KR101944960B1

KR101944960B1 - 폐렴 구균 혈청형을 갖는 협막 다당류의 제조방법

Info

Publication number: KR101944960B1
Application number: KR1020130106993A
Authority: KR
Inventors: 신진환; 박만훈; 김훈; 노명주; 박수진
Original assignee: 에스케이바이오사이언스 주식회사
Priority date: 2012-09-07
Filing date: 2013-09-06
Publication date: 2019-02-07
Also published as: CO7400875A2; CN104781413B; PH12015500497A1; BR112015005081A8; WO2014038879A1; CA2884241C; CA2884241A1; ES2651415T3; KR20140032912A; RU2015109997A; BR112015005081A2; EP2894225A4; AU2013313794B2; CN104781413A; EP2894225B1; US20150231225A1; PH12015500497B1; MX363051B; RU2606022C2; JP2015527079A

Abstract

본 발명은 폐렴 구균 혈청형을 갖는 협막 다당류의 개선된 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따른 제조방법은 pH 조절 없이 폐렴 구균 혈청형을 생성하는 균주를 추가로 배양하는 단계를 포함함으로써, pH 조절제를 사용한 산성화를 통한 단백질 침전 공정을 제거할 수 있다.

Description

폐렴 구균 혈청형을 갖는 협막 다당류의 제조방법{Process for preparing a capsular polysaccharide having a serotype of Streptococcus pneumoniae}

본 발명은 폐렴 구균 혈청형을 갖는 협막 다당류의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 폐렴 구균 혈청형을 생성하는 균주의 배양액으로부터 단백질, 핵산 등의 불순물을 제거하여 폐렴 구균 혈청형을 갖는 협막 다당류를 제조하는 방법에 관한 것이다.

폐렴 구균(Streptococcus pneumoniae)은 락토바실러스목 연쇄상구균과에 속하는 그람 양성균으로서, 사람에게 폐렴, 균혈증, 중이염, 뇌막염 등의 질병을 일으킨다. 폐렴구균의 혈청형 세포는 각 세포의 주변을 감싸는 다당류 코팅인 협막(夾膜)을 갖는다. 이 협막은 항체가 박테리아 세포에 결합하는 것을 막음으로써 식균작용을 방해한다. 면역학적 특성에 따라서 약 90 종 이상의 혈청형으로 구분되고 있으나, 이중 일부의 혈청형이 침습성 질환을 유발하는 것으로 보고되어 있다. 1996 ∼ 2008 년 동안 수집한 침습성 폐렴 구균에서 총 37 종의 혈청형이 확인되었고, 19F ＞ 23F ＞ 19A ＞ 6A ＞ 3 ＞ 9V ＞ 6B 혈청형 순으로 나타난 이들 주요 혈청형이 53.4 %로 과반수 이상을 차지하였다. 이러한 혈청형의 폐렴구균의 협막 다당류를 이용하여 다당류 백신, 다당류-단백질 접합 백신 등의 백신이 제조된 바 있다.

다당류 백신 및 다당류-단백질 접합 백신의 생산을 위해 이용되는 협막 다당류는 각 혈청형을 생성하는 균주의 배양액으로부터 얻어진다. 각 균주는 최적화된 온도, pH 조건 및 교반 조건하에서 최대 증식량에 도달할 때까지 배양된다. 세포질 외로 분비되지 않는 폐렴구균의 협막 다당류를 얻기 위해서, 데옥시콜레이트 나트륨(DOC) 등을 이용한 세포 용해과정이 수행된다. 이때, 협막 다당류 이외에 균주가 가지는 다양한 단백질과 핵산이 함께 방출되며, 이는 배양 후 정제 공정에서 제거되어야 한다. 백신 접종 후 항원 이외의 물질에 의한 부작용을 최소화하기 위해서는, 엄격한 단백질 및 핵산 함량의 기준을 충족할 것이 요구된다. 예를 들어, 프레브나 7^TM(Prevnar 7^TM)의 경우, 혈청형에 따라서 건조중량 기준 단백질은 2∼5% 이하, 핵산은 1∼2 %이하의 기준을 만족해야 한다.

