JP2006525330A - 髄膜炎菌性疾患の予防および処置のための新規免疫原性組成物 - Google Patents

髄膜炎菌性疾患の予防および処置のための新規免疫原性組成物 Download PDF

Info

Publication number
JP2006525330A
JP2006525330A JP2006513095A JP2006513095A JP2006525330A JP 2006525330 A JP2006525330 A JP 2006525330A JP 2006513095 A JP2006513095 A JP 2006513095A JP 2006513095 A JP2006513095 A JP 2006513095A JP 2006525330 A JP2006525330 A JP 2006525330A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
protein
seq
composition
amino acid
acid sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2006513095A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2006525330A5 (ja
Inventor
ズロットニック，ゲイリー・ダブリュー
フレッチヤー，リー・ディー
ファーレー，ジョン
バーンフィールド，リーセル・エイ
ザガースキー，ロバート・ジェイ
メットカーフ，ベンジャミン・ジェイ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wyeth Holdings LLC
Original Assignee
Wyeth Holdings LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wyeth Holdings LLC filed Critical Wyeth Holdings LLC
Publication of JP2006525330A publication Critical patent/JP2006525330A/ja
Publication of JP2006525330A5 publication Critical patent/JP2006525330A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/095—Neisseria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本発明は、ナイセリアＯＲＦ２０８６タンパク質、髄膜炎菌株から単離するか、または組換えにより作製することができる交差反応性免疫原性タンパク質（その免疫原性部分、その生物学的等価物を含む）、上記のものに免疫特異的に結合する抗体、および上記のそれぞれをコードする核酸配列、ならびにナイセリア メニンギティディス セログループＢによる感染に対して有効な免疫原性組成物におけるその使用に関する。

