ES2651415T3

ES2651415T3 - Método de producción de un polisacárido capsular que tiene un serotipo neumocócico

Info

Publication number: ES2651415T3
Application number: ES13834636.6T
Authority: ES
Inventors: Jin-Hwan Shin; Mahn-Hoon Park; Hun Kim; Myeong-Ju NOH; Su-Jin Park
Original assignee: SK Chemicals Co Ltd
Current assignee: SK Chemicals Co Ltd
Priority date: 2012-09-07
Filing date: 2013-09-06
Publication date: 2018-01-26
Anticipated expiration: 2033-09-06
Also published as: US9636392B2; MX363051B; RU2015109997A; EP2894225B1; KR20140032912A; KR101944960B1; CN104781413A; JP2015527079A; RU2606022C2; BR112015005081A8; CA2884241A1; CO7400875A2; WO2014038879A1; US20150231225A1; JP5905649B2; AU2013313794B2; BR112015005081B1; EP2894225A4; CA2884241C; AU2013313794A1

Abstract

Un método de producción de un polisacárido capsular que tiene un serotipo neumocócico, comprendiendo el método: (a) cultivar células bacterianas que producen un serotipo neumocócico mientras se mantiene el pH de un caldo de cultivo en el intervalo de 7,0 a 9,4; (b) finalizar el cultivo de la etapa (a) en un momento entre cuando la absorbancia del caldo de cultivo permanece constante y cuando la absorbancia comienza a disminuir; (c) realizar un cultivo adicional del caldo de cultivo de la etapa (b) sin ajuste de pH hasta que el pH del caldo de cultivo alcanza un pH de 5,5 o inferior; (d) añadir un agente de lisis al caldo de cultivo obtenido de la etapa (c) para lisar las células, precipitar las proteínas y retirar las proteínas precipitadas y los residuos celulares para obtener un lisado celular aclarado; y (e) aislar y purificar el polisacárido capsular del lisado obtenido de la etapa (d), donde no se utiliza un ajustador de pH para la precipitación de proteínas.

Description

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DESCRIPCION

Metodo de produccion de un polisacarido capsular que tiene un serotipo neumococico Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un metodo de produccion de un polisacarido capsular que tiene un serotipo neumococico y, mas en particular, a un metodo de produccion de un polisacarido capsular que tiene un serotipo neumococico mediante la retirada de impurezas tales como protemas y acidos nucleicos de un caldo de cultivo de celulas bacterianas que producen el serotipo neumococico.

Antecedentes de la tecnica

El neumococo (Streptococcus pneumoniae) es una bacteria Grampositiva que pertenece a la familia Streptococcaceae, dentro del orden Lactobacillus, y que provoca enfermedades tales como la neumoma, la bacteriemia, la otitis media y la meningitis en seres humanos. Las celulas de los serotipos neumococicos tienen una capsula que es un recubrimiento polisacandico que rodea a cada celula. Esta capsula interfiere con la fagocitosis evitando que los anticuerpos se adhieran a las celulas bacterianas. Las celulas se han clasificado en mas de 90 serotipos basandose en las caractensticas inmunologicas, se notifica que algunos de los mismos provocan enfermedades invasivas. Se identifico un total de 37 serotipos a partir de Streptococcus pneumoniae invasivo recogido de 1996 a 2008, y los principales serotipos, 19F > 23F > 19A > 6A > 3 > 9V > 6B en este orden de frecuencia, suponen una mayona del 53,4 %. Se han utilizado polisacaridos capsulares de estos serotipos neumococicos en la produccion de vacunas tales como vacunas de polisacaridos y vacunas conjugadas de polisacaridos-protemas.

Los polisacaridos capsulares utilizados en la produccion de vacunas de polisacaridos y vacunas conjugadas de polisacaridos-protemas se obtienen a partir de caldos de cultivo de celulas bacterianas que producen los serotipos respectivos. Cada cepa se cultiva a temperatura, pH y agitacion optimas hasta que alcanza una densidad maxima. Para obtener polisacaridos capsulares neumococicos que no se secretan fuera del citoplasma, se realiza una lisis celular utilizando un agente de lisis tal como desoxicolato de sodio (DOC). Cuando se lisan las celulas, se liberan diversas protemas y acidos nucleicos de la cepa, junto con los polisacaridos capsulares, y estos deben retirarse mediante un proceso de purificacion post-cultivo. Para minimizar el riesgo de eventos adversos por cualquier sustancia distinta de un antfgeno despues de la vacunacion, existen especificaciones estrictas para el contenido de protemas y acidos nucleicos. Por ejemplo, en el caso de Prevnar 7™, el contenido de protemas y acidos nucleicos en cada serotipo satisface las especificaciones del 2-5 % o menos y del 1-2 % o menos sobre la base del peso seco, respectivamente.

La Publicacion de Patente Internacional N.° WO 2006/110352 divulga un metodo de produccion de polisacaridos capsulares que comprende el cultivo de Streptococcus pneumoniae, la lisis celular, la precipitacion de protemas mediante la acidificacion del lisado celular a un pH de menos de 5,5, la incubacion sin agitacion y la centrifugacion y/o filtracion. Ademas, la Publicacion de Patente Internacional N.° WO 2008/118752 divulga un metodo de produccion de polisacaridos capsulares mediante la realizacion de una ultrafiltracion y una diafiltracion de un lisado celular, seguidas de un proceso de precipitacion de protemas mediante acidificacion y Massaldi et al., Biotechnology and Applied Biochemistry, Academic Press, EE.UU., vol. 55, N.° 1 (2010), paginas 37-43, describe la produccion de polisacaridos de Streptococcus pneumoniae serotipo 14. Sin embargo, todos estos metodos de produccion relacionados requieren el proceso de precipitacion de protemas mediante acidificacion con un ajustador de pH, lo que hace que el proceso global sea complicado y ademas provoca la modificacion del polisacarido capsular y la generacion de sustancias nocivas.