국제특허공개 제WO 2006/110352호는 폐렴 구균의 배양, 세포 용해, pH 5.5 미만으로의 산성화에 의한 단백질 침전, 진탕없이 방치, 및 원심분리 및/또는 여과 등의 단계를 수행하여, 협막 다당류를 얻는 방법을 개시한 바 있다. 또한, 국제특허공개 제WO 2008/118752호는 세포 용해물을 한외여과 및 정용여과한 다음, 산성화에 의한 단백질 침전 공정을 수행하여, 협막 다당류를 얻는 방법을 개시한 바 있다. 그러나, 종래의 제조방법은 모두 pH 조절제를 사용한 산성화를 통한 단백질 침전 공정을 필수적으로 수행하여야 하나, 이는 전체 공정을 복잡하게 할 뿐만 아니라, 협막 다당류의 변형 및 유해물질의 생성을 야기할 수 있다.

본 발명자들은 폐렴 구균 혈청형을 갖는 협막 다당류의 제조방법을 개선하기 위하여 다양한 연구를 수행하였다. 본 발명자들은 놀랍게도 pH 조절 없이 동일한 조건에서 추가 배양을 수행할 경우, 배양 산물(특히, 젖산 등)에 의해 pH를 단백질 침전에 적합한 범위 즉, pH 5.5 이하로 낮출 수 있다는 것을 발견하였다. 즉, 본 발명자들은 pH 조절 없이 추가의 배양을 수행한 다음, 세포 용해 및 단백질 침전 공정을 수행함으로써, pH 조절제를 사용한 산성화를 통한 단백질 침전 공정을 제거할 수 있다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 폐렴 구균 혈청형을 갖는 협막 다당류의 개선된 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 하기 단계를 포함하는, 폐렴 구균 혈청형을 갖는 협막 다당류의 제조방법이 제공된다:

(a) 배양액의 pH를 7.0 내지 9.4의 범위로 유지하면서, 폐렴 구균 혈청형을 생성하는 균주를 배양하는 단계;

(b) 배양액의 흡광도가 일정한 값으로 유지되는 시점부터 감소하기 시작하는 시점 사이에서 단계(a)의 배양을 종료하는 단계;

(c) pH 조절 없이, 단계(b)로부터 얻어진 배양액을 배양액의 pH가 5.5 이하로 될 때까지 추가로 배양하는 단계;

(d) 단계(c)로부터 얻어진 배양액에 용해제를 가하여 세포를 용해시킨 다음, 단백질을 침전시키고, 침전된 단백질 및 세포 잔해를 제거하는 단계;

(e) 단계(d)로부터 얻어진 용액으로부터 협막 다당류를 단리 및 정제하는 단계.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 폐렴 구균 혈청형은 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9N, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 또는 33F일 수 있다.

단계(a)의 상기 배양은 34∼38 ℃ 에서 50∼150 rpm 으로 교반하면서 수행될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 단계(b)는 배양액의 흡광도가 일정한 값으로 유지되는 시점부터 1 내지 3 시간 이내에 단계(a)의 배양을 종료함으로써 수행될 수 있다.

단계(c)의 추가 배양은 pH 조절 없이, 34∼38 ℃ 에서 50∼150 rpm으로 교반하면서 수행될 수 있다.

단계(d)에서 사용되는 용해제는 데옥시콜레이트 나트륨일 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 단계(d)는 단계(c)로부터 얻어진 배양액에 용해제를 가하여 세포를 용해시킨 다음, 얻어진 용액을 10∼20 ℃에서 3∼24 시간 동안 교반없이 유지하여 단백질을 침전시키고, 원심분리에 의해 침전된 단백질 및 세포 잔해를 제거함으로써 수행될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서, 단계(e)의 단리 및 정제는 하기 단계를 포함할 수 있다:

(i) 단계(d)로부터 얻어진 용액을 심층 여과기(Depth filter)로 여과하는 단계;

(ii) 단계(i)로부터 얻어진 여액을 농축한 후, 한외여과 및 원심분리를 수행하는 단계;

(iii) 단계(ii)로부터 얻어진 상등액에 양이온성 계면활성제를 가하여 반응시킨 후, 원심분리하여 협막 다당류를 함유하는 펠렛 또는 상등액을 얻는 단계;

(iv) 단계(iii)로부터 얻어진 협막 다당류를 요오드화나트륨과 반응시키고, 원심분리하여 상등액을 회수하는 단계;

(v) 단계(iv)로부터 얻어진 용액에 활성탄을 가하고 여과하는 단계;

(vi) 단계(v)로부터 얻어진 여액을 농축한 후, 한외여과 및 원심분리를 수행하여 협막 다당류를 얻는 단계.