Description

発明が属する技術分野
本発明はたとえばナイセリア メニンギティディス（Neisseria meningitidis）セログループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｗ−１３５、Ｘ、Ｙ、Ｚおよび２９Ｅ）、ナイセリア ゴノロエ（Neisseria gonorrhoeae）、およびナイセリア ラクタミカ（Neisseria lactamica）の菌株を含むナイセリア種の菌株から単離することができるナイセリアＯＲＦ２０８６タンパク質（サブファミリーＡおよびサブファミリーＢ）、および上記タンパク質の免疫原性部分および／または生物学的等価物に関する。本発明はまた、上記タンパク質、免疫原性部分および／または生物学的等価物に免疫特異的に結合する抗体に関する。さらに、本発明は上記タンパク質、免疫原性部分、生物学的等価物および／または抗体のいずれかをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドに関する。さらに、本発明は免疫原性組成物、およびナイセリア メニンギティディスによって引き起こされる髄膜炎菌感染症、とりわけナイセリア メニンギティディス セログループＢによって引き起こされる髄膜炎菌性疾患の予防、処置および／または診断におけるそれらの使用、ならびに前記組成物の製造方法に関する。本発明は組み換え型および天然の供与源から単離された型の両方、ならびに脂質化および非脂質化型の両方に関する。
発明の背景
髄膜炎菌性髄膜炎は抗生物質の有効性にかかわらず、数時間以内に小児および青少年を死に到らせることが可能な、破壊的な疾患である。Pizza et al., 2000, Science 287:1816-1820。髄膜炎は髄膜の炎症と見なされ、強い頭痛、発熱、食欲不振、光および音に対する不耐性、筋、とりわけ頸部の硬直、ならびに重症の場合、痙攣、嘔吐および譫妄を引き起こし、死に到らす。髄膜炎菌性髄膜炎の症状は突然出現し、結果的に特徴的な出血性発疹を伴った髄膜炎菌性敗血症になる。もしどんな生存の可能性でもあれば、速やかな診断と大量の抗生物質による迅速な処置が重要である。2000. Bantam Medical Dictionary、 3版 302。
髄膜炎菌性髄膜炎はグラム陰性、きょう膜形成菌であるナイセリア メニンギティディス（髄膜炎菌）により引き起こされ、該菌はＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｗ−１３５、Ｘ、Ｙ、Ｚおよび２９Ｅを含むいくつかの病原性セログループに分類されている。Ｎ．メニンギティディスのセログループＢ株は世界中の髄膜炎菌性髄膜炎の主要な原因である。たとえば、医学文献では米国およびヨーロッパに居住する幼児および小児ではセログループＢが細菌性髄膜炎の約５０％に関与することを報告している。現在、Ｎ．メニンギティディス セログループＢにより引き起こされる髄膜炎菌性髄膜炎を予防するためのワクチンは存在しない。
３０年以上前のＧｏｌｄｓｃｈｎｅｉｄｅｒらの研究以来、セログループＢ髄膜炎菌性疾患の予防のための免疫原性組成物の開発は研究者にとって難題であり続けている。Goldschneider et al., 1969, J.Exp.Med. 129(6):1307-26; Goldschneider et al., 1969, J.Exp.Med. 129(6):1327-48; Gotschlich et al., 1969, J.Exp.Med. 129(6):1385-95; およびGotschlich et al., 1969, J.Exp.Med. 129(6):1367-84。第二次世界大戦以後実質的に北米から消失したセログループＡ疾患（Achtman,M., 1995, Trends in Microbiology 3(5):186-92）とは異なり、セログループＢおよびＣ生物により引き起こされる疾患は経済的に発展した世界の大部分にわたって依然として風土病である。疾患の発生率は、風土病がまれな地域の＜１／１００，０００〜流行中の高リスク集団の２００／１００，０００まで変化する。
多糖接合体に基づいたワクチンがＮ．メニンギティディス セログループＡおよびＣに対して開発されていて、疾患の予防に効果的であると考えられる。現在、セログループＡ、Ｃ、Ｙ、＆Ｗ−１３５由来のきょう膜多糖から作製された免疫原性組成物が利用可能である。Ambrosch et al., 1983, Immunogenicity and side-effects of a new tetravalent. Bulletin of the World Health Organization 61(2):317-23．しかし、この免疫原性組成物はＴ細胞非依存的免疫反応を引き起こし、小児には効果的でなく、そして髄膜炎菌性疾患の５０％以上を引き起こす、セログループＢ株には適用範囲が及ばない。
他の研究者らもきょう膜多糖を使用した免疫原性組成物の開発を試みてきた。最近、セログループＣきょう膜物質をタンパク質に接合することによって製造されたセログループＣ疾患のための免疫原性組成物が欧州での使用に関して認可されている。しかし、セログループＢきょう膜はワクチン候補として不適切な可能性がある。なぜなら、きょう膜多糖は成長中のヒト神経組織の炭水化物部分に類似性を有するポリシアル酸によって構成されるからである。この糖部分は自己抗原として認識され、したがってヒトでは免疫原性に乏しい。
外膜タンパク質（ＯＭＰ）が、代わりとなるセログループＢ疾患のワクチン抗原として開発されてきた。ＰｏｒＡの２種の可変領域に結合するモノクローナル抗体は髄膜炎菌のセロサブタイプ判別スキームを説明する。ＰｏｒＡタンパク質はしたがって、髄膜炎菌株のセロサブタイプ判別抗原として役立ち（Abdillahi et al., 1988, Microbial Pathogenesis 4(1):27-32）、セログループＢ免疫原性組成物の成分として活発に研究されている（Poolman, 1996, Adv.Exp.Med.Biol. 397:73-7）。なぜなら、それらは殺菌抗体を誘導することができるからである（Saukkonen, 1987, Microbial Pathogenesis 3(4):261-7）。殺菌抗体は保護の指標であると考えられ、任意の免疫原性組成物候補はこれらの機能的抗体を誘導すべきである。
ヒトおよび動物における研究は、セロサブタイプ判別抗原、ＰｏｒＡが殺菌抗体を誘導することを示唆する。しかし、ＰｏｒＡに対する免疫反応は一般にセロサブタイプ特異的である。とりわけ、セロサブタイプ判別データは、ＰｏｒＡから作製される免疫原性組成物はそのような免疫原性組成物の適用を受けるには、それぞれのセロサブタイプに関して、ＰｏｒＡをおそらく６〜９必要とするかもしれないことを示唆する。したがって、セログループＢ菌株の７０〜８０％に適用するためには６〜９のＰｏｒＡが必要であろう。したがって、このタンパク質の変わりやすい性質は、十分な数の髄膜炎菌セロサブタイプ臨床分離菌から保護するために、多価ワクチン組成物を必要とする。
セログループＢ髄膜炎菌の免疫原性組成物を開発することは非常に困難であったので、最近いくつかのグループが新規免疫原性組成物候補の同定を促進するためにセログループＡおよびＢ両方に相当する株由来のゲノム配列を決定している。Tettelin, 2000, Science, 287(5459):1809-15; Pizza et al., 2000, Science 287:1816-1820。髄膜炎菌ゲノムの情報があっても、新規免疫原性組成物候補の同定は困難な手順であり、そのための適切な数学的アルゴリズムは現在存在しない。実際、最近の報告は理論上の膜貫通ドメインを含む数百のオープンリーディングフレーム（“ＯＲＦ”）を同定していても、発現、精製、および表面反応性で機能的に活性な抗体を誘導することが困難なため、研究者はわずか７種のセログループＢ髄膜炎菌免疫原性組成物の候補しか見出していない。同書参照。これらの１種は以前に公知であった。
したがって、（１）複数の髄膜炎菌株に対する殺菌抗体を誘導する；（２）複数の菌株の表面と反応する；（３）生菌攻撃に対して受動的に保護する；および／または（４）コロニー化を妨げる；免疫原性組成物の必要性が依然として存在する。
発明の概要
これらおよびその他の必要性に応じるため、およびその目的のために、本発明は２０８６サブファミリーＡタンパク質および２０８６サブファミリーＢタンパク質を含む、ナイセリアＯＲＦ２０８６タンパク質（“２０８６タンパク質”）を提供する。２０８６タンパク質のそれぞれはナイセリア メニンギティディス（セログループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｗ−１３５、Ｘ、Ｙ、Ｚおよび２９Ｅ）、ナイセリア ゴノロエ、およびナイセリア ラクタミカの菌株を含む、天然のナイセリア菌株から単離することができるタンパク質である。２０８６タンパク質は組換え技術を使用して製造してもよい。
とりわけ、本発明は２０８６タンパク質、その免疫原性部分、および／またはその生物学的等価物、上記のいずれかに免疫特異的に結合する抗体、ならびに上記のいずれかをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明は組成物、髄膜炎菌感染症、およびとりわけＮ．メニンギティディスにより引き起こされる髄膜炎菌性疾患の予防、処置および／または診断におけるそれらの使用、および上記組成物を製造する方法に関する。本明細書に記載の２０８６タンパク質は、組み換え型および天然の供与源から単離された型、ならびに脂質化および非脂質化型に関する。
本発明は予想外に、そして好都合には：（１）Ｎ．メニンギティディス、Ｎ．ゴノロエ、および／またはＮ．ラクタミカの菌株のような複数のナイセリア菌株に対する殺菌抗体を誘導する；（２）複数の菌株の表面と反応する；（３）生菌攻撃に対して受動的保護を与える；および／または（４）コロニー形成を妨げる；組成物、ならびに上記組成物を使用する方法および上記組成物を製造する方法を提供する。本発明の種々の態様は以下に記載される。
配列概要
調べた配列のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ 天然のリーダー配列に結合した場合のＬ３ ６２７５菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ 天然のリーダー配列を使用して作製したＬ３ ６２７５菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＬ３ ６２７５菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ Ｐ４リーダー配列を使用して調製したＬ３ ６２７５菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５ Ｌ３ ６２７５菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６ Ｌ３ ６２７５菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７ 天然のリーダー配列に結合した場合のＣＤＣ２３６９菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８ 天然のリーダー配列を使用して調製したＣＤＣ２３６９菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＣＤＣ２３６９菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０ Ｐ４リーダー配列を使用して調製したＣＤＣ２３６９菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１ ＣＤＣ２３６９菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２ ＣＤＣ２３６９菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３ 天然のリーダー配列に結合した場合のＣＤＣ１０３４菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４ 天然のリーダー配列を使用して作製したＣＤＣ１０３４菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＣＤＣ１０３４菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＣＤＣ１０３４菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７ ＣＤＣ１０３４菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８ ＣＤＣ１０３４菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９ 天然のリーダー配列に結合した場合のＬ４ ８９１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０ 天然のリーダー配列を使用して作製したＬ４ ８９１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＬ４ ８９１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＬ４ ８９１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３ Ｌ４ ８９１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４ Ｌ４ ８９１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５ 天然のリーダー配列に結合した場合のＢ１６Ｂ６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６ 天然のリーダー配列を使用して作製したＢ１６Ｂ６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＢ１６Ｂ６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＢ１６Ｂ６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９ Ｂ１６Ｂ６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０ Ｂ１６Ｂ６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１ 天然のリーダー配列に結合した場合のＷ１３５（ＡＴＣＣ３５５５９）菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２ 天然のリーダー配列を使用して作製したＷ１３５（ＡＴＣＣ３５５５９）菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＷ１３５（ＡＴＣＣ３５５５９）菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＷ１３５（ＡＴＣＣ３５５５９）菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５ Ｗ１３５（ＡＴＣＣ３５５５９）菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６ Ｗ１３５（ＡＴＣＣ３５５５９）菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７ 天然のリーダー配列に結合した場合のＣ１１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８ 天然のリーダー配列を使用して作製したＣ１１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＣ１１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＣ１１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１ Ｃ１１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２ Ｃ１１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３ 天然のリーダー配列に結合した場合のＹ（ＡＴＣＣ３５５６１）菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４ 天然のリーダー配列を使用して作製したＹ（ＡＴＣＣ３５５６１）菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＹ（ＡＴＣＣ３５５６１）菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＹ（ＡＴＣＣ３５５６１）菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７ Ｙ（ＡＴＣＣ３５５６１）菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８ Ｙ（ＡＴＣＣ３５５６１）菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９ 天然のリーダー配列に結合した場合のＭ９８ ２５０７３２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０ 天然のリーダー配列を使用して作製したＭ９８ ２５０７３２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＭ９８ ２５０７３２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＭ９８ ２５０７３２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３ Ｍ９８ ２５０７３２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４ Ｍ９８ ２５０７３２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５ 天然のリーダー配列に結合した場合のＭ９８ ２５０７７１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６ 天然のリーダー配列を使用して作製したＭ９８ ２５０７７１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＭ９８ ２５０７７１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＭ９８ ２５０７７１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９ Ｍ９８ ２５０７７１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０ Ｍ９８ ２５０７７１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１ 天然のリーダー配列に結合した場合のＣＤＣ１１３５菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２ 天然のリーダー配列を使用して作製したＣＤＣ１１３５菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＣＤＣ１１３５菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＣＤＣ１１３５菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５ ＣＤＣ１１３５菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６ ＣＤＣ１１３５菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７ 天然のリーダー配列に結合した場合のＭ９７ ２５２１５３菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８ 天然のリーダー配列を使用して作製したＭ９７ ２５２１５３菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＭ９７ ２５２１５３菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＭ９７ ２５２１５３菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１ Ｍ９７ ２５２１５３菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２ Ｍ９７ ２５２１５３菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３ 天然のリーダー配列に結合した場合のＣＤＣ１６１０菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４ 天然のリーダー配列を使用して作製したＣＤＣ１６１０菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＣＤＣ１６１０菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＣＤＣ１６１０菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７ ＣＤＣ１６１０菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８ ＣＤＣ１６１０菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９ 天然のリーダー配列に結合した場合のＣＤＣ１４９２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０ 天然のリーダー配列を使用して作製したＣＤＣ１４９２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＣＤＣ１４９２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＣＤＣ１４９２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３ ＣＤＣ１４９２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４ ＣＤＣ１４９２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５ 天然のリーダー配列に結合した場合のＬ８Ｍ９７８菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６ 天然のリーダー配列を使用して作製したＬ８Ｍ９７８菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＬ８Ｍ９７８菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＬ８Ｍ９７８菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９ Ｌ８Ｍ９７８菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０ Ｌ８Ｍ９７８菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１ 天然のリーダー配列に結合した場合のＭ９７ ２５２９８８菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２ 天然のリーダー配列を使用して作製したＭ９７ ２５２９８８菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＭ９７ ２５２９８８菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＭ９７ ２５２９８８菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５ Ｍ９７ ２５２９８８菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６ Ｍ９７ ２５２９８８菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７ 天然のリーダー配列に結合した場合のＭ９７ ２５２６９７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８ 天然のリーダー配列を使用して作製したＭ９７ ２５２６９７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＭ９７ ２５２６９７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＭ９７ ２５２６９７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１ Ｍ９７ ２５２６９７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２ Ｍ９７ ２５２６９７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３ 天然のリーダー配列に結合した場合の６５５７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４ 天然のリーダー配列を使用して作製した６５５７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５ Ｐ４リーダー配列に結合した場合の６５５７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６ Ｐ４リーダー配列を使用して作製した６５５７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７ ６５５７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８ ６５５７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９ 天然のリーダー配列に結合した場合の２９９６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０ 天然のリーダー配列を使用して作製した２９９６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１ Ｐ４リーダー配列に結合した場合の２９９６株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２ Ｐ４リーダー配列を使用して作製した２９９６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３ ２９９６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４ ２９９６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５ 天然のリーダー配列に結合した場合のＭ９７ ２５２９７６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６ 天然のリーダー配列を使用して作製したＭ９７ ２５２９７６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＭ９７ ２５２９７６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＭ９７ ２５２９７６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９ Ｍ９７ ２５２９７６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０ Ｍ９７ ２５２９７６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１ 天然のリーダー配列に結合した場合のＭ９７ ２５１８５４菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２ 天然のリーダー配列を使用して作製したＭ９７ ２５１８５４菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＭ９７ ２５１８５４菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＭ９７ ２５１８５４菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５ Ｍ９７ ２５１８５４菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６ Ｍ９７ ２５１８５４菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７ 天然のリーダー配列に結合した場合のＣＤＣ１５２１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２８ 天然のリーダー配列を使用して作製したＣＤＣ１５２１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２９ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＣＤＣ１５２１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＣＤＣ１５２１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１ ＣＤＣ１５２１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３２ ＣＤＣ１５２１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３ 天然のリーダー配列に結合した場合のＭ９８ ２５０６２２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４ 天然のリーダー配列を使用して作製したＭ９８ ２５０６２２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３５ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＭ９８ ２５０６２２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＭ９８ ２５０６２２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７ Ｍ９８ ２５０６２２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８ Ｍ９８ ２５０６２２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９ 天然のリーダー配列に結合した場合の８７０４４６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０ 天然のリーダー配列を使用して作製した８７０４４６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１ Ｐ４リーダー配列に結合した場合の８７０４４６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２ Ｐ４リーダー配列を使用して作製した８７０４４６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３ ８７０４４６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４４ ８７０４４６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５ 天然のリーダー配列に結合した場合のＭ９７ ２５３２４８菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４６ 天然のリーダー配列を使用して作製したＭ９７ ２５３２４８菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４７ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＭ９７ ２５３２４８菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＭ９７ ２５３２４８菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９ Ｍ９７ ２５３２４８菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５０ Ｍ９７ ２５３２４８菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５１ 天然のリーダー配列に結合した場合のＭ９８ ２５０８０９菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５２ 天然のリーダー配列を使用して作製したＭ９８ ２５０８０９菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５３ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＭ９８ ２５０８０９菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５４ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＭ９８ ２５０８０９菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５ Ｍ９８ ２５０８０９菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５６ Ｍ９８ ２５０８０９菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５７ 天然のリーダー配列に結合した場合のＬ５Ｍ９８１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５８ 天然のリーダー配列を使用して作製したＬ５Ｍ９８１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５９ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＬ５Ｍ９８１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６０ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＬ５Ｍ９８１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６１ Ｌ５Ｍ９８１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６２ Ｌ５Ｍ９８１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６３ 天然のリーダー配列に結合した場合のＮＭＢ菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６４ 天然のリーダー配列を使用して作製したＮＭＢ菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６５ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＮＭＢ菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６６ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＮＭＢ菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６７ ＮＭＢ菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６８ ＮＭＢ菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６９ 天然のリーダー配列に結合した場合のＭ９８ ２５０５７２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７０ 天然のリーダー配列を使用して作製したＭ９８ ２５０５７２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７１ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＭ９８ ２５０５７２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７２ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＭ９８ ２５０５７２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７３ Ｍ９８ ２５０５７２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７４ Ｍ９８ ２５０５７２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７５ 天然のリーダー配列に結合した場合のＡ４ Ｓａｎｆｏｒｄ；Ｍ９７ ２５１８３６ ＰＡＲＴ；Ｍ９７ ２５１９５７；Ｍ９７ ２５１９８５；Ｍ９７ ２５２０６０；Ｍ９７ ２５１８７０；Ｍ９７ ２５１９９４；Ｍ９８ ２５００２４；Ｍ９７ ２５１９０５；Ｍ９７ ２５１８７６；Ｍ９７ ２５１８９８；またはＭ９７ ２５１８３０菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７６ 天然のリーダー配列を使用して作製したＡ４ Ｓａｎｆｏｒｄ；Ｍ９７ ２５１８３６ ＰＡＲＴ；Ｍ９７ ２５１９５７；Ｍ９７ ２５１９８５；Ｍ９７ ２５２０６０；Ｍ９７ ２５１８７０；Ｍ９７ ２５１９９４；Ｍ９８ ２５００２４；Ｍ９７ ２５１９０５；Ｍ９７ ２５１８７６；Ｍ９７ ２５１８９８；またはＭ９７ ２５１８３０菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７７ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＡ４ Ｓａｎｆｏｒｄ；Ｍ９７ ２５１８３６ ＰＡＲＴ；Ｍ９７ ２５１９５７；Ｍ９７ ２５１９８５；Ｍ９７ ２５２０６０；Ｍ９７ ２５１８７０；Ｍ９７ ２５１９９４；Ｍ９８ ２５００２４；Ｍ９７ ２５１９０５；Ｍ９７ ２５１８７６；Ｍ９７ ２５１８９８；またはＭ９７ ２５１８３０菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７８ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＡ４ Ｓａｎｆｏｒｄ；Ｍ９７ ２５１８３６ ＰＡＲＴ；Ｍ９７ ２５１９５７；Ｍ９７ ２５１９８５；Ｍ９７ ２５２０６０；Ｍ９７ ２５１８７０；Ｍ９７ ２５１９９４；Ｍ９８ ２５００２４；Ｍ９７ ２５１９０５；Ｍ９７ ２５１８７６；Ｍ９７ ２５１８９８；またはＭ９７ ２５１８３０菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７９ Ａ４ Ｓａｎｆｏｒｄ；Ｍ９７ ２５１８３６ＰＡＲＴ；Ｍ９７ ２５１９５７；Ｍ９７ ２５１９８５；Ｍ９７ ２５２０６０；Ｍ９７ ２５１８７０；Ｍ９７ ２５１９９４；Ｍ９８ ２５００２４；Ｍ９７ ２５１９０５；Ｍ９７ ２５１８７６；Ｍ９７ ２５１８９８；またはＭ９７ ２５１８３０菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８０ Ａ４ Ｓａｎｆｏｒｄ；Ｍ９７ ２５１８３６ ＰＡＲＴ；Ｍ９７ ２５１９５７；Ｍ９７ ２５１９８５；Ｍ９７ ２５２０６０；Ｍ９７ ２５１８７０；Ｍ９７ ２５１９９４；Ｍ９８ ２５００２４；Ｍ９７ ２５１９０５；Ｍ９７ ２５１８７６；Ｍ９７ ２５１８９８；またはＭ９７ ２５１８３０菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８１ 天然のリーダー配列に結合した場合のＣＤＣ９３７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８２ 天然のリーダー配列を使用して作製したＣＤＣ９３７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８３ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＣＤＣ９３７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８４ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＣＤＣ９３７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８５ ＣＤＣ９３７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８６ ＣＤＣ９３７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８７ 天然のリーダー配列に結合した場合のＭ９７ ２５２０９７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８８ 天然のリーダー配列を使用して作製したＭ９７ ２５２０９７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８９ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＭ９７ ２５２０９７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９０ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＭ９７ ２５２０９７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９１ Ｍ９７ ２５２０９７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９２ Ｍ９７ ２５２０９７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９３ 天然のリーダー配列に結合した場合の８７０２２７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９４ 天然のリーダー配列を使用して作製した８７０２２７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９５ Ｐ４リーダー配列に結合した場合の８７０２２７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９６ Ｐ４リーダー配列を使用して作製した８７０２２７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９７ ８７０２２７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９８ ８７０２２７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９９ 天然のリーダー配列に結合した場合のＨ３５５菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２００ 天然のリーダー配列を使用して作製したＨ３５５菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０１ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＨ３５５菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０２ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＨ３５５菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０３ Ｈ３５５菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０４ Ｈ３５５菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０５ 天然のリーダー配列に結合した場合のＨ４４ ７６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６ 天然のリーダー配列を使用して作製したＨ４４ ７６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０７ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＨ４４ ７６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＨ４４ ７６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９ Ｈ４４ ７６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０ Ｈ４４ ７６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１ 天然のリーダー配列に結合した場合の８５２９菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２ 天然のリーダー配列を使用して作製した８５２９菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３ Ｐ４リーダー配列に結合した場合の８５２９菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４ Ｐ４リーダー配列を使用して作製した８５２９菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５ ８５２９菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１６ ８５２９菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１７ 天然のリーダー配列に結合した場合の６９４０菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１８ 天然のリーダー配列を使用して作製した６９４０菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１９ Ｐ４リーダー配列に結合した場合の６９４０菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２０ Ｐ４リーダー配列を使用して作製した６９４０菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２１ ６９４０菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２２ ６９４０菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２３ 天然のリーダー配列に結合した場合のＭ９８２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２４ 天然のリーダー配列を使用して作製したＭ９８２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＭ９８２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＭ９８２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７ Ｍ９８２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２８ Ｍ９８２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２９ 天然のリーダー配列に結合した場合の８８００４９菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３０ 天然のリーダー配列を使用して作製した８８００４９菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３１ Ｐ４リーダー配列に結合した場合の８８００４９菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３２ Ｐ４リーダー配列を使用して作製した８８００４９菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３３ ８８００４９菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３４ ８８００４９菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３５ 天然のリーダー配列に結合した場合のＭ９７ ２５３５２４、Ｍ９７ ２５１８８５、およびＭ９７ ２５１９２６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３６ 天然のリーダー配列を使用して作製したＭ９７ ２５３５２４、Ｍ９７ ２５１８８５、およびＭ９７ ２５１９２６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３７ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＭ９７ ２５３５２４、Ｍ９７ ２５１８８５、およびＭ９７ ２５１９２６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３８ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＭ９７ ２５３５２４、Ｍ９７ ２５１８８５、およびＭ９７ ２５１９２６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３９ Ｍ９７ ２５３５２４、Ｍ９７ ２５１８８５、およびＭ９７ ２５１９２６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４０ Ｍ９７ ２５３５２４、Ｍ９７ ２５１８８５、およびＭ９７ ２５１９２６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４１ 天然のリーダー配列に結合した場合のＭ９８ ２５０６７０菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４２ 天然のリーダー配列を使用して作製したＭ９８ ２５０６７０菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４３ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＭ９８ ２５０６７０菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４４ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＭ９８ ２５０６７０菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４５ Ｍ９８ ２５０６７０菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４６ Ｍ９８ ２５０６７０菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４７ 天然のリーダー配列に結合した場合のＣＤＣ１５７３菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８ 天然のリーダー配列を使用して作製したＣＤＣ１５７３菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４９ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＣＤＣ１５７３菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５０ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＣＤＣ１５７３菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５１ ＣＤＣ１５７３菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５２ ＣＤＣ１５７３菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５３ ナイセリア ラクタミカ菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする部分核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５４〜２５９ ２０８６ファミリータンパク質のタンパク質に付随するアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６０〜２７８ ２０８６サブファミリーＡタンパク質に付随するアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７９〜２９９ ２０８６サブファミリーＢタンパク質に付随するアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３００は本発明の態様に記載の２０８６タンパク質ファミリー（“２０８６タンパク質”）に対応するアミノ酸コンセンサス配列である。