BRPI0607025B1

BRPI0607025B1 - composição imunogênica 13-valente, e uso de 13 conjugados de polissacarídeo-proteína distintos

Info

Publication number: BRPI0607025B1
Application number: BRPI0607025-6A
Authority: BR
Inventors: Rainer Siber George; r paradiso Peter; P Hausdorff William
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2005-04-08
Filing date: 2006-03-31
Publication date: 2019-11-12
Also published as: KR101298053B1; KR102017842B1; CA2878579C; US10780160B2; US9399060B2; CN101180079A; IL267125B; TW200719911A; KR101730749B1; US10716848B2; SI1868645T1; IL308456A; EP4005595A1; CN104815327A; US20200179508A1; AR053354A1; ES2382048T3; IL282638A; EP1868645B1; US20120237542A1

Abstract

composição imunogênica multivalente e seu uso. a presente invenção refere-se a uma composição imunogênica tendo 13 conjugados de polissacarídeo-proteina distintos e opcionalmente, um adjuvante baseado em alumínio. cada conjugado contém um polissacarídeo capsular preparado de um sorotipo diferente de streptococcus pneumoniae (1, 3, 4, 5, 6a, 6b, 7f, 9v, 14,1 8c, 1 9a, 1 9f e 23f) conjugado com uma proteína-veículo. composição imunogênica, formulada como uma vacina, aumenta a cobertura contra doença pneumocôcica nos lactentes e crianças jovens globalmente, e provê cobertura para sorotipos 6a e 19a que não é dependente das limitações de proteção cruzada de sorogrupo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPOSIÇÃO DE CONJUGADO DE POLISSACARÍDEO PNEUMOCÓCICO MULTI VALENTE-PROTEÍN A.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se, em geral, ao campo de medicina, e especificamente à microbiologia, imunologia, vacinas e a prevenção de infecção por um patógeno bacteriano através de imunização. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Streptococcus pneumoniae é uma causa principal de meningite, pneumonia e doença invasiva severa em lactentes e crianças novas ao longo do mundo. As vacinas de polissacarídeo pneumocócico multivalente foram autorizadas por muitos anos e provaram preciosidade em impedir doença pneumocócica em adultos anciãos e pacientes de alto risco. Porém, os lactentes e crianças novas respondem fracamente à maioria dos polissacarídeos pneumocócicos. A vacina de conjugado pneumocócico 7-valente (7vPnC, Prevnar®) foi a primeira de seu tipo demonstrada ser altamente imunogênica e eficaz contra doença invasiva e meios de otite em lactentes e crianças novas. Esta vacina está agora aprovada em muitos países ao redor do mundo. Prevnar contém os polissacarídeos capsulares de sorotipos 4, 6B, 9V, 14, 18Ç, 19F e 23F, cada um conjugado com uma proteína veículo designada CRM197. Prevnar abrange aproximadamente 80-90%, 60-80% e 40-80% da doença pneumocócica invasiva (IPD) nos EUA, Europa, e outras regiões do mundo, respectivamente [1,2]. Dados de vigilância colhidos nos anos seguintes à introdução de Prevnar demonstraram claramente uma redução de doença pneumocócica invasiva em lactentes dos EUA como esperado (figura 1) [3,4].

Vigilância de IPD conduzida em lactentes dos EUA antes da introdução de Prevnar demonstrou que uma porção significativa da doença devido aos sorogrupos 6 e 19 foi devido aos sorotipos 6A (aproximadamente um terço) e 19A (aproximadamente um quarto) [5,6]. Vigilância de doença invasiva pneumocócica conduzida nos EUA após licenciamento de Prevnar sugere que uma carga grande da doença ainda é atribuível aos sorotipos 6A e 19A (figura 1) [3]. Além disso, estes dois sorotipos respondem por mais casos de doença invasiva que os sorotipos 1,3, 5, e 7F combinados (8,2 vs.

3,3 casos/100.000 crianças de 2 anos e abaixo). Além disso, sorotipos 6A e 19A são associados às taxas altas de resistência antibiótica (figura 2) [7,8,9]. Embora seja possível que proteção cruzada de sorogrupo resultará em um declínio da doença de sorotipo 6A e 19A à medida que mais crianças são imunizadas, há evidência para sugerir que haverá um limite para o declínio, e uma carga significativa da doença devido a estes sorotipos permanecerá (vide abaixo).

Dado a carga relativa e importância da doença pneumocócica invasiva devido aos sorotipos 1,3, 5, 6A, 7F, e 19A, adicionando estes sorotipos à formulação de Prevnar aumentaria a cobertura para doença invasiva para >90% nos EUA e Europa, e tão alto quanto 70%-80% na Ásia e América Latina. Esta vacina significativamente expandiría além da cobertura de Prevnar, e provê cobertura para 6A e 19A que não é dependente das limitações de proteção cruzada do sorogrupo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Conseqüentemente, a presente invenção provê em geral uma composição imunogênica multivalente compreendendo 13 conjugados de polissacarídeo-proteína distintos, em que cada um dos conjugados contém um polissacarídeo capsular de um sorotipo diferente de Streptococcus pneumoniae conjugado com uma proteína veículo, junto com um veículo fisiologicamente aceitável. Opcionalmente, um adjuvante, como um adjuvante com base em alumínio, é incluído na formulação. Mais especificamente, a presente invenção provê uma composição de conjugado pneumocócico 13valente (13vPnC) compreendendo os sete sorotipos na vacina de 7vPnC (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F) mais seis sorotipos adicionais (1, 3, 5, 6A, 7F e 19A).

A presente invenção também provê uma composição imunogênica multivalente, em que os polissacarídeos capsulares são de sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F de Streptococcus pneumoniae e a proteína veículo é CRM197.

A presente invenção também provê uma composição imunogênica multivalente, em que os polissacarídeos capsulares são de sorotipos 1,

3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9v, 14, 18C, 19A, 19F e 23F de Streptococcus pneumoniae, a proteína veículo é CRM197 e o adjuvante é um adjuvante baseado em alumínio, como fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio. Em uma modalidade particular da invenção, o adjuvante é fosfato de alumínio.

A presente invenção também provê uma composição imunogênica multivalente, compreendendo conjugados de polissacarídeo-proteína juntos com um veículo fisiologicamente aceitável, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo capsular de um sorotipo diferente de Streptococcus pneumoniae conjugado com uma proteína veículo, e os polissacarídeos capsulares são preparados de sorotipo 3 e pelo menos um sorotipo adicional.

Em uma modalidade desta composição imunogêniça multivalente, o sorotipo adicional é selecionado do grupo que consiste em sorotipos 1,

4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, e 23F. Em outra modalidade, a proteína veículo é CRM197. Em ainda outra modalidade, a composição compreende um adjuvante, como um adjuvante baseado em alumínio selecionado de fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio. Em uma modalidade particular, o adjuvante é fosfato de alumínio.

A presente invenção também provê uma composição imunogênica multivalente, compreendendo conjugados de polissacarídeo-proteína juntos com um veículo fisiologicamente aceitável, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo capsular de um sorotipo diferente de Streptococcus pneumoniae conjugado com uma proteína veículo, e os polissacarídeos capsulares são preparados dos sorotipos 4, 6B1 9V, 14, 18C, 19F, 23F e pelo menos um sorotipo adicional.

Em uma modalidade desta composição imunogêniça multivalente, o sorotipo adicional é selecionado do grupo que consiste em sorotipos 1, 3, 5, 6A, 7F, e 19A. Em outra modalidade, a proteína veículo é CRM197. Em ainda outra modalidade, a composição compreende um adjuvante, como um adjuvante baseado em alumínio selecionado de fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio. Em uma modalidade particular, o adjuvante é fosfato de alumínio.

A presente invenção também provê um método de induzir uma resposta imune a um conjugado de polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae, compreendendo administrar a um ser humano uma quantidade imunologicamente eficaz de quaisquer das composições imunogênicas recém descritas.

A presente invenção também provê que quaisquer das composições imunogênicas administradas é uma dose simples de 0,5 ml formulada para conter: 2 pg de cada sacarídeo, com exceção de 6B a 4 pg; aproximadamente 29 pg de proteína veículo de CRM^?; 0,125 mg de adjuvante de alumínio elementar (0,5 mg de fosfato de alumínio); e tampão de cloreto de sódio e de succinato de sódio como excipientes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 descreve as alterações nas taxas de IPD pelo sorotipo em crianças dos EUA < 2 anos de idade da linha base (1998/1999) a 2001.

A figura 2 descreve a distribuição de isolados pneumocócicos com resistência à penicilina (PCN) em crianças < 5 anos de idade (1998).

A figura 3 descreve as curvas de distribuição cumulativa reversa (RCDC) dos resultados de pós-terceira dose de OPA da experimentação de Prevnar de D118-P16.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

INCLUSÃO DE SOROTIPOS DE PREVNAR 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F

Dados de vigilância de IPD entre 1995-1998 estimaram que os sete sorotipos em Prevnar foram responsáveis por volta de 82% de IPD em crianças < 2 anos de idade [5]. Na Califórnia do Norte, o sítio da experimentação de eficácia, os sorotipos de Prevnar responderam por 90% de todos os casos de IPD nos lactentes e crianças jovens [10]. Desde a introdução da vacina de Prevnar em 2000, houve uma diminuição significativa nas taxas de IPD gerais devido a uma diminuição na doença devido aos sorotipos de vacina [3,4], Portanto, não há nenhuma justificação neste momento para remo ver quaisquer dos sorotipos de Prevnar da próxima geração de vacinas de conjugado pneumocócico mas do contrário adicionar sorotipos para obter cobertura mais ampla.

INCLUSÃO DE SOROTIPOS 1,3, 5 E 7F

Nos EUA, a taxa de IPD causada por sorotipo 1 em crianças abaixo da idade de 5 anos é < 2%, cerca da mesma para cada um dos tipos 3 e 7F [1,6]. Sorotipos 1 e 5 somam taxas mais altas de IPD em populações dos EUA em risco alto para doença pneumocócica invasiva. Especificamente, sorotipo 1 causa 3,5% de IPD em crianças nativas do Alasca < 2 anos de idade, e 18% em crianças 2-4 anos de idade [11]. Sorotipo 1 e sorotipo 5 significativamente causam doença em outras partes do mundo e em populações indígenas em países desenvolvidos [12,13,14].

Sorotipo 1 pode também ser associado à doença mais severa quando comparado com outros sorotipos pneumocócicos [15]. Esta observação é com base na diferença em taxas de identificação de casos entre os EUA e Europa, e a diferença associada na prática médica. Geral, a incidência de IPD é mais baixa na Europa que nos EUA. Porém, o percentual de IPD causada pelo sorotipo 1 na Europa é desproporcionalmente mais alto que nos EUA (6-7%, vs. 1-2%, respectivamente). Na Europa, culturas de sangue são predominantemente obtidas de crianças hospitalizadas. Nos EUA, é prática médica rotineira obter culturas de sangue em um cenário de paciente externo de crianças que apresentam com febre £ 39°C e contagens de células sangüíneas brancas elevadas. Dada a diferença na prática médica, é postulado que o percentual inferior de doença causada pelo sorotipo 1 nos EUA pode ser diluído por taxas mais altas de outros sorotipos que causam doença mais moderada, enquanto o percentual mais alto na Europa reflete doença mais séria. Além disso, estudos de seroepidemiologia de crianças com pneumonia complicada demonstram que sorotipo 1 é desproporcionalmente representado [16,17,18]. Isto sugere que a inclusão de sorotipo 1 pode reduzir a quantidade de doença pneumocócica severa, como também, contribuir para uma redução total em doença pneumocócica invasiva.

A adição de sorotipos 3 e 7F aumentarão a cobertura contra IPD na maioria das áreas do mundo em aproximadamente 3%-7%, e na Asia por volta de 9%. Desse modo, uma vacina 11-valente cobriría 50% na Ásia e por volta de 80% de IPD em todas as outras regiões [1,2], Estes sorotipos são também importantes com respeito à cobertura de meios de otite [19]. Em um estudo multinacional de sorotipos pneumocócicos que causam meios de otite, Hausdorff et al descobriu que o sorotipo 3 é o isolado de fluido do ouvido mediano 8- mais comum geral [20]. Sorotipo 3 soma até 8,7% dos sorotipos pneumocócicos associados aos meios de otite. Desse modo, a importância de tipos 3 e 7F em meios de otite, como também em IPD, garante sua inclusão em uma vacina de conjugado pneumocócico.

Porém, tentativas de produzir uma vacina de conjugado pneumocócico multivalente que exibe imunogenicidade significativa com respeito aos polissacarídeos de sorotipo 3 foram mal-sucedidas. Por exemplo, em um estudo da imunogenicidade e segurança de uma vacina de conjugado de proteína D pneumocócica 11-valente (11-Pn-PD), nenhum efeito preparatório foi observado para sorotipo 3 em lactentes que tinham recebido três doses da vacina seguidas por uma injeção auxiliar da mesma vacina ou uma vacina de polissacarídeo pneumocócico (Nurkka et al. (2004) Ped. Inf. Dis. J., 23:1008-1014). Em outro estudo, ensaio opsonogagocítico (OPA) resulta de lactentes que tinham recebido doses de l 1-Pn-PD não mostraram respostas de anticorpo para o sorotipo 3 em níveis comparáveis para outros sorotipos testados (Gatchalian et al., 17^th Annual Meeting of the Eur. Soc. Paed. Inf. Dis. (ESPID), Poster N^Q 4, P1A Poster Session, Istambul Turquia, 27 de março de 2001). Em ainda outro estudo que avaliou a eficácia de uma 11Pn-PD na prevenção de meios de otite agudos, a vacina não proveu proteção contra episódios causados por sorotipo 3 (Prymula et al. www.thelancet.com. Vol. 367: 740-748 (4 de março de 2006)). Conseqüentemente, uma vacina de conjugado pneumocócico compreendendo polissacarídeos capsulares de sorotipo 3 e capaz de suscitar uma resposta imunogênica para polissacarídeos de sorotipo 3 provê uma melhoria significativa no estado existente da técnica.

INCLUSÃO DE SOROTIPOS 6A E 19A

A. EPIDEMIOLOGIA DE SOROTIPOS 6A E 19A

Dados de vigilância na literatura sugerem que os sorotipos 6A e 19A são responsáveis por mais doença pneumocócica invasiva em crianças dos EUA < 2 anos de idade que os sorotipos 1,3, 5, e 7F combinados (figura 1) [1,5]. Além disso, estes sorotipos são comumente associados à resistência a antibióticos (figura 2) e desempenham um papel importante nos meios de otite [6,19,20]. A habilidade da vacina de Prevnar atual para proteger contra doença devido a 6A e 19A não está clara. A razão para inclusão de componentes de 6A e 19A em uma vacina de 13vPnC é debatida abaixo.

