CN104781413A - 用于具有肺炎球菌血清型的荚膜多糖的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于具有肺炎球菌血清型的荚膜多糖的改进的生产方法。根据本发明的生产方法包括在不调节pH的情况下另外培养产生肺炎球菌血清型的微生物菌株的步骤，并且从而能够消除通过使用pH调节剂的酸化的蛋白沉淀过程。

Description

用于具有肺炎球菌血清型的荚膜多糖的生产方法
技术领域
本发明涉及生产具有肺炎球菌血清型的荚膜多糖的方法，更具体地，涉及通过从产生肺炎球菌血清型的细菌细胞的发酵液(培养肉汤，culturebroth)中除去杂质如蛋白和核酸生产具有肺炎球菌血清型的荚膜多糖的方法。
背景技术
肺炎球菌(肺炎链球菌)是属于家族链球菌科的革兰氏阳性菌，属于乳酸菌纲，并且它会在人类中引起疾病如肺炎、菌血症、中耳炎和脑膜炎。肺炎球菌血清型的细胞具有荚膜，其是围绕各个细胞的多糖涂膜。该荚膜通过防止抗体附着到细菌细胞上从而干扰吞噬作用。基于免疫学特性，该细胞已分类为超过90种血清型，据报道其中一些引起侵袭性疾病。从1996年至2008年间收集的侵袭性链球菌性肺炎识别了总计有37种血清型，和以以下顺序出现的主要的血清型19F>23F>19A>6A>3>9V>6B占了大多数53.4％。这些肺炎球菌血清型的荚膜多糖已经用于生产疫苗如多糖疫苗和多糖-蛋白结合疫苗。
用于生产多糖疫苗和多糖-蛋白结合疫苗的荚膜多糖由生产相应血清型的细菌细胞的发酵液获得。各种菌株在最佳温度、pH和搅拌下培养，直到其达到最大密度。为获得并不是细胞质之外分泌的肺炎球菌荚膜多糖，使用裂解剂如脱氧胆酸钠(DOC)进行细胞裂解。当细胞被裂解时，连同荚膜多糖释放出菌株的各种蛋白和核酸，并且它们必须通过后培养纯化过程除去。疫苗接种后，为了最小化由任何非抗原物质引起的不良事件的风险，对于蛋白和核酸含量有严格的规定。例如，在Prevnar 7TM的情况下，基于干重，每种血清型中蛋白和核酸分别满足2％至5％或更低以及1％至2％或更低的规定。
国际专利公开号WO 2006/110352公开了一种生产荚膜多糖的方法，包括肺炎链球菌的培养、细胞裂解，通过将细胞裂解液酸化至小于5.5的pH蛋白沉淀、不搅拌孵育和离心和/或过滤。此外，国际专利公开第WO2008/118752号公开了通过进行细胞裂解液的超滤和渗滤以及随后通过经由酸化的蛋白沉淀过程生产荚膜多糖的方法。然而，所有这些相关的生产方法需要通过用pH调节剂酸化的蛋白沉淀过程，这使得整个过程变得复杂并且还导致荚膜多糖改性并产生有害物质。
发明内容
技术问题
本发明人已经进行了各种研究以改进生产具有肺炎球菌血清型的荚膜多糖的方法。令人惊讶地，本发明人发现当在不调节pH的情况下在相同的条件下进行另外的培养时，通过来自培养的产物(尤其是乳酸等)可以将pH降低至适合蛋白沉淀的范围，即pH 5.5。也就是说，本发明人发现，通过在没有pH调节的情况下进行另外的培养可以去除通过用pH调节剂酸化的蛋白沉淀过程，并且随后进行细胞裂解和蛋白沉淀过程。
因此，本发明的目的是提供生产具有肺炎球菌血清型的荚膜多糖的改进的方法。
技术方案
根据本发明的一方面，提供了生产具有肺炎球菌血清型的荚膜多糖的方法，包括以下步骤：
(a)培养产生肺炎球菌血清型的细菌细胞，同时将发酵液的pH保持在7.0至9.4的范围；
(b)在发酵液的吸光度保持恒定至吸光度开始下降之间的时刻终止步骤(a)的培养；
(c)在不调节pH的情况下对获得自步骤(b)的发酵液进行另外的培养直到发酵液的pH达到5.5或更低的pH；
(d)将裂解剂加入获得自由步骤(c)的发酵液以裂解细胞，沉淀蛋白，并除去沉淀的蛋白和细胞碎片以得到澄清的细胞裂解液；和
(e)从获得自步骤(d)的裂解液中分离并纯化荚膜多糖。
在本发明的生产方法中，肺炎球菌血清型可以是1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F或33F。