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０１は本発明の態様に記載の２０８６タンパク質サブファミリーＡに対応するアミノ酸コンセンサス配列である。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０２は本発明の態様に記載の２０８６タンパク質サブファミリーＢに対応するアミノ酸コンセンサス配列である。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０３ ＢａｍＨＩ制限部位を持つリバースプライマー（化合物Ｎｏ．４６２３）の核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０４ ＮｄｅＩ制限部位を持つフォワードプライマー（化合物Ｎｏ．４６２４）の核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０５ フォワードプライマー（化合物Ｎｏ．４６２５）の核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０６ フォワードプライマー（化合物Ｎｏ．５００５）の核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０７ リバースプライマー（化合物Ｎｏ．５００７）の核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０８ ＢｇｌＩＩ制限部位を持つリバースプライマー（化合物Ｎｏ．５１３５）の核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０９ ＢａｍＨＩ制限部位を持つフォワードプライマー（化合物Ｎｏ．５６５８）の核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１０ ＳｐｈＩ制限部位を持つリバースプライマー（化合物Ｎｏ．５６６０）の核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１１ ＢａｍＨＩ制限部位を持つフォワードプライマー（化合物Ｎｏ．６３８５）の核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２ ＢｇｌＩＩおよびＮｄｅＩ制限部位を持つフォワードプライマー（化合物Ｎｏ．６４０６）の核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１３ フォワードプライマー（化合物Ｎｏ．６４７０）の核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１４ リバースプライマー（化合物Ｎｏ．６４７２）の核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１５ ＢａｍＨＩ制限部位を持つフォワードプライマー（化合物Ｎｏ．６４７３）の核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１６ ＢｇｌＩＩおよびＮｄｅＩ制限部位を持つフォワードプライマー（化合物Ｎｏ．６４７４）の核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１７ フォワードプライマー（化合物Ｎｏ．６４９５）の核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１８ リバースプライマー（化合物Ｎｏ．６４９６）の核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１９ ＳｐｈＩ制限部位を持つリバースプライマー（化合物Ｎｏ．６５４３）の核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２０ ＢｇｌＩＩ制限部位を持つリバースプライマー（化合物Ｎｏ．６６０５）の核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２１ ＢｇｌＩＩおよびＮｄｅＩ制限部位を持つフォワードプライマー（化合物Ｎｏ．６７２１）の核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２２ Ｐ４リーダー配列の核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２３ 天然の２０８６リーダー変異体１の核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２４ 天然の２０８６リーダー変異体２の核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２５ 天然の２０８６リーダー変異体３の核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２６ 天然の２０８６リーダー変異体４の核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２７はP４４３１のアミノ酸配列である。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２８はＰ５１６３のアミノ酸配列である。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２９は本発明の態様に記載のアミノ酸配列である。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３０ 天然のリーダー配列に結合した場合の８８００４９菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１ 天然のリーダー配列を使用して作製した８８００４９菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３２ Ｐ４リーダー配列に結合した場合の８８００４９菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３３ Ｐ４リーダー配列を使用して作製した８８００４９菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３４ ８８００４９菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３５ ８８００４９菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３６ 天然のリーダー配列に結合した場合のＣＤＣ−９３７菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３７ 天然のリーダー配列を使用して作製したＣＤＣ−９３７菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３８ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＣＤＣ−９３７菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３９ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＣＤＣ−９３７菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４０ ＣＤＣ−９３７菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４１ ＣＤＣ−９３７菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４２ 天然のリーダー配列に結合した場合のＭ９７ ２５２０９７菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４３ 天然のリーダー配列を使用して作製したＭ９７ ２５２０９７菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４４ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＭ９７ ２５２０９７菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４５ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＭ９７ ２５２０９７菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４６ Ｍ９７ ２５２０９７菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４７ Ｍ９７ ２５２０９７菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４８ 天然のリーダー配列に結合した場合のＢ４０菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４９ 天然のリーダー配列を使用して作製したＢ４０菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５０ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＢ４０菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５１ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＢ４０菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５２ Ｂ４０菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５３ Ｂ４０菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５４ 天然のリーダー配列に結合した場合のＢ４０菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５５ 天然のリーダー配列を使用して作製したＢ４０菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５６ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＢ４０菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５７ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＢ４０菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５８ Ｂ４０菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５９ Ｂ４０菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６０ 天然のリーダー配列に結合した場合のＣＤＣ−１３４３菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６１ 天然のリーダー配列を使用して作製したＣＤＣ−１３４３菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６２ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＣＤＣ−１３４３菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６３ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＣＤＣ−１３４３菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６４ ＣＤＣ−１３４３菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６５ ＣＤＣ−１３４３菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６６ 天然のリーダー配列に結合した場合のＣＤＣ−１３４３菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６７ 天然のリーダー配列を使用して作製したＣＤＣ−１３４３菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６８ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＣＤＣ−１３４３菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６９ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＣＤＣ−１３４３菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７０ ＣＤＣ−１３４３菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７１ ＣＤＣ−１３４３菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７２ 天然のリーダー配列に結合した場合のＣＤＣ−２３６７菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７３ 天然のリーダー配列を使用して作製したＣＤＣ−２３６７菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７４ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＣＤＣ−２３６７菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７５ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＣＤＣ−２３６７菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７６ ＣＤＣ−２３６７菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７７ ＣＤＣ−２３６７菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７８ 天然のリーダー配列に結合した場合のＣＤＣ−２３６７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７９ 天然のリーダー配列を使用して作製したＣＤＣ−２３６７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８０ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＣＤＣ−２３６７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８１ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＣＤＣ−２３６７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８２ ＣＤＣ−２３６７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８３ ＣＤＣ−２３６７菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８４ 天然のリーダー配列に結合した場合のＣＤＣ−５３１５菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８５ 天然のリーダー配列を使用して作製したＣＤＣ−５３１５菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８６ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＣＤＣ−５３１５菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８７ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＣＤＣ−５３１５菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８８ ＣＤＣ−５３１５菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８９ ＣＤＣ−５３１５菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９０ 天然のリーダー配列に結合した場合のＣＤＣ−５３１５菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９１ 天然のリーダー配列を使用して作製したＣＤＣ−５３１５菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９２ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＣＤＣ−５３１５菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９３ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＣＤＣ−５３１５菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９４ ＣＤＣ−５３１５菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９５ ＣＤＣ−５３１５菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９６ 天然のリーダー配列に結合した場合のＣＤＣ−８５２菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９７ 天然のリーダー配列を使用して作製したＣＤＣ−８５２菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９８ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＣＤＣ−８５２菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９９ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＣＤＣ−８５２菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４００ ＣＤＣ−８５２菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０１ ＣＤＣ−８５２菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０２ 天然のリーダー配列に結合した場合のＣＤＣ−８５２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０３ 天然のリーダー配列を使用して作製したＣＤＣ−８５２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０４ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＣＤＣ−８５２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０５ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＣＤＣ−８５２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０６ ＣＤＣ−８５２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０７ ＣＤＣ−８５２菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０８ 天然のリーダー配列に結合した場合のＣＤＣ−９８３菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０９ 天然のリーダー配列を使用して作製したＣＤＣ−９８３菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１０ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＣＤＣ−９８３菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１１ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＣＤＣ−９８３菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１２ ＣＤＣ−９８３菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１３ ＣＤＣ−９８３菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１４ 天然のリーダー配列に結合した場合のＣＤＣ−９８３菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１５ 天然のリーダー配列を使用して作製したＣＤＣ−９８３菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１６ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＣＤＣ−９８３菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１７ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＣＤＣ−９８３菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１８ ＣＤＣ−９８３菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１９ ＣＤＣ−９８３菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２０ 天然のリーダー配列に結合した場合のＭ９７ ２５０５７１菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２１ 天然のリーダー配列を使用して作製したＭ９７ ２５０５７１菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２２ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＭ９７ ２５０５７１菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２３ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＭ９７ ２５０５７１菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２４ Ｍ９７ ２５０５７１菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２５ Ｍ９７ ２５０５７１菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２６ 天然のリーダー配列に結合した場合のＭ９７ ２５０５７１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２７ 天然のリーダー配列を使用して作製したＭ９７ ２５０５７１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２８ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＭ９７ ２５０５７１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２９ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＭ９７ ２５０５７１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３０ Ｍ９７ ２５０５７１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３１ Ｍ９７ ２５０５７１菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３２ 天然のリーダー配列に結合した場合のＭ９８ ２５０７１６菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３３ 天然のリーダー配列を使用して作製したＭ９８ ２５０７１６菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３４ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＭ９８ ２５０７１６菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３５ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＭ９８ ２５０７１６菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３６ Ｍ９８ ２５０７１６菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３７ Ｍ９８ ２５０７１６菌株由来の２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３８ 天然のリーダー配列に結合した場合のＭ９８ ２５０７１６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３９ 天然のリーダー配列を使用して作製したＭ９８ ２５０７１６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４０ Ｐ４リーダー配列に結合した場合のＭ９８ ２５０７１６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４１ Ｐ４リーダー配列を使用して作製したＭ９８ ２５０７１６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４２ Ｍ９８ ２５０７１６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４３ Ｍ９８ ２５０７１６菌株由来の成熟２０８６タンパク質のアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４４〜４４９ ２０８６サブファミリーＢタンパク質に付随するアミノ酸配列。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５０〜４５２ ２０８６サブファミリーＡタンパク質に付随するアミノ酸配列。
発明の詳細な説明
ナイセリア メニンギティディス セログループＢに対する交差作用性殺菌活性を有する新規クラスの抗原は、感染に対して免疫化するための多価ＰｏｒＡ法の必要性を回避させることになる。そのような抗原が思いがけず同定され、本明細書に記載され、主張される。そのような抗原の１種の存在が、髄膜炎菌株由来の可溶性外膜タンパク質（ｓＯＭＰ）の複合混合物中に初めて見出された。関心のあるタンパク質混合物がわずか数種のタンパク質だけを含むようになるまで、この抗原の殺菌活性を一連の分画およびタンパク質精製を通じて追跡した。Ｎ−末端アミノ酸配列決定およびペプチドマッピングによりこの混合物の主要タンパク質が同定された。殺菌活性を示す関心のあるタンパク質は、脂質化タンパク質、ＯＲＦ２０８６として（さらにより具体的にはＬＰ２０８６として）同定された。“ＯＲＦ２０８６タンパク質”はナイセリア種のオープンリーディングフレーム２０８６（ＯＲＦ２０８６）によりコードされるタンパク質を表す。
本明細書に記載のように、Ｎ．メニンギティディスから単離されたナイセリア種ＯＲＦ２０８６タンパク質（本明細書では交換して使用可能な、“２０８６タンパク質”もしくは“ＯＲＦ２０８６”タンパク質、または非脂質化タンパク質のＰ２０８６および脂質化型タンパク質のＬＰ２０８６としても表される）に基づいた新規免疫原性組成物候補は、抗血清調製物に対する細胞分画、ディファレンシャル界面活性剤抽出、タンパク質精製、および複数の菌株を使用した殺菌活性アッセイを組み合わせることにより同定された。先に引用した参考文献に開示された潜在的な免疫原性組成物および診断法に代わるものとして、本発明はタンパク質、その免疫原性部分およびその生物学的等価物、ならびに上記ポリペプチド、部分、および等価物をコードする遺伝子、および同じものに免疫特異的に結合する抗体の使用による髄膜炎菌感染の処置および／または予防のための組成物および方法に関する。
本発明の態様に従って、単離されたポリペプチド、その免疫原性部分および／またはその生物学的等価物を含む、２０８６タンパク質に基づいた免疫原性物質が、交差反応性または菌株非特異性を示す上記物質の能力に基づいた免疫原性候補物質として同定された。とりわけ、予想外に以下の能力を示す候補物質が同定された：（１）複数の髄膜炎菌株および／または淋菌株に対する殺菌抗体を誘導する；（２）複数の菌株の表面と反応する；（３）生菌攻撃に対して受動的保護を与える；および／または（４）コロニー化を妨げる。したがって、本発明は単離されたポリペプチド、その免疫原性部分、および／またはその生物学的等価物を含む上記免疫原性物質、を含む免疫原性組成物、およびＮ．メニンギティディスによる感染に対して同じものを使用するための方法を提供する。（２０８６タンパク質の同定に使用される方法に関しては本明細書の実施例１を参照されたい）。
本明細書で使用する“菌株非特異的”という用語は、１種以上のＮ．メニンギティディス菌株（たとえば異種髄膜炎菌株）に対して有効な免疫反応を誘発する抗原の特徴を表す。本明細書で使用する“交差反応性”という用語は“菌株非特異的”という用語と交換して使用することができる。本明細書で使用する“免疫原性菌株非特異的Ｎ．メニンギティディス抗原”という用語は、Ｎ．メニンギティディスから単離することができる抗原を説明するが、それは別の細菌（たとえば、別の髄膜炎菌株、たとえば淋菌株）から単離するか、または組換え技術を使用して作製することもできる。
本発明の２０８６タンパク質は脂質化および非脂質化タンパク質を包含する。さらに、本発明は中間体化合物／組成物としてそれぞれのタンパク質に対応する未熟タンパク質またはプレタンパク質の使用も企図する。
本発明はまた、本発明の実行に従って、先の免疫原性物質に免疫特異的に結合する抗体を提供する。さらに、本発明は上記のいずれかをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドに関する。その上、本発明は髄膜炎菌性髄膜炎、とりわけセログループＢ髄膜炎菌性疾患の予防、処置、および／または診断における組成物および／または免疫原性組成物およびそれらの使用、ならびに上記組成物を製造するための方法を提供する。
本発明の組成物は高度に免疫原性であり、殺菌抗体の産生を誘導できることが示されている。これらの抗体はセログループ、セロタイプおよびセロサブタイプ異種髄膜炎菌株に交差反応性である。したがって、本発明の組成物は異種髄膜炎菌株に対する殺菌抗体を誘導する能力を示すことにより、以前のＮ．メニンギティディスワクチンの試みの欠陥を克服する。したがって、とりわけ本発明は以前使用された物質に匹敵する保護を引き出すために混合する成分が少なくてよい、免疫原性組成物を提供する。組成物またはその中の免疫原性物質（たとえば、ポリペプチド、免疫原性部分またはフラグメント、および生物学的等価物などであるが、それらに限定されない）は単独で、または他の抗原もしくは剤と組み合わせて使用し、髄膜炎菌性感染および疾患から免疫学的保護を引き出す、および別の病原体によって引き起こされた感染および／または疾患から免疫学的保護を引き出す為に使用することができる。このことは、複数の菌株に対する保護に必要とされる抗原の数を減らすことにより、髄膜炎菌性感染に対して使用する免疫学組成物の設計を簡単にする。実際、精製された２０８６タンパク質は、髄膜炎菌性疾患に関与する菌株による適切な免疫原性の保護範囲の提供に必要なタンパク質の数を劇的に、そして予想外に減少させることになる。２０８６タンパク質はリポタンパク質として大腸菌（E. coli）に組換えにより発現させることができ、そしてそれは天然の髄膜炎菌よりもずっと高いレベルの野生型タンパク質である。
単一株由来の２０８６タンパク質を指向した抗体が、関連のない（すなわち異種）菌株を致死させることが見出されているため、多数の異種菌株を“２０８６ホモログ”の存在に関して特徴付け、そして配列保存のレベルを確認するための試みが行われた。ＰＣＲによって試験した菌株の約７０％は、菌株８５２９由来の元の２０８６遺伝子を増幅するプライマーを使用して増幅することができる２０８６ホモログを有していたが、残りの約３０％はこのテストでは陰性であった。これらの残りの約３０％は元の８５２９由来の２０８６遺伝子に約６０％だけアミノ酸配列相同性を有する２０８６ホモログを含有することが見出された。これらの約３０％の菌株由来の２０８６ホモログを増幅することができる別のプライマーが同定された。試験したＮ．メニンギティディス株は、どのプライマーセットが２０８６ホモログを増幅することができるかに依存して、サブファミリーＡまたはサブファミリーＢに属すると称される。これらの実験の詳細は以下の実施例５に概説する。
多数のセロサブタイプにおける２０８６タンパク質の存在
Ｎ．メニンギティディス菌株間の２０８６遺伝子の配列保存の程度を確かめるために、全長遺伝子としてサブファミリーＡおよびＢ由来のいくつかの代表をクローニングし、ＤＮＡ配列解析を行った。本明細書に開示されたプライマーを使用して（たとえば表ＩＶを参照されたい）、異なるセロサブタイプ抗原を発現し、共有タンパク質Ｐ２０８６も発現する２４種のセログループＢ髄膜炎菌株を同定した。これらの配列の例を本明細書に提供し、成熟ＤＮＡ配列として示す（すなわち、すべてのリポタンパク質シグナル配列はシステイン残基において開裂されている）。たとえば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜２５２の偶数番号およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１〜４４３の奇数番号のアミノ酸配列（それらに限定されない）を参照されたい。
２０８６タンパク質は野生型菌株に大量は存在しないが、それは殺菌抗体の標的である。これらの抗体は、ＰｏｒＡに反応して産生されるものとは異なり、異種セロサブタイプを発現する菌株を致死させることが可能である。
２０８６タンパク質に対する抗体はまた、髄膜炎菌による攻撃から幼少ラットを受動的に保護する。（表ＶＩＩを参照されたい）。２０８６タンパク質の組換え発現は髄膜炎菌性疾患の予防のための免疫原性組成物としての２０８６タンパク質の使用を可能にする。臨床試験における最近の髄膜炎菌性免疫原性組成物候補のすべては、これまで多くの異なるタンパク質を含む複合混合物または外膜タンパク質調製物であった。セロサブタイプ特異性を提供するＰｏｒＡタンパク質は、約７０〜８０％の疾患に関連したセロサブタイプに適用するために６〜９種の変異体を免疫原性組成物に含有することが必要とされる。対照的に、単一２０８６タンパク質だけに対する抗血清は、西ヨーロッパおよび米国における約６５％の疾患分離菌の原因となる６種のセロサブタイプの典型を致死できることが本明細書において明確に証明される。したがって、精製した２０８６タンパク質は、髄膜炎菌性疾患に関与するセロサブタイプに対して適切な免疫原性組成物による保護範囲を提供するために必要なタンパク質の数を減少させる可能性を有する。
タンパク質、免疫原性部分および生物学的等価物
本発明で提供される２０８６タンパク質は単離されたタンパク質である。“単離された”という用語は、天然の状態から人為的に変化されたことを意味する。“単離された”組成物または物質が天然に存在する場合、それはその元の環境を変えられているか、もしくはそこから除去されている、またはその両方である。たとえば、生きている動物に天然に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドは“単離”されていないが、その天然の状態に共存する物質から分離された同じポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、本明細書で使用される用語のとおりに、“単離”されている。したがって、本明細書で使用する“単離されたタンパク質”という用語は、天然の供与源から単離されたタンパク質および組換え技術を使用して製造されたタンパク質、ならびに、別の抗原および／または薬剤的に受容できるキャリア、バッファー、アジュバントなどのような添加剤と組み合わせた場合のそのようなタンパク質を包含する。
本発明の態様に記載の２０８６タンパク質、その免疫原性部分および／またはその生物学的等価物は、以下のものからなる群から選択されるアミノ酸配列：
Figure 2006525330
またはその組み合わせを含む。
本発明の態様に従って、２０８６サブファミリーＡタンパク質、その免疫原性部分および／またはその生物学的等価物は、以下のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列：
Figure 2006525330
またはその組み合わせを含む。
本発明の態様に従って、２０８６サブファミリーＢタンパク質、その免疫原性部分および／またはその生物学的等価物は、以下のアミノ酸配列：
Figure 2006525330
Figure 2006525330
のいずれかを含む。
本発明の態様に従って、２０８６タンパク質は以下のコンセンサス配列および／またはその免疫原性部分を包含する。
２０８６タンパク質コンセンサス配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３００）：
Figure 2006525330
先のコンセンサス配列において、“ｘ”はいずれかのアミノ酸を表し、アミノ酸位置５〜アミノ酸位置９までの領域は０〜５のアミノ酸のいずれかであり、アミノ酸位置６７〜アミノ酸位置６９までの領域は０〜３のアミノ酸のいずれかであり、そしてアミノ酸位置１５６は０〜１のアミノ酸のいずれかである。アミノ酸位置５〜アミノ酸位置９までの領域は好ましくは０、４または５のアミノ酸を含有する。アミノ酸位置６７〜アミノ酸位置６９までの領域は好ましくは０または３のアミノ酸を含有する。このコンセンサス配列は２０８６タンパク質の高度な可変性を説明することに注意すべきである。理論的に束縛されることを意図しないが、理論的にはこの高度な可変性は好都合で、予想外の交差反応性を提供すると考えられる。
本発明の実行に従い、２０８６タンパク質は免疫原性、非病原性、および菌株非特異的であると特徴付けられる。さらに、本発明の別の実行に従って、これらのタンパク質は約２％〜約４０％非保存であるが、予想外に免疫原性を示す。
本明細書で使用する“非保存”という用語は、タンパク質中の挿入、置換および／または欠失されてもよいアミノ酸の数をアミノ酸総数の百分率として表す。たとえば、あるタンパク質が４０％非保存であり、２６３のアミノ酸を有する場合、そのタンパク質には、アミノ酸が置換されてもよい１０５のアミノ酸位置がある。同様に、あるタンパク質が１０％非保存であり、そしてたとえば２８０のアミノ酸を有する場合、そのタンパク質には、アミノ酸が置換されてもよい２８のアミノ酸位置がある。また、２０８６タンパク質はタンパク質の免疫原性を弱めることなくアミノ酸残基が欠失されてもよい。
さらに、２０８６タンパク質は種々の領域の相同性に基づいてサブファミリーに分割することができる。たとえば、２種のそのようなサブファミリー、サブファミリーＡおよびサブファミリーＢのコンセンサス配列は以下のように提供されるが、それに限定することを意図しない：
２０８６サブファミリーＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ３０１）
Figure 2006525330
記号“ｘ”はいずれかのアミノ酸である。
アミノ酸位置５〜アミノ酸位置８までの領域は、０〜４のアミノ酸のいずれかである。
アミノ酸位置６６〜アミノ酸位置６８までの領域は、０〜３のアミノ酸のいずれかである。
アミノ酸位置５〜アミノ酸位置８までの領域は、好ましくは０または４のアミノ酸を含有する。アミノ酸位置６６〜アミノ酸位置６８までの領域は好ましくは０または３のアミノ酸を含有する。
本発明の実行に従って、サブファミリーＡ由来の２０８６タンパク質は、以下のものからなる群から選択されるアミノ酸配列：
Figure 2006525330
およびその組み合わせを包含する。
本発明の別の態様に従って、サブファミリーＡ由来の２０８６タンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５０〜４５２のいずれかをコードするポリヌクレオチドのいずれかにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含有する。当業者は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５０〜４５２のいずれかをコードするポリヌクレオチド（すなわち、核酸配列）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５０〜４５２のいずれかをコードするポリヌクレオチドのいずれかにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを同定し、選択することができるであろう。
２０８６サブファミリーＢ（ＳＥＱ ＩＤ ３０２）
Figure 2006525330
記号“ｘ”はいずれかのアミノ酸である。
アミノ酸位置８〜アミノ酸位置１２までの領域は０〜５のアミノ酸のいずれかである。
アミノ酸位置８〜アミノ酸位置１２までの領域は好ましくは０または５のアミノ酸を含有する。
本発明の態様に従って、２０８６タンパク質は、以下のものからなる群から選択されるアミノ酸配列：
Figure 2006525330
Figure 2006525330
およびその組み合わせを含有する。
本発明の別の態様に従って、サブファミリーＢ由来の２０８６タンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４４〜４４９のいずれかをコードするポリヌクレオチドのいずれかにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含有する。当業者は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４４〜４４９のいずれかをコードするポリヌクレオチド（すなわち、核酸配列）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４４〜４４９のいずれかをコードするポリヌクレオチドのいずれかにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を同定し、選択することができるであろう。
本発明の実行に従って、２０８６タンパク質サブファミリーはさらにクラスターに細分することができる。たとえば、本発明の実行に従って、以下のクラスターが提供される：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜１２の偶数番号；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４〜２４の偶数番号；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６〜４２の偶数番号；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０〜６０の偶数番号；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２〜１０８の偶数番号；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０〜１３８の偶数番号；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０〜１５６の偶数番号；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５８〜１７４の偶数番号；およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２４〜２５２の偶数番号。
本発明のポリペプチド配列は基準配列（たとえば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜２５２の偶数番号またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１〜４４３の奇数番号）と同一、すなわち１００％同一であってもよく、または基準配列に比較して％同一性が１００％未満であるような、いくつかのアミノ酸の変更を含んでいてもよい。そのような変更には、少なくとも１ヶ所のアミノ酸欠失、保存的および非保存的置換を含む置換、または挿入が挙げられる。変更は基準ポリペプチド配列のアミノ−もしくはカルボキシ−末端位置において、または基準アミノ酸配列中のアミノ酸間に個別に、もしくは基準アミノ酸配列内に１またはそれより多くの連続したグループで点在して、それらの末端位置間のいずれかの位置に存在してもよい。
したがって、本発明はまた、配列表に含有されるアミノ酸配列（すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜２５２の偶数番号またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１〜４４３の奇数番号）に配列同一性を有するタンパク質を提供する。具体的な配列に依存して、配列同一性の程度は、好ましくは６０％以上（たとえば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％、９９．９％またはそれより高い）である。これらの相同タンパク質には突然変異体および対立遺伝子変異体が挙げられる。
本発明の好ましい態様において、２０８６タンパク質または別の２０８６ポリペプチド（たとえば、免疫原性部分および生物学的等価物）は、髄膜炎菌と同種の、および少なくとも１種の異種の菌株に対する殺菌抗体を生じる。とりわけ、２０８６ポリペプチドに対する抗体は、髄膜炎菌による、たとえば鼻腔内への攻撃から幼少ラットを受動的に保護する。別の好ましい態様において、２０８６ポリペプチドは同種および少なくとも１種の異種菌株に関して幼少ラットをそのように保護する。ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜２５２の偶数番号またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１〜４４３の奇数番号中に示されたような上記の配列概要から選択してもよく、またはポリペプチドは記載されたポリペプチドの免疫原性フラグメントもしくは生物学的等価物のいずれかであってもよい。好ましくは、ポリペプチドは上記の配列概要中のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜２５２の偶数番号またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１〜４４３の奇数番号のいずれかから選択される。
本発明はまた、生物学的等価物である２０８６ポリペプチドの対立遺伝子または別の変異体に関する。適切な生物学的等価物は以下の能力を提示することになる：（１）同種菌株および少なくとも１種の異種髄膜炎菌株および／または淋菌株に対する殺菌抗体を誘導する；（２）同種菌株および少なくとも１種の異種髄膜炎菌株および／または淋菌株の表面と反応する；（３）生菌攻撃に対して受動的保護を与える；および／または（４）コロニー化を妨げる。
適切な生物学的等価物は、当該生物学的等価物が本発明の２０８６タンパク質の１種と実質的に同じ免疫原性を引き出すことができる限りにおいて、本明細書に具体的に述べられた２０８６ポリペプチド（すなわちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜２５２の偶数番号およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１〜４４３の奇数番号）の１種に少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約７５％、さらにより好ましくは約８０％、さらにより好ましくは約８５％、さらにより好ましくは約９０％、さらにより好ましくは約９５％またはさらにより好ましくは９８％、またはさらにより好ましくは９９％類似性を有する。
あるいは、生物学的等価物はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜２５２の偶数番号またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１〜４４３の奇数番号中の２０８６タンパク質の１種と実質的に同じ免疫原性を有する。本発明の態様に従って、生物学的等価物はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜２５２の偶数番号またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１〜４４３の奇数番号と同じ免疫原性を有する。