B. RESPOSTAS PARA 6A E 19A INDUZIDAS POR POLISSACARÍDEOS 6B E19F

As vacinas de polissacarídeo pneumocócico não-conjungadas autorizadas (para uso em pessoas de pelo menos dois anos de idade) continham polissacarídeo capsular 6A ou 6B mas não ambos [21]. Dados de imunogenicidade gerados na hora da formulação da vacina de polissacarídeo pneumocócico 23-valente demonstraram que uma vacina monovalente de 6B induziu anticorpo para ambas as cápsulas de 6A e 6B. Os dados de várias experimentações que avaliam respostas de IgG e ensaio opsonofagocítico (OPA) em uma variedade de populações com polissacarídeo livre e com vacinas de conjugado pneumocócico sugeriram que as respostas de IgG a 6A são induzidas através dos antígenos de 6B, mas as respostas são em geral inferiores, e a atividade de OPA com organismos 6A é diferente que com organismos 6B [22,23,24,25]. Além disso, indivíduos que respondem com anticorpo alto de 6B podem ter pouca ou nenhuma atividade contra 6A.

Em contraste com a composição química dos polissacarídeos capsulares 6A e 6B onde existem um grau alto de similaridade, as cápsulas 19A e 19F são bastante diferentes devido à presença de duas correntes laterais adicionais no polissacarídeo de 19A. Não surpreendentemente, respostas imunes medidas em voluntários humanos imunizados com vacina de polissacarídeo de 19F mostraram que respostas foram induzidas para 19F em 80% dos indivíduos, mas apenas 20% dos indivíduos tiveram uma resposta para 19A [26]. Baixos níveis de respostas reativas cruzadas de IgG e OPA para sorotipo 19A após imunização com polissacarídeo 19F têm também sido documentados em experimentações com vacinas de conjugado também [24,26].

Dados internos em respostas de OPA reativas cruzadas para 6A e 19A foram gerados da experimentação de ligação de 7vPnC (D118-P16) conduzidas em lactentes dos EUA (figura 3). Estes estudos são consistentes com as descobertas de outros, e demonstram indução de anticorpo funcional reativo cruzado para polissacarídeo 6A após imunização com polissacarídeo 6B, embora em um nível inferior, e muito pouco anticorpo funcional para 19A após imunização com 19F.

IMPACTO DE IMUNIZAÇÃO DE 6B E 19F EM 6A E 19A EM MODELOS ANIMAIS

Modelos animais foram usados para avaliar o potencial para proteção cruzada com imunização de polissacarídeo. Em um modelo de meios de otite desenvolvido por Giebink et al., chinchilas foram imunizadas com uma vacina de conjugado de proteína de membrana externa de polissacarídeo tetravalente (OMP) (contendo os sacarídeos 6B, 14, 19F, 23F) ou placebo [27]. Nesta experimentação pareceu haver alguma proteção cruzada para 6A; porém esta não alcançou significação estatística e o nível de proteção foi inferior que com 6B contra meios de otite. Neste mesmo modelo houve 100% de proteção contra meios de otite de 19F, mas apenas 17% de proteção contra meios de otite de 19A.

Saeland et al. usou soros de lactentes imunizados com uma vacina de conjugado pneumocócico de tétano 8-valente (contendo 6B e 19F) para imunizar camundongos passivamente antes de um desafio intranasal com organismos de 6A, em um modelo de infecção pulmonar [28]. Das 59 amostras de soro, 53% protegeram os camundongos contra bacteremia com 6B e 37% protegeram contra 6A. Camundongos imunizados passivamente com soros de lactentes imunizados com quatro doses de uma vacina de conjugado pneumocócico 11 -valente (contendo 19F conjugado com toxóide de tétano) foram dados a um desafio intranasal com organismos de 19A no mesmo modelo [29]. Dos 100 camundongos passivamente imunizados e depois desafiados, 60 camundongos não tiveram nenhum organismo de 19A detectado em tecido pulmonar, enquanto que organismos foram identificados em todos os camundongos dados solução salina de placebo. Porém, imunização passiva não protegeu contra desafio com organismos de 19F neste modelo; portanto, a relevância do modelo para sorogrupo 19 é questionável. Em geral estes modelos provêem evidência de algum impacto biológico de imunização de 6B em organismos de 6A embora o efeito no sorotipo heterólogo não tenha sido tão grande quanto aquele observado com o sorotipo homólogo. O impacto de imunização de 19F em organismos de 19A não é bem-entendido a partir destes modelos.

IMPACTO DE IMUNIZAÇÃO DE CONJUGADO DE POLISSACARÍDEO DE 6B E 19F EM DOENÇA DE 6A E 19A EM EXPERIMENTAÇÕES DE EFICÁCIA

O número de casos de doença devido aos sorotipos 6B, 6A, 19F e 19A em experimentações de eficácia de 7vPnC e 9vPnC (7vPnC mais sorotipos 1 e 5) é observado na Tabela 1 [30,10,31]. Os números de casos de doença invasiva são muito pequenos para permitir tirar qualquer conclusão para os sorotipos 6A e 19A. Porém, a experimentação de meios de otite finlandesa gerou um número grande de isolados pneumocócicos [32]. Na análise por protocolo 7vPnC foi 84% (95% de Cl 62%, 93%) eficaz contra meios de otite devido ao sorotipo 6B e 57% (95% de Cl 24%, 76%) eficaz contra meios de otite devido ao sorotipo 6A (Tabela 1). Em contraste, eficácia sorotipo-específica com 7vPnC não foi demonstrada para meios de otite devido ou a 19F ou a 19A.

TABELA 1

CASOS DE DOENÇA PNEUMOCÓCICA DEVIDO AOS SOROTIPOS 6B, 6A, 19F, E 19A EM EXPERIMENTAÇÕES DE EFICÁCIA COM AS VACINAS DE 7vPnC E 9vPnC

6B 6A 19F 19A

PnC Contr. PnC Contr. PnC Contr. PnC Contr.

Ensaio de Eficácia de kaiser - 7vPnC (ITT)

0 1

2* 13

	6B	6A	19F Contr. PnC	19A Contr.
PnC	Contr.	PnC	Contr. PnC
Ensaio de Eficácia de Navajo - 7vPnC (ITT)	0	5	1	0 1	1 1	0
Ensaio de Eficácia da África do Sul 9vPnC HIV (-) (ITT)	1	2	1	0 0	1 3	1
Ensaio de Eficácia da África do Sul 9vPnC HIV (+) (ITT)	1	7	3	10 2	3 2	3
Ensaio de Meios de Otite Finlandês	9*	56	19*	45 43	58 17	26

7vPnC (PP) ‘Eficácia estatisticamente significativa demonstrou

Das referências 30, 10 e 33, e comunicações pessoais

Contr = controle

ITT = Intenção para tratar análise PP = Análise por protocolo

Dados de vigilância de IPD de pós-comercialização estão também disponíveis de uma experimentação de controle de caso pelo Centers for Disease Contorol para avaliar a eficácia de Prevnar [33]. Foram identificados casos de doença invasiva pneumocócica ocorrendo em crianças de 3 a 23 meses de idade nos laboratórios de vigilância e equiparados com três casos de controle por idade e código de região. Após obter consentimento, história médica e de imunização (indivíduos foram considerados imunizados se eles tivessem recebido pelo menos uma dose de Prevnar) foi obtida dos pais e provedores médicos para casos e controles. Os resultados preliminares foram apresentados no encontro de ICAAC em 2003 e um sumário das descobertas para doença de 6B1 19F, 19A e 6A é apresentado na Tabela 2. Estes dados indicam que Prevnar é capaz de impedir a doença devido a 6A, embora em um nível que pode ser um pouco inferior que a doença de sorotipo 6B. Estes dados também indicam que a proteção cruzada para doença invasiva devido a 19A é limitada.

TABELA 2

RESULTADOS PRELIMINARES DE UMA EXPERIMENTAÇÃO DE CONTROLE DE CASO EXECUTADA PELO CDC (APRESENTADA NA ICAAC 2003)

Sorotipo	Ajustes Informativos, n	VE* (95% Cl)
Tipo de Vacina, todos	115	94 (87, 97)
Vacina Relacionada, todas	36	70 (38,86)
Tipo de não-vacina, todos	43	-4 (-106,48)
6B	27	94 (72,99)
19F	19	73 (16, 92)
6A	15	87 (53, 97)
19A	16	40 (-87,80)

* Eficácia de vacina comparando vacinados (>1 dose) vs. não-vacinados, e ajustada para condições subjacentes

Referência 40 e comunicação pessoal/confidencial

Uma análise publicada [3] do uso de Prevnar também indicou que os sorotipos 6B e 19F conferiram uma redução moderada em IPD cau10 sada por sorotipos 6A e 19A entre crianças abaixo de dois anos de idade (Tabela 1 em [3]). Taxas de doença entre adultos não-imunizados causada por sorotipos 6A, 9A, 9L, 9N, 18A, 18B, 18F, 19A, 19B, 19C, 23A e 23B (todos os sorotipos relacionados à vacina) foram um pouco reduzidas (Tabela 2 em [3]). Estes dados estabelecem que a imunidade de rebanho do uso de 15 Prevnar em crianças abaixo de dois anos de idade foi modesta para sorotipos 6A e 19A, e provê uma base para a inclusão de sorotipos 6A e 19A na vacina de 13vPnC desta invenção.

CONCLUSÃO PARA ADIÇÃO DE 6A E 19A

Os dados de vigilância de pós-comercialização e os resultados de estudo de controle de caso observados na figura 1 e Tabela 2 com a vacina de 7vPnC sugerem que, consistente com a outra informação sobre respostas imunes e desempenho nos modelos de animais descritos acima, pode haver alguma proteção cruzada contra doença de 6A, mas menos que para doença de 6B. Além disso, parece a proteção contra 19A é limitada. Portanto, uma vacina de 13vPnC contendo sorotipos 6A e 19A provê cobertura que não é dependente das limitações de proteção cruzada do sorogrupo pelos sorotipos 6B e 19F.

Conseqüentemente, a presente invenção provê uma composição imunogênica multivalente compreendendo 13 conjugados de polissacarídeoproteína distintos, em que cada um dos conjugados contém um polissacarídeo capsular diferente conjugado com uma proteína veículo, e em que os polissacarídeos capsulares são preparados de sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F de Streptococcus pneumoniae, juntos com um veículo fisiologicamente aceitável. Uma tal proteína veículo é o toxóide de difteria designado CRM197. A composição imunogênica pode também compreender um adjuvante, como um adjuvante baseado em alumínio, como fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio.

Polissacarídeos capsulares são preparados por técnicas padrões conhecidas àqueles versados na técnica. Na presente invenção, polissacarídeos capsulares são preparados de sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F de Streptococcus pneumoniae. Estes conjugados pneumocócicos são preparados através de processos separados e formulados em uma formulação de dosagem simples. Por exemplo, em uma modalidade, cada sorotipo de polissacarídeo pneumocócico é crescido em um meio com base em soja. Os polissacarídeos individuais são depois purificados através de centrifugação, precipitação, ultrafiltração, e cromatografia de coluna. Os polissacarídeos purificados são ativados para tornar os sacarídeos capazes de quimicamente reagir com a proteína veículo.

Uma vez ativado, cada polissacarídeo capsular é separadamente conjugado com uma proteína veículo para formar um glicoconjugado. Em uma modalidade, cada polissacarídeo capsular é conjugado com a mesma proteína veículo. Nesta modalidade, a conjugação é realizada por aminação redutora.

A ativação química dos polissacarídeos e conjugação subseqüente com a proteína veículo é alcançada através de meios convencionais. Vide, por exemplo, Pats. U. S. N— 4.673.574 e 4.902.506 [34,35].

Proteínas veiculares são preferivelmente proteínas que são nãotóxicas e não-reatogênicas e obteníveis em quantidade e pureza suficientes. Proteínas veiculares deveríam ser tratáveis em procedimentos de conjugação padrão. Em uma modalidade particular da presente invenção, CRM197 é usada como a proteína veículo.

CRM₁₉₇ (Wyeth, Sanford, NC) é uma variante não-tóxica (isto é, toxóide) da toxina de difteria isolada de culturas da cepa C7 de Corynebacterium difteria (β197) crescida em casamino ácidos e meio com base em extrato de levedura. CRM₁₉₇ é purificado através de ultrafiltração, precipitação de sulfato de amônio, e cromatografia de permuta de íon. Alternativamente, CRMi₉7 é preparada recombinantemente de acordo com a patente U. S. N^s5.614.382 que é por este meio incorporada por referência. Outros toxóides de difteria são também adequados para o uso como proteínas veículoes.

Outras proteínas veículoes adequadas incluem toxinas bacterianas inativadas como toxóide de tétano, toxóide de coqueluche, toxóide de cólera (por exemplo, como descrito no Pedido de Patente Internacional W02004/083251 [38]), LT de E. coli, ST de E. coli e exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa. Proteínas de membrana externa bacterianas como complexo c de membrana externa (OMPC), porinas, proteínas ligadoras de transferrina, pneumolisina, proteína de superfície pneumocócica A (PspA), proteína de adesina pneumocócica (PsaA), C5a peptidase do estreptococo do Grupo A ou Grupo B, ou proteína D de Haemophilus influenzae, podem também ser usadas. Outras proteínas, como ovalbumina, hemocianina de lapa (KLH), albumina de soro bovino (BSA) ou derivado de proteína de tuberculina purificada (PPD) podem também ser usadas como proteínas veículoes.

Após conjugação do polissacarídeo capsular com a proteína veí culo, os conjugados de polissacarídeo-proteína são purificados (enriquecidos com respeito à quantidade de conjugado de polissacarídeo-proteína) por uma variedade de técnicas. Estas técnicas incluem operações de concentração/diafiltração, precipitação/elução, cromatografia de coluna, e filtração de profundidade. Vide exemplos abaixo.

Após os glicoconjugados individuais serem purificados, eles são compostos para formular a composição imunogênica da presente invenção que pode ser usada como uma vacina. Formulação da composição imunogênica da presente invenção pode ser realizada usando métodos reconhecidos na técnica. Por exemplo, os 13 conjugados pneumocócicos individuais podem ser formulados com um veículo fisiologicamente aceitável para preparar a composição. Exemplos de tais veículos incluem, mas não são limitados a, água, solução salina tamponada, polióis (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicol líquido) e soluções de dextrose.