步骤(a)的培养可以在50至150转/分的搅拌下在34至38℃进行。
在本发明的实施方式中，可以通过从发酵液的吸光度保持恒定的时刻1至3小时内终止步骤(a)的培养进行步骤(b)。
步骤(c)的另外的培养可以在不调节pH的情况下在34至38℃在50-150转/分的搅拌下进行。
在步骤(d)中使用的裂解剂可以是脱氧胆酸钠。在本发明的另一实施方式中，通过将裂解剂加入至由步骤(c)获得的发酵液进行步骤(d)以裂解细胞，然后在不搅拌的情况下在10至20℃将获得的细胞裂解液孵育3至24小时以沉淀蛋白，以及通过离心去除沉淀的蛋白和细胞碎片。
在本发明的又一实施方式中，步骤(e)的分离和纯化可以包括以下步骤：
(i)使用深层过滤器过滤由步骤(d)获得的裂解液；
(ii)浓缩由步骤(i)获得的滤液，然后超滤和离心；
(iii)使获得自步骤(ii)的上清液与阳离子表面活性剂反应，并且随后离心获得的溶液以生产含有荚膜多糖的粒料或上清液；
(iv)使获得自步骤(iii)的荚膜多糖与碘化钠反应，然后离心，从而获得上清液。
(v)将活性炭加入至获得自步骤(iv)的溶液，然后过滤；以及
(vi)浓缩获得自步骤(v)的滤液，然后超滤和离心，从而获得荚膜多糖。
在上述实施方式中，可以使用100kDa的膜进行步骤(ii)的浓缩，以及可以使用30kDa的膜进行步骤(vi)的浓缩。此外，在步骤(iii)中使用的阳离子表面活性剂可以是十六烷基三甲基溴化铵，并且十六烷基三甲基溴化铵的使用浓度可以是0.5％至3.0％。另外，在步骤(v)中使用的活性炭可以以1％至5％(w/v)的浓度使用。
有益效果
在根据本发明的生产方法中，未使用用于蛋白沉淀的pH调节剂。即，本发明证实在不调节pH情况下，生产肺炎球菌血清型的细菌细胞的另外的培养在相同条件且进行时，通过来自培养的产物(尤其是乳酸等)，pH可以降低到适于蛋白沉淀的范围，即，pH为5.5或更低。因此，本发明的生产方法不需要使用用于蛋白沉淀的pH调节剂，从而最小化荚膜多糖的改性和任何有害物质的产生并且简化生产过程。通过本发明的生产方法得到的具有肺炎球菌血清型的荚膜多糖可以有利地用于生产多糖疫苗和多糖-蛋白结合疫苗。
附图说明
图1示出了发酵液中pH的变化和用于培养生产肺炎球菌血清型3的细菌细胞的条件；
图2示出了发酵液中pH的变化和用于培养生产肺炎球菌血清型6B的细菌细胞的条件；
图3示出了发酵液中pH的变化和用于培养生产肺炎球菌血清型7F的细菌细胞的条件；
图4示出了发酵液中pH的变化和用于培养生产肺炎球菌血清型14的细菌细胞的条件；
图5示出了发酵液中pH的变化和用于培养生产肺炎球菌血清型19A的细菌细胞的条件；和
图6示出了发酵液中pH的变化和用于培养生产肺炎球菌血清型23F的细菌细胞的条件。
具体实施方式
本发明提供了生产具有肺炎球菌血清型的荚膜多糖的方法，包括以下步骤：
(a)培养生产肺炎球菌血清型的细菌细胞，同时将发酵液的pH保持在7.0至9.4的范围；
(b)在发酵液的吸光度保持恒定至吸光度开始下降之间的时刻终止步骤(a)的培养；
(c)在不调节pH的情况下对获得自步骤(b)的发酵液进行另外的培养直到发酵液的pH达到5.5或更低的pH；
(d)将裂解剂加入至获得自步骤(c)的发酵液以裂解细胞，沉淀蛋白，并去除沉淀的蛋白和细胞碎片以得到澄清的细胞裂解液；和
(e)从获得自步骤(d)的裂解液中分离并纯化荚膜多糖。
在根据本发明的生产方法的步骤(a)中，肺炎球菌血清型可以是用于肺炎球菌疫苗生产的任何种类的血清型；例如，血清型可以包括血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F，但不仅限于此。生产肺炎球菌血清型的细菌细胞在本领域中是已知的，并且可以没有任何限制地使用任何已知细菌细胞(例如，参见WO2006/110381)。根据本发明的生产方法的步骤(a)的培养可以在通用培养基如大豆类培养基中进行，同时通过使用例如氢氧化钠将发酵液的pH保持在7.0至9.4，优选地为7.2-8.2的范围。该培养可以在任何已知的培养条件例如34℃至38℃，在50至150转/分的搅拌速度下进行。在下表1中给出了适合用于生产代表性血清型的肺炎链球菌的接种培养和主要培养的pH条件。