生物学的等価物は本発明のタンパク質に対する変異体および改変体を生み出すことによって得られる。該タンパク質に対するこれらの変異体および改変体は１またはそれより多くのアミノ酸の挿入、欠失または置換によってアミノ酸配列を変化させることにより得られる。アミノ酸配列は、たとえば実質的に同じか、または改善された性質を有するポリペプチドを作製するための置換により改変される。変更を導入する好ましい手段には、部位特異的変異誘発により予め決められたポリペプチドのヌクレオチド配列突然変異を作製することが挙げられる。
改変および変更は本発明のポリペプチドの構造中に行われ、そしてさらにＮ．メニンギティディス免疫原性を有する分子を得ることができる。たとえば、ある種のアミノ酸は明らかな免疫原性の損失なしに配列中において別のアミノ酸に置換してもよく、そのような置換には保存および非保存置換を含むが、それらに限定されない。あるポリペプチドの生物学的な機能活性を説明するものはそのポリペプチドの相互作用能力と性質であるため、いくつかのアミノ酸配列置換をポリペプチド配列中（または、もちろん、その基礎をなすＤＮＡコーディング配列）に行ってもよく、そしてそれにもかかわらず、同じ特性を有するポリペプチドを得ることができる。本発明は本明細書のポリペプチド構造、および上記ポリペプチドをコードする核酸配列に関するどのような変更も企図するが、ここでポリペプチドは免疫原性を保持する。したがって、当業者は本明細書に提供された手引きに基づき、開示されたポリペプチドおよびポリヌクレオチドを容易に改変することができる。
たとえば、置換または欠失が許容される、ある種の可変領域が同定されている。先に説明したように２０８６コンセンサス配列は本発明の実行に従って、タンパク質の２０８６ファミリーの保存および非保存領域を示す。
そのような変更を行う場合、当業者に公知のどのような技術を使用してもよい。たとえば、アミノ酸のハイドロパシーインデックスを考慮することができるが、それに限定することは意図しない。双方向生物機能を付与するハイドロパシーアミノ酸インデックスの重要性は当該技術分野で一般に理解されている。Kyte et al. 1982. J.Mol.Bio. 157:105〜132。
また、類似アミノ酸の置換は、とりわけそれによって作製された生物機能等価のポリペプチドまたはペプチドの免疫学的態様における使用を意図する場合、親水性に基づいて行うことができる。米国特許第４，５５４，１０１号（参照として本明細書に援用する）は、隣接するアミノ酸の親水性に支配されるような、ポリペプチドの最も高い局所平均親水性はその免疫原性、すなわち、該ポリペプチドの生物学的特性に関連することを示している。
ポリペプチドの生物学的等価物はまた、部位特異的変異誘発を使用して作製することができる。部位特異的変異誘発は、基礎をなすＤＮＡの特定の変異誘発を介して、その配列に由来する第２世代ポリペプチド、または生物機能等価のポリペプチドもしくはペプチドの作製に有用な技術である。そのような変更は、アミノ酸置換が好ましい場合、好ましくてよい。該技術はさらに、たとえばＤＮＡに１以上のヌクレオチド配列変更を導入することにより、１以上の上記の要件を組み込む配列変異体を作製し、試験するための機敏な能力を提供する。部位特異的変異誘発は、所望する変異のＤＮＡ配列をコードする具体的なオリゴヌクレオチド配列、および十分な数の隣接ヌクレオチドを使用して、横切っている欠失接合部の両側上で安定なデュープレックスを形成するために十分なサイズと配列複雑性のプライマー配列を提供することを通じて変異体を産生する。典型的には、変更する配列の接合部の両側上に約５〜１０残基を持つ、長さ約１７〜２５ヌクレオチドのプライマーが好ましい。
一般に、部位特異的変異誘発技術は当該技術分野で公知である。理解されるように、該技術は１本鎖および２本鎖型の両方で存在することができるファージベクターを使用する。一般に、これに従った部位特異的変異誘発は、選択されたＮ．メニンギティディスポリペプチド配列のすべてまたは一部をコードするＤＮＡ配列を配列内に含有する１本鎖ベクターを初めに得ることにより行われる。所望する変異した配列を持つオリゴヌクレオチドプライマーを製造する（たとえば、合成により）。このプライマーは１本鎖ベクターにアニーリングされ、たとえば大腸菌ポリメラーゼＩ Ｋｌｅｎｏｗフラグメントのような酵素の使用により伸長され、変異を含有する鎖の合成を完了する。したがって第１鎖がもとの非変異配列をコードし、第２鎖が所望する変異を持つヘテロデュープレックスが形成される。次にこのヘテロデュープレックスベクターを使用して、大腸菌のような適切な細胞を形質転換し、変異を持つ組換えベクターを含有するクローンを選択する。オリゴヌクレオチドプライマーを除いて、必要なすべての試薬が含まれた市販のキットが提供されている。
２０８６ポリペプチドには、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜２５２の偶数番号の１種に由来するアミノ酸配列を有する２０８６タンパク質に対して実質的な配列類似性および／または生物学的等価性を含有するいずれかのタンパク質またはポリペプチドが挙げられる。さらに、本発明の２０８６ポリペプチドは特定の供与源に限定されない。したがって、本発明は多様な供与源由来のポリペプチドの一般的な検出および単離を提供する。また、２０８６ポリペプチドは当業者に公知のように、本明細書に提供された手引きに基づいて組換えにより、または当該技術分野で公知の任意の別の合成方法で、製造することができる。
本発明では、２０８６ポリペプチドは好都合には、さらなる構造または機能解析、または２０８６−関連ポリペプチドおよび２０８６−特異的抗体のような試薬の作製における使用のために、フラグメントに開裂されてもよいことが企図される。このことは、エンドプロテイナーゼｇｌｕ−Ｃ（Ｂｅｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）のようなペプチダーゼで、精製または非精製Ｎ．メニンギティディス ポリペプチドを処理することにより行うことができる。ＣＮＢｒによる処理は、天然のＮ．メニンギティディス ポリペプチドからペプチドフラグメントを産生することができる別の方法である。組換え技術はまた、２０８６タンパク質の特定のフラグメントを産生するために使用することができる。
本明細書で使用する“変異体”という用語は、それぞれ基準ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、本質的な特性を保持するポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、別の基準ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる。変異体のヌクレオチド配列の変更は、基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させても、させなくてもよい。ヌクレオチド変更は、以下に説明するように、基準配列によってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合および切断を生じてもよい。典型的なポリペプチドの変異体は、別の基準ポリペプチドとアミノ酸配列が異なる。一般に、差は限定され、その結果基準ポリペプチドと変異体の配列は全体的に密接に類似し、そして多くの領域で同一（すなわち、生物学的等価）である。変異体および基準ポリペプチドは、いずれの組み合わせにおいても１以上の置換、付加、欠失によりアミノ酸配列が異なってよい。置換または挿入されたアミノ酸残基は遺伝コードによってコードされているものであっても、されていないものであってもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は対立遺伝子変異体のような天然に存在するものであってもよく、またはそれは天然に存在することが公知でない変異体であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの天然に存在しない変異体は、変異誘発技術または直接合成によって作製することができる。
当該技術分野で公知の“同一性”は、配列を比較することによって確かめられる、２以上のポリペプチド配列または２以上のポリヌクレオチド配列間の関連である。当該技術分野では、“同一性”は、事例がそのような配列のストリング間の適合性によって確かめられる限り、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。“同一性”および“類似性”は以下のものを含むがそれらに限定されない、公知の方法によって容易に計算することができる：Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press,New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M. and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; および Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; および Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073(1988)。同一性を確認する好ましい方法は、試験される配列間に最も大きい適合を示すように設計される。同一性および類似性を確認する好ましい方法は、公式に入手できるコンピュータプログラムに成文化される。２つの配列間の同一性および類似性を確認する好ましいコンピュータプログラム法には、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al 1984）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Altschul, S. F., et al., 1990）が挙げられるが、それらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮＣＢＩ およびその他の供与源（BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., et al., 1990）から公式に入手可能である。公知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を確認するために使用してよい。
例として、本発明のアミノ酸配列は基準配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜２５２の偶数番号およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１〜４４３の奇数番号に同一；すなわち１００％同一であってもよく、またはそれは％同一性が１００％未満であるように、基準配列に比較していくつかのアミノ酸変更を含んでいてもよいが、それらに限定することを意図しない。そのような変更は少なくとも１ヶ所のアミノ酸欠失、置換（保存的および非保存的置換を含む）、または挿入からなる群から選択され、ここで上記の変更は基準ポリペプチド配列のアミノ−もしくはカルボキシ−末端位置、または基準配列中のアミノ酸間に別々に、または基準配列内の１以上の隣接群中に点在して、それらの末端位置間のどこかで起こってもよい。一定の％同一性に関するアミノ酸変更の数は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜２５２の偶数番号およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１〜４４３の奇数番号中のアミノ酸の総数に、個々のパーセント同一性のパーセント数値（１００で割る）を掛け、そしてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜２５２の偶数番号およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１〜４４３の奇数番号のいずれかのアミノ酸の上記総数からその産物を減じることにより決定するか、または：
ｎａ＝ｘａ−（ｘａ・ｙ）であり、
式中、ｎａはアミノ酸変更の数であり、ｘａはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜２５２の偶数番号およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１〜４４３の奇数番号のアミノ酸の総数であり、そしてｙはたとえば、７０％の場合は０．７、８０％の場合は０．８、８５％の場合は０．８５などであり、ここで、ｘａおよびｙの非整数産物はいずれもそれをｘａから減じる前に最も近い整数に切り捨てる。
好ましい態様において、上記ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜２５２の偶数番号に示されたタンパク質、たとえば２０８６タンパク質の成熟プロセシング型から選択される。２０８６タンパク質または等価物などは脂質化、または非脂質化されていてよい。
ＯＲＦ２０８６は、天然のＯＲＦ２０８６シグナル配列により大腸菌で発現できる。しかし、タンパク質の発現を改善させる手段を見出すことが好ましい。本発明の態様に従って、リーダー配列はタンパク質の脂質化型を産生する。たとえば、以下に述べるものは発現を促進するための型分類不能ヘモフィルス インフルエンザＰ４タンパク質のシグナル配列の使用を説明する。
細菌リポタンパク質のプロセシングは、シグナル配列を含有する前駆体またはプロリポタンパク質の合成から始め、それが今度はコンセンサスリポタンパク質プロセシング／改変部位を含有する。このプロリポタンパク質は初めにグラム陰性菌の内膜、またはグラム陽性菌の膜上の共通のＳｅｃシステムを通過する。一旦Ｓｅｃシステムにより膜に配置されると、プロリポタンパク質はコンセンサス部位でシグナルペプチダーゼＩＩにより開裂され、露出したＮ−末端システイン残基はグリセリル化（ｇｌｙｃｅｒａｔｅｄ）およびアシル化される。Hayashi et al. 1990. Lipoproteins in bacteria. J. Bioenerg. Biomembr. Jun; 22(3):451-71; Oudega et al. 1993。 Escherichia coli SecB, SecA, and SecY proteins are required for expression and membrane insertion of the bacteriocin release protein, a small lipoprotein. J.Bacteriol. Mar; 175(5):1543-7; Sankaran et al. 1995. Modification of bacterial lipoproteins. Methods Enzymol. 250:683-97。
グラム陽性菌では、外膜への脂質化タンパク質の輸送は、リポタンパク質の位置２のソーティングシグナルに依存して、膜特異性を持つ特有のＡＢＣトランスポーターにより媒介される。Yakushi et al. 2000. A new ABC tansporter mediating the detachment of lipid modified proteins from membranes. Nat Cell Biol. Apr; 2(4):212-8。
細菌リポタンパク質とそれらのシグナル配列の融合は、細菌の表面に組換えタンパク質を提示するために使用されてきた。米国特許第５，５８３，０３８号および６，１３０，０８５号。リポタンパク質シグナル配列の交換はリポタンパク質の産生を促進することができる。De et al. 2000. Purification and characterization of Streptococcus pneumoniae palmitoylated pneumococcal surface adhesin A expressed in Escherichia coli. Vaccine. Mar 6; 18(17):1811-21。
細菌タンパク質脂質化は、タンパク質に対する免疫反応を促進または改変することが公知である。Erdile et al. 1993. Role of attached lipid in immunogenicity of Borrelia burgdorferi OspA. Infect. Immun. Jan; 61(1):81-90; Snapper et al. 1995. Bacterial lipoproteins may substitute for cytokines in the humoral immune response to T cell-independent type II antigens. J. Immunol. Dec 15; 155(12):5582-9。しかし、細菌リホ゜タンハ゜ク質発現はフ゜ロセシンク゛のストリンシ゛ェンシーにより複雑化されてよい。Pollitt et al. 1986. Effect of amino acid substitutions at the signal peptide cleavage site of the Escherichia coli major outer membrane lipoprotein. J. Biol. Chem. Feb 5; 261(4):1835-7; Lunn et al. 1987. Effect of prolipoprotein signal peptide mutations on secretion of hybrid prolipo-beta-lactamase in Escherichia coli. J. Biol. Chem. Jun 15; 262(17):8318-24; Klein et al. 1988. Distinctive properties of signal sequences from bacterial lipoproteins. Protein Eng. Apr; 2(1):15-20。細菌リポタンパク質発現は毒性および低発現レベルのような別の問題によりさらに複雑化される。Gomez et al. 1994. Nucleotide The Bacillus subtilis lipoprotein LplA causes cell lysis when expressed in Escherichia coli. Microbiology. Aug; 140(Pt8):1839-45; Hansson et al. 1995. Expression of truncated and full-length forms of the Lyme disease Borrelia outer surface protein A in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. Feb; 6(1):15-24; Yakushi et al. 1997. Lethality of the covalent linkage between mislocalized major outer membrane lipoprotein and the peptidoglycan of Escherichia coli. J. Bacteriol. May; 179(9):2857-62。
型分類不能なヘモフィルス インフルエンザ細菌はＰ４（タンパク質“ｅ”としても公知）と呼ばれるリポタンパク質を発現する。Ｐ４タンパク質の組換え型は天然のＰ４シグナル配列を使用して大腸菌に高度に発現される。米国特許第５，９５５，５８０号。天然のＰ４シグナル配列が大腸菌の発現ベクター中の天然のＯＲＦ２０８６シグナル配列と置換される場合、ＯＲＦ２０８６の発現レベルは増大する。
発現を増大させるために異種Ｐ４シグナル配列を使用するというこの概念は、別の細菌リポタンパク質に適用可能である。とりわけ、細菌ゲノムの解析は可能性のある関心事として多くのＯＲＦの同定に役立つ。大腸菌のような異種宿主細胞中に天然のシグナル配列を持つそれぞれのＯＲＦを発現させる試みは、安定性、適合性などを含む、シグナル配列を使用することに付随する多様な困難な問題を生み出す。これらの問題を最少にするために、Ｐ４シグナル配列を使用して関心のあるそれぞれのＯＲＦを発現させる。先に記載のように、Ｐ４シグナル配列は異種２０８６ＯＲＦの発現を改善する。発現ベクターは関心のある天然のＯＲＦシグナル配列を欠失させ、ＯＲＦにＰ４シグナル配列を連結することより構築される。その後適切な宿主細胞が発現ベクターにより形質転換、トランスフェクションまたは感染され、ＯＲＦの発現はＯＲＦの天然のシグナル配列を使用した発現に比較して増大する。
非脂質化型は、元のリーダー配列を欠いたタンパク質、または宿主細胞の脂肪酸アシル化部位を特定しない配列の部分により置換されたリーダー配列により産生される。
本発明の２０８６タンパク質の種々の形状は、特記しない限り、本明細書では、“２０８６”タンパク質と呼ばれる。また、“２０８６ポリペプチド”は、特記しない限り、上記のように２０８６タンパク質、およびその免疫原性部分または生物学的等価物を表す。
単離し、精製した全長Ｎ．メニンギティディス２０８６タンパク質は、１０％〜２０％グラジエントＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による測定では約２８〜３５ｋＤａのみかけの分子量を有する。より具体的には、この部分は質量分析による測定では約２６，０００〜３０，０００ダルトンの分子量を有する。
好ましくは、２０８６ポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸はＮ．メニンギティディスおよび／または別の種により引き起こされる感染の予防または改善に使用される。
抗体
また、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜２５２の偶数番号およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１〜４４３の奇数番号のアミノ酸配列を含む、本発明のタンパク質、それらのフラグメント、およびその類似体、またはそれらを発現する細胞は、本発明のポリペプチドに免疫特異的な抗体の産生のための免疫原として使用される。本発明は免疫特異的なポリペプチドに対する抗体を包含し、Ｎ．メニンギティディスの存在を検出するためのそのような抗体の使用を含み、受動保護を提供するか、または細胞、細胞もしくは組織抽出物、または生体液中のポリペプチドの量または濃度の尺度を提供する。
本発明の抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、および抗−イディオタイプ抗体が挙げられる。ポリクローナル抗体は、抗原によって免疫化された動物の血清に由来する抗体分子の異質集団である。モノクローナル抗体は、特異的抗原に対する抗体の実質的に均質な集団である。モノクローナル抗体は当業者に公知の方法、たとえば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７および米国特許第４，３７６，１１０号により得ることができる。そのような抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤおよびそれらのサブクラスを含むいずれかのイムノグロブリンクラスに由来してよい。
キメラ抗体は、分子の異なる部分がマウスモノクローナル抗体由来の可変領域とヒトイムノグロブリン不変領域を有するもののような、異なる動物種に由来する分子である。キメラ抗体およびそれらの産生のための方法は当該技術分野で公知である（Cabilly et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277; Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Boulianne et al., 1984, Nature 312:643-646; Cabilly et al., 欧州特許出願１２５０２３（１９８４年１１月１４日公開）；Taniguchi et al., 欧州特許出願１７１４９６（１９８５年２月１９日公開）；Morrison et al., 欧州特許出願１７３４９４（１９８６年３月５日公開）；Neuberger et al., ＰＣＴ出願ＷＯ８６／０１５３３（１９８６年３月１３日公開）；Kudo et al., 欧州特許出願１８４１８７（１９８６年６月１１日公開）；Morrison et al., 欧州特許出願１７３４９４（１９８６年３月５日公開）；Sahagan et al., 1986, J. Immunol. 137:1066-1074；Robinson et al., ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９（１９８７年３月７日公開）；Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Better et al., 1988, Science 240: 1041-1043)。これらの参考文献はそのまま参照として本明細書に援用する。
抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体は一般に抗体の抗原−結合部位に結合する特有の決定基を認識する抗体である。抗−Ｉｄ抗体は、モノクローナル抗体の供与源としての同じ種および遺伝子型の動物（たとえばマウス系統）を抗−Ｉｄ抗体が作製されているモノクローナル抗体で免疫化することにより作製する。免疫化された動物は、これらのイソタイプ決定基に対する抗体（抗−Ｉｄ抗体）を産生することにより免疫化抗体のイディオタイプ決定基を認識し、それに反応することになる。
したがって、本発明のポリペプチドに対して作製されたモノクローナル抗体を使用して適切な動物に抗−Ｉｄ抗体を誘導することができる。そのような免疫化マウス由来の脾臓細胞を使用して、抗−Ｉｄモノクローナル抗体を分泌する抗−Ｉｄハイブリドーマを産生することができる。さらに、抗−Ｉｄ抗体をキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）のようなキャリアに結合させ、別のＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化するために使用することができる。これらのマウスの血清は、Ｒ−ＰＴＰアーゼ エピトープに特異的な最終ｍＡｂの結合特性を有する抗−抗−Ｉｄ抗体を含有することになる。抗−Ｉｄ抗体はしたがって、それらのイディオタイプエピトープ、またはストレプトコッカス ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）ポリペプチドのような評価されるエピトープに構造的に類似した“イディオトープ”を有する。
また、“抗体”という用語は無傷分子および抗原に結合できるＦａｂのようなフラグメントの両方を包含することを意味する。Ｆａｂフラグメントは無傷抗体のＦｃフラグメントを欠き、循環からより速やかに取り除かれ、そして無傷抗体よりも非特異的組織結合が少ない（Wahl et al., 1983, J. Nucl. Med. 24:316-325）。本発明において有用な抗体のＦａｂおよび他のフラグメントは、無傷抗体分子のための方法に従ってＮ．メニンギティディス ポリペプチドの検出および定量に使用してもよいことは理解されるであろう。
本発明の抗体、たとえば抗−イディオタイプ（“抗−Ｉｄ”）抗体は、哺乳動物宿主におけるナイセリア感染の処置または予防のための方法に使用してよく、そして該方法は先に記載のポリペプチドに特異的な、免疫学的有効量の抗体の投与を含む。抗−Ｉｄ抗体はまた、さらに別の動物に免疫反応を誘発するための免疫原として使用し、いわゆる抗−抗−Ｉｄ抗体を産生することができる。抗−抗−Ｉｄは、抗−Ｉｄを誘導した元のｍＡｂにエピトープが同一であってよい。したがって、ｍＡｂのイディオタイプ決定基に対する抗体を使用することにより、同じ特異性の抗体を発現する別のクローンを同定することが可能である。
抗体は多様な手段、たとえばタンパク質発現の確認、またはタンパク質が発現される場所の確認に使用される。標識抗体（たとえばＦＡＣＳのための蛍光標識）は無傷細菌とインキュベートしてよく、たとえば細菌表面の標識の存在はタンパク質の位置を確証する。
本発明のポリペプチドに対して生成される抗体は、慣例のプロトコルを使用して動物にポリペプチドもしくはエピトープを持つフラグメント、類似体、または細胞を投与することにより得ることができる。モノクローナル抗体の作製には、継代細胞株培養物により産生される抗体を提供するいずれかの技術が使用される。
ポリヌクレオチド
本発明のタンパク質と同様に、本発明のポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３０〜４４２の偶数番号の基準配列のいずれかに同一、すなわち１００％同一である核酸配列を含んでいてもよく、または基準配列に比較していくつかまでのヌクレオチドの変更を含んでいてもよい。そのような変更は少なくとも１ヶ所のヌクレオチド欠失、置換（トランジションおよびトランスバージョンを含む）、または挿入からなる群から選択され、ここで上記変更は基準ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置、またはそれらの末端位置間のどこかにおいて、基準配列中のヌクレオチド間に別々に、もしくは基準配列内の１以上の連続したグループの中のいずれかに点在して存在してもよい。ヌクレオチド変更の数は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３０〜４４２の偶数番号のいずれかのヌクレオチドの総数に個々のパーセント同一性のパーセント数値（１００で割る）を掛け、そして上記の配列中の上記総ヌクレオチド数からその産物を減じることにより決定する。
例としては（それに限定することを意図しない）、単離されたＮ．メニンギティディスポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜２５３の奇数番号およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３０〜４４２の偶数番号のいずれかの核酸配列に少なくとも７０％同一性を有するポリヌクレオチド配列；その縮退変異体またはそのフラグメントを含み、ここでポリヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜２５３の奇数番号およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３０〜４４２の偶数番号の核酸配列の全ポリヌクレオチド領域にわたるｎｎまでの核酸変更を含んでいてよく、ここでｎｎは変更の最大数であり、式：
ｎｎ＝ｘｎ−（ｘｎ・ｙ）
により計算され、式中、ｘｎはのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜２５３の奇数番号およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３０〜４４２の偶数番号のいずれかの核酸の総数であり、そしてｙは０．７０の値を有し、ここでｘｎおよびｙの非整数産物はいずれもｘｎからそのような産物を減じる前に切り捨てられる。もちろん、ｙは８０％の場合は０．８、８５％の場合は０．８５、９０％の場合は０．９０、９５％の場合は０．９５などの値を有する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜２５２の偶数番号およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１〜４４３の奇数番号のいずれかのアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変更は、このコーディング配列中にナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト突然変異を生み出し、それによってそのような変更に従ってポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドを変化させることができる。
本発明のある種の態様は２０８６タンパク質をコードするポリヌクレオチド（本明細書では“２０８６ポリヌクレオチド”または“ＯＲＦ２０８６ポリヌクレオチド”と呼ばれる）および２０８６タンパク質に対して作製された抗体をコードするポリヌクレオチドに関する。好ましい態様において、本発明の単離されたポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜２５３の奇数番号もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３０〜４４２の偶数番号、その縮退変異体、またはそのフラグメントの１種から選択されたヌクレオチド配列に少なくとも約９５％同一性を有するヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドである。本明細書で説明する“縮退変異体”は、遺伝子コードの縮退のために奇数のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５３の奇数番号（およびそのフラグメント）に示されたヌクレオチド配列と異なるが、それでもＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜２５３の奇数番号およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３０〜４４２の偶数番号に示されたヌクレオチド配列によってコードされるものと同じ２０８６タンパク質（たとえばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜２５２の偶数番号およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１〜４４３の奇数番号）をコードするポリヌクレオチドとして定義される。
別の態様では、ポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜２５３奇数番号もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３０〜４４２の偶数番号、その縮退変異体、またはそのフラグメントの１種から選択されたヌクレオチド配列に対して相補的である。さらに別の態様において、ポリヌクレオチドはＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡからなる群から選択され、さらに異種ヌクレオチドを含んでいてもよい。別の態様において、単離されたポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜２５３もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３０〜４４２の偶数番号、その相補体、その縮退変異体、またはそのフラグメントの１種から選択されたヌクレオチド配列に、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。
２０８６ポリヌクレオチドは天然、合成または半合成の供与源から得られてよいことは理解されるであろう；さらに、常にそのような配列を含む核酸分子を上記のような２０８６免疫原性ポリペプチドとして発現することが可能な場合、ヌクレオチド配列は天然に存在する配列であってもよく、またはそれはそのような天然に存在する配列に対して、１もしくは複数塩基の置換、欠失、挿入および逆位を含む突然変異により関連付けられてもよい。核酸分子はＲＮＡ、ＤＮＡ、１本鎖または２本鎖、線状または共有結合により閉環した形状であってもよい。ヌクレオチド配列はそれに隣接して位置する発現制御配列を有していてもよく、そのような制御配列は通常異種供与源に由来する。一般に、本発明の核酸配列の組換え発現は核酸配列末端にＴＡＡのような停止コドン配列を使用することになる。
本発明はまた、本明細書に記載のポリヌクレオチドに、低ストリンジェントな条件、より好ましくはストリンジェントな条件、そして最も好ましくは高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるポリヌクレオチドを包含する。ストリンジェントな条件の例は、以下のストリンジェンシー条件の表に示される：高ストリンジェントな条件はたとえば、少なくとも条件Ａ〜Ｆと同じ程度にストリンジェントな条件であり；ストリンジェントな条件はたとえば、少なくとも条件Ｇ〜Ｌと同じ程度にストリンジェントな条件であり；軽ストリンジェントな条件はたとえば、少なくとも条件Ｍ〜Ｒと同じ程度にストリンジェントな条件である。
Figure 2006525330
Figure 2006525330
ｂｐＩ：ハイブリッド長は、ハイブリダイズしているポリヌクレオチドのハイブリダイズされた領域（単数または複数）に対して予想されるものである。ポリヌクレオチドが未知の配列の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合、ハイブリッド長はハイブリダイズしているポリヌクレオチドのそれであると考えられる。公知の配列のポリヌクレオチドがハイブリダイズされる場合、ハイブリッド長はポリヌクレオチドの配列を配置し、最適な相補性の領域または複数の領域を同定することにより決定することができる。
バッファーＨ：ＳＳＰＥ（１ｘＳＳＰＥは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）はハイブリダイゼーションおよび洗浄バッファーにおいてＳＳＣ（１ｘＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）で置き換えることができる；洗浄はハイブリダイゼーション完了後１５分間行われる。
ＴＢ〜ＴＲ：長さが５０塩基対未満であると予想されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度はハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）が以下の方程式に従って決定される場合、Ｔｍの５〜１０ＥＣ未満であるべきである。１８塩基対長未満のハイブリッドでは、Ｔｍ（ＥＣ）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）。１８〜４９塩基対長のハイブリッドでは、Ｔｍ（ＥＣ）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、ここでＮはハイブリッド中の塩基の数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーションバッファー中のナトリウムイオンの濃度である（１ｘＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。
ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのための付加的なストリンジェンシー条件の例としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｕｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，９および１１章、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２．１０および６．３〜６．４節が挙げられ、それらを参照として本明細書に援用する。
本発明はこれらのポリヌクレオチドに完全に相補的であるポリヌクレオチドを提供し、またアンチセンス配列も提供する。本発明のアンチセンス配列はアンチセンスオリゴヌクレオチドとも呼ばれ、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を阻止する、内部で生成された、または外部から投与された配列の両方を包含する。本発明のアンチセンス配列は、たとえば約１５〜２０塩基対を含有する。アンチセンス配列はたとえば、上流の非翻訳配列に結合するプロモーターを妨害するか、またはリボソームの結合を妨害することによって本発明のポリペプチドをコードする転写物の翻訳を妨害することにより転写を阻害するように設計することができる。
本発明のポリヌクレオチドは多くの方法（たとえば化学合成により、ＤＮＡライブラリーから、生体自体から）で作製され、そして種々の形状（たとえば、１本鎖、２本鎖、ベクター、プローブ、プライマー）をとることができる。“ポリヌクレオチド”という用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、そしてさらにそれらの類似体、たとえば改変された骨格を含むものを包含する。
本発明の別の実行に従って、本発明のポリヌクレオチドはＤＮＡライブラリー、たとえばｃＤＮＡライブラリーを包含する。
融合タンパク質
本発明はまた、融合タンパク質に関する。“融合タンパク質”は、２種の、しばしば関連のない、融合遺伝子またはそのフラグメントによりコードされたタンパク質を表す。たとえば、イムノグロブリン分子の定常領域の種々の部分を別の免疫原性タンパク質またはその部分と一緒に含む融合タンパク質である。多くの場合、融合タンパク質の一部としてイムノグロブリンＦｃ領域を利用することは、治療および診断における使用に好都合であり、たとえば改善された薬物動態学的特性を生じる（たとえばＥＰ ０ ２３２ ２６２ Ａ１を参照されたい）。一方、ある種の使用には融合タンパク質が発現され、検出され、そして精製された後、Ｆｃ部分を取り除くことができることが好ましい。本発明の２０８６ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの組換え体産生に使用され、該ポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのコーディング配列だけ、または別のコーディング配列、たとえばリーダーもしくは分泌配列、プレ−、もしくはプロ−、もしくはプレプロ−タンパク質配列、または他の融合ペプチド部分をコードするものと一緒にリーディングフレーム中の成熟ポリペプチドのコーディング配列を包含していてもよい。たとえば、２０８６ポリペプチドまたは融合ポリペプチドの精製を促進するマーカー配列がコードされていてよい（Ｇｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照されたい。これをそのまま参照として本明細書に援用する）。したがって、本発明の実行において、発現産物のＨｉｓ−タグ精製を可能にする融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの製造が企図される。ポリヌクレオチドはまた非−コーディング５’および３’配列、たとえば転写された、非−翻訳配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含んでいてよい。そのような融合ポリペプチドは以下に記載の組換えＤＮＡクローニングビヒクルにより形質転換／トランスフェクションまたは感染された宿主細胞によって産生されてよく、そしてそれはその後宿主細胞から単離され、実質的に他の宿主細胞タンパク質を含まない融合ポリペプチドを提供することができる。
免疫原性組成物
本発明の一側面は免疫原性組成物を提供し、そしてそれは少なくとも１種の２０８６タンパク質または上記タンパク質をコードする核酸を含有する。上記のものは以下の能力を有する：（１）複数の菌株に対して殺菌抗体を誘導する；（２）複数の菌株と反応する；（３）生菌攻撃に対して受動的保護を授ける；および／または（４）コロニー化を妨害する。
そのような免疫原性組成物の製剤化は当業者に公知である。本発明の免疫原性組成物は好ましくは薬剤的に受容できるキャリアを包含する。適切な薬剤的に受容できるキャリアおよび／または希釈剤には、いずれかのそしてすべての慣用の溶媒、分散媒質、充填剤、固体キャリア、水溶液、コーティング剤、抗菌および抗真菌剤、等張性および吸収遅延剤などが挙げられる。適切な薬剤的に受容できるキャリアには、たとえば１種以上の水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グルセロール、エタノールなど、およびぞれらの組み合わせの１以上が挙げられる。薬剤的に受容できるキャリアはさらに、少量の付加的な物質、たとえば湿潤もしくは乳化剤、保存剤またはバッファーを含んでいてもよく、それらは抗体の貯蔵期間または有効性を促進する。薬剤的に受容できるキャリアの製造および使用は当該技術分野で公知である。いずれかの慣用の媒質または物質が活性成分と不適合である場合以外は、本発明の免疫原性組成物におけるその使用が企図される。
そのような免疫原性組成物は非経口的に、たとえば皮下または筋肉内のいずれかの注射により、および経口的または鼻腔内に投与することができる。筋肉内免疫のための方法は、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．，およびＳｅｄｅｇａｈ ｅｔ ａｌ．，により記載される。別の投与様式にはたとえば経口製剤、肺製剤、坐剤、および経皮適用が挙げられるが、それらに限定されない。経口製剤にはたとえば、薬剤的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような通常使用される添加剤が挙げられるが、それらに限定されない。
本発明の免疫原性組成物には以下のものを含む１種以上のアジュバントを挙げることができるが、それらに限定されない：水酸化アルミニウム；リン酸アルミニウム；ＳＴＩＭＵＬＯＮ（登録商標）ＱＳ−２１（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）；ＭＰＬ（登録商標）（３−Ｏ−デアシルモノホスホリル脂質Ａ；Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）、５２９（アミノアルキルグルコサミンリン酸化合物、Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）、ＩＬ−１２（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）；ＧＭ−ＣＳＦ（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）；Ｎ−アセチル−ムラミル−−Ｌ−テロニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）；Ｎ−アセチル−ｎｏｒ−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ １１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと表す）；Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホス−ホリルオキシ−エチルアミン）（ＣＧＰ １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと表す）；およびコレラ毒素。使用することができる他のものとしては、コレラ毒素Ａサブユニットを含むコレラ毒素の非−毒性誘導体、、および／またはコレラ毒素またはそのＢサブユニット（“ＣＴＢ”）とＮ．メニンギティディスポリペプチドの接合体または遺伝子工学的に操作された融合物、プロコレラゲノイド、シゾフィランを含む真菌多糖類、ムラミルジペプチド、ムラミルジペプチド（“ＭＤＰ”）誘導体、ホルボールエステル、大腸菌の熱不安定毒素、ブロックポリマーまたはサポニンが挙げられる。
ある種の好ましい態様において、本発明のタンパク質は粘膜アジュバントを含む経口投与のための免疫原性組成物に使用され、そしてヒト宿主におけるＮ．メニンギティディス感染の処置または予防に使用される。粘膜アジュバントはコレラ毒素であってよい；しかし、好ましくは、本発明に従って使用することができるコレラ毒素以外の粘膜アジュバントには、Ａサブユニットが変異したコレラホロトキシンの非毒性誘導体、化学的に改変されたコレラ毒素、またはコレラ毒素アミノ酸配列の改変により産生された関連タンパク質が挙げられる。本発明の免疫原性組成物の製造にとりわけ有用であってよい具体的なコレラ毒素に関しては、公開された国際特許出願ＷＯ００／１８４３４（これをそのまま本明細書に参照として援用する）に開示された、変異体コレラホロトキシンＥ２９Ｈを参照されたい。これらは本発明のポリペプチドに添加されるか、またはそれらと接合してもよい。同じ技術は大腸菌熱不安定毒素（ＬＴ）のような粘膜アジュバント、または送達特性を持つ別の分子に適用してもよい。粘膜アジュバントまたは送達活性を持つ以下のような別の化合物を使用してもよい：たとえば胆汁；ＤＥＡＥ−デキストランおよびポリオルニチンのようなポリカチオン；ドデシルベンゼン硫酸ナトリウムのような界面活性剤；脂質−結合物質；ストレプトマイシンのような抗生物質；ビタミンＡ；および粘膜表面の構造または機能完全性を変化させる別の化合物。他の粘膜活性化合物には、ＭＤＰのような微生物構造誘導体；アクリジンおよびシメチジンが挙げられる。先に記載のようなＳＴＩＭＵＬＯＮ（登録商標）ＱＳ−２１、ＭＰＬ、およびＩＬ−１２も使用することができる。
本発明の免疫原性組成物はＩＳＣＯＭＳ（免疫刺激複合体）、ＣＴＢを含有するＩＳＣＯＭＳ、リポソームの形状で送達されるか、またはアクリレートもしくはポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコシド）のような化合物に被包されて、吸着に適したサイズのミクロスフェアを形成してもよい。本発明のタンパク質はまた、油性エマルジョンに取り込まれてもよい。
多重抗原
本発明のタンパク質、ポリヌクレオチドおよび等価物を含む免疫原性物質は免疫原性組成物中の唯一の活性免疫原として投与されてもよく、あるいは、該組成物は別のナイセリア種免疫原性ポリペプチド、または１種以上の別の微生物病原体（たとえば、ウイルス、プリオン、細菌または真菌（それらに限定されない））の免疫学的に活性なタンパク質もしくはきょう膜多糖を含む別の活性な免疫原を含んでいてよい。該組成物は選択された徴候に適切な、１以上の所望のタンパク質、フラグメントまたは薬剤的な化合物を含んでいてよい。同じ様に、免疫原性組成物中に１以上の核酸を使用する本発明の組成物はまた、先に記載のように同一の多様なタンパク質群をコードする核酸を含有していてよい。
いずれの多重−抗原または多価免疫原性組成物も本発明により企図される。たとえば、本発明の組成物は、粘膜送達に適切な形状において、２以上の２０８６タンパク質の組み合わせ、１以上のＰｏｒＡタンパク質と２０８６タンパク質の組み合わせ、髄膜炎菌セログループＡ、Ｃ、ＹおよびＷ１３５多糖類および／または多糖接合体と２０８６タンパク質の組み合わせ、髄膜炎菌および肺炎球菌の組み合わせと２０８６タンパク質の組み合わせ、または上記のいずれかの組み合わせを含んでいてよい。当業者はそのような多重抗原または多価免疫原性組成物を容易に製剤化することができるであろう。
本発明はまた、病原体に対して有用ないずれかの組成物を本発明の組成物の中に、またはそれらと一緒に組み合わせることができる多重免疫化処方計画を企図する。たとえば、非限定的に、患者は多重免疫化処方計画の一部として、Ｓ．ニューモニアに対して免疫するために本発明の免疫原性組成物と別の免疫原性組成物を投与されてもよい。当業者は、多重免疫処方計画を開発および実施するために、本発明の免疫原性組成物と一緒に使用するための免疫原性組成物を容易に選択することができるであろう。
本発明の具体的態様は、Ｓ．ニューモニア感染の予防または改善のための組成物における、または処置計画の一部としての、１以上の本発明のポリペプチド、またはそのようなものをコードする核酸の使用に関する。２０８６ポリペプチドまたは２０８６ポリヌクレオチドは、Ｓ．ニューモニア感染に対して使用するためにいずれかの免疫原性組成物と組み合わせることができる。また、２０８６ポリペプチドまたは２０８６ポリヌクレオチドはいずれか別のタンパク質または多糖を基礎にした髄膜炎菌ワクチンと組み合わせてもよい。
２０８６ポリペプチド、フラグメントおよび等価物は接合型免疫原性組成物の一部として使用してもよく；その場合１以上のタンパク質またはポリペプチドがキャリアに接合し、いくつかのセロタイプに対し、および／またはいくつかの疾患に対し免疫原性を有する組成物が生じる。あるいは、２０８６ポリペプチドの１種は別の免疫原性ポリペプチドのキャリアタンパク質として使用することができる。
本発明はまた、本発明の免疫原性組成物を哺乳動物に提供する段階を含む、上記哺乳動物において免疫反応を誘発する方法に関する。免疫原性組成物は、そのような免疫原性組成物に含有される免疫学的有効量のポリペプチド（単数または複数）がＮ．メニンギティディス感染に対して所望する免疫反応を引き起こすように、処置される動物またはヒトに抗原性の組成物である。好ましい態様は、ヒトに免疫学的有効量の組成物を投与することを含む、ヒトにおけるＮ．メニンギティディス感染の改善、または予防を含む、処置の方法に関する。
