NL8000527A - Werkwijze voor het bevorderen van hybridisatie van cellen in vitro en van de produktie en uitscheiding van stoffen, gevormd door dergelijke celhybriden, werkwijze voor het bevorderen van de produktie van monoclonale antilichamen in vitro door toepassing van een hybridomatechniek, alsmede endotheelcellen en/of supernatant van endotheelcellen. - Google Patents

Description

- 1 - ΐ ^^3

Ν/29.466-Kp/vdM

Werkwijze voor het bevorderen van hybridisatie van cellen in vitro en van de produktie en uitscheiding van stoffen, gevormd door dergelijke celhybriden, werkwijze voor het bevorderen van de produktie van monoclonale antilichamen in vitro door toepassing van een hybridomatechniek, alsmede endotheelcellen en/of supernatant van endotheelcellen.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bevorderen van hybridisatie van cellen in vitro en van de produktie en uitscheiding van stoffen die gevormd worden door dergelijke celhybriden, op een werkwijze voor het 5 bevorderen van de produktie van monoclonale antilichamen in vitro door toepassing van een hybridomatechniek, alsmede op endotheelcellen en/of de supernatant van endotheelcellen.

De inductie van hybriden tussen 2 verschillende cellen blijkt succesvol te zijn bij de in vitro synthese en 10 secretie van diverse celprodukten. Deze techniek blijkt bovendien op grote schaal te worden toegepast bij "gene mapping".

Het is aangetoond (Kohier, G en Milstein, C.: Nature, vol.

256, blz. 495, -1975) dat de hybridomatechniek de produktie van monoclone antilichamen mogelijk maakt, (d.w.z. zuivere 15 antilichamen met één specificiteit, gericht tegen één enkele antigene determinant) in plaats van een mengsel van antilichamen, dus met diverse (ongewenste) specificiteiten, zoals gewoonlijk wordt verkregen door toepassing van conventionele immunisatie in vivo. Bovendien kan door hybridisatie van 20 menselijke cellen de produktie van menselijke monoclone antilichamen worden verkregen.

De techniek van de produktie van monoclone antilichamen omvat in hoofdzaak 3 trappen: 1) fusie van myeloma cellijn cellen en lymfocyten, 25 afkomstig van een dier of mens, dat geïmmuniseerd is met het gewenste antigeen, teneinde hybridoma's te verkrijgen, welke de gewenste antilichamen uitscheiden en welke bovendien in vitro een permanente groei vertonen.

2) Selectie van de gewenste hybridomacloon door 30 kweken van één enkele cel (d.w.z. "limiting dilution").

3) Het doen voortleven, delen en behoud van functie van de geselecteerde monoclone cellijn in vitro gedurende 8000527 - 2 - een langere tijd.

Gebleken is, dat bovengenoemde trappen een aantal problemen met zich meebrengen: 1) de fusie verloopt niet altijd op dezelfde wijze 5 en blijkt in feite weinig efficiënt te zijn (d.w.z. het aantal verkregen hybriden is vaak laag).

2) bij "limiting dilution" is de aanwezigheid van "feeder"-cellen vereist; deze hebben vaak een sterk variabele activiteit.

10 3) De hybridoma's, verkregen door fusie van mense lijke cellen met muize-myelomacellen, vertonen vaak een zeer beperkte overleving in vitro.

In het algemeen doen bovengenoemde problemen zich bij alle hybriden tussen verschillende cellen voor.

15 De uitvinding verschaft thans een werkwijze voor het bevorderen van hybridisatie van cellen in vitro en van de produktie en uitscheiding van stoffen gevormd door dergelijke celhybriden, met het kenmerk, dat aan een hybridekweek menselijke endotheelcellen en/of de supernatant van menselijke 20 endotheelcellen worden toegevoegd.

In het bijzonder verschaft thans de uitvinding een werkwijze voor het bevorderen van de produktie van monoclone antilichamen in vitro door toepassing van een hybridomatech-niek, waarbij aan een hybridomakweek menselijke endotheelcel-25 len en/of de supernatant van menselijke endotheelcellen worden toegevoegd. Door toepassing van de werkwijze volgens de uitvinding zijn de bovengenoemde nadelen op doeltreffende wijze opgeheven.

