BR112016015835B1 - Processo de preparação de conjugados compreendendo polissacarídeos capsulares de streptococcus pneumoniae - Google Patents

Processo de preparação de conjugados compreendendo polissacarídeos capsulares de streptococcus pneumoniae Download PDF

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Abstract

polissacarídeos capsulares de streptococcus pneumoniae e conjugados destes. a presente invenção refere-se a polissacarídeos de serotipo 10a, 22f ou 33f de streptococcus pneumoniae ativados e a processos para sua preparação. a invenção também se refere a conjugados imunogênicos incluindo polissacarídeos de serotipo 10a, 22f ou 33f de streptococcus pneumoniae covalentemente ligados a uma proteína carreadora, a processos para sua preparação e a composições imunogênicas e vacinas incluindo estes.

Description

Campo da Invenção
[001] A invenção refere-se a polissacarídeos de serotipo 10A, 22F ou 33F de Streptococcus pneumoniae e a processos para sua preparação. A invenção também se refere a conjugados imunogênicos incluindo polissacarídeos de serotipo 10A, 22F ou 33F de Streptococcus pneumoniae covalentemente ligados a uma proteína carreadora, a processos para sua preparação e a composições imunogênicas e vacinas incluindo estas.
Antecedentes
[002] Streptococcus pneumoniae são cocos em forma de lança Gram-positivos que são geralmente vistos em pares (diplococos), mas também em cadeias curtas ou como células únicas. Eles crescem prontamente em placas de ágar de sangue com colônias brilhantes e apresentam alfa hemólise a menos que cultivadas anaerobicamente, onde eles apresentam beta hemólise. As células da maioria dos serotipos de pneumococos possuem uma cápsula, que é um revestimento de polissacarídeo envolvendo cada célula. Esta cápsula é um determinante de virulência em humanos, já que interfere a fagocitose pela prevenção da ligação de anticorpos às células bacterianas. Atualmente, há mais de 90 serotipos capsulares de pneumococos identificados, com os 23 serotipos mais comuns totalizando aproximadamente 90% da doença invasiva mundialmente. Como uma vacina, o revestimento de polissacarídeo de pneumococos pode transmitir um grau razoável de imunidade a Streptococcus pneumoniae para indivíduos com sistemas imunes desenvolvidos ou não deficientes, mas o polissacarídeo capsular conjugado em uma proteína carreadora apropriada permite uma resposta imune em recém-nascidos e idosos que também estão com o maior risco de contrair infecções de pneumococos.
[003] Desde a introdução da primeira vacina conjugada de pneumococo 7-valente (PCV7 ou Prevnar) em 2000, a doença invasiva destes sete serotipos (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F) quase desapareceu. A adição dos serotipos 1, 3, 5, 6A, 7F e 19A em Prevnar 13 diminuiu adicionalmente os números de doença de pneumococos invasiva.
[004] Nenhuma das vacinas atualmente comercializadas fornece uma proteção apropriada contra o serotipo 10A, 22F ou 33F de Streptococcus pneumoniae em humanos, e em particular, em crianças com menos de 2 anos de idade. Logo, há a necessidade de composições imunogênicas que possam ser usadas para induzir uma resposta imune contra o serotipo 10A, 22F ou 33F de Streptococcus pneumoniae.
Sumário da Invenção
[005] Em um aspecto, a presente divulgação fornece um processo para a preparação de um polissacarídeo capsular de serotipo 10A, 22F ou 33F Streptococcus pneumoniae ativado, o processo incluindo as etapas de:
[006] (a) reação de um polissacarídeo capsular de serotipo 10A, 22F ou 33F isolado com um agente oxidante; e
[007] (b) extinção da reação de oxidação pela adição de um agente de extinção resultando em um polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F de Streptococcus pneumoniae ativado.
[008] Em um aspecto adicional, a presente divulgação fornece um processo para preparação de um conjugado imunogênico incluindo polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F de Streptococcus pneumoniae covalentemente ligado a uma proteína carreadora, o processo incluindo as etapas de:
[009] (a) composição de um polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F obtido ou obtenível por um processo divulgado aqui com uma proteína carreadora; e
[0010] (b) reação do composto, polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado e proteína carreadora com um agente redutor para formar um conjugado de polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F:proteína carreadora.
[0011] Em um aspecto adicional, a presente divulgação fornece o conjugado de polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F:proteína carreadora obtido ou obtenível por um processo divulgado aqui.
[0012] Em um aspecto adicional, a presente divulgação fornece composições imunogênicas e vacinas incluindo o conjugado imunogênico divulgado aqui.
[0013] Em um aspecto adicional, a presente divulgação fornece um método de tratamento ou prevenção de uma infecção, doença ou condição de Streptococcus pneumoniae em um sujeito, o método incluindo a etapa de administração de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficiente de uma composição imunogênica ou uma vacina divulgada aqui.
Breve Descrição dos Desenhos
[0014] A Figura 1 mostra a estrutura da Unidade de Repetição de Serotipo 10A de polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae.
[0015] A Figura 2 mostra a estrutura da Unidade de Repetição de Serotipo 22F de polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae.
[0016] A Figura 3 mostra a estrutura da Unidade de Repetição de Serotipo 33F de polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae.
[0017] A Figura 4 mostra o peso molecular do polissacarídeo de serotipo 22F ativado como uma função da quantidade de agente oxidante a 23°C com e sem etapa de extinção.
[0018] A Figura 5 mostra o peso molecular do polissacarídeo de serotipo 22F ativado como uma função da quantidade de agente oxidante a 4°C com e sem etapa de extinção.
[0019] A Figura 6 mostra o peso molecular do polissacarídeo de serotipo 33F ativado como uma função da quantidade de agente oxidante a 2 a 8°C com e sem etapa de extinção ou a 23°C sem etapa de extinção.
Descrição Detalhada da Invenção
[0020] A presente invenção pode ser entendida mais prontamente por referência à seguinte descrição detalhada das modalidades preferidas da invenção e aos Exemplos incluídos aqui. A menos que definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados aqui possuem o mesmo significado que o comumente entendido por alguém ordinariamente versado na técnica ao qual a invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou testes da presente invenção, certos métodos e materiais preferidos são descritos aqui. Na descrição das modalidades e reivindicações da invenção, certas terminologias serão usadas de acordo com as definições estabelecidas abaixo.
[0021] Como usado aqui, as formas singulares “um”, “uma”, e “o/a” incluem referências plurais a menos que indicado de outra maneira. Logo, por exemplo, referências “ao método” incluem um ou mais métodos, e/ou etapas do tipo descrito aqui e/ou que se tornarão aparentes a alguém ordinariamente versado na técnica após leitura desta divulgação.
[0022] Como usado aqui, o termo “peso molecular” do polissacarídeo ou conjugado de polissacarídeo-proteína carreadora refere-se ao peso molecular calculado por cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) combinada com um detector de espalhamento de luz laser multiangular (MALLS).
[0023] Como usado aqui, o termo “grau de oxidação” (DO) refere- se ao número de unidades de repetição de açúcar por grupo aldeído gerado quando o polissacarídeo isolado é ativado com um agente de oxidação. O grau de oxidação de um polissacarídeo pode ser determinado usando métodos rotineiros conhecidos pela pessoa versada na técnica.
[0024] Nota-se que, nesta divulgação, termos como, por exemplo, “inclui”, “incluiu”, “incluindo”, “contém”, “contendo” e similares podem possuir o significado atribuído a eles na lei de patentes norte- americanas; por exemplo, podem significar “incluir”, “incluiu”, “incluindo” e similares. Tais termos se referem à inclusão de ingredientes ou conjuntos de ingredientes particulares sem a exclusão de quaisquer outros ingredientes. Termos como, por exemplo, “consistindo essencialmente em” e “consiste essencialmente em” possuem os significados atribuídos a eles na lei de patentes norte- americanas, por exemplo, eles permitem a inclusão de ingredientes ou etapas adicionais que não divirjam das características novas ou básicas da invenção, ou seja, eles excluem ingredientes ou etapas não citados adicionais que divirjam das características novas ou básicas da invenção. Os termos “consiste em” e “consistindo em” possuem os significados atribuídos a eles na lei de patentes norte-americanas; a saber, estes termos são fechados. De acordo com isto, estes termos se referem à inclusão de um ingrediente ou conjunto de ingredientes particulares e à exclusão de todos os outros ingredientes.