本明細書で使用する“免疫学的有効量”という句は、少なくとも処置される個体の免疫系に、単一投与量または一連の投与量の一部としてのいずれかで、細菌感染の臨床的影響を軽減する応答を誘発させるための、哺乳動物宿主（好ましくはヒト）への十分な量の投与を表す。このことは細菌負担のわずかな軽減から、感染の予防までに及ぶ。理論的には、処置された個体はより重篤な細菌感染の徴候を示さないことになる。投与量は個体の具体的な状態に依存して変化してよい。この量は定法、または当業者に公知の手段によって決定することができる。
本発明の別の具体的な側面は、免疫原性組成物として、本発明のタンパク質、またはその免疫原性部分を発現するベクターまたはプラスミドを使用することに関する。したがって、本発明の別の側面は哺乳動物に免疫反応を誘発する方法を提供し、そしてそれは少なくとも１種の単離された２０８６ポリペプチドを発現するベクターまたはプラスミドを哺乳動物に提供することを含む。本発明のタンパク質は、外来ポリペプチドとしてのポリペプチドまたは免疫原性部分の発現に必要な遺伝物質を含有する生きたベクターを使用して、とりわけ生きた組換え細菌、ウイルスまたは他の生きた因子を使用して、哺乳動物に送達することができる。
本発明の別の実行に従って、一方法は、哺乳動物または上記哺乳動物由来の組織試料における免疫複合体の存在の検出を含む、該哺乳動物における髄膜炎菌の診断を提供し、上記哺乳動物または組織試料はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２〜２５２の偶数番号およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１〜４４３の奇数番号のいずれかのアミノ酸配列を含む少なくとも１種のポリペプチドと免疫特異的に結合する抗体を含む、抗体組成物と接触さえ；ここで該哺乳動物または組織試料は免疫複合体の形成に適切な条件下で抗体組成物と接触させる。
ウイルスおよび非ウイルスベクター
とりわけｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの細胞アッセイのための好ましいベクターには、ウイルスベクター、たとえばレンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、および好ましい細胞親和性を有する他の組換えウイルスが挙げられる。したがって、２０８６タンパク質またはその免疫原性フラグメントをコードする核酸はウイルスベクターを使用して、またはＤＮＡの直接導入によりｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで導入することができる。標的組織における発現は、具体的な細胞をトランスジェニックベクター、たとえばウイルスベクターまたは受容体リガンドの標的にすることにより、もしくは組織特異的プロモーターを使用することにより、または両方により行うことができる。標的化された遺伝子送達はＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／２８４９４に記載され、それをそのまま参照として本明細書に援用する。
ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏターゲッティングおよび治療手順に通常使用されるウイルスベクターは、ＤＮＡを基礎にしたベクターおよびレトロウイルスベクターである。ウイルスベクターの構築および使用の方法は当該技術分野で公知である（たとえば、Miller and Rosman, BioTechniques, 1992, 7:980-990）。好ましくは、ウイルスベクターは複製欠陥性であり、すなわち、それらは標的細胞において自発的に複製することができない。好ましくは、複製欠陥ウイルスは最小ウイルスであり、すなわち、それはゲノムを封入し、ウイルス粒子を産生するために必要なゲノム配列だけを保持する。
ＤＮＡウイルスベクターには、弱毒または欠陥ＤＮＡウイルス、たとえば単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、パピローマウイルス、エプスタインバーウイルス（ＥＳＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などが挙げられる。完全に、またはほとんどウイルス遺伝子を欠く、欠陥ウイルスが好ましい。欠陥ウイルスは細胞に導入後は感染性でない。欠陥ウイルスベクターを使用すると、該ベクターが別の細胞に感染する可能があることを懸念せずに、特定の、限定された部位の細胞に投与できる。したがって、特定の組織を限定して標的にすることができる。具体的なベクターの例としては以下のものが挙げられるが、それらに限定されない：欠陥ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）ベクター（Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci, 1991, 2:320-330）、糖タンパク質Ｌ遺伝子を欠如する欠陥ヘルペスウイルスベクター、または別の欠陥ヘルペスウイルスベクター（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２１８０７およびＷＯ９２／０５２６３）；弱毒アデノウイルスベクター、たとえばＳｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．（J. Clin. Invest., 1992, 90: 626-630; La Salle et al., Science, 1993, 259:988-990も参照されたい）；および欠陥アデノ随伴ウイルスベクター（Samulski et al., J. Viol., 1987, 61:3096-3101; Samulski et al., J. Viol., 1989, 63:3822-3828; Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol., 1988, 8:3988-3996）。これらをそれぞれそのまま参照として本明細書に援用する。
以下に挙げる種々の会社がウイルスベクターを市販しているが、それらに限定されない：Ａｖｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ；ＡＡＶベクター）、Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｓｙｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ；レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶベクター、およびレンチウイルスベクター）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（レトロウイルスおよびバキュロウイルスベクター）、Ｇｅｎｏｖｏ，Ｉｎｃ．（Ｓｈａｒｏｎ Ｈｉｌｌ，ＰＡ；アデノウイルスおよびＡＡＶベクター）、Ｇｅｎｅｃ（アデノウイルスベクター）、ＩｎｔｒｏＧｅｎｅ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；アデノウイルスベクター）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ、およびヘルペスウイルスベクター）、Ｎｏｒｇｅｎ（アデノウイルスベクター）、Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ；レンチウイルスベクター）、およびＴｒａｎｓｇｅｎｅ（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ，Ｆｒａｎｃｅ；アデノウイルス、ワクシニア、レトロウイルス、およびレンチウイルスベクター）。これらをそのまま参照として本明細書に援用する。
アデノウイルスベクター。アデノウイルスは本発明の核酸を多様な細胞型に効率的に送達するために改変することができる、真核細胞ＤＮＡウイルスである。種々のアデノウイルスセロタイプが存在する。本発明の範囲内では、これらのセロタイプの中で２型または５型ヒトアデノウイルス（Ａｄ２またはＡｄ５）または動物起源のアデノウイルス（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２６９１４を参照されたい）を使用することが好ましい。本発明の範囲内で使用することができる動物起源のアデノウイルスには、イヌ、ウシ、マウス（例：Ｍａｖ１、Beard et al., Virology, 1990, 75-81）、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、およびサル（例：ＳＡＶ）起源のアデノウイルスが挙げられる。好ましくは、動物起源のアデノウイルスはイヌアデノウイルス、より好ましくはＣＡＶ２アデノウイルス（たとえば、ＭａｎｈａｔｔａｎまたはＡ２６／６１株、ＡＴＣＣ ＶＲ−８００）である。種々の複製欠陥アデノウイルスおよび最小アデノウイルスベクターが記載されている（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２６９１４、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９６／２２３７８）。本発明に記載の複製欠陥組換えアデノウイルスは、当業者に公知のいずれの技術でも作製することができる（Levreto et al., Gene, 1991, 101:195；欧州特許公開番号．ＥＰ １８５ ５７３；Graham, EMBO J., 1984, 3:2917; Graham et al., J. Gen. Virol., 1977, 36:59）。組換えアデノウイルスは、当業者に公知の標準分子生物学的技術を使用して、回収され、精製される。
アデノ随伴ウイルス。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は安定な、部位特異的様式でそれらが感染する細胞のゲノムに結合することができる、比較的小さなサイズのＤＮＡウイルスである。それらは細胞増殖、形態または分化にどのような影響も与えずに広い範囲の細胞に感染することができ、そしてそれらはヒトの病理に関与しないと考えられる。ＡＡＶゲノムはクローニングされ、配列決定され、そして性状が解析されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子を移入させるためのＡＡＶ由来ベクターの使用が記載されている（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１８０８８およびＷＯ９３／０９２３９；米国特許第４，７９７，３６８号および５，１３９，９４１号；欧州特許公開番号．４８８ ５２８）。本明細書に記載の複製欠陥ＡＡＶは、ヒトヘルパーウイルス（たとえばアデノウイルス）が感染した細胞系統に、２種のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）領域が隣接する、関心のある核酸配列を含むプラスミド、およびＡＡＶキャプシド形成遺伝子（ｒｅｐ ａｎｄ ｃａｐ遺伝子）を持つプラスミドを共トランスフェクションすることにより作製することができる。産生されたＡＡＶ組換え体はその後標準技術により精製される。
レトロウイルスベクター。本発明の別の実行において、核酸は以下に記載のように、レトロウイルスベクターに導入することができる：たとえば、米国特許第５，３９９，３４６号；Mann et al., Cell, 1983, 33:153；米国特許第４，６５０，７６４号および４，９８０，２８９号；Markowitz et al., J. Viol., 1988, 62:1120；米国特許第５，１２４，２６３号；欧州特許公開番号ＥＰ ４５３ ２４２およびＥＰ １７８ ２２０；Bermstein et al., Genet. Eng., 1985, 7:235; McCormick, BioTechnology, 1985, 3:689；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／０７３５８；およびKuo et al. Blood, 1993, 82:845。これらのそれぞれはそのまま参照として本明細書に援用する。レトロウイルスは分裂細胞に感染する統合ウイルスである。レトロウイルスゲノムは２種のＬＴＲ、キャプシド形成配列および３種のコーディング領域（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を含有する。組換えレトロウイルスベクターでは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子は一般に全部または一部が欠失し、関心のある異種核酸配列により置換される。これらのベクターは異なる型のレトロウイルス、たとえばＨＩＶ、ＭｏＭｕＬＶ（“マウスモロニー白血病ウイルス”）、ＭＳＶ（“マウスモロニー肉腫ウイルス”）、ＨａＳＶ（“ハーベイ肉腫ウイルス”）；ＳＮＶ（“脾臓壊死ウイルス”）；ＲＳＶ（“ラウス肉腫ウイルス”）およびフレンドウイルスから構築することができる。適切なパッケージング細胞系統、とりわけ細胞系統ＰＡ３１７（米国特許第４，８６１，７１９号）；ＰｓｉＣＲＩＰ細胞系統（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／０２８０６）およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２細胞系統（ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／０７１５０）が先行技術において記載されている。さらに、組換えレトロウイルスベクターは転写活性を抑制するためにＬＴＲ内のある種の改変、およびｇａｇ遺伝子の一部を含有することができる拡張キャプシド形成配列を含んでいてよい（Bender et al., J. Viol., 1987, 61:1639）。組換えレトロウイルスベクターは当業者に公知の技術により精製される。
レトロウイルスベクターは感染性粒子として機能するか、または１回のトランスフェクションを行うために構築される。前者の場合、ウイルスは腫瘍形成性形質転換に関与する遺伝子以外のそのすべての遺伝子を保持し、異種遺伝子を発現するように改変される。非感染性ウイルスベクターは、ウイルスパッケージングシグナルを破壊するが、異種遺伝子およびパッケージングシグナルを含有するように作り出された、共導入されるウイルスをパッケージするために必要な構造遺伝子を保持するように操作される。したがって、産生されるウイルス粒子は付加的なウイルスを産生することができない。
レトロウイルスベクターはまた、ＤＮＡウイルスに導入されてもよく、そのことは１サイクルのレトロウイルス複製を可能にし、トランスフェクション効率を増幅する（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／２２６１７、ＷＯ９５／２６４１１、ＷＯ９６／３９０３６およびＷＯ９７／１９１８２を参照されたい）。
レンチウイルスベクター。本発明の別の実行において、レンチウイルスベクターは、脳、網膜、筋肉、肝臓および血液を含むいくつかの組織型におけるトランスジーンの直接送達および持続的発現のための剤として使用することができる。該ベクターはこれらの組織の分裂および非分裂細胞に効率的に形質導入し、関心のある遺伝子を長期間発現させることができる。総説としてはNaldini, Curr. Opin. Biotechnol., 1998, 9:457-63を参照されたい；さらにZufferey,et al., J. Viol., 1998, 72:9873-80も参照されたい）。レンチウイルスパッケージング細胞系統は入手可能であり、当該技術分野で一般に公知である。それらは遺伝子治療のための高力価レンチウイルスベクターの産生を促進する。例としては、少なくとも３〜４日間で１０６ＩＵ／ｍＬ以上の力価でウイルス粒子を生み出すことができるテトラサイクリン誘導性ＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスパッケージング細胞系統が挙げられる（Kafri,et al., J.Viol., 1999, 73:576-584）。誘導性細胞系統により産生されるベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて非分裂細胞に効率的に形質導入するために必要なだけ、濃縮することができる。
非ウイルスベクター。本発明の別の態様において、ベクターは裸ＤＮＡのように、リポフェクションにより、または別のトランスフェクション促進剤（ペプチド、ポリマーなど）によりｉｎ ｖｉｖｏで導入されてもよい。合成カチオン脂質を使用して、マーカーをコードする遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションのためのリポソームを作製することができる（Felgner, et al., Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A., 1987, 84:7413-7417; Felgner and Ringold, Science, 1989, 337:387-388; Mackey, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85:8027-8031; Ulmer et al., Science, 1993, 259:1745-1748を参照されたい）。核酸の移入に有用な脂質化合物および組成物はＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／１８８６３およびＷＯ９６／１７８２３、および米国特許第５，４５９，１２７号に記載される。脂質はターゲッティングのために別の分子に化学的に結合してもよい（Ｍａｃｋｅｙ，ｅｔ．ａｌ．，上記を参照されたい）。標的化ペプチド、たとえばホルモンまたは神経伝達物質、および抗体のようなタンパク質、または非ペプチド分子は化学的にリポソームに結合してもよい。
カチオンオリゴペプチド（たとえばＰＣＴ特許公開Ｎｏ．ＷＯ９５／２１９３１）、ＤＮＡ結合タンパク質由来のペプチド（たとえばＰＣＴ特許公開Ｎｏ．ＷＯ９６／２５５０８）由来のペプチド、またはカチオン性ポリマー（たとえばＰＣＴ特許公開Ｎｏ．ＷＯ９５／２１９３１）のような別の分子もｉｎ ｖｉｖｏにおける核酸のトランスフェクションの促進に有用である。
裸ＤＮＡプラスミドとしてｉｎ ｖｉｖｏでベクターを導入することも可能である。ワクチン用途または遺伝子治療のための裸ＤＮＡベクターは当該技術分野で公知の方法、たとえばエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿法、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクタートランスポーターの使用により所望する宿主細胞に導入することができる（たとえば、Wu et al., J. Biol. Chem., 1992, 267:963-967; Wu and Wu, J. Biol. Chem., 1988, 263:14621-14624；カナダ特許出願第２，０１２，３１１号；Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88:2726-2730)。さらに受容体媒介ＤＮＡ送達法を使用することができる（Curiel et al., Hum. Gene Ther., 1992, 3:147-154; Wu and Wu, J.Biol.Chem., 1987, 262:4429-4432)。米国特許第５，５８０，８５９号および５，５８９，４６６号は、哺乳動物におけるトランスフェクション促進剤のない外来ＤＮＡ配列の送達を開示する。最近、エレクトロトランスファーと名付けられた、比較的低電圧で、効率のよい、ｉｎ ｖｉｖｏＤＮＡ導入技術が記載されている（Mir et al., C. P. Acad. Sci., 1988, 321:893；ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９９／０１１５７；ＷＯ９９／０１１５８；ＷＯ９９／０１１７５）。したがって、本発明の別の態様は、本発明の２０８６ポリペプチドをコードするある量のＤＮＡ分子を、場合によりトランスフェクション促進剤と共にヒトに投与することを含む、上記ヒトにおける免疫反応を誘発する方法に関し、ここで上記ポリペプチドは、発現された場合、免疫原性を保持し、そして免疫原性組成物に組み込まれ、そしてヒトに投与された場合、その後Ｎ．メニンギティディスのような、ナイセリア種病原体にヒトが感染したときに強化された疾患を誘発することなく、保護を提供する。トランスフェクション促進剤は当該技術分野で公知であり、ブピビカイン、および他の局所麻酔薬（たとえば、米国特許第５，７３９，１１８号を参照されたい）、ならびにカチオン性ポリアミン（国際特許出願ＷＯ９６／１００３８に公開）を包含し、それらは参照として本明細書に援用される。
本発明はまた、抗体に関し、そしてそれは上記のように２０８６ポリペプチドに特異的な、モノクローナルまたはポリクローナル抗体のいずれであってもよい。そのような抗体は当業者に公知の方法により産生することができる。
細菌発現系およびプラスミド
本発明はまた、プロモーター配列およびイニシエーター配列を有する発現制御配列、ならびに本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する、ベクターまたはプラスミドのような組換えＤＮＡ分子を提供し、該ヌクレオチド配列はプロモーターおよびイニシエーター配列に対し、３’に位置する。さらに別の側面において、本発明はプロモーター配列およびイニシエーター配列を有する発現制御配列、ならびに２０８６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する、２０８６ポリペプチドを発現することができる組換えＤＮＡクローニングビヒクルを提供し、該ヌクレオチド配列はプロモーターおよびイニシエーター配列の３’に位置する。別の側面において、先に記載の組換えＤＮＡクローニングビヒクルおよび／または組換えＤＮＡ分子を含有する宿主細胞が提供される。適切な発現制御配列および宿主細胞／クローニングビヒクルの組み合わせは当該技術分野で公知であり、例としてはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）に記載される。
ひとたび本発明の所望するポリペプチドを発現する組換えＤＮＡクローニングビヒクルおよび／または宿主細胞が、対応する２０８６ポリヌクレオチドを含有するプラスミドにより形質転換、トランスフェクションまたは感染させることにより構築されていれば、クローニングビヒクルまたは宿主細胞は該ポリペプチドが発現されるような条件下で培養される。その後ポリペプチドは当業者に公知の技術により、実質的に宿主細胞成分に汚染されずに単離される。
以下に実施例を挙げ、本発明の好ましい態様を説明する。当業者は、以下に記載の実施例に開示された技術が、本発明の実施において十分に機能するように本発明者らが見出した技術を表し、したがってその実施のための好ましい様式を構成すると見なしてよいことを理解すべきである。しかし、当業者は本発明の開示を考慮して、開示されている具体的な態様に多くの変更が行われ、そして依然として、本発明の意図および範囲から逸脱することなく、同じか、または類似の結果が得られることを理解すべきである。
実施例
実施例１
異種菌株に対して殺菌抗体を誘導することができる髄膜炎菌膜タンパク質抽出物の同定
以下の表ＩＩに表すように、ＬＯＳ−除去外膜タンパク質調製物は殺菌抗体を誘導することが示されている。これらの抗体はしばしばそれぞれの菌株のＰｏｒＡを指向する。セログループＢ髄膜炎菌株８５２９（Ｂ：１５：Ｐ１．７ｂ，３）由来のＬＯＳ−除去外膜調製物は、予想外にいくつかの異種菌株に対する殺菌抗体を誘導するので、それらは上記の性質において異常である。
Figure 2006525330
異種殺菌抗体の誘導に関与する抗原（単数または複数）の単離および性状決定を促進するために、どの界面活性剤が最も適切にその抗原（単数または複数）を抽出するかを同定することを試みた。
菌株および培養条件
凍結ウイルス由来のＮ．メニンギティディス菌株８５２９はＧＣプレートに筋状にまいた。（髄膜炎菌株８５２９はＲＩＶＭ、Ｂｉｌｔｈｏｖｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄから供与された）。プレートは３６Ｃ／５％ＣＯ２で７．５時間インキュベートした。いくつかのコロニーを使用して、５０ｍＬの改変フランツ培地＋ＧＣサプリメントを含有するフラスコに接種した。フラスコはエアーシェーカー中、３６℃でインキュベートし、２００ＲＰＭで４．５時間撹拌した。５ｍＬを使用して、４５０ｍＬの改変フランツ培地＋ＧＣサプリメントを含有するフェルンバッハフラスコに接種した。フラスコはエアーシェーカー中、３６℃でインキュベートし、１００ＲＰＭで１１時間撹拌した。全部で４５０ｍＬを使用して、１０Ｌ発酵装置中の８．５Ｌの改変フランツ培地＋ＧＣサプリメントに接種した。
Figure 2006525330
発酵中以下のパラメータが制御された：温度＝３６℃；ｐＨ＝７．４；溶解酸素＝２０％。数滴のＰ−２０００消泡剤を添加し、発泡を制御した。培養物は定常期まで培養した。細胞はＯＤ６５０＝５．２５において遠心分離により採取した。一般に、全部で１００〜３００グラムの湿潤細胞ペーストを約８．５Ｌの培養物から採取した。
異種殺菌抗体を誘導する髄膜炎菌由来の外膜タンパク質画分の部分的精製
湿重量１００ｇｍｓの細胞を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡで湿重量の５倍の容積に懸濁し、約１８，０００ｐｓｉでチャンバーに備えられた１１０Ｙマイクロフリュイダイザーを通過させることにより溶解した。細胞溶解物を清澄にし、３００，０００ｘｇ、１時間、１０℃で遠心分離することにより細胞エンベロープを分離した。細胞エンベロープを同じバッファーでホモジナイザーで懸濁し、続いて上述のように遠心分離することにより２回洗浄した。次に細胞エンベロープを１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＭｇＣｌ２中の１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ３２０ｍＬで抽出した。以下の表ＩＩＩに示すように、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００およびＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４を使用した逐次ディファレンシャル界面活性剤抽出、その後のマウスの免疫化から、Ｔｒｉｔｏｎ抽出物が関心のある候補（単数または複数）を最適に抽出したことを確認した。表ＩＩＩに挙げた５種の菌株のうち４種に対して殺菌抗体反応を誘発するこのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００抽出物は、ＢｉｏＲａｄ Ｒｏｔｏｐｈｏｒユニット中でプレパラティブ等電点分離法（ＩＥＦ）を使用して分画した。両性電解質濃度は１％ ｐＨ３〜１０と１％ ｐＨ４〜６の混合であった。表ＩＩＩに示すように、いくつかの画分は異種殺菌反応を誘発することが見出された。ｐＨ５．５〜７．８の範囲に集められた、ＩＥＦから得た画分は殺菌アッセイにより確認された大部分の菌株に異種反応を誘発した。集めたＩＥＦ画分は濃縮し、両性電解質はエタノール沈殿により除去した。約ｐＨ５．５〜７．８の範囲で得られたタンパク質のいくつかをアニオン交換カラムに吸着させ、吸着および非吸着タンパク質でマウスを免疫後に得られた殺菌活性を比較することによりさらに精製を行った。また表ＩＩに示すように、多くのタンパク質がアニオン交換樹脂に吸着するが、カラムに吸着しないタンパク質はより多くの異種殺菌抗体を誘導した。
Figure 2006525330
図１Ａに示すように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した２種の主要タンパク質が非吸着タンパク質画分に存在した。これらのタンパク質を同定するために、２種の分析を行った。１種の分析は、限定タンパク質分解（図１Ａ、および図１Ｂを参照されたい）、続いてペプチドの分離および直接タンパク質配列決定を行うことであった。別の分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてゲル切り出し、タンパク質分解、およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィータンデム質量分析）（図３参照）を行い、関心のある調製物の成分の質量スペクトル情報を得ることであった。（本節で以下に記載のペプチドマッピングおよび配列決定法を参照されたい）。
Ｎ．メニンギティディスＡのＳａｎｇｅｒゲノム配列はＺａｇｕｒｓｋｙ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ，２００１，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３１：６３６−６５９に記載の方法およびアルゴリズムを使用して分析した。このマイニング分析から、１２，０００以上の可能性のあるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を得た。上記の直接配列データおよび質量スペクトルデータは、非吸着タンパク質画分の主要成分がＳａｎｇｅｒデータベースの分析に存在するいつくかのＯＲＦの産物であることを示した。この方法により同定された３種の主なタンパク質はＯＲＦ４４３１、５１６３および２０８６に相当する（図１Ｂおよび３を参照されたい）。
ＯＲＦ４４３１は該画分に同定された最も主要なタンパク質であるが、組換え脂質化４４３１に対するマウス抗体は殺菌性ではなく、動物モデルに保護反応を提供しなかった。ＯＲＦ５１６３の付加的な解析は進行中である。
本明細書に記載の調製物の２番目に主要な成分はＯＲＦ２０８６の産物に相当する。
免疫原性法：
抗血清の作製：
特記しない限り、タンパク質組成物／ワクチンは総タンパク質２５μｇにより製剤し、２０μｇのＱＳ−２１をアジュバントとして添加した。投与量０．２ｍＬを、０および４週目に６〜８週齢の雌Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスに皮下（臀部）注射により投与した。０および４週目に血液を採取し、６週目に全採血を行った。
殺菌アッセイ：
殺菌アッセイは本質的に記載されたように行った（Ｍｏｕｎｔｚｏｕｒｏｓ ａｎｄ Ｈｏｗｅｌｌ，２０００，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３８（８）：２８７８−２８８４を参照されたい）。ＳＢＡに対する補体媒介抗体依存的殺菌力価は、アッセイに導入された標的細胞の≧５０％を致死させる試験血清の最高希釈の逆数として表現した（ＢＣ５０力価）。
２０８６タンパク質を同定するために使用された方法：
臭化シアン開裂およびフラグメントの直接配列決定：
アニオン交換非吸着画分（ＡＥＵＦ）の臭化シアン開裂。ＡＥＵＦは９０％冷エタノールで沈殿させ、７０％ギ酸中の１０ｍｇ／ｍＬの臭化シアンにより、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度に可溶化した。反応は暗所中、室温で一晩行った。開裂生成物は高速真空により乾燥させ、ペレットはＨＥ／０．１％還元ＴＸ−１００で可溶化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてＮ−末端アミノ酸配列決定を使用してこの画分の成分を同定した。
成分を同定するためのプロテアーゼ消化／逆相／Ｎ−末端配列決定：
ＡＥＵＦはＧｌｕＣ（Ｖ８）、ＬｙｓＣまたはＡｒｇＣで消化した。タンパク質対酵素の比は３０μｇタンパク質対１μｇ酵素であった。消化は３７℃で一晩行った。消化されたタンパク質混合物（３０μｇ）は７ミクロンＡｑｕａｐｏｒｅ ＲＦ−３００カラムに通し、０．１％トリフルオロ酢酸中の１０〜９５％アセトニトリルのグラジエントで溶出し、ピークを手動で集めた。無タンパク質ブランクも流し、これのピークを試料のクロマトグラムから減じた。試料測定中だけに現れるピークを質量分析計により分析し、明瞭な質量を示す試料をＮ−末端アミノ酸配列決定のために分析した。
Ｎ−末端アミノ酸配列決定：
ブロットから切り出したバンドの場合、タンパク質試料はＳＤＳゲルからＰＶＤＦ膜に移し、アミドブラック（脱イオン水中１０％酢酸、０．１％アミドブラック）で染色し、１０％酢酸で脱色する。次に所望するタンパク質バンドをメタノールで洗浄したメスまたはミニ−Ｅｘａｃｔｏナイフを使用して全１０レーンから切り出し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４７７Ａタンパク質シークエンサーの反応カートリッジに入れる。溶液中の試料の直接配列決定の場合、Ｐｒｏｓｏｒｂカートリッジを集め、ＰＶＤＦを６０μＬのメタノールで湿らす。該ＰＶＤＦを５０μＬの脱イオン水で洗浄し、試料（５０μＬ）をＰＶＤＦにおく。５０μＬの脱イオン水を使用して試料をリンスした後、Ｐｒｏｓｏｒｂ ＰＶＤＦを押し抜き、乾燥し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４７７Ａタンパク質シークエンサーの反応カートリッジにおく。両方法の場合、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｎ−末端シークエンサーを最適ブロット条件下で１２サイクル以上（１サイクル ブランク、１サイクル 標準、および所望する残基同定のための１０サイクル以上）操作し、ＰＴＨ−アミノ酸検出をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ １２０Ａ ＰＴＨアナライザーで行う。サイクルはアナログチャートレコーダーおよび装置ソフトウェアによるデジタル式の両方で集める。アミノ酸の帰属は、アナログおよびデジタルデータの両方を使用して、ＰＴＨ−アミノ酸の標準セットとアナライザー上のそれら個々の保持時間の比較により行われる（システイン残基は変換中に破壊され、検出されない）。複数の配列情報を単一の残基から得ることが可能であり、一次対二次帰属はシグナル強度に基づいて行われる。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ
ＩＥＦにより精製されたタンパク質試料はさらにＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。タンパク質はクーマシーブルー染色により視覚化し、関心のあるバンドを手動で切り出し、その後還元し、アルキル化し、そして自動ｉｎ−ｇｅｌトリプシン消化ロボット（１）を使用してｉｎ ｓｉｔｕでトリプシンにより消化（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）した。消化後、ペプチド抽出物はＳａｖａｎｔ Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ，Ｈｏｌｄｂｒｏｏｋ，ＮＹ）を使用して、最終容積１０〜２０μＬに濃縮した。
ペプチド抽出物は自動マイクロエレクトロスプレイ逆相ＨＰＬＣで分析した。手短に述べると、マイクロエレクトロスプレイインターフェースは、１０ｕｍＣ１８逆相ビーズ（ＹＭＣ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ）で長さ１０ｃｍに充填した、Ｐｉｃｏｆｒｉｔフューズドシリカスプレイニードル、長さ５０ｃｍ、ＩＤ７５ｕｍ、８ｕｍオリフィス直径（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）から構成された。Ｐｉｃｏｆｒｉｔニードルは、質量分析計の前に位置する手製基部に保持された光ファイバーホルダー（Ｍｅｌｌｅｓ Ｇｒｉｏｔ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）に取り付けた。カラムの後ろを、チタンユニオンを介して配管し、エレクトロスプレイインターフェースに電気的接続を供給した。ユニオンはある長さのフューズドシリカキャピラリー（ＦＳＣ）管と共に、ＨＰＬＣ溶媒ポンプ（ＡＢＩ １４０Ｃ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）に連結されたＦＡＭＯＳオートサンプラー（ＬＣ−Ｐａｃｋｉｎｇｓ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）に連結した。ＨＰＬＣ溶媒ポンプは５０μＬ／分の流量を送達し、それをＰＥＥＫマイクロタイトスプリッティングティー（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏａｋ Ｈａｒｂｏｒ，ＷＡ）を使用して２５０ｎＬ／分に減らし、ＦＳＣトランスファーラインを使用してオートサンプラーに送った。ＬＣポンプおよびオートサンプラーはそれらの内部ユーザープログラムを使用してそれぞれコントロールした。試料はプラスチックオートサンプラーバイアルに入れ、密封し、５μＬ試料ループを使用して注入した。
マイクロキャピラリーＨＰＬＣ−質量分析：
ｉｎ−ｇｅｌ消化由来の抽出されたペプチドはマイクロエレクトロスプレイＨＰＬＣシステムにより０〜５０％溶媒Ｂ（Ａ：０．１Ｍ ＨｏＡｃ、Ｂ：９０％ ＭｅＣＮ／０．１Ｍ ＨｏＡｃ）の５０分間グラジエントを使用して分けた。ペプチド分析は、スプレイ電位１．５ｋＶで作動し、加熱キャピラリー温度１５０℃を使用したＦｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱイオントラップ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で行った。データは、機器と共に提供されたデータ獲得ソフトウェアを使用して、自動ＭＳ／ＭＳモードで得た。取得法は、１ＭＳスキャン（３７５〜１２００ｍ／ｚ）、続くＭＳスキャン中の最も豊富な３種のイオンのＭＳ／ＭＳスキャンを包含した。動的排除関数および同位体排除関数を使用して分析されるペプチドの数を増やした（セッティング：３ａｍｕ＝排除幅、３分＝排除期間、３０秒＝排除前期間、３ａｍｕ＝同位体排除幅）。ＭＳ／ＭＳデータの自動分析は、Ｎ．メニンギティディスの完全ゲノム由来のタンパク質データベース（Ｓａｎｇｅｒ由来）を使用して、Ｆｉｎｎｉｇａｎ Ｂｉｏｗｏｒｋｓデータ解析パッケージに含まれたＳＥＱＵＥＳＴコンピュータアルゴリズム（ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して実行した。研究の結果は図３に示す。
実施例２
組換え脂質化Ｐ２０８６（ｒＬＰ２０８６）のクローニング：
Ａ．）天然のリーダー配列：
供与源物質：
ＯＲＦ２０８６遺伝子は８５２９と呼ばれるセログループＢナイセリア メニンギティディス株の臨床分離菌からＰＣＲにより増幅された。この菌株のセログループ、セロタイプおよびセロサブタイプは括弧で示される；８５２９（Ｂ：１５、Ｐ１：７ｂ、３）。この髄膜炎菌株はＴｈｅ ＲＩＶＭ，Ｂｉｌｔｈｏｖｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから得た。髄膜炎菌株８５２９由来の成熟２０８６タンパク質遺伝子配列は本明細書ではＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２として提供される。
ＰＣＲ増幅およびクローニング法：
ＯＲＦ２０８６の肉眼検査は、この遺伝子が潜在的なリポタンパク質シグナル配列を有することを示した。独自の（proprietary）隠れマルコフモデルリポタンパク質アルゴリズム（Hidden Markov Model Lipoprotein algorithm）を使用した付加的な解析は、ＯＲＦ２０８６がリポタンパク質シグナル配列を含有することを確証した。より自然に近いコンホメーションでＰ２０８６を組換え発現するために、オリゴヌクレオチドプライマーを設計して、リポタンパク質シグナル配列を持つ全長遺伝子をそのまま増幅するために設計し、そしてそれらはＮ．メニンギティディスＡ ＯＲＦ２０８６のＳａｎｇｅｒ配列の解析に基づいており、
Figure 2006525330
それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０４（化合物Ｎｏ．４６２４）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０３（化合物Ｎｏ．４６２３）である。（本明細書の表ＩＶも参照されたい）。２０８６遺伝子はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）［ＡＢＩ２４００サーマルサイクラー，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ］によりＮ．メニンギティディス菌株８５２９から増幅した。正しいサイズの増幅産物は連結し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。プラスミドＤＮＡはＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで制限消化し、ゲル精製し、ｐＥＴ−２７ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に連結した。
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドプライマーは、β−シアノエチルホスホロアミダイト化学（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）を使用して、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓオリゴヌクレオチドシンセサイザー，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ、で合成した。ＯＲＦ２０８６遺伝子ファミリーのＰＣＲ増幅に使用されるプライマーは表ＩＶに挙げられ、それは本発明のプライマーの限定的でない例を示す。
Figure 2006525330
Figure 2006525330
天然のリーダー配列を使用したｒＬＰ２０８６タンパク質発現：
図５に表すように、プラスミドｐＰＸ７３４０をＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ宿主細胞（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に形質転換／トランスフェクション、または感染させた。１種の形質転換体を選択し、２％グルコース、カナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）、クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）、およびテトラサイクリン（１２μｇ／ｍＬ）を含有するテリフィックブロス（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）５０ｍＬに接種した。一晩培養した培養物のＯＤ６００は６．０であった。一晩培養した培養物は１％グリセロールおよび同じ抗生物質を含有するテリフィックブロス１リットルで希釈した。出発ＯＤ６００は０．４であった。２時間後、ＯＤ６００は１．６であり、誘導前試料を採取した。ＯＤ６００＝１に等価の細胞は遠心分離し、上清を除去した。全細胞ペレットを１５０μＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーおよび１５０μＬの２ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファーに再懸濁した。ＩＰＴＧを添加し、最終濃度１ｍＭとした。３．５時間後、記載のように誘導後試料を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図４を参照されたい）。
ｒＬＰ２０８６の精製：
ｒＬＰ２０８６はディファレンシャル界面活性剤抽出後に大腸菌から可溶化した。天然の環境にあるＰ２０８６とは異なり、ｒＬＰ２０８６はＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００またはＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３−１２により著しく可溶化されなかった。ｒＬＰ２０８６のバルクはサルコシルで可溶化され、それはＮ．メニンギティディスにおける相互作用とは異なって大腸菌の外膜成分と相互作用することを示唆した。一旦可溶化されると、ｒＬＰ２０８６は天然のタンパク質と同様に精製され、その中に混在する多くの大腸菌タンパク質はアニオン交換レジンにｐＨ＝８で吸着させることにより除去した。その理論的ｐＩの半分のｐＨユニット以上であるにもかかわらず、ｒＬＰ２０８６はｐＨ８で吸着されないままであった。それ以上の精製は、ｐＨ４．５におけるカチオン交換レジンへのｒＬＰ２０８６の吸着によって行った。
ｒＬＰ２０８６の均一性はＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の図２に示す。ｒＬＰ２０８６の質量はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析により２７，８３６であると確認した。この質量は理論的質量の２７，１００と７３６異なり、そしてそれは細菌リポタンパク質に一般的なＮ−末端脂質改変物の質量に近似する。天然物およびｒＬＰ２０８６は共に外膜リポタンパク質であると考えられる。Ｎ−末端配列決定の試みは遮断され、そしてこのことは末端改変と一致する。
精製法：
Ｐ２０８６を発現するＢＬＲ ＤＥ３ ｐＬｙｓＳ細胞の凍結ペレットは、２０ｍＬ／ｇ細胞湿重量で１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ／１ｍＭ ＥＤＴＡ／１μｇ／ｍＬ Ｐｅｆａｂｌｏｃ ＳＣプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）ｐＨ７．４（ＨＥＰ）に再懸濁し、マイクロフリュイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙ）により溶解した。細胞溶解物は１５０，０００ｘｇで１時間遠心分離した。ペレットはＨＥＰで２回洗浄し、２回遠心分離し、得られた膜ペレットは一晩凍結した。該ペレットは１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ／１ｍＭ ＭｇＣｌ２／１％ＴＸ−１００ ｐＨ７．４で３０分間可溶化し、続いて１５０，０００ｘｇで３０分間遠心分離した。これを３回繰り返した。膜ペレットは上記のように５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１２ ｐＨ８で２回洗浄し、続いて５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４ ｐＨ８および５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４／０．５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８のそれぞれで２回洗浄した。
ｒＬＰ２０８６は次に５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／１％サルコシル ｐＨ８で可溶化した。このサルコシル抽出物を１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４（Ｚ３−１４）に調整し、３０倍過剰の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／１％Ｚ３−１４に対して２回透析した。透析したｒＬＰ２０８６抽出物は９０％エタノールで沈殿させ、残存するサルコシルを除去し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／１％Ｚ３−１４ ｐＨ８（ＴＥＺ）で可溶化した。不溶な物質は遠心分離により除去し、上清はアニオン交換クロマトグラフィーカラムを通し、ｒＬＰ２０８６は非結合画分に集めた。その後非結合画分は３０倍過剰の２５ｍＭ ＮａＡｃ／１％Ｚ３−１４ｐＨ４．５に対して２回透析し、カチオン交換クロマトグラフィーカラムを通した。ｒＬＰ２０８６は０〜０．３Ｍ ＮａＣｌグラジエントで溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）により分析した。ｒＬＰ２０８６プールはレーザーデンシトメトリーにより８４％純粋であることが確認された。
ｒＬＰ２０８６サブファミリーＢに対する抗血清の表面反応性および殺菌活性：
表ＶＩＩに示すように、サブファミリーＢ菌株８５２６由来の精製したｒＬＰ２０８６に対する抗血清は、全細胞ＥＬＩＳＡにより試験した１０種の２０８６サブファミリーＢ菌株すべてに対して表面反応性を示した。殺菌活性は異種セロサブタイプ抗原、ＰｏｒＡを発現する１０種の２０８６サブファミリーＢ菌株のうち９種に対して検出された。これらの菌株は西ヨーロッパ、アメリカ、オーストラリア、およびニュージーランド全体にわたってセログループＢ髄膜炎菌性疾患を引き起こす代表的な菌株である。殺菌アッセイで致死しなかった唯一の菌株、８７０２２７は全細胞ＥＬＩＳＡにより抗−ｒＬＰ２０８６（サブファミリーＢ）血清と強く反応し、この菌株がＰ２０８６に共通のエピトープを持つタンパク質を発現することを示した。
表ＶＩＩに挙げた２０８６サブファミリーＡ菌株も同様に、全細胞ＥＬＩＳＡにより表面反応性を試験した。これらの菌株３種の中の２種は非常に低レベルの反応性を有することが分かり、いくつかの２０８６サブファミリーＡ菌株はｒＬＰ２０８６サブファミリーＢに対して産生された抗体と交差反応性ではない可能性があることを示した。菌株８５２９から２０８６サブファミリーＢ遺伝子を同定するために使用されるＰＣＲ増幅手順はまた、菌株８７０４４６、ＮＭＢおよび６５５７に対しても行われた。２０８６サブファミリーＢのＰＣＲ増幅産物は検出されなかった。
免疫原性法：
抗血清の調製：
ワクチンは先の実施例１に記載のように製剤された。しかし、１０μｇ投与量を使用した。
全細胞酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）：
Ｎ．メニンギティディス全細胞懸濁液は滅菌０．０１Ｍ ホスフェート、０．１３７Ｍ ＮａＣｌ、０．００２Ｍ ＫＣｌ（ＰＢＳ）中、６２０ｎｍにおける吸光度０．１に希釈した。この懸濁液から、０．１ｍＬをＮｕｎｃ Ｂａｃ Ｔ９６ウェルプレート（Ｃａｔ＃ ２−６９６２０）のそれぞれのウェルに添加した。細胞は室温において３日間プレート上で乾燥し、その後覆いをし、ひっくり返し、４℃で保存した。プレートは洗浄バッファー（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１３９Ｍ ＮａＣｌ／ＫＣｌ、０．１％ドデシルポリ（オキシエチレレングリコールエーテル）ｎ ｎ＝２３（Ｂｒｉｊ−３５（登録商標）、ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅから入手）、ｐＨ７．０〜７．４）で３回洗浄した。抗血清の希釈物はＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／アジドで調製し、そして０．１ｍＬを被覆したプレートに移した。プレートは２時間３７℃でインキュベートした。プレートは洗浄バッファーで３回洗浄した。ヤギ−抗−マウスＩｇＧ ＡＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）はＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で１：１５００に希釈し、０．１ｍＬをそれぞれのウェルに添加し、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。プレートは（上記のように）洗浄した。基質溶液は、１Ｍ ジエタノールアミン／０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２中にｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ）を１ｍｇ／ｍＬに溶解することにより、調製した。基質はウェルにつき０．１ｍＬでプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。反応は５０μＬ／ウェルの３Ｎ ＮａＯＨで停止し、プレートは６９０ｎｍを基準とし、４０５ｎｍで読み取った。