상기 구현예에서, 단계(ii)의 농축은 100 kDa 멤브레인을 사용하여 수행될 수 있으며, 단계(vi)의 농축은 30 kDa 멤브레인을 사용하여 수행될 수 있다. 또한, 단계(iii)에서 사용되는 양이온성 계면활성제는 세틸트리메틸암모늄브로마이드일 수 있으며, 상기 세틸트리메틸암모늄브로마이드는 0.5∼3.0 %의 농도로 사용될 수 있다. 또한 단계(v)에서 사용되는 활성탄은 1∼5 %(w/v)의 함량으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법은 단백질 침전을 위한 pH 조절제를 사용하지 않는다. 즉, 본 발명에 의해, pH 조절 없이 동일한 조건에서 폐렴 구균 혈청형을 생성하는 균주를 추가로 배양할 경우, 배양 산물(특히, 젖산 등)에 의해 pH를 단백질 침전에 적합한 범위 즉, pH 5.5 이하로 낮출 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 제조방법은 단백질 침전을 위한 pH 조절제의 사용이 요구되지 않으므로, 협막 다당류의 변형 및 유해물질의 생성을 최소화할 수 있으며, 제조공정을 단순화할 수 있다. 본 발명의 제조방법에 따라 얻어진 폐렴 구균 혈청형을 갖는 협막 다당류는 다당류 백신 및 다당류-단백질 접합 백신에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 폐렴 구균 혈청형 3를 생성하는 균주의 배양 pH 변화 추이 및 조건을 나타낸다.
도 2은 폐렴 구균 혈청형 6B를 생성하는 균주의 배양 pH 변화 추이 및 조건을 나타낸다.
도 3은 폐렴 구균 혈청형 7F를 생성하는 균주의 배양 pH 변화 추이 및 조건을 나타낸다.
도 4은 폐렴 구균 혈청형 14를 생성하는 균주의 배양 pH 변화 추이 및 조건을 나타낸다.
도 5은 폐렴 구균 혈청형 19A를 생성하는 균주의 배양 pH 변화 추이 및 조건을 나타낸다.
도 6은 폐렴 구균 혈청형 23F를 생성하는 균주의 배양 pH 변화 추이 및 조건을 나타낸다.

본 발명은 하기 단계를 포함하는, 폐렴 구균 혈청형을 갖는 협막 다당류의 제조방법을 제공한다:

본 발명에 따른 제조방법의 단계(a)에 있어서, 상기 폐렴 구균 혈청형은 폐렴구균 백신 제조에 사용되는 모든 형태의 혈청형일 수 있으며, 예를 들어, 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9N, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 33F 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 폐렴 구균 혈청형을 생성하는 균주는 본 기술분야에 공지되어 있으며, 공지된 균주를 제한 없이 사용할 수 있다(예를 들어, 제WO 2006/110381호 참조). 본 발명에 따른 제조방법의 단계(a)의 배양은, 예를 들어 수산화나트륨 등을 사용하여, 배양액의 pH를 7.0 내지 9.4, 바람직하게는 7.2 내지 8.2의 범위로 유지하면서 대두-기제 배지 등의 통상의 배지 중에서 수행된다. 상기 배양은 공지의 배양 조건 예를 들어 34∼38 ℃ 에서 50∼150 rpm 으로 교반하면서 수행될 수 있다. 폐렴 구균의 대표적인 혈청형에 따른 종 배양 및 본 배양에 적합하게 사용될 수 있는 pH 조건은 다음 표 1과 같다.

혈청형에 따른 pH 조건

혈청형	종 배양 조건	본 배양 조건
1	pH 7.2±0.2	pH 7.2±0.2
2	pH 7.2±0.2	pH 7.2±0.2
3	pH 7.2±0.2	pH 7.2±0.2
4	pH 7.6±0.6	pH 7.6±0.6
5	pH 7.2±0.2	pH 7.2±0.2
6A	pH 7.2±0.2	pH 7.2±0.2
6B	pH 7.2±0.2	pH 7.2±0.2
7F	pH 7.2±0.2	pH 7.2±0.2
9N	pH 7.6±0.6	pH 7.6±0.6
9V	pH 7.6±0.6	pH 7.6±0.6
14	pH 7.6±0.6	pH 7.6±0.6
18C	pH 7.2±0.2	pH 7.2±0.2
19A	pH 7.2±0.2	pH 7.2±0.2
19F	pH 7.2±0.2	pH 7.2±0.2
22F	pH 7.2±0.2	pH 7.2±0.2
23F	pH 7.2±0.2	pH 7.2±0.2
33F	pH 7.2±0.2	pH 7.2±0.2