Em certas modalidades, a composição imunogênica compreenderá um ou mais adjuvantes. Como definido aqui, um adjuvante é uma substância que serve para intensificar a imunogenicidade de uma composição imunogênica desta invenção. Desse modo, os adjuvantes são freqüentemente dados para reforçar a resposta imune e são bem-conhécidos ao artesão versado. Adjuvantes adequados para intensificar eficácia da composição incluem, mas não são limitados a:

(1) sais de alumínio (alume), como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio, etc.;

(2) formulações de emulsão de óleo-em-água (com ou sem outros agentes de imunotingimento específicos como peptídeos de muramila (definidos abaixo) ou componentes de parede celular bacteriana), como, por exemplo, (a) MF59 (Publ. de PCT N^e WO 90/14837), contendo 5% de Esqualeno, 0,5% de Tween 80 e 0,5% de Span 85 (opcionalmente contendo várias quantidades de MTP-PE (vide abaixo, embora não requerido)) formulada em partículas de submícron usando um microfluidizador como microfluidizador Modelo 110Y (Microfluidics,

Newton, MA), (b) SAF, contendo 10% Esqualeno, 0,4% de Tween 80, 5% de polímero de bloco plurônico L121 e thr-MDP (vide abaixo) ou microfluidizado em uma emulsão de submicron ou submetida a vórtice para gerar uma emulsão de tamanho de partícula maior, e (c) sistema de adjuvante de Ribi® (RAS), (Corixa, Hamilton, MT) contendo 2% de Esqualeno, 0,2% de Tween 80, e um ou mais componentes de parede celular bacterianos do grupo que consiste em monofosfrililídio A 3-O-desailado (MPL®) descrito na patente U. S. N⁹ 4.912.094 (Corixa), dimicolato de trealose (TDM), e esqueleto de parede celular (CWS), preferivelmente MPL + CWS (Detox®);

(3) adjuvantes de saponina, como Quil A ou STIMULON® QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) (patente U. S. N⁹ 5.057.540) podem ser usados ou partículas geradas dele como ISCOMs (complexos de imunotingimento);

(4) lipopolissacarídeos bacterianos, análogos de lipídios sintéticos A como compostos de fosfato de glicosamina de aminoalquila (AGP), ou derivados ou análogos destes que estão disponíveis de Corixa e em que são descritos na patente U. S. N⁹ 6.113.918; um tal AGP é 2-Desóxi-4O-fosfino-3-O-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil]-2-[(R)-3tetradecanoiloxitetradecanoilamino]-b-D-glucopiranosídeo de 2-[(R)-3Tetradecanoiloxitetradecanoilamino]etila que é também conhecido como 529 (antigamente conhecido como RC529) que é formulado como uma forma aquosa ou como uma emulsão estável, polinucleotídeos sintéticos como oligonucleotídeos contendo motivo(s) de CpG (patente U.

S. N⁹ 6.207.646);

(5) citocinas, como interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, etc.), interferonas (por exemplo, interferona gama), fator estimulante de colônia de granulócitos-macrófagos (GMCSF), fator estimulante de colônia de macrófagos (M-CSF), fator de necrose tumoral (TNF), moléculas coestimuladoras B7-1 e B7-2, etc.;

(6) mutantes desintoxicados de uma toxina bacteriana ribosante de PAD como uma toxina de cólera (CT) ou em uma forma do tipo selvagem ou mutante, por exemplo, onde o ácido glutâmico na posição de aminoácido 29 é substituído por outro aminoácido, preferivelmente uma histidina, de acordo com pedido de patente internacional publicado número WO 00/18434 (vide também WO 02/098368 e WO 02/098369), uma toxina da coqueluche (PT), ou uma toxina lábil em calor de E. coli (LT), particularmente LT-K63, LT-R72, CT-S109, PT-K9/G129 (vide, por exemplo, WO 93/13302 e WO 92/19265); e (7) outras substâncias que agem como agentes de imunotingimento para intensificar a eficácia da composição. Peptídeos de muramila incluem, mas não são limitados a, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thrMDP), N-acetil-normuramil-L-alanina-2-(1’-2’dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosfrilóxi)-etilamina (MTP-PE)1 etc.

As formulações de vacina da presente invenção podem ser usadas para proteger ou tratar um ser humano suscetível à infecção pneumocócica, mediante administração da vacina por meio de uma rota sistêmica ou mucosa. Estas administrações podem incluir injeção por meio das rotas intramusculares, intraperitoneais, intradérmicas ou subcutâneas; ou por meio de administração mucosa para os tratos oral/alimentar, respiratório ou geniturinário. Em uma modalidade, administração intranasal é usada para o tratamento de pneumonia ou meios de otite (como carro nasofaringeano pneumocócico pode ser impedido mais eficazmente, desse modo atenuando infecção para seu estágio mais prematuro).

A quantidade de conjugado em cada dose de vacina é selecionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotetora sem efeitos significativos, adversos. Tal quantidade pode variar, dependendo do sorotipo pneumocócico. Em geral, cada dose compreenderá 0,1 a 100 pg de polissacarídeo, particularmente 0,1 a 10 pg, e mais particularmente 1 a 5 pg.

Ótimas quantidades de componentes para uma vacina particular podem ser averiguadas por estudos padrão que envolvem observação das respostas imunes apropriadas em indivíduos. Seguindo uma vacinação inicial, indivíduos podem receber uma ou várias imunizações intensificadoras adequadamente espaçadas.

Em uma modalidade particular da presente invenção, a vacina de 13vPnC é uma formulação líquida estéril de polissacarídeos capsulares pneumocócicos dos sorotipos 1,3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, e 23F individualmente conjugados com CRM197. Cada 0,5 ml de dose é formulado para conter: 2 pg de cada sacarídeo, com exceção de 6B a 4 pg; aproximadamente 29 pg de proteína veículo de CRM197; 0,125 mg de adjuvante de alumínio elementar (0,5 mg de fosfato de alumínio); e tampão de cloreto de sódio e de succinato de sódio como excipientes. O líquido é enchido em seringas de dose simples sem um preservativo. Após agitar, a vacina torna uma suspensão homogênea, branca pronta para administração intramuscular.

A escolha de nível de dose para a vacina de 13vPnC é similar à vacina comercializada de 7vPnC (Prevnar). Os 2 pg de nível de dose de sacarídeo foram selecionados para todos os sorotipos, com exceção de 6B, que está a 4 pg por dose. A vacina de 7vPnC mostrou segurança, imunogenicidade, e eficácia desejáveis contra IPD no nível de dose de 2 pg de sacarídeo para sorotipos 4, 9V, 14, 18C, 19F e 23F, e em dose de 4 pg para 6B.

O programa de imunização pode seguir aquele designado para a vacina de 7vPnC. Por exemplo, o programa rotineiro para os lactentes e crianças contra doença invasiva causada por S. pneumoniae devido aos sorotipos incluídos na vacina de 13vPnC é 2, 4, 6 e 12-15 meses de idade. As composições desta invenção são também adequadas para o uso com crianças mais velhas, adolescentes e adultos.

As composições desta invenção podem também incluir um ou mais antígenos adicionais para 0 uso contra meios de otite causados por infecção com outras bactérias. Tais bactérias incluem Haemophilus influenza não-tipável, Moraxella catarrhalis (antigamente conhecida como Branhamella catarrhalis) e Alloiococcus otitidis.

Exemplos de antígenos Haemophilus influenzae não-tipável adequados para inclusão incluem a proteína de P4, também conhecida como proteína e“ (patente U. S. N⁹ 5.601.831; Pedido de patente internacional

WO03/078453), a proteína de P6, também conhecida como a proteína de PAL ou de PBOMP-1 (patente U. S. N² 5.110.908; Pedido de patente internacional WO0100790), a proteína de P5 (Patente U. S. Re-emitida N²37.741), a proteína de adesão e de penetração de Haemophilus (patentes U.

S. Nos. 6.245.337 e 6.676.948), a proteína de adesina de ponta de LKP (patente U. S. N^s 5.643.725) e a proteína de NucA (patente U. S. N² 6.221.365).

Exemplos de antígenos de Moraxella catarrhalis adequados para inclusão incluem a proteína de UspA2 (patentes U. S. N— 5.552.146, 6.310.190), a proteína de CD (patente U. S. N² 5.725.862), a proteína de E (patente U. S. N² 5.948.412) e a proteína de membrana externa de 74 quilodaltons (patente U. S. N² 6.899.885).

Exemplos de antígenos de Alloiococcus otitidis adequados para inclusão incluem aqueles identificados no Pedido de Patente Internacional W003/048304.

As composições desta invenção podem também incluir uma ou mais proteínas de Streptococcus pneumoniae. Exemplos de proteínas de Streptococcus pneumoniae adequadas para inclusão incluem aquelas identificadas no Pedido de Patente Internacional WO02/083855, como também aquelas descritas no Pedido de Patente Internacional W002/053761.

As. composições desta invenção podem também incluir uma ou mais proteínas de Neisseria meningitidis tipo B. Exemplos de proteínas de Neisseria meningitidis tipo B adequadas para inclusão incluem aquelas identificou nos Pedidos de Patente Internacionais WO03/063766, WQ2004/094596, WO01 /85772, WO02/16612 e WO01/87939.

A descrição acima em geral descreve a presente invenção. Uma compreensão mais completa pode ser obtida por referência aos exemplos específicos a seguir. Estes exemplos são descritos somente para o propósito de ilustração e não são intencionados a limitar o escopo da invenção. EXEMPLOS

EXEMPLO 1

PREPARAÇÃO DE SOROTIPO CAPSULAR DE POLISSACARÍDEO S. PNEUMONIAE 1

PREPARAÇÃO DE BANCOS DE CÉLULA PRINCIPAL E DE TRABALHO

Sorotipo de S. pneumoniae 1 foi obtido da Coletânea de Cultura de Tipo americana, ATCC, cepa 6301. Várias gerações de matérias-primas de semente foram criadas para expandir a cepa e remover os componentes de origem animal (gerações F1, F2 e F3). Duas gerações adicionais foram produzidas de matérias-primas de semente. A primeira geração adicional foi feita de um frasco de F3, e a geração subseqüente foi feita de um frasco da primeira geração adicional. Frascos de semente congelada foram armazenados (<-70°C) com glicerol sintético como um crioconservante. Além dos frascos congelados, frascos liofilizados foram preparados para a geração de F4. Para preparação de banco de célula, todas as culturas foram crescidas em um meio com base em soja. Antes de gelar, as células foram concentradas através de centrifugação, meio gasto foi removido, e péletes de célula foram ressuspensas em meio fresco contendo um crioconservante, oomo glicerol sintético.

FERMENTAÇÃO E COLETA

Culturas do banco de célula de trabalho foram usadas para inocular garrafas de semente contendo um meio com base em soja. As garrafas foram incubadas a 36°C ± 2°C sem agitação até que os requerimentos de crescimento fossem satisfeitos. Uma garrafa de semente foi usada para inocular um fermentador de semente contendo meio com base em soja. Um pH de cerca de 7,0 foi mantido com solução de carbonato de sódio estéril. Após a densidade óptica alvo ter sido alcançada, o fermentador de semente foi usado para inocular o fermentador de produção contendo meio com base em soja. O pH foi mantido com solução de carbonato de sódio estéril. A fermentação foi terminada após cessação de crescimento ou quando o volume de funcionamento do fermentador foi alcançado. Uma quantidade apropriada de 12% de deoxicolato de sódio estéril foi adicionada à cultura para lisar as células bacterianas e o polissacarídeo associado à célula de liberação. Após lise, os conteúdos do fermentador foram esfriados. O pH do caldo da cultura lisada foi ajustado para aproximadamente pH 6,6 com ácido acético. O lisado foi clarificado por centrifugação de fluxo contínuo seguida por filtração de profundidade e microfiltração de 0,45 μιτι.

Em um processo alternado, o pH de fermentação de cerca de 7,0 foi mantido com 3N NaOH. Após a densidade óptica alvo ter sido alcançada, o fermentador de semente foi usado para inocular o fermentador de produção contendo meio com base em soja. O pH foi mantido com 3N NaOH. A fermentação foi terminada após cessação de crescimento ou quando o volume de funcionamento do fermentador foi alcançado. Uma quantidade apropriada de 12% de deoxicolato de sódio estéril foi adicionada à cultura para obter uma concentração de 0,12% no caldo, para lisar as células bacterianas e o polissacarídeo associado à célula de liberação. Após lise, os conteúdos do fermentador foram mantidos, com agitação, por um intervalo de tempo entre 8 e 24 horas em uma temperatura entre 7°C e 13°C, para assegurar que lise celular completa e liberação de polissacarídeo tivessem ocorrido. Agitação durante este período de retenção impediu sedimento de lisado de depositar nas paredes do fermentador e sonda de pH, assim permitindo manter a integridade da sonda de pH. Em seguida, o pH do caldo de cultura lisada foi ajustado para aproximadamente pH 5,0 com 50% de ácido acético. Após um tempo de contensão sem agitação, por um intervalo de tempo entre 12 e 24 horas em uma temperatura uma porção significativa das proteínas previamente solúveis verteu fora da solução como um precipitado sólido com pequena perda ou degradação do polissacarídeo que permaneceu na solução entre 15°C e 25°C. A solução com o precipitado foi depois clarificada por centrifugação de fluxo contínuo seguida por filtração de profundidade e microfiltração de 0,45 μηι.

PURIFICAÇÃO

A purificação do polissacarídeo pneumocócico consistiu em várias etapas de operações de concentração/diafiltração, precipitação/elução, cromatografia de coluna, e filtração de profundidade. Todos os procedimentos foram executados em temperatura ambiente a menos que do contrário especificado.

Caldo clarificado das culturas do fermentador de sorotipo 1 de S. pneumoniae foi concentrado e diafiltrado usando um filtro de MWCO de 100 kDa (corte de peso molecular em quilodálton). Diafiltração foi realizada usando tampão de fosfato de sódio em pH neutro. Diafiltração removeu os componentes médios de peso molecular baixo dos biopolímeros de peso molecular mais alto como ácido nucléico, proteína e polissacarídeo.

O polissacarídeo foi precipitado do concentrado e solução diafiltrado adicionando brometo de amónio de hexadeciltrimetila (HB) de uma solução de matéria-prima para dar uma concentração final de 1% de HB (p/v). O precipitado de polissacarídeo/HB foi capturado em um filtro de profundidade e o filtrado foi descartado. O precipitado de polissacarídeo foi ressolubilizado e eluído recirculando uma solução de cloreto de sódio através do filtro de profundidade contendo precipitado. Os filtros foram depois enxaguados com solução de cloreto de sódio adicional.

lodeto de sódio (Nal) foi adicionado à solução de polissacarídeo de uma solução de Nal de matéria-prima para alcançar uma concentração final de 0,5% para precipitar HB. O precipitado foi removido através de filtração de profundidade. O filtrado contém o polissacarídeo alvo. O vaso de precipitação e o filtro foram enxaguados com uma solução de NaCI/Nal e o enxágüe foi combinado com a solução de polissacarídeo parcialmente purificada. O filtro foi descartado. O polissacarídeo foi depois filtrado através de um filtro de 0,2 pm.

A solução de polissacarídeo foi concentrada em um ultrafiltro de MWCO de 30 kDa e diafiltrada com uma solução de cloreto de sódio.