Descripcion detallada del concepto inventivo

Problema tecnico

Los inventores han realizado diversos estudios con el fin de mejorar un metodo de produccion de un polisacarido capsular que tenga un serotipo neumococico. Sorprendentemente, los inventores descubrieron que el pH puede reducirse a un intervalo adecuado para la precipitacion de protemas, en concreto, a un pH de 5,5 o inferior mediante productos del cultivo (especialmente, acido lactico, etc.), cuando se realiza un cultivo adicional en las mismas condiciones sin ajuste de pH. Es decir, los inventores descubrieron que el proceso de precipitacion de protemas a traves de la acidificacion con un ajustador de pH puede eliminarse mediante la realizacion de un cultivo adicional sin ajuste de pH y realizando despues la lisis celular y el proceso de precipitacion de protemas.

En consecuencia, el objetivo de la presente invencion es proporcionar un metodo mejorado de produccion de un polisacarido capsular que tenga un serotipo neumococico.

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Solucion tecnica

De acuerdo con un aspecto de la presente invencion, se proporciona un metodo de produccion de un polisacarido capsular que tiene un serotipo neumococico, que comprende las siguientes etapas de:

(a) cultivar celulas bacterianas que producen un serotipo neumococico, mientras se mantiene el pH de un caldo de cultivo en el intervalo de 7,0 a 9,4;

(b) finalizar el cultivo de la etapa (a) en un momento entre cuando la absorbancia del caldo de cultivo permanece constante y cuando la absorbancia comienza a disminuir;

(c) realizar un cultivo adicional del caldo de cultivo obtenido de la etapa (b) sin ajuste de pH hasta que el pH del caldo de cultivo alcanza un pH de 5,5 o inferior;

(d) anadir un agente de lisis al caldo de cultivo obtenido de la etapa (c) para lisar las celulas, precipitar las protemas y retirar las protemas precipitadas y los residuos celulares para obtener un lisado celular aclarado; y

(e) aislar y purificar el polisacarido capsular del lisado obtenido de la etapa (d) y donde no se utiliza un ajustador de pH para la precipitacion de protemas.

En el metodo de produccion de la presente invencion, el serotipo neumococico puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9N, 9V, 14,18C, 19A, 19F, 22F, 23F o 33F.

El cultivo de la etapa (a) puede realizarse a 34-38 °C con agitacion a 50-150 rpm.

En una realizacion de la presente invencion, la etapa (b) puede realizarse mediante la finalizacion del cultivo de la etapa (a) a las 1 a 3 horas desde el momento en el que la absorbancia del caldo de cultivo permanece constante.

El cultivo adicional de la etapa (c) puede realizarse a 34-38 °C con agitacion a 50-150 rpm sin ajuste del pH.

El agente de lisis utilizado en la etapa (d) puede ser desoxicolato de sodio. En otra realizacion de la presente invencion, la etapa (d) puede realizarse mediante la adicion del agente de lisis al caldo de cultivo obtenido de la etapa (c) para lisar las celulas, incubando despues el lisado celular resultante a 10-20 °C durante 3-24 horas sin agitacion para precipitar las protemas y retirando las protemas precipitadas y los residuos celulares por centrifugacion.

En otra realizacion mas de la presente invencion, el aislamiento y la purificacion de la etapa (e) pueden incluir las siguientes etapas:

(i) filtrar el lisado obtenido de la etapa (d) utilizando un filtro de profundidad;

(ii) concentrar un filtrado obtenido de la etapa (i), seguido de ultrafiltracion y centrifugacion;

(iii) hacer reaccionar el sobrenadante obtenido de la etapa (ii) con un tensioactivo cationico y, despues, centrifugar la solucion obtenida para producir un sedimento o sobrenadante que contiene polisacaridos capsulares;

(iv) hacer reaccionar los polisacaridos capsulares obtenidos de la etapa (iii) con yoduro de sodio, seguido de centrifugacion, obteniendo de este modo el sobrenadante;

(v) anadir carbon activado a la solucion obtenida de la etapa (iv), seguido de filtracion; y

(vi) concentrar un filtrado obtenido de la etapa (v), seguido de ultrafiltracion y centrifugacion, obteniendo de este modo polisacaridos capsulares.

En la realizacion anterior, la concentracion de la etapa (ii) puede realizarse utilizando una membrana de 100 kDa y la concentracion de la etapa (vi) puede realizarse utilizando una membrana de 30 kDa. Adicionalmente, el tensioactivo cationico utilizado en la etapa (iii) puede ser bromuro de cetiltrimetilamonio, bromuro de cetiltrimetilamonio y puede utilizarse a una concentracion del 5 ~ 3,0 %. Ademas, el carbon activado utilizado en la etapa (v) puede utilizarse a una concentracion del 1 ~ 5 % (p/v).

Efectos ventajosos

En un metodo de produccion de acuerdo con la presente invencion, no se utiliza un ajustador de pH para la precipitacion de protemas. Es decir, la presente invencion demostro que cuando el cultivo adicional de celulas bacterianas que producen un serotipo neumococico se realiza en las mismas condiciones sin ajuste de pH, el pH puede reducirse a un intervalo adecuado para la precipitacion de protemas, en concreto, un pH de 5,5 o menor, mediante productos del cultivo (especialmente, acido lactico, etc.). Por tanto, el metodo de produccion de la presente invencion no requiere el uso del ajustador de pH para la precipitacion de protemas, minimizando de este modo la modificacion de los polisacaridos capsulares y la generacion de sustancias nocivas y simplificando el proceso de produccion. El polisacarido capsular que tiene el serotipo neumococico obtenido mediante el metodo de produccion de la presente invencion puede utilizarse ventajosamente para producir vacunas de polisacaridos y vacunas conjugadas de polisacaridos-protemas.