[0025] Como usado aqui, o termo “conjugados” ou “glicoconjugados” refere-se a um polissacarídeo covalentemente conjugado com uma proteína carreadora. Glicoconjugados da invenção e composições imunogênicas incluindo estas podem conter alguma quantidade de polissacarídeo livre.
[0026] Como usado aqui, o termo “glicoconjugado de serotipo 10A” ou “conjugado de serotipo 10A" refere-se a um polissacarídeo capsular de serotipo 10A de Streptococcus pneumoniae isolado covalentemente conjugado covalentemente com uma proteína carreadora.
[0027] Como usado aqui, o termo “glicoconjugado de serotipo 22F” ou “conjugado de serotipo 22F" refere-se a um polissacarídeo capsular de serotipo 22F de Streptococcus pneumoniae isolado covalentemente conjugado covalentemente com uma proteína carreadora.
[0028] Como usado aqui, o termo “glicoconjugado de serotipo 33F” ou “conjugado de serotipo 33F" refere-se a um polissacarídeo capsular de serotipo 33F de Streptococcus pneumoniae isolado covalentemente conjugado covalentemente com uma proteína carreadora.
[0029] Como usado aqui, o termo “polissacarídeo de serotipo 10A” refere-se a um polissacarídeo capsular de serotipo 10A de Streptococcus pneumoniae.
[0030] Como usado aqui, o termo “polissacarídeo de serotipo 22F” refere-se a um polissacarídeo capsular de serotipo 22F de Streptococcus pneumoniae.
[0031] Como usado aqui, o termo “polissacarídeo de serotipo 33F” refere-se a um polissacarídeo capsular de serotipo 33F de Streptococcus pneumoniae.
[0032] Como usado aqui, o termo “polissacarídeo livre” significa um polissacarídeo capsular que não está covalentemente conjugado com a proteína carreadora, mas está presente ainda assim na composição de conjugado de polissacarídeo capsular-proteína carreadora. O polissacarídeo livre pode estar não covalentemente associado com (ou seja, não covalentemente ligado a, absorvido em, ou preso em ou com) o conjugado de polissacarídeo-proteína carreadora.
[0033] A percentagem de polissacarídeo livre é medida após a purificação final do conjugado de polissacarídeo capsular de serotipo 10A, 22F ou 33F-proteína carreadora. Preferivelmente, ela é medida dentro de 4 semanas após a purificação final. Ela é expressa como uma percentagem do polissacarídeo total na amostra.
[0034] Como usado aqui, “conjugar”, “conjugado” e “conjugando” referem-se a um processo pelo qual um polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae é covalentemente ligado a uma proteína carreadora.
[0035] O termo “sujeito” refere-se a um mamífero, incluindo um humano, ou um passar, peixe, réptil, anfíbio ou qualquer outro animal. O termo “sujeito” também inclui animais de estimação e animais de pesquisa. Exemplos não limitantes de animais de estimação e animais de pesquisa incluem: cachorros, gatos, porcos, coelhos, ratos, camundongos, gerbos, hamsters, porquinhos-da-índia, furões, macacos, pássaros, cobras, lagartos, peixes, tartarugas, e sapos. O termo “sujeito” também inclui animais de pecuária. Exemplos não limitantes de animais de pecuária incluem: alpaca, bisões, camelos, gado, veados, porcos, cavalos, lhamas, mulas, burros, ovelhas, bodes, coelhos, renas, iaques, galinhas, gansos, e perus.
[0036] Na preparação de vacinas de pneumococos conjugadas multivalentes direcionadas para a prevenção de doenças invasivas causadas pelo organismo Streptococcus pneumoniae (também conhecido como pneumococo), serotipos de Streptococcus pneumoniae selecionados são cultivados para suprir polissacarídeos necessários para produzir a vacina. As células são cultivadas em fermentadores com lise induzida ao fim da fermentação pela adição de desoxiclorato de sódio ou um agente de lise alternativo. O broto de lisado é então colhido para purificação posterior e a recuperação do polissacarídeo capsular que envolve as células bacterianas. Após ativação e conjugação com uma proteína carreadora, o polissacarídeo é incluído no produto de vacina final e confere imunidade na população alvo da vacina aos serotipos de Streptococcus pneumoniae selecionados.
[0037] A imunogenicidade de um conjugado de polissacarídeo:proteína carreadora depende de vários fatores, incluindo o tamanho do polissacarídeo. O tamanho de polissacarídeo é um atributo de qualidade avaliado para cada batelada de preparação e deve ser apropriadamente controlado. Polissacarídeos capsulares de alto peso molecular são capazes de induzir certas respostas imunes de anticorpo devido a uma valência maior de epitopos presentes na superfície antigênica. É geralmente preferível prevenir ou limitar a redução indesejável do tamanho do polissacarídeo durante a preparação do conjugado para reter a imunogenicidade do polissacarídeo. Adicionalmente, é importante reduzir a variabilidade entre bateladas do Peso Molecular de polissacarídeo durante a etapa de ativação e a ativação subsequente a fim de manter a consistência de qualidade atribuída ao conjugado.
[0038] A química de aminação redutiva (RAC) foi demonstrada pelos inventores como um processo apropriado para preparo do conjugado de polissacarídeo capsular de serotipo 10A, 22F ou 33F de Streptococcus pneumoniae-carreador de proteína. A abordagem com RAC envolve a ativação do polissacarídeo por oxidação e conjugação subsequente do polissacarídeo ativado com um carreador de proteína por redução. Os polissacarídeos de serotipo 10A, 33F, e 22F se provaram como sendo polissacarídeos particularmente sensíveis e são suscetíveis à degradação e redução de tamanho durante a etapa de oxidação da preparação do conjugado. Em adição a isto, o uso do processo de ativação conhecido através desta produziu o polissacarídeo de serotipo 10A, 33F e 22F de pesos moleculares variáveis.
[0039] Então, há uma necessidade importante para um processo de preparo de polissacarídeos de serotipo 10A, 22F ou 33F de Streptococcus pneumoniae ativados possuindo um peso molecular controlado e consistente.
[0040] Um objeto da presente invenção é um processo para preparo de polissacarídeos de serotipo 10A, 22F ou 33F de Streptococcus pneumoniae ativados. Em particular, um objetivo da invenção é um processo para preparo de um polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F de Streptococcus pneumoniae ativado, tal processo incluindo as etapas de:
[0041] (a) reação do polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F isolado com um agente oxidante; e
[0042] (b) extinção da reação de oxidação pela adição de um agente de extinção resultando em um polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F de Streptococcus pneumoniae ativado.
Isolamento e purificação de polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F
[0043] As estruturas de polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F são divulgadas na literatura (veja, por exemplo, em Kamerling J P C. Pneumococcal polysaccharides: a chemical view. Em: Tomasz A, editor. Streptococcus pneumoniae, molecular biology and mechanisms of disease. New York, N.Y: Mary Ann Liebert, Inc.; 2000. págs. 81-114).
[0044] Como mostrado na Figura 1, a unidade de repetição de polissacarídeo de serotipo 22F consiste em um esqueleto de pentassacarídeo ramificado (um ácido glicurônico (GlcpA), uma glicopiranose (Glcp), uma galactofuranose (Galf) e duas ramnopiranoses (Rhap)) com uma ramificação de αGIcp ligada ao grupo C3 hidroxila de βRhap 45. Aproximadamente 80% dos grupos C2 hidroxila do resíduo de βRhap na unidade repetidora de polissacarídeo são O-acetiladas.
[0045] Como mostrado na Figura 2, a unidade repetidora de polissacarídeo do serotipo 10A consiste em duas D- galactosefuranoses, três D-galactopiranoses, uma N- acetilgalactosamina e uma ligação de fosfato ligada com cadeia de sacarídeo através de um D-ribitol.
[0046] Como mostrado na Figura 3, a unidade repetidora de serotipo 33F consiste em três D-galactopiranoses, duas D- galactofuranoses, e uma D-glicopiranose. Notavelmente, resíduos de 5-D-galactofuranosila são O-acetilados em cerca de 90% das unidades de repetição de polissacarídeo 33F.
[0047] Polissacarídeos capsulares de serotipo 10A, 22F e 33F podem ser obtidos diretamente de bactérias usando procedimentos de isolamento conhecidos para alguém versado na técnica (veja, por exemplo, os métodos divulgados nas Pub. de Ped. de Patentes Norte- Americanas Nos. 20060228380, 20060228381, 20070184071, 20070184072, 20070231340, e 20080102498 ou WO2008118752). Adicionalmente, eles podem ser produzidos usando protocolos sintéticos.