A solução de polissacarídeo parcialmente purificada foi também purificada por filtração através de um filtro de profundidade impregnado com carbono ativado. Após filtração, o filtro de carbono foi enxaguado com uma solução de cloreto de sódio. O enxágüe é combinado com a solução de polissacarídeo que é depois filtrada através de um filtro de 0,2 pm.

A solução de polissacarídeo foi concentrada em um ultrafiltro de MWCO de 30 kDa e ajustada com um tampão a 1 M de fosfato de sódio para alcançar uma concentração final de 0,025 M de fosfato de sódio. O pH foi verificado e ajustado em 7,0 ± 0,2.

A coluna de hidroxiapatita de cerâmica (HA) foi equilibrada com tampão de fosfato de sódio contendo cloreto de sódio para obter a condutividade apropriada (< 15 pS). A solução de polissacarídeo foi depois carregada sobre a coluna. Sob estas condições, impurezas ligaram à resina e o polissacarídeo foi restabelecido no fluxo através da coluna. A solução de polissacarídeo foi filtrada através de filtros em-linha de 0,2 pm localizados antes e após a coluna.

A solução de polissacarídeo foi concentrada usando um filtro de MWCO de 30 kDa. O concentrado foi depois diafiltrado com Water For Injection (WFI). A solução de polissacarídeo diafiltrada foi filtrada através de um filtro de membrana de 0,02 pm em garrafas de polipropileno.

Amostras foram removidas para testagem de liberação e o polissacarídeo purificado foi armazenado congelado a -25° ± 5°C. CARACTERIZAÇÃO

Os dados de 1H-RMN foram consistentes com a estrutura química pela designação de sinais atribuída aos prótons da molécula de polissacarídeo. O espectro de 1 H-RMN mostrou uma série de sinais bemresolvidos (prótons do grupo metila) para a quantificação do grupo O-acetila funcional no polissacarídeo.

A identidade do polissacarídeo monovalente foi confirmada através de imunoeletroforese contracorrente usando anti-soros específicos.

Cromatografia de filtração em gel de alto desempenho acoplada a detectores de índice refrativo e de difração de luz de laser de multi-ângulo (MALLS) foram usados juntos com a concentração de amostra para calcular o peso molecular.

Meios de cromatografia por exclusão de tamanho (CL-4B) foram usados para perfilar a distribuição de tamanho molecular relativo do polissacarídeo.

EXEMPLO 2

PREPARAÇÃO DE CONJUGADO DE SACARÍDEO PNEUMOCÓCICO DE SOROTIPO I-CRM197

ATIVAÇÃO E CONJUGAÇÃO

Os recipientes de polissacarídeo purificado foram descongela dos e combinados em um vaso de reação. Ao vaso, 0,2 M de carbonato de sódio, pH 9,0, foi adicionado para desacetilação parcial (hidrólise) durante 3 horas a 50°C. A reação foi esfriada para 20°C e neutralização foi executada através de 0,2 M de ácido acético. Oxidação na presença de periodato de sódio foi executada através de incubação a 2-8°C, e a mistura foi agitada durante 15-21 horas.

A mistura de reação de ativação foi concentrada e diafiltrada 10x com 0,9% de NaCI usando uma membrana de MWCO de 30K. O retentato foi filtrado a 0,2 pm. O sacarídeo ativado foi enchido em garrafas de liofilização de vidro de 100 ml e congeladas em invólucro a -75°C e liofilizadas.

Congelamento em invólucro é um método para preparar amostras para liofilização (secagem por congelação). Frascos são girados automaticamente por cilindros a motor em um banho refrigerado contendo álcool ou qualquer outro fluido apropriado. Um revestimento fino de produto é uniformemente congelado por volta do invólucro interior de um frasco, permitindo processar um maior volume de material seguramente durante cada operação de secagem por congelamento. Estas unidades automáticas, refrigeradas provêm um meio simples e eficientes de pré-gelar muitos frascos de uma vez, produzindo os revestimentos desejados dentro, e provê área de superfície suficiente para secagem por congelamento eficiente.

As garrafas de material liofilizadas para trazidas para temperatura ambiente e ressuspensas em solução de CRM197 a uma razão de sacarídeo/proteína de 2:1. À mistura de sacarídeo/proteína 1M de tampão de fosfato de sódio foi adicionado a uma resistência iônica final de 0,2 M e um pH de 7,5, depois cianoboroidreto de sódio foi adicionado. A reação foi incubada a 23°C durante 18 horas, seguida por uma segunda incubação a 37°C durante 72 horas. Seguindo as incubações de cianoboroidreto, a mistura de reação foi diluída com solução salina fria seguida pela adição de 1M de carbonato de sódio para ajustar a mistura de reação em pH 9,0. Aldeídos nãoreagidos foram extinguidos por adição de boroidreto de sódio através de incubação a 23°C durante 3-6 horas.

A mistura de reação foi diluída 2 vezes com solução salina e transferida através de um pré-filtro de 0,45 - 5 pm em um vaso retentato. A mistura de reação é diafiltrada 30x com 0,15 M tampão de fosfato, pH 6, e 20x com solução salina. O retentato foi filtrado através de um filtro de 0,2 pm.

A solução conjugada foi diluída para um alvo de 0,5 mg/ml em 0,9% de solução salina, e depois filtrada estéril em recipientes de concentrado de volume final (FBC) em uma cobertura Class 100. O conjugado foi armazenado a 2 - 8°C.

CARACTERIZAÇÃO

Meios de cromatografia por exclusão de tamanho (CL-4B) foram usados para perfilar a distribuição de tamanho molecular relativa do conjugado.

A identidade do conjugado foi confirmada pelo ensaio de fendaborrão (slot blot) usando anti-soros específicos.

As concentrações de sacarídeo e de proteína foram determinadas pelo ácido urônico e ensaios de Lowry, respeçtivamente. A razão de sacarídeo para proteína no covalentemente complexo conjugado ligado foi obtida pelo cálculo:

pg/mL de sacarídeo

Razão =_____________________ ^£ pg/mL de proteína

Conteúdo de O-acetila foi medido pelo método de Hestrin (Hestrin et. al., J. Biol. Chem. 1949, 180, pág., 249). A razão de concentração de O-acetila para concentração de sacarídeo total deu pmoles de O-acetila por mg de sacarídeo.

EXEMPLO 3

PREPARAÇÃO DE SOROTIPO 3 DE POLISSACARÍDEO CAPSULAR DE

S. pneumoniae

PREPARAÇÃO DE BANCOS DE CÉLULA PRINCIPAL E DE TRABALHO Sorotipo 3 deS. pneumoniae foi obtido de Dr. Robert Austrian, Pennsylvania University, Filadélfia, Pensilvânia. Para preparação do sistema de banco de célula, vide Exemplo 1.

FERMENTAÇÃO E COLETA

Culturas do banco de célula de trabalho foram usadas para inocular garrafas de semente contendo meio com base em soja. As garrafas foram incubadas a 36°C ± 2°C sem agitação até que os requerimentos de crescimento fossem satisfeitos. Uma garrafa de semente foi usada para inocular um fermentador de semente contendo meio com base em soja. Um pH de cerca de 7,0 foi mantido com solução de carbonato de sódio estéril. Após a densidade óptica alvo ter sido alcançada, o fermentador de semente foi usado para inocular um fermentador de semente intermediário. Após a densidade óptica alvo ser alcançada, o fermentador de semente de intermediário foi usado para inocular o fermentador de produção. O pH foi mantido com solução de carbonato de sódio estéril. A fermentação foi terminada após o volume de trabalho do fermentador ter sido alcançada. Uma quantidade apropriada de 12% de deoxicolato de sódio estéril foi adicionada à cultura para lisar as células bacterianas e polissacarídeo associado à liberação. Após lise, os conteúdos do fermentador foram esfriados. O pH do caldo de cultura lisada foi ajustado para aproximadamente pH 6,6 com ácido acético. O lisado foi clarificado por centrifugação de fluxo contínuo seguido por filtração de profundidade e microfiltração de 0,45 pm.

PURIFICAÇÃO

A purificação do polissacarídeo pneumocócico consistiu em várias etapas de operações de concentração/diafiltração, precipitação/elução, cromatografia de coluna e filtração de profundidade. Todos os procedimentos foram executados em temperatura ambiente a menos que do contrário especificado.

Caldo clarificado das culturas do fermentador de sorotipo 3 de S. pneumoniae foi concentrado e diafiltrado usando um filtro de MWCO de 100 kDa. Diafiltração foi realizada usando tampão de fosfato de sódio em pH neutro. Diafiltração removeu os componentes médios de peso molecular baixo dos biopolímeros de peso molecular mais alto como ácido nucléico, proteína e polissacarídeo.

Antes da adição de brometo de amônio de hexadeciltrimetila (HB), um volume calculado de uma solução de matéria-prima de NaCI foi adicionado à solução de polissacarídeo concentrada e diafiltrada para dar uma concentração final de 0,25 M NaCI. O polissacarídeo foi depois precipitado adicionando HB de uma solução de matéria-prima para dar uma concentração final de 1% de HB (p/v). O precipitado de polissacarídeo/HB foi capturado em um filtro de profundidade e o filtrado foi descartado. O precipitado de polissacarídeo foi ressolubilizado e eluído recirculando uma solução de cloreto de sódio através do filtro de profundidade contendo precipitado. Os filtros foram depois enxaguados com solução de cloreto de sódio adicional.

lodeto de sódio (Nal) foi adicionado à solução de polissacarídeo de uma solução de Nal de matéria-prima para alcançar uma concentração final de 0,5% para precipitar HB. O precipitado foi removido através de filtração de profundidade. O filtrado continha o polissacarídeo alvo. Foram enxaguados o vaso de precipitação e o filtro com uma solução de NaCI/Nal e o enxágüe foi combinado com a solução de polissacarídeo parcialmente purificada. O filtro foi descartado. O polissacarídeo foi depois filtrado através de um filtro de 0,2 μιτι. A solução de polissacarídeo foi concentrada em um ultrafiltro de MWCO de 30 kDa e diafiltrada com uma solução de cloreto de sódio. ₇

A solução de polissacarídeo parcialmente purificada foi também purificada por filtração através de um filtro de profundidade impregnado com carbono ativado. Após filtração, o filtro de carbono foi enxaguado com uma solução de cloreto de sódio. O enxágüe foi combinado com a solução de polissacarídeo que foi depois filtrada através de um filtro de 0,2 μιτι.

A coluna de hidroxiapatita de cerâmica (HA) foi equilibrada com tampão de fosfato de sódio contendo cloreto de sódio para obter a condutividade apropriada (15 μ8). A solução de polissacarídeo foi depois carregada para a coluna. Sob estas condições, impurezas ligaram à resina e o polissacarídeo foi restabelecido no fluxo através da coluna. O polissacarídeo foi fluxado através da coluna com tampão e filtrado através de um filtro de 0,2 pm.

A solução de polissacarídeo foi concentrada usando um filtro de MWCO de 30 kDa. O concentrado foi depois diafiltrado com WFI.

A solução de polissacarídeo diafiltrada foi filtrada através de uma membrana de filtro de 0,2 pm em recipientes de aço inoxidável. Amostras foram removidas para testagem de liberação e o polissacarídeo purificado foi armazenado congelado a -25° ± 5°C.

CARACTERIZAÇÃO

Os dados de 1H-RMN foram consistentes com a estrutura química pela designação de sinais atribuída aos prótons da molécula de polissacarídeo.

Cromatografia de filtração em gel de alto desempenho, acoplada a detectores de difração de índice refrativo e de luz de laser multi-ângulo (MALLS), foi usada junto com a concentração de amostra para calcular o peso molecular.

Meio de cromatografia por exclusão de tamanho (CL-4B) foi usado pra perfil a distribuição de tamanho molecular relativa do polissacarídeo.

EXEMPLO 4

PREPARAÇÃO DE CONJUGADO DE SACARÍDEO PNEUMOCÓCICO DE SOROTIPO 3-CRM197

ATIVAÇÃO E CONJUGAÇÃO

Recipientes de sacarídeo de sorotipo 3 purificado foram descongelados e combinados em um vaso de reação. Ao vaso, foram adicionados WFI e 2M de ácido acético a uma concentração final de 0,2M e 2 mg/ml de sacarídeo. A temperatura da solução foi elevada para 85°C durante uma hora para hidrolisar o polissacarídeo. A reação foi esfriada para < 25°C e 1 M de cloreto de magnésio foi adicionado a uma concentração final de 0,1 M. Oxidação na presença de periodato de sódio foi executada através de incubação durante 16-24 horas a 23°C.

A mistura de reação de ativação foi concentrada e diafiltrada 10x com WFI usando uma membrana de MWCO de 100K. O retentato foi filtrado através de um filtro de 0,2 pm.

Para composição, 0,2 M de fosfato de sódio, pH 7,0, foi adicionado ao sacarídeo ativado a uma concentração final de 10 mM e um pH de 6,0-6,5. Proteína veicular de CRM₁₉₇ foi misturada com a solução de sacarídeo para uma razão de 2 g de sacarídeo para 1 g de CRMi₉₇. A solução de sacarídeo/proteína combinada foi enchida em garrafas de liofilização de vidro de 100 ml com um enchimento alvo de 50 ml_, congeladas em invólucro a -75°C, e liofilizadas.

As garrafas de material de sacarídeo/proteína co-liofilizadas foram tragas para até a temperatura ambiente e ressuspensas em 0,1 M de tampão de fosfato de sódio, pH 7,0, para uma concentração de sacarídeo final de 20 mg/ml. O pH foi ajustado em 6,5 e depois um equivalente molar de 0,5 de cianoboroidreto de sódio foi adicionado. A reação foi incubada a 37°C durante 48 horas. Seguindo a incubação de cianoboroidreto, a mistura de reação foi diluída com 5 mM de succinato resfriado/0,9% de solução salina de tampão. Aldeídos não-reagidos foram extinguidos pela adição de boroidreto de sódio e incubação a 23°C durante 3-6 horas. A mistura de reação foi transferida através de um pré-filtro de 0,45-5 pm em um vaso de retentato.

A mistura de reação foi diafiltrada 30x com 0,1 M de tampão de fosfato (pH 9), 20x com 0,15 M de manteiga de fosfato (pH 6) e 20x com 5 mM succinato/0,9% de solução salina. O retentato foi filtrado através de um filtro de 0,2 pm.

A solução conjugada foi diluída para um alvo de sacarídeo de 0,5 mg/ml, e depois filtrada estéril em recipientes de FBC em uma cobertura Class 100. O conjugado foi armazenado a 2 - 8°C.

CARACTERIZAÇÃO

Meio de cromatografia por exclusão de tamanho (CL-4B) foi usado para perfilar a distribuição de tamanho molecular relativa do conjugado.

A identidade do conjugado foi confirmada pelo ensaio de fendaborrão usando anti-soros específicos.