본 발명에 따른 제조방법은 단백질 침전을 위한 pH 조절제를 사용하지 않는다. 즉, 본 발명자들은 놀랍게도 pH 조절 없이 동일한 조건에서 추가 배양을 수행할 경우, 배양 산물(특히, 젖산 등)에 의해 pH를 단백질 침전에 적합한 범위 즉, pH 5.5 이하로 낮출 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 제조방법은 폐렴 구균 혈청형을 생성하는 균주의 배양 후, 바람직하게는 최대 증식에 도달된 시점에서 pH 조절 없이 추가의 배양을 수행한 다음, 세포 용해 및 단백질 침전 공정을 수행하는 것을 포함한다. 그러므로, 본 발명의 제조방법은 단백질 침전을 위한 pH 조절제의 사용이 요구되지 않으므로, 협막 다당류의 변형 및 유해물질의 생성을 최소화할 수 있으며, 제조공정을 단순화할 수 있다.

따라서, 본 발명의 제조방법은 배양액의 흡광도가 일정한 값으로 유지되는 시점부터 감소하기 시작하는 시점 사이에서 단계(a)의 배양을 종료하는 단계[즉, 단계(b)]; 및 pH 조절 없이, 단계(b)로부터 얻어진 배양액을 배양액의 pH가 5.5 이하로 될 때까지 추가로 배양하는 단계[즉, 단계(c)]를 포함한다.

본 발명의 제조방법의 단계(a)에 따라 배양을 수행하면, 균주가 증식함으로써 배양액의 흡광도[예를 들어, 590 nm에서의 흡광도(OD₅₉₀)]가 서서히 증가하게 되고, 최대 증식에 도달된 시점(배양 시작 후 약 7∼24 시간)에서 흡광도가 일정한 값으로 유지된다. 이후, 상기 흡광도는 1 내지 3 시간 이내에 다시 감소되게 된다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에서, 단계(b)는 배양액의 흡광도가 일정한 값으로 유지되는 시점부터 1 내지 3 시간 이내에 단계(a)의 배양을 종료함으로써 수행될 수 있다. 단계(c)의 추가 배양은 pH 조절 없이, 단계(a)와 동일한 조건 즉 34∼38 ℃ 에서 50∼150 rpm으로 교반하면서 수행될 수 있다. 이와 같이 추가의 배양을 수행할 경우, 배양액의 pH는 5.5 이하로 자연스럽게 감소되며, 따라서 단백질 응집에 필요한 적정 pH를 제공한다.

본 발명의 제조방법은 단계(c)로부터 얻어진 배양액에 용해제를 가하여 세포를 용해시킨 다음, 단백질을 침전시키고, 침전된 단백질 및 세포 잔해를 제거하는 단계[즉, 단계(d)]를 포함한다.

상기 세포의 용해는 공지의 방법, 예를 들어 제WO 2006/110381호, 제WO 2008/118752호 등에 개시된 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 세포의 용해는 용해제로서 데옥시콜레이트 나트륨을 사용하여 수행될 수 있다. 데옥시콜레이트 나트륨은 0.10∼0.15 %의 농도(데옥시콜레이트 나트륨을 가했을 때의 농도)로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 세포의 용해에 따라 폐렴구균 혈청형의 협막 다당류가 세포질 외로 방출되게 된다. 또한, 단백질 침전은 예를 들어, 10∼20 ℃에서 정치함으로써 수행될 수 있으며, 침전된 단백질 및 세포 잔해의 제거는 통상의 방법(예를 들어, 원심분리 등)에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 단계(d)는 단계(c)로부터 얻어진 배양액에 용해제를 가하여 세포를 용해시킨 다음, 얻어진 용액을 10∼20 ℃에서 3∼24 시간 동안 교반없이 유지하여 단백질을 침전시키고, 원심분리에 의해 침전된 단백질 및 세포 잔해를 제거함으로써 수행될 수 있다.

본 발명의 제조방법은 단계(d)로부터 얻어진 용액으로부터 불순물(예를 들어, 세포 내부에 포함되어 있던 단백질, 핵산 등)을 제거하여 협막 다당류를 단리 및 정제하는 단계[즉, 단계(e)]를 포함한다. 상기 협막 다당류의 단리 및 정제는 공지의 정제방법, 예를 들어 제WO 2006/110381호, 제WO 2008/118752호 등에 개시된 방법에 따라 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 단계(e)의 단리 및 정제는 하기 단계를 포함할 수 있다:

상기 구현예에서, 심층 여과기(Depth filter)를 사용한 여과에 의해, 침전된 단백질 및 세포 잔해의 제거를 위한 원심분리 후에도 남아있는 용해물이 제거된다.