表1
[表1]
用于各种血清型的pH条件
血清型 接种培养条件 主要培养条件
1 pH 7.2±0.2 pH 7.2±0.2
2 pH 7.2±0.2 pH 7.2±0.2
3 pH 7.2±0.2 pH 7.2±0.2
4 pH 7.6±0.6 pH 7.6±0.6
5 pH 7.2±0.2 pH 7.2±0.2
6A pH 7.2±0.2 pH 7.2±0.2
6B pH 7.2±0.2 pH 7.2±0.2
7F pH 7.2±0.2 pH 7.2±0.2
9N pH 7.6±0.6 pH 7.6±0.6
9V pH 7.6±0.6 pH 7.6±0.6
14 pH 7.6±0.6 pH 7.6±0.6
18C pH 7.2±0.2 pH 7.2±0.2
19A pH 7.2±0.2 pH 7.2±0.2
19F pH 7.2±0.2 pH 7.2±0.2
22F pH 7.2±0.2 pH 7.2±0.2
23F pH 7.2±0.2 pH 7.2±0.2
33F pH 7.2±0.2 pH 7.2±0.2
根据本发明的生产方法不需要使用用于蛋白沉淀的pH调节剂。即，本发明人惊奇地发现当在不调节pH的情况下在相同的条件下进行另外的培养时，通过来自培养的产物(尤其是乳酸等)可以将pH降低至适合蛋白沉淀的范围，即pH为5.5或更低。因此，本发明的生产方法包括，在培养生产肺炎球菌血清型的细菌细胞后，优选地，在细菌细胞达到最大生长的时间点，在不调节pH的情况下进行另外的培养，并且随后进行细胞裂解和蛋白沉淀过程。因此，本发明的生产方法不需要使用用于蛋白沉淀的pH调节剂，从而最小化荚膜多糖的改性和任何有害物质的产生并且简化生产过程。
因此，本发明的生产方法包括以下步骤：发酵液的吸光度保持稳定至吸光度开始下降之间的时刻终止步骤(a)的培养[即，步骤(b)]；和在不调节pH的情况下，对获得自步骤(b)的发酵液进行另外的培养，直到发酵液的pH达到5.5或更低的pH[即，步骤(c)]。
当根据本发明的生产方法的步骤(a)进行培养时，细菌细胞增殖以及发酵液的吸光度[例如，590nm处的吸光度(OD590)]逐渐增加以达到稳定水平(最大生长)，然后保持稳定(开始培养后约7至24小时)。随后，在1至3小时内吸光度下降。因此，在本发明的实施方式中，可以通过在从发酵液的吸光度保持恒定的时刻1至3小时内终止步骤(a)的培养进行步骤(b)。在与步骤(a)相同的条件下，即，在34℃至38℃，在50至150转/分的搅拌下在不调节pH的情况下进行步骤(c)另外的培养。当进行这类另外的培养时，发酵液的pH自发降低到5.5或更低，从而为蛋白沉淀提供合适的pH。
本发明的生产方法包括将裂解剂加入至获得自步骤(c)的发酵液以裂解细胞，沉淀蛋白，并去除沉淀的蛋白和细胞碎片以获得澄清的细胞裂解液[即，步骤(d)]。
按照已知方法可以进行细胞裂解，例如，在WO 2006/110381、WO2008/118752等中公开的方法，例如，可以使用脱氧胆酸钠作为裂解剂进行细胞裂解。脱氧胆酸钠的使用浓度可以是0.10％至0.15％(加入脱氧胆酸钠后的浓度)，但不限于此。当细胞被裂解时，肺炎球菌血清型的荚膜多糖被释放至细胞质外。此外，蛋白沉淀可以通过例如在10-20℃孵育进行，并可以通过常用的方法(例如，离心)进行沉淀的蛋白和细胞碎片的去除。在本发明的另一实施方式中，通过将裂解剂加入至获得自步骤(c)的发酵液以裂解细胞，通过在不搅拌的情况下将获得的细胞裂解液在10至20℃孵育3至24小时以沉淀蛋白，以及通过离心去除沉淀的蛋白和细胞碎片。
