＬＴ−ＢＮＴ処理牌細胞は、１．０ＯＯＸ（ｌで１０分間遠心分離することによって回収された。バイプリドーマを産生するために、これらは次にマウス骨髄腫細胞（Ｘ６３−Ａｇ８゜６５３）と４倍過剰において混合され、そして融合は、４０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ１３００．エムシービー　ケミカルズ［ＭＣＢ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓコ）および５％ジメチルスルフｔキシドの添加によって促進された。２５°Ｃでの１分間のゆっくりした混合に続いて、懸濁液は、ゆっくりとＤＥＡＭで希釈され、そして細胞は遠心分離によって培地より除去された。細胞は次に、５Ｘ１０’Ｍ　２−メルカプト　エタノール、３０％ＴＣＭおよびＨＡ丁（１０−４Ｍヒポキサンチン。１０Ｍ　アミノプロティン、３Ｘ１０’Ｍ　チミジン）で補足されている完全ＤＭＥＭ中に５Ｘ１０５骨髄腫細胞／ｄの希釈度で懸濁された。細胞は次に、この懸濁液を９６ウエル（窪み）組織培養皿中に分配することにより＠養生され、そして３７℃で１０％ＣＱ２において、１週１回の培地交換を２度行なってインキニーベートされた。１週間接に可視的群落が３０〜６０％の窪みにおいて表われ、そして３週間後に、窪みにおける上澄み培地は、西洋ワサビペルオキシダーゼ　ＥＬＩＳＡによってＬＴ−ＢＮ丁特異性抗体の存在に関して、第６．８．１節において述べるようにして試験された。培地がＥＬＩＳＡによって陽性であった窪みにおける細胞は次に限界希釈によっであるいはアガロースにおいて平板培養することによってクローニングされた。限界希釈クローニングは、所望されたハイブリドーマ細胞を、４０％ＴＣＭで補足された完全ＤＭＥＭ中に５００．５０および５細胞／ｄの温度に希釈し、この懸濁液の部分標本を複数ウェル組織培養口中に平板培谷することによって行なわれた。クローンをおおう培地は、２〜３週間のインキ１ベーシヨンの後にＥＬＩＳＡによって再試験され、そして陽性クローンは、同じ培地における継代培養によって拡大された。アガロースにおけるクローニングはコッフィノとシャルフ［ＣｏＨｉｎｏ　ａｎｄ　５ｃｈａｒｆ’ｆｌ　（ブロク、ナトル、アカド、サイ、ニーニスエイ　旦旦：２１９〜２２３　（１９７１年）［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　ＵＳＡ　６旦：２１９−２２３　（１９７１）］　）によって述べられるようにして本質的に行なわれた。ＤＭＥＭ中の４％ジ−プラークアガロース［Ｓｅａ　ＰＩａｑｕｅ　Ａｐａｒｏｓｅｌ　４　ｍｌで被覆された組織培養皿（１５Ｘ６０ｍ、Ｄ−ニング［Ｃｏｒｎｉｎｇｌ　）は、４０％ＴＣＭで補足された完全ＤＭＥＭ中の１０００到胞／ｌｄを含む０．３５％アガロース１１ＩＪｌで重みされた。このプレートは加湿された１０％ＣＯ２インキユベータにおいて３７° Ｃで、群落が８〜１６セルザイズになるまでインキュベートされた。次に、抗マウスＩ９Ｍ／ＩｇＧの１：５０希釈度を有するＤＭＥＭ中の０．４％アガロースを含む重倦物１ｍｌがそれぞれの皿に添加された。２〜３日のインキ１ベーシヨンの後に、視認できる沈澱物は、免疫グロブリン分泌群落を区分し、そして最も活発な分泌群落が無菌パスツールピペットによって９６ウエルプレートへと移された。特に強力な抗ＬＴ−ＢＮＴ抗体産生体はＥＬＩＳＡによって識別され、そして株は所望されるように継代培養によって発育された。しかしながら誘導されクローン化された株は、９０％胎児ウシ血清を有する１０％ジメチルスルフｔキシド中に一１７０’Ｃで凍結して貯蔵することによって保存された。診断試験における使用のために、あるいは他の目的のために大量の単クローン性抗体を産生ずるために、ハイブリトーマ細胞は、腹水腫として増殖させられた。８週齢ＢＡＬＢ／Ｃマウスがブリスタン［Ｐｒ１ｓｔａｎｅ　］　（０，５ｍｌ／マウス、アルドリッヂケミカル　カンパニー、ミルウォーキー、ウィスコンシン州［ＡＩｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、　Ｗａ３．３　）で初回抗原刺激され、そして次に１０日後に１０７個ハイブリドーマ細胞で注射された。７〜１０日間において発現した腹水流体は、麻酔された動物の腹部中に挿入された１Ｂゲージ注射針で捕集された。この流体は次に、１０分間２．○○Ｏｘｇで遠心分離することにより清澄化され、０．１％アジ化ナトリウムの添加によって保存され、そして４°Ｃで貯蔵された。６．１３．ＬＴ−ＢＮＴに対する抗血清によるエンテロトキシン性の中和ＬＴ−ＢＮＴに対する抗血清がビブリオ・コレラおよびエシェリキア・コリのエンテロトキシンの活性を中和し得るか否かを測定するために、Ｙ１副腎ＩＩＩ胞系において細胞の丸くなることをもたらすのに必要とされる量の１００倍であるこれらの毒素の量が、種々の希釈度のヤギ抗血清（第６．６．２節）と、３７℃ にて１時間インキュベートされた。このインキニーベーシヨンに続いて、サンプルは、第６．６．２節において述べるようにして、副腎細胞系にあける毒性に関して分析された。