[0048] Linhagens de serotipo 10A, 22F e 33F de Streptococcus pneumoniae usadas para produzir os polissacarídeos respectivos que são usados nos conjugados imunogênicos da invenção podem ser obtidas de coleções de cultura estabelecidas ou espécimes clínicas.
[0049] Os polissacarídeos de serotipo 10A, 22F e 33F são obtidos por métodos bem conhecidos para a pessoa versada na técnica. As células bacterianas são preferivelmente cultivadas em um meio baseado em soja. Após a fermentação de células bacterianas que produzem polissacarídeos capsulares de serotipo 10A, 22F ou 33F de Streptococcus pneumoniae, as células bacterianas são lisadas para produzir um lisado celular. As células bacterianas podem ser lisadas usando qualquer agente lítico. Um “agente lítico” é qualquer agente que auxilia na quebra de parede celular e liberação de autolisina que causa lise celular incluindo, por exemplo, detergentes. Como usado aqui, o termo “detergente” refere-se a qualquer detergente aniônico ou catiônico capaz de incluir a lise de células bacterianas. Exemplos representativos de tais detergentes para uso dentro dos métodos da presente invenão incluem desoxicolato de sódio (DOC), N-lauroil sarcosina, ácido quendesoxicólico de sódio, e saponinas.
[0050] Em uma modalidade da presente invenção, o agente lítico usado para a lise de células bacterianas é DOC. DOC é o sal de sódio do ácido de bile ácido desoxicólico, que é comumente derivado de fontes biológicas, por exemplo, vacas ou bois. DOC ativa a proteína LytA, que é uma autolisina que está envolvida em crescimento de parede celular e divisão em Streptococcus pneumoniae. A proteína LytA possui domínios de ligação de coluna em sua porção C-terminal, e mutações do gene lytA são conhecidas como produtoras de mutantes de LytA que são resistentes à lise com DOC.
[0051] Em uma modalidade da presente invenção, o agente lítico usado para a lise de células bacterianas é um agente lítico derivado de não animal. Agentes líticos derivados de não animal para uso dentro dos métodos da presente invenção incluem agentes de fontes não animais com modos de ação similares àquele de DOC (ou seja, que afetam a função de LytA e resultam em lise de células de Streptococcus pneumoniae). Tais agentes líticos derivados de não animais incluem, mas não estão limitados a, análogos de DOC, tensoativos, detergentes e análogos estruturais de colina. Em uma modalidade, o agente lítico derivado de não animal é selecionado do grupo consistindo em ácido decanossulfônico, terc-octilfenóxi poli(oxietileno)etanóis (por exemplo, Igepal® CA-630, CAS #: 9002-931, disponível de Sigma Aldrich, St. Louis, MO), condensados de octil fenol óxido de etileno (por exemplo, Triton® X-100, disponível de Sigma Aldrich, St. Louis, MO), N-lauroil sarcosina de sódio, lauril iminodipropionato, dodecil sulfato de sódio, quenodesoxicolato, e colato. Em outra modalidade, o agente lítico derivado de não animal é N-lauroil sarcosina. Em outra modalidade, o agente lítico é N-lauroil sarcosina de sódio.
[0052] Os polissacarídeos capsulares podem então ser purificados do lisado celular usando técnicas de purificação conhecidas na técnica, incluindo o uso de centrifugação, filtração profunda, precipitação, ultrafiltração, tratamento com carvão ativado, diafiltração e/ou cromatografia por colunas (ver, por exemplo, nas Pub. de Apl. de Patentes Norte-Americanas Nos. 20060228380, 20060228381, 20070184071, 20070184072, 20070231340, e 20080102498 ou WO2008118752). Os polissacarídeos de serotipo 10A, 22F ou 33F purificados podem então ser usados para a preparação de conjugados imunogênicos.
[0053] Preferivelmente, a fim de gerar conjugados de serotipo 22F ou conjugados de serotipo 33F com características de filtração e/ou rendimentos vantajosos, o dimensionamento de um polissacarídeo a uma faixa de peso molecular (MW) menor é realizada antes da conjugação com uma proteína carreadora. Vantajosamente, o tamanho do polissacarídeo de serotipo 22F ou polissacarídeo de serotipo 33F purificados é reduzido enquanto preservando características críticas da estrutura do polissacarídeo como, por exemplo, a presença de grupos O-acetila. Preferivelmente, o tamanho do polissacarídeo de serotipo 22F ou polissacarídeo de serotipo 33F purificado é reduzido por homogeneização mecânica.
[0054] Em uma modalidade preferida, o tamanho do polissacarídeo purificado é reduzido por homogeneização a alta pressão. A homogeneização a alta pressão alcança altas taxas de cisalhamento pelo bombeamento da corrente de processo através de um caminho de fluxo com dimensões suficientemente pequenas. A taxa de cisalhamento é aumentada usando a aplicação de uma pressão de homogeneização maior e o tempo de exposição pode ser aumentado pela recirculação da corrente de alimentação através do homogeneizador.
[0055] O processo de homogeneização a alta pressão é particularmente apropriado para a redução do tamanho do polissacarídeo de serotipo 22F ou polissacarídeo de serotipo 33F purificados enquanto preservando as características estruturais do polissacarídeo como, por exemplo, a presença de grupos O-acetila.
[0056] O polissacarídeo de serotipo 22F isolado obtido pela purificação do polissacarídeo capsular de serotipo 22F do lisado de Streptococcus pneumoniae e dimensionamento opcional do polissacarídeo purificado pode ser caracterizado por diferentes parâmetros incluindo, por exemplo, o peso molecular e a mM do acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 22F. Em uma modalidade, o polissacarídeo de serotipo 22F dimensionado possui um peso molecular entre 400 e 700 kDa.
[0057] O polissacarídeo de serotipo 33F isolado obtido por purificação do polissacarídeo capsular de serotipo 33F do lisado de Streptococcus pneumoniae e dimensionamento opcional do polissacarídeo purificado pode ser caracterizado por diferentes parâmetros, incluindo, por exemplo, o peso molecular, e a mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 33F.
[0058] O grau de O-acetilação do polissacarídeo pode ser determinado por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, por NMR protônica (Lemercinier e Jones (1996) Carbohydrate Research 296; 83-96, Jones e Lemercinier (2002) J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30; 1233-1247), WO 05/033148 ou WO 00/56357. Outro método comumente usado é descrito em Hestrin (1949) J. Biol. Chem. 180; 249-261. Preferivelmente, a presença de grupos O-acetila é determinada por análise de íon-HPLC.
[0059] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 22F isolado é obtido por um processo incluindo as etapas de:
[0060] - preparação de uma cultura de fermentação de células bacterianas de serotipo 22F de Streptococcus pneumoniae;
[0061] - lise das células bacterianas em tal cultura de fermentação; e
[0062] - purificação de polissacarídeo de serotipo 22F da cultura de fermentação.
[0063] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 22F isolado é obtido por um processo incluindo as etapas de:
[0064] - preparação de uma cultura de fermentação de células bacterianas de serotipo 22F de Streptococcus pneumoniae;
[0065] - lise das células bacterianas em tal cultura de fermentação;
[0066] - purificação de polissacarídeo de serotipo 22F da cultura de fermentação; e
[0067] - dimensionamento do polissacarídeo de serotipo 22F por dimensionamento mecânico, preferivelmente por homogeneização a alta pressão.
[0068] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 22F isolado é obtido por um processo incluindo as etapas de:
[0069] - preparação de uma cultura de fermentação de células bacterianas de serotipo 22F de Streptococcus pneumoniae;
[0070] - lise das células bacterianas em tal cultura de fermentação;
[0071] - purificação de polissacarídeo de serotipo 22F da cultura de fermentação;
[0072] - dimensionamento do polissacarídeo de serotipo 22F por dimensionamento mecânico, preferivelmente por homogeneização a alta pressão;
[0073] em que o polissacarídeo de serotipo 22F isolado possui um peso molecular entre 400 e 700 kDa.
[0074] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 33F isolado é obtido por um processo incluindo as etapas de:
[0075] - preparação de uma cultura de fermentação de células bacterianas de serotipo 33F de Streptococcus pneumoniae;
[0076] - lise das células bacterianas em tal cultura de fermentação; e
[0077] - purificação de polissacarídeo de serotipo 33F da cultura de fermentação.
[0078] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 33F isolado é obtido por um processo incluindo as etapas de:
[0079] - preparação de uma cultura de fermentação de células bacterianas de serotipo 33F de Streptococcus pneumoniae;
[0080] - lise das células bacterianas em tal cultura de fermentação;
[0081] - purificação de polissacarídeo de serotipo 33F da cultura de fermentação; e
[0082] - dimensionamento do polissacarídeo de serotipo 33F por dimensionamento mecânico, preferivelmente por homogeneização a alta pressão.