本发明的生产方法包括以下步骤：通过从获得自步骤(d)的裂解液中去除杂质(例如，包含在细胞中的蛋白和核酸)从裂解液中分离和纯化荚膜多糖[即，步骤(e)]。按照已知的纯化方法可以进行荚膜多糖的分离和纯化，例如，在WO 2006/110381和WO 2008/118752中公开的方法。在实施方式中，步骤(e)的分离和纯化可以包括以下步骤：
(i)使用深层过滤器过滤获得自步骤(d)的裂解液；
(ii)浓缩获得自步骤(i)的滤液，然后超滤和离心；
(iii)使获得自步骤(ii)的上清液与阳离子表面活性剂反应，并且随后离心获得的溶液以获得含有荚膜多糖的粒料或上清液；
(iv)使获得自步骤(iii)的荚膜多糖与碘化钠反应，然后离心从而获得上清液。
(v)将活性炭加入至获得自步骤(iv)的上清液，然后过滤；以及
(vi)浓缩获得自步骤(v)的滤液，然后超滤和离心，从而获得荚膜多糖。
在上述实施方式中，甚至在离心去除沉淀的蛋白和细胞碎片后存在的裂解液通过使用深度过滤器过滤去除。
此外，通过重复浓缩/超滤2次可以去除蛋白和核酸。在一个实施方式中，步骤(ii)的浓缩可以通过使用100kDa的膜进行，和步骤(vi)的浓缩可以通过使用30kDa的膜进行。在此过程中，超滤也可以称为“渗滤”。
此外，在步骤(iii)中使用的阳离子表面活性剂可以是十六烷基三甲基溴化铵。十六烷基三甲基溴化铵(十六烷基溴化铵、十六烷基-三甲基溴化铵(HB))的使用浓度可以是0.5％-3％(加入十六烷基三甲基溴化铵后的浓度)。通过使用碘化钠可以沉淀并去除使用的阳离子表面活性剂，如HB。当在步骤(iii)中进行离心时，荚膜多糖可以存在于粒料中(例如，血清型1、2、3、4、5、6A、6B、9N、9V、18C、19A、19F、22F、23F等)或上清液(例如，血清型7F、14、33F等)。可以将以粒料形式获得的膜多糖溶解于适当的溶剂中(例如，氯化钠水溶液等)，然后用于随后的步骤(即，与碘化钠的反应)。存在于上清液中的荚膜多糖可以用于后续步骤(即，与碘化钠的反应)，而不需要另外的分离。
此外，步骤(v)中的活性炭可以1至5％(w/v)的浓度优选使用。
下文中，将参考实施例更详细地说明本发明。然而，本文描述的以下实施例应该认为仅仅是描述性的而不是为了限制的目的。
实施例
在以下实施例中使用的大豆类培养基具有如下表2所示的组成。
表2
[表2]
培养基组成 每升含量(g)
大豆蛋白胨(SoytoneTM,BD 243620) 28
氯化钠 3.5
磷酸钾 0.7
实施例1.肺炎球菌血清型3、6B、和19A的荚膜多糖的生产
<细胞库的制备>
产生肺炎球菌血清型3、6B、和19A的各个菌种获得自美国典型培养物保藏中心[ATCC]。在下表3中给出了在接种培养和主要培养中使用的菌株。
表3
[表3]
血清型 ATCC号
3 6303
6B 6326
19A 10357
建立了多代的菌种(F1、F2、和F3代)。生产了另外的两代菌种。第一种另外的代培养自F3小瓶，以及随后的代培养自第一另外的代的小瓶。用合成甘油作为冷冻保存剂冷冻保存(<-70℃)接种小瓶。为了细胞库制备，所有培养物在大豆类培养基中生长。在冷冻之前，通过离心浓缩细胞，去除用过的培养基并且在包含冷冻保存剂(例如，合成的甘油)的新鲜的培养基中重悬细胞粒料。
<培养和回收>
将来自工作细胞库的培养物用于接种含有大豆类培养基的接种瓶。在达到目标吸光度后，将接种瓶用于接种含有大豆类培养基的发酵罐。培养在34℃至38℃和120转/分下培养，同时使用3N NaOH将pH保持在约7.2或更高。每2至3小时进行取样以测量吸光度。当吸光度开始急剧增加时，每隔0.5至1小时进行取样并测量吸光度。在吸光度达到某一值并保持恒定后约1小时终止培养。培养结束后，在相同的温度和转速条件下进行另外的培养而不调节pH直到pH达到5.5或更低。终止另外的培养后，加入0.12％浓度的脱氧胆酸钠以裂解细胞。将这样获得的裂解液冷却到10℃至15℃，并且随后在相同温度下孵育约3小时，并且不搅拌以引起蛋白沉淀。随后，离心获得的裂解液以去除沉淀的蛋白和细胞碎片。
<纯化>