第１８表において示されるように、ＬＴ−ＢＮＴに対する希釈された抗血清は双方のエンテロトキシンを完全に中和した。第１８表り丁−ＢＮＴに対する抗血清による副腎細胞検定におけるコレラおよびエシェリキア・コリエンテロトキシンの活の中和エンテロトキシン　Ｗ証五虫■力員” コレラ毒素　４０エシエリキア・コリＬＴ　１，２８０＋用いられたエンテロトキシンは、球状化する最小用伍の約１００倍である。本力価は、生物学的活性の完全な中和を示す最も高い白漬希釈度の〕Ｉｆ数として定義される。６．１４．ＬＴ−ＢＮＴに基づく分析、６．１４，１．ＥＬＩＳＡ検定上記第６．８．１節においては、手順がサンプルにおけるＬＴ−ＢＮＴのＥＬＩＳＡ検知に関して述べられる。［ＬＩＳＡ系は、人類からのあるいは免疫された動物からの面漬中のＬＴの必るいはしＴ−Ｂに対する特異的抗体の検知に同様に適用できる。抗体検知にＥＬＩＳＡを使用するために、５０ｍＭ炭酸ナトリウムを含むコーティング緩衝液、ｐＨ９゜６中の１　μ’７／ｍ１ＬＴ−ＢＮＨの１００μΩ部分標本が、９６ウエルボリビニルプレート（コスタ−［Ｃ０３ｔａｒ］　）の窪み中にピペットにより添加された。このプレートは空温で２時間インキュベートされ、その時点で窪みはコーティング緩衝液中の０．５％ゼラチンで満たされ、そして−晩４°Ｃでインキュベートされた。非付着抗原は次に、０．０５％ツクツーン２０［丁ｗｅｅｎ　２０コを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ− Ｔ＞で３回洗浄することによつ、で除去された。ヤギ、ヒトあるいはマウス直情またはマウスハイブリドーマ１澄み液などのような、分析されるべき抗体を含有するサンプルは、次に０．５％ゼラチンを含有するＰＢＳ中に希釈され、そして１００μす部分標本において抗原被覆窪みへ添加された。プレートは３７°Ｃで４５分間インキ１ベートされ、上澄み流体が除去され、そして窪みはＰＢＳ−Ｔで３回洗浄された。次に、西洋ワサビベルオキシダーぜに結合した第２の抗体（適当な抗ヤギ、ヒトあるいはマウス免疫グロブリン抗血清）が１００μρ部分標本において、窪みに添加され、そしてプレートは３７℃で４５分間インキュベートされた。第２抗体インキュベーションの後に、プレートはＰＢＳ−■で洗浄され、そして基質（０，００６％Ｉ−（２０２を含む０．１Ｍ　クエン酸ナトリエム緩衝液、ｐＨ５，０１瀬中のＯ−フェニレンジアミン　１ｍ９）の、２０Ｑμｐ部分標本が窪みに加えられた。２５℃での３０分間のインキュベーションの後、酵素反応は、４ＭＨ２Ｓ○４７５μ■表昭６１−５０２９５７　（３Ｂ）層の添加によって停止された。窪みの内容物の吸光度が、次に４９２　ｎｍで計測された。陽性のサンプルは、最初の抗体が添加されなかった比較対照のものより、吸光度が少なくとも２倍であるものに解釈された。この方法の実施においては、第１９表において示されるように、血清サンプルは小児および成人から採取されそしてＬＴ−ＢＮＴに対する抗体の存在に関して分析された。（以下余白）第１９表ヒト血−中のＬＴ−ＢＮＴに欠する抗体の有　・挨ヌ済　Ｘ腋数　星捗ユ玄小児１８〜２４ケ月　１０　２２４〜３６ケ月　１０　１３６〜４８ケ月　９２成人妊婦　１０　２一般母集団　１０　５小児叶康専門家　９７第１９表に於けるデータは、示された年齢範囲におりる個体からあるいはザ　ユニヴアー　シティ　オブ　ロチニスター　メディカル　センターのディヴイジョン　オブベディアトリツク　インフエクシアス　ディシーズ［ｔｈｅ［）ｉｖｉｏｎ　ｏｆ　ｐｅｄｉａｔｒｉｃ　Ｉｎｆｅｃｔｔｏｕｓ　（）ｉｓｅａｓｅ　ａｔ　ＴｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ　Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ　ＭｅｄｉｃａＩ　Ｃｅｎｔｅｒ　］に従事する健康保護専門家から採取された面液サンプルの分析に基づくものである。限された暴露遍歴を有する小児に関して期待されたように、ＬＴ−ＢＮＴに対する抗体の発生は低かった。発生は、一般的成人母集団に関して幾分かより高いものであり、そして小児健康専門家グループに関してより一層高いものであった。後者のグループの９個体中の７個体の血清が陽性であり、エンテロトキシン誘発性下痢症の存在する患者に接触する彼らの高い可能性の見地からは予想されない発見でめった。６．１４．２．免疫プロット分析ＬＴまたはＬＴ−Ｂを含むタンパク質の混合物は、電気泳動的に分離されることができ、そしてホロ毒素またはＢサブユニットはイムノプロット法によって同定され１ｑる。この方法の１つの例示として、ＬＴ−ＢＮ丁１０μびが、５％スペーサーおよび１３％分解化ゲルを用いて、ラエムリ［１−ａｅｍｍｌｉ］　Ｃネイチｐ−２２７：６８０〜６８５（１９７０年＞［Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０−６８５（１９７０）］）の方法によってドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリドアミドゲル電気泳動へと運ばれた。電気泳動に続いて、ゲルは、１９２ｍＭグリシンおよび２０％メタノールと共に、２５ｍＭトリス−ＨＣ，Ｑ、ｐＨ８，３を含む電気溶出Ｍ’ＰＭ液中に４°Ｃで４５分間浸された。