[0083] O polissacarídeo de serotipo 10A isolado obtido pela purificação de polissacarídeo capsular de serotipo 10A do lisado de Streptococcus pneumoniae e dimensionamento opcional do polissacarídeo purificado pode ser caracterizado por diferentes parâmetros incluindo, por exemplo, o peso molecular. Preferivelmente, o polissacarídeo de serotipo 10A isolado não é dimensionado.
[0084] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 10A isolado é obtido por um processo incluindo as etapas de:
[0085] - preparação de uma cultura de fermentação de células bacterianas de serotipo 10A de Streptococcus pneumoniae;
[0086] - lise das células bacterianas em tal cultura de fermentação; e
[0087] - purificação do polissacarídeo de serotipo 10A da cultura de fermentação.
Ativação do polissacarídeo 10A, 22F ou 33F
[0088] O polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F é ativado por um processo incluindo as etapas de:
[0089] (a) reação de um polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F isolado com um agente de oxidação; e
[0090] (b) extinção da reação de oxidação pela adição de um agente de extinção resultando em um polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F de Streptococcus pneumoniae ativado.
[0091] Em uma modalidade preferida, a concentração do polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F na etapa (a) é de entre 0,1 e 10 mg/mL. Em uma modalidade preferida, a concentração de polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F na etapa (a) é de entre 0,5 e 5 mg/mL. Em uma modalidade preferida, a concentração de polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F na etapa (a) é de entre 1 e 3 mg/mL. Em uma modalidade preferida, a concentração de polissacarídeo de serotipo 22F ou 33F na etapa (a) é de cerca de 2 mg/mL. Em uma modalidade preferida, a concentração de polissacarídeo de serotipo 10Ana etapa (a) é de cerca de 2,5 mg/mL.
[0092] Em uma modalidade preferida, o agente de oxidação é periodato. Periodato oxida grupos hidroxila vizinhos para formar grupos carbonila ou aldeído e causa a clivagem de uma ligação C-C. O termo “periodato” inclui tanto periodato e ácido periódico. Este termo também inclui tanto metaperiodato (IO4-) como ortoperiodato (IO85-). O termo periodato também inclui os vários sais de periodato incluindo periodato de sódio e periodato de potássio. Em uma modalidade preferida, o agente de oxidação é periodato de sódio. Em uma modalidade preferida, o periodato usado para oxidação do polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F é metaperiodato. Em uma modalidade preferida, o periodato usado para a oxidação do polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F é metaperiodato de sódio.
[0093] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo é reagido com 0,01 a 10, 0,05 a 5, 0,1 a 1, 0,5 a 1, 0,7 a 0,8, 0,01 a 0,2, 0,05 a 0,5, 0,05 a 0,2, ou 0,1 a 0,3 equivalentes molares de agente oxidante. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo é reagido com cerca de 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, ou 0,8 equivalentes molares de agente oxidante. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo é reagido com cerca de 0,10 equivalentes molares de agente oxidante. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo é reagido com cerca de 0,15 equivalentes molares de agente oxidante. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo é reagido com cerca de 0,25 equivalentes molares de agente oxidante. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo é reagido com cerca de 0,5 equivalentes molares de agente oxidante. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo é reagido com cerca de 0,8 equivalentes molares de agente oxidante.
[0094] Em uma modalidade preferida, a duração da reação da etapa (a) é de entre 1 e 50, 1 e 40, 1 e 30, 1 e 25, 1 e 20, 1 e 10, 10 a 50, 10 a 40, 10 a 30, ou entre 10 a 20 horas. Em uma modalidade preferida, quando o polissacarídeo é um polissacarídeo de serotipo 10A, a duração da reação na etapa (a) é de entre 1 a 10 horas. Em uma modalidade preferida, quando o polissacarídeo é um polissacarídeo de serotipo 10A, a duração da reação na etapa (a) é de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 horas. Em uma modalidade preferida, quando o polissacarídeo for um polissacarídeo de serotipo 10A, a duração da reação na etapa (a) é de cerca de 4 horas. Em uma modalidade preferida, quando o polissacarídeo for um polissacarídeo de serotipo 22F, a duração da reação na etapa (a) é de cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 horas. Em uma modalidade preferida, quando o polissacarídeo for um polissacarídeo de serotipo 33F, a duração da reação na etapa (a) é de cerca de 15 a 25 horas. Em uma modalidade preferida, quando o polissacarídeo for um polissacarídeo de serotipo 33F, a duração da reação na etapa (a) é de cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 horas. Em uma modalidade preferida, quando o polissacarídeo for um polissacarídeo de serotipo 33F, a duração da reação na etapa (a) é de cerca de 20 horas.
[0095] Em uma modalidade preferida, a temperatura da reação na etapa (a) é mantida entre 1 a 30°C, 1 a 10°C, 10 a 20 C, 20 a 30°C, 2 a 8°C. Em uma modalidade preferida, a temperatura da reação na etapa (a) é mantida a cerca de 5°C.
[0096] Em uma modalidade preferida, a etapa (a) é realizada em um tampão selecionado de fosfato de sódio, fosfato de potássio, 2-(N- morfolino)ácido etanossulfônico (MES) ou Bis-Tris. Em uma modalidade preferida, a etapa (a) é realizada em tampão de fosfato de potássio. Em uma modalidade preferida, a etapa (a) é realizada em tampão de fosfato de sódio.
[0097] Em uma modalidade preferida, o tampão possui uma concentração de entre 1 a 500 mM, 1 a 300 mM, 50 a 200 mM. Em uma modalidade preferida, o tampão possui uma concentração de cerca de 100 mM.
[0098] Em uma modalidade preferida, o pH na etapa (a) é de entre 4 e 8, 5 e 7 5,5 e 6,5. Em uma modalidade preferida, o pH na etapa (a) é de cerca de 6. Em uma modalidade preferida, o pH na etapa (a) é de cerca de 5,8.
[0099] Em uma modalidade, o agente de extinção é selecionado de dióis vicinais, 1,2-aminoálcoois, aminoácidos, glutationa, sulfito, bissulfato, ditionito, metabissulfito, tiossulfato, fosfitos, hipofosfitos ou ácido fosforoso.
[00100] Em uma modalidade, o agente de extinção é um 1,2- aminoálcool de fórmula
[00101] em que R1 é selecionado de H, metila, etila, propila ou isopropila.
[00102] Em uma modalidade, o agente de extinção é selecionado de sais de sódio e potássio de sulfito, bissulfato, ditionito, metabissulfito, tiossulfato, fosfitos, hipofosfitos ou ácido fosforoso.
[00103] Em uma modalidade, o agente de extinção é um aminoácido. Em uma modalidade, tal aminoácido é selecionado de serina, treonina, cisteína, cistina, metionina, prolina, hidroxiprolina, triptofano, tirosina e histidina.
[00104] Em uma modalidade, o agente de extinção é um sulfito como, por exemplo, bissulfato, ditinito, metabissulfito, ou tiossulfato.
[00105] Em uma modalidade, o agente de extinção é um composto incluindo dois grupos hidroxila vicinais (dióis vicinais), ou seja, dois grupos hidroxila covalentemente ligados a dois átomos de carbono adjacentes.
[00106] Preferivelmente, o agente de extinção é um composto de fórmula (II)
[00107] em que R1 e R2 são cada um independentemente selecionados de H, metila, etila, propila ou isopropila.
[00108] Em uma modalidade preferida, o agente de extinção é glicerol, etileno glicol, propano-1,2-diol, butan-1,2-diol ou butan-2,3- diol, ou ácido ascórbico. Em uma modalidade preferida, o agente de extinção é butan-2,3-diol.
[00109] Em uma modalidade preferida, o agente de oxidação é neutralizado pela adição de 0,1 a 10, 0,5 a 5, 0,5 a 3, ou 0,5 a 2 equivalentes molares de agente de extinção. Em uma modalidade preferida, o agente de oxidação é neutralizado pela adição de cerca de 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, ou 3 equivalentes molares de agente de extinção. Em uma modalidade preferida, o agente de oxidação é neutralizado pela adição de cerca de 2 equivalentes molares de agente de extinção.
[00110] Em uma modalidade preferida, a duração da etapa (b) é de entre 0,1 e 10, 0,5 e 5, ou entre 0,5 e 2 horas. Em uma modalidade preferida, a duração da etapa (b) é de cerca de 0,5, 1, 1,5, 2,5 ou 3 horas.