As concentrações de sacarídeo e de proteína foram determinadas pelos ensaios de Anthrone 10 e Lowry, respectivamente. A razão de sacarídeo para proteína no complexo covalentemente conjugado ligado foi obtida pelo cálculo:

pg/mL de sacarídeo

Razão =____________:____________ pg/mL de proteína

EXEMPLO 5

PREPARAÇÃO DE SOROTIPO 5 DE POLISSACARÍDEO CAPSULAR DE

S. pneumoniae

Sorotipo 5 de S. pneumoniae foi obtido de Dr. Gerald Schiffman da Universidade Estadual de Nova Iorque, Brooklyn, Nova Iorque. Para preparação do sistema de banco de célula, vide Exemplo 1. Para fermentação, coleta, purificação e caracterização do polissacarídeo, vide Exemplo 1. PROCESSO DE FERMENTAÇÃO ALTERNADO

Culturas do banco de célula de trabalho foram usadas para inocular garrafas de semente contendo um meio com base em soja e uma solução a 10 mM de NaHCO₃ estéril. As garrafas foram incubadas a 36°C ± 2°C sem agitação até que os requerimentos de crescimento fossem satisfeitos. Uma garrafa de semente foi usada para inocular um fermentador de semente contendo meio com base em soja e uma solução a 10 mM de NaHCO₃estéril. Um pH de cerca de 7,0 foi mantido com 3N NaOH. Após a densidade óptica alvo ter sido alcançada, o fermentador de semente foi usado para inocular o fermentador de produção contendo meio com base em soja com uma concentração a 10 mM de NaHCO₃. O pH foi mantido com 3N NaOH. A fermentação foi terminada após cessação de crescimento ou quando o volume de trabalho do fermentador foi alcançado. Uma quantidade apropriada de 12% de deoxicolato de sódio estéril foi adicionada à cultura para obter uma concentração a 0,12% no caldo, para lisar as células bacterianas e polissa carídeo associado à célula de liberação. Após lise, os conteúdos do fermentador foram mantidos, com agitação, por um intervalo de tempo entre 8 e 24 horas em uma temperatura entre 7°C e 13°C para assegurar que lise celular completa e liberação de polissacarídeo tivessem ocorrido. Agitação durante este período de retenção impediu sedimento de lisado de depositar nas paredes do fermentador e sonda de pH, assim permitindo manter a integridade da sonda de pH. Em seguida, o pH do caldo de cultura lisada foi ajustado em aproximadamente pH 4,5 com 50% de ácido acético. Após um tempo de contensão sem agitação, por um intervalo de tempo entre 12 e 24 horas em uma temperatura uma porção significativa das proteínas previamente solúveis caiu fora de solução como um precipitado sólido com pequena perda ou degradação do polissacarídeo que permaneceu na solução entre 15°C e 25°C. A solução com o precipitado foi depois clarificada por centrifugação de fluxo contínuo seguida por filtração de profundidade e microfiltração de 0,45 pm.

EXEMPLO 6

PREPARAÇÃO DE CONJUGADO SACARÍDEO PNEUMOCÓCICO DE SOROTIPO 5-CRM-I97

ATIVAÇÃO E CONJUGAÇÃO

Recipientes de sacarídeo de sorotipo 5 foram descongelados e combinados em um vaso de reação. Aó vaso, 0,1 M de acetato de sódio, pH 4,7, foi adicionado seguido por oxidação na presença de periodato de sódio através de incubação durante 16-22 horas a 23°C. A mistura de reação de ativação foi concentrada e diafiltrada 10x com WFI usando uma membrana de MWCO de 100K. O retentato foi filtrado através de um filtro de 0,2 pm.

O sacarídeo ativado de sorotipo 5 foi combinado com CRM197 a uma razão de 0,8:1. A solução de sacarídeo/proteína combinada foi enchida em garrafas de liofilização de vidro de 100 ml (50 ml de enchimento alvo), congelada em invólucro a -75°C, e co-liofilizada.

As garrafas de material co-liofilizado foram trazidas até a temperatura ambiente e ressuspensas em 0,1 M de fosfato de sódio, pH 7,5, e cianoboroidreto de sódio foi adicionado. A reação foi incubada a 30°C durante horas, seguida por uma segunda adição de cianoboroidreto e incubada a 30°C durante 20-28 horas.

Seguindo as incubações de cianoboroidreto, a mistura de reação foi diluída 2 vezes com solução salina e transferida através de um pré-filtro de 0,45-5 pm em um vaso de retentato. A mistura de reação foi diafiltrada 30x com 0,01 M de tampão de fosfato, pH 8, 20x com 0,15 M de tampão de fosfato, pH 6, e 20x com solução salina. O retentato foi filtrado através de um filtro de 0,2 pm.

Para a caracterização do conjugado, vide Exemplo 2.

EXEMPLO 7

PREPARAÇÃO DE SOROTIPO 6A DE POLISSACARÍDEO CAPSULAR DE

S. pneumoniae

Sorotipo 6A de S. pneumoniae foi obtido de Dr. Gerald Schiffman da Universidade Estadual de Nova Iorque, Brooklyn, Nova Iorque. Para preparação do sistema de banco de célula, vide Exemplo 1. Para fermentação, coleta e purificação do polissacarídeo, vide Exemplo 1, exceto que durante a purificação, a etapa de concentração de MWCO de 30 kDa, antes da etapa de cromatografia, é omitida.

EXEMPLO 8

PREPARAÇÃO DE CONJUGADO DE SACARÍDEO PNEUMOCÓCICO DE SOROTIPO 6A-CRM-I97

ATIVAÇÃO E CONJUGAÇÃO

Polissacarídeo de sorotipo 6A é um polímero de peso molecular alto que teve que ser reduzido em tamanho antes da oxidação. Recipientes de sacarídeo de sorotipo 6A foram descongelados e combinados em um vaso de reação. 2 M de ácido acético fomos adicionados a uma concentração final de 0,1 M para hidrólise durante 1,5 hora a 60°C ao vaso. A reação foi esfriada para 23°C e neutralização foi executada ajustando a mistura de reação com 1 M de NaOH para pH 6. Oxidação na presença de periodato de sódio foi executada através de incubação a 23°C durante 14-22 horas.

Sorotipo 6A foi composto com sacarose e enchido em garrafas de liofilização de vidro de 100 ml (enchimento alvo de 50 ml_) e congeladas em invólucro a -75°C e liofilizadas.

As garrafas de material liofilizadas foram trazidas para temperatura ambiente e ressuspensas em dimetilsulfóxido (DMSO) a uma razão de sacarídeo/proteína de 1:1. Após adição de cianoboroidreto de sódio, a mistura de reação foi incubada a 23°C durante 18 horas. Seguindo a incubação de cianoboroidreto, a mistura de reação foi diluída com solução salina fria. Aldeídos não-reagidos foram extinguidos mediante adição de boroidreto de sódio através de incubação a 23°C durante 3-20 horas.

A mistura de reação diluída foi transferida através de um préfiltro de 5 pm em um vaso de retentato. A mistura de reação foi diafiltrada 10x com 0,9% de NaCI e 30x com NaCI tamponado com succinato. O retentato foi filtrado através de um filtro de 0,2 pm.

Para a caracterização do conjugado, vide Exemplo 2.

EXEMPLO 9

PREPARAÇÃO DE SOROTIPO 7F DE POLISSACARÍDEO CAPSULAR DE

S. pneumoniae

Sorotipo 7F de S. pneumoniae foi obtido de Dr. Gerald Schiffman da Universidade Estadual de Nova Iorque, Brooklyn, Nova Iorque. Para preparação do sistema de banco de célula, e para fermentação e coleta do polissacarídeo, vide Exemplo 3. Para um processo de fermentação e coleta alternado, vide o processo alternado descrito no Exemplo 1.

PURIFICAÇÃO

A purificação do polissacarídeo pneumocócico consistiu em vá rias etapas de operações de concentração/diafiltração, precipitação/elução, cromatografia de coluna, e filtração de profundidade. Todos os procedimentos foram executados em temperatura ambiente a menos que do contrário especificado.

Caldo clarificado das culturas de fermentador de sorotipo 7F de

S. pneumoniae foi concentrado e diafiltrado usando um filtro de MWCO de 100 kDa. Diafiltração foi realizada usando tampão de fosfato de sódio em pH neutro. Diafiltração removeu os componentes médios de peso molecular baixo dos biopolímeros de peso molecular mais alto como ácido nucléico, proteína e polissacarídeo.

Sorotipo 7F não forma um precipitado com HB. Do contrário, impurezas foram precipitadas da solução concentrada e diafiltrada adicionando o HB de uma solução de matéria-prima a uma concentração final de 1% de HB. O precipitado foi capturado em um filtro de profundidade e o filtro foi descartado. O polissacarídeo foi contido no filtrado.

lodeto de sódio (Nal) foi adicionado à solução de polissacarídeo de uma solução de Nal de matéria-prima para alcançar uma concentração final de 0,5% para precipitar HB. O precipitado foi removido através de filtração de profundidade. O filtrado continha o polissacarídeo alvo. O vaso de precipitação foi enxaguado e o filtro com uma solução de NaCI/Nal e o enxágüe foram combinados com a solução de polissacarídeo parcialmente purificada. O filtro foi descartado. O polissacarídeo foi depois filtrado através de um filtro de 0,2 qm.

A solução de polissacarídeo parcialmente purificada foi também purificada por filtração através de um filtro de profundidade impregnado com carbono ativado. Após filtração, o filtro de carbono foi enxaguado com uma solução de cloreto de sódio. O enxágüe foi combinado com a solução de polissacarídeo que foi depois filtrada através de um filtro de 0,2 qm.

A solução de polissacarídeo foi concentrada em um ultrafiltro de MWCO de 30 kDa e ajustada com um tampão a 1 M de fosfato de sódio para alcançar uma concentração final de 0,025 M de fosfato de sódio. O pH foi verificado e ajustado a 7,0 ± 0,2.

A coluna de hidroxiapatita de cerâmica (HA) foi equilibrada com tampão de fosfato de sódio contendo cloreto de sódio para obter a condutividade apropriada (15 pS). A solução de polissacarídeo foi depois carregada para a coluna. Sob estas condições, impurezas ligaram à resina e o polissacarídeo são restabelecidos no fluxo através da coluna. O polissacarídeo foi fluxado através da coluna com tampão e filtrado através de um filtro de 0,2 pm.

A solução de polissacarídeo diafiltrada foi filtrada através de um filtro de membrana de 0,2 pm em recipientes de aço inoxidável. Amostras foram removidas para testagem de liberação e o polissacarídeo purificado foi armazenado a 2^o - 8°C.

Para caracterização do polissacarídeo, vide Exemplo 3.

EXEMPLO 10

PREPARAÇÃO DE CONJUGADO DE SACARÍDEO PNEUMOCÓCICO DE SOROTIPO 7F-CRMi97

Ativação e Oxidação de Conjugação na presença de periodato de sódio foram executadas através de incubação por 16-24 h a 23°C.

A mistura de reação de ativação foi concentrada e diafiltrada 10x com 10 mM de NaOAc, pH 4,5, usando uma membrana de MWCO de 100 K. O retentato foi filtrado através de um filtro de 0,2 pm.

Sorotipo 7F foi enchido em garrafas de liofilização de vidro de 100 ml (enchimento alvo de 50 ml) e congeladas em invólucro a -75°C e liofilizadas.

As garrafas de sorotipo 7F liofilizadas e CRM197 foram trazidas para temperatura ambiente e ressuspensas em DMSO a uma razão de sacarídeo/proteína de 1,5:1. Após a adição de cianoboroidreto de sódio, a reação foi incubada a 23°C por 8 - 10 horas. Aldeídos não-reagidos foram extinguidos pela adição de boroidreto de sódio através de incubação a 23°C durante horas.

A mistura de reação foi diluída 10 vezes com solução salina fria e transferida através de um pré-filtro de 5 pm em um vaso de retentato. A mistura de reação foi diafiltrada 10x com 0,9% de solução salina e 30x com solução salina tamponada com succinato. O retentato foi filtrado através de um filtro de 0,2 pm.

A solução conjugada foi diluída para um alvo de sacarídeo de 0,5 mg/ml de 0,9% de solução salina, e depois filtrada estéril em recipientes de FBC em uma cobertura Class 100. O conjugado foi armazenado a 2 8°C.

Para caracterização do conjugado, vide Exemplo 4.

EXEMPLOU

PREPARAÇÃO DE SOROTIPO 19A DE POLISSACARÍDEO CAPSULAR DE S. pneumoniae

Sorotipo 19A de S. Pneumoniae foi obtido de Dr. Gerald Schiffman da Universidade Estadual de Nova Iorque, Brooklyn, Nova Iorque. Para preparação do sistema de banco de célula, vide Exemplo 1. Para fermentação, coleta e purificação do polissacarídeo, vide Exemplo 7. Para caracterização, vide Exemplo 3.

EXEMPLO 12

PREPARAÇÃO DE CONJUGADO SACARÍDEO PNEUMOCÓCICO DE SOROTIPO 19A-CRMi97

ATIVAÇÃO E CONJUGAÇÃO

Recipientes de sacarídeo de sorotipo 19A foram descongelados e combinados em um vaso de reação. Acetato de sódio foi adicionado a 10 mM (pH 5,0) e oxidação foi realizada na presença de periodato de sódio através de incubação por 16-24 h a 23°C.

A mistura de reação de ativação foi concentrada e diafiltrada 10x com 10 mM de acetato, pH 5,0, usando uma membrana de MWCO de 100K. O retentato foi filtrado através de um filtro de 0,2 μπη.

O sacarídeo ativado foi composto com sacarose seguido pela adição de CRM₁₉₇. A mistura de sacarídeo de sorotipo 19A ativado e de

CRMi97 (razão 0,8:1) foi enchida em garrafas de liofilização de vidro de 100 ml (enchimento alvo de 50 ml) e congeladas em invólucro a -75°C e liofilizadas.

Garrafas de material liofilizadas foram trazidas até a temperatura ambiente e ressuspensas em DMSO. À mistura de sacarídeo/proteína, cianoboroidreto de sódio (100 mg/ml) foi adicionado. A reação foi incubada a 23°C durante 15 horas. Seguindo a incubação de cianoboroidreto, aldeídos não-reagidos foram extinguidos pela adição de boroidreto de sódio através de incubação a 23°C durante 3-20 horas.

A mistura de reação foi diluída 10 vezes com solução salina fria e transferida através de um pré-filtro de 5 pm em um vaso de retentato. A mistura de reação foi diafiltrada 10x com 0,9% de NaCI, filtrada em 0,45 um e 30x com diafiltração usando 5 mM de succinato/0,9% de tampão de NaCI, pH 6. O retentato foi filtrado através de um filtro de 0,2 pm.