Volgens de onderhavige werkwijze wordt het aantal 30 monoclone antilichamen producerende cellen in vitro significant verhoogd.

Gebaseerd op de veronderstelling, dat succesvolle celfusie (zie voorbeeld II), de-groei van enkele cellen in vitro (zie voorbeeld III) en eveneens het gedurende lange tijd 35 doen voortleven, delen en behoud van functie van hybridoma's (zie voorbeeld IV) vooral afhankelijk zijn van de aanwezigheid van een factor of factoren, geproduceerd door cellen, werd thans getracht een dergelijke factor of dergelijke factoren te identificeren.

8000527 - 3 - -s - “'ί

Verrassenderwijs werd volgens de uitvinding gevonden, dat endotheelcellen en de supernatant van dergelijke endotheelcellen, - endotheelcellen zelf of de supernatant van endotheelcellen na toevoeging 5 aan een hybridomakweek 1) het aantal hybriden na fusie doen toenemen, 2) zorgen voor toename en stabiliteit van het aantal clonen, dat door middel van "limiting dilution" is geïsoleerd en 10 3) het voortleven, delen en behoud van functie van hybridoma's tussen mense-ei>6f muizecellen in vitro significant verlengen.

Hoewel het mechanisme vooralsnog onbekend is, lijkt het duidelijk, dat de activiteit van endotheelcellen 15 plaatsvindt middels een factor of factoren, die geproduceerd worden of vrijkomen tijdens de kweek. Ofschoon de chemie van deze factor of factoren nog niet bekend is, is het onwaarschijnlijk, dat het hier om prostaglandinen gaat (zie voorbeeld V) .

20 Deze factor of factoren, geproduceerd door endo theelcellen, kunnen eveneens bijdragen tot de bevordering van de groei van hybriden tussen andere typen cellen dan myeloma-cellen en lymfocyten (bijv. hepatomacellen en levercellen, fibroblasten en lymfocyten, enz.), alsmede de groei van cellen 25 die anders in vitro moeilijk te kweken zijn, bijv. beenmergcellen. Aangetoond is, dat de endotheelcel-supernatant de groei van diverse clonen van menselijke beenmergcellen in vitro (zie voorbeeld VI) induceert en/of bevordert.

De inductie of bevordering door endotheelcellen 30 van de groei van clonen van menselijke beenmergcellen is beschreven voor granulopoiesis (zie Knudtzon, S. en Mortensen, B.T.: Blood, vol. £6, blz. 937, 1975).

Opgemerkt wordt, dat volgens de uitvinding een hybridomakweek wordt gebruikt, die verkregen is door fusie van 35 myelomacellijncellen en lymfocyten, afkomstig van een dier of mens, dat of die met het gewenste antigeen is geïmmuniseerd.

Thans wordt de uitvinding toegelicht aan de hand van de volgende voorbeelden.

8000527 f* *- - 4 -

VOORBEELD I

Kweken van menselijke endotheelcellen en produktie van menselijke endotheelkweek-supernatant, aangeduid als "HECS" (Human Endothelial Culture line Supernatant).

5 De menselijke endotheelcellen werden geïsoleerd en gekweekt volgens de methode, die eerst is beschreven door Joffe, E.A. en medew., J. Clin. Invest. 52_, blz. 2745-2756 (1973).

Hiertoe werden menselijke navelstrengvenae gewas-10 sen met 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,4) met 0,9 % NaCl. Daarna werd het vat gevuld met fosfaatbuffer, waarin opgelost trypsine (0,5 g/1) en EDTA (0,2 g/1). Na 15 min. incubatie bij 37°C werd het incubatiemedium verwijderd, waarna de vaatwand wederom met de buffer werd gevuld. Na lichte traumatisatie van 15 de vaatwand werd de bufferoplossing opgevangen en toegevoegd aan de eerste effluent. Aan deze celsuspensie werd 5 ml groei-medium (GM) toegevoegd.