タンパク質は最大電流量を用いて、ホヱファー　サイエンティフィック　トランスファ　［Ｈｏｅｆｆｅｒ　３ｃｉｅｎｔｉｆｉｃＴ　ｒａｎｓｐｈｏｒ］電気移動装置における４°Ｃで２時間の電気泳動によってニトロセルロース紙（ＢＡ８５．シュレイカー７ンド　シュエル［３ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　３ｃｈｕｅｌｌ］　）に膨潤ゲルより移された。ＬＴ−ＢＮＴを検知するために、ニトロセルロースシートは２つの方法を発展させた。シートの一切片がすべての移動されたタンパク質を暴露するために７ミドブラツク［Ａｍ１ｄｏ　Ｂｌａｃｋｌで染色された。シートの残りの切片は残存タンパク質結合部位をブロックするために、０．１％アジ化ナトリウムおよび１％オボアルブミンを含有するＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳ−Ａｚ−０）中に４°Ｃで一晩浸された。ブロックされたニトロセルロースは次にＰＢＳ−Ｔで３度、それぞれ１０分間かけて洗浄された。ＬＴ−ＢＮＴを含有するレーンが、室温にて２時間、アフィニティークロマトグラフィー精製ヤギ抗ＬＴ−ＢＮＴ抗血清（第６．．１２．２節）またはアフィニティークロマトグラフィーによりＬＴ−Ｂ　Ｎ　Ｔ結合抗体の調温した血清のいずれかに曝された。これらの血清調製物は、使用前にＰＢＳ−Ａｚ−〇でそれぞれ１−５００および１−１０６に希釈された。血清への暴露が完了した後に、このシートはＰＢＳ　−Ｔを用いて３度それぞれ１０分間かけて洗浄され、そして次に１％オボアルブミンを含有するＰＢＳで” １０００倍希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ヤギ免疫グロブリンと室温で１時間インキュベートされた。このシートは再び、ＰＢＳ−Ｔで３度、１０分間かけて洗浄され、その後基質（０，００５％町０２を含む５０ｍＭトリス −ＨＣΩ、ｐＨ７，６１ｄ当り３，３°　−ジアミノベンゼン塩酸塩ｏ、３ｍｇ＞と室温で３０分間インキュベートされた。反応はシートを水中に浸しこれを風乾することによって停止され、ＬＴ−ＢＮＨの位置が褐色の帯域で示された。６．１４．３．ラテックスビーズ凝集抗原または抗体のいずれかで被覆されたラテックスビーズは対応する特異性抗体または抗原を検知するために用いられ得る。ＬＴ−ＢＮＴに対する抗体を検知するのにこの試験を実行するために、０．８μラテツクスビーズ（ディフコ　ラボラトリーズ、デトロイト、ミシガン州［［）ｉｌ’ｃ。Ｉ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、［）ｅｔｒｏｉｔ　Ｍｉｃｈ、］　）が０．１５ＭＮａＣ，ｌｌ！を含む０．１Ｍグリシン緩衝液、ｐＨ８，２中の１μｇ／／ＩＪＩ！精製Ｉ　Ｔ−ＢＮＨの等容量に添加された。懸濁液はゆつ（つとした振盪を行いながら３７℃で２時間インキュベートされ、有効なビーズ被覆が結果的になされた。インキュベーションの後に、ビーズは１，０ＯＯＸＯで１２分間ゆっくりと遠心分離することによって洗浄された。上澄み流体は０．１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳで置き代えられ、ブロモフェノール　ブルー［３Ｉ’０ｍ０ｐＨｅｎ０１Ｂ１ｕｅ］およびアジ化ナトリウムが、それぞれ最終濃度０．０４％および０．１％へと添加された。抗り丁− ８Ｎ丁抗体に関する凝集検定を行うために、感作ビーズ懸濁液５μｇが、ＰＢＳ比較対照緩衝液必るいはＰＢＳで希釈された試験サンプル１５μｊと混合された。混合直後に示された凝集は、乳状（比較対象）懸濁液から清澄された素性を有する粒子状の懸濁液への変化として定義された。凝集検定はまた、０．２５ｍｙ／ｄのアフィニティー精製ヤギ抗血清あるいは０．１１ｒＧ／ｌｔｄ！のＬＴ−ＢＮＴに対するマウス単クローン性抗体を含有する等容量のグリシン緩衝液中のビーズを感作することによって、サンプル中のＬＴ−ＢＮＨの検知にも適用された。６、１５．微生物の供託プラスミドｐＪＣ２１７を保持するＬＴ−ＢＮＴ産生性エシェリキア・コリ株が、イリノイ州ペオリアのザ　アガリカルチュラル　リサーチ　カルチャー　コレクション（エヌ７−／１ｚ７−ルエル）　［ｔｈｅ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｑｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ［（ＮＲＲＬ）　、Ｐｅ０Ｉ’ｉａ、　Ｊｌｌｉｎｏｉｓ　］に供託され、そして受入番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１５７５７を指定された。供託微生物の培養株は、本出願に基づく特許の認可によって公衆に入手可能なものとなされるであろう。ここに説明されそして請求の範囲に記載された発明は、供託された実施態様が本発明のひとつの例示として意図されたものであるから、供託された微生物の株によって範昭を限定されるものではない。等価のエンテロトキシン　サブユニットを機能的に産生ずる任意の等価の微生物は、本発明の範驕に属するものである。竹表昭６１−５０２９５７　（４０）Ｉｎｍａ＊１ｍ＋ａｌ＾ｏｍｔａｕａｎｎ＊ＰＣＴ／ＵＳ８５１０１２５１１″ １１１ｅｌ１ｍＡ１１ｍ　Ｈａｐ、、、、【Ｉｑ８５，０．　、、。ｑｔｆ表ＮＵ　６１−５０２９５７　（４１）

