BR112015005081B1 - Método para produzir um polissacarídeo capsular tendo um sorotipo de pneumococo - Google Patents
Método para produzir um polissacarídeo capsular tendo um sorotipo de pneumococo Download PDFInfo
- Publication number
- BR112015005081B1 BR112015005081B1 BR112015005081-6A BR112015005081A BR112015005081B1 BR 112015005081 B1 BR112015005081 B1 BR 112015005081B1 BR 112015005081 A BR112015005081 A BR 112015005081A BR 112015005081 B1 BR112015005081 B1 BR 112015005081B1
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- culture broth
- cultivation
- serotype
- concentration
- centrifugation
- Prior art date
Links
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 title claims abstract description 67
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 67
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 title claims abstract description 67
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 43
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 claims abstract description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 30
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 29
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 28
- FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M sodium iodide Chemical compound [Na+].[I-] FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 21
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 20
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 17
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 17
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 16
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 claims description 13
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 12
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 11
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 11
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 claims description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 10
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 10
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 9
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 claims description 9
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims description 8
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 claims description 7
- 238000013019 agitation Methods 0.000 claims description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 6
- 235000009518 sodium iodide Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 2
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 claims 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 abstract description 20
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 11
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 51
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 29
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 15
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 12
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000002338 cryopreservative effect Effects 0.000 description 6
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940031937 polysaccharide vaccine Drugs 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 6
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 5
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 4
- 229960000800 cetrimonium bromide Drugs 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 3
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 3
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 2
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 208000005141 Otitis Diseases 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000194018 Streptococcaceae Species 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 208000019258 ear infection Diseases 0.000 description 1
- 210000000959 ear middle Anatomy 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 229960001973 pneumococcal vaccines Drugs 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000013060 ultrafiltration and diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
- A61K39/092—Streptococcus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
método para produzir um polissacarídeo capsular tendo um sorotipo de pneumococo. a presente invenção provê um método melhorado de produção de um polissacarídeo capsular contendo um serotipo de pneumococo. o método de acordo com a presente invenção inclui uma etapa de cultura adicional de células bacterianas produzindo um serotipo pneumococo sem ajuste do ph, assim removendo um processo de precipitação de proteína por meio da acidificação com um regulador de ph.
Description
[001] A presente invenção refere-se a um método de produção de um polissacarídeo capsular contendo um serotipo de pneumococo, e mais particularmente, a um método de produção de um polissacarídeo capsular contendo um serotipo de pneumococo pela remoção de impurezas, tais como proteínas e ácidos nucleicos a partir de um caldo da cultura de células bacterianas produzindo o serotipo de pneumococo.
[002]O pneumococo (Streptococcus pneumoniae) é uma bactéria gram-positiva pertencente à família Streptococcaceae, na ordem dos Lactobacillus, e provoca doenças tais como a pneumonia, bacteremia, otite do ouvido médio e meningite em seres humanos. As células do serotipo pneumococo têm uma cápsula que é um revestimento de polissacarídeo envolvendo cada célula. Esta cápsula interfere com a fagocitose por impedindo os anticorpos de atacarem as células bacterianas. As células foram categorizadas em mais de 90 serotipos com base nas características imunológicas, algumas das quais são relatadas por provocarem doenças invasivas. Um total de 37 serotipos foi identificado a partir do Streptococcus pneumoniaeinvasivo coletado de 1996 a 2008, e os serotipos principais, 19F > 23F > 19A > 6A > 3 > 9V > 6B frequentes nesta ordem, contabilizam uma maioria de 53,4%. Os polissacarídeos capsulares destes serotipos de pneumococo têm sido utilizados na produção de vacinas, tais como as vacinas de polissacarídeo e vacinas de polissacarídeos conjugados com proteína.
[003]Os polissacarídeos capsulares usados na produção de vacinas de polissacarídeo e vacinas de polissacarídeo conjugado com proteína são obtidos a partir dos caldos de cultura de células bacterianas produzindo os respectivos serotipos. Cada cepa é coletada sob temperatura, pH e agitação ótimos até que alcance uma densidade máxima. Para obter os polissacarídeos capsulares de pneumococo que não são secretados fora do citoplasma, a lise celular é realizada utilizando um agente de lise, tal como o deoxicolato de sódio (DOC). Quando as células são lisadas, diversas proteínas e ácidos nucleicos da cepa são liberados, juntos com os polissacarídeos capsulares, e devem ser removidos por meio de um processo de purificação pós-cultura. Para minimizar o risco de eventos adversos através de qualquer substância além de um antígeno após a vacinação, existem especificações estritas para os teores de proteína e ácido nucleico. Por exemplo, no caso do Prevnar 7TM, os teores de proteína e ácido nucleico em cada serotipo atende as especificações de 2-5% ou menos e 1-2% ou menos em uma base de peso seco, respectivamente.
[004] A Publicação de Patente Internacional WO 2006/110352 revela um método de produção de polissacarídeos capsulares compreendendo o cultivo de Streptococcus pneumoniae, lise celular, precipitação de proteína por meio da acidificação do lisado celular para um pH de menos de 5,5, incubação sem agitação, e centrifugação e/ou filtragem. Além disso, a Publicação de Patente Internacional N° WO 2008/118752 revela um método de produção de polissacarídeos capsulares por meio da realização da ultrafiltrarem e diafiltração de um lisado celular seguida por um processo de filtragem da proteína por meio da acidificação. No entanto, todos estes métodos de produção relacionados necessitam do processo de precipitação de proteína por meio da acidificação com um regulador de pH, o que torna o processo em geral complicado e também provoca a modificação do polissacarídeo capsular e geração de substâncias prejudiciais.
[005]Os inventores têm conduzido diversos estudos a fim de melhorar um método de produção de um polissacarídeo capsular contendo um serotipo de pneumococo. Surpreendentemente, os inventores descobriram que o pH pode ser diminuído para uma faixa adequada para precipitação da proteína, a saber, para um pH de 5,5 ou inferior por meio de produtos da coleta (especialmente, ácido lático, etc.), quando uma coleta adicional é realizada sob as mesmas condições sem o ajuste do pH. Isto é, os inventores descobriram que o processo de precipitação da proteína através da acidificação com um regulador de pH pode ser removido realizando uma coleta adicional sem o ajuste do pH e então realizando a lise celular e o processo de precipitação da proteína.