또한, 농축/한외여과를 2차에 걸쳐 수행함으로써 단백질과 핵산을 제거할 수 있다. 일 구현예에서, 단계(ii)의 농축은 100 kDa 멤브레인을 사용하여 수행될 수 있으며, 단계(vi)의 농축은 30 kDa 멤브레인을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 한외여과는 본 공정에서 '정용여과(diafiltration)'로 칭해질 수도 있다.

또한, 단계(iii)에서 사용되는 양이온성 계면활성제는 세틸트리메틸암모늄브로마이드일 수 있다. 상기 세틸트리메틸암모늄브로마이드(Cetrimonium Bromide, Hexadecyl-trimethylammonium bromide (HB))는 0.5∼3 %의 농도(세틸트리메틸암모늄브로마이드를 가했을 때의 농도)로 사용될 수 있다. 사용된 HB 등의 양이온성 계면활성제는 요오드화나트륨을 사용하여 침전 및 제거된다. 상기 단계(iii)에서 원심분리 공정을 수행할 경우, 협막 다당류는 펠렛(예를 들어, 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 9N, 9V, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 등) 또는 상등액(예를 들어, 혈청형 7F, 14, 33F, 등)에 존재하게 된다. 펠렛 형태로 얻어지는 협막 다당류는 적절한 용매(예를 들어, 염화나트륨 수용액 등)에 용해시켜 이어지는 단계(즉 요오드화나트륨과의 반응)를 수행할 수 있다. 상등액에 존재하는 협막 다당류는 별도의 분리 없이 그대로 상등액 형태로 이어지는 단계(즉 요오드화나트륨과의 반응)를 수행할 수 있다.

또한, 단계(v)에서 활성탄(activated carbon)은 1∼5 %(w/v)의 함량으로 바람직하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예

하기 실시예에서 사용된 대두-기제 배지의 조성은 다음 표 2와 같다.

배지 조성	리터당 함량(g)
대두 펩톤(Soytone^TM, BD 243620)	28
염화나트륨	3.5
인산칼륨	0.7

실시예 1. 폐렴구균 혈청형 3, 6B, 및 19A 의 협막 다당류의 제조

<세포은행의 제조>

폐렴구균 혈청형 3, 6B, 및 19A을 각각 생산하는 원종균(seed stock)을 수탁기관[American Type Culture Collection, ATCC]으로부터 수득했다. 종 배양 및 본 배양에 사용된 균주는 다음 표 3과 같다.

혈청형	ATCC No.
3	6303
6B	6326
19A	10357

상기 원종균(seed stock)을 여러 세대 배양하였다(F1, F2 및 F3 세대). 원종균을 추가적으로 두 세대 더 배양하였다. 추가적인 제1세대는 F3 바이알로부터 배양하였고, 후속 세대는 추가적인 제1세대의 바이알로부터 배양하였다. 냉동보존제로서 합성 글리세롤과 함께 종균 바이알을 냉동보관하였다(<-70℃). 세포 은행 제조를 위하여, 모든 배양물을 대두-기제 배지에서 증식시켰다. 냉동시키기 전에, 원심분리에 의해 세포를 농축시키고, 사용된 배지를 제거한 후, 냉동보존제(예: 합성 글리세롤)를 함유하는 새로운 배지에 세포 펠릿을 재현탁시켰다.

<배양 및 회수>

제조용 세포 은행 유래의 배양물을 사용하여 대두-기제 배지를 함유하는 씨드 병(seed bottles)에 접종하고, 배양하였다. 목표 흡광도에 도달한 후, 씨드 병을 사용하여 대두-기제 배지를 함유하는 발효기에 접종하였다. 3N NaOH를 사용하여 pH를 약 7.2 이상으로 유지하면서, 34∼38 ℃에서 120 rpm의 조건하에서 배양을 수행하였다. 2∼3 시간 마다 샘플링하여 흡광도 값을 측정하였다. 흡광도 값이 급격이 증가하기 시작하면 0.5∼1 시간마다 샘플링하여 흡광도를 측정하였다. 흡광도 값이 일정한 값으로 유지되기 시작한 후 약 1시간 후에 배양을 종료하였다. 배양 종료 후, pH 조절 없이 pH가 5.5 이하로 될 때까지 동일한 온도 및 rpm 조건에서 추가배양을 수행하였다. 상기 추가 배양 종료 후, 0.12 %의 농도로 데옥시콜레이트 나트륨을 가하여 세포를 용해(lysis)시켰다. 얻어진 배양물을 10∼15 ℃로 냉각하고, 이 온도에서 약 3시간 동안 교반 없이 유지하여 단백질 침전을 유도하였다. 이후, 상기 혼합물을 원심분리하여, 침전된 단백질 및 세포 잔해를 제거하였다.