Claims

【特許請求の範囲】

１．還元末端を有しまた細菌性病原体の莢膜ポリマーから誘導された免疫原性莢膜ポリマーの還元アミノ化産物と、細菌毒素、トキソイドあるいはこれらからの結合サブユニットとから構成される免疫原性複合体。
２．莢膜ポリマーが成熟したヒトにおいて免疫原性でありかつヒト乳児においてより免疫原性の低いものである請求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
３．還元アミノ化がシアノボロハイドライドアニオンの存在下でなされるものである請求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
４．毒素、トキソイドあるいはこれらからの結合サブユニットがジフテリア細菌からのものである請求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
５．トキソイドがジフテリアＣＲＭである請求の範囲第４項に記載の免疫原性複合体。
６．ＣＲＭがＣＲＭ１９７である請求の範囲第５項に記載の免疫原性複合体。
７．毒素、トキソイドあるいはこれらからの結合サブユニットが破傷風細菌からのものである請求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
８．毒素またはトキソイドがシュードモナス毒素またはトキソイドである請求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
９．毒素またはトキソイドがスタフィロコッカス毒素またはトキソイドである請求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
１０．毒素またはトキソイドがストレプトコッカス毒素またはトキソイドである請求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
１１．毒素またはトキソイドが百日咳菌毒素またはトキソイドである請求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
１２．毒素、トキソイドあるいはこれらからの結合サブユニットがエシェリキア・コリ細菌からのものである請求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
１３．結合サブユニットが、エシェリキア・コリの熱不安定性エンテロトキシンのＬＴ−Ｂサブユニットの１ないしそれ以上の免疫反応性で抗原性の決定基を有する非毒性ポリペプチドである請求の範囲第１２項に記載の免疫原性複合体。
１４．ＮＲＲＬに供託されそして受入番号Ｂ−１５７５７を指定されたエシェリキア・コリ細菌によりあるいはこれの変異体、組換え体もしくは遺伝子工学処理等価誘導体により産生された請求の範囲第１３項の非毒性ポリペプチド。
１５．細菌性病原体がヘモフィルス・インフルエンゼタイプｂである請求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
１６．細菌性病原体がエシェリキア・コリである請求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
１７．細菌性病原体がナイセリア・メニンギチジスである請求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
１８．細菌性病原体がナイセリア・メニンギチジス血清グループＡである請求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
１９．細菌性病原体がナイセリァ・メニンギチジス血清グループＣある請求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
２０．細菌性病原体がストレプトコッカス・ニューモニエである請求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
２１．細菌性病原体がストレプトコッカス・ニューモニエ血清型３である請求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
２２．細菌性病原体がズブレプトコッカス・ニューモニエ血清型６である請求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
２３．細菌性病原体がストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１２である請求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