[006] Assim, o objetivo da presente invenção é prover um método melhorado de produção de um polissacarídeo capsular contendo um serotipo de pneumococo.
[007]De acordo com um aspecto da presente invenção, é provido um método de produção de um polissacarídeo capsular contendo um serotipo de pneumococo, compreendendo as seguintes etapas de: (a) cultivo de células bacterianas que produzem um serotipo de pneumococo, enquanto mantém o pH de um caldo de cultura na faixa de 7,0 a 9,4; (b) término do cultivo da etapa (a) em um momento entre quando a absorbância do caldo de cultura permanece constante e quando a absorbância começa a diminuir; (c) realização do cultivo adicional do caldo de cultura obtido a partir da etapa (b) sem o ajuste do pH até que o pH do caldo da cultura alcance um pH de 5,5 ou inferior; (d) adição de um agente de lise ao caldo de cultura obtido a partir da etapa (c) para a lise das células, precipitação das proteínas, e remoção das proteínas precipitadas e fragmentos de células para obter um lisado celular clarificado; e (e) isolamento e purificação do polissacarídeo capsular a partir do lisado obtido na etapa (d). No método de produção da presente invenção, o serotipo de pneumococo pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9N, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F ou 33F. O cultivo da etapa (a) pode ser realizado em 34-38 °C sob agitação em 50-150 rpm. Em uma realização da presente invenção, a etapa (b) pode ser realizada terminando o cultivo da etapa (a) dentro de 1 a 3 horas a partir do momento em que a absorbância do caldo de cultura permanece constante. O cultivo adicional da etapa (c) pode ser realizado em 34-38 °C sob agitação em 50-150 rpm sem ajuste do pH. O agente de lise utilizado na etapa (d) pode ser deoxicolato de sódio. Em outra realização da presente invenção, a etapa (d) pode ser realizada por meio da adição do agente de lise ao caldo da cultura obtido na etapa (c) para lise das células, então incubando o lisado celular resultante em 10-20 °C por 3-24 horas sem agitação para precipitar as proteínas, e remoção das proteínas precipitadas e fragmentos de células por meio da centrifugação. Em ainda outra realização da presente invenção, o isolamento e purificação da etapa (e) podem incluir as etapas as seguir: (i) filtração do lisado obtido na etapa (d) usando um filtro de profundidade; (ii) concentração de um filtrado obtido na etapa (i), seguida por ultrafiltração e centrifugação; (iii) reação do sobrenadante obtido na etapa (ii) com um surfactante catiônico, e então centrifugação da solução obtida para produzir um grânulo ou sobrenadante contendo polissacarídeos capsulares; (iv) reação dos polissacarídeos capsulares obtidos a partir da etapa (iii) com iodeto de sódio, seguida por centrifugação, obtendo assim o sobrenadante; (v) adição de carvão ativado à solução obtida na etapa (iv), seguida pela filtragem; e (vi) concentração de um filtrado obtido na etapa (v), seguida por ultrafiltração e centrifugação, obtendo assim os polissacarídeos capsulares. Na realização acima, a concentração da etapa (ii) pode ser realizada utilizando uma membrana de 100 kDA, e a concentração da etapa (vi) pode ser realizada utilizando uma membrana de 30 kDa. Além disso, o surfactante catiônico usado na etapa (iii) pode ser brometo de cetiltriometilamônio pode ser utilizado em uma concentração de 0,5 a 3,0%. Adicionalmente, o carvão ativado utilizado na etapa (v) pode ser usado em uma concentração de 1 a 5% (p/v).
[008]Em um método de produção de acordo com a presente invenção, um regulador de pH para a precipitação de proteína não é utilizado. Isto é, a presente invenção demonstrou que quando um cultivo adicional de células bacterianas produzindo um serotipo de pneumococo é realizado sob as mesmas condições sem o ajuste do pH, o pH pode ser diminuído para uma faixa adequada para precipitação da proteína, a saber, para um pH de 5,5 ou inferior por meio de produtos da coleta (especialmente, ácido lático, etc.). Portanto, o método de produção da presente invenção não demanda o uso do regulador de pH para precipitação da proteína, assim minimizando a modificação dos polissacarídeos capsulares e geração de quaisquer substâncias prejudiciais e simplificando o processo de produção. O polissacarídeo capsular contendo o serotipo de pneumococo obtido por meio do método de produção da presente invenção pode ser vantajosamente utilizado para produzir vacinas de polissacarídeo e vacinas de polissacarídeo conjugado com proteína.
[009] A FIG. 1 mostra as mudanças no pH no caldo da cultura e condições para cultivo de células bacterianas produzindo o serotipo pneumococo 3;
[010] A FIG. 2 mostra as mudanças no pH no caldo da cultura e condições para cultivo de células bacterianas produzindo o serotipo pneumococo 6B;
[011] A FIG. 3 mostra as mudanças no pH no caldo da cultura e condições para cultivo de células bacterianas produzindo o serotipo pneumococo 7F;
[012] A FIG. 4 mostra as mudanças no pH no caldo da cultura e condições para cultivo de células bacterianas produzindo o serotipo pneumococo 14;
[013] A FIG. 5 mostra as mudanças no pH no caldo da cultura e condições para cultivo de células bacterianas produzindo o serotipo pneumococo 19A; e
[014] A FIG. 6 mostra as mudanças no pH no caldo da cultura e condições para cultivo de células bacterianas produzindo o serotipo pneumococo 23F.
[015] A presente invenção provê um método de produção de um polissacarídeo capsular contendo um serotipo de pneumococo, compreendendo as seguintes etapas de: (a) cultivo de células bacterianas que produzem um serotipo de pneumococo, enquanto mantém o pH de um caldo de cultura na faixa de 7,0 a 9,4; (b) término do cultivo da etapa (a) em um momento entre quando a absorbância do caldo de cultura permanece constante e quando a absorbância começa a diminuir; (c) realização do cultivo adicional do caldo de cultura obtido a partir da etapa (b) sem o ajuste do pH até que o pH do caldo da cultura alcance um pH de 5,5 ou inferior; (d) adição de um agente de lise ao caldo de cultura obtido a partir da etapa (c) para a lise das células, precipitação das proteínas, e remoção das proteínas precipitadas e fragmentos de células para obter um lisado celular clarificado; e (e) isolamento e purificação do polissacarídeo capsular a partir do lisado obtido na etapa (d).