<정제>

상기 원심분리를 통하여 얻어진 용액을 심층 여과기(Depth filter)로 여과하여 원심분리 시 가라앉지 않은 단백질 및 세포잔해를 제거하였다. 얻어진 여액을 100 kDa 멤브레인을 사용하여 농축한 다음, 얻어진 농축액에 대하여 25 mM 인산나트륨 완충용액(pH 7.2)을 사용하여 한외여과를 수행하였다. 상기 한외여과는 투과액의 전도도가 약 3∼4 mS/cm 정도가 될 때까지 수행하였으며, 막차압(TMP)은 0.5∼1.5 바 이하로 설정하였다. 얻어진 시료의 불순물을 제거한 후, 약 1.0 w/v%의 농도로 세트리모늄브로마이드(Cetrimonium Bromide, Hexadecyl-trimethylammonium bromide (HB))를 가하여 약 1시간 동안 교반한 후, 원심분리하여 다당류를 침전시켰다. 얻어진 펠렛을 약 0.25 M 염화나트륨 수용액에 용해시킨 다음, 약 0.5 w/v%의 농도로 요오드화나트륨(NaI)을 첨가하였다. 상기 용액을 원심분리하여 상등액을 회수하고, 얻어진 용액을 교반하면서 약 2.0 w/v%의 농도로 활성탄을 서서히 첨가한 다음, 약 1시간 동안 교반한 후 여과하였다. 얻어진 여액을 30 kDa 멤브레인을 사용하여 농축한 다음, 얻어진 농축액에 대하여 약 10배의 3차 증류수를 사용하여 한외여과를 수행하였다. 상기 한외여과는 투과액의 전도도가 약 10 ㎲/cm 정도가 될 때까지 수행하였으며, 막차압(TMP)은 0.5∼1.5 바 이하로 설정하였다. 얻어진 농축액을 무균 여과한 다음, -20℃ 이하에서 냉동 보관하였다.

상기 각 단계의 정제과정에서 총 단백질 함량, 총 핵산 함량, 총 다당류 함량, 및 정제 수율을 평가한 결과는 하기 표 4 내지 표 6과 같다.

상기 표 4 내지 표 6의 결과로부터, 본 발명에 따른 제조방법에 의해 얻어진 협막 다당류는, 별도의 산성화 공정의 채용 없이도, 잔류 단백질 함량 기준치를 만족하였으며, 협막 다당류의 회수율 또한 각각 49% 이상(혈청형 3 협막 다당류), 65% 이상(혈청형 6B 협막 다당류), 및 60% 이상(혈청형 19A 협막 다당류)이었다. 따라서, 본 발명에 따른 제조방법은 단순화된 공정을 통하여 협막 다당류를 효과적으로 생산할 수 있다.

실시예 2. 폐렴구균 혈청형 7F 및 14의 협막 다당류의 제조

<세포은행의 제조>

폐렴구균 혈청형 7F, 14를 생산하는 원종균(seed stock)을 수탁기관[American Type Culture Collection, ATCC]으로부터 수득했다. 종 배양 및 본 배양에 사용된 균주는 다음 표 7과 같다.