２４．細菌性病原体がストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１４である請求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
２５．細菌性病原体がストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１９である請求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
２６．細菌性病原体がストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２３である請求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
２７．細菌性病原体がストレプトコッカス・ニューモニエ血清型５１である請求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
２８．細菌性病原体がシュードモナスである請求の範囲第１項に記載免疫原性複合体。
２９．細菌性病原体がヘモフィルス・インフルエンゼタイプｂである請求の範囲第６項に記載の免疫原性複合体。
３０．細菌性病原体がストレプトコッカス・ニューモニエ血清型６である請求の範囲第６項に記載の免疫原性複合体。
３１．細菌性病原体がストレプトコッカス・ニューモニエ血清型１４である請求の範囲第６項に記載の免疫原性複合体。
３２．細菌性病原体がストレプトコッカス・ニユーモニエ血清型１９である請求の範囲第６項に記載の免疫原性複合体。
３３．細菌性病原体がストレプトコッカス・ニューモニエ血清型２３である請求の範囲第６項に記載の免疫原性複合体。
３４．フラグメントが酸化開裂により莢膜ポリマーから誘導されるものである請求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
３５．フラグメントが過ヨウ素酸塩酸化により莢膜ポリマーから誘導されるものである請求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
３６．フラグメントがグリコシド結合の加水分解にによって莢膜ポリマーから誘導されるものである請求の範囲第１項に記載の免疫原性複合体。
３７．加水分解は、酵素的になされるものである請求の範囲第３６項に記載の免疫原性複合体。
３８．加水分解は化学的になされるものである請求の範囲第３６項に記載の免疫原性複合体。
３９．加水分解は酸によってなされるものである請求の範囲第３６項に記載の免疫原性複合体。
４０．フラグメントはバイオーゲルＰ−１０［Ｂｉｏ−ＧｅｌＰ−１０］のカラムにおいて１．０８以下のＶｅ／Ｖｏ比で溶出するものである請求の範囲第１５項に記載の免疫原性複合体。
４１．フラグメントはバイオーゲルＰ−１０のカラムにおいて１．０９〜１．３８のＶｅ／Ｖｏ比で溶出するものである請求の範囲第１５項に記載の免疫原性複合体。
４２．フラグメントはバイオーゲルＰ−１０のカラムにおいて１．３９〜１．９９のＶｅ／Ｖｏ比で溶出するものである請求の範囲第１５項に記載の免疫原性複合体。
４３．フラグメントはバイオーゲルＰ−１０のカラムにおいて２．０〜２．４のＶｅ／Ｖｏ比で溶出するものである請求の範囲第１５項に記載の免疫原性複合体。
４４．還元末端を有し、また細菌性病原体の莢膜ポリマーから誘導された免疫原性莢膜ポリマーのフォルマリン処理された還元アミノ化産物と、細菌毒素、トキソイドあるいはこれらからの結合サブユニットとから構成される免疫原性複合体。
４５．細菌毒素、トキソイドあるいはこれらからの結合サブユニットがジフテリア細菌からのものである請求の範囲第４４項に記載の免疫原性複合体。
４６．ジフテリアトキソイドがＣＲＭである請求の範囲第４５項に記載の免疫原性複合体。
４７．ＣＲＭがＣＲＭ１９７である請求の範囲第４６項に記載の免疫原性複合体。
４８．細菌毒素、トキソイドあるいはこれらからの結合サブユニットがエシェリキア・コリ細菌からのものである請求の範囲第４４項に記載の免疫原性複合体。
４９．結合サブユニットがエシェリキア・コリの熱不安定性エンテロトキシンのＬＴ−Ｂサブユニットの１ないしそれ以上の免疫反応性で抗原性の決定基を有する非毒性ポリペプチドである請求の範囲第４８項に記載の免疫原性複合体。
５０．ＮＲＲＬに供託されそして受入番号Ｂ−１５７５７を指定されたエシェリキア・コリ細菌によりあるいはこれの変異体、組換え体もしくは遺伝子工学処理等価誘導体より産生された請求の範囲第４９項に記載の非毒性ポリペプチド。
５１．細菌毒素、トキソイドあるいはこれらからの結合サブユニットが破傷風細菌からのものである請求の範囲第４４項に記載の免疫原性複合体。
５２．還元末端を有しまた細菌性病原体の莢膜ポリマーから誘導された免疫原性莢膜ポリマーと、細菌毒素、トキソイドあるいはこれらからの結合サブユニットとの還元アミノ化産物を、シアノボロハイドライドイオンの存在下において達成される還元アミノ化で形成することでなる免疫原性複合体の調製方法。
５３．莢膜ポリマーが成熟したヒトにおいて免疫原性でありかつヒト乳児においてより低い免疫原性である請求の範囲第５２項に記載の方法。