[016] Na etapa (a) do método de produção de acordo com a presente invenção, o serotipo pneumococo pode ser qualquer tipo de serotipo que é utilizado na produção de vacinas de pneumococos; por exemplo, os serotipos podem incluir o serotipo 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9N, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F, entre outros. As células bacterianas produzindo o serotipo pneumococo são conhecidas na técnica, e qualquer célula bacteriana conhecida pode ser usada sem nenhuma limitação (por exemplo, vide WO 2006/110381). O cultivo da etapa (a) do método de produção de acordo com a presente invenção pode ser realizada em um meio geral, tal como um meio com base em soja, enquanto mantém o pH do caldo da cultura na faixa de 7,0 a 9,4, preferencialmente, de 7,2 a 8,2 usando, por exemplo, hidróxido de sódio. O cultivo pode ser realizado sob quaisquer condições de cultura conhecidas, por exemplo, em 34-38 °C sob agitação em 50-150 rpm. As condições de pH adequadas para cultura de sementes e a cultura principal para produção de serotipos representativos de Streptococcus pneumoniaesão dadas na Tabela 1 a seguir. [Tabela 1] Condição do pH para cada serotipo
[017]O método de produção de acordo com a presente invenção não requer o uso de um regulador de pH para precipitação de proteína. Isto é, os presentes inventores surpreendentemente descobriram que o pH pode ser diminuído para uma faixa adequada para precipitação da proteína, a saber, para um pH de 5,5 ou inferior por meio de produtos do cultivo (especialmente, ácido lático, etc.), quando um cultivo adicional é realizado sob as mesmas condições sem o ajuste do pH. Portanto, o método de produção da presente invenção inclui a realização do cultivo adicional sem o ajuste do pH após a cultura das células bacterianas que produzem o serotipo pneumococo, preferencialmente, no mesmo momento em que as células bacterianas alcançam um crescimento máximo, e então realizam os processos de lise celular e precipitação da proteína. Assim, o método de produção da presente invenção não demanda o uso do regulador de pH para precipitação da proteína, desta maneira minimizando a modificação dos polissacarídeos capsulares e geração de quaisquer substâncias prejudiciais e simplificando o processo de produção.
[018]O método de produção da presente invenção, portanto, inclui a etapa de término do cultivo da etapa (a) em um momento entre quando a absorbância do caldo da cultura permanece constante e quando a absorbância começa a diminuir [isto é, etapa (b)]; e a etapa de realização do cultivo adicional do caldo da cultura obtido a partir da etapa (b) sem o ajuste do pH até que o pH do caldo da cultura alcance pH de 5,5 ou inferior [isto é, etapa (c)].
[019]Conforme o cultivo é realizado de acordo com a etapa (a) do método de produção da presente invenção, as células bacterianas proliferam-se e a absorbância [por exemplo, absorbância em 590 nm (OD590)] do caldo da cultura aumenta para alcançar a constância (o crescimento máximo) e então permanecer constante (cerca de 7-24 horas após o início do cultivo). Subsequentemente, a absorbância diminui dentro de 1 a 3 horas. Em uma realização da presente invenção, portanto, a etapa (b) pode ser realizada terminando o cultivo da etapa (a) dentro de 1 a 3 horas a partir do momento em que a absorbância do caldo de cultura permanece constante. O cultivo adicional da etapa (c) pode ser realizado sem o ajuste do pH sob as mesmas condições que na etapa (a), em 3438 °C sob agitação em 50-150 rpm. Quando tal cultivo adicional é realizado, o pH do caldo da cultura diminui espontaneamente para 5,5 ou menos, assim provendo um pH apropriado necessário para precipitação da proteína.
[020] O método de produção da presente invenção inclui a etapa de adição de um agente de lise ao caldo de cultura obtido a partir da etapa (c) para a lise das células, precipitação das proteínas, e remoção das proteínas precipitadas e fragmentos de células para obter um lisado celular clarificado [isto é, etapa (d)].
[021] A lise celular pode ser realizada de acordo com um método conhecido, por exemplo, um método revelado nos documentos de patente WO 2006/110381, WO 2008/118752, etc. Por exemplo, a lise celular pode ser realizada usando o deoxicolato de sódio como um agente de lise. O deoxicolato de sódio pode ser usado em uma concentração de 0,10 a 0,15% (concentração após a adição de deoxicolato de sódio), mas não é limitada a este. Conforme as células são lisadas, os polissacarídeos capsulares do serotipo pneumococo são liberados fora do citoplasma. Além disso, a precipitação da proteína pode ser realizada, por exemplo, por meio da incubação em 10-20 °C, e remoção das proteínas precipitadas e fragmentos de células pode ser realizada por meio de um método típico (por exemplo, centrifugação). Em uma realização da presente invenção, a etapa (d) pode ser realizada por meio da adição do agente de lise ao caldo da cultura obtido na etapa (c) para lise das células, a precipitação das proteínas por meio da incubação do lisado obtido em 10-20 °C por 3-24 horas sem agitação, e remoção das proteínas precipitadas e fragmentos de células por meio da centrifugação.
[022]O método de produção da presente invenção inclui a etapa de isolamento e purificação do polissacarídeo capsular a partir do lisado através da remoção das impurezas (por exemplo, proteínas e ácidos nucleicos contidos nas células) a partir do lisado obtido na etapa (d) [isto é, etapa (e) ] . O isolamento e purificação do polissacarídeo capsular pode ser realizado de acordo com um método de purificação conhecido, por exemplo, um método revelado nos documentos de patente WO 2006/110381 e WO 2008/118752. Em uma realização, o isolamento e purificação da etapa (e) pode incluir as seguintes etapas: (i) filtragem do lisado obtido na etapa (d) usando um filtro de profundidade; (ii) concentração de um filtrado obtido na etapa (i), seguida por ultrafiltração e centrifugação; (iii)reação do sobrenadante obtido na etapa (ii) com um surfactante catiônico, e então centrifugação da solução resultante para obter um grânulo ou sobrenadante contendo polissacarídeos capsulares; (iv) reação dos polissacarídeos capsulares obtidos a partir da etapa (iii) com iodeto de sódio, seguida por centrifugação, obtendo assim o sobrenadante; (v) adição de carvão ativado ao sobrenadante obtido na etapa (iv), seguida por filtração; e (vi) concentração de um filtrado obtido na etapa (v) , seguida por ultrafiltração e centrifugação, obtendo assim os polissacarídeos capsulares.