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Descripcion de los dibujos

La FIG. 1 muestra los cambios de pH en el caldo de bacterianas que producen el serotipo neumococico 3;

La FIG. 2 muestra los cambios de pH en el caldo de bacterianas que producen el serotipo neumococico 6B;

La FIG. 3 muestra los cambios de pH en el caldo de bacterianas que producen el serotipo neumococico 7F;

La FIG. 4 muestra los cambios de pH en el caldo de bacterianas que producen el serotipo neumococico 14;

La FIG. 5 muestra los cambios de pH en el caldo de bacterianas que producen el serotipo neumococico 19A; y La FIG. 6 muestra los cambios de pH en el caldo de bacterianas que producen el serotipo neumococico 23F.

Mejor modo

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cultivo: y las condiciones para el cultivo de celulas

cultivo: y las condiciones para el cultivo de celulas

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cultivo: y las condiciones para el cultivo de celulas

cultivo: y las condiciones para el cultivo de celulas

La presente invencion proporciona un metodo de produccion de un polisacarido capsular que tiene un serotipo neumococico, que incluye las siguientes etapas:

En la etapa (a) del metodo de produccion de acuerdo con la presente invencion, el serotipo neumococico puede ser cualquier tipo de serotipo que se utilice en la produccion de vacunas neumococicas; por ejemplo, los serotipos pueden incluir el serotipo 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9N, 9V, 14,18C, 19A, 19F, 22F, 23F y 33f, pero no se limitan a los mismos. Las celulas bacterianas que producen los serotipos neumococicos son conocidas en la tecnica y puede utilizarse cualquier celula bacteriana conocida sin ninguna limitacion (por ejemplo, vease el documento WO 2006/110381). El cultivo de la etapa (a) del metodo de produccion de acuerdo con la presente invencion puede realizarse en un medio general, tal como un medio a base de soja, mientras se mantenga el pH del caldo de cultivo en el intervalo de 7,0 a 9,4, preferentemente, de 7,2 a 8,2 mediante el uso de, por ejemplo, hidroxido de sodio. El cultivo puede realizarse en cualesquiera condiciones de cultivo conocidas, por ejemplo, a 34-38 °C con agitacion a 50-150 rpm. Se proporcionan condiciones de pH adecuadas para el cultivo de siembra y el cultivo principal para la produccion de serotipos representativos de Streptococcus pneumoniae en la siguiente Tabla 1.

[Tabla 11

Condicion de pH para cada serotipo

2: pH 7,2 ± 0,2 pH 7,2 ± 0,2

3: pH 7,2 ± 0,2 pH 7,2 ± 0,2

4: pH 7,6 ± 0,6 pH 7,6 ± 0,6

5: pH 7,2 ± 0,2 pH 7,2 ± 0,2

6A: pH 7,2 ± 0,2 pH 7,2 ± 0,2

6B: pH 7,2 ± 0,2 pH 7,2 ± 0,2

7F: pH 7,2 ± 0,2 pH 7,2 ± 0,2

9N: pH 7,6 ± 0,6 pH 7,6 ± 0,6

9V: pH 7,6 ± 0,6 pH 7,6 ± 0,6

14: pH 7,6 ± 0,6 pH 7,6 ± 0,6

18C: pH 7,2 ± 0,2 pH 7,2 ± 0,2

19A: pH 7,2 ± 0,2 pH7,2 ± 0,2

19F: pH 7,2 ± 0,2 pH 7,2 ± 0,2

22F: pH 7,2 ± 0,2 pH 7,2 ± 0,2

23F: pH 7,2 ± 0,2 pH 7,2 ± 0,2

33F: pH 7,2 ± 0,2 pH 7,2 ± 0,2

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El metodo de produccion de acuerdo con la presente invencion no requiere el uso de un ajustador de pH para la precipitacion de protemas. Es decir, los presentes inventores descubrieron sorprendentemente que el pH puede reducirse a un intervalo adecuado para la precipitacion de protemas, en concreto, a un pH de 5,5 o inferior mediante los productos de cultivo (especialmente, acido lactico, etc.), cuando se realiza un cultivo adicional en las mismas condiciones, sin ajuste del pH. Por tanto, el metodo de produccion de la presente invencion incluye realizar el cultivo adicional sin ajuste del pH despues de cultivar celulas bacterianas que producen los serotipos neumococicos, preferentemente, en el punto temporal cuando las celulas bacterianas alcanzan un crecimiento maximo, y despues realizar los procesos de lisis celular y de precipitacion de protemas. Por tanto, el metodo de produccion de la presente invencion no requiere el uso de un ajustador de pH para la precipitacion de protemas, minimizando de este modo la modificacion del polisacarido capsular y la generacion de sustancias nocivas y simplificando el proceso de produccion.

El metodo de produccion de la presente invencion, por tanto, incluye la etapa de finalizar el cultivo de la etapa (a) en un momento entre cuando la absorbancia del caldo de cultivo permanece constante y cuando la absorbancia comienza a disminuir [es decir, la etapa (b)] ; y la etapa de realizar un cultivo adicional del caldo de cultivo obtenido de la etapa (b) sin ajuste de pH hasta que el pH del caldo de cultivo alcanza un pH de 5,5 o inferior [es decir, la etapa (c)].