５４．毒素、トキソイドあるいはこれらからの結合サブユニットがジフテリア細菌からのものである請求の範囲第５２項に記載の方法。
５５．毒素またはトキソイドがＣＲＭ１９７である請求の範囲第５２項に記載の方法。
５６．毒素、トキソイドあるいはこれらからの結合サブユニットが破傷風細菌からのものである請求の範囲第５２項に記載の方法。
５７．毒素またはトキソイドがシュードモナス毒素またはトキソイドである請求の範囲第５２項に記載の方法。
５８．毒素またはトキソイドがスタフィロコッカス毒素またはトキソイドである請求の範囲第５２項に記載の方法。
５９．毒素またはトキソイドがストレプトコッカス毒素またはトキソイドである請求の範囲第５２項に記載の方法。
６０．毒素またはトキソイドが百日咳菌毒素またはトキソイドである請求の範囲第５２項に記載の方法。
６１．毒素、トキソイドあるいはこれらからの結合サブユニットがエシェリキア・コリからのものである請求の範囲第５２項に記載の方法。
６２．結合サブユニットがエシェリキア・コリの熱不安定性エンテロトキシンのＬＴ−Ｂサブユニットの１ないしそれ以上の免疫反応性で抗原性の決定基を有する非毒性ポリペプチドである請求の範囲第６１項に記載の方法。
６３．結合サブユニットがＮＲＲＬに供託されそして受入番号Ｂ−１５７５７を指定されたエシェリキア・コリ細菌よりあるいはこれの変異体、組換え体もしくは遺伝子工学処理等価誘導体により産生されたものである請求の範囲第６２項に記載の方法。
６４．病原体がヘモフィルス・インフルエンゼタイプｂである請求の範囲第５２項に記載の方法。
６５．病原体がエシェリキア・コリである請求の範囲第５２項に記載の方法。
６６．病原体がナイセリア・メニンギチジスである請求の範囲第５２項に記載の方法。
６７．病原体がストレプトコッカス・ニューモニエである請求の範囲第５２項に記載の方法。
６８．病原体がシュードモナスである請求の範囲第５２項に記載の方法。
６９．病原体がヘモフィルス・インフルエンゼｂである請求の範囲第５５項に記載の方法。
７０．病原体がストレプトコッカス・ニユーモニエである請求の範囲第５５項に記載の方法。
７１．フラグメントが酸化開裂により莢膜ポリマーから誘導されたものである請求の範囲第５３項に記載の方法。
７２．フラグメントが過ヨウ素酸塩酸化によって莢膜ポリマーから誘導されたものである請求の範囲第５３項に記載の方法。
７３．フラグメントがグリコシド結合の加水分解によって莢膜ポリマーから誘導されたものである請求の範囲第５３項に記載の方法。
７４．加水分解が酵素的になされるものである請求の範囲第７３項に記載の方法。
７５．加水分解が化学的になされるものである請求の範囲第７３項に記載の方法。
７６．加水分解が酸によりなされるものである請求の範囲第７３項に記載の方法。
７７．該還元アミノ化産物をフォルマリンで処理することでさらに構成される請求の範囲第５２項に記載の方法。
７８．細菌トキソイドがジフテリアトキソイドである請求の範囲第７７項に記載の方法。
７９．ジフテリアトキソイドがＣＲＭである請求の範囲第７８項に記載の方法。
８０．ＣＲＭがＣＲＭ１９７である請求の範囲第７９項に記載の方法。
８１．細菌毒素、トキソイドあるいはこれらからの結合サブユニットが破傷風細菌からのものである請求の範囲第７７項に記載の方法。
８２．請求の範囲第１項の免疫原性複合体からなる、ヒトにおける抗莢膜ポリマー抗体の有効レベルを誘い出すワクチン。
８３．請求の範囲第８２項のワクチンの有効量を投与することでなる、莢膜ポリマーを有する細菌性病原体に対してヒトを能動免疫する方法。
８４．還元末端を有しまた細菌性病原体の莢膜ポリマーから誘導された免疫原性莢膜ポリマーフラグメント。
８５．細菌毒素、トキソイドあるいはこれらからの結合サブユニットに共有結合した抗原からなる免疫原性複合体。
８６．細菌毒素、トキソイドあるいはこれらからの結合サブユットがジフテリア細菌からのものである請求の範囲第８５項に記載の免疫原性複合体。
８７．シツフリアトキソイドがＣＲＭ１９７である請求の範囲第８６項に記載の免疫原性複合体。
８８．細菌毒素、トキソイドあるいはこれらからの結合サブユニットが破傷風細菌からのものである請求の範囲第８５項に記載の免疫原性複合体。
８９．細菌毒素、トキソイドあるいはこれらからの結合サブユニットがエシェリキア・コリ細菌かうのものである請求の範囲第８５項に記載の免疫原性複合体。
９０．結合サブユニットがエシェリキア・コリの熱不安定性エンテロトキシンのＬＴ−Ｂサブユニットの１ないしそれ以上の免疫反応性で抗原性の決定基を有する非毒性ポリペプチドである請求の範囲第８９項に記載の免疫原性複合体。
９１．ＮＲＲＬに供託されそして受入番号Ｂ−１５７５７を指定されたエシェリキア・コリ細菌によりあるいはこれの変異体、組換え体もしくは遺伝子工学処理等価誘導体により産生された請求の範囲第９０項の非毒性ポリペプチド。
９２．細菌毒素、トキソイドあるいはこれらからの結合サブユニットに共有結合した抗原を投与することでなる、ヒトにおける抗莢膜ポリマー抗体の有効レベルを誘い出すワクチン。