[00111] Em uma modalidade preferida, a temperatura da reação na etapa (b) é mantida entre 1 e 30°C, 1 e 25°C, 1 e 20°C, 1 e 10°C, 10 e 20°C, ou entre 2 e 8°C. Em uma modalidade preferida, a temperatura da reação na etapa (b) é mantida a cerca de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8°C.
[00112] Em uma modalidade preferida, o pH da etapa (b) está entre 4 e 8, 5 e 7, ou 5,5 e 6,5. Em uma modalidade preferida, o pH na etapa (a) é de cerca de 6.
[00113] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado é purificado. O polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado pode ser purificado de acordo com métodos conhecidos para a pessoa versada na técnica como, por exemplo, cromatografia por permeação em gel (GPC), diálise ou ultrafiltração/diafiltração. Por exemplo, o polissacarídeo ativado é purificado por concentração e diafiltração usando um dispositivo de ultrafiltração.
[00114] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 10A isolado é ativado por um processo incluindo as etapas de:
[00115] (a) reação do polissacarídeo de serotipo 10A isolado com periodato; e
[00116] (b) extinção da reação de oxidação pela adição de butan- 2,3-diol resultando em um polissacarídeo de serotipo 10A ativado.
[00117] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 10A isolado é ativado por um processo incluindo as etapas de:
[00118] (a) reação do polissacarídeo de serotipo 10A isolado com periodato a uma temperatura entre 2 e 8°C; e
[00119] (b) extinção da reação de oxidação pela adição de butan- 2,3-diol a uma temperatura entre 2 e 8°C resultando em um polissacarídeo de serotipo 10A ativado.
[00120] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 10A isolado é ativado por um processo incluindo as etapas de:
[00121] (a) reação do polissacarídeo de serotipo 10A isolado com 0,2 a 0,3 equivalentes molares de periodato a uma temperatura entre 2 e 8°C; e
[00122] (b) extinção da reação de oxidação pela adição de 0,5 a 2 equivalentes molares de butan-2,3-diol a uma temperatura entre 2 e 8°C resultando em um polissacarídeo de serotipo 10A ativado.
[00123] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 22F isolado é ativado por um processo incluindo as etapas de:
[00124] (a) reação do polissacarídeo de serotipo 22F isolado com periodato; e
[00125] (b) extinção da reação de oxidação pela adição de butan- 2,3-diol resultando em um polissacarídeo de serotipo 22F ativado.
[00126] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 22F isolado é ativado por um processo incluindo as etapas de:
[00127] (a) reação do polissacarídeo de serotipo 22F isolado com periodato a uma temperatura entre 2 e 8°C; e
[00128] (b) extinção da reação de oxidação pela adição de butan- 2,3-diol a uma temperatura entre 2 e 8°C resultando em um polissacarídeo de serotipo 22F ativado.
[00129] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 22F isolado é ativado por um processo incluindo as etapas de:
[00130] (a) reação do polissacarídeo de serotipo 22F isolado com 0,05 a 0,2 equivalentes molares de periodato a uma temperatura entre 2 e 8°C; e
[00131] (b) extinção da reação de oxidação pela adição de 2 a 3, preferivelmente 2, equivalentes molares de butan-2,3-diol a uma temperatura entre 2 e 8°C resultando em um polissacarídeo de serotipo 22F ativado.
[00132] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 33F isolado é ativado por um processo incluindo as etapas de:
[00133] (a) reação do polissacarídeo de serotipo 33F isolado com periodato; e
[00134] (b) extinção da reação de oxidação pela adição de butan- 2,3-diol resultando em um polissacarídeo de serotipo 33F ativado.
[00135] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 33F isolado é ativado por um processo incluindo as etapas de:
[00136] (a) reação do polissacarídeo de serotipo 33F isolado com periodato a uma temperatura entre 2 e 8°C; e
[00137] (b) extinção da reação de oxidação pela adição de butan- 2,3-diol a uma temperatura entre 2 e 8°C resultando em um polissacarídeo de serotipo 33F ativado.
[00138] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 33F isolado é ativado por um processo incluindo as etapas de:
[00139] (a) reação do polissacarídeo de serotipo 33F isolado com 0,05 a 0,2 equivalentes molares de periodato a uma temperatura entre 2 e 8°C; e
[00140] (b) extinção da reação de oxidação pela adição de 0,5 a 1,5 equivalentes molares de butan-2,3-diol a uma temperatura entre 2 e 8°C resultando em um polissacarídeo de serotipo 33F ativado.
[00141] Em uma modalidade preferida, a invenção refere-se a um polissacarídeo capsular de serotipo 10A ativado obtido ou obtenível pelo processo divulgado acima.
[00142] Em uma modalidade preferida, a invenção refere-se a um polissacarídeo capsular de serotipo 22F ativado obtido ou obtenível pelo processo divulgado acima.
[00143] Em uma modalidade preferida, a invenção refere-se a um polissacarídeo capsular de serotipo 33F ativado obtido ou obtenível pelo processo divulgado acima.
[00144] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 10A ativado obtido da etapa (b) possui peso molecular entre 20 e 100%, 30 e 95%, 40 e 95%, 60 a 95%, 85 a 95%, ou cerca de 90%, do peso molecular do polissacarídeo isolado usado na etapa (a).
[00145] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 10A ativado obtido da etapa (b) possui um peso molecular de pelo menos 20, 25, 30, 35, 40 ou 45% do peso molecular do polissacarídeo isolado usado na etapa (a). Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 10A ativado obtido da etapa (b) possui um peso molecular de pelo menos 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% do peso molecular do polissacarídeo isolado usado na etapa (a).
[00146] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 22F ativado obtido da etapa (b) possui peso molecular entre 50 e 100%, 60 e 95%, 85 e 95%, ou cerca de 90%, do peso molecular do polissacarídeo isolado usado na etapa (a).
[00147] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 22F ativado obtido da etapa (b) possui um peso molecular de pelo menos 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% do peso molecular do polissacarídeo isolado usado na etapa (a).
[00148] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 33F ativado obtido da etapa (b) possui peso molecular entre 50 e 100%, 60 e 95%, 85 e 95%, ou cerca de 90%, do peso molecular do polissacarídeo isolado usado na etapa (a).
[00149] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 33F ativado obtido da etapa (b) possui um peso molecular de pelo menos 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% do peso molecular do polissacarídeo isolado usado na etapa (a).
[00150] Em uma modalidade preferida, o grau de oxidação do polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado está entre 2 e 30, 2 e 25, 2 e 20, 2 e 15, 2 e 10, 2 e 5, 5 e 30, 5 e 25, 5 e 20, 5 e 15, 5 e 10, 10 e 30, 10 e 25, 10 e 20, 10 e 15, 5 e 25, 10 e 30, 15 e 30, 15 e 25, 15 e 20, 20 a 30, ou de 20 a 25. Em uma modalidade preferida, o grau de oxidação do polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado está entre 2 e 10, 4 e 8, 4 e 6, 6 e 8, 6 e 12, 8 e 14, 9 e 11, 10 e 16, 12 e 16, 14 e 18, 16 e 20, 16 e 18, 18 e 22, ou entre 18 e 20.
[00151] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 10A ativado possui um peso molecular entre 50 e 400, 50 e 350, 50 e 300, 50 e 250, 50 e 200, 100 e 300, 100 e 250 ou entre 100 e 200 kDa. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 10A ativado possui um peso molecular entre 50 e 300 kDa. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 10A ativado possui um peso molecular entre 100 e 200 kDa. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 10A ativado possui um peso molecular entre 100 e 200 kDa e um grau de oxidação entre 5 e 20, 5 e 15, 8 e 14, 8 e 12 ou entre 9 e 11. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 10A ativado possui um peso molecular entre 100 e 200 kDa e um grau de oxidação entre 9 e 11.
[00152] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 22F ativado possui um peso molecular entre 25 e 1000, 100 e 1000, 300 e 800, 300 e 700, 300 e 600, 400 e 1000, 400 e 800, 400 e 700 ou entre 400 e 600 kDa. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 22F ativado possui um peso molecular entre 300 e 800 kDa. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 22F ativado possui um peso molecular entre 400 e 800 kDa. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 22F ativado possui um peso molecular entre 400 e 600 kDa. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 22F ativado possui um peso molecular entre 400 e 800 kDa e um grau de oxidação entre 10 e 25, 10 e 20, 12 e 20 ou entre 14 e 18. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 22F ativado possui um peso molecular entre 400 e 800 kDa e um grau de oxidação entre 10 e 20.