A medida que el cultivo se realiza de acuerdo con la etapa (a) del metodo de produccion de la presente invencion, las celulas bacterianas proliferan y la absorbancia [por ejemplo, la absorbancia a 590 nm (DO590)] del caldo de cultivo aumenta gradualmente hasta alcanzar la meseta (el maximo crecimiento) y despues permanece constante (aproximadamente 7-24 horas despues de comenzar el cultivo). Posteriormente, la absorbancia disminuye a las 1 a 3 horas. En una realizacion de la presente invencion, por tanto, la etapa (b) puede mediante la finalizacion del cultivo de la etapa (a) a las 1 a 3 horas desde el momento cuando la absorbancia del caldo de cultivo permanece constante. El cultivo adicional de la etapa (c) puede realizarse sin ajuste de pH en las mismas condiciones que en la etapa (a), es decir, a 34-38 °C con agitacion a 50-150 rpm. Cuando se realiza dicho cultivo adicional, el pH del caldo de cultivo disminuye espontaneamente a 5,5 o inferior, proporcionando de este modo un pH adecuado necesario para la precipitacion de protemas.

El metodo de produccion de la presente invencion incluye la etapa de anadir un agente de lisis al caldo de cultivo obtenido de la etapa (c) para lisar las celulas, precipitar las protemas y retirar las protemas precipitadas y los residuos celulares para obtener un lisado celular aclarado [es decir, la etapa (re)].

La lisis celular puede realizarse de acuerdo con un metodo conocido, por ejemplo, un metodo divulgado en el documento WO 2006/110381, el documento WO 2008/118752, etc. Por ejemplo, la lisis celular puede realizarse utilizando desoxicolato de sodio como agente de lisis. El desoxicolato de sodio puede utilizarse a una concentracion de 0,10-0,15 % (concentracion despues de la adicion de desoxicolato de sodio), pero no se limita a ello. Como se lisan las celulas, los polisacaridos capsulares de los serotipos neumococicos son liberados fuera del citoplasma. Ademas, la precipitacion de protemas puede realizarse mediante, por ejemplo, la incubacion a 10-20 °C y la eliminacion de las protemas precipitadas y desechos de celulas puede realizarse por un metodo tfpico (por ejemplo, centrifugacion). En una realizacion de la presente invencion, la etapa (d) puede realizarse mediante la adicion de un agente de lisis al caldo de cultivo obtenido de la etapa (c) para lisar las celulas, precipitando protemas por incubacion del lisado obtenido a 10-20 °C durante 3-24 horas sin agitacion y la eliminacion de las protemas precipitadas y restos celulares por centrifugacion.

El metodo de produccion de la presente invencion incluye la etapa de aislar y purificar el polisacarido capsular del lisado mediante la retirada de impurezas (por ejemplo, protemas y acidos nucleicos contenidos en las celulas) del lisado obtenido de la etapa (d) [es decir, la etapa (e)]. El aislamiento y la purificacion del polisacarido capsular pueden realizarse de acuerdo con un metodo de purificacion conocido, por ejemplo, un metodo divulgado en el documento WO 2006/110381 y el documento WO 2008/118752. En una realizacion, el aislamiento y la purificacion de la etapa (e) pueden incluir las siguientes etapas:

(iii) hacer reaccionar el sobrenadante obtenido de la etapa (ii) con un tensioactivo cationico y, despues, centrifugar la solucion resultante para obtener un sedimento o sobrenadante que contiene polisacaridos capsulares;

(iv) hacer reaccionar los polisacaridos capsulares obtenidos de la etapa (iii) con yoduro de sodio, seguido de centrifugacion, obteniendo de este modo un sobrenadante;

En la realizacion anterior, los lisados que permanecen incluso despues de la centrifugacion para la retirada de las protemas y los residuos celulares precipitados se retiran por filtracion mediante el filtro de profundidad.

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Adicionalmente, las protemas y los acidos nucleicos pueden retirarse mediante la repeticion de la concentracion/ultrafiltracion dos veces. En una realizacion, la concentracion de la etapa (ii) puede realizarse utilizando una membrana de 100 kDa y la concentracion de la etapa (vi) puede realizarse utilizando una membrana de 30 kDa. En este proceso, la ultrafiltracion tambien puede ser denominarse 'diafiltracion'.

Adicionalmente, el tensioactivo cationico utilizado en la etapa (iii) puede ser bromuro de cetiltrimetilamonio. El bromuro de cetiltrimetilamonio (bromuro de cetrimonio, bromuro de hexadecil-trimetilamonio (HB)) puede utilizarse a una concentracion del 0,5-3% (concentracion despues de la adicion de bromuro de cetiltrimetilamonio). El tensioactivo cationico utilizado como HB puede precipitarse y retirarse mediante el uso de yoduro de sodio. Cuando se realiza la centrifugacion en la etapa (iii), puede haber presentes polisacaridos capsulares en el sedimento (por ejemplo, serotipo 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 9N, 9V, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, etc.) o en el sobrenadante (por ejemplo, serotipo 7F, 14, 33F, etc.). Los polisacaridos capsulares obtenidos en forma de sedimento pueden disolverse en un disolvente apropiado (por ejemplo, solucion acuosa de cloruro de sodio, etc.) y despues pueden utilizarse en la etapa posterior (es decir, la reaccion con yoduro de sodio). Los polisacaridos capsulares presentes en el sobrenadante pueden utilizarse en la etapa posterior (es decir, la reaccion con yoduro de sodio) sin separacion adicional.

Adicionalmente, el carbon activado en la etapa (v) puede utilizarse preferentemente a una concentracion del 1-5% (p/v).

En lo sucesivo en el presente documento, la presente invencion se describira en mas detalle con referencia a los Ejemplos. Sin embargo, los siguientes Ejemplos que se describen en el presente documento deben considerarse en un sentido descriptivo solamente y con fines de limitacion.

Ejemplo

Un medio a base soja utilizado en los siguientes Ejemplos tiene la composicion como en la Tabla 2 a continuacion.