使用深度过滤器过滤通过离心获得的溶液以去除在离心期间没有沉降的蛋白和细胞碎片。使用100kDa膜浓缩获得的滤出液，并且随后使用25mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2)使获得的浓缩液进行超滤。进行超滤直到透析液的导电率达到约3至4mS/cm，以及跨膜压(TMP)设定为0.5至1.5巴或更低。从获得的溶液中去除杂质，并且将十六烷基三甲基溴化铵(十六烷基-三甲基溴化铵(HB))以约1.0w/v％的浓度加入至溶液，随后搅拌约1小时。然后，进行离心以沉淀多糖。将由此获得的粒料溶于约0.25M氯化钠水溶液中并以约0.5w/v％的浓度向其中加入碘化钠(NaI)。离心此溶液以回收上清液，并缓慢加入活性炭，所得溶液为约2.0w/v％的浓度，同时搅拌，随后搅拌约1小时并过滤。用30kDa的膜浓缩获得的滤液，然后用约10倍体积的三重蒸馏水(triple distilled water)对浓缩的溶液进行超滤。进行超滤直到透析液的导电率达到约10μs/cm，并且将跨膜压(TMP)设置为0.5至1.5巴或更小。使获得的浓缩溶液进行无菌过滤，并冻存于-20℃或更低。
在以下表4到表6中给出了每个纯化步骤中评估的总蛋白含量、总核酸含量、总多糖含量，和纯化产率。
表4
[表4]
血清型3的蛋白含量、核酸含量、和回收的荚膜多糖
表5
[表5]
血清型6B的蛋白含量、核酸含量、和回收的荚膜多糖
表6
[表6]
血清型19A的蛋白含量、核酸含量、和回收的荚膜多糖
ND※：未检测到
表4到表6的结果表明，根据本发明的生产方法获得的荚膜多糖满足了对于残余蛋白含量的标准，且不需要任何单独的酸化过程，并且荚膜多糖的回收率还分别为49％或更高(血清型3荚膜多糖)、65％或更高(血清型6B荚膜多糖)以及60％或更高(血清型19A荚膜多糖)。因此，根据本发明的生产方法通过简化的方法可以用于有效生产荚膜多糖。
实施例2.肺炎球菌血清型7F和14的荚膜多糖的生产
<细胞库的制备>
生产肺炎球菌血清型7F和14的各个菌种获得自美国典型培养物保藏中心[American Type Culture Correction，ATCC]。在下表7中列出了接种培养和主要培养中使用的菌株。
表7
[表7]
血清型 ATCC号
7F 10351
14 6314
建立了多代的保藏菌种(F1、F2、和F3代)。生产了另外两代的保藏菌种。第一另外的代培养自F3接种小瓶，以及随后的代培养自第一另外的代的接种小瓶。用合成甘油作为冷冻保护剂冷冻保存(<-70℃)接种小瓶。为了细胞库制备，所有培养物在大豆类培养基中生长。在冷冻之前，通过离心浓缩细胞，去除用过的培养基并且在包含冷冻保存剂(例如合成的甘油)的新鲜的培养基中重悬细胞沉淀。
<培养和回收>
将来自工作细胞库的培养物用于接种含有大豆类培养基的接种瓶用于培养。在达到目标吸光度后，将接种瓶用于接种含有大豆类培养基的发酵罐。培养在34至38℃和120转/分下培养，同时使用3N NaOH将pH保持在约7.2或更高。每2至3小时进行取样以测量吸光度。当吸光度开始急剧增加时，每隔0.5至1小时进行取样以测量吸光度。在吸光度达到某一值并保持恒定后约1小时终止培养。培养结束后，在相同的温度和转速条件下进行另外的培养而不调节pH直到pH达到5.5或更低。终止另外的培养后，以0.12％的浓度加入脱氧胆酸钠以裂解细胞。将由此获得的裂解液冷却至10至15℃，并且随后在相同温度下孵育约3小时，并且不搅拌以引起蛋白沉淀。随后，离心获得的裂解液以去除沉淀的蛋白和细胞碎片。
<纯化>