[023] Na realização acima, os lisados que permanecem mesmo após a centrifugação para a remoção das proteínas precipitadas e fragmentos celulares são removidos por meio da filtragem usando o filtro de profundidade.
[024] Além disso, as proteínas e ácidos nucleicos podem ser removidos por através da repetição dupla da concentração/ultrafiltração. Em uma realização, a concentração da etapa (ii) pode ser realizada utilizando uma membrana de 100 kDa, e a concentração da etapa (vi) pode ser realizada utilizando uma membrana de 30 kDa. Neste processo, a ultrafiltração também pode ser referida como 'diafiltração'.
[025]Além disso, o surfactante catiônico usado na etapa (iii) pode ser brometo de cetiltrimetilamônio. O brometo de cetiltrimetilamônio (Brometo de Cetrimônio, brometo hexadecil-trimetilamônio (HB)) pode ser usado em uma concentração de 0,5-3% (concentração após a adição de brometo de cetiltrimetilamônio). O surfactante catiônico utilizado tal como HB pode ser precipitado e removido usando iodeto de sódio. Quando a centrifugação é realizada na etapa (iii), os polissacarídeos capsulares podem estar presentes no grânulo (por exemplo, serotipo 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 9N, 9V, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, etc.) ou sobrenadante (por exemplo, serotipo 7F, 14, 33F, etc.). Os polissacarídeos capsulares obtidos na forma de grânulo podem ser dissolvidos em um solvente apropriado (por exemplo, solução aquosa de cloreto de sódio, etc.), e então usado na etapa subsequente (isto é, reação com iodeto de sódio). Os polissacarídeos capsulares presentes no sobrenadante podem ser usados na etapa subsequente (isto é, reação com iodeto de sódio) sem separação adicional.
[026] Além disso, o carvão ativado na etapa (v) pode ser preferencialmente utilizado em uma concentração de 1 a 5% (p/v).
[027] A seguir, a presente invenção será descrita em mais detalhes com referência aos Exemplos. No entanto, os Exemplos a seguir descritos aqui devem ser considerados em um sentido descritivo e não para propósitos de limitação.
[028]EXEMPLO
[029] Um meio com base em soja nos Exemplos a seguir tem a composição como na Tabela 2 abaixo. [Tabela 2]
[030]Preparação do Banco de Célula
[031]Os respectivos estoques de semente produzindo serotipos penumococo 3, 6B e 19A foram obtidos a partir da American Type Culture Collection [ATCC] (Coleta de Cultura do Tipo Americana). As cepas usadas na cultura de semente e cultura principal são dadas na Tabela 3 a seguir. [Tabela 3]
[032]Diversas gerações de estoques de semente foram criadas (gerações F1, F2 e F3). Duas gerações adicionais de estoques de sementes foram produzidas. A primeira geração adicional foi coletada a partir de um frasco F3, e a geração subsequente foi coletada a partir de um frasco da primeira geração adicional. congelados (< - 7 0 Os frascos de semente foram armazenados ) °C) com glicerol sintético como um crio conservante. Para o preparo do banco de células, todas as culturas foram cultivadas em um meio com base em soja. Antes do congelamento, as células foram concentradas por meio de centrifugação, o meio residual foi removido, e os grânulos celulares foram suspensos novamente em um meio fresco contendo um crio conservante (por exemplo, glicerol sintético).
[033]Cultura e Recuperação
[034]As culturas do banco de célula em funcionamento foram usadas para inocular os recipientes de semente contendo um meio com base em soja para cultivo. Após alcançar uma absorbância alvo, o recipiente de semente foi usado para inocular um fermentador contendo o meio com base em soja. O cultivo foi realizado em 34-38 °C e 120 rpm enquanto mantém o pH em torno de 7.2 ou superior usando 3N NaOH. A amostragem foi realizada a cada 2-3 horas para medir a absorbância. Quando a absorbância começa a diminuir drasticamente, a amostragem foi realizada a cada 0,5-1 hora e a absorbância foi medida. O cultivo foi terminado em torno de 1 hora após a absorbância alcançar um certo valor e permanecer constante. Após o término do cultivo, o cultivo adicional foi realizado sem o ajuste de pH sob a mesma temperatura e condições de rpm até o pH alcançar 5,5 ou menos. Após o térmico do cultivo adicional, o deoxicolato de sódio foi adicionado em uma concentração de 0,12% para lise das células. O lisado assim obtido foi resfriado para 10-15 °C, e então incubado na mesma temperatura por cerca de 3 horas sem agitação para levar à precipitação da proteína. Subsequentemente, o lisado resultante foi centrifugado para remover as proteínas precipitadas e fragmentos celulares.
[035]Purificação
[036] A solução obtida por meio da centrifugação foi filtrada usando um filtro de profundidade para remover fragmentos de célula e proteínas que não se depositaram durante a centrifugação. O filtrado resultante foi concentrado usando uma membrana de 100 kDa, e então a solução de concentrado resultante foi submetida à ultrafiltração usando 25 mM de tampão de fosfato de sódio (pH 7.2). A ultrafiltração foi realizada até que a condutividade do dialisado alcançasse cerca de 3-4 mS/cm, e a pressão da transmembrana (TMP) fosse estabelecida em 0,5-1,5 bar ou menos. As impurezas foram removidas da solução resultante, e o brometo de cetrimônio (brometo de hexadeciltrometilamônio (HBB)) foi adicionado à solução em uma concentração de cerca de 1,0 p/v%, seguido pela agitação por cerca de 1 hora. Então, a centrifugação foi realizada para precipitar os polissacarídeos. O grânulo assim obtido foi dissolvido em cerca de 0,25 M de solução aquosa de cloreto de sódio, e o iodeto de sódio (NaI) foi adicionado a este em uma concentração de cerca de 0,5 p/v%. Esta solução foi centrifugada para recuperar o sobrenadante, e o carvão ativado foi lentamente adicionado à solução resultante em uma concentração de cerca de 2,0 p/v% durante a agitação, seguido pela agitação por cerca de 1 hora e filtragem. O filtrado resultante foi concentrado usando uma membrana de 30 kDa, e então a solução concentrada resultante foi submetida à ultrafiltração usando cerca de 10 vezes o volume de água triplamente destilada. A ultrafiltração foi realizada até que a condutividade do dialisado alcançasse cerca de 3-4 μs/cm, e a pressão da transmembrana (TMP) fosse estabelecida em 0,5- 1,5 bar ou menos. A solução concentrada resultante foi submetida à filtragem estéril, e armazenada congelada em -20 °C ou menos.
