CN114106209A - 一种纯化17f型肺炎球菌多糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种简化的、安全的、有效的纯化17F型肺炎球菌多糖的工艺。本发明的方法，菌液粗裂解液经超滤置换成含0.85％NaCl的0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS，然后添加CTAB反应后直接收集上清液，不再需要进行氯化钠解聚离心步骤，具有工艺流程简化、易于操作、生产的多糖杂质含量更低、产量更高的特点，减少了工艺步骤，节省了工艺用时和生产成本、生产的多糖更加安全有效，值得在荚膜多糖疫苗生产中推广、使用。

Description

一种纯化17F型肺炎球菌多糖的方法
技术领域
本发明属于生物制药领域，涉及一种纯化17F型肺炎球菌多糖的方法。
背景技术
肺炎球菌多糖疫苗生产因为涉及多个复杂的生产过程而成本高昂，如细菌培养，荚膜多糖纯化等。因此，改进以上步骤的任一步骤都有助于提高疫苗生产成本的效益比。
20世纪50年代，Scott首先发现十六烷基三甲基铵(CTAB)对酸性多糖有较强的沉淀作用，能与多糖形成季胺络合物而沉淀多糖。十六烷基三甲基铵(CTAB)是一种阳离子表面活性剂，具有从低离子强度溶液中沉淀酸性物质的特性，已经被广泛用于从多种细菌培养上清液中沉淀荚膜多糖。在高离子强度的溶液中，CTAB与蛋白质和多糖形成复合物。该反应基于CTAB的正电荷与CPS负电荷之间的相互作用。
现有使用CTAB沉淀17F型肺炎球菌多糖的工艺中，如美国专利需要将肺炎球菌粗裂解物进行浓缩透析，透析液使用pH值中性的磷酸盐溶液，然后向浓缩液中加入CTAB以分离多糖与蛋白质、核酸等杂质，反应完成后收集沉淀，向沉淀中加入氯化钠进行解聚，然后进行后续的分离纯化。
本发明的创新点在于对CTAB反应的工艺进行了优化，不再需要进行氯化钠解聚，简化了纯化工艺，节约了生产成本，最终收获了收率更高、质量更高的多糖。
发明内容
本发明提出了一种简便的可放大的用于17F型肺炎球菌多糖纯化的工艺。
本发明在现有专利的基础上进行了改进，使用了一种全新的菌液上清透析液，不再需要进行氯化钠解聚步骤。
使用本工艺进行纯化，得到了纯度更高的多糖，并提高了多糖收率。
具体的，本发明所述的肺炎球菌多糖纯化工艺，包括以下步骤：
(1)将17F型肺炎链球菌经发酵、灭活、离心、澄清后得到菌液上清；
(2)将菌液上清使用截留分子量为100Kd的超滤膜包进行浓缩和透析，使用中性pH值的磷酸盐缓冲溶液完成透析，透析结束后收集超滤浓缩液；
(3)向超滤浓缩液中加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)至终浓度为1％，分离多糖与蛋白质、核酸等杂质，离心收集上清得到CTAB上清液；
(4)向CTAB上清液中加入碘化钠(NaI)至终浓度为0.5％以沉淀CTAB，离心收集上清得到NaI上清液；
(5)将NaI上清液经超滤浓缩后使用阳离子交换柱进行纯化、经超滤、冻干后收获多糖。
其中，骤(2)中超滤透析液为含0.85％NaCl的0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS，pH值为中性。其中，步骤(3)中CTAB反应完成后，收集上清液，无需进行氯化钠解聚即可进行后续的碘化钠沉淀步骤。
优选的，本发明所述的肺炎球菌多糖纯化工艺，包括以下步骤：
(1)将肺炎链球菌经发酵、灭活、离心、澄清后得到菌液上清；
(2)将菌液上清使用截留分子量为100KD的超滤膜包进行浓缩和透析，使用中性pH值的含0.85％NaCl的0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS完成透析，透析结束后收集超滤浓缩液；
(3)向超滤浓缩液中加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)至终浓度为1％，离心收集上清得到CTAB上清液；
(4)向CTAB上清液中加入碘化钠(NaI)至终浓度为0.5％以沉淀CTAB，离心收集上清得到NaI上清液；
(5)将NaI上清液使用截留分子量为10到100Kd的超滤膜包进行浓缩和透析，透析结束后收集超滤浓缩液；
(6)将超滤浓缩液使用羟基磷灰石层析柱进行纯化，收集多糖流穿峰；
(7)将收集的多糖流穿峰使用截留分子量为10到100Kd的超滤膜包进行浓缩和透析，透析溶液为注射用水(WFI)，透析结束后收集超滤浓缩液；
(8)将透析的多糖溶液进行冷冻干燥以去除水分，得到的多糖样品用于测试，并将纯化的多糖冷冻储存。
对收获的多糖进行理化项目检测，具体检测方法参考《中国药典》。
本发明提出的纯化工艺相对于现有的纯化工艺，工艺中不再需要进行氯化钠解聚，简化了工艺，降低了生产成本，提高了生产效率。
附图说明
图1为17F工艺流程图。
图2、四批次17F型肺炎球菌多糖的抗原性试验
图3、17F型01批色谱图和重均分子量数据图谱
图4、17F型02批色谱图和重均分子量数据图谱
图5、17F型03批色谱图和重均分子量数据图谱
图6、17F型04批色谱图和重均分子量数据图谱
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围不局限于以下所述。实施例1、肺炎球菌多糖纯化工艺
(1)将肺炎链球菌经发酵、灭活、离心、澄清后得到菌液上清；
(2)将菌液上清使用截留分子量为100KD的超滤膜包进行浓缩和透析，使用中性pH值的含0.85％NaCl的0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS完成透析，透析结束后收集超滤浓缩液；
(3)向超滤浓缩液中加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)至终浓度为1％，离心收集上清得到CTAB上清液；
(4)向CTAB上清液中加入碘化钠(NaI)至终浓度为0.5％以沉淀CTAB，离心收集上清得到NaI上清液；
(5)将NaI上清液使用截留分子量为10到100Kd的超滤膜包进行浓缩和透析，透析结束后收集超滤浓缩液；
(6)将超滤浓缩液使用羟基磷灰石层析柱进行纯化，收集多糖流穿峰；
(7)将收集的多糖流穿峰使用截留分子量为10到100Kd的超滤膜包进行浓缩和透析，透析溶液为注射用水(WFI)，透析结束后收集超滤浓缩液；
(8)将透析的多糖溶液进行冷冻干燥以去除水分，得到的多糖样品用于测试，并将纯化的多糖冷冻储存。
试验例1、
现有专利
(1)配制菌液上清超滤透析液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液PB，pH值为中性；
(2)将肺炎链球菌经发酵、灭活、离心后得到的菌液上清进行超滤浓缩，超滤膜包截留分子量为100Kd，使用超滤透析液进行透析，透析结束后收集超滤浓缩液；
(3)向超滤浓缩液中加入CTAB，经CTAB反应、离心收集沉淀、氯化钠解聚、层析、冻干后收获多糖。
本专利：
(1)配制菌液上清超滤透析液为含0.85％NaCl的0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS，pH值为中性；
(2)将肺炎链球菌经发酵、灭活、离心后得到的菌液上清进行超滤浓缩，超滤膜包截留分子量为100Kd，使用超滤透析液进行透析，透析结束后收集超滤浓缩液。
(3)向超滤浓缩液中加入CTAB，经CTAB反应、离心收集上清液、层析、冻干后收获多糖。
通过本发明工艺所获得的17F型肺炎球菌多糖各项理化指标与国家药典标准进行比较，结果如下：
Figure BDA0003344107310000041
可以发现，本工艺实施例所获得的17F型肺炎球菌多糖各项理化指标均符合国家药典标准，并且蛋白质、核酸、内毒素等杂质含量远低于现有专利，最终收获的多糖产量也大大提高。
采用免疫单扩散法对本发明工艺所获得的四批次17F型肺炎球菌多糖进行抗原性试验，抗原性试验结果如图2所示。
可以发现，本专利生产的四批次17F型肺炎球菌多糖有抗原性，均能与17F型肺炎球菌抗血清形成沉淀圈。
对四批17F型肺炎球菌多糖抗原性试验形成的沉淀圈直径数据进行分析，结果如下：
Figure BDA0003344107310000042
可以看出，四批次17F型肺炎球菌多糖产生的沉淀圈直径相近，抗原性强弱无明显差异。
采用多角度激光散射-凝胶色谱联用仪(HPSEC-MALLS)对4批次17型肺炎球菌多糖进行重均分子量(Mw)检测，得到色谱图和重均分子量数据(多分散系数(Mw/Mn))如如3-图6所示：
Figure BDA0003344107310000051
可以看出，17F型4批次肺炎多糖的多角度激光散射图谱峰形基本一致；4批次17F型肺炎球菌多糖重均分子量差异较小，说明分子量分布较为均匀，批间差异不大。