[Tabla 21

Composicion del medio: contenido por litro (g)

Peptona de (Soytone™, BD 243620): 28

Cloruro de sodio: 3,5

Fosfato de potasio: 0,7

Ejemplo 1. Produccion de polisacaridos capsulares de los serotipos neumococicos 3, 6B y 19A

Se obtuvieron reservas de las semillas respectivas que producen los serotipos neumococicos 3, 6B y 19A de la American Type Culture Collection [ATCC]. Las cepas utilizadas en el cultivo de siembra y el cultivo principal se proporcionan en la siguiente Tabla 3.

[Tabla 3]

Serotipo: ATCC N.°

3: 6303

6B: 6326

19A: 10357

Se crearon varias generaciones de reservas de semillas (generaciones F1, F2 y F3). Se produjeron dos generaciones adicionales de reservas de semillas. La primera generacion adicional se cultivo a partir de un vial F3 y la generacion posterior se cultivo a partir de un vial de la primera generacion adicional. Los viales de semillas se almacenaron congeladas (<-70 °C) con glicerol sintetico como crioconservante. Para la preparacion del banco de celulas, todos los cultivos se cultivaron en un medio a base de soja. Antes de la congelacion, las celulas se concentraron por centrifugacion, el medio gastado se retiro y los sedimentos celulares se volvieron a suspender en un medio recien preparado que contema un crioconservante (por ejemplo, glicerol sintetico).

Se utilizaron cultivos del banco de celulas de trabajo para inocular botellas de semillas que conteman un medio a base de soja para el cultivo. Despues de alcanzar una absorbancia objetivo, la botella de siembra se uso para inocular un fermentador que contema el medio a base de soja. El cultivo se realizo a 34-38 °C y 120 rpm mientras se mantema el pH a aproximadamente 7,2 o superior utilizando NaOH 3 N. El muestreo se realizo cada 2-3 horas para medir la absorbancia. Cuando la absorbancia comenzo a aumentar drasticamente, el muestreo se realizo cada 0,5-1 horas y se midio la absorbancia. El cultivo finalizo aproximadamente 1 hora despues de que la absorbancia

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alcanzase un valor determinado y permaneciese constante. Despues de la finalizacion del cultivo, se realizo un cultivo adicional sin ajuste de pH en las mismas condiciones de temperatura y rpm hasta que el pH alcanzo un valor de 5,5 o inferior. Despues de la finalizacion del cultivo adicional, se anadio desoxicolato de sodio a una concentracion del 0,12 % para lisar las celulas. El lisado obtenido de este modo se enfrio a 10-15 °C y despues se incubo a la misma temperatura durante aproximadamente 3 horas sin agitacion para conducir a la precipitacion de protemas. Posteriormente, el lisado resultante se centrifugo para retirar las protemas y los residuos celulares precipitados.

La solucion obtenida mediante la centrifugacion se filtro utilizando un filtro de profundidad para retirar las protemas y los residuos celulares que no habfan sedimentado durante la centrifugacion. El filtrado resultante se concentro utilizando una membrana de 100 kDa y despues la solucion concentrada resultante se sometio a ultrafiltracion utilizando tampon de fosfato de sodio 25 mM (pH 7,2). La ultrafiltracion se realizo hasta que la conductividad del dializado alcanzo aproximadamente 3-4 mS/cm y la presion transmembrana (PTM) se fijo en 0,5-1,5 bar (50 kPa- 150 kPa) o menos. Se retiraron las impurezas de la solucion resultante y se anadio bromuro de cetrimonio (bromuro de hexadecil-trimetilamonio (HB)) a la solucion a una concentracion de aproximadamente el 1,0 % p/v, seguido de agitacion durante aproximadamente 1 hora. Despues, se realizo centrifugacion para precipitar los polisacaridos. El sedimento obtenido de este modo se disolvio en solucion acuosa aproximadamente 0,25 M de cloruro de sodio y se anadio yoduro de sodio (Nal) a los mismos a una concentracion de aproximadamente el 0,5 % p/v. Esta solucion se centrifugo para recuperar el sobrenadante y se anadio carbon activado lentamente a la solucion resultante a una concentracion de aproximadamente el 2,0% p/v, mientras que se agitaba, seguido de agitacion durante aproximadamente 1 hora y filtracion. El filtrado resultante se concentro utilizando una membrana de 30 kDa y despues la solucion concentrada se sometio a ultrafiltracion utilizando aproximadamente 10 veces el volumen de agua triplemente destilada. La ultrafiltracion se realizo hasta que la conductividad del dializado alcanzo aproximadamente 10 ps/cm y la presion transmembrana (TMP) se fijo en 0,5~1,5 bar (50 kPa~150 kPa) o menos. La solucion concentrada resultante se sometio a filtracion esteril y se almaceno congelada a -20 °C o menos.

El contenido de protema total, el contenido de acido nucleico total, el contenido de polisacarido total y el rendimiento de la purificacion evaluados en cada etapa de purificacion se proporcionan en las siguientes Tablas 4 a 6.

[Tabla 41

Contenido de protema, contenido de acido nucleico y recuperacion de polisacarido capsular del serotipo 3

: Contenido de protema total (mg) Relacion de contenido de protema a polisacarido (%) Contenido de acido nucleico (mg) Relacion de contenido de acido nucleico a polisacarido (%) Contenido de polisacarido total (mg) Rendimiento de purificacion (%)

Filtro de profundidad: 581320,00 354,46 27354,00 16,68 164000,00 100,00

Concentracion/ultrafiltracion 100 kDa: 6829,00 5,57 601,60 0,49 122.600,00 74,76

CTAB/Nal: 7322,00 7,44 204,00 0,21 98400,00 60,00

Carbon activado: 412,00 0,45 58,80 0,06 91600,00 55,85

Concentracion/ultrafiltracion 30 kDa: 352,50 0,44 28,20 0,04 80400,00 49,30

[Tabla 51

Contenido de protema, contenido de acido nucleico y recuperacion de polisacarido capsular del serotipo 6B