A solução conjugada foi diluída para um alvo de 0,5 mg/ml usando 5 mM de succinato/0,9% de solução salina, e depois filtrada estéril em recipientes de FBC em uma cobertura Class 100. O conjugado foi armazenado a 2 - 8°C.

Para caracterização do conjugado, vide Exemplo 4.

EXEMPLO 13 .

PREPARAÇÃO DE SOROTIPOS 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F E 23F DE POLISSACARÍDEO CAPSULAR DE S. pneumoniae

PREPARAÇÃO DA CULTURA DE SEMENTE DE S. pneumoniae

Sorotipos 4, 6B, 9V, 18C1 19F e 23F de S. pneumoniae foram obtidos de Dr. Gerald Schiffman, Universidade Estadual de Nova Iorque, Brooklyn, Nova Iorque. Sorotipo de S. pneumoniae 14 foi obtido da ATCC, cepa 6314.

Separadamente, um frasco de cada um dos sorotipos desejados de Streptococcus pneumoniae foi usado para iniciar uma batelada de fermentação. Duas garrafas contendo um meio com base em soja e fenol vermelho foram ajustadas em uma faixa de pH de 7,4 ± 0,2 usando carbonato de sódio, e o volume requerido de 50% de dextrose/1% de solução de sulfa to de magnésio foi depois adicionado às garrafas. As duas garrafas foram inoculadas com quantidades diferentes de semente. As garrafas foram incubadas a 36° ± 2°C até que o meio ficasse amarelo. Seguindo incubação, as amostras foram removidas de cada garrafa e testadas para densidade óptica (OD) (0,3 a 0,9) e pH (4,6 a 5,5). Uma das duas garrafas foi selecionada para inoculação do fermentador de semente.

Meio com base em soja foi transferido ao fermentador de semente e esterilizado. Depois um volume de 50% de dextrose/1% de solução de sulfato de magnésio foi adicionado ao fermentador. O pH e agitação do fermentador de semente foram monitorados e controlados (pH 6,7 a 7,4). A temperatura foi mantida a 36° ± 2°C. O inóculo de semente (garrafa) foi assepticamente conectado ao fermentador de semente e o inóculo foi transferido. O fermentador foi mantido em controle de pH e as amostras foram periodicamente removidas e testadas para OD e pH. Quando o OD desejado de 0,5 a 600 nm foi alcançado, o fermentador de intermediário foi inoculado com o caldo de fermentação do fermentador de semente.

Meio com base em soja foi transferido para o fermentador de intermediário e esterilizado. Depois um volume de 50% de dextrose/1% de solução de sulfato de magnésio foi adicionado ao fermentador. O pH e agitação do fermentador intermediário foram monitorados e controlados (pH 6,7 a 7,4). A temperatura foi mantida a 36° ± 2°C. Foram transferidos os conteúdos do fermentador de semente para o fermentador intermediário. O fermentador foi mantido no controle de pH e as amostras foram periodicamente removidas e testadas para OD e pH. Quando a OD desejada de 0,5 a 600 nm foi alcançada, o fermentador de produção foi inoculado com o caldo de fermentação do fermentador intermediário.

Meio com base em soja foi transferido para o fermentador dè produção e esterilizada. Depois um volume de 50% de dextrose/1% de solução de sulfato de magnésio foi adicionado ao fermentador. O pH e agitação do fermentador de produção foram monitorados e controlados (pH 6,7 a 7,4). A temperatura foi mantida a 36° ± 2°C. O fermentador foi mantido no controle de pH e as amostras foram periodicamente removidas e testadas para OD e pH, até que a fermentação estivesse completa.

Deoxicolato de sódio foi adicionado ao fermentador para uma concentração final de aproximadamente 0,12% p/v. A cultura foi misturada por um mínimo de trinta minutos e o ponto de ajuste de temperatura foi reduzido para 10°C. A cultura foi incubada durante a noite e seguindo confirmação de inativação, o pH da cultura foi ajustado para entre 6,4 e 6,8, conforme necessário, com 50% de ácido acético. A temperatura do fermentador foi aumentada para 20° ± 5°C e os conteúdos foram transferidos para o tanque de retenção de clarificação.

Os conteúdos do tanque de retenção de clarificação (incluindo os restos celulares) foi processado através de uma centrífuga a uma taxa de fluxo entre 25 e 600 litros por hora (exceto Sorotipo 4, em que o restos de célula foram descartados e a taxa de fluxo apertada para entre 25 e 250 litros por hora). Amostras do sobrenadante foram removidas e testadas para OD. A OD desejada durante a centrifugação foi < 0,15.

Inicialmente, o sobrenadante foi recirculado através de um conjunto de filtro de profundidade até uma OD de 0,05 ± 0,03 ter sido alcançada. Depois o sobrenadante foi passado através do conjunto de filtro de profundidade e através de um filtro de membrana de 0,45 pm para o tanque de retenção de filtraçlo.

Subsequentemente, o produto foi transferido através de canos fechados para a área de purificação para processar.

Todas das operações acima (centrifugação, filtração e transferência) foram executadas entre 10°C a 30°C.

Para um processo de fermentação e coleta alternado para sorotipos 4 e 6B, vide o processo alternado descrito no Exemplo 1. PURIFICAÇÃO

A purificação de cada polissacarídeo pneumocócico consistiu em várias etapas de operações de concentração/diafiltração, precipitação/elução, cromatografia de coluna, e filtração de profundidade. Todos os procedimentos foram executados em temperatura ambiente a menos que do contrário especificado.

Caldo clarificado das culturas do fermentador do sorotipo de S. pneumoniae desejado foi concentrado e diafiltrado usando um filtro de MWCO de 100 kDa. Diafiltração foi realizada usando tampão de fosfato de sódio para pH < 9,0. Diafiltração removeu os componentes médios de peso molecular baixo dos biopolímeros de peso molecular mais alto como ácido nucléico, proteína e polissacarídeo.

O polissacarídeo foi precipitado do concentrado e solução diafiltrada adicionando HB de uma solução de matéria-prima para dar uma concentração final de 1% de HB (p/v) (exceto Sorotipo 23F que teve uma concentração final de 2,5%). O precipitado de polissacarídeo/ΗΒ foi capturado em um filtro de profundidade e o filtrado foi descartado. (Nota: Sorotipo 14 não precipita; portanto o filtrado foi retido). O precipitado de polissacarídeo foi ressolubilizado e eluído recirculando uma solução de cloreto de sódio através do filtro de profundidade contendo precipitado.

Os filtros foram depois enxaguados com solução de cloreto de sódio adicional.

Iodeto de sódio (Nal) foi adicionado à solução de polissacarídeo de uma solução de Nal de matéria-prima para alcançar uma concentração final de 0,5% para precipitar HB (com exceção do Sorotipo 6B que teve uma concentração final de 0,25%). O precipitado foi removido através de filtração de profundidade. O filtrado continha o polissacarídeo alvo. O filtro foi descartado. O polissacarídeo foi depois filtrado através de um filtro de 0,2 pm.

A solução de polissacarídeo parcialmente purificada foi também purificada por filtração através de um filtro de profundidade impregnado com carbono ativado. Após filtração, o filtro de carbono foi enxaguado com uma solução de cloreto de sódio. O enxágue foi combinado com a solução de polissacarídeo que foi depois filtrada através de um filtro de 0,2 pm.

A solução de polissacarídeo foi concentrada em um ultrafiltro de MWCO de 30 kDa e o filtro foi enxaguado com uma solução de cloreto de sódio. O pH foi verificado e ajustado em 7,0 ± 0,3.

A coluna de hidroxiapatita de cerâmica (HA) foi equilibrada com tampão de fosfato de sódio contendo cloreto de sódio até que o pH fosse 7,0 ± 0,3 e a condutividade foram 26 + 4 pS. A solução de polissacarídeo foi depois carregada sobre a coluna. Sob estas condições, impurezas ligaram à resina e o polissacarídeo é restabelecido no fluxo através de da coluna. A solução de polissacarídeo foi filtrada através de um filtro de 0,2 pm. A solução de polissacarídeo foi concentrada usando um filtro de MWCO de 30 kDa.

O concentrado foi depois diafiltrado com WFI até que a condutividade fosse <. 15 pS.

A solução de polissacarídeo diafiltrada foi filtrada através de uma membrana de filtro de 0,2 pm em recipientes de volume e armazenada a 28°C.

EXEMPLO 14

PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS DE SACARÍDEO PNEUMOCÓCICO CRM₁₉₇ PARA SOROTIPOS 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19FE 23F

PROCESSO DE ATIVAÇÃO

Os sacarídeos de sorotipo diferentes seguem vias diferentes para ativação (hidrólise ou nenhuma hidrólise antes da ativação) e conjugação (reações aquosas ou de DMSO) como descrita neste exemplo.

Polissacarídeo foi transferido dos recipientes de volume para o vaso de reator. O polissacarídeo foi depois diluído em WFI e fosfato de sódio a uma faixa de concentração final de 1,6 - 2,4 mg/ml

ETAPA 1.

Para sorotipos 6B, 9V, 14, 19F e 23F, pH foi ajustado para pH 6,0 ±0,3.

Para sorotipo 4, ácido clorídrico (0,01 M de concentração de ácido final) foi adicionado e a solução foi incubada por 25 - 35 minutos a 45° ± 2°C. Hidrólise foi parada esfriando para 21 - 25°C e adicionando 1 M de fosfato de sódio a um alvo de pH 6,7 ± 0,2. Um teste dentro do processo foi feito para confirmar um nível apropriado de despiruvilação.

Para o sorotipo 18C, ácido acético glacial (0,2 M de concentra ção de ácido final) foi adicionado e a solução foi incubada por 205 - 215 minutos a 94° ± 2°C. Temperatura foi depois diminuída para 21 - 25°C e 1 - 2 M de fosfato de sódio foi adicionado a um alvo de pH 6,8 ± 0,2.

ETAPA 2: REAÇÃO DE PERIODATO

Os equivalentes molares de periodato de sódio requeridos para ativação de sacarídeo pneumocócico foram determinados usando conteúdo de sacarídeo total (com exceção do sorotipo 4). Para o sorotipo 4, uma razão de 0,8-1,2 mol de periodato de sódio por mol de sacarídeo foi usada. Com mistura completa, a reação de oxidação foi deixada prosseguir entre 16 a 20 horas a 21 - 25°C para todos os sorotipos exceto 19F para os quais a temperatura foi 15°C.

ETAPA 3: ULTRAFILTRAÇÃO

O sacarídeo oxidado foi concentrado e diafiltrado com WFI (0,0 1M de tampão de fosfato de sódio pH 6,0 para sorotipo 19F) em um ultrafiltro de MWCO de 100 kDa (ultrafiltro de 5 kDa para 18C). O permeado foi descartado e o retentato foi filtrado através de um filtro de 0,22 μιτι.

ETAPA 4: LIOFILIZAÇÃO

Para sorotipos 4, 9V e 14, o sacarídeo concentrado foi misturado com proteína veículo de CRM197, enchido em garrafas de vidro, congelados em invólucro e armazenados a < -65°C. O sacarídeo congelado concentrado-CRMi97 foi liofilizado e depois armazenado a -25° ± 5°C.

Para sorotipos 6B, 19F e 23F foi adicionada uma quantidade especificada de sacarose que foi calculada para alcançar uma concentração de 5% ± 3% de sacarose na mistura de reação de conjugação. Sorotipo 18C não requereu adição de sacarose. O sacarídeo concentrado foi depois enchido em garrafas de vidro, congelado em invólucro e armazenado a < 65°C. O sacarídeo concentrado congelado foi liofilizado e depois armazenado a -25° ± 5°C.

PROCESSO DE CONJUGAÇÃO

Dois processos de conjugação foram usados: conjugação aquosa para sorotipos 4, 9V, 14 e 18C, e conjugação de DMSO para sorotipos 6B, 19Fe23F.

CONJUGAÇÃO AQUOSA ETAPA 1: DISSOLUÇÃO

Para sorotipos 4, 9V e 14, a mistura de sacarídeo ativado liofilzado-CRM₁₉₇ foi descongelada e equilibrada em temperatura ambiente. O sacarídeo ativado liofilzado-CRMig? foi depois reconstituído em 0,1M de tampão de fosfato de sódio a uma razão típica de:

• 1 L de tampão por 16 - 24 g de sacarídeo para sorotipo 4 e 9V • 1 L de tampão por 6 -10 g de sacarídeo para sorotipo 14

A mistura de reação foi incubada a 37° ± 2°C até dissolução total para o sorotipo 9V e a 23° ± 2°C para os sorotipos 4 e 14.

O sacarídeo liofilizado foi reconstituído em uma solução de CRM-I97 em 1 M de fosfato de sódio dibásico a uma razão típica de 0,11 L de fosfato de sódio para sorotipo 18C, por 1 L de solução de CRM197. A mistura de reação (concentração de sacarídeo de 8-12 g/L) foi incubada a 23° ± 2°C até dissolução total.

O pH foi testado como um controle dentro do processo neste estágio.

ETAPA 2: REAÇÃO DE CONJUGAÇÃO

Para sorotipos 4 e 9V, a reação de conjugação foi iniciada adicionando a solução de cianoboroidreto de sódio (100 mg/ml) para alcançar 1,0-1,4 mol de cianoboroidreto de sódio por mol de sacarídeo. A mistura de reação foi incubada por 44 - 52 horas a 37° ± 2°C. A temperatura foi depois reduzida para 23° ± 2°C e cloreto de sódio a 0,9% foi adicionado ao reator. Solução de boroidreto de sódio (100 mg/ml) foi adicionada para alcançar 1,8 - 2,2 equivalentes molares de boroidreto de sódio por mol de sacarídeo. A mistura foi incubada por 3-6 horas a 23° ± 2°C. A mistura foi diluída com cloreto de sódio a 0,9% e o reator foi enxaguado. A mistura de conjugação diluída foi filtrada usando um pré-filtro de 1,2 μιτι em um vaso de contensão.

Para sorotipos 14 e 18C, a reação de conjugação foi iniciada adicionando a solução de cianoboroidreto (100 mg/ml) para alcançar 1,0 -

1,4 mol de cianoboroidreto de sódio por mol de sacarídeo. A mistura de reação foi incubada por 12-24 horas a 23° ± 2°C. A temperatura foi aumentada para 37° ± 2°C e a reação para 72 - 96 horas. A temperatura foi depois reduzida a 23° ± 2°C e 0,9% de cloreto de sódio foi adicionado ao reator. Solução de boroidreto de sódio (100 mg/mL) foi adicionada para alcançar 1,8 -

2,2 equivalentes molares de boroidreto de sódio por mol de sacarídeo. A mistura foi incubada por 3 - 6 horas a 23° ± 2°C. A mistura foi diluída com 0,9% de cloreto de sódio e o reator foi enxaguado. A mistura de conjugação diluída foi depois filtrada usando um pré-filtro de 1,2 pm em um vaso de contensão.