９３．（ａ）エントロトキシン産生性細菌の熱不安定性エンテロトキシンのＬＴ −Ｂサブユニットの１ないしそれ以上の免疫反応性で抗原性の決定基を有するポリペプチドに関してコードするＤＮＡ配列からなり、また単細胞性有機体中において複製され、転写されかつ翻訳され得る組換え型ベクターを含有する単細胞性有機体を培養し、そして（ｂ）培養株からこのポリペプチドを単離することからなる、エンテロトキシン産生性細菌の熱不安定性エンテロトキシンのＬＴ−Ｂサブユニットの１ないしそれ以上の免疫反応性のかつ抗原性の決定基を有する非毒性ポリペプチドを製造する方法。
９４．ポリペプチドが免疫原性である請求の範囲第９３項に記載の方法。
９５．組換え型ベクターが、形質転換により単細胞性有機体中に導入されるものである請求の範囲第９３項に記載の方法。
９６．組換え型ベクターが形質導入により単細胞性有機体中に導入されるものである請求の範囲第９３項に記載の方法。
９７．組換え型ベクターがトランスフェクションにより単細胞性有機体中に導入されるものである請求の範囲第９３項に記載の方法。
９８．ＤＮＡ配列中に含まれる情報がエンテロトキシン産生性エシェリキア・コリ細菌のＥｎｔプラスミドから得られるものである請求の範囲第９３項に記載の方法。
９９．ＤＮＡ配列中に含まれる情報が、ブタ起源のエンテロトキシン産生性エシェリキア・コリ細菌のＥｎｔプラスミドから得られるものである請求の範囲第９８項に記載の方法。
１００．ＤＮＡ配列中に含まれる情報が、ウシ起源のエンテロトキシン産生性エシェリキア・コリ細菌のＥｎｔプラスミドから得られるものである請求の範囲第９８項に記載の方法。
１０１．ＤＮＡ配列中に含まれる情報が、ヒト起源のエンテロトキシン産生性エシェリキア・コリ細菌のＥｎｔプラスミドから得られるものである請求の範囲第９８項に記載の方法。
１０２．ＤＮＡ配列中に含まれる情報が、ヒト単離体Ｈ１０４０７のＥｎｔプラスミドから得られるものである請求の範囲第１０１項に記載の方法。
１０３．ＤＮＡ配列がエンテロトキシンＢサブユニットＤＮＡ配列を含むＤＮＡベクターから得られるものである請求の範囲第９３項に記載の方法。
１０４．単細胞性有機体が真核性有機体である請求の範囲第９３項に記載の方法。
１０５．単細胞性有機体が原核性有機体である請求の範囲第９３項に記載の方法。
１０６．原核性有機体がエシェリキア・コリである請求の範囲第１０５項に記載の方法。
１０７．エシェリキア・コリが、ＮＲＲＬ受入番号Ｂ−１５７５７を有するものあるいはその変異体、組換え体もしくは遺伝子工学処理等価誘導体である請求の範囲第１０６項に記載の方法。
１０８．エンテロトキシン産生性細菌の熱不安定性エンテロトキシンのＬＴ−Ｂサブユニットの１ないしそれ以上の免疫反応性で抗原性の決定基を有するポリペプチドに関してコードするＤＮＡ配列からなり、単細胞性有機体中において複製され、転写されかつ翻訳され得る組換え型ベクターを、単細胞性有機体中へ導入することでなる、エンテロトキシン産生性細菌の熱不安定性エンテロトキシンのＬＴ−Ｂサブユニットの１ないしそれ以上の免疫反応性で抗原性の決定基を有するポリペプチドに関してコードするＤＮＡ配列を有する単細胞性有機体を調製する方法。
１０９．エンテロトキシン産生性細菌の熱不安定性エンテロトキシンのＬＴ−Ｂサブユニットの１ないしそれ以上の免疫反応性で抗原性の決定基を有する非毒性ポリペプチド。
１１０．エシェリキア・コリＮＲＲＬ受入番号Ｂ−１５７５７によりあるいはその変異体、組換え体もしくは遺伝子工学処理等価誘導体により産生されたものである請求の範囲第１０９項に記載の非毒性ポリペプチド。
１１１．請求の範囲第１０９項のＬＴ−Ｂポリペプチドおよびこれのための適合性薬理学的担体よりなるワクチン処方物。
１１２．請求の範囲第１１１項のワクチン処方物をＬＴ−Ｂおよびコレラ毒素に対する抗体の産生を誘導するのに十分な量で哺乳類または鳥類動物に注射することでなる、細菌誘発性下痢症に対する防御免疫学的応答をもたらすために哺乳類または鳥類動物を刺激する方法。
１１３．さらに産生された抗体を収穫しそして免疫グロブリン分画を単離することでなる請求の範囲第１１２項に記載の方法。
１１４．哺乳類動物がヤギである請求の範囲第１１２項に記載の方法。
１１５．哺乳類動物がウマである請求の範囲第１１２項に記載の方法。
１１６．哺乳類動物がヒツジである請求の範囲第１１２項に記載の方法。
１１７．哺乳類動物が雌ウシである請求の範囲第１１２項に記載の方法。
１１８．哺乳類動物が雄ウシである請求の範囲第１１２項に記載の方法。
１１９．鳥類動物がニワトリである請求の範囲第１１２項に記載の方法。
１２０．哺乳類動物がヒトである請求の範囲第１１２項に記載の方法。
１２１．請求の範囲第１０９項に記載のＬＴ−Ｂポリペプチドに対する抗体。
１２２．請求の範囲第１１０項に記載のＬＴ−Ｂポリペプチドに対する抗体。
１２３．請求の範囲第１２１項のＬＴ−Ｂポリペプチドに対する抗体およびこれのための薬理学的担体よりなる薬理学的組成物。
１２４．薬理学的担体が動物へのまたはヒトヘの口中投与に適したものである請求の範囲第１２３項に記載の薬理学的組成物。
１２５．薬理学的担体が家畜飼料である請求の範囲第１２４項に記載の薬理学的組成物。