Dit medium bevatte: - 35 % RPMI 1640 Hepes 20 - 35 % Medium 199 met Hanks' zoutoplossing - 30 % menselijk serum, dat een mengsel was van de sera van 18 normale donors.

Na centrifugeren (5 min. 200 g) werd een kleine witte pellet verkregen, die vervolgens opnieuw werd gesuspen-25 deerd in 10 ml van het boven beschreven groeimedium. De aldus verkregen cellen werden overgebracht in weefselkweekflesjes.

Na 5-6 dagen waren de flessen volgegroeid met één cel-dikke laag. Vervolgens werd geïncubeerd met gebufferde trypsine in EDTA gedurende 3-5 min. De losgemaakte cellen werden volgens 30 de boven beschreven procedure gewassen en opnieuw overgebracht in de weefselkweekflesjes, waarbij het cellenaantal per fles met een factor 4 tot 5 werd verlaagd. De gekweekte cellen waren endotheelcellen en wel op grond van de volgende criteria: 35 1) de cellen vertoonden een groei, die afhankelijk is van de dichtheid, 2) door toepassing van immunofluorescentie werd de aanwezigheid van factor VIII verwant antigeen en fibronectine 8000527 A β - 5 - aangetoond, 3) met behulp van een electronenmicroscoop werd de aanwezigheid van Weibel Palade lichamen aangetoond.

Bij het kweken van endotheelcellen werd het groei-5 medium twee keer per week ververst. Het medium, dat gedurende 2-4 dagen zich boven de samenvloeiende cellen bevond, werd opgevangen en gebruikt.

Alternatief: wanneer endotheelcellen samenvloeiend zijn, kunnen ze ververst worden met kweekmedium met foetaal 10 kalfserum (FCS) erin, teneinde de aanwezigheid van menselijk serum in de supernatant te voorkomen.

VOORBEELD II

Toename van het fusierendement met behulp van humane endotheelkweek-supernatant "HECS".

15 Myelomacellen van muizen werden gefuseerd met ge ïmmuniseerde miltcellen van muizen of met menselijke lymfocy-ten, in aanwezigheid van polyethyleenglycol, overeenkomstig de methode van Galfre, G. en medew., Nature, vol. 266, blz. 550 (1977) of volgens Kennet, R.H. en medew., in: Current Topics 20 in Microbiology and Immunology, vol. _81^, blz. 77 (1978); de gefuseerde cellen werden gewassen en overgebracht in een weefselkweekschaal met 96 kweekvaatjes, waarin HECS of als controle een normaal medium aanwezig was. Na 10-20 dagen werden kolonies van hybrideclonen waarneembaar.

25 De tabellen A en B tonen de inductie van een gro ter aantal hybriden, als gevolg van de aanwezigheid van HECS.

TABEL A

muis-myelomacellen x muis-lymfocyten 30 fusie 1 fusie 2

-HECS +HECS -HECS . +HECS

totaal aantal kweken a) 96 48 96 48 aantal kweken met b) groeiende hybriden 28 38 2 3 1 8000527 % = | x 100 29 % 79 % 2 % 6 % cl - 6 -

TABEL B

muis-myelomacellen x menselijke lymfocyten fusie 1 fusie 2 fusie 3 fusie 4

-HECS + HECS -HECS; +HECS . -HECS : + HECS -HECS +HECS

5 a) 96 48 96 48 96 96 48 48 b) 0 36 15 17 1 6 1 5 % 0 75 % 16% 35% 1% 6% 2% 10%

Uit de gegevens volgt, dat "factor" telkens een hoger aantal hybriden induceert, zowel bij muis-muis- als bij 10 mens-muishybriden.

VOORBEELD III

Toename van het rendement, waarmee clonen worden gevormd door "limiting dilution", wanneer endotheelcellen of HECS . : worden toegevoegd.

15 Voor de groei van een hybridomacel zijn "feeder"- cellen nodig. Hybridomacellen, verkregen na fusie, werden verzameld in afzonderlijke kweken van een weefselkweekschaal bij 3 verschillende celconcentraties (5 hybridoma's/kweek; 1 hybridoma/kweek; en 0,5 hybridoma/kweek), in aanwezigheid van 20 verschillende "feeder"-cellen. Tabel C toont de gunstige invloed van menselijke endotheelcellen, vergeleken met andere cellen, die gewoonlijk als "feeder"-cellen worden gebruikt.