使用深度过滤器过滤通过离心获得的溶液以去除在离心期间没有沉降的蛋白和细胞碎片。使用100kDa膜浓缩获得的滤出液，并且随后使用25mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2)使获得的浓缩液进行超滤。进行超滤直到透析液的导电率达到约3至4mS/cm，以及跨膜压(TMP)设定为0.5至1.5巴或更低。从获得的溶液中去除杂质，并且将十六烷基三甲基溴化铵(十六烷基-三甲基溴化铵(HB))以1.0w/v％的浓度加入，随后搅拌约1小时并且离心以回收上清液。然后，将碘化钠(NaI)以浓度为约0.5w/v％加入至上清液。离心获得的溶液以回收上清液，并且将活性炭以约2.0w/v％的浓度缓慢加入至获得的溶液，同时搅拌，随后搅拌约1小时并过滤。用30kDa的膜浓缩获得的滤液，然后用约10倍体积的三重蒸馏水对浓缩的溶液进行超滤。进行超滤直到透析液的导电率达到约10μs/cm，并且将跨膜压(TMP)设置为0.5至1.5巴或更小。使获得的浓缩溶液进行无菌过滤，并冻存于-20℃或更低。
在以下表8到表9中给出了每个纯化步骤评估的总蛋白含量、总核酸含量、总多糖含量、和纯化产率。
表8
[表8]
血清型7F的蛋白含量、核酸含量、和回收的荚膜多糖
表9
[表9]
血清型14的蛋白含量、核酸含量、和回收的荚膜多糖
表8和表9的结果表明，根据本发明的生产方法获得的荚膜多糖满足了对于残余蛋白含量的标准，且不需要任何单独的酸化过程，并且荚膜多糖的回收率还分别为60％或更高(血清型7F荚膜多糖)和55％或更高(血清型14荚膜多糖)。因此，根据本发明的生产方法通过简化的方法可以用于有效生产荚膜多糖。
实施例3.肺炎球菌血清型23F的荚膜多糖的生产
<细胞库的制备>
生产肺炎球菌血清型23F的保藏菌种得自美国典型培养物保藏中心[ATCC，第6323号]。建立了多代的菌种(F1、F2、和F3代)。生产了另外两代的保藏菌种。第一另外的代培养自F3接种瓶，以及随后的代培养自第一另外的代的接种瓶。用合成甘油作为冷冻保存剂冷冻保存(<-70℃)接种瓶。为了细胞库制备，所有培养物在大豆类培养基中生长。在冷冻之前，通过离心浓缩细胞，去除用过的培养基并且在包含冷冻保存剂(例如合成的甘油)的新鲜的培养基中重悬细胞沉淀。
<培养和回收>
将来自工作细胞库的培养物用于接种含有大豆类培养基的接种瓶用于培养。在达到目标吸光度后，将接种瓶用于接种含有大豆类培养基的发酵罐。培养在34至38℃和120转/分下进行，同时使用3N NaOH将pH保持在约7.2或更高。每2至3小时进行取样以测量吸光度。当吸光度开始急剧增加时，每0.5至1小时进行取样以测量吸光度。在吸光度达到某值并保持恒定后约1小时终止培养。培养终止后，在相同的温度和转速条件下进行另外的培养而不调节pH直到达到5.5或更低的pH。终止另外的培养后，加入浓度为0.12％的脱氧胆酸钠以裂解细胞。将这样获得的裂解液冷却到10至15℃，并且随后在相同温度下孵育约3小时，并且不搅拌以引起蛋白沉淀。随后，离心获得的裂解液以去除沉淀的蛋白和细胞碎片。
<纯化>
使用深度过滤器过滤通过离心获得的溶液以去除在离心期间没有沉降的蛋白和细胞碎片。使用100kDa膜浓缩获得的滤出液，并且随后使用25mM磷酸钠缓冲液(pH 7.2)对获得的浓缩液进行超滤。进行超滤直到透析液的导电率达到约3至4mS/cm，以及跨膜压(TMP)设定为0.5至1.5巴或更低。从获得的溶液中去除杂质，并且将十六烷基三甲基溴化铵(十六烷基-三甲基溴化铵(HB))以约2.5w/v％的浓度加入至溶液，随后搅拌约1小时并且离心以沉淀多糖。将由此获得的粒料溶解于约0.25M的氯化钠水溶液中并以约0.5w/v％的浓度向其中加入碘化钠(NaI)。离心该溶液以回收上清液，并以约2.0w/v％的浓度将活性炭缓慢加入至获得的溶液，同时搅拌，随后搅拌约1小时并过滤。用30kDa的膜浓缩获得的滤液，然后用约10倍体积的三重蒸馏水对浓缩的溶液进行超滤。进行超滤直到透析液的导电率达到约10μs/cm，并且将跨膜压(TMP)设置为0.5至1.5巴或更小。使获得的浓缩溶液进行无菌过滤，并在-20℃或更低温下冻存。
在下表10中给出了每个纯化步骤评估的总蛋白含量、总核酸含量、总多糖含量、和纯化产率。
表10
[表10]
血清型23F的蛋白含量、核酸含量、和回收的荚膜多糖
ND※：未检测到