혈청형	ATCC No.
7F	10351
14	6314

<배양 및 회수>

<정제>

상기 원심분리를 통하여 얻어진 용액을 심층 여과기(Depth filter)로 여과하여 원심분리 시 가라앉지 않은 단백질 및 세포잔해를 제거하였다. 얻어진 여액을 100 kDa 멤브레인을 사용하여 농축한 다음, 얻어진 농축액에 대하여 25 mM 인산나트륨 완충용액(pH 7.2)을 사용하여 한외여과를 수행하였다. 상기 한외여과는 투과액의 전도도가 약 3∼4 mS/cm 정도가 될 때까지 수행하였으며, 막차압(TMP)은 0.5∼1.5 바 이하로 설정하였다. 얻어진 시료의 불순물을 제거한 후, 약 1.0 w/v%의 농도로 세틸트리메틸암모늄브로마이드(Cetrimonium Bromide, Hexadecyl-trimethylammonium bromide (HB))를 가하여 약 1시간 동안 교반한 후, 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 얻어진 상등액에 약 0.5 w/v%의 농도로 요오드화나트륨(NaI)을 첨가하였다. 상기 용액을 원심분리하여 상등액을 회수하고, 얻어진 용액을 교반하면서 약 2.0 w/v%의 농도로 활성탄을 서서히 첨가한 다음, 약 1시간 동안 교반한 후 여과하였다. 얻어진 여액을 30 kDa 멤브레인을 사용하여 농축한 다음, 얻어진 농축액에 대하여 약 10배의 3차 증류수를 사용하여 한외여과를 수행하였다. 상기 한외여과는 투과액의 전도도가 약 10 ㎲/cm 정도가 될 때까지 수행하였으며, 막차압(TMP)은 0.5∼1.5 바 이하로 설정하였다. 얻어진 농축액을 무균 여과한 다음, -20℃ 이하에서 냉동 보관하였다.

상기 각 단계의 정제과정에서 총 단백질 함량, 총 핵산 함량, 총 다당류 함량, 및 정제 수율을 평가한 결과는 하기 표 8 및 표 9와 같다.

상기 표 8 및 표 9의 결과로부터, 본 발명에 따른 제조방법에 의해 얻어진 협막 다당류는, 별도의 산성화 공정의 채용 없이도, 잔류 단백질 함량 기준치를 만족하였으며, 협막 다당류의 회수율 또한 각각 60% 이상(혈청형 7F 협막 다당류) 및 55% 이상(혈청형 14 협막 다당류)이었다. 따라서, 본 발명에 따른 제조방법은 단순화된 공정을 통하여 협막 다당류를 효과적으로 생산할 수 있다.

실시예 3. 폐렴구균 혈청형 23F 의 협막 다당류의 제조

<세포은행의 제조>

폐렴구균 혈청형 23F를 생산하는 원종균(seed stock)을 수탁기관[American Type Culture Collection, ATCC, No. 6323]으로부터 수득했다. 상기 원종균(seed stock)을 여러 세대 배양하였다(F1, F2 및 F3 세대). 원종균을 추가적으로 두 세대 더 배양하였다. 추가적인 제1세대는 F3 바이알로부터 배양하였고, 후속 세대는 추가적인 제1세대의 바이알로부터 배양하였다. 냉동보존제로서 합성 글리세롤과 함께 종균 바이알을 냉동보관하였다(<-70℃). 세포 은행 제조를 위하여, 모든 배양물을 대두-기제 배지에서 증식시켰다. 냉동시키기 전에, 원심분리에 의해 세포를 농축시키고, 사용된 배지를 제거한 후, 냉동보존제(예: 합성 글리세롤)를 함유하는 새로운 배지에 세포 펠릿을 재현탁시켰다.

<배양 및 회수>

<정제>

상기 원심분리를 통하여 얻어진 용액을 심층 여과기(Depth filter)로 여과하여 원심분리 시 가라앉지 않은 단백질 및 세포잔해를 제거하였다. 얻어진 여액을 100 kDa 멤브레인을 사용하여 농축한 다음, 얻어진 농축액에 대하여 25 mM 인산나트륨 완충용액(pH 7.2)을 사용하여 한외여과를 수행하였다. 상기 한외여과는 투과액의 전도도가 약 3∼4 mS/cm 정도가 될 때까지 수행하였으며, 막차압(TMP)은 0.5∼1.5 바 이하로 설정하였다. 얻어진 시료의 불순물을 제거한 후, 약 2.5 w/v%의 농도로 세틸트리메틸암모늄브로마이드(Cetrimonium Bromide, Hexadecyl-trimethylammonium bromide (HB))를 가하여 약 1시간 동안 교반한 후, 원심분리하여 다당류를 침전시켰다. 얻어진 펠렛을 약 0.25 M 염화나트륨 수용액에 용해시킨 다음, 약 0.5 w/v%의 농도로 요오드화나트륨(NaI)을 첨가하였다. 상기 용액을 원심분리하여 상등액을 회수하고, 얻어진 용액을 교반하면서 약 2.0 w/v%의 농도로 활성탄을 서서히 첨가한 다음, 약 1시간 동안 교반한 후 여과하였다. 얻어진 여액을 30 kDa 멤브레인을 사용하여 농축한 다음, 얻어진 농축액에 대하여 약 10배의 3차 증류수를 사용하여 한외여과를 수행하였다. 상기 한외여과는 투과액의 전도도가 약 10 ㎲/cm 정도가 될 때까지 수행하였으며, 막차압(TMP)은 0.5∼1.5 바 이하로 설정하였다. 얻어진 농축액을 무균 여과한 다음, -20℃ 이하에서 냉동 보관하였다.