Claims (5)

1.一种纯化肺炎球菌多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将17F型肺炎链球菌经发酵、灭活、离心、澄清后得到菌液上清；
(2)将菌液上清使用截留分子量为100Kd的超滤膜包进行浓缩和透析，使用中性pH值的磷酸盐缓冲溶液完成透析，透析结束后收集超滤浓缩液；
(3)向超滤浓缩液中加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)至终浓度为1％，分离多糖与蛋白质、核酸等杂质，离心收集上清得到CTAB上清液；
(4)向CTAB上清液中加入碘化钠(NaI)至终浓度为0.5％以沉淀CTAB，离心收集上清得到NaI上清液；
(5)将NaI上清液经超滤浓缩后使用阳离子交换柱进行纯化、经超滤、冻干后收获多糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该纯化工艺适用于肺炎链球菌血清型17F型。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中超滤透析液为含0.85％NaCl的0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS，pH值为中性。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中CTAB反应完成后，收集上清液，无需进行氯化钠解聚即可进行后续的碘化钠沉淀步骤。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将肺炎链球菌经发酵、灭活、离心、澄清后得到菌液上清；
(2)将菌液上清使用截留分子量为100KD的超滤膜包进行浓缩和透析，使用中性pH值的含0.85％NaCl的0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS完成透析，透析结束后收集超滤浓缩液；
(3)向超滤浓缩液中加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)至终浓度为1％，离心收集上清得到CTAB上清液；
(4)向CTAB上清液中加入碘化钠(NaI)至终浓度为0.5％以沉淀CTAB，离心收集上清得到NaI上清液；
(5)将NaI上清液使用截留分子量为10到100Kd的超滤膜包进行浓缩和透析，透析结束后收集超滤浓缩液；
(6)将超滤浓缩液使用羟基磷灰石层析柱进行纯化，收集多糖流穿峰；
(7)将收集的多糖流穿峰使用截留分子量为10到100Kd的超滤膜包进行浓缩和透析，透析溶液为注射用水(WFI)，透析结束后收集超滤浓缩液；
(8)将透析的多糖溶液进行冷冻干燥以去除水分，得到的多糖样品用于测试，并将纯化的多糖冷冻储存。
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