[037]O teor de proteína total, teor de ácido nucleico total, teor de polissacarídeo total, e produção de purificação avaliada em cada etapa de purificação são dados nas Tabelas 4 a 5 a seguir. [Tabela 4]
[038]Teor de proteína, teor de ácido nucleico, e recuperação de polissacarídeo capsular do serotipo 3.
[039] Teor de proteína, teor de ácido nucleico, e recuperação de polissacarídeo capsular do serotipo 6B
[040]Teor de proteína, teor de ácido nucleico, e recuperação de polissacarídeo capsular do serotipo 19ª
[041]Os resultados das Tabelas 4 a 6 mostraram que os polissacarídeos capsulares obtidos pelo método de produção de acordo com a presente invenção atende a um padrão para teor de proteína residual sem nenhum processo de acidificação separado, e as taxas de recuperação de polissacarídeos capsulares também foram 49% ou superiores (polissacarídeo capsular serotipo 3) , 65% ou mais (polissacarídeo capsular serotipo 6B), e 60% ou mais (polissacarídeo capsular serotipo 19A), respectivamente. Portanto, o método de produção de acordo com a presente invenção pode ser usado para produzir eficazmente polissacarídeos capsulares por meio do método simplificado.
[042]Exemplo 2. Produção de polissacarídeos capsulares dos serotipos pneumococo 7F e 14
[043]Preparação do Banco de Célula
[044]Os respectivos estoques de semente produzindo serotipos penumococo 7F e 14 foram obtidos a partir da American Type Culture Collection [ATCC] (Coleta de Cultura do Tipo Americana). As cepas usadas na cultura de semente e cultura principal são dadas na Tabela 7 a seguir.
[045]Diversas gerações de estoques de semente foram criadas (gerações F1, F2 e F3). Duas gerações adicionais de estoques de sementes foram produzidas. A primeira geração adicional foi coletada a partir de um frasco F3, e a geração subsequente foi coletada a partir de um frasco da primeira geração adicional. Os frascos de semente foram armazenados congelados (< - 70 °C) com glicerol sintético como um crio conservante. Para o preparo do banco de células, todas as culturas foram cultivadas em um meio com base em soja. Antes do congelamento, as células foram concentradas por meio de centrifugação, o meio residual foi removido, e os grânulos celulares foram suspensos novamente em um meio fresco contendo um crio conservante (por exemplo, glicerol sintético).
[046]Cultura e Recuperação
[047]As culturas do banco de célula em funcionamento foram usadas para inocular os recipientes de semente contendo um meio com base em soja para cultivo. Após alcançar uma absorbância alvo, o recipiente de semente foi usado para inocular um fermentador contendo o meio com base em soja. O cultivo foi realizado em 34-38 °C e 120 rpm enquanto mantém o pH em torno de 7,2 ou superior usando 3N NaOH. A amostragem foi realizada a cada 2-3 horas para medir a absorbância. Quando a absorbância começou a diminuir drasticamente, a amostragem foi realizada a cada 0,5 a 1 hora para medir a absorbância. O cultivo foi terminado em torno de 1 hora após a absorbância alcançar um certo valor e permanecer constante. Após o término do cultivo, o cultivo adicional foi realizado sem o ajuste de pH sob a mesma temperatura e condições de rpm até o pH alcançar 5,5 ou menos. Após o térmico do cultivo adicional, o deoxicolato de sódio foi adicionado em uma concentração de 0,12% para lise das células. O lisado assim obtido foi resfriado para 10 a 15 °C, e então incubado na mesma temperatura por cerca de 3 horas sem agitação para levar à precipitação da proteína. Subsequentemente, o lisado resultante foi centrifugado para remover as proteínas precipitadas e fragmentos celulares.
[048]Purificação
[049] A solução obtida por meio da centrifugação foi filtrada usando um filtro de profundidade para remover fragmentos de célula e proteínas que não se depositaram durante a centrifugação. O filtrado resultante foi concentrado usando uma membrana de 100 kDa, e então a solução de concentrado resultante foi submetida à ultrafiltração usando 25 mM de tampão de fosfato de sódio (pH 7,2). A ultrafiltração foi realizada até que a condutividade do dialisado alcançasse cerca de 3-4 mS/cm, e a pressão da transmembrana (TMP) fosse estabelecida em 0,5-1,5 bar ou menos. As impurezas foram removidas da solução resultante, e o brometo de cetrimônio (brometo de hexadeciltrometilamônio (HBB)) foi adicionado à solução em uma concentração de cerca de 1,0 p/v%, seguido pela agitação por cerca de 1 hora e centrifugação para recuperar o sobrenadante. O iodeto de sódio (NaI) foi adicionado ao sobrenadante em uma concentração de cerca de 0,5% p/v. A solução obtida foi centrifugada para recuperar o sobrenadante, e o carvão ativado foi lentamente adicionado à solução obtida em uma concentração de cerca de 2,0 p/v% durante a agitação, seguido pela agitação por cerca de 1 hora e filtragem. O filtrado resultante foi concentrado usando uma membrana de 30 kDa, e então a solução concentrada resultante foi submetida à ultrafiltração usando cerca de 10 vezes o volume de água triplamente destilada. A ultrafiltração foi realizada até que a condutividade do dialisado alcançasse cerca de 10 μs/cm, e a pressão da transmembrana (TMP) fosse estabelecida em 0,51,5 bar ou menos. A solução concentrada resultante foi submetida à filtragem estéril, e armazenada congelada em -20 °C ou menos.
[050]O teor de proteína total, teor de ácido nucleico total, teor de polissacarídeo total, e produção de purificação avaliada em cada etapa de purificação são dados nas Tabelas 8 a 9 a seguir.