ETAPA 3: ULTRAFILTRAÇÃO DE 100 kDa

A mistura de conjugação diluída foi concentrada e diafiltradas em um ultrafiltro de MWCO de 100 kDa com ou um mínimo de 15 volumes (sorotipo 4) ou 40 volumes (sorotipos 9V, 14, e 18C) de 0,9% de cloreto de sódio.

O permeado foi descartado.

Para sorotipo 4, o retentato foi filtrado através de um filtro de 0,45 pm. Um controle dentro do processo (conteúdo de sacarídeo) foi executado nesta etapa.

ETAPA 4: PURIFICAÇÃO EM COLUNA DE HA

Esta etapa foi apenas executada para o sorotipo 4 conjugado.

A coluna de HA foi neutralizada primeiro usando 0,5 M de tampão de fosfato de sódio (pH 7,0 + 0,3) e depois equilibrada com 0,9% de cloreto de sódio. O retentato filtrado (sorotipo 4) foi carregado sobre a coluna a uma taxa de fluxo de 1,0 L/min. A coluna foi lavada com 0,9% de cloreto de sódio a uma taxa de fluxo de < 2,0 Umin. O produto foi depois eluído com 0,5 M de tampão de fosfato de sódio a uma taxa de fluxo de < 2,0 L/min.

A fração de HA foi depois concentrada e diafiltrada em uma membrana de MWCO de 100 kDa com um mínimo de 20 volumes de 0,9% de cloreto de sódio. O permeado foi descartado.

ETAPA 5: FILTRAÇÃO ESTÉRIL

O retentato após a diafiltração de MWCO de 100 kDa foi filtrado através de um filtro de 0,22 pm. Controles dentro do processo (conteúdo de sacarídeo, proteína livre, sacarídeo livre e cianeto) foram executados no produto filtrado. Controles dentro do processo foram executados no retentato filtrado para determinar se a concentração, diafiltração e/ou diluição adicionais era(m) necessária(s) para satisfazer os alvos de FBC. Estes e testes adicionais foram repetidos nas amostras de FBC.

Quando necessário, o conjugado filtrado foi diluído com 0,9% de cloreto de sódio para alcançar uma concentração final de menos de 0,55 g/L. Testes de liberação para conteúdo de sacarídeo, conteúdo de proteína e razão de sacarídeo:proteína foram executados neste estágio.

Por fim, o conjugado foi filtrado (0,22 pm) e enchido em potes de aço inoxidável de 10 L a uma quantidade típica de 2,64 g/pote. Neste estágio, rendimento, conteúdo de sacarídeo, conteúdo de proteína, pH, razão de sacarídeo:proteína e conteúdo de lisina como controles dentro do processo foram executados. Testagem de liberação (aparência, proteína livre, sacarídeo livre, endotoxina, determinação de tamanho molecular, cianeto residual, identidade de sacarídeo, identidade de CRM197) foi executada neste estágio. CONJUGAÇÃO DE DMSO ETAPA I: DISSOLUÇÃO

Os sorotipos de sacarídeo ativado liofilizado 6B, 19F, 23F foram equilibrados e a proteína veículo de CRM197 liofilizada em temperatura ambiente e reconstituída em DMSO. A concentração de dissolução tipicamente variou de 2-3 gramas de sacarídeo (2-2,5 g de proteína) por litro de DMSO. ETAPA II: REAÇÃO DE CONJUGAÇÃO

O sacarídeo ativado e proteína veículo de CRM197 foram misturados por 60 - 75 minutos a 23° ± 2°C a uma razão variando de 0,6 g - 1,0 g sacarídeo/g CRM197 para sorotipos 6B e 19F ou 1,2 a 1,8 g sacarídeo/g CRM197 para sorotipo 23F.

A reação de conjugação foi iniciada adicionando a solução de cianoboroidreto de sódio (100 mg/ml) a uma razão de 0,8 - 1,2 equivalente molar de cianoboroidreto de sódio por um mol de sacarídeo ativado. WFI foi adicionado à mistura de reação a um alvo de 1% (v/v) e a mistura foi incubada durante mais de 40 horas a 23° ± 2°C.

Solução de boroidreto de sódio, 100 mg/ml (típico 1,8 - 2,2 equi45 valentes molares de boroidreto de sódio por mol sacarídeo ativado) e WFI (alvo 5% v/v) foram adicionados à reação e a mistura foi incubada por 3 - 6 horas a 23° ± 2°C. Este procedimento reduziu qualquer aldeído não-reagido presente nos sacarídeos. Depois a mistura de reação foi transferida para um tanque de diluição contendo 0,9% de cloreto de sódio a < 15°C.

ETAPA III: ULTRAFILTRAÇÂO DE 100 kDa

A mistura conjugada diluída foi filtrada através de um filtro de 1,2 pm e concentrado e diafiltrado em uma membrana de MWCO de 100 kDa com um mínimo de 15 volumes de 0,9% de cloreto de sódio (tampão de 0,01 M de fosfato de sódio /0,05 M de NaCI foi usado para sorotipo 23F). O permeado foi descartado. O retentato foi filtrado através de um filtro de 0,45 pm. Uma amostra de conteúdo de sacarídeo dentro do processo foi tirada neste estágio.

ETAPA IV: PURIFICAÇÃO DE COLUNA DE DEAE

Esta etapa foi apenas executada para sorotipo 23F.

A coluna de DEAE foi equilibrada com tampão de 0,01 M de fosfato de sódio/0,05 M de cloreto de sódio. O retentato filtrado (sorotipo 23F) foi carregado sobre a coluna e lavado com tampão de 0,01 M de fosfato de sódio/0,05 M de cloreto de sódio. A coluna foi depois lavada com tampão de 0,01 M de fosfato de sódio/0,9% de NaCI. O produto foi depois eluído com tampão de 0,01 M de fosfato de sódio/0,5 M de cloreto de sódio.

ETAPA V: ULTRAFILTRAÇÂO DE 100 kDa

O retentato de 6B e 19F foi concentrado e diafiltrado com pelo menos 30 volumes de 0,9% de cloreto de sódio. O permeado foi descartado.

O eluato de sorotipo 23F foi concentrado e diafiltrado com um mínimo de 20 volumes de 0,9% de cloreto de sódio. O permeado foi descartado.

ETAPA VI: FILTRAÇÃO ESTÉRIL

O retentato após a dialfiltração de MWCO de 100 kDa foi filtrado através de filtro de 0,22 pm. Controles dentro do processo (conteúdo de sacarídeo, proteína livre, sacarídeo livre, DMSO residual e cianeto residual) foram executados no produto filtrado. Controles dentro do processo foram executados no retentato filtrado para determinar se a concentração adicional, diafiltração e/ou diluição era(m) necessária(s) para satisfazer os alvos de FBC. Estes e testes adicionais foram repetidos nas amostras de FBC.

Por fim, o conjugado foi filtrado (0,22 pm) e enchido em potes de aço inoxidável de 10 L a uma quantidade de 2,64 g/pote. Neste estágio, rendimento, conteúdo de sacarídeo, conteúdo de proteína, pH, razão de sacarídeo:proteína e conteúdo de lisina foram executados como controles dentro do processo. Testagem de liberação (aparência, proteína livre, sacarídeo livre, endotoxina, determinação de tamanho molecular, cianeto residual, DMSO residual, identidade de sacarídeo e identidade de CRM197) foi executada neste estágio.

EXEMPLO 15

FORMULAÇÃO DE UMA VACINA DE CONJUGADO PNEUMOCÓCICO MULTIVALENTE

Os concentrados de volume final dos 13 conjugados contêm 0,85% de cloreto de sódio. Concentrados de volume do tipo 3, 6A, 7F e 19A também contêm 5 mM de tampão de succinato de sódio a pH 5,8. Os volumes requeridos de concentrados em volume foram calculados com base no volume de batelada e nas concentrações de sacarídeo em volume. Após 80% do cloreto de sódio a 0,85% (solução salina fisiológica) e a quantidade requerida de tampão de succinato terem sidos adicionados ao vaso de formulação pré-marcado, concentrados em volume foram adicionados. A preparação foi depois filtrada estéril através de uma membrana de 0,22 pm em um segundo recipiente usando uma unidade de filtra de membrana de Millipore Durapore. O primeiro recipiente foi lavado com os 20% restantes de cloreto de sódio a 0,85% e a solução foi passada através do mesmo filtro e colhida no segundo recipiente. O volume formulado foi suavemente misturado durante e seguindo a adição de fosfato de alumínio em volume. O pH foi verificado e ajustado se necessário. O produto de volume formulado foi armazenado a 2-8°C.

O produto de volume formulado foi enchido em seringas de vidro de borossilicato Tipo 1 obtidas de Becton Dickinson. A vacina foi monitorada em intervalos regulares para turvação para assegurar a uniformidade da operação de enchimento. A vacina enchida (Produto final) foi armazenada a 2-8°C.

EXEMPLO 16 - IMUNOGENICIDADE DA VACINA DE CONJUGADO 13VALENTE

Até agora, os estudos pré-clínicos executados na vacina de 13vPnC foram em coelhos. Estudos N⁹ HT01-0021 e N⁹ HT01-0036 foram elaborados independentemente para examinar o efeito da conjugação química de polissacarídeos capsulares (PSs) de S. pneumoniae para CRM197 e o efeito de adjuvante de fosfato de alumínio (ALPO4) na resposta imune para a vacina de 13vPnC em coelhos. Estes efeitos foram caracterizados por ELISA antígeno-específica para concentrações de IgG do soro e para função de anticorpo através de ensaio opsonofagocítico (OPA).

ESTUDO N⁹ ΗΤΌ1 -0021

Estudo N⁹ HT01-0021 examinou a habilidade da vacina de 13vPnC com adjuvante de ALPO4 para suscita respostas imunes sorotipoespecíficas da vacina. Os sorotipos pneumocócicos representados na vacina de 13vPnC incluem tipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C1 19A, 19F e 23F. Objetivos secundários incluíram uma avaliação da cinética e duração da resposta de anticorpo. Coelhos Brancos da Nova Zelândia foram imunizados intramuscularmente na semana 0 e semana 2 com a dose clínica humana planejada de cada polissacarídeo (2 pg de cada PS, exceto 4 pg de 6B) formulada com ou sem ALPO₄ (100 pg/dose). Soros foram colhidos em vários pontos de tempo. Sorotipo IgG específico foi medido por ELISA e atividade funcional foi avaliada por OPA.

Tabela 3 mostra a titulação de média geométrica (GMT) alcançada em amostras de soro agrupado, seguindo duas doses da vacina de 13vPnC. Uma razão do IgG GMTs foi usada para comparar àss respostas da semana 4 a semana 0. Estes dados demonstram que a inclusão de ALPO₄na formulação de 13vPnC suscita níveis mais altos de anticorpo de IgG em comparação à mesma vacina sem adjuvante. Embora as respostas de anticorpo tenham sido maiores quando ALPO4 foi incluído na formulação, estes aumentos não foram estatisticamente significativos.

Respostas de anticorpos funcionais foram também avaliadas em coelhos seguindo imunização com as duas formulações de 13vPnC (Tabela 4). Ao comparar as formulações de vacina com ou sem adjuvante, GMTs de OPA mais altos foram observados nos grupos de tratamento com vacina de 13vPnC + ALPO4. Titulações de OPA foram detectadas nos agrupamentos de soro da semana 4 em todos os sorotipos de vacina em ambos os grupos. Para a maioria dos sorotipos, titulações de OPA medidas na semana 4 foram pelo menos 4 vezes mais altas às na semana 0 (linha base).

As respostas cinéticas para cada um dos sorotipos de vacina de 13vPnC foram avaliadas de fundo geral de soro de ambos os grupos de tratamento. Titulações de IgG para cada sorotipo foram medidas de retiradas de sangue na semana 0 e semanas 1, 2, 3, 4, 8, 12, 26 e 39 e depois comparadas. Com a exceção do sorotipo 1, respostas de anticorpo em animais que recebem vacina com adjuvante foram superiores que aqueles que receberam vacina sem adjuvante e tiveram um pico na semana 2 do programa de imunização (dados não mostrados).

Geral, os dados indicam que a vacina de 13vPnC formulada com fosfato de alumínio que é imunogênico em coelhos, suscita respostas de anticorpo substanciais para os polissacarídeos capsulares pneumocócicos contidos na vacina e estas respostas estão associadas à atividade funcional. As respostas observadas nos sete sorotipos de núcleo seguindo imunização com 13vPnC + ALPO₄ são consistentes com as respostas históricas de coelhos para a formulação heptavalente.

TABELA 3

RESPOSTAS IMUNES DE IgG DE COELHO (GMTs) SEGUINDO IMUNIZAÇÃO COM DUAS DOSES DE GLICOCONJUGADO

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(11,987- (21,14141,914) 192,146)

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TABELA 4

GMTs DE OPA DE S. pneumoniae PARA FUNDOS GERAIS DE SORO DE COELHO DE NZW SEGUINDO IMUNIZAÇÃO COM DUAS DOSES DE GLICOCONJUGADO PNEUMOCÓCICO 13-VALENTE

Sorotipo	Semana 0	13vPnC^a Semana 4	Razão Semana4: SemanaO	13vPnC + ALPO₄ ^a Semana Semana Semana4: 0 4 SemanaO
1	<8	64	16	<8	64	16
3	<8	8	2	<8	16	4
4	<8	16	4	<8	32	8
5	<8	128	32	<8	512	128
6A	8	128	16	8	512	64
6B	<8	256	64	8	1,024	128
7F	8	64	8	8	128	16
9V	8	64	8	8	128	16
14	16	32	2	16	32	2
18C	8	256	32	<8	256	64
19A	<8	256	64	<8	1,024	256
19F	<8	128	32	<8	512	128
23F	8	64	8	<8	256	64

A: Fundos gerais consistiram em volumes iguais de soro de coelhos individuais dentro de um grupo de tratamento (n = 12)

ESTUDO N^{5 * * * 9 10 * * * * 15} HT01 -0036

Estudo N⁹ HT01-0036 comparou respostas imunes de coelho para os polissacarídeos (PSs) contidos na vacina, após imunização com a vacina de 13vPnC com ou sem conjugação com a proteína de CRM197. Coelhos Brancos da Nova Zelândia foram imunizados intramuscularmente na semana 0 e semana 2 com uma dose de 2,2 pg de cada PS (exceto 4,4 pg de 6B). Animais receberam uma das três preparações de vacina: (a) 13vPnC (PS diretamente conjugado com CRM197), (b) 13vPnPS, (PS livre) ou (c)

13vPnPS + CRM₁₉₇ (PS livre misturado com CRM197). Todas as preparações de vacina continham ALPO4 como o adjuvante a 125 pg/dose.