TABEL C

aantal hybridoma's/kweken 25 "feeder"-cellen 5_1_0,5 medium alleen 0/36 0/36 0/24 miltcellen van muizen 24/36 7/36 3/24 menselijke fibroblasten 13/36 6/36 5/24 menselijke endotheelcellen 36/36 24/36 13/24 30 De resultaten zijn uitgedrukt als aantal groeiende clonen/aantal kweken.

Uit deze gegevens blijkt, dat endotheelcellen als "feeder"-cellen het hoogste rendement geven bij de groei van hybridomaclonen. Tabel D laat zien, dat de "feeder"-cellen 35 vervangen kunnen worden door factor(en), geproduceerd in de supernatant van endotheelcellen HECS. Controle factor is het medium, dat gebruikt werd voor het kweken van de endothee1ce1len.

8000527 - 7 - ft r?

TABEL D

aantal hybridoma's/kweken factoren 5_1_0,5 medium alleen 0/36 0/36 0/24 5 1/100 controle factor 0/36 0/36 0/24 1/20 controle factor 0/36 0/36 0/24 1/5 controle factor 0/36 0/36 0/24 1/100 HECS 2/36 0/36 0/24 1/20 HECS 23/36 15/36 7/24 10 1/5 HECS 30/36 17/36 9/24

De resultaten zijn uitgedrukt als het aantal groeiende clonen/ aantal kweken.

Uit tabel D blijkt duidelijk, dat HECS. . de "feeder"-cellen kan vervangen en dat de factor nog actief is 15 bij een verdunning van 1/20.

VOORBEELD IV

Verlengde overleving en stabiliteit van mensenmui zenhybridoma's in aanwezigheid van menselijke endotheel-cellen. Mensen-muizenhybridoma's zijn in de regel zeer onsta-20 biel. Zij verliezen snel het vermogen om menselijke immuno-globulinen te vormen en ze sterven. In dit voorbeeld werden de beste omstandigheden onderzocht voor het verlengen van hun levensduur, waarbij ze in een kweek van twee verschillende "feeder"-cellen, te weten miltcellen (deze cellen worden het 25 meeste gebruikt als "feeder"-cellen) en menselijke endotheel-cellen werden bewaard.

De overleving van de cellen en het vermogen om menselijke immunoglobulinen(Ig) te vormen werden iedere week via microscopische analyse en ELISA-techniek bepaald.

30 Tabel E toont het vermogen om de levensduur van menselijke hybridoma's te verlengen en toont voorts de stabiliteit bij het produceren van menselijk Ig door menselijke endotheelcellen. 1 8000527 - 8 -

TABEL E

"Feeder" cellen endotheelcellen miltcellen levende Ig produce- levende Ig produce- cloon/ rende cloon/ cloon/ rende cloon/ totaal totaal totaal totaal 5 kweken kweken kweken kweken weken na de verschijning van clonen van hybriden 10 3 12/12 11/12 12/12 11/12 4 12/12 niet gedaan 6/12 niet gedaan 5 12/12 11/12 0/12 2/12 6 12/12 11/12 0/12 0/12 7 12/12 4/12 0/12 0/12 15 8 12/12 4/12 0/12 0/12

Uit deze gegevens volgt, dat de endotheelcellen de levensduur verlengen en de stabiliteit in Ig~produktie van mensèlijke hybridoma's gunstig beïnvloeden.

VOORBEELD V

_ O

20 Endotheelcel-supernatant bevat + 2 x 10 M PGE2.

Onderzocht werd of de activiteit van endotheelcel-supernatant op de groei van hybridomacellen te danken is aan de aanwezigheid van prostaglandinen. Aangezien bekend is, dat prostaglan-E

dinen~zeer onstabiel zijn wanneer ze gedurende een uur bij 25 37°C en een pH hoger dan 9 worden bewaard, werd de endotheelcel-supernatant gedurende 2 uur bij 37°C en verschillende pH's geïncubeerd. Daarna werd de pH van de endotheelcel-supernatant teruggebracht op zijn oorspronkelijke waarde (pH 7,2), waarna de supernatant werd getest voor het bevorderen van de groei· 30 van de hybridoma's bij "limiting dilution" kweken.