[051] [Tabela 8]
[052] Teor de proteína, teor de ácido nucleico, e recuperação de polissacarídeo capsular do serotipo 7F.
[053]Teor de proteína, teor de ácido nucleico, e recuperação de polissacarídeo capsular do serotipo 14.
[054]Os resultados das Tabelas 8 e 9 mostraram que os polissacarídeos capsulares obtidos pelo método de produção de acordo com a presente invenção atende a um padrão para teor de proteína residual sem nenhum processo de acidificação separado, e as taxas de recuperação de polissacarídeos capsulares também foram 60% ou superiores (polissacarídeo capsular serotipo 7F) , 55% ou mais (polissacarídeo capsular serotipo 14), respectivamente. Portanto, o método de produção de acordo com a presente invenção pode ser usado para produzir eficazmente polissacarídeos capsulares por meio do método simplificado.
[055] Exemplo 3. Produção de polissacarídeos capsulares do serotipo pneumococo 23F
[056]Preparação do Banco de Célula
[057] O estoque de semente produzindo serotipo penumococo 23F foi obtido a partir da American Type Culture Collection [ATCC] (Coleta de Cultura do Tipo Americana). Diversas gerações de estoques de semente foram criadas (gerações F1, F2 e F3). Duas gerações adicionais de estoques de sementes foram produzidas. A primeira geração adicional foi coletada a partir de um frasco F3, e a geração subsequente foi coletada a partir de um frasco da primeira geração adicional. Os frascos de semente foram armazenados congelados (< - 70 °C) com glicerol sintético como um crio conservante. Para o preparo do banco de células, todas as culturas foram cultivadas em um meio com base em soja. Antes do congelamento, as células foram concentradas por meio de centrifugação, o meio residual foi removido, e os grânulos celulares foram suspensos novamente em um meio fresco contendo um crio conservante (por exemplo, glicerol sintético).
[058]Cultura e Recuperação
[059] A cultura do banco de célula em funcionamento foi usada para inocular o recipiente de semente contendo um meio com base em soja para cultivo. Após alcançar uma absorbância alvo, o recipiente de semente foi usado para inocular um fermentador contendo o meio com base em soja. O cultivo foi realizado em 34-38 °C e 120 rpm enquanto mantém o pH em torno de 7,2 ou superior usando 3N NaOH. A amostragem foi realizada a cada 2-3 horas para medir a absorbância. Quando a absorbância começou a diminuir drasticamente, a amostragem foi realizada a cada 0,5-1 hora para medir a absorbância. O cultivo foi terminado em torno de 1 hora após a absorbância alcançar um certo valor e permanecer constante. Após o término do cultivo, o cultivo adicional foi realizado sem o ajuste de pH sob a mesma temperatura e condições de rpm até o pH alcançar 5,5 ou menos. Após o térmico do cultivo adicional, o deoxicolato de sódio foi adicionado em uma concentração de 0,12% para lise das células. O lisado assim obtido foi resfriado para 10 a 15 °C, e então incubado na mesma temperatura por cerca de 3 horas sem agitação para levar à precipitação da proteína. Subsequentemente, o lisado resultante foi centrifugado para remover as proteínas precipitadas e fragmentos celulares.
[060]Purificação
[061] A solução obtida por meio da centrifugação foi filtrada usando um filtro de profundidade para remover fragmentos de célula e proteínas que não se depositaram durante a centrifugação. O filtrado resultante foi concentrado usando uma membrana de 100 kDa, e então a solução de concentrado resultante foi submetida à ultrafiltração usando 25 mM de tampão de fosfato de sódio (pH 7,2). A ultrafiltração foi realizada até que a condutividade do dialisado alcançasse cerca de 3 a 4 mS/cm, e a pressão da transmembrana (TMP) fosse estabelecida em 0,5 a 1,5 bar ou menos. As impurezas foram removidas da solução resultante, e o brometo de cetrimônio (brometo de hexadeciltrometilamônio (HBB)) foi adicionado à solução em uma concentração de cerca de 2,5 p/v%, seguido pela agitação por cerca de 1 hora e centrifugação para precipitar os polissacarídeos. O grânulo assim obtido foi dissolvido em cerca de 0,25 M de solução aquosa de cloreto de sódio, e o iodeto de sódio (NaI) foi adicionado a este em uma concentração de cerca de 0,5 p/v%. Esta solução foi centrifugada para recuperar o sobrenadante, e o carvão ativado foi lentamente adicionado à solução resultante em uma concentração de cerca de 2,0 p/v% durante a agitação, seguido pela agitação por cerca de 1 hora e filtragem. O filtrado resultante foi concentrado usando uma membrana de 30 kDa, e então a solução concentrada resultante foi submetida à ultrafiltração usando cerca de 10 vezes o volume de água triplamente destilada. A ultrafiltração foi realizada até que a condutividade do dialisado alcançasse cerca de 3-4 μs/cm, e a pressão da transmembrana (TMP) fosse estabelecida em 0,5-1,5 bar ou menos. A solução concentrada resultante foi submetida à filtragem estéril, e armazenada congelada em -20 °C ou menos.
[062]O teor de proteína total, teor de ácido nucleico total, teor de polissacarídeo total, e produção de purificação avaliada em cada etapa de purificação são dados na Tabela 10 a seguir.
[063] [Tabela 10]
[064] Teor de proteína, teor de ácido nucleico, e recuperação de polissacarídeo capsular do serotipo 23F.
ND*: Não detectado
[065]Os resultados da Tabela 10 mostraram que os polissacarídeos capsulares de serotipo 23F obtidos pelo método de produção de acordo com a presente invenção atendem a um padrão para teor de proteína residual sem utilizar um processo de acidificação adicional, e a taxa de recuperação de polissacarídeo capsular também foi 60% ou superior. Portanto, o método de produção de acordo com a presente invenção pode ser usado para produzir eficazmente polissacarídeos capsulares por meio do método simplificado.