[00153] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 22F ativado inclui pelo menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 ou cerca de 0,8 mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 22F. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 22F ativado inclui pelo menos 0,5, 0,6 ou 0,7 mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 22F. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 22F ativado inclui pelo menos 0,6 mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 22F. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 22F ativado inclui pelo menos 0,7 mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 22F.
[00154] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 22F ativado possui um peso molecular entre 400 e 800 kDa e inclui pelo menos 0,6 mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 22F.
[00155] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 22F ativado possui um peso molecular entre 400 e 800 kDa, um grau de oxidação entre 12 e 20, e inclui pelo menos 0,6 mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 22F.
[00156] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 33F ativado possui um peso molecular entre 50 e 1250, 200 e 1200, 500 e 1200, 500 e 1000, 700 e 1200, 800 e 1200, 800 e 1100, 900 e 1200, ou entre 800 e 1000 kDa. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 33F ativado possui um peso molecular entre 500 e 1000 kDa. Em outra modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 33F ativado possui um peso molecular entre 50 e 600, 50 e 500 ou entre 50 e 400 kDa.
[00157] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 33F ativado inclui pelo menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 ou cerca de 0,9 mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 33F. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 33F ativado inclui pelo menos 0,6, 0,7 ou 0,8 mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 33F. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 33F ativado inclui pelo menos 0,6 mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 33F. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 33F ativado inclui pelo menos 0,7 mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 33F.
[00158] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 33F ativado possui um peso molecular entre 800 e 1200 kDa e inclui pelo menos 0,7 mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 33F. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 33F ativado possui um peso molecular entre 800 e 1200 kDa, inclui pelo menos 0,7 mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 33F e possui um grau de oxidação entre 10 e 20.
[00159] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 33F ativado possui um peso molecular entre 50 e 200 kDa e inclui pelo menos 0,7 mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 33F.
[00160] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 33F ativado possui um peso molecular entre 50 e 200 kDa e inclui pelo menos 0,7 mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 33F e possui um grau de oxidação entre 10 e 20.
[00161] Em uma modalidade, o polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado é liofilizado, opcionalmente na presença de um crioprotetor/lioprotetor. Em uma modalidade preferida, o crioprotetor/lioprotetor é selecionado de sacarose, trealose, rafinose, estaquiose, melezitose, dextrana, manitol, lactitol e palatinit. Em uma modalidade preferida, o crioprotetor/lioprotetor é sacarose. O polissacarídeo liofilizado ativado pode então ser composto com uma solução incluindo a proteína carreadora.
[00162] Em outra modalidade, o polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado é composto com a proteína carreadora e liofilizado opcionalmente na presença de um crioprotetor/lioprotetor. Em uma modalidade preferida, o crioprotetor/lioprotetor é selecionado de sacarose, trealose, rafinose, estaquiose, melezitose, dextrana, manitol, lactitol e palatinit. Em uma modalidade preferida, o crioprotetor/lioprotetor é sacarose. O polissacarídeo coliofilizado e a proteína carreadora podem ser então ressuspensas em solução e reagidas com um agente redutor.
[00163] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um polissacarídeo de serotipo 10A ativado liofilizado. Em uma modalidade, a invenção refere-se a um polissacarídeo de serotipo 22F ativado liofilizado. Em uma modalidade, a invenção refere-se a um polissacarídeo de serotipo 33F ativado liofilizado.
[00164] Em uma modalidade, a invenção refere-se ao polissacarídeo de serotipo 10A ativado coliofilizado e a um carreador de proteína. Em uma modalidade preferida, o carreador de proteína é CRM197.
[00165] Em uma modalidade, a invenção refere-se ao polissacarídeo de serotipo 22F ativado coliofilizado e a um carreador de proteína. Em uma modalidade preferida, o carreador de proteína é CRM197.
[00166] Em uma modalidade, a invenção refere-se ao polissacarídeo de serotipo 33F ativado coliofilizado e a um carreador de proteína. Em uma modalidade preferida, o carreador de proteína é CRM197.
Conjugação de polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado com uma proteína carreadora
[00167] O polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado divulgado aqui pode ser conjugado com uma proteína carreador por um processo incluindo as etapas de:
[00168] (a) composição do polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado com uma proteína carreadora; e
[00169] (b) reação do polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado e proteína carreadora com um agente de redução para formar um conjugado de polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F:proteína carreadora.
[00170] A conjugação do polissacarídeo de serotipo 22F ou 33F ativado com um carreador de proteína por aminação redutiva em dimetilsulfóxido (DMSO) é apropriada para preservar o conteúdo de O- acetila do polissacarídeo quando comparado, por exemplo, à aminação redutiva em fase aquosa em que o nível de O-acetilação do polissacarídeo é significantemente reduzido. Em uma modalidade preferida, a etapa (a) e a etapa (b) são realizadas em DMSO.
[00171] Em uma modalidade preferida, a etapa (a) inclui a dissolução do polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F liofilizado em uma solução aquosa incluindo uma proteína carreadora ou em uma solução incluindo uma proteína carreadora e DMSO. Em uma modalidade preferida, a etapa (a) inclui a dissolução de polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F coliofilizado e proteína carreadora em uma solução aquosa ou em DMSO.
[00172] Quando a etapa (a) e (b) forem realizadas em uma solução aquosa, tal solução inclui um tampão, preferivelmente selecionado de tampão, preferivelmente selecionado de PBS, MES, HEPES, Bis-tris, ADA, PIPES. MOPSO, BES, MOPS, DIPSO, MOBS, HEPPSO, POPSO, TEA, EPPS, Bicina ou HEPB, em um pH entre 6,0 e 8,5, 7 e 8 ou entre 7 e 7,5. Em uma modalidade preferida, o tampão é PBS. Em uma modalidade preferida, o pH é cerca de 7,3.
[00173] Em uma modalidade preferida, a concentração de polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado na etapa (a) é de entre 0,1 e 10 mg/mL, 0,5 e 5 mg/mL, ou entre 0,5 e 2 mg/mL. Em uma modalidade preferida, a concentração de polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado na etapa (a) é de cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 ou 3 mg/mL.
[00174] Em uma modalidade preferida, a razão inicial (em peso) de polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado para proteína carreadora está entre 5:1 e 0,1:1, 2:1 e 0,1:1, 2:1 e 1:1, 1,5:1 e 1:1, 0,1:1 e 1:1, 0,3:1 e 1:1, ou entre 0,6:1 e 1:1,2. Em uma modalidade preferida, a razão inicial de polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado para proteína carreadora é de cerca de 0,6:1 e 1:1,2. Em uma modalidade preferida, a razão inicial de polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado para proteína carreadora é de cerca de 0,4:1, 0,5:1, 0,6:1, 0,7:1, 0,8:1, 0,9:1, 1:1, 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1, 1,6:1, 1,7:1, 1,8:1, 1,9:1, ou 2:1.
[00175] Em uma modalidade preferida, na etapa (b), o polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado é reagido com entre 0,1 e 10 equivalentes molares, 0,5 e 5 equivalentes molares, ou entre 0,5 e 2,5 equivalentes molares de agente redutor. Em uma modalidade preferida, na etapa (b), o polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado é reagido com cerca de 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4 ou 2,5 equivalentes molares de agente redutor.
[00176] Em uma modalidade, o agente redutor é cianoboroidreto de sódio, triacetoxiboroidreto de sódio, boroidreto de sódio ou zinco na presença de ácidos de Bronsted ou Lewis, boranos de amina como, por exemplo, borano de piridina, borano de 2-picolina, 2,6-diborano- metanol, dimetilamina-borano, t-BuMeiPrN-BH3, benzilamina-BH3 ou 5- etil-2-metilpiridina borano (PEMB). Em uma modalidade preferida, o agente redutor é cianoboroidreto de sódio.
[00177] Em uma modalidade preferida, a duração da etapa (b) é de entre 1 e 50, 5 e 30, 10 e 30, 15 e 30, 20 e 30, 5 e 25, 10 e 25, ou entre 15 e 25 horas. Em uma modalidade preferida, a duração da etapa (b) é de cerca de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, ou 28 horas.
[00178] Em uma modalidade preferida, a temperatura da reação na etapa (b) é mantida entre 10 e 40°C, 15 e 30°C, 20 e 26°C, ou entre 21 e 25°C. Em uma modalidade preferida, a temperatura de reação na etapa (b) é mantida em cerca de 21,22, 23, 24 ou 25°C.