Filtro de profundidad: 137280,00 65,37 4872,40 2,32 210000,00 100,00

Concentracion/ultrafiltracion 100 kDa: 8986,00 4,59 576,26 0,29 195800,00 93,24

CTAB/Nal: 7030,00 4,30 352,06 0,22 163600,00 77,90

Carbon activado: 1376,00 0,93 76,96 0,05 148400,00 70,67

Concentracion/ultrafiltracion 30 kDa: 843,00 0,70 43,23 0,04 120000,00 67,57

5

10

15

20

25

30

35

40

45

[Tabla 61

Contenido de protema, contenido de acido nucleico y recuperacion de polisacarido capsular del serotipo 19A

Filtro de profundidad: 1735640,00 2479,49 5053,30 7,22 70000,00 100,00

Concentracion/ultrafiltracion 100 kDa: 10288,00 16,87 252,56 0,41 61000,00 87,14

CTAB/Nal: 5528,00 10,31 593,54 1,11 53600,00 76,57

Carbon activado: 12,00 0,03 0,39 ND** 42400,00 60,57

Concentracion/ultrafiltracion 30 kDa: 8,00 0,02 0,06 ND 44650,00 60,86

ND*. No detectado

Los resultados de las Tablas 4 a 6 demostraron que los polisacaridos capsulares obtenidos mediante el metodo de produccion de acuerdo con la presente invencion satisficieron un patron para el contenido de protema residual sin ningun proceso de acidificacion separado, y las tasas de recuperacion de los polisacaridos capsulares tambien fueron del 49 % o mas (polisacarido capsular serotipo 3), del 65 % o mas (polisacarido capsular serotipo 6B) y del 60 % o mas (polisacarido capsular serotipo 19A), respectivamente. Por tanto, el metodo de produccion de acuerdo con la presente invencion puede utilizarse para producir eficazmente polisacaridos capsulares mediante el proceso simplificado.

Ejemplo 2. Produccion de polisacaridos capsulares de los serotipos neumococicos 7F y 14

Se obtuvieron reservas de las semillas respectivas que producen los serotipos neumococicos 7F y 14 de la American Type Culture Collection [ATCC]. Las cepas utilizadas en el cultivo de siembra y el cultivo principal se proporcionan en la siguiente Tabla 7.

[Tabla 71

Serotipo: ATCC N.°

7F: 10351

14: 6314

Se utilizaron cultivos del banco de celulas de trabajo para inocular botellas de semillas que conteman un medio a base de soja para el cultivo. Despues de alcanzar una absorbancia objetivo, la botella de siembra se uso para inocular un fermentador que contema el medio a base de soja. El cultivo se realizo a 34-38 °C y 120 rpm mientras se mantema el pH a aproximadamente 7,2 o superior utilizando NaOH 3 N. El muestreo se realizo cada 2-3 horas para medir la absorbancia. Cuando la absorbancia comenzo a aumentar drasticamente, el muestreo se realizo cada 0,5~1 horas para medir la absorbancia. El cultivo finalizo aproximadamente 1 hora despues de que la absorbancia alcanzase un valor determinado y permaneciese constante. Despues de la finalizacion del cultivo, se realizo un cultivo adicional sin ajuste de pH en las mismas condiciones de temperatura y rpm hasta que el pH alcanzo un valor de 5,5 o inferior. Despues de la finalizacion del cultivo adicional, se anadio desoxicolato de sodio a una concentracion del 0,12% para lisar las celulas. Los lisados obtenidos de este modo se enfriaron a 10~15°C y despues se incubaron a la misma temperatura durante aproximadamente 3 horas sin agitacion para conducir a la precipitacion de protemas. Posteriormente, el lisado resultante se centrifugo para retirar las protemas y los residuos celulares precipitados.

5

10

15

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25

30

La solucion obtenida mediante la centrifugacion se filtro utilizando un filtro de profundidad para retirar las protemas y los residuos celulares que no habfan sedimentado durante la centrifugacion. El filtrado resultante se concentro utilizando una membrana de 100 kDa y despues la solucion concentrada resultante se sometio a ultrafiltracion utilizando tampon de fosfato de sodio 25 mM (pH 7,2). La ultrafiltracion se realizo hasta que la conductividad del dializado alcanzo aproximadamente 3-4 mS/cm y la presion transmembrana (PTM) se fijo en 0,5-1,5 bar (50 kPa- 150 kPa) o menos. Se retiraron las impurezas de la solucion resultante y se anadio bromuro de cetrimonio (bromuro de hexadecil-trimetilamonio (HB)) a una concentracion de aproximadamente el 1,0% p/v seguido de agitacion durante aproximadamente 1 hora y centrifugacion para recuperar el sobrenadante. Despues, se anadio yoduro de sodio (Nal) al mismo a una concentracion de aproximadamente el 0,5 % p/v. La solucion obtenida se centrifugo para recuperar el sobrenadante y se anadio carbon activado lentamente a la solucion resultante a una concentracion de aproximadamente el 2,0% p/v, mientras que se agitaba, seguido de agitacion durante aproximadamente 1 hora y filtracion. El filtrado resultante se concentro utilizando una membrana de 30 kDa y despues la solucion concentrada se sometio a ultrafiltracion utilizando aproximadamente 10 veces el volumen de agua triplemente destilada. La ultrafiltracion se realizo hasta que la conductividad del dializado alcanzo aproximadamente 10|js/cm y la presion transmembrana (TMP) se fijo en 0,5-1,5bar (50 kPa~150 kPa) o menos. La solucion concentrada resultante se sometio a filtracion esteril y se almaceno congelada a -20 °C o menos.