Ｂ．）Ｐ４リーダー配列：
ＰＣＲ増幅およびクローニング法：
ｒＬＰ２０８６発現を最適化するために、２０８６遺伝子を型分類不能なヘモフィルス インフルエンザのＰ４シグナル配列の後にクローニングした（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。リポタンパク質のクローニングに使用されたプライマーは表ＩＶに挙げられ、化合物番号：５６５８、５６６０、６４７３、６５４３および６３８５によって同定される。ＯＲＦ２０８６は、以下の化合物番号５６５８および５６６０を持つプライマーを使用してＮ．メニンギティディス セログループＢ菌株８５２９から増幅された。ＯＲＦ２０８６は、以下の化合物番号６３８５および５６６０を持つプライマーを使用してＮ．メニンギティディス セログループＢ菌株ＣＤＣ１５７３から増幅された。ＯＲＦ２０８６は、以下の化合物番号６４７３および６５４３を持つプライマーを使用してＮ．メニンギティディス セログループＢ菌株２９９６から増幅された。Ｎ−末端（５’）プライマーは２０８６遺伝子の成熟領域（システインのすぐ下流のアミノ酸位置３のセリン残基において開始）に相同であるように設計された。制限部位ＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＴＣ）はそれぞれのＮ−末端プライマーの５’末端に組み込まれ、アミノ酸位置２において成熟タンパク質にグリシン残基が挿入された。Ｃ−末端（３’）プライマーは２０８６遺伝子のＣ−末端に相同であるように設計され、終止コドンおよびクローニングのためにＳｐｈＩ部位を含有した。それぞれのＮ．メニンギティディスＢ菌株から増幅されたフラグメントは中間ベクターにクローニングし、配列分析によってスクリーニングした。
適切なクローン由来のプラスミドＤＮＡはＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，（ＮＥＢ））で消化した。ｐＬＰ３３９という名称のベクター（出願者の譲受人により供与された）を発現ベクターとして選択した。このベクターはｐＢＡＤ１８−Ｃｍバックボーン（Ｂｅｃｋｗｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９５）を使用し、Ｐ４リポタンパク質シグナル配列および型分類不能なヘモフィルス インフルエンザのＰ４遺伝子（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１）を含有する。ｐＬＰ３３９ベクターは制限酵素ＢａｍＨＩにより部分的に消化され、その後ＳｐｈＩで消化された。増幅された２０８６フラグメント（ＢａｍＨＩ／ＳｐｈＩ）はそれぞれ別々にｐＬＰ３３９ベクター（部分的ＢａｍＨＩ／ＳｐｈＩ）に連結した。このクローニング法は成熟２０８６遺伝子をＰ４リポタンパク質シグナル配列の後に配置する。ＢａｍＨＩ部位はＰ４シグナル配列と２０８６遺伝子間のクローニング接合部に残る（図７に示したプラスミド構築物を参照されたい）。以下のものはＢａｍＨＩクローニング接合部における配列の例である：
［Ｐ４シグナル配列］−ＴＧＴ ＧＧＡ ＴＣＣ−［残りの２０８６成熟核酸配列］
［Ｐ４シグナル配列］−Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ−［残りの２０８６成熟アミノ酸配列］
図７に表すように、それぞれの増幅されたフラグメントはＰ４リーダー配列を含有する改変ｐＢＡＤ１８−Ｃｍベクターにクローニングされた。発酵はｒＰ４ＬＰ２０８６（組換えＰ４脂質化２０８６）を発現する組み換え大腸菌ＢＬＲ ｐＰＸ７３４３で行い、付加的グルコースの添加により細胞密度増大を試みた。発酵装置は、１％グルコースを補足したＳａｍｂｒｏｏｋの完全Ｍ９最小培地１０Ｌで満たした。
発酵装置中のグルコースの初期濃度は４５ｇ／Ｌであった。初期ＯＤが約０．２５になるように発酵装置に菌を接種した。約ＯＤ２５で、付加的な２０ｇ／Ｌグルコースを添加した。培養物はＯＤ６３．４、グルコース枯渇において１％アラビノースで誘導した。誘導後３時間まで発酵は継続した。試料は誘導後ｔ＝０、１、２、３において採取し、タンパク質はＢＳＡを使用して定量した。ｔ＝３でタンパク質収量は約０．３５ｇ／Ｌ、７％の総細胞タンパク質であった。約１０Ｌの培養物から全部で８９５グラムの湿細胞ペーストが採取された。
ｒＰ４ＬＰ２０８６の精製は上記の実施例２、節Ａに記載のものと同じ方法を使用して行った。
実施例３
非脂質化成熟２０８６タンパク質の発生遺伝学：
２０８６タンパク質の免疫原性をさらに評価するために、Ｐ２０８６の非脂質化型のクローニングおよび発現を行った。
ＯＲＦ２０８６のＰＣＲ遺伝子増幅：
非脂質化２０８６遺伝子のＰＣＲ増幅に使用されるオリゴヌクレオチドは表ＩＶのプライマー表に挙げられる。菌株８５２９由来の２０８６遺伝子は、表に示すように、化合物番号５１３５および６４０６（それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０８および３１２）によって同定されたプライマーで増幅することができる。菌株ＣＤＣ１５７３由来の２０８６遺伝子は化合物番号５１３５および６４７４（それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０８および３１６）によって同定されたプライマーで増幅することができる。菌株２９９６由来の２０８６遺伝子は化合物番号６４０６および６６０５（それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２および３２０）によって同定されたプライマーで増幅することができる。
これらのプライマーの特徴には、それぞれのプライマーにおける合成ＢｇｌＩＩ制限部位、化合物番号６４０６および６４７４における合成ＮｄｅＩ制限部位が挙げられ、そして３種すべてのリーディングフレームの停止コドンは化合物番号５１３５および６６０５に存在する。プライマー番号６４０６および６４７４は、第２のアミノ末端コドン（ＡＣＧ）に融合したＡＴＧ（Ｍｅｔ）を持つ２０８６遺伝子を増幅し、成熟２０８６ポリペプチドの単一アミノ酸置換（ＴＧＣ Ｃｙｓを置換）を表す。
ＰＣＲクローニングベクターはＴＯＰＯ−ＰＣＲ２．１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡであった。
非脂質化２０８６タンパク質を発現するために使用されたベクターはＮｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのｐＥＴ９ａであった。
大腸菌クローニング菌株はＴｏｐ１０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡであった。
大腸菌発現菌株はＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ，Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩであった。
クローニング目的のための培地はグリセロールの代わりの１％滅菌グルコース、および適切な抗生物質（アンピシリンまたはカナマイシン）を含む、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，のテリフィックブロス液または寒天培地であった。
プラスミド精製はＱｉａｇｅｎ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により行った。
非脂質化２０８６発現のための産生菌株または細胞系統の調製：
２０８６遺伝子は髄膜炎菌株８５２９に由来する染色体ＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）［ＡｍｐｌｉＴａｑ ａｎｄ ＡＢＩ２４００サーマルサイクラー，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ］により増幅した。２０８６遺伝子のＰＣＲ増幅は、それぞれの反応において化合物番号６４７４および５１３５（それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１６および３０８）によって同定された２種のオリゴヌレオチドプライマーを使用した。増幅された２０８６ＰＣＲ産物はＴＯＰＯ−ＰＣＲ２．１クローニングベクターに直接クローニングし、１００μｇ／ｍｌ アンピシリンおよび２０μｇ／ｍｌ Ｘ−Ｇａｌを補足したテリフィックブロス寒天培地で選択した。白色コロニーを選択し、培養した。プラスミドＤＮＡはＱｉａｇｅｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用して作製し、該プラスミドをＰＣＲフラグメントインサートに関してスクリーニングした。ＰＣＲインサートプラスミドは、ＤＮＡ配列決定を行った（ＡＢＩ３７７シークエンサーでのＢｉｇ Ｄｙｅ化学，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。
適切なＤＮＡ配列を示すプラスミドはＢｇｌＩＩ制限酵素で消化し、ＢｇｌＩＩフラグメントは、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ ＩＩ精製キット（Ｂｉｏ１０１、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してゲル精製した。精製されたＢｇｌＩＩフラグメントは発現ベクターｐＥＴ９ａのＢａｍＨＩ部位にクローニングした。ｐＥＴ９ａ／２０８６クローンは３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補足したテリフィックブロスプレートで選択した。カナマイシン耐性クローンを培養し、ｍｉｎｉｐｒｅｐプラスミドＤＮＡを作製した。プラスミドはＢａｍＨＩ部位における２０８６遺伝子の適切なオリエンテーションに関してスクリーニングした。適切に配置されたプラスミドは、２０８６遺伝子のアミノ末端へのＴ７−抗原の融合物（ｒＰ２０８６Ｔ７）を表す。これらのｒＰ２０８６Ｔ７遺伝子融合物はＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに形質転換し、テリフィックブロス／Ｋａｎプレートで選択し、テリフィックブロスで培養し、ｒＰ２０８６Ｔ７融合タンパク質を発現するように１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）により誘導した。ｒＰ２０８６Ｔ７融合タンパク質は高レベルで発現された。
これらの融合プラスミドにＮｄｅＩ制限消化を行い、それによりＴ７−抗原を欠失し、ベクターに提供されたＡＴＧスタートに成熟２０８６遺伝子を直接連結する。これらのＮｄｅＩ欠失プラスミドはＴｏｐ１０細胞に形質転換し、テリフィックブロス／Ｋａｎプレートで選択した。候補クローンを培養し、ミニプレッププラスミドＤＮＡを作製した。プラスミドＤＮＡはＤＮＡ配列決定を行い、欠失と２０８６遺伝子配列の完全性を確認した。これらのプラスミドはｐＰＸ７３２８と呼ぶプラスミドマップによって表す（図６）。適切なＤＮＡ配列を表すプラスミドはＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに形質転換し、テリフィックブロス／Ｋａｎプレートで選択し、テリフィックブロスで培養し、ＩＰＴＧにより２０８６タンパク質を発現するように誘導した。ｐＥＴ９ａベクターは、Ｔ７−タグが除去されると、菌株ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに成熟２０８６タンパク質を発現できなかった。
非脂質化２０８６タンパク質の産生：
精製されたプラスミドＤＮＡを使用して、発現菌株ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形質転換した。プラスミドを持つＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞はカナマイシン耐性で、１ｍＭ ＩＰＴＧの添加により高レベルのＰｏｒＡタンパク質を発現するように誘導することができる。ｒＰ２０８６Ｔ７融合タンパク質は、大腸菌細胞系統ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中に不溶性封入体として、全タンパク質の約４０％において発現することができる。この精製された融合タンパク質を使用してマウスを免疫し、そしてそれは異種髄膜炎菌株に対する高レベルの殺菌抗体を生成した（表Ｖを参照されたい）。
２０８６非脂質化遺伝子変異誘発：
ＰＣＲプライマー変異誘発は２０８６遺伝子の５’末端で行われた。成熟ｒＰ２０８６Ｔ７の高発現レベルを示しながらＴ７−タグを除去できるかどうかを確かめるための発現研究が進行中である。
非脂質化ｒＰ２０８６Ｔ７の精製：
非脂質化ｒＰ２０８６Ｔ７を発現する大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／１ｍＭ Ｐｅｆａｂｌｏｃ ＳＣ ｐＨ７．４中で、マイクロフリュイダイザーにより溶解した。。細胞溶解物は１８，０００ｘｇで３０分間遠心分離した。封入体ペレットは５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ｐＨ８で３回洗浄し、その度に２４，０００ｘｇで３０分間遠心分離した。次に封入体ペレットを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４ ｐＨ８で２回洗浄し、その度に２４，０００ｘｇで１５分間遠心分離した。続いて封入体ペレットを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／４Ｍ 尿素 ｐＨ８で２時間可溶化し、その後不溶性物質を遠心分離により除去した。上清（可溶化ｒＰ２０８６Ｔ７）は４つの等しい試料に分けた。保存溶液を使用して、１つは５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／２５０ｍＭ ＮａＣｌ／２Ｍ 尿素 ｐＨ８（界面活性剤を含まない）に調整し、１種は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／２５０ｍＭ ＮａＣｌ／２Ｍ 尿素／１％水素化Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ｐＨ８（ＴＸ−１００）に調整し、１種は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／２５０ｍＭ ＮａＣｌ／２Ｍ 尿素／１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１２ ｐＨ８（Ｚ３−１２）に調整し、そして１種は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／２５０ｍＭ ＮａＣｌ／２Ｍ 尿素／１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４ ｐＨ８（Ｚ３−１４）に調整した。尿素を除去するために、尿素を含まないそれぞれのバッファーに対して試料を透析した。次に尿素を含まずに６０ｍＭ ＮａＣｌを含むそれぞれのバッファーに対して透析し、ＮａＣｌ濃度を減少させた。不溶性物質は２，０００ｘｇで１５分間遠心分離することにより除去し、得られた上清（再生したｒＰ２０８６Ｔ７）をその後の実験に使用した。ｒＰ２０８６Ｔ７の均一性はクーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびレーザーデンシトメトリーを使用して測定し、９１〜９５％であることが見出された。
免疫原性手順−実施例２に記載のものと同様
この精製された融合タンパク質を使用してマウスを免疫し、異種髄膜炎菌株に対する高レベルの殺菌抗体を生成した。（以下の表Ｖを参照されたい）：
Figure 2006525330
実施例４
ＯＲＦ２０８６のキメラクローンの開発
菌株ＣＤＣ−１５７３由来の２０８６タンパク質Ｎ−末端領域は、菌株８５２９および２９９６由来の２０８６遺伝子には存在しない反復部分を含有する（図８を参照されたい）。この反復部分は、大腸菌を基礎にした２つの発現系（ｐＥＴおよびｐＢＡＤ）由来の高レベルの組換え２０８６タンパク質発現に関与すると考えられる。ｐＥＴおよびｐＢＡＤ発現系におけるＣＤＣ−１５７３ ２０８６遺伝子由来の組換えタンパク質発現レベルは、同じ系を使用した菌株８５２９および２９９６による２０８６遺伝子由来の組換え体発現レベルに比較して著しく高かった。３種すべての菌株に由来する２０８６遺伝子のＮ−末端領域は、この反復部分以外は比較的相同である。したがって、ｐＥＴおよびｐＢＡＤ系を使用した場合、菌株８５２９および２９９６由来の２０８６遺伝子にＣＤＣ−１５７３Ｎ−末端を融合することにより、これらの遺伝子から発現される組換え２０８６タンパク質レベルが増大すると考えることは妥当である。
材料および方法：
菌株８５２９および２９９６由来の染色体ＤＮＡを精製し、キメラ２０８６遺伝子のＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。化合物番号６７２１および５１３５（それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２１および３０８）のＰＣＲプライマーを使用して菌株８５２９由来のキメラ２０８６遺伝子を増幅し、化合物番号６７２１および６６０５（それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２１および３２０）のＰＣＲプライマーを使用して、菌株２９９６由来のキメラ２０８６遺伝子を増幅した。ＰＣＲ産物はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰＣＲ２．１ ＴＯＰＯベクターに直接クローニングし、ＤＮＡ配列分析によりスクリーニングし、無傷のキメラ２０８６遺伝子を同定した。次にその遺伝子をＢｇｌＩＩによりＰＣＲ２．１ベクターから開裂し、ＢｇｌＩＩフラグメントをｐＥＴ９ａプラスミドのＢａｍＨＩ部位に挿入した。プラスミドインサートが適切な配置であることをスクリーニングした後、ＮｄｅＩ消化を行った。線状ＮｄｅＩフラグメントは自己連結し、ｐＥＴ９ａベクターによって提供された、Ｔ７−タグ配列を含有する小ＮｄｅＩフラグメントが欠失された。この欠失によりキメラ２０８６遺伝子の５’末端にＴ７プロモーターを直接連結する。ＮｄｅＩ欠失プラスミドは大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、カナマイシン耐性コロニーをＩＰＴＧ誘導によるキメラ２０８６タンパク質発現に関してスクリーニングした。
初期の研究は、ｐＥＴ９ａ系で発現される場合、菌株２９９６由来のキメラ２０８６遺伝子は天然の２９９６／２０８６遺伝子に比較して２倍の組換えタンパク質を発現することを示す。ｐＢＡＤ系は現在のところ試験されていない。
ただ１回の実験が行われただけであるが、データはキメラ２０８６遺伝子に由来する、増大した用途があることを示唆する。菌株８５２９および２９９６由来２０８６遺伝子に対するＣＤＣ−１５７３Ｎ−末端融合物の生成により、増大した組換え２０８６タンパク質発現が提供される。
実施例５
Ｎ．メニンギティディス菌株の２０８６ＰＣＲスクリーニング：
臨床分離菌間の２０８６遺伝子の保存を確かめるために、８８のＮ．メニンギティディス菌株にＰＣＲ増幅を行った。
ＯＲＦ２０８６の初めのＰＣＲ同定は、表ＩＶ（先の実施例２を参照されたい）に挙げられた化合物番号：４６２３、４６２４および４６２５（それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０３、３０４および３０２５）により同定されたプライマーを使用した。これらのプライマーはＳａｎｇｅｒのＮ．メニンギティディス セログループＡ配列に基づいて設計された。多数の菌株のスクリーニングを促進するために、内部プライマーが２０８６遺伝子に関して設計された。全部で８８のＮ．メニンギティディス菌株は、化合物番号５００５および５００７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０６および３０７）により同定された、新規に設計された内部２０８６プライマーを用いて、ＰＣＲによりスクリーニングした。これらのプライマーを使用して、本出願者らは８８のＮ．メニンギティディス菌株の中の６３（約７０％）を同定することができた（表ＶＩ−Ａを参照されたい）。
ＳａｎｇｅｒのＮ．メニンギティディス セログループＡ配列およびＴＩＧＲのＮ．メニンギティディス セログループＢ配列中の２０８６遺伝子を囲む伸長領域を調べ、並べた。プライマーは２０８６遺伝子の上流および下流領域に対応するように設計した。目的は、配列比較のためにこれらのプライマーを使用して、多様なＮ．メニンギティディス菌株から全長２０８６遺伝子より大きいものを増幅することであった。化合物Ｎｏ．６４７０および６４７２（それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１３および３１４）を使用した１種の菌株（６５７７）のＰＣＲ増幅により産物を低収率で得た。菌株６５５７増幅産物をクローニングし、プラスミドＤＮＡの配列分析を行った。結果は、以前理解されていたよりも配列可変性の大きい新型の２０８６遺伝子を示した。菌株６５５７由来の２０８６遺伝子は、配列決定された別の菌株に対してアミノ酸レベルが約７５％同一であった。興味深いことに、菌株６５５７は先に記載の２０８６ＰＣＲスクリーニングにより以前陰性とされた菌株３０％の中の１種であった。
菌株６５５７内のＣ−末端可変領域に特異的な内部プライマーが設計された。これらのプライマーを使用して、２０８６ＰＣＲスクリーニングによる試験で以前陰性とされた約３０％の菌株の可変性の高い２０８６遺伝子をスクリーニングした。これらの新規に同定された内部２０８６プライマー（化合物番号６４９５および６４９６；それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５９および１６０により識別）を使用して、入手可能なすべてのＮ．メニンギティディス菌株（ｎ＝８８）をＰＣＲによりスクリーニングした。２０８６に関してＰＣＲにより以前陰性とされた約３０％のＮ．メニンギティディス菌株だけがこのスクリーニングでＰＣＲ陽性であった。以前のＰＣＲ陰性（約３０％）菌株から増幅された遺伝子の組は新型２０８６遺伝子または２０８６遺伝子の第２ファミリーを表すべきであり、本明細書では２０８６サブファミリーＡと呼ぶ。８５２９由来のプライマーにより約７０％の菌株から増幅された２０８６遺伝子の組は、本明細書ではサブファミリーＢと呼ぶ。
２０８６遺伝子のサブファミリーＡはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜１７３の奇数番号により例示されるが、それらに限定されない。２０８６遺伝子のサブファミリーＢはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７５〜２５１の奇数番号により例示されるが、それらに限定されない。
ＰＣＲ増幅研究に使用されるＮ．メニンギティディス菌株は以下の表、表ＶＩ−Ａおよび表ＶＩ−Ｂから選択された。表に挙げられた菌株は、Ｎ．メニンギティディス菌株の例として提供されるが、それらに限定されない。表ＶＩ−Ａに挙げられた菌株は２０８６タンパク質サブファミリーＡに分類され、表ＶＩ−Ｂに挙げられた菌株は２０８６タンパク質サブファミリーＢに分類される。それぞれの表に挙げられた菌株はセロサブタイプにより分類される。菌株は表に示すような以下の４種の供与源から入手可能である：MPHL-Manchester Public Health Laboratory, Manchester, UK; RIVM, Bilthoven, The Netherlands; University of Iowa, College of Medicine, Department of Microbiology, Iowa City, IA; および Walter Reed Army Insitute of Research, Washington,D.C.
Figure 2006525330
Figure 2006525330
Figure 2006525330
その他の菌株は感染した個体から分離菌として容易に入手可能である。
実施例６
髄膜炎菌株に対するｒＬＰ２０８６抗血清の反応性：
以下の表、表ＶＩＩは先に記載のｒＬＰ２０８６の交差反応性および交差保護能力を示す。表に示すように、ｒＬＰ２０８６は全細胞ＥＬＩＳＡ（ＷＣＥ）力価、殺菌アッセイ（ＢＣＡ）および幼児ラット（ＩＲ）アッセイを含む、多様な技術を使用して処理し、分析し、２０８６タンパク質に対して誘導されたポリクローナル抗体の細菌表面反応性を確認した。
Figure 2006525330
実施例７
ＯＲＦ２０８６タンパク質を発現するための種々の構築物が作製された。以下の表、表ＶＩＩＩは例を示し、本発明の実行を説明するために提供されるｒ２０８６構築物表であるが、それらに限定されない。
Figure 2006525330
実施例８
ＬＯＳ除去外膜タンパク質についてのさらなる研究から、異種セロサブタイプを発現する菌株に殺菌抗体を誘導することができる、ＰｏｒＡ以外の外膜タンパク質（単数または複数）を産生する付加的な菌株を同定した。以下に、本発明の一態様に記載の付加的なタンパク質、具体的には髄膜炎菌免疫原性組成物に必要なタンパク質の数を減少させることができる外膜リポタンパク質を同定するためのさらなる研究を説明する。これらのさらなる研究は先の実施例に記載された研究を補足する。
複数の菌株に対する免疫および殺菌アッセイと共に、細胞下分画、ディファレンシャル界面活性剤抽出、等電点分離法、およびイオン交換クロマトグラフィーを使用して、関心のある小グループのタンパク質を同定した。主成分の直接配列決定は、Ｎ−末端が遮断されていることを示した。内部タンパク質配列は、化学的およびタンパク質分解消化に由来するポリペプチドの直接配列決定により得た。グループＡ髄膜炎菌株のゲノム配列はＳａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｅｒからダウンロードし、既存および本出願者らが所有するアルゴリズムを使用して本出願者らのバイオインフォマティックグループが分析し、検索データベースを作製した。ペプチド配列データは、ＯＲＦ２０８６が関心のあるものであることを示した。このｏｒｆに基づいたプライマーを使用して、菌株８５２９からＰ２０８６遺伝子をＰＣＲした。遺伝子配列の分析、Ｎ−末端が遮断されているという事実、およびその細胞下局在は、Ｐ２０８６が脂質化外膜タンパク質（ＬＰ２０８６）であることを示した。ｒＬＰ２０８６−８５２９および別の髄膜炎菌株由来の変異体は、Ｈ．インフルエンザＰ４シグナル配列を使用して大腸菌中でリポタンパク質として組換え発現された。これらの組換えタンパク質はディファレンシャル界面活性剤抽出により大腸菌膜から単離し、イオン交換クロマトグラフィーを使用して精製し、マウスを免疫するために使用した。マウス抗−ＬＰ２０８６血清はＮ．メニンギティディスのいくつかの異なるセロサブタイプ株に対する殺菌活性の亢進が可能であった。多くのＮ．メニンギティディス菌株由来のＰ２０８６遺伝子のさらなる分析は、これらの配列がサブファミリーＡおよびサブファミリーＢと呼ばれる２種のグループに分類されることを示した。（図１２を参照されたい）。サブファミリーＢタンパク質に対して誘導された抗血清はサブファミリーＢタンパク質を発現する９種の菌株、およびサブファミリーＡタンパク質を発現する１種の菌株に対して殺菌性であった。サブファミリーＡ抗血清はサブファミリーＡ系統に対して殺菌性であった。１種のｒＰｏｒＡと１種のｒＬＰ２０８６の混合物は、いずれかのタンパク質だけにより誘導されたもの以上の広いワクチン適用範囲を持つ相補的抗体を誘導した。
これらの観察は以下の結論を導く。ｒＬＰ２０８６抗原は異種ＰｏｒＡおよび異種Ｐ２０８６タンパク質を発現する髄膜炎菌株に対して殺菌抗体を誘導することができる。抗原のＰ２０８６ファミリーは、単独または別の髄膜炎菌抗原との組み合わせのいずれかで、有用なワクチンであるか、または免疫原性であってよい。
以下に先の研究について詳細に述べる。可溶性外膜タンパク質（ｓＯＭＰ）の複合体混合物は、異種ＰｏｒＡタンパク質を発現する菌株に対してＰｏｒＡ非依存的殺菌抗体を誘導することが見出された。ディファレンシャル界面活性剤抽出、等電点分離法およびイオン交換クロマトグラフィー、続くマウス免疫化の工程を使用して免疫学的に活性な成分を追跡した。
それぞれのステップで、髄膜炎菌性疾患の世界的疫学を代表するセロサブタイプ抗原を含有するいくつかの菌株に対して、血清は表面反応性および殺菌活性をアッセイされた。
上記の分離および免疫化の工程を使用してグループＢ Ｎ．メニンギティディスに関する新規交差反応性免疫原性候補を同定した。
ＰｏｒＡ欠乏菌株の作製 − ｐｏｒＡ染色体座位は菌株２９９６由来のプラスミドｐＰＸ７０１６にクローニングした。プラスミド内では、ｐｏｒＡプロモーター、Ｓ／Ｄボックスおよび初めの３８Ｎ−末端コドンが欠失し、自己含有ＫａｎＲ発現カセットにより置換されている。該プラスミドは制限酵素で線状にされ、セロサブタイプ菌株ＰＩ：５，２；ＰＩ：９；ＰＩ：７，１６；ＰＩ：１５；ＰＩ：４；ＰＩ：３＆ＰＩ：１０に予想通りに形質転換された。カナマイシン耐性形質転換体を選択し、ＥＬＩＳＡにおいてセロサブタイプ特異的モノクローナル抗体によりＰｏｒＡの損失をスクリーニングした。
殺菌アッセイ：Mountzourous, K. T. and Howell, A. P. Detection of Complement-Mediated Antibody-Dependent Bactericidal Activity in a Flourescence-Based Serum Bactericidal Assay for Group B Neisseria meningitidis. J. Clin Microbiol. 2000; 38:2878-2884 を参照されたい。
全細胞酸素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）：Ｎ．メニンギティディス全細胞懸濁液は滅菌０．０１Ｍ ホスフェート、０．１３７Ｍ ＮａＣｌ、０．００２Ｍ ＫＣｌ（ＰＢＳ）中で、６２０ｎｍにおける吸光度０．１に希釈した。この懸濁液から、Ｎｕｎｃ Ｂａｃ Ｔ９６ウェルプレート（Ｃａ＃２−６９６２０）のそれぞれのウェルに０．１ｍＬを添加した。細胞は３７℃で一晩、プレート上で乾燥させ、その後被覆し、裏返し、４℃で保存した。プレートは洗浄バッファー（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１３９Ｍ ＮａＣｌ／ＫＣｌ、０．１％ Ｂｒｉｊ−３５、ｐＨ７．０〜７．４）で３回洗浄した。抗血清の希釈物はＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／アジドで調製し、０．１ｍＬを被覆プレートに移し、３７℃で２時間インキュベートした。プレートは洗浄バッファーで３回洗浄した。ヤギ−抗−マウスＩｇＧ ＡＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）をＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で１：１５００に希釈し、０．１ｍＬをそれぞれのウェルに添加し、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。プレートは（上記のように）洗浄した。基質溶液は、ジエタノールアミンで、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ）を１ｍｇ／ｍｌに希釈することにより調製した。ウェルにつき０．１ｍＬの基質をプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。反応は５０uL／ウェルの３Ｎ ＮａＯＨで停止し、６９０ｎｍを参照として４５０ｎｍでプレートを読んだ。
組換えＰｏｒＡの誘導：ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ９ａ菌株は、Ｋａｎ−３０および２％グルコースを補足したハイソイ（ＨｙＳｏｙ）ブロス（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）中、３７℃で一晩培養した。明朝、Ｏ／Ｎ培養物をハイソイブロス、Ｋａｎ−３０および１％グリセロールで希釈し、３７℃で１時間培養した。これらの培養物にＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭで添加することにより誘導した。培養物はさらに２〜３時間培養し、その後採取した。
組換えＰｏｒＡ精製：ｒＰｏｒＡは大腸菌封入体から８Ｍ 尿素で可溶化し、尿素を含まないバッファーに対して透析して再生した。再生されたｒＰｏｒＡは透析ろ過により濃縮し、バッファーはＧ２５カラムでＮａＰＯ４ ｐＨ６に交換した。透析したｒＰｏｒＡは次にカチオン交換カラム（Ｓ Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）に流し、１Ｍ ＮａＣｌで溶出した。
菌株８５２９（Ｐ１．７−２，３）のｓＯＭＰは、異種セロサブタイプを発現する菌株に対してマウスにＰｏｒＡ非依存的殺菌活性を誘導する。以下の表、表ＩＸは調べた菌株における殺菌活性を示す。
Figure 2006525330
ｓＯＭＰの調製：Ｎ．メニンギティディス膜はＴＸ−１００、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４，およびＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４＋０．５Ｎ ＮａＣｌで抽出した。上記のｓＯＭＰはＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１４／０．５Ｍ ＮａＣｌ抽出物中で可溶化した。抽出は当業者に周知の技術、たとえば、米国特許第６，３５５，２５３号（これを本明細書に参照として援用する）を使用して行った。
免疫原性：メスＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスは、０および４週目に２０ｕｇ ＱＳ−２１をアジュバントとして添加した２５ｕｇの総タンパク質量で免疫した。全採血およびデータ分析は６週目に行った。
１ 殺菌性（ＢＣ５０）力価は生細胞数を５０％減少させる抗血清の希釈度の逆数として表した。０週の正常マウス血清のＢＣ５０力価は＜２５であった。
２ ＮＳＴ＝セロタイプ分類不能
以下の表、表ＸはサブファミリーＡおよびサブファミリーＢ両方の組換え脂質化Ｐ２０８６（ｒＬＰ２０８６）の精製および特徴の概要を示す。
サブファミリーＡ ｒＬＰ２０８６精製
Figure 2006525330
サブファミリーＢ ｒＬＰ２０８６精製
Figure 2006525330
精製法：すべての変異体はＴＸ−１００により大腸菌膜から可溶化された（サルコシルまたは尿素で可溶化されたｒＬＰ２０８６−８５２９を除く）。その後の精製はＴｒｉｓ−ＨＣｌまたはＮａＰＯ４バッファー中でアニオン交換（ＴＭＡＥ）、サイズ排除および／またはカチオン交換（Ｓ Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）クロマトグラフィーの組み合わせにより行った。
１ 菌株８５２９由来のＰ２０８６に比較したアミノ酸相同性
２ ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびコロイド状クーマシー染色バンド（単純な青色染色）のレーザーデンシトメトリーにより確認した純度
サブファミリーＢメンバーｒＬＰ２０８６−８５２９の免疫原性は同種および異種菌株に対して試験した。
以下の表ＸＩＩは同種および異種菌株に対して試験した、サブファミリーＢメンバー、ｒＬＰ２０８６−８５２９の免疫原性を示す。
Figure 2006525330
ワクチン接種手順：６〜８週齢のメスＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスは０および４週目に１０ｕｇ ｒＬＰ２０８６−８５２９＋２０ｕｇ ＱＳ−２１で免疫した。データ分析は６週目の全採血した血液により行った。
ａ ｒＬＰ２０８６−８５２９に比較したＰ２０８６のアミノ酸相同性
ｂ エンドポイント力価は吸光度＝０．１における希釈度の逆数として表した。
ｃ ＢＣ５０力価は生細胞数を５０％減少させる抗血清の希釈度の逆数として表した。０週の正常マウス血清のＢＣ５０力価は＜１０であった。
表ＸＩＩＩは同種および異種菌株に対して試験した、サブファミリーＢメンバー、ｒＬＰ２０８６−２９９６の免疫原性を示す。
Figure 2006525330
ワクチン接種手順：６〜８週齢のメスＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスは、０および４週目に１０ｕｇ ｒＬＰ２０８６−２９９６＋２０ｕｇ ＱＳ−２１で免疫した。データ分析は６週目の全採血した血液で行った。
ａ ｒＬＰ２０８６−２９９６に比較したＰ２０８６のアミノ酸相同性
ｂ エンドポイント力価は吸光度＝０．１における希釈度の逆数として表した。
ｃ 殺菌性（ＢＣ５０）力価は生細胞数を５０％減少させる抗血清の希釈度の逆数として表した。０週の正常マウス血清のＢＣ５０力価は＜１０であった。
以下の表ＸＩＶは、ｒＬＰ２０８６およびｒＰｏｒＡに対する抗血清は、混合し、殺菌活性をアッセイした場合に相補的であることを示す。
Figure 2006525330
ワクチン接種手順：６〜８週齢のメスＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスは０および４週目に１０ｕｇ ｒＬＰ２０８６−８５２９／２０ｕｇ ＱＳ−２１、または１５ｕｇ ｒＰｏｒＡ／１００ｕｇ ＭＰＬのいずれかで免疫した。データ分析は６週目の全採血した血液により行った。
ａ 殺菌性（ＢＣ５０）力価は生細胞数を５０％減少させる抗血清の希釈度の逆数として表した。０週の正常マウス血清のＢＣ５０力価は＜１０であった。
以下の表ＸＶは、ｒＬＰ２０８６サブファミリーおよび２種のｒＰｏｒＡの混合物がマウスに殺菌抗体を誘導することを示す。
Figure 2006525330
ワクチン接種手順：６〜８週齢のメスＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスは、０および４週目にそれぞれのタンパク質１０ｕｇ＋２０ｕｇ ＱＳ−２１で免疫した。データ分析は６週目の全採血した血液で行った。
ａ 殺菌性（ＢＣ５０）力価は生細胞数を５０％減少させる抗血清の希釈度の逆数として表した。０週の正常マウス血清のＢＣ５０力価は＜１０であった。
ｂ ＳｆＡ−サブファミリーＡ、ＳｆＢ−サブファミリーＢ
ｃ 適切な１価対照：ｒＬＰ２０８６−８５２９、ｒＬＰ２０８６−２９９６、ｒＰ１．５−１，２−２またはｒＰ１．２２−１，１４−１抗血清
以下に上記の研究の結果を概説する。抗−ｒＬＰ２０８６抗血清は１３／１６の試験菌株に対して殺菌性である。異なるセロサブタイプを発現する１１種の菌株は抗−Ｐ２０８６血清により致死する。抗−ｒＬＰ２０８６血清の殺菌活性は抗−ｒＰｏｒＡ血清に相補的である。Ｐ２０８６とＰｏｒＡの混合物はマウスに相補的殺菌抗体を誘導する。ディファレンシャル界面活性剤抽出、精製および免疫、ならびに多くの菌株に対する機能的抗体アッセイを使用して、新規ワクチン候補を同定することができる。Ｐ２０８６は、Ｐ２０８６およびＰｏｒＡの両方に異種の菌株に対して殺菌抗体を誘導するワクチン候補として同定されている。したがって、タンパク質の２０８６ファミリーは単独で、または別の髄膜炎菌抗原と組み合わせて有用なワクチンであってもよい。
実施例９
先の実施例に従って、異なるセログループの付加的な髄膜炎菌株をＯＲＦ２０８６遺伝子の存在に関してＰＣＲによりスクリーニングした。結局、１００種の髄膜炎菌株をスクリーニングした。以下に研究とその全体的な結果を説明する。これらの結果は先の実施例のデータを補足する。
２組のＣ−末端可変領域に特異的な内部ＰＣＲプライマーを利用してサブファミリーＡおよびＢ遺伝子配列を識別した。約３５０ｂｐのＰＣＲ増幅産物の存在は、２０８６遺伝子配列が染色体上に存在することを示した。すべての菌株は、予想されたサイズの単一のＰＣＲ産物を生じた。５５の全長ＯＲＦ２０８６遺伝子のヌクレオチド配列を決定し、整列させ（ＤＮＡＳｔａｒ ＭｅｇＡｌｉｇｎ）、系統樹を作製するために使用した。（図１２を参照されたい）。
これらの２０８６遺伝子の中の９種は、ｐＢＡＤアラビノース誘導性プロモーター系においてｒＬＰ２０８６リポタンパク質として組換え発現し、これらの遺伝子の中の３種はＩＰＴＧ誘導性ｐＥＴ系において、ｒＬＰ２０８６非脂質化タンパク質として組換え発現した。これらの組換えタンパク質は大腸菌Ｂにおいて発現させた。精製された組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、マウス抗血清の血清ＩｇＧ力価および多様な髄膜炎菌株に対する殺菌活性をアッセイした。
ＯＲＦ２０８６は、以下の全髄膜炎菌細胞、精製した染色体ＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡ鋳型の１種からＰＣＲにより増幅した。
９種のＯＲＦ２０８６遺伝子はベクターｐＬＰ３３９にクローニングし、それはヘモフィルスＰ４リーダー配列をＯＲＦ２０８６遺伝子の５’末端に融合する。大腸菌株ＢＬＲは、ｐＢＡＤ／ＯＲＦ２０８６クローン由来のｒＰ２０８６の脂質化型の組換え発現のための宿主菌株として使用した。（図１０Ａを参照されたい）。ｐＢＡＤアラビノース誘導性プロモーターはＰ４シグナル／ＯＲＦ２０８６融合タンパク質の発現を操作し、ｒＰ２０８６の脂質化型を発現させる。シグナル配列を欠如する、３種のＰ２０８６遺伝子は高活性のＴ７ファージプロモーターの後に続いてｐＥＴ９ａベクターにクローニングされた。大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）は、ｐＥＴ９ａ／ＯＲＦ２０８６クローン由来のＯＲＦ２０８６の非脂質化型の組換え発現のための宿主菌株として使用した。（図１０Ｂを参照されたい）。大腸菌株ＢＬ２１におけるＤＥ３溶原（ｌｙｓｏｇｅｎ）は、ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下で、ＩＰＴＧの添加によりに誘導されてＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現することができる。ＷＣＥ；ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏ．Ｌｅｔｔ．，４８（１９８７）３６７−３７１およびＢＣＡ；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３８（２０００）２８７８−２８８４を参照されたい。
遺伝子、ＯＲＦ２０８６は５５種の異なるＮ．メニンギティディス菌株からクローニングされ、配列決定された。ヌクレオチド配列を整列させ（ＤＮＡＳｔａｒ ＭｅｇＡｌｉｇｎ）、系統樹作製に使用した（図１２を参照されたい）。この樹はＯＲＦ２０８６遺伝子ヌクレオチド配列の２種の異なるサブファミリーを明らかにする。２種の遺伝子サブファミリーはそれらの５’末端で類似するが、それらの３’末端近くは相当変動している。著しく可変性があると考えられるが、遺伝子のある種の重要な領域は、異なる菌株間で高度に相同性である。これらの保存された領域はタンパク質に対して機能的な連続性を提供してもよく、そしてワクチン標的として利用されることになる交差反応性エピトープを表してもよい。
２０８６遺伝子はいくつかのセログループＢ髄膜炎菌株からクローニングされ、脂質化シグナル配列を伴って、またはそれを伴わずに発現された。図１１Ａおよび１１Ｂに表すように、ゲル写真はｒ２０８６タンパク質を発現する大腸菌Ｂの全細胞溶解物を示す。Ｔ７−タグに融合した非脂質化型は高レベルで発現した。Ｔ７−タグ配列はｍＲＮＡに安定性を提供し、翻訳されるポリペプチドのレベルを著しく高めることができる。この融合タンパク質は封入体内に沈着すると考えられ、公知のプロトコルにより容易に精製し、再生することができる。Ｐ２０８６の脂質化、および非脂質化型は全細胞タンパク質の約５〜８％で発現され、全タンパク質の約５０％としてｒＰ２０８６を発現するＴ７−タグ融合物を例外とする。タンパク質の非脂質化型は可溶性で細胞質に局在すると考えられる。タンパク質の脂質化型は膜画分に結合すると考えられ、界面活性剤により可溶化される。
Ｎ．メニンギティディスＢ菌株８５２９由来の組換え脂質化２０８６タンパク質は、一貫して非脂質化型よりも血清ＩｇＧ高力価を誘導し（以下の表ＸＶＩを参照されたい）、このことは同種および異種髄膜炎菌株の両方に対する高められたレベル殺菌活性とよく相関する（以下の表ＸＶＩＩを参照されたい）。天然の脂質化型のタンパク質は抗原提示に関して優れた三次元構造を有してもよく、および／または結合した脂質がより強い免疫原性反応を刺激するアジュバントとして作用してもよい。
Figure 2006525330
Figure 2006525330
以下は研究結果の概要である。試験したすべてのＮ．メニンギティディスＢ菌株は１種の２０８６様遺伝子を有すると考えられる。少なくとも、２０８６遺伝子の２種のファミリーが提示される：サブファミリーＡ−約３０％の株およびサブファミリーＢ−約７０％の株。２０８６遺伝子は５５のＮ．メニンギティディス菌株からクローニングされ、配列決定されている。サブファミリーＡ内の配列は、ＤＮＡレベルにおいて約８６〜１００％同一である。サブファミリーＢ内の配列はＤＮＡレベルにおいて約８９．５〜１００％同一である。サブファミリーＡ対サブファミリーＢ内の配列はＤＮＡレベルにおいて約６０．９〜７４％同一である。２０８６ホモログは以下のＰＣＲスクリーニングにより同定されている。
Ｎ．メニンギティディスＡ、Ｂ、Ｃ，Ｗ１３５、Ｙ
Ｎ．ラクタミカ
Ｎ．ゴノロエＦＡ１０９０
いくつかのＯＲＦ２０８６遺伝子はクローニングされ、組換え発現されている。
Ｐ２０８６の脂質化したものは９種の髄膜炎菌株から発現された。
これらの組換えタンパク質は精製され、マウスを免疫するために使用されている。
得られた抗血清は殺菌性である。
Ｐ２０８６の非−脂質化型は先の９種の菌株の中の３種から発現された。
ｒＬＰ２０８６は一貫してｒＰ２０８６より強い免疫反応を誘発する。
ｒＬＰ２０８６はさらに同種および異種髄膜炎菌株の両方に対して高められた殺菌活性を示す。
実施例１０
以下の表、表ＸＶＩＩＩおよびＸＩＸは２種のサブファミリーのメンバーの変異体の特徴を示す。
Figure 2006525330
Figure 2006525330
Figure 2006525330
Figure 2006525330
以下の表ＸＸは、２０８６サブファミリーＡの蛍光血清殺菌性アッセイの結果を提供する。
Figure 2006525330
Figure 2006525330
実施例１１
以下は、Ｐ２０８６が髄膜炎菌株に発現され、そしていくつかの菌株においてＰ２０８６発現の付加的な具体例を提供することをさらに示す。
細胞溶解物はＳＤＳ試料バッファーに再懸濁されたプレート培養物由来の細胞により調製され、９８℃で４分間加熱された。試料はウェルにつき約３０〜５０ｕｇ総タンパク質で、１０〜２０％プレキャストゲル（ＩＣＮ）に負荷し、１７５Ｖで流した。ゲルはニトロセルロース膜に移し、次にそれを３０分間、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（Ｂｌｏｔｔｏ）中の５％粉末ミルクでブロッキングした。使用した一次抗体はマウスにおいて個々のｒＬＰ２０８６変異体に対して誘導されたポリクローナル抗血清のプールであった。
図１７および１８に表すように、ウェスタンブロットはＰ２０８６サブファミリーＡおよびＢ全細胞溶解物に対するｒＬＰ２０８６マウス抗血清の反応性を示す。サブファミリーＡ細胞溶解物ブロットの場合、使用される抗血清は、ｒＬＰ２０８６−２９９６、−８７０４４６および−２５０７７１に対して誘導され、ｒＬＰ２０８６−２５０７７１はＢｌｏｔｔｏで１／５００に希釈され、他はＢｌｏｔｔｏで１／１０００に希釈された。サブファミリーＢ細胞溶解物ブロットの場合、使用される抗血清は、ｒＬＰ２０８６−８５２９（Ｂｌｏｔｔｏで１／１０００に希釈）、−ＣＤＣ１５７３、−Ｍ９８２および−８８００４９（これら３種はＢｌｏｔｔｏで１／５００に希釈）に対して誘導された。一次抗血清およびブロットは４℃で一晩インキュベートした。ブロットは洗浄し、ヤギ−抗−マウスＡＰ二次をＢｌｏｔｔｏで１／５００に希釈して添加し、ブロットは３０分間室温でインキュベートした。洗浄後、ブロットをＢＣＩＰ／ＮＢＴ膜ホスファターゼ基質系（ＫＰＬ）を使用して展開した。
参考文献目録
本明細書において先に参照した参考文献を以下に記載し、それらをそのまま参照として本明細書に援用する。
Figure 2006525330
Figure 2006525330
Figure 2006525330
Figure 2006525330
Figure 2006525330
Figure 2006525330
Figure 2006525330
Figure 2006525330
Figure 2006525330
Figure 2006525330
本発明はここで十分に説明されているが、本明細書に説明された発明の意図または範囲から逸脱することなく、それに対して多くの変更および改変を行ってもよいことは当業者には明らかであろう。本発明の好ましい態様および多数の可能性のある代替案は先に説明されている。しかし、これらの態様は単に例のためであって本発明はそれらに限定されない。
図１Ａは、異種菌株に対する殺菌抗体を誘導することができるナイセリア膜タンパク質抽出物を同定するための実験から得られたタンパク質画分の２種の主要タンパク質を表す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを表す。 図１Ｂは、プロテアーゼ消化および逆相Ｎ−末端配列決定によるＴＭＡＥフロースルー成分の分析に基づいた２種の主要タンパク質の同定のための実験の結果を表す。 図２は、ｒＬＰ２０８６の精製スキームとＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した均一性を表す。 図３は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよび対応するＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＴＭＡＥＦフロースルー成分の分析に基づいた２種の主要タンパク質および１種の少量タンパク質の同定の実験の結果を表す。 図４は、２０８６タンパク質の組換え発現に由来するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。 図５は、本明細書の実施例に記載のプラスミドｐＰＸ７３４０の概要図である。 図６は、本明細書の実施例に記載のプラスミドｐＰＸ７３２８の概要図である。 図７は、本明細書の実施例に記載のプラスミドｐＰＸ７３４３の概要図である。 図８は、種々の菌株の２０８６遺伝子のＮ−末端領域を説明する。 図９Ａは、ナイセリア菌株の免疫原性成分の同定における準備段階を示すフローチャートである。 図９Ｂは、ナイセリア菌株の免疫原性成分の同定における最終段階を示すフローチャートである。 図１０Ａは、本明細書の実施例に記載のｒＰ２０８６の脂質化型を発現させるためのＰ４シグナル／ＯＲＦ２０８６融合タンパク質を発現させる、ｐＢＡＤアラビノース誘導プロモーターの概要図である。図１０Ｂは、ＯＲＦ２０８６の非脂質化型の組換え発現のためのｐＥＴ９ａ−Ｔ７ベクターの概要図である。 図１１Ａは、ｒＬＰ２０８６タンパク質を発現する大腸菌Ｂの全細胞溶解産物を表す写真である。図１１Ｂは、ｒＬＰ２０８６タンパク質を発現する大腸菌Ｂの全細胞溶解産物を示す。 図１２は、本発明の方法に従ったＯＲＦ２０８６タンパク質のサブファミリーおよびグループの構成を示す系統樹である。 図１３は、ｒＬＰ２０８６サブファミリーＡ抗血清の全細胞ＥＬＩＳＡデータのグラフ表示である。 図１４は、ｒＬＰ２０８６サブファミリーＢ抗血清の全細胞ＥＬＩＳＡデータのグラフ表示である。 図１５は、ｒＬＰ２０８６混合研究−ＷＣＥ力価の結果のグラフ表示である。 図１６は、ｒＬＰ２０８６／ｒＰｏｒＡ混合研究−ＷＣＥ力価の結果のグラフ表示である。 図１７は、Ｐ２０８６サブファミリーＢ髄膜炎菌全細胞溶解産物に対するｒＬＰ２０８６マウス抗血清の反応性を示すウェスタンブロットである。 図１８は、Ｐ２０８６サブファミリーＡ Ｎ．メニンギティディスおよびＮ．ラクタミカ全細胞溶解産物に対するｒＬＰ２０８６マウス抗血清の反応性を示すウェスタンブロットである。 図１９は、本発明の方法に従ったＯＲＦ２０８６タンパク質のサブファミリーおよびグループの構成を示す系統樹である。 図２０は、本発明のポリペプチドを比較する配列アラインメントである。