[00179] Em uma modalidade preferida, o processo para a preparação de um conjugado imunogênico incluindo polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F covalentemente ligado a uma proteína carreadora inclui adicionalmente uma etapa (etapa c) de terminação de aldeído não reagido (extinção) por adição de NaBH4.
[00180] Em uma modalidade preferida, na etapa (c), os aldeídos não reagidos são terminados pela adição de 0,1 a 10 equivalentes molares, 0,5 a 5 equivalentes molares ou 1 a 3 equivalentes molares de NaBH4. Em uma modalidade preferida, na etapa (c), os aldeídos não reagidos são terminados pela adição de cerca de 2 equivalentes molares de NaBH4.
[00181] Em uma modalidade preferida, a duração da etapa (c) é de entre 0,1 e 10, 0,5 e 5 ou entre 2 e 4 horas. Em uma modalidade preferida, a duração da etapa (c) é de cerca de 3 horas.
[00182] Em uma modalidade preferida, a temperatura de reação da etapa (c) é mantida entre 10 e 40°C, 15 e 30°C ou entre 20 e 26°C. Em uma modalidade preferida, a temperatura de reação na etapa (c) é mantida em cerca de 23°C.
[00183] Após conjugação do polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F com a proteína carreadora, o conjugado de polissacarídeo- proteína pode ser purificado (enriquecido com respeito à quantidade de conjugado de polissacarídeo-proteína) por uma variedade de técnicas conhecidas pela pessoa versada. Estas técnicas incluem diálise, operações de concentração/diafiltração, precipitação/eluição de filtração por fluxo tangencial, cromatografia por colunas (DEAE ou cromatografia de interação hidrofóbica), e filtração profunda.
[00184] Em uma modalidade preferida, a proteína carreadora não é tóxica, não é reatogênica e é obtenível em quantidade e pureza suficientes. Proteínas carreadoras devem ser amistosas a procedimentos de conjugação padrão.
[00185] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado é conjugado com uma proteína carreadora que é selecionada do grupo consistindo em: DT (toxina de difteria), TT (toxoide de tétano) ou o fragmento C de TT, CRM197 (uma variante não tóxica, mas antigenicamente idêntica de toxina de difteria), outros mutantes pontuais de DT como, por exemplo, CRM176, CRM228, CRM 45 (Uchida et al J. BioI. Chem. 218; 3838-3844, 1973); CRM 9, CRM102, CRM 103 e CRM107, e outras mutações descritas por Nicholls e Youle em Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; exclusão ou mutação de Glu-148 para Asp, Gln ou Ser e/ou Ala 158 para Gly e outras mutações divulgadas em US 4709017 ou US 4950740; mutação de pelo menos um ou mais resíduos de Lys 516, Lys 526, Phe 530 e/ou Lys 534, e outras mutações divulgadas em US 5917017 ou US 6455673; ou fragmento divulgado em US 5843711, pneumosina de pneumococo (Kuo et al (1995) Infect Immun 63; 2706-13), incluindo as detoxificadas por ply de alguma maneira, por exemplo, dPLY-GMBS (WO 04081515, PCT/EP2005/010258) ou dPLY-formol, PhtX, incluindo PhtA, PhtB, PhtD, PhtE (sequências de PhtA, PhtB, PhtD ou PhtE são divulgadas em WO 00/37105 ou WO 00/39299) e fusões de proteínas Pht, por exemplo, fusões de PhtDE, fusões de PhtBE, Pht A-E (WO 01/98334, WO 03/54007, W02009/000826), OMPC (proteína de membrana externa de meningococo - geralmente extraída de N.meningitidis, serogrupo B - EP0372501), PorB (de N. meningitidis), PD (proteína D de hemófilo de influenza - ver, por exemplo EP 0 594 610 B), ou equivalentes imunologicamente funcionais destes, peptídeos sintéticos (EP0378881, EP0427347), proteínas de choque térmico (WO 93/17712, WO 94/03208), proteínas de pertussis (WO 98/58668, EP0471 177), citocinas, linfoquinas, fatores ou hormônios de crescimento (WO10 91/01146), proteínas artificiais incluindo múltiplos epitopos de células-T CD4+ humanas de vários antígenos derivados de patógenos (Falugi et al (2001) Eur J Immunol 31 ; 3816-3824) como, por exemplo, a proteína N19 (Baraldoi et al (2004) Infect Immun 72; 4884-7), a proteína de superfície de pneumococo PspA (WO 02/091998), proteínas de acúmulo de ferro (WO 01/72337), toxina A ou B de C. difficile (WO 00/61761). Em uma modalidade, o polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado é conjugado com TT (toxoide de tétano). Em outra modalidade, o polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado é conjugado com um fragmento C de TT. Em outra modalidade, o polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado é conjugado com PD (proteína D de hemófilo de influenza - ver, por exemplo EP 0 594 610 B).
[00186] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado é conjugado com a proteína CRM197. A proteína CRM197 é uma forma não tóxica da toxina de difteria, mas é imunologicamente indistinguível da toxina de difteria. CRM197 é produzida por C. diphtheria infectado pelo fago não toxigênico □197tox- criado por mutagênese de nitrosoguanidina do corinefago beta toxinogênico (Uchida, T. et al. 1971, Nature New Biology 233:8-11). CRM197 é purificada através de ultrafiltração, precipitação com sulfato de amônio, e cromatografia por troca iônica. A proteína CRM197 possui o mesmo peso molecular que a toxina de difteria, mas se difere desta por uma única troca de bases (guanidina para adenina) no gene estrutural. Esta única troca de bases causa a substituição de aminoácido ácido glutâmico por glicina na proteína madura e elimina as propriedades tóxicas da toxina de difteria. A proteína CRM197 é um carreador dependente de células-T seguro e eficiente para sacarídeos. Detalhes adicionais com respeito à CRM197 e à produção desta podem ser encontrados, por exemplo, em US 5.614.382.
[00187] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado divulgado aqui é conjugado com CRM197 por um processo incluindo as etapas de:
[00188] (a) composição do polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado com CRM197;
[00189] (b) reação do polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado composto e CRM197 com cianoboroidreto de sódio para formar um conjugado de polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F:CRM197.
[00190] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado divulgado aqui é conjugado com CRM197 por um processo incluindo as etapas de:
[00191] (a) composição do polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado com CRM197;
[00192] (b) reação do polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado composto e CRM197 com cianoboroidreto de sódio para formar um conjugado de polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F:CRM197;
[00193] em que as etapas (a) e (b) são realizadas em DMSO.
[00194] Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado divulgado aqui é conjugado com CRM197 por um processo incluindo as etapas de:
[00195] (a) composição do polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado com CRM197;
[00196] (b) reação do polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado composto e CRM197 com 0,5 a 2 equivalentes molares de cianoboroidreto de sódio para formar um conjugado de polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F:CRM197;
[00197] em que as etapas (a) e (b) são realizadas em DMSO.
[00198] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um conjugado imunogênico obtido ou obtenível por um processo divulgado aqui. Em uma modalidade preferida, a invenção refere-se a um conjugado imunogênico obtido ou obtenível pela conjugação de um polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado como divulgado aqui com uma pro-teína carreadora por aminação redutiva. Em uma modalidade preferida, a invenção refere-se a um conjugado imunogênico obtido ou obtenível pela conjugação de um polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado como divulgado aqui com uma proteína carreadora por aminação redutiva em DMSO. Em uma modalidade preferida, a proteína carreadora é CRM197.
Conjugado imunogênico de serotipo 10A
[00199] Em uma modalidade preferida, o conjugado imunogênico de serotipo 10A possui um peso molecular entre 500 e 15000; 500 e 10000; 2000 e 10000; ou entre 3000 e 8000 kDa. Em uma modalidade preferida, o conjugado imunogênico de serotipo 10A possui um peso molecular entre 3000 e 8000 kDa. O peso molecular do conjugado imunogênico é medido por SEC-MALLS.
[00200] Em uma modalidade preferida, o conjugado imunogênico de serotipo 10A inclui menos de cerca de 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20 ou 15% de polissacarídeo de serotipo 10A livre quando comparado com a quantidade total de polissacarídeo de serotipo 10A. Em uma modalidade preferida, o conjugado imunogênico de serotipo 10A inclui menos de cerca de 25% de polissacarídeo de serotipo 10A livre quando comparado com a quantidade total de polissacarídeo de serotipo 10A. Em uma modalidade preferida, o conjugado imunogênico de serotipo 10A inclui menos de cerca de 20% de polissacarídeo de serotipo 10A livre quando comparado com a quantidade total de polissacarídeo de serotipo 10A. Em uma modalidade preferida, o conjugado imunogênico de serotipo 10A inclui menos de cerca de 15% de polissacarídeo de serotipo 10A livre quando comparado com a quantidade total de polissacarídeo de serotipo 10A.