상기 각 단계의 정제과정에서 총 단백질 함량, 총 핵산 함량, 총 다당류 함량, 및 정제 수율을 평가한 결과는 하기 표 10과 같다.

상기 표 10의 결과로부터, 본 발명에 따른 제조방법에 의해 얻어진 혈청형 23F 협막 다당류는, 별도의 산성화 공정의 채용 없이도, 잔류 단백질 함량 기준치를 만족하였으며, 협막 다당류의 회수율 또한 60% 이상이었다. 따라서, 본 발명에 따른 제조방법은 단순화된 공정을 통하여 협막 다당류를 효과적으로 생산할 수 있다.

Claims

하기 단계를 포함하는, 폐렴 구균 혈청형을 갖는 협막 다당류의 제조방법:
(a) 배양액의 pH를 7.0 내지 9.4의 범위로 유지하면서, 폐렴 구균 혈청형을 생성하는 균주를 배양하는 단계;
(b) 배양액의 흡광도가 일정한 값으로 유지되는 시점부터 감소하기 시작하는 시점 사이에서 단계(a)의 배양을 종료하는 단계;
(c) pH 조절 없이, 단계(b)로부터 얻어진 배양액을 배양액의 pH가 5.5 이하로 될 때까지 추가로 배양하는 단계;
(d) 단계(c)로부터 얻어진 배양액에 용해제를 가하여 세포를 용해시킨 다음, 단백질을 침전시키고, 침전된 단백질 및 세포 잔해를 제거하는 단계;
(e) 단계(d)로부터 얻어진 용액으로부터 협막 다당류를 단리 및 정제하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 폐렴 구균 혈청형이 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9N, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 또는 33F인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 단계(a)의 상기 배양이 34∼38 ℃에서 50∼150 rpm 으로 교반하면서 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 단계(b)가 배양액의 흡광도가 일정한 값으로 유지되는 시점부터 1 내지 3 시간 이내에 단계(a)의 배양을 종료함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 단계(c)의 추가 배양이 pH 조절 없이, 34∼38 ℃에서 50∼150 rpm으로 교반하면서 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 단계(d)에서 사용되는 용해제가 데옥시콜레이트 나트륨인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 단계(d)가 단계(c)로부터 얻어진 배양액에 용해제를 가하여 세포를 용해시킨 다음, 얻어진 용액을 10∼20 ℃에서 3∼24 시간 동안 교반없이 유지하여 단백질을 침전시키고, 원심분리에 의해 침전된 단백질 및 세포 잔해를 제거함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 단계(e)의 단리 및 정제가 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법:
(i) 단계(d)로부터 얻어진 용액을 심층 여과기(Depth filter)로 여과하는 단계;
(ii) 단계(i)로부터 얻어진 여액을 농축한 후, 한외여과 및 원심분리를 수행하는 단계;
(iii) 단계(ii)로부터 얻어진 상등액에 양이온성 계면활성제를 가하여 반응시킨 후, 원심분리하여 협막 다당류를 함유하는 펠렛 또는 상등액을 얻는 단계;
(iv) 단계(iii)로부터 얻어진 협막 다당류를 요오드화나트륨과 반응시키고, 원심분리하여 상등액을 회수하는 단계;
(v) 단계(iv)로부터 얻어진 용액에 활성탄을 가하고 여과하는 단계;
(vi) 단계(v)로부터 얻어진 여액을 농축한 후, 한외여과 및 원심분리를 수행하여 협막 다당류를 얻는 단계.
제8항에 있어서, 단계(ii)의 농축이 100 kDa 멤브레인을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제8항에 있어서, 단계(vi)의 농축이 30 kDa 멤브레인을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제8항에 있어서, 단계(iii)에서 사용되는 양이온성 계면활성제가 세틸트리메틸암모늄브로마이드인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제11항에 있어서, 상기 세틸트리메틸암모늄브로마이드가 0.5∼3.0 %(w/v)의 농도로 사용되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제8항에 있어서, 단계(v)에서 사용되는 활성탄이 1∼5 %(w/v)의 함량으로 사용되는 것을 특징으로 하는 제조방법.