Claims (13)
1. MÉTODO PARA PRODUZIR UM POLISSACARÍDEO CAPSULAR TENDO UM SOROTIPO DE PNEUMOCOCO, o método caracterizado por compreender: (a) cultivar células bacterianas que produzem um sorotipo de pneumococo enquanto mantêm o pH de um caldo de cultura na faixa de 7,0 a 9,4; (b) terminar o cultivo da etapa (a) em um momento entre quando a absorbância do caldo de cultura permanece constante e quando a absorbância começa a diminuir; (c) realizar um cultivo adicional do caldo de cultura da etapa (b) sem a adição de um ajustador de pH até que o pH do caldo de cultura atinja pH de 5,5 ou inferior; (d) adicionar um agente de lise ao caldo de cultura obtido na etapa (c) para lisar células, precipitar proteínas, e remover as proteínas precipitadas e fragmentos celulares para obter um lisado celular clarificado; e (e) isolar e purificar o polissacarídeo capsular do lisado obtido na etapa (d).
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo sorotipo de pneumococo ser 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9N, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F ou 33F.
3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo cultivo da etapa (a) ser realizado a 3438°C sob agitação a 50-150 rpm.
4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa (b) ser realizada pelo término do cultivo da etapa (a) dentro de 1 a 3 horas a partir do momento em que a absorbância do caldo de cultura permanece constante.
5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo cultivo adicional da etapa (c) ser realizado a 34-38°C sob agitação a 50-150 rpm sem ajuste de pH.
6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo agente de lise utilizado na etapa (d) ser deoxicolato de sódio.
7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa (d) ser realizada pela adição do agente de lise ao caldo de cultura obtido na etapa (c) para lisar as células, então incubar o lisado celular resultante a 10-20°C por 3-24 horas sem agitação para precipitar as proteínas, e remover as proteínas precipitadas e fragmentos celulares por centrifugação.
8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo isolamento e purificação da etapa (e) compreenderem: (i) filtrar o lisado obtido na etapa (d) utilizando um filtro de profundidade; (ii) concentrar um filtrado obtido na etapa (i) , seguido por ultrafiltração e centrifugação; (iii) reagir um sobrenadante obtido na etapa (ii) com um tensoativo catiônico, e então centrifugar a solução resultante para obter um grânulo ou sobrenadante contendo polissacarídeos capsulares; (iv) reagir os polissacarídeos capsulares obtidos na etapa (iii) com iodeto de sódio, seguido por centrifugação, obtendo assim um sobrenadante; (v) adicionar carvão ativado à solução obtida na etapa (iv), seguida por filtração; e (vi) concentrar um filtrado obtido na etapa (v) , seguido por ultrafiltração e centrifugação, obtendo assim polissacarídeos capsulares.
9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pela concentração da etapa (ii) ser realizada utilizando uma membrana de 100 kDa.
10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pela concentração da etapa (vi) ser realizada utilizando uma membrana de 30 kDa.
11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo tensoativo catiônico utilizado na etapa (iii) ser brometo de cetiltrimetilamônio.
12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo brometo de cetiltrimetilamônio ser utilizado em uma concentração de 0,5-3,0%.
13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo carvão ativado utilizado na etapa (v) ser utilizado em uma concentração de 1-5% (p/v).
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20120099348 | 2012-09-07 | ||
| KR10-2012-0099348 | 2012-09-07 | ||
| PCT/KR2013/008048 WO2014038879A1 (ko) | 2012-09-07 | 2013-09-06 | 폐렴 구균 혈청형을 갖는 협막 다당류의 제조방법 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BR112015005081A2 BR112015005081A2 (pt) | 2017-07-04 |
| BR112015005081A8 BR112015005081A8 (pt) | 2018-07-31 |
| BR112015005081B1 true BR112015005081B1 (pt) | 2021-10-26 |
Family
ID=50237413
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BR112015005081-6A BR112015005081B1 (pt) | 2012-09-07 | 2013-09-06 | Método para produzir um polissacarídeo capsular tendo um sorotipo de pneumococo |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9636392B2 (pt) |
| EP (1) | EP2894225B1 (pt) |
| JP (1) | JP5905649B2 (pt) |
| KR (1) | KR101944960B1 (pt) |
| CN (1) | CN104781413B (pt) |
| AU (1) | AU2013313794B2 (pt) |
| BR (1) | BR112015005081B1 (pt) |
| CA (1) | CA2884241C (pt) |
| CO (1) | CO7400875A2 (pt) |
| ES (1) | ES2651415T3 (pt) |
| MX (1) | MX363051B (pt) |
| PH (1) | PH12015500497A1 (pt) |
| RU (1) | RU2606022C2 (pt) |
| WO (1) | WO2014038879A1 (pt) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015110940A2 (en) | 2014-01-21 | 2015-07-30 | Pfizer Inc. | Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides and conjugates thereof |
| TWI718144B (zh) | 2015-05-04 | 2021-02-11 | 美商輝瑞股份有限公司 | Ｂ型鏈球菌多醣－蛋白質軛合物、製造軛合物之方法、含軛合物之免疫原性組成物、及其用途 |
| WO2016204265A1 (ja) * | 2015-06-18 | 2016-12-22 | 一般財団法人阪大微生物病研究会 | 肺炎球菌補体依存性殺菌能測定方法 |
| CN105131139B (zh) * | 2015-07-31 | 2018-02-13 | 兰州生物制品研究所有限责任公司 | 一种肺炎链球菌荚膜多糖的纯化方法 |
| CN107936128B (zh) * | 2017-11-22 | 2020-07-03 | 成都欧林生物科技股份有限公司 | 一种简便有效的细菌疫苗纯化方法 |
| CN109336989B (zh) * | 2018-10-22 | 2022-05-13 | 北京智飞绿竹生物制药有限公司 | 一种通过粘度控制制备肺炎球菌荚膜多糖的方法 |