Respostas imunes sorotipo-específicas foram avaliadas para todas as preparações de vacina em um ELISA de IgG e OPA mediado por complemento medindo anticorpo funcional. As respostas imunes foram comparadas entre os grupos de tratamento.

Tabela 5 apresenta dados de GMT obtidos de sangramento da semana 4 analisado em ELISAs IgG antígeno-específicas. Análises adicionais mostram a razão de valores de GMT na semana 4 a semana 0. Os dados indicam que a preparação de vacina de conjugado suscita titulações de IgG de soro maiores que vacina de PS livre ou PS livre + CRM197. Com a exceção de S. pneumoniae tipo 14, a vacina de 13vPnC pôde induzir anti10 corpos funcionais para cepas representativas de S. pneumoniae em um OPA (Tabela 6). Após duas imunizações com vacina de 13vPnPS ou 13vPnPS + CRM197, nenhuma pôde induzir titulações de OPA £ 8 vezes na semana 4 com relação à semana 0 para 10 dos 13 sorotipos medidos (Tabela 6).

Em conclusão, estes resultados indicam que conjugação dos 15 polissacarídeos de vacina pneumocócica de 13-valente produz titulações de IgG de soro mais altas e maior atividade de anticorpo funcional geral que visto sozinho com polissacarídeo livre ou misturado com CRM₁₉₇ nãoconjugado.

TABELA 5

RESPOSTAS DE IGG EM COELHO (GMTS) PARA PNPS POR ELISA SEGUINDO IMUNIZAÇÃO COM DUAS DOSES DE

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Tabela 5 (continuação)

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TABELA 6

TITULAÇÕES DE OPA DE S. pneumoniae PARA FUNDOS GERAIS DE SORO DE COELHO SEGUINDO IMUNIZAÇÃO COM DUAS DOSES DE VACINAS PNEUMOCÓCICA DE 13-VALENTE

	Titulações de OPA
Nenhum T ratame nto	13vPnPS (PS livre)	13vPnPS + CRM197 (PS livre misturado com CRM197)	13vPnC
Sorotipo	Semana 0^a	Semana 4	Razão Semana4: Se- manaO	Semana 4	Razão Semana4: Se- manaO	Semana 4	Razão Semana4: Se- manaO
1	4	16	4	16	4	8	32
3	4	4	1	4	1	4	8
4	4	4	1	4	1	4	64
5	4	32	8	16	4	16	64
6A	8	64	8	32	4	32	664
6B	8	64	8	32	4	32	32
7F	16	32	2	16	1	16	16
9V	16	16	1	32	2	32	8
14	16	16	1	16	1	16	2
18C	4	16	4	16	4	8	64
19A	8	8	1	8	1	16	64
19F	4	4	1	4	1	8	64
23F	16	32	2	16	1	32	32

^a Usado como valores da Semana 0 para todos os grupos

Deveria ser entendido que o debate anterior e exemplos meramente apresentam uma descrição detalhada de certas modalidades. Deveria ser portanto evidente àqueles versados na técnica que várias modificações e equivalentes podem ser feitas sem divergir do espírito e escopo da invenção. 10 Todos os artigos de jornal, outras referências, patentes e pedidos de patente que são identificados neste pedido de patente são aqui incorporados por referência em sua totalidade.

LISTAGEM DE REFERÊNCIAS

1. Hausdorff WP, Bryant J, Paradiso PR, Siber GR. Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, parte I. Clin Infect Dis 2000; 30: 100-21.

2. Hausdorff WP, Bryant J, Kloek C, Paradiso PR, Siber GR. The contribution of specific pneumococcal serogroups to different disease manifestations: implications for conjugate vaccine formulation and use, parte I. Clin Infect Dis 2000; 30:122-40.

3. Whitney CG, Farley MM, Hadler J, et al. Decline in invasive pneumococcal disease after the introduction of protein-polysaccharide conjugate vaccine. New Engl J Med 2003; 348(18): 1737-46.

4. Black S, Shinefield H, Hansen J, et al. Postlicensure evaluation of the effectiveness of seven valent pneumococcal conjugate vaccine. Pediatr Infect Dis J 2001 ; 20; 1105-7.

5. Robinson KA, Baughman W, Rothrock G, et al. Epidemiology of invasive Streptococcus pneumoniae infections in the United States, 19951998: Opportunities for prevention in the conjugate vaccine era. JAMA 2001; 285:1729-35.

6. Butler J, Breiman R, Lipman H, et al. Serotype distribution of Streptococcus pneumoniae infections among preschool children in the United States, 1978- 1994. J Infect Dis 1995; 171 :885-9.

7. Whitney CG, Farley MM, Hadler J, et al. Increasing prevalence of multidrug-resistant Streptococcus pneumoniae in the United States. N Engl J Med 2000; 343:1917-24.

8. Hofmann J, Cetron MS, Farley MM, et al. The prevalence of drugresistant Streptococcus pneumoniae in Atlanta. N Engl J Med 1995; 333:481-6.

9. Joloba ML, Windau A, Bajaksouzian S, Appelbaum PC Hausdorff WP, Jacobs MR. Pneumococcal conjugate vaccine serotypes of Streptococcus pneumoniae isolates and the antimicrobial susceptibility of such isolates in children with otitis media. Clin Infect Dis 2001 ; 33:1489-94.

10. Black S, Shinefield H, Fireman B, et al. Efficacy, safety, and immuno genicity of heptavalent pneumococcal conjugate vaccine in children. Pediatr Infect Dis J 2000; 19:187-95.

11. Rudolph KM, Parkinson AJ, Reasonover AL, Bulkow LR, Parks DJ, Butler JC. Serotype distribution and antimicrobial resistance pattenrs of invasive isolates of Streptococcus pneumoniae: Alaska, 1991 -1998. J Infect Dis 2000; 182:490-6.

12. Sniadack DH, Schwartz B, Lipman H, et al. Potential interventions for the prevention of childhood pneumonia: geographic and temporal differences in serotype and serogroup distribution of sterile site pneumococcal isolates from children: implications for vaccine strategies. Pediatr Infect Dis J 1995; 14:503-10.

13. Fagan RL, Hanna JN, Messer RD, Brookes DL, Murphy DM. The epidemiology of invasive pneumococcal disease in children in Far North Queensland. J. Paediatr Child Health 2001; 37:571-5.

14. Kertesz DA, Di Fabio JL, de Cunto Brandileone MC, et al. Invasive Streptococcus pneumoniae infection in Latin American children: results of the Pan American Health Organization Surveillance Study. Clin Infect Dis 1998; 26:1355-61.

15. Hausdorff W, Siber G, Paradiso P. Geographical differences in invasive pneumococcal disease rates and serotype frequency in young children. Lancet 2001; 357:950-52.

16. Buckingham SC, King MD, Miller ML. Incidence and etiologies of complicated parapneumonic effusions in children, 1996 to 2001. Pediatr Infect Dis J 2003;22:499-504.

17. Byington Ci Spencer L, Johnson T, et al. An epidemiological investigation of a sustained high rate of pediatric parapneumonic empyema: risk factors and microbiological associations. Clin Infect Dis 2002; 34:43440.

18. Tan T, Mason E, Wald E, et al. Clinical characteristics with complicated pneumonia caused by Streptococcus pneumoniae. Pediatrics 2002; 110:1-6.

19. Block SL, Hedrick J, Harrison CJ, et al. Pneumococcal serotypes from acute otitis media in rural Kentucky. Pediatr Infect Dis J 2002; 21 :85965.

20. Hausdorff WP, Yothers G, Dagan R, et al. Multinational study of pneumococcal serotypes causing acute otitis media in children. Pediatr Infect Dis J 2002; 21 :1008-16.

21. Robbins JB, Austrian R, Lee CJ, et al. Considerations for formulating the second-generation pneumococcal capsular polysaccharide vaccine with emphasis on the cross-reactive types within groups. J Infect Dis 1983;148:1136-59.

22. Nahm MH, Olander JV, Magyarlaki M. Identification of cross-reactive antibodies with low opsonophagocytic activity for Streptococcus pneumoniae. J Infect Dis 1997; 176:698-703.

23. Yu X, Gray B, Chang S, Ward JI, Edwards KM, Nahm MH. Immunity to cross- reactive serotypes induced by pneumococcal conjugate vaccines in infants. J Infect Dis 1999; 180: 1569-76.

24. Vakevainen M, Eklund C, Eskola J, Kayhty H. Cross-reactivity of antibodies to type 6B and 6A polysaccharides of Streptococcus pneumoniae, evoked by pneumococcal conjugate vaccines, in infants. J Infect Dis 2001;184:789-93.

25. Ekstrom N, Kilpi T, Lahdenkari Mi Lehtonen Hi Ahman H, Kayhty, H. Immune response to cross-reacting pneumococcal serotypes 6A/6B and 19A/19F in the FinOM vaccine trial, Third World of Congress of Pediatric Infectious Diseases, Santiago, Chile, 19-23 de novembro de 2003.

26. Penn RL, Lewin EB, Douglas RG, Jr., Schiffman G, Lee CJ, Robbins JB. Antibody responses in adult volunteers to pneumococcal polysaccharide types 19F and 19A administered singly and in combination. Infeet Immun 1982; 36:1261-2.

27. Giebink GS, Meier JD, Quartey MK, Liebeler CL1 Le CT. Immunogenicity and efficacy of Streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugate vaccines against homologous and heterologous serotypes in the chinchilla otitis media model. J Infect Dis 1996; 173:119-27.

28. Saeland E, Jakobsen H, Ingolfsdottir G, Sigurdardottir ST, Jonsdottir I. Serum samples from infants vaccinated with a pneumococcal conjugate vaccine, PncT, protect mice against invasive infection caused by Streptococcus pneumoniae serotypes 6A and 6B. J Infect Dis 2001; 183:25360.

29. Jakobsen H, Sigurdsson VD, Sigurdardottir S, Schulz D, Jonsdottir I. Pneumococcal serotype 19F conjugate vaccine induces crossprotective immunity in serotype 19A in a murine pneumococcal pneumonia model. Infect Immun 2003; 71:2956-9.

30. Klugman KP, Madhi SA, Huebner RE, Kohberger R, Mbelle N, Pierce

N. A trial of a 9-valent pneumococcal conjugate vaccine in children with and those without HIV infection. N Engl J Med 2003; 349:1341-8.

31. O’Brien KL, Moulton LH, Reid R, et al. Efficacy and safety of sevenvalent conjugate pneumococcal vaccine in American Indian children: group randomised trial. Lancet 2003; 362:355-61.

32. Eskola J, Kilpi T, Palmu A, et al. Efficacy of a pneumococcal conjugate vaccine against acute otitis media. N Engl J Med 2001 : 344:403-9.

33. Pilishvili T, Farley M, Vazquez M, Reingold A, Nyquist A, et al. Effectiveness of heptavalent pneumococcal conjugate vaccine in children. Res. G-1Q79, ICAAC, Chicago, IL, 2003.

34. Patente U. S. N² 4.673.574.

35. Patente U. S. N⁹ 4.902.506.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição imunogêniça multivalente, caracterizada pelo fato de que compreende: 13 conjugados de polissacarídeo-proteína distintos, junto com um veículo fisiologicamente aceitável, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo capsular de um sorotipo diferente de Streptococcus pneumoniae conjugado com uma proteína-veículo, e os polissacarídeos capsulares são preparados a partir dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19Fe23F.

2. Composição imunogêniça de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína-veículo é CRM197.

3. Composição imunogêniça de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que adicionalmente compreende um adjuvante.

4. Composição imunogêniça de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é um adjuvante com base em alumínio.

5. Composição imunogêniça de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é selecionado do grupo que consiste em fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio.

6. Composição imunogêniça de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é fosfato de alumínio.

7. Método de induzir uma resposta imune a um conjugado de polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um ser humano uma quantidade imunologicamente eficaz da composição imunogêniça como definida na reivindicação 1.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a composição imunogêniça administrada é uma dose única de 0,5 ml formulada para conter: 2 pg de cada sacarídeo, com exceção de 6B a 4 pg; aproximadamente 29 pg de proteína-veículo de CRM197; 0,125 mg de adjuvante de alumínio elementar (0,5 mg de fosfato de alumínio); e tampão de cloreto de sódio e de succinato de sódio como excipientes.

9. Composição imunogêniça multivalente, caracterizada pelo fato de que compreende conjugados de polissacarídeo-proteína junto com um veículo fisiologicamente aceitável, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo capsular de um sorotipo diferente de Streptococcus pneumoniae conjugado com uma proteína-veículo, e os polissacarídeos capsulares são preparados a partir do sorotipo 3 e pelo menos um sorotipo adicional.

10. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o sorotipo adicional é selecionado do grupo que consiste nos sorotipos 1,4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, e23F.

11. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a proteína-veículo é CRM197.

12. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que adicionalmente compreende um adjuvante.

13. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é um adjuvante baseado em alumínio.

14. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é selecionado do grupo que consiste em fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio.

15. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é fosfato de alumínio.

16. Método de induzir uma resposta imune a um conjugado de polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um ser humano uma quantidade imunologicamente eficaz da composição imunogênica como definida na reivindicação 9.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a composição imunogênica administrada é uma dose única de 0,5 ml formulada para conter: 2 pg de cada sacarídeo, com exceção de 6B a 4 pg; aproximadamente 29 pg de proteína-veículo de CRM197; 0,125 mg de adjuvante de alumínio elementar (0,5 mg de fosfato de alumínio); e tampão de cloreto de sódio e de succinato de sódio como excipientes.

18. Composição imunogênica multivalente, caracterizada pelo fato de que compreende conjugados de polissacarídeo-proteína junto com um veículo fisiologicamente aceitável, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo capsular de um sorotipo diferente de Strep-

5 tococcus pneumoniae conjugado com uma proteína-veículo, e os polissacarídeos capsulares são preparados a partir dos sorotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F e pelo menos um sorotipo adicional.

19. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o dito sorotipo adicional é selecionado do

10 grupo que consiste nos sorotipos 1,3, 5, 6A, 7F, e 19A.

. 20. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a proteína-veículo é CRM197.

' 21. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que adicionalmente compreende um adjuvante.

15 22. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é um adjuvante baseado em alumínio.

23. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é selecionado do grupo que con-

20 siste em fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio.

24. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é fosfato de alumínio.

25. Método de induzir uma resposta imune para um conjugado de polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae, caracterizado

25 pelo fato de que compreende administrar a um ser humano uma quantidade imunologicamente eficaz da composição imunogênica como definida na reivindicação 18.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a composição imunogênica administrada é uma dose única de

30 0,5 ml formulada para conter: 2 pg de cada sacarídeo, com exceção de 6B a

4 pg; aproximadamente 29 pg de proteína-veículo de CRM197; 0,125 mg de adjuvante de alumínio elementar (0,5 mg de fosfato de alumínio); e tampão