El contenido de protema total, el contenido de acido nucleico total, el contenido de polisacarido total y el rendimiento de la purificacion evaluados en cada etapa de purificacion se proporcionan en las siguientes Tablas 8 a 9.

[Tabla 81

Contenido de protema, contenido de acido nucleico y recuperacion de polisacarido capsular del serotipo 7F

Filtro de profundidad: 1861130,00 1604,42 4325,00 3,73 116000,00 100,00

Concentracion/ultrafiltracion 100 kDa: 21352,00 21,39 546,80 0,55 99800,00 86,03

CTAB/Nal: 5962,00 6,47 565,70 0,61 92200,00 79,48

Carbon activado: 428,00 0,50 269,67 0,32 85200,00 73,45

Concentracion/ultrafiltracion 30 kDa: 259,00 0,42 21,30 0,03 61300,00 60,26

[Tabla 91

Contenido de protema, contenido de acido nucleico y recuperacion de polisacarido capsular del serotipo 14

Filtro de profundidad: 138480,00 121,47 6609,40 5,80 114000,00 100,00

Concentracion/ultrafiltracion 100 kDa: 10624,00 12,92 1369,61 1,67 82200,00 72,11

CTAB/Nal: 3706,00 4,10 491,22 0,54 90400,00 79,30

Carbon activado: 656,00 0,99 274,56 0,42 66000,00 57,89

Concentracion/ultrafiltracion 30 kDa: 209,00 0,41 68,09 0,13 50490,00 55,87

Los resultados de las Tablas 8 y 9 demostraron que los polisacaridos capsulares obtenidos mediante el metodo de produccion de acuerdo con la presente invencion satisficieron un patron para el contenido de protema residual sin ningun proceso de acidificacion separado, y las tasas de recuperacion de los polisacaridos capsulares tambien fueron del 60% o mas (polisacarido capsular serotipo 7F) y del 55% o mas (polisacarido capsular serotipo 14), respectivamente. Por tanto, el metodo de produccion de acuerdo con la presente invencion puede utilizarse para producir eficazmente polisacaridos capsulares mediante el proceso simplificado.

5

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45

50

Ejemplo 3. Produccion de polisacaridos capsulares del serotipo neumococico 23F

Se obtuvo una reserva de semillas que produce el serotipo neumococico 23F de la American Type Culture Collection [ATCC, N.° 6323]. Se crearon varias generaciones de reservas de semillas (generaciones F1, F2 y F3). Se produjeron dos generaciones adicionales de reservas de semillas. La primera generacion adicional se cultivo a partir de un vial F3 y la generacion posterior se cultivo a partir de un vial de la primera generacion adicional. Los viales de semillas se almacenaron congeladas (<-70 °C) con glicerol sintetico como crioconservante. Para la preparacion del banco de celulas, todos los cultivos se cultivaron en un medio a base de soja. Antes de la congelacion, las celulas se concentraron por centrifugacion, el medio gastado se retiro y los sedimentos celulares se volvieron a suspender en un medio recien preparado que contema un crioconservante (por ejemplo, glicerol sintetico).

Se utilizo un cultivo del banco de celulas de trabajo para inocular una botella de semillas que contema un medio a base de soja para el cultivo. Despues de alcanzar una absorbancia objetivo, la botella de siembra se uso para inocular un fermentador que contema el medio a base de soja. El cultivo se realizo a 34-38 °C y 120 rpm mientras se mantema el pH a aproximadamente 7,2 o superior utilizando NaOH 3 N. El muestreo se realizo cada 2-3 horas para medir la absorbancia. Cuando la absorbancia comenzo a aumentar drasticamente, el muestreo se realizo cada 0,5~1 horas para medir la absorbancia. El cultivo finalizo aproximadamente 1 hora despues de que la absorbancia alcanzase un valor determinado y permaneciese constante. Despues de la finalizacion del cultivo, se realizo un cultivo adicional sin ajuste de pH en las mismas condiciones de temperatura y rpm hasta que el pH alcanzo un valor de 5,5 o inferior. Despues de la finalizacion del cultivo adicional, se anadio desoxicolato de sodio a una concentracion del 0,12 % para lisar las celulas. El lisado obtenido de este modo se enfrio a 10~15 °C y despues se incubo a la misma temperatura durante aproximadamente 3 horas sin agitacion para conducir a la precipitacion de protemas. Posteriormente, el lisado resultante se centrifugo para retirar las protemas y los residuos celulares precipitados.

La solucion obtenida mediante la centrifugacion se filtro utilizando un filtro de profundidad para retirar las protemas y los residuos celulares que no habfan sedimentado durante la centrifugacion. El filtrado resultante se concentro utilizando una membrana de 100 kDa y despues la solucion concentrada resultante se sometio a ultrafiltracion utilizando tampon de fosfato de sodio 25 mM (pH 7,2). La ultrafiltracion se realizo hasta que la conductividad del dializado alcanzo aproximadamente 3~4 mS/cm y la presion transmembrana (PTM) se fijo en 0,5~1,5 bar (50 kPa- 150 kPa) o menos. Se retiraron las impurezas de la solucion resultante y se anadio bromuro de cetrimonio (bromuro de hexadecil-trimetilamonio (HB)) a una concentracion de aproximadamente el 2,5% p/v seguido de agitacion durante aproximadamente 1 hora y centrifugacion para precipitar los polisacaridos. El sedimento obtenido de este modo se disolvio en solucion acuosa aproximadamente 0,25 M de cloruro de sodio y se anadio yoduro de sodio (Nal) a los mismos a una concentracion de aproximadamente el 0,5 % p/v. Esta solucion se centrifugo para recuperar el sobrenadante y se anadio carbon activado lentamente a la solucion resultante a una concentracion de aproximadamente el 2,0% p/v, mientras que se agitaba, seguido de agitacion durante aproximadamente 1 hora y filtracion. El filtrado resultante se concentro utilizando una membrana de 30 kDa y despues la solucion concentrada se sometio a ultrafiltracion utilizando aproximadamente 10 veces el volumen de agua triplemente destilada. La ultrafiltracion se realizo hasta que la conductividad del dializado alcanzo aproximadamente 10ps/cm y la presion transmembrana (TMP) se fijo en 0,5~1,5bar (50 kPa~150 kPa) o menos. La solucion concentrada resultante se sometio a filtracion esteril y se almaceno congelada a -20 °C o menos.