１２６．薬理学的担体がヒト幼児用食品である請求の範囲第１２４項に記載の薬理学的組成物。
１２７．薬理学的担体が薬理学的に許容される電解質溶液である請求の範囲第１２４項に記載の薬理学的組成物。
１２８．組成物が錠剤投薬形態にある請求の範囲第１２４項に記載の薬理学的組成物。
１２９．組成物がカプセル形態にある請求の範囲第１２４項に記載の薬理学的組成物。
１３０．ヒトまたは動物に請求の範囲第１２３項の薬理学的組成物の予防的有効量を投与することでなるヒトまたは動物におけるコレラ様エンテロトキシン誘発性下痢症を阻止する方法。
１３１．ヒトまたは動物に請求の範囲第１２４項の薬理学的組成物の予防的有効量を投与することでなるヒトまたは動物におけるコレラ様エンテロトキシン誘発性下痢症を阻止する方法。
１３２．動物に請求の範囲第１２５項の薬理学的組成物の予防的有効量を投与することでなる動物におけるコレラ様エンテロトキシン誘発性下痢症を阻止する方法。
１３３．ヒトに請求の範囲第１２６項の薬理学的組成物の予防的有効量を投与することでなるヒトにおけるコレラ様エンテロトキシン誘発性下痢症を阻止する方法。
１３４．ヒトに請求の範囲第１２７項の薬理学的組成物の予防的有効量を投与することでなるヒトにおけるコレラ様エンテロトキシン誘発性下痢症を阻止する方法。
１３５．ヒトに請求の範囲第１２８項の薬理学的組成物の予防的有効量を投与することでなるヒトにおけるコレラ様エンテロトキシン誘発性下痢症を阻止する方法。
１３６．ヒトに請求の範囲第１２９項の薬理学的組成物の予防的有効量を投与することでなるヒトにおけるコレラ様エンテロトキシン誘発性下痢症を阻止する方法。
１３７．ヒトまたは動物に請求の範囲第１２３項の薬理学的組成物の治療的有効量を投与することでなるコレラ様エンテロトキシン誘発性下痢症に悩まされるヒトまたは動物を治療する方法。
１３８．ヒトまたは動物に請求の範囲第１２４項の薬理学的組成物の治療的有効量を投与することでなるコレラ様エンテロトキシン誘発性下痢症に悩まされるヒトまたは動物を治療する方法。
１３９．動物に請求の範囲第１２５項の薬理学的組成物の治療的有効量を投与することでなるコレラ様エンテロトキシン誘発性下痢症に悩まされる動物を治療する方法。
１４０．ヒトに請求の範囲第１２６項の薬理学的組成物の治療的有効量を投与することでなるコレラ様エンテロトキシン誘発性下痢症に悩まされるヒトを治療する方法。
１４１．ヒトに請求の範囲第１２７項の薬理学的組成物の治療的有効量を投与することでなるコレラ様エンテロトキシン誘発性下痢症に悩まされるヒトを治療する方法。
１４２．ヒトに請求の範囲第１２８項の薬理学的組成物の治療的有効量を投与することでなるコレラ様エンテロトキシン誘発性下痢症に悩まされるヒトを治療する方法。
１４３．ヒトに請求の範囲第１２９項の薬理学的組成物の治療的有効量を投与することでなるコレラ様エンテロトキシン誘発性下痢症に悩まされるヒトを治療する方法。
１４４．動物が子ブタである請求の範囲第１３０項、第１３１項、第１３２項、第１３７項または第１３８項のいずれかに記載の方法。
１４５．動物が子ウシである請求の範囲第１３０項、第１３１項、第１３２項、第１３７項または第１３８項のいずれかに記載の方法。
１４６．動物が子ヒツジである請求の範囲第１３０項、第１３１項、第１３２項、第１３３項または第１３４項のいずれかに記載の方法。
１４７．エンテロトキシン産生性細菌がエシェリキア・コリである請求の範囲第１３０項に記載の方法。
１４８．エンテロトキシン産生性細菌がビブリオ・コレレである請求の範囲第１３０項に記載の方法。
１４９．請求の範囲第１２１項の抗ＬＴ−ＢＮＴポリペプチド抗体を、コレラ様エンテロトキシン産生性細菌、それらのエンテロトキシンあるいはこれらからの結合サブユニットを含むと疑われるサンプルと混合し、そしてこの抗体と任意のコレラ様エンテロトキシン産生性細菌性エンテロトキシンあるいはこれらからの結合サブユニットとの相互作用を検知することでなるコレラ様エンテロトキシン陽性のエンテロトキシン産生性細菌、それらのエンテロトキシンあるいはこれらからの結合サブユニットに関する診断試験方法。
１５０．エンテロトキシン産生性細菌がエシェリキア・コリである請求の範囲第１４９項に記載の方法。
１５１．エンテロトキシン産生性細菌がビブリオ・コレレである請求の範囲第１４９項に記載の方法。
１５２．相互作用が酵素結合免疫吸着剤検定法により検知されるものである請求の範囲第１４９項に記載の方法。
１５３．相互作用が放射標識免疫検定法により検知されるものである請求の範囲第１４９項に記載の方法。
１５４．相互作用がイムノブロット分析法により検知されるものである請求の範囲第１４９項に記載の方法。
１５５．相互作用が、この抗ＬＴ−ＢＮＴポリペプチド抗体で被覆された粒子のラテックスビーズ凝集により検知されるものである請求の範囲第１４９項に記載の方法。
１５６．粒子がラテックスビーズである請求の範囲第１５５項に記載の方法。
１５７．粒子がリポソームである請求の範囲第１５５項に記載の方法。
１５８．粒子が赤血球である請求の範囲第１５５項に記載の方法。
１５９．粒子がポリアクリルアミドからなるものである請求の範囲第１５５項に記載の方法。