Claims (110)

  1. 組成物であって、以下のもの：
    （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４４〜４５２のいずれかのアミノ酸配列を含む少なくとも１種のタンパク質；
    （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４４〜４５２のいずれかをコードするポリヌクレオチドのいずれかにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む少なくとも１種のタンパク質；
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載の少なくとも１種のタンパク質の少なくとも１種の免疫原性部分；または
    （ｄ）（ａ）もしくは（ｂ）に記載の少なくとも１種のタンパク質、または（ｃ）に記載の免疫原性部分、の少なくとも１種の生物学的等価物；
    を含む、前記組成物。
  2. 少なくとも１種のタンパク質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４４〜４４９のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 少なくとも１種のタンパク質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５０〜４５２のいずれかを含む、請求項１に記載の組成物。
  4. ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１種のタンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４４〜４４９のいずれかをコードするポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１に記載の組成物。
  5. ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１種のタンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５０〜４５２のいずれかをコードするポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１に記載の組成物。
  6. 組成物が少なくとも１種のＰｏｒＡ、ＰｏｒＢ、トランスフェリン結合タンパク質、または混濁タンパク質（opacity protein）（Ｏｐｃ）を付加的に含む、請求項１に記載の組成物。
  7. 組成物が少なくとも１種の付加的なナイセリア種の表面抗原を付加的に含み、前記の付加的表面抗原が非ＯＲＦ２０８６タンパク質である、請求項１に記載の組成物。
  8. 少なくとも１種のタンパク質が質量分析によって測定した場合に、分子量約２６，０００〜約３０，０００を有する、請求項１に記載の組成物。
  9. 少なくとも１種のタンパク質が１０％〜２０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで測定した場合に、分子量約２８〜３５Ｄａを有する、請求項１に記載の組成物。
  10. 組成物が薬剤的に受容できるバッファー、希釈剤、アジュバントまたはキャリアを付加的に含む、請求項１に記載の組成物。
  11. 組成物がキャリアを付加的に含む、請求項１に記載の組成物。
  12. 組成物がアジュバントを付加的に含む、請求項１に記載の組成物。
  13. 前記アジュバントが液体を含む、請求項１２に記載の組成物。
  14. タンパク質が脂質化されていない、請求項１に記載の組成物。
  15. タンパク質が組換えタンパク質である、請求項１に記載の組成物。
  16. タンパク質が天然のナイセリア種から単離される、請求項１に記載の組成物。
  17. タンパク質がリポタンパク質である、請求項１に記載の組成物。
  18. 組成物が多糖を付加的に含む、請求項１に記載の組成物。
  19. 組成物が付加的なペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を含み、哺乳動物において２種以上の細菌に対して免疫反応を誘発する接合体を形成する、請求項６０に記載の組成物。
  20. 組成物であって、以下のもの：
    （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１〜４４３の奇数番号のいずれかのアミノ酸配列を含む、少なくとも１種のタンパク質；
    （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３０〜４４２の偶数番号のいずれかの核酸配列を含むポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１種のタンパク質；
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載の少なくとも１種のタンパク質の少なくとも１種の免疫原性部分；または
    （ｄ）（ａ）もしくは（ｂ）に記載の少なくとも１種のタンパク質または（ｃ）に記載の免疫原性部分、の少なくとも１種の生物学的等価物；
    を含む、前記組成物。
  21. 少なくとも１種のタンパク質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３３〜４４３の奇数番号のいずれかのアミノ酸配列を含む、記載２０に記載の組成物。
  22. 少なくとも１種のタンパク質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１〜４３１の奇数番号のいずれかを含む、請求項２０に記載の組成物。
  23. ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１種のタンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３２〜４４２の偶数番号のいずれかにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、請求項２０に記載の組成物。
  24. ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１種のタンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３０〜４３０の偶数番号のいずれかにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、請求項２０に記載の組成物。
  25. 組成物が付加的に少なくとも１種のＰｏｒＡ、ＰｏｒＢ、トランスフェリン結合タンパク質、または混濁タンパク質（opacity protein）（Ｏｐｃ）を含む、請求項２０に記載の組成物。
  26. 組成物が付加的に少なくとも１種の付加的なナイセリア種の表面抗原を含み、前記の付加的表面抗原が非ＯＲＦ２０８６タンパク質である、請求項２０に記載の組成物。
  27. 少なくとも１種のタンパク質が質量分析によって測定した場合に、分子量約２６，０００〜約３０，０００を有する、請求項２０に記載の組成物。
  28. 少なくとも１種のタンパク質が１０％〜２０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで測定した場合に、分子量約２８〜３５Ｄａを有する、請求項２０に記載の組成物。
  29. ナイセリア種の第１の菌株の少なくとも１種の抗原であって、ナイセリア種の第２の菌株による対象の感染に対して免疫原性を提供する、前記抗原；
    ここで第１菌株はナイセリア メニンギティディス セログループＢの株Ｍ９８ ２５０７１６であり、前記の第２菌株はナイセリア メニンギティディス セログループＢの別の株である、
    を含む組成物。
  30. ナイセリア種の第１の菌株の少なくとも１種の抗原であって、ナイセリア種の第２の菌株による対象の感染に対して免疫原性を提供する、前記抗原；
    ここで第１菌株はナイセリア メニンギティディス セログループＢのＣＤＣ−５３１５、Ｂ４０、Ｍ９７ ２５０５７１、ＣＤＣ−２３６７、ＣＤＣ−１３４３、ＣＤＣ−９８３およびＣＤＣ−８５２からなる群から選択されるいずれかの株であり、そして前記の第２菌株はナイセリア メニンギティディス セログループＢの別の株である、
    を含む、組成物。
  31. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０１のアミノ酸配列を含む少なくとも１種の単離されたタンパク質：
    ここで、ｘはいずれかのアミノ酸であり；
    ここで、アミノ酸位置５〜アミノ酸位置８までの領域が０〜４のアミノ酸のいずれかであり；
    ここで、アミノ酸位置６６〜アミノ酸位置６８までの領域が０〜３のアミノ酸のいずれかであり；そして
    ここで、少なくとも１種の単離されたタンパク質がさらにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４４〜４４９のいずれかのアミノ酸配列を含む；
    を含む組成物。
  32. アミノ酸位置５〜アミノ酸位置８までの領域が０〜４のアミノ酸を含む、請求項３２に記載の組成物。
  33. アミノ酸位置６６〜アミノ酸位置６８までの領域が０〜３のアミノ酸を含む、請求項３２に記載の組成物。
  34. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０２のアミノ酸配列を含む、少なくとも１種の単離されたタンパク質：
    ここで、ｘはいずれかのアミノ酸であり；
    ここで、アミノ酸位置８〜アミノ酸位置１２までの領域が０〜５のアミノ酸のいずれかであり、そして
    ここで、少なくとも１種の単離されたタンパク質がさらにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５０〜４５２のいずれかのアミノ酸配列を含む；
    を含む組成物。
  35. アミノ酸位置８〜アミノ酸位置１２までの領域が０〜５のアミノ酸を含む、請求項３５に記載の組成物。
  36. 以下：
    （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４４〜４５２のいずれかのアミノ酸配列を含む少なくとも１種のタンパク質；
    （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４４〜４５２のいずれかをコードするポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸を含む、少なくとも１種のタンパク質；または
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載の少なくとも１種のタンパク質の少なくとも１種の免疫原性部分；または
    （ｄ）少なくとも１種の（ａ）もしくは（ｂ）に記載のタンパク質または１種の（ｃ）に記載の免疫原性部分の少なくとも１種の生物学的等価物；
    のいずれかと免疫特異的に結合する少なくとも１種の抗体を含む組成物。
  37. 抗体がモノクローナル抗体である、請求項３７に記載の組成物。
  38. 付加的に薬剤的に受容できるキャリアを含む、請求項３７に記載の組成物。
  39. 以下：
    （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１〜４４３の奇数番号のいずれかを含む少なくとも１種のタンパク質；または
    （ｂ）（ａ）に記載の少なくとも１種のタンパク質の少なくとも１種の免疫原性部分；または
    （ｃ）（ａ）に記載の少なくとも１種のタンパク質または（ｂ）に記載の少なくとも１種のフラグメントの少なくとも１種の生物学的等価物；
    のいずれかと免疫特異的に結合する、少なくとも１種の抗体を含む組成物。
  40. 少なくとも１種のタンパク質、その免疫原性部分またはその生物学的等価物がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４４〜４５２のいずれかを含む、請求項４０に記載の組成物。
  41. 少なくとも１種の抗体がモノクローナル抗体である、請求項４０に記載の組成物。
  42. （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４４〜４５２のいずれかを含む少なくとも１種の単離されたタンパク質をコードするか、または（ｂ）（ａ）に記載のポリヌクレオチドのいずれかにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１種のポリヌクレオチドを含む組成物。
  43. 付加的にＰ４リーダー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３２２）を含む、請求項４３に記載の組成物。
  44. 組成物がベクターを含む、請求項４３に記載の組成物。
  45. ストリンジェントな条件が、高ストリンジェンシーサザンハイブリダイゼーション条件である、請求項４３に記載の組成物。
  46. ポリヌクレオチドが組換えポリヌクレオチドである、請求項４３に記載の組成物。
  47. ポリヌクレオチドが天然の供与源から単離される、請求項４３に記載の組成物。
  48. 組成物がさらに付加的なペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列を付加的に含む、請求項４３に記載の組成物。
  49. 以下：
    （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４４〜４５２のいずれかのアミノ酸配列を含む、少なくとも１種のタンパク質；
    （ｂ）（ａ）に記載の少なくとも１種のタンパク質の少なくとも１種の免疫原性部分；または
    （ｃ）少なくとも１種の（ａ）に記載のタンパク質または（ｂ）に記載の免疫原性フラグメントの少なくとも１種の生物学的等価物；
    のいずれかを含むベクター、を含む組成物
  50. ベクターがプラスミドである、請求項５０に記載の組成物。
  51. ベクターがファージである、請求項５０に記載の組成物。
  52. ベクターがバクテリオファージである、請求項５０に記載の組成物。
  53. ベクターがモデレートファージ（moderate phage）である、請求項５０に記載の組成物。
  54. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３００のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを含むベクター：
    ここで,、ｘはいずれかのアミノ酸であり；
    ここで、アミノ酸位置５〜アミノ酸位置９までの領域は０〜５のアミノ酸のいずれかであり；
    ここで、アミノ酸位置６７〜アミノ酸位置６９までの領域は０〜３のアミノ酸のいずれかであり；そして
    ここで、タンパク質がさらにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４４〜４４９のいずれかを含む；
    を含む組成物。
  55. 以下：
    （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１〜４４３のポリペプチドの奇数番号の少なくとも１種をコードする、少なくとも１種のポリヌクレオチド；
    （ｂ）（ａ）の少なくとも１種のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１種のポリヌクレオチド；
    のいずれかを含むベクター、
    を含む組成物。
  56. ベクターがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３０〜４４２の偶数番号のいずれかの核酸配列を含む、請求項５６に記載の組成物。
  57. 組成物であって、以下のもの：
    ベクターで形質転換／トランスフェクション、または感染された宿主細胞であって、前記ベクターが以下：
    （ａ）ナイセリア種のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ２０８６）によってコードされる少なくとも１種のタンパク質（前記オープンリーディングフレームは交差反応性免疫原性抗原をコードし、前記交差反応性免疫原性抗原は対象においてナイセリア メニンギティディス セログループＢによる感染に対して免疫原性を提供する）；
    （ｂ）（ａ）に記載の少なくとも１種のタンパク質の少なくとも１種の免疫原性部分；または
    （ｃ）少なくとも１種の（ａ）に記載のタンパク質または（ｂ）に記載の免疫原性フラグメントの少なくとも１種の生物学的等価物；
    のいずれかを含む前記宿主細胞、
    を含む前記組成物。
  58. 組成物であって、以下のもの：
    ベクターに形質転換／トランスフェクション、または感染された宿主細胞であって、前記ベクターが以下：
    （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４４〜４５２のいずれかを含む、少なくとも１種のタンパク質；または
    （ｂ）（ａ）に記載の少なくとも１種のタンパク質の少なくとも１種の免疫原性部分；または
    （ｃ）少なくとも１種の（ａ）に記載のタンパク質または（ｂ）に記載の免疫原性部分の少なくとも１種の生物学的等価物；
    のいずれかを含む前記宿主細胞、
    を含む前記組成物。
  59. 組成物であって、以下の工程：
    ナイセリア種から以下：
    （ａ）ナイセリア種のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ２０８６）によってコードされた少なくとも１種のタンパク質（前記オープンリーディングフレームは交差反応性免疫原性抗原をコードし、そして前記交差反応性免疫原性抗原は対象におけるナイセリア メニンギティディス セログループＢによる感染に対して免疫原性を提供する）；
    （ｂ）（ａ）に記載の少なくとも１種のタンパク質の少なくとも１種の免疫原性部分；または
    （ｃ）少なくとも１種の（ａ）に記載のタンパク質または（ｂ）に記載の免疫原性フラグメントの少なくとも１種の生物学的等価物；
    ここで、少なくとも１種のポリヌクレオチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３０〜４４２の偶数番号のいずれかの核酸配列を含む、
    のいずれかを単離し、そして精製することを含む前記工程、
    により製造される、前記組成物。
  60. 工程が少なくとも１種の単離されたポリヌクレオチドに非天然リーダー配列を導入することをさらに含む、請求項６０に記載の組成物。
  61. 非天然リーダー配列がＰ４リーダー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３２２）である、請求項６１に記載の組成物。
  62. 組成物であって、以下の工程：
    ナイセリア種から、以下：
    （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４４〜４５２のいずれかを含む、少なくとも１種のタンパク質；または
    （ｂ）（ａ）に記載の少なくとも１種のタンパク質の少なくとも１種の免疫原性部分；または
    （ｃ）少なくとも１種の（ａ）に記載のタンパク質または（ｂ）に記載の免疫原性部分の少なくとも１種の生物学的等価物；
    のいずれかを単離し、そして精製することを含む前記工程、
    により製造される組成物。
  63. 組成物であって、以下の工程：
    ナイセリア種から以下：
    （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１〜４４３の奇数番号のいずれかのアミノ酸配列を含む、少なくとも１種のタンパク質；
    （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３０〜４４２の偶数番号のいずれかの核酸配列を含むポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、少なくとも１種のタンパク質；
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載の少なくとも１種のタンパク質の少なくとも１種の免疫原性部分；または
    （ｄ）少なくとも１種の（ａ）もしくは（ｂ）に記載のタンパク質または（ｃ）に記載の免疫原性フラグメントの、少なくとも１種の生物学的等価物；
    のいずれかを単離し、そして精製することを含む前記工程、
    により製造される、前記組成物。
  64. 組成物であって：
    少なくとも１種の免疫原性菌株非特異的ナイセリア メニンギティディス抗原であって、非病原性であり、実質的にどんな感染性不純物も含まず；ここで、前記抗原がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１〜４４３の奇数番号のいずれかに少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記抗原、
    を含む前記組成物。
  65. 哺乳動物において免疫反応を誘発する医薬品の製造における請求項１〜６５のいずれかに記載の組成物の使用。
  66. 組成物が非経口的に投与される、請求項６６に記載の使用。
  67. 組成物が粘膜に投与される、請求６６に記載の使用。
  68. 哺乳動物の細菌性髄膜炎に対して有効な医薬品における、請求項１〜６５のいずれかの組成物の使用。
  69. 組成物が非経口的に投与される、請求項６９に記載の組成物の使用。
  70. 組成物が粘膜に投与される、請求項６９に記載の組成物の使用。
  71. 組成物が皮下または筋肉内注射により投与される、請求項６９に記載の組成物の使用。
  72. 組成物を製造する方法であって：
    以下：
    （ａ）ナイセリア種のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ２０８６）によってコードされる少なくとも１種のタンパク質（前記オープンリーディングフレームは交差反応性免疫原性抗原をコードし、そして前記交差反応性免疫原性抗原は対象においてナイセリア メニンギティディス セログループＢによる感染に対して免疫原性を提供する）；
    （ｂ）（ａ）に記載の少なくとも１種のタンパク質の少なくとも１種の免疫原性部分；または
    （ｃ）少なくとも１種の（ａ）に記載のタンパク質または（ｂ）に記載の免疫原性フラグメントの少なくとも１種の生物学的等価物；
    のいずれかをコードする核酸配列を宿主細胞に発現させること、ここで、少なくとも１種のタンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４４〜４５２のいずれかである；
    を含む前記方法。
  73. 核酸配列がｉｎ ｖｉｖｏで発現される、請求項７３に記載の方法。
  74. 核酸配列がｉｎ ｖｉｔｒｏで発現される、請求項７３に記載の方法。
  75. Ｐ４リーダー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３２２）を結合することをさらに含む、請求項７３に記載の方法。
  76. （ａ）ナイセリア種のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ２０８６）によってコードされる少なくとも１種のタンパク質または前記の少なくとも１種のタンパク質の、少なくとも１種の免疫原性部分または生物学的等価物をコードする（前記オープンリーディングフレームは交差反応性免疫原性抗原をコードし、前記交差反応性免疫原性抗原は対象においてナイセリア メニンギティディス セログループＢによる感染に対して免疫原性を提供する）；または（ｂ）（ａ）に記載のポリヌクレオチドのいずれかにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも１種のポリヌクレオチドをＮ．メニンギティディスから単離し、そして精製することを含む、組成物を製造する方法。
  77. ストリンジェントな条件が、高ストリンジェンシーサザンハイブリダイゼーション条件である、請求項７７に記載の方法。
  78. ナイセリア種から本明細書に記載のタンパク質、免疫原性部分または生物学的等価物のいずれかを単離し、そして精製することを含む、組成物を製造する方法。
  79. 本明細書に記載のタンパク質、免疫原性部分または生物学的等価物のいずれかを含む組成物を動物に導入後、該動物から抗体を回収することを含む、抗体組成物を製造する方法。
  80. 請求項１〜６５に記載の１以上の組成物の有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物に免疫反応を誘発する方法。
  81. 前記組成物が非経口的に投与される、請求項８１に記載の方法。
  82. 前記組成物が粘膜に投与される、請求項８１に記載の方法。
  83. 請求項１〜６５に記載の１以上の組成物の有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の細菌性髄膜炎を予防または処置する方法。
  84. 前記組成物が非経口的に投与される、請求項８４に記載の方法。
  85. 前記組成物が粘膜に投与される、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記組成物が皮下または筋肉内に投与される、請求項８４に記載の方法。
  87. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１〜４４３の奇数番号のいずれか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４４〜４５２のいずれかのアミノ酸配列を含む、タンパク質、免疫原性部分または生物学的等価物と免疫特異的に結合する抗体を含む抗体組成物の有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の細菌性髄膜炎を予防または処置する方法。
  88. 抗体組成物が非経口的に投与される、請求項８８に記載の方法。
  89. 抗体組成物が粘膜に投与される、請求項８８に記載の方法。
  90. 抗体組成物が皮下または筋肉内注射によりに投与される、請求項８８に記載の方法。
  91. 組成物を製造する方法であって：
    以下：
    （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１〜４４３の奇数番号のいずれかまたはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５４〜２９９のいずれかのアミノ酸配列を含む、少なくとも１種のタンパク質；
    （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３０〜４４２の偶数番号のいずれの核酸配列を含むポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１種のタンパク質；
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載の少なくとも１種のタンパク質の少なくとも１種の免疫原性部分；または
    （ｄ）少なくとも１種の（ａ）もしくは（ｂ）に記載のタンパク質または（ｃ）に記載の免疫原性フラグメントの少なくとも１種の生物学的等価物；
    のいずれかをコードする核酸配列を宿主細胞に発現させること、
    を含む、前記方法。
  92. 核酸配列がｉｎ ｖｉｖｏで発現される、請求項９２に記載の方法。
  93. 核酸配列がｉｎ ｖｉｔｒｏで発現される、請求項９２に記載の方法。
  94. ベクターがプラスミドである、記載９２に記載の方法。
  95. ベクターがファージである、請求項９２に記載の方法。
  96. 前記の少なくとも１種の単離されたポリヌクレオチドと非天然リーダー配列を結合することをさらに含む、請求項９２に記載の方法。
  97. 非天然リーダー配列がＰ４リーダー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：．２６７）である、請求項９７に記載の方法。
  98. 抗体組成物を製造する方法であって、以下のもの：
    （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１〜４４３の奇数番号のいずれかのアミノ酸配列またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４４〜４５２のいずれかのアミノ酸配列を含む、少なくとも１種のタンパク質；
    （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３０〜４４２の偶数番号のいずれかのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１種のタンパク質；
    を含む組成物を動物に導入した後、動物から抗体を回収することを含む、前記方法。
  99. ストリンジェントな条件が、高ストリンジェンシーサザンハイブリダイゼーション条件である、請求項９９に記載の方法。
  100. 以下のもの：（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４４〜４５２のいずれかのアミノ酸配列を含む少なくとも１種の単離されたタンパク質をコードするか、または（ｂ）（ａ）に記載のポリヌクレオチドのいずれかにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を発現する組み換え細胞、を含む、形質転換／トランスフェクション、または感染された細胞系統。
  101. 形質転換／トランスフェクション、または感染された細胞系統であって、以下のもの：
    （ａ）ナイセリア種のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ２０８６）によってコードされる少なくとも１種のタンパク質もしくは前記の少なくとも１種のタンパク質の、少なくとも１種の免疫原性部分または生物学的等価物をコードする（前記オープンリーディングフレームは交差反応性免疫原性抗原をコードし、前記交差反応性免疫原性抗原は対象においてナイセリア メニンギティディス セログループＢによる感染に対して免疫原性を提供する）か；または（ｂ）（ａ）に記載のポリヌクレオチドのいずれかにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を発現する組み換え細胞；または
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）のいずれかによってコードされた少なくとも１種のポリペプチド；または（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１〜４４３の奇数番号のいずれかのアミノ酸配列を含む少なくとも１種のポリペプチドをコードする核酸配列を発現する組み換え細胞；
    を含む、前記形質転換／トランスフェクション、または感染された細胞系統。
  102. ポリペプチドがモノクローナル抗体である、請求項１０２に記載の形質転換／トランスフェクション、または感染された細胞系統。
  103. 組み換え細胞がハイブリドーマである、請求項１０２に記載の形質転換／トランスフェクション、または感染された細胞系統。
  104. 組み換え細胞がトリオーマである、請求項１０２に記載の形質転換／トランスフェクション、または感染された細胞系統。
  105. 形質転換／トランスフェクション、または感染された細胞系統であって、以下のもの：
    （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１〜４４３の奇数番号のいずれかを含むタンパク質をコードする少なくとも１種のポリヌクレオチド；
    （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３０〜４４２の偶数番号のいずれかの核酸配列を含む少なくとも１種のポリヌクレオチド；
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）のいずれかにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１種のポリヌクレオチド；
    を含む核酸配列を発現する組み換え細胞；または
    （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかによってコードされた少なくとも１種のポリペプチド；または
    （ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３１〜４４３の奇数番号のいずれかのアミノ酸配列を含む
    少なくとも１種のポリペプチド；
    をコードする核酸配列を発現する組み換え細胞；
    を含む、前記形質転換／トランスフェクション、または感染された細胞系統。
  106. ポリペプチドがモノクローナル抗体である、請求項１０６に記載の形質転換／トランスフェクション、または感染された細胞系統。
  107. ポリペプチドがハイブリドーマである、請求項１０６に記載の形質転換／トランスフェクション、または感染された細胞系統。
  108. ポリペプチドがトリオーマである、請求項１０６に記載の形質転換／トランスフェクション、または感染された細胞系統。
  109. 実質的に先に記載の組成物。
  110. 実質的に先に記載の使用。
JP2006513095A 2003-04-16 2004-04-16 髄膜炎菌性疾患の予防および処置のための新規免疫原性組成物 Pending JP2006525330A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US46316103P 2003-04-16 2003-04-16
PCT/US2004/011901 WO2004094596A2 (en) 2003-04-16 2004-04-16 Novel immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2006525330A true JP2006525330A (ja) 2006-11-09
JP2006525330A5 JP2006525330A5 (ja) 2008-01-24