| JP7239509B6 (ja) * | 2019-02-22 | 2023-03-28 | ファイザー・インク | 細菌多糖類を精製するための方法 |
| CN112608392B (zh) * | 2020-12-23 | 2023-03-31 | 北京民海生物科技有限公司 | 肺炎球菌荚膜多糖的制备 |
| CN114106209A (zh) * | 2021-11-09 | 2022-03-01 | 北京智飞绿竹生物制药有限公司 | 一种纯化17f型肺炎球菌多糖的方法 |
| CN116693706A (zh) * | 2022-02-24 | 2023-09-05 | 成都生物制品研究所有限责任公司 | 一种肺炎链球菌荚膜多糖的纯化方法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2059693C (en) * | 1991-01-28 | 2003-08-19 | Peter J. Kniskern | Polysaccharide antigens from streptococcus pneumoniae |
| US7709001B2 (en) * | 2005-04-08 | 2010-05-04 | Wyeth Llc | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
| ME01334B (me) * | 2005-04-08 | 2013-12-20 | Wyeth Llc | Polivalentni pripravak konjugata pneumokoknog polisaharida s proteinom |
| MX2007012337A (es) * | 2005-04-08 | 2007-11-21 | Wyeth Corp | Separacion de contaminantes de polisacarido de streptococcus pneumoniae por manipulacion de ph. |
| MX2009003730A (es) | 2006-10-10 | 2009-04-22 | Wyeth Corp | Purificacion de polisacaridos de streptococcus pneumoniae tipo 3. |
| MX2009010221A (es) | 2007-03-23 | 2009-10-19 | Wyeth Corp | Proceso abreviado de purificacion para la produccion de polisacaridos capsulares de streptococcus pneumoniae. |
| KR101045881B1 (ko) | 2008-09-11 | 2011-07-01 | 전남대학교산학협력단 | 연쇄상구균으로부터의 협막다당 생산 배지, 생산 방법 및 정제 방법 |
| CN102257155B (zh) | 2008-12-18 | 2016-03-02 | 惠氏有限责任公司 | 控制肺炎链球菌血清型19a多糖分子量的方法 |
| WO2011151841A1 (en) * | 2010-05-31 | 2011-12-08 | Panacea Biotec Limited | Fermentation process for streptococcus pneumoniae |
-
2013
- 2013-09-06 CN CN201380058019.5A patent/CN104781413B/zh active Active
- 2013-09-06 WO PCT/KR2013/008048 patent/WO2014038879A1/ko active Application Filing
- 2013-09-06 AU AU2013313794A patent/AU2013313794B2/en active Active
- 2013-09-06 BR BR112015005081-6A patent/BR112015005081B1/pt active IP Right Grant
- 2013-09-06 KR KR1020130106993A patent/KR101944960B1/ko active IP Right Grant
- 2013-09-06 EP EP13834636.6A patent/EP2894225B1/en active Active
- 2013-09-06 US US14/426,585 patent/US9636392B2/en active Active
- 2013-09-06 RU RU2015109997A patent/RU2606022C2/ru active
- 2013-09-06 CA CA2884241A patent/CA2884241C/en active Active
- 2013-09-06 ES ES13834636.6T patent/ES2651415T3/es active Active
- 2013-09-06 JP JP2015531010A patent/JP5905649B2/ja active Active
- 2013-09-06 MX MX2015002950A patent/MX363051B/es unknown
-
2015
- 2015-03-06 PH PH12015500497A patent/PH12015500497A1/en unknown
- 2015-03-30 CO CO15072525A patent/CO7400875A2/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| MX2015002950A (es) | 2016-04-26 |
| KR20140032912A (ko) | 2014-03-17 |
| EP2894225A4 (en) | 2016-04-27 |
| EP2894225A1 (en) | 2015-07-15 |
| WO2014038879A1 (ko) | 2014-03-13 |
| KR101944960B1 (ko) | 2019-02-07 |
| BR112015005081A8 (pt) | 2018-07-31 |
| CA2884241C (en) | 2018-11-20 |
| AU2013313794A1 (en) | 2015-04-23 |
| PH12015500497B1 (en) | 2015-04-27 |
| JP5905649B2 (ja) | 2016-04-20 |
| US20150231225A1 (en) | 2015-08-20 |
| CA2884241A1 (en) | 2014-03-13 |
| BR112015005081A2 (pt) | 2017-07-04 |
| CN104781413B (zh) | 2018-01-23 |
| RU2015109997A (ru) | 2016-10-27 |
| AU2013313794B2 (en) | 2016-10-20 |
| EP2894225B1 (en) | 2017-11-22 |
| JP2015527079A (ja) | 2015-09-17 |
| PH12015500497A1 (en) | 2015-04-27 |
| CN104781413A (zh) | 2015-07-15 |
| RU2606022C2 (ru) | 2017-01-10 |
| CO7400875A2 (es) | 2015-09-30 |
| ES2651415T3 (es) | 2018-01-26 |
| MX363051B (es) | 2019-03-06 |
| US9636392B2 (en) | 2017-05-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BR112015005081B1 (pt) | Método para produzir um polissacarídeo capsular tendo um sorotipo de pneumococo | |
| DK1866342T3 (en) | SEPARATION OF POLLUTANTS CONTAMINATING FROM STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE POLYSACCHARID BY PH-MANIPULATION | |
| US8999697B2 (en) | Shortened purification process for the production of capsular Streptococcus pneumoniae polysaccharides | |
| CA1146862A (en) | Multivalent pneumococcal vaccine and preparation thereof | |
| RU2511404C2 (ru) | Способ получения раствора, содержащего высокомолекулярные изолированные капсульные полисахариды streptococcus pneumoniae серотипа 19а (варианты) | |
| JP5789514B2 (ja) | 二酸化炭素を用いて肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）多糖の分子量を制御するための方法 | |
| IE47149B1 (en) | Vaccine | |
| TWI545192B (zh) | 用於製備肺炎鏈球菌血清型之莢膜多醣的方法 | |
| BR102014021245A2 (pt) | processo rápido para produzir e purificar hib-prp | |
| BR102015002980B1 (pt) | processo para purificar polissacarídeo bacteriano |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B06I | Publication of requirement cancelled [chapter 6.9 patent gazette] |
Free format text: ANULADA A PUBLICACAO CODIGO 6.6.1 NA RPI NO 2462 DE 13/03/2018 POR TER SIDO INDEVIDA. |
|
| B25D | Requested change of name of applicant approved |
Owner name: SK DISCOVERY CO., LTD. (KR) |
|
| B25G | Requested change of headquarter approved |
Owner name: SK DISCOVERY CO., LTD. (KR) |
|
| B25A | Requested transfer of rights approved |
Owner name: SK CHEMICALS CO., LTD. (KR) |
|
| B25A | Requested transfer of rights approved |
Owner name: SK BIOSCIENCE CO., LTD. (KR) |
|
| B06U | Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette] | ||
| B06A | Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette] | ||
| B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 06/09/2013, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. |