El contenido de protema total, el contenido de acido nucleico total, el contenido de polisacarido total y el rendimiento de la purificacion evaluados en cada etapa de purificacion se proporcionan en la siguiente Tabla 10.

[Tabla 10]

Filtro de profundidad: 1667780,00 1437,74 5740,00 4,95 116000,00 100,00

Concentracion/ultrafiltracion 100 kDa: 17798,00 17,28 442,90 0,43 103000,00 88,79

CTAB/Nal: 7678,00 9,23 299,00 0,36 83200,00 71,72

Carbon activado: ND* ND* 137,20 0,18 77600,00 66,90

Concentracion/ultrafiltracion 30 kDa: ND* ND* 5,605 0,01 55860,00 64,53

ND*. No detectado

Los resultados de la Tabla 10 demostraron que el polisacarido capsular serotipo 23F obtenido mediante el metodo de produccion de acuerdo con la presente invencion satisfizo un patron para el contenido de protema residual sin el empleo de un proceso de acidificacion adicional, y la tasa de recuperacion del polisacarido capsular tambien fue del 5 60 % o mas. Por tanto, el metodo de produccion de acuerdo con la presente invencion puede utilizarse para producir

eficazmente polisacaridos capsulares mediante el proceso simplificado.

Claims

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10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

REIVINDICACIONES

1. Un metodo de produccion de un polisacarido capsular que tiene un serotipo neumococico, comprendiendo el metodo:

(a) cultivar celulas bacterianas que producen un serotipo neumococico mientras se mantiene el pH de un caldo de cultivo en el intervalo de 7,0 a 9,4;

(b) finalizar el cultivo de la etapa (a) en un momento entre cuando la absorbancia del caldo de cultivo permanece constante y cuando la absorbancia comienza a disminuir;

(c) realizar un cultivo adicional del caldo de cultivo de la etapa (b) sin ajuste de pH hasta que el pH del caldo de cultivo alcanza un pH de 5,5 o inferior;

(d) anadir un agente de lisis al caldo de cultivo obtenido de la etapa (c) para lisar las celulas, precipitar las protemas y retirar las protemas precipitadas y los residuos celulares para obtener un lisado celular aclarado; y

(e) aislar y purificar el polisacarido capsular del lisado obtenido de la etapa (d), donde no se utiliza un ajustador de pH para la precipitacion de protemas.
2. El metodo de la reivindicacion 1, donde el serotipo neumococico es 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9N, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F o 33F.
3. El metodo de la reivindicacion 1, donde el cultivo de la etapa (a) se realiza a 34-38 °C con agitacion a 50-150 rpm.
4. El metodo de la reivindicacion 1, donde la etapa (b) se realiza mediante la finalizacion del cultivo de la etapa (a) a las 1 a 3 horas desde el momento en el que la absorbancia del caldo de cultivo permanece constante.
5. El metodo de la reivindicacion 1, donde el cultivo adicional de la etapa (c) se realiza a 34-38 °C con agitacion a 50150 rpm sin ajuste del pH.
6. El metodo de la reivindicacion 1, donde el agente de lisis utilizado en la etapa (d) es desoxicolato de sodio.
7. El metodo de la reivindicacion 1, donde la etapa (d) se realiza mediante la adicion del agente de lisis al caldo de cultivo obtenido de la etapa (c) para lisar las celulas, incubando despues el lisado celular resultante a 10-20 °C durante 3-24 horas sin agitacion para precipitar las protemas y retirando las protemas precipitadas y los restos celulares por centrifugacion.
8. El metodo de la reivindicacion 1, donde el aislamiento y la purificacion de la etapa (e) comprenden:

(i) filtrar el lisado obtenido de la etapa (d) utilizando un filtro de profundidad;

(ii) concentrar un filtrado obtenido de la etapa (i), seguido de ultrafiltracion y centrifugacion;

(iii) hacer reaccionar un sobrenadante obtenido de la etapa (ii) con un tensioactivo cationico y, despues, centrifugar la solucion resultante para obtener un sedimento o sobrenadante que contiene polisacaridos capsulares;

(iv) hacer reaccionar los polisacaridos capsulares obtenidos de la etapa (iii) con yoduro de sodio, seguido de centrifugacion, obteniendo de este modo un sobrenadante;

(v) anadir carbon activado a la solucion obtenida de la etapa (iv), seguido de filtracion; y

(vi) concentrar un filtrado obtenido de la etapa (v), seguido de ultrafiltracion y centrifugacion, obteniendo de este modo polisacaridos capsulares.
9. El metodo de la reivindicacion 8, donde la concentracion de la etapa (ii) se realiza utilizando una membrana de 100 kDa.
10. El metodo de la reivindicacion 8, donde la concentracion de la etapa (vi) se realiza utilizando una membrana de 30 kDa.
11. El metodo de la reivindicacion 8, donde el tensioactivo cationico utilizado en la etapa (iii) es bromuro de cetiltrimetilamonio.
12. El metodo de la reivindicacion 11, donde el bromuro de cetiltrimetilamonio se utiliza a una concentracion del 0,5~3,0 %.
13. El metodo de la reivindicacion 8, donde el carbon activado en la etapa (v) se utiliza a una concentracion del 15 % (p/v).