Family

ID=33310752

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2006513095A Pending JP2006525330A (ja) 2003-04-16 2004-04-16 髄膜炎菌性疾患の予防および処置のための新規免疫原性組成物

Country Status (11)

Country Link
US (5) US20070253964A1 (ja)
EP (1) EP1618185A4 (ja)
JP (1) JP2006525330A (ja)
KR (1) KR20060019515A (ja)
CN (1) CN1867354A (ja)
AU (2) AU2004233012A1 (ja)
BR (1) BRPI0409459A (ja)
CA (1) CA2522751A1 (ja)
CO (1) CO5700785A2 (ja)
MX (1) MXPA05011110A (ja)
WO (1) WO2004094596A2 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013540432A (ja) * 2010-09-10 2013-11-07 ワイス・エルエルシー 髄膜炎菌ｏｒｆ２０８６抗原の非脂質化変異体
JP2013540705A (ja) * 2010-08-23 2013-11-07 ワイス・エルエルシー ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｒＬＰ２０８６抗原の安定な製剤
JP2014503172A (ja) * 2009-10-27 2014-02-13 ノバルティス アーゲー 改変髄膜炎菌ｆＨＢＰポリペプチド

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR9910089A (pt) 1998-05-01 2004-06-08 Chiron Corp Composições e antìgenos de neisseria meningitidis
EP2270174A1 (en) 1999-05-19 2011-01-05 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Combination neisserial compositions
EP2275552B1 (en) 1999-10-29 2015-09-09 GlaxoSmithKline Biologicals SA Neisserial antigenic peptides
PT2270030E (pt) 2000-02-28 2012-07-24 Novartis Vaccines & Diagnostic Expressão heteróloga de proteínas de neisseria
GB0118249D0 (en) 2001-07-26 2001-09-19 Chiron Spa Histidine vaccines
GB0121591D0 (en) 2001-09-06 2001-10-24 Chiron Spa Hybrid and tandem expression of neisserial proteins
MX339524B (es) 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
US7785608B2 (en) 2002-08-30 2010-08-31 Wyeth Holdings Corporation Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease
GB0227346D0 (en) 2002-11-22 2002-12-31 Chiron Spa 741
GB0408977D0 (en) 2004-04-22 2004-05-26 Chiron Srl Immunising against meningococcal serogroup Y using proteins
CN102716480B (zh) 2005-04-08 2023-03-21 惠氏有限责任公司 多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物
US7709001B2 (en) 2005-04-08 2010-05-04 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
WO2007042326A2 (en) * 2005-10-14 2007-04-19 Intercell Ag Neisseria meningitidis antigens
GB0524066D0 (en) 2005-11-25 2006-01-04 Chiron Srl 741 ii
TW200806315A (en) 2006-04-26 2008-02-01 Wyeth Corp Novel formulations which stabilize and inhibit precipitation of immunogenic compositions
SG174013A1 (en) 2006-07-27 2011-09-29 Wyeth Corp High-cell density fed-batch fermentation process for producing recombinant protein
AR064642A1 (es) 2006-12-22 2009-04-15 Wyeth Corp Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi
NZ587382A (en) 2008-02-21 2012-01-12 Novartis Ag Meningococcal fhbp polypeptides
GB0819633D0 (en) * 2008-10-25 2008-12-03 Isis Innovation Composition
NZ595234A (en) 2009-03-24 2013-12-20 Novartis Ag Adjuvanting meningococcal factor h binding protein
WO2011024072A2 (en) 2009-08-27 2011-03-03 Novartis Ag Hybrid polypeptides including meningococcal fhbp sequences
CN102869377A (zh) * 2010-03-10 2013-01-09 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 免疫原性组合物
CA2798331C (en) * 2010-05-14 2022-03-15 Baxter International Inc. Ospa chimeras and use thereof in vaccines
PL3170508T3 (pl) 2010-06-04 2020-04-30 Wyeth Llc Preparaty szczepionek
EP2585106A1 (en) 2010-06-25 2013-05-01 Novartis AG Combinations of meningococcal factor h binding proteins
US10596246B2 (en) 2011-12-29 2020-03-24 Glaxosmithkline Biological Sa Adjuvanted combinations of meningococcal factor H binding proteins
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
NZ628449A (en) 2012-03-09 2016-04-29 Pfizer Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
NZ630133A (en) 2012-06-14 2016-10-28 Novartis Ag Vaccines for serogroup x meningococcus
EP2877492A1 (en) 2012-07-27 2015-06-03 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Cd147 as receptor for pilus-mediated adhesion of meningococci to vascular endothelia
JP6446377B2 (ja) 2013-03-08 2018-12-26 ファイザー・インク 免疫原性融合ポリペプチド
CA2923129C (en) 2013-09-08 2020-06-09 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
BR112016019735A2 (pt) 2014-02-28 2017-10-17 Glaxosmithkline Biologicals Sa fhbp, polipeptídeo, plasmídeo ou outro ácido nucleico, célula hospedeira, vesículas de membrana, e, composição imunogênica
BR112017017460A2 (pt) * 2015-02-19 2018-04-10 Pfizer Inc. composições de neisseria meningitidis e métodos das mesmas
US10738338B2 (en) 2016-10-18 2020-08-11 The Research Foundation for the State University Method and composition for biocatalytic protein-oligonucleotide conjugation and protein-oligonucleotide conjugate
CN110234658B (zh) 2017-01-31 2024-03-12 辉瑞大药厂 脑膜炎奈瑟菌组合物及其使用方法
GB202016604D0 (en) * 2020-10-20 2020-12-02 Univ Of Oxford Compositions and methods for inducing an immune response
CN113372571A (zh) * 2021-07-05 2021-09-10 云南紫辰集团生物科技有限公司 黄腐酸钾干粉的生产工艺

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002505083A (ja) * 1998-02-03 2002-02-19 センター フォア ディズィーズ コントロール アンド プリヴェンション 組換え脂質化ＰｓａＡタンパク質、調製法および使用
JP2002525093A (ja) * 1998-09-30 2002-08-13 アメリカン・サイアナミド・カンパニー アジュバントとしての変異コレラホロトキシン
JP2005515771A (ja) * 2001-10-11 2005-06-02 ワイエス・ホールディングス・コーポレーション 髄膜炎性疾患の予防および治療のための新規免疫原性組成物

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US466829A (en) * 1892-01-12 Carpet-stretcher
US4376110A (en) * 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4554101A (en) * 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US4650764A (en) * 1983-04-12 1987-03-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Helper cell
US4797368A (en) * 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US4666829A (en) * 1985-05-15 1987-05-19 University Of California Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis
US5139941A (en) * 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US4861719A (en) * 1986-04-25 1989-08-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center DNA constructs for retrovirus packaging cell lines
US4980289A (en) * 1987-04-27 1990-12-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Promoter deficient retroviral vector
US5124263A (en) * 1989-01-12 1992-06-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Recombination resistant retroviral helper cell and products produced thereby
US5703055A (en) * 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5399346A (en) * 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5264618A (en) * 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
EP0625052A4 (en) * 1991-10-21 1995-07-19 Medimmune Inc SECRETION SIGNAL OF LIPOPROTEIN-ENCODING DNA CONTAINING BACTERIAL EXPRESSION VECTOR.
FR2708622B1 (fr) * 1993-08-02 1997-04-18 Raymond Hamers Vecteur recombinant contenant une séquence d'un gène de lipoprotéine de structure pour l'expression de séquences de nucléotides.
US5739118A (en) * 1994-04-01 1998-04-14 Apollon, Inc. Compositions and methods for delivery of genetic material
DE19723095C2 (de) * 1997-06-02 2001-08-23 Siemens Ag Bildrekonstruktionsverfahren für einen Computertomographen
BR9910089A (pt) * 1998-05-01 2004-06-08 Chiron Corp Composições e antìgenos de neisseria meningitidis
US20070020622A1 (en) * 2001-09-14 2007-01-25 Invitrogen Corporation DNA Polymerases and mutants thereof
GB0227346D0 (en) * 2002-11-22 2002-12-31 Chiron Spa 741

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002505083A (ja) * 1998-02-03 2002-02-19 センター フォア ディズィーズ コントロール アンド プリヴェンション 組換え脂質化ＰｓａＡタンパク質、調製法および使用
JP2002525093A (ja) * 1998-09-30 2002-08-13 アメリカン・サイアナミド・カンパニー アジュバントとしての変異コレラホロトキシン
JP2005515771A (ja) * 2001-10-11 2005-06-02 ワイエス・ホールディングス・コーポレーション 髄膜炎性疾患の予防および治療のための新規免疫原性組成物

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014503172A (ja) * 2009-10-27 2014-02-13 ノバルティス アーゲー 改変髄膜炎菌ｆＨＢＰポリペプチド
JP2016040302A (ja) * 2009-10-27 2016-03-24 ノバルティス アーゲー 改変髄膜炎菌ｆＨＢＰポリペプチド
JP2013540705A (ja) * 2010-08-23 2013-11-07 ワイス・エルエルシー ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｒＬＰ２０８６抗原の安定な製剤
JP2013540432A (ja) * 2010-09-10 2013-11-07 ワイス・エルエルシー 髄膜炎菌ｏｒｆ２０８６抗原の非脂質化変異体

Also Published As

Publication number Publication date
EP1618185A2 (en) 2006-01-25
AU2010200892A1 (en) 2010-04-01
US20070082007A1 (en) 2007-04-12
CO5700785A2 (es) 2006-11-30
US20070082866A1 (en) 2007-04-12
WO2004094596A8 (en) 2006-06-15
US20070253964A1 (en) 2007-11-01
US20090202593A1 (en) 2009-08-13
CN1867354A (zh) 2006-11-22
AU2004233012A1 (en) 2004-11-04
KR20060019515A (ko) 2006-03-03
MXPA05011110A (es) 2006-01-24
BRPI0409459A (pt) 2006-05-02
WO2004094596A2 (en) 2004-11-04
CA2522751A1 (en) 2004-11-04
EP1618185A4 (en) 2009-05-27
US20070082006A1 (en) 2007-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5997400B2 (ja) 髄膜炎性疾患の予防および治療のための新規免疫原性組成物
JP2006525330A (ja) 髄膜炎菌性疾患の予防および処置のための新規免疫原性組成物
JP2010512792A (ja) 髄膜炎菌性疾患の予防および処置のための新規な免疫原性組成物

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20070411

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20070411

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20070411

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20071128

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100617

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20100916

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20100927

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20120119