表10中的结果表明通过根据本发明的生产方法而不采用另外的酸化过程获得的血清型23F荚膜多糖满足对于残留蛋白含量的标准，并且荚膜多糖的回收率还是60％或更高。因此，根据本发明的生产方法通过简化的方法可以用于有效地生产荚膜多糖。

Claims (13)

1.一种生产具有肺炎球菌血清型的荚膜多糖的方法，所述方法包括：
(a)培养产生肺炎球菌血清型的细菌细胞，同时将发酵液的pH保持在7.0至9.4的范围；
(b)在所述发酵液的吸光度保持恒定时至所述吸光度开始下降时之间的时刻终止步骤(a)的所述培养；
(c)在不调节pH的情况下对步骤(b)的所述发酵液进行另外的培养，直到所述发酵液的pH达到5.5或更低的pH；
(d)将裂解剂加入至获得自步骤(c)的所述发酵液以裂解细胞，沉淀蛋白，并去除沉淀的蛋白和细胞碎片以获得澄清的细胞裂解液；以及
(e)从获得自步骤(d)的裂解液中分离和纯化所述荚膜多糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肺炎球菌血清型是1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F或33F。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)的所述培养是在50至150转/分的搅拌下在34℃至38℃进行。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，通过从所述发酵液的吸光度保持恒定的时刻起1至3小时内终止步骤(a)的所述培养来进行步骤(b)。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(c)的所述另外的培养是在50至150转/分的搅拌下在34℃至38℃进行。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(d)中使用的所述裂解剂是脱氧胆酸钠。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，通过将所述裂解剂加入至获得自步骤(c)的所述发酵液进行步骤(d)以裂解细胞，然后在不搅拌的情况下将所得的细胞裂解液在10℃至20℃孵育3至24小时以沉淀蛋白，并且通过离心去除沉淀的蛋白和细胞碎片。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(e)的所述分离和纯化包括：
(i)使用深层过滤器过滤获得自步骤(d)的所述裂解液；
(ii)浓缩获得自步骤(i)的滤液，然后超滤和离心；
(iii)使获得自步骤(ii)的上清液与阳离子表面活性剂反应，并且随后离心所得的溶液以获得含有荚膜多糖的粒料或上清液；
(iv)使获得自步骤(iii)的所述荚膜多糖与碘化钠反应，然后离心，从而获得上清液；
(v)将活性炭加入至获得自步骤(iv)的溶液，然后过滤；以及
(vi)浓缩获得自步骤(v)的滤液，然后超滤和离心，从而获得荚膜多糖。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，使用100kDa的膜进行步骤(ii)的所述浓缩。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，使用30kDa的膜进行步骤(vi)的所述浓缩。
11.根据权利要求8所述的方法，其中，步骤(iii)中使用的所述阳离子表面活性剂是十六烷基三甲基溴化铵。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述十六烷基三甲基溴化铵以0.5％至3.0％的浓度使用。
13.根据权利要求8所述的方法，其中，步骤(v)中使用的所述活性炭以1％至5％(w/v)的浓度使用。
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