Tabel F toont de stabiliteit van de endotheelcel-supernatant bij verschillende pH's. 1 8000527 - 9 -

TABEL F

aantal hybridoma's/kweek "feeder"-cellen 5_1_0/5 medium alleen 5/36 2/36 1/24 5 1/5 HECS +4°C pH 7/2 2h 32/36 21/36 11/24 1/5 HECS 37°C pH 7,2 2h 33/36 23/36 10/24 1/5 HECS 37°C pH 5,5 2h 34/36 15/36 12/24 1/5 HECS . 37°C pH 9/1 2h 36/36 19/36 4/24

De resultaten zijn uitgedrukt als aantal groeiende 10 clonen/totaal aantal kweken.

Uit deze gegevens blijkt, dat een hoge pH geen nadelige invloed heeft op de activiteit van de endotheelcel-supernatant, zodat het onwaarschijnlijk is, dat de activiteit van de supernatant alleen te danken zou zijn aan prostaglan-15 dinen.

VOORBEELD VI

Toename van menselijke beenmergkolonie-vormende cellen (CFU-C) onder invloed van menselijke endotheelcel-supernatant.

20 Menselijke beenmergcellen werden verkregen uit ge zonde donors, waarna de cellen in vitro werden gekweekt onder toepassing van de methode van G. Wagemaker en medew., Experimental Hematology Today, uitg. S.J. Baum en G.D. Ledney, Springer Verlag, New York, blz. 103 (1977).

25 Na 12 dagen werd de groei van de kolonies via de microscoop bepaald. De menselijke endotheel-supernatant werd getest op het vermogen om het aantal kolonies te doen toenemen. De hierbij verkregen resultaten zijn in tabel G vermeld.

TABEL G

30 proef 1 proef 2 1 x 105 1 x 105 2 x 105 beenmergcellen/ml_beenmergcellen per ml - HECS 28 0 22 + 12,5 % HECS 44 37 91 35 + 25 S HECS. 51 64 79

De resultaten zijn uitgedrukt als aantallen kolonies ( 40 cellen/kolonie) per 100.000 beenmergcellen.

Uit de gegevens blijkt, dat de endotheelcel-super-natant het aantal beenmergkolonies doet toenemen, zowel bij 8000527 -?>· y - 10 - toepassing van 100.000 cellen per kweek als bij toepassing van 200.000 cellen per kweek 5 8000527

Claims (6)

1. Werkwijze voor het bevorderen van hybridisatie van cellen in vitro en van de produktie en uitscheiding van stoffen, gevormd door dergelijke celhybriden, met het kenmerk, dat aan een hybridekweek endotheelcellen en/of 5 de supernatant van endotheelcellen worden toegevoegd.

2. Werkwijze voor het bevorderen van de produktie van monoclonale antilichamen in vitro door toepassing van een hybridomatechniek, met het kenmerk, dat aan een hybridomakweek endotheelcellen en/of de supernatant van 10 endotheelcellen worden toegevoegd.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat menselijke endotheelcellen worden toegevoegd.

4. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met .15 het kenmerk, dat de supernatant van menselijke endotheelcellen wordt toegevoegd. «

5. Werkwijze volgens conclusie 2,met het kenmerk , dat als hybridomakweek de door fusie van myeloma cellijn cellen en lymfocyten, afkomstig van dier of 20 mens, dat of die met het gewenste antigeen is geïmmuniseerd, verkregen kweek wordt gebruikt.

6. Endotheelcellen en/of supernatant van endotheelcellen, ten gebruike voor het bevorderen van de hybridisatie van cellen in vitro en van de produktie en uitscheiding 25 van stoffen, gevormd door dergelijke celhybriden, alsmede voor het bevorderen van de produktie van monoclone antilichamen in vitro. 8000527