[00201] Em uma modalidade preferida, a razão (em peso) de polissacarídeo de serotipo 10A para proteína carreadora no conjugado é de entre 0,5 e 3. Em uma modalidade preferida, a razão de polissacarídeo de serotipo 10A para proteína carreadora no conjugado é de entre 0,5 e 2, 0,5 e 1,5, 0,5 e 1, 1 e 1,5, ou entre 1 e 2. Em uma modalidade preferida, a razão de polissacarídeo de serotipo 10A para proteína carreadora no conjugado é de entre 0,8 e 1,4. Em uma modalidade preferida, a razão de polissacarídeo capsular de serotipo 10A para proteína carreadora no conjugado é de entre 0,8 e 1,2.
[00202] Meios de cromatografia por exclusão de tamanho (CL-4B) podem ser usados para determinar a distribuição de tamanho molecular no conjugado. Cromatografia por Exclusão de Tamanho (SEC) é usada em colunas alimentadas por gravidade para se obter o perfil de distribuição de tamanho molecular dos conjugados. Grandes moléculas excluídas dos poros nos meios eluem mais rapidamente que moléculas pequenas. Coletores de fração são usados para coletar o eluído da coluna. As frações são testadas colorimetricamente por ensaio com sacarídeos. Para a determinação de Kd, as colunas são calibradas para estabelecer a fração em que as moléculas são totalmente excluídas (V0), (Kd=0), e a fração representando a retenção máxima (Vi), (Kd=1). A fração em que um atributo de amostra especificado é alcançada (Ve), está relacionada ao Kd pela expressão Kd = (Ve - Vo)/ (Vi-Vo).
[00203] Em uma modalidade preferida, pelo menos 30% do conjugado imunogênico de serotipo 1oA possui um Kd menor ou igual a o,3 em uma coluna de CL-4B. Em uma modalidade preferida, pelo menos 4o% do conjugado imunogênico possui um Kd abaixo ou igual a o,3 em uma coluna de CL-4B. Em uma modalidade preferida, pelo menos 45%, 5o%, 55%, 6o%, 65%, 7o%, 75%, 8o%, ou 85% do conjugado imunogênico de serotipo 1oA possui um Kd abaixo ou igual a o,3 em uma coluna de CL-4B. Em uma modalidade preferida, pelo menos 6o% do conjugado imunogênico de serotipo 1oA possui um Kd abaixo ou igual a o,3 em uma coluna de CL-4B. Em uma modalidade preferida, entre 5o% e 8o% do conjugado imunogênico de serotipo 10A possui um Kd abaixo ou igual a 0,3 em uma coluna de CL-4B.
[00204] O grau de conjugação é o número de resíduos de lisina na proteína carreadora que são conjugados com o polissacarídeo de interesse. A evidência para modificação de lisina da proteína carreadora, devido às ligações covalentes aos polissacarídeos, é obtida por análise de aminoácidos usando métodos de rotina conhecidos por aqueles versados na técnica. A conjugação resulta em uma redução no número de resíduos de lisina recuperados quando comparado com a matéria-prima de proteína CRM197 usada para gerar os materiais conjugados.
[00205] Em uma modalidade preferida, o grau de conjugação o conjugado imunogênico está entre 2 e 15, 2 e 13, 2 e 10, 2 e 8, 2 e 6, 2 e 5, 2 e 4, 3 e 15, 3 e 13, 3 e 10, 3 e 8, 3 e 6, 3 e 5, 3 e 4, 5 e 15, 5 e 10, 8 e 15, 8 e 12, 10 e 15 ou entre 10 e 12. Em uma modalidade preferida, o grau de conjugação do conjugado imunogênico está entre 6 e 8.
Conjugado imunogênico de serotipo 22F
[00206] Em uma modalidade preferida, o conjugado imunogênico inclui pelo menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 ou cerca de 0,8 mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 22F. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 22F ativado inclui pelo menos 0,5, 0,6 ou 0,7 mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 22F. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 22F ativado inclui pelo menos 0,6 mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 22F. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 22F ativado inclui pelo menos 0,7 mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 22F.
[00207] Em uma modalidade preferida, a razão de mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 22F no conjugado imunogênico para mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 22F no polissacarídeo isolado é de pelo menos 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, ou 0,95. Em uma modalidade preferida, a razão de mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 22F no conjugado imunogênico para mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 22F no polissacarídeo isolado é de pelo menos 0,7. Em uma modalidade preferida, a razão de mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 22F no conjugado imunogênico para mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 22F no polissacarídeo isolado é de pelo menos 0,9.
[00208] Em uma modalidade preferida, a razão de mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 22F no conjugado imunogênico para mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 22F no polissacarídeo ativado é de pelo menos 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, ou 0,95. Em uma modalidade preferida, a razão de mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 22F no conjugado imunogênico para mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 22F no polissacarídeo ativado é de pelo menos 0,7. Em uma modalidade preferida, a razão de mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 22F no conjugado imunogênico para mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 22F no polissacarídeo ativado é de pelo menos 0,9.
[00209] Em uma modalidade preferida, o conjugado imunogênico de serotipo 22F possui um peso molecular entre 400 e 15000; 500 e 10000; 2000 e 10000 kDa; 3000 e 8000 kDa; ou entre 3000 e 5000 kDa. Em uma modalidade preferida, o conjugado imunogênico de serotipo 22F possui um peso molecular entre 3000 e 5000 kDa. O peso molecular do conjugado imunogênico é medido por SEC-MALLS.
[00210] Em uma modalidade preferida, o conjugado imunogênico de serotipo 22F inclui menos de cerca de 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20 ou 15% de polissacarídeo de serotipo 22F livre quando comparado com a quantidade total de polissacarídeo de serotipo 22F. Em uma modalidade preferida, o conjugado imunogênico de serotipo 22F inclui menos de cerca de 40% de polissacarídeo de serotipo 22F livre quando comparado com a quantidade total de polissacarídeo de serotipo 22F. Em uma modalidade preferida, o conjugado imunogênico de serotipo 22F inclui menos de cerca de 25% de polissacarídeo de serotipo 22F livre quando comparado com a quantidade total de polissacarídeo de serotipo 22F. Em uma modalidade preferida, o conjugado imunogênico de serotipo 22F inclui menos de cerca de 20% de polissacarídeo de serotipo 22F livre quando comparado com a quantidade total de polissacarídeo de serotipo 22F. Em uma modalidade preferida, o conjugado imunogênico de serotipo 22F inclui menos de cerca de 15% de polissacarídeo de serotipo 22F livre quando comparado com a quantidade total de polissacarídeo de serotipo 22F.
[00211] Em uma modalidade preferida, a razão (em peso) de polissacarídeo de serotipo 22F para proteína carreadora no conjugado é de entre 0,5 e 3. Em uma modalidade preferida, a razão de polissacarídeo de serotipo 22F para proteína carreadora no conjugado é de entre 0,5 e 2, 0,5 e 1,5, 0,8 e 1,2, 0,5 e 1, 1 e 1,5 ou entre 1 e 2. Em uma modalidade preferida, a razão de polissacarídeo de serotipo 22F para pro-teína carreadora no conjugado é de entre 0,8 e 1,2. Em uma modalidade preferida, a razão de polissacarídeo capsular de serotipo 22F para proteína carreadora no conjugado é de entre 0,9 e 1,1.
[00212] Em uma modalidade preferida, pelo menos 30% do conjugado imunogênico de serotipo 22F possui um Kd menor ou igual a 0,3 em uma coluna de CL-4B. Em uma modalidade preferida, pelo menos 40% do conjugado imunogênico possui um Kd abaixo ou igual a 0,3 em uma coluna de CL-4B. Em uma modalidade preferida, pelo menos 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, ou 85% do conjugado imunogênico de serotipo 22F possui um Kd abaixo ou igual a 0,3 em uma coluna de CL-4B. Em uma modalidade preferida, pelo menos 60% do conjugado imunogênico de serotipo 22F possui um Kd abaixo ou igual a 0,3 em uma coluna de CL-4B. Em uma modalidade preferida, entre 50% e 80% do conjugado imunogênico de serotipo 22F possui um Kd abaixo ou igual a 0,3 em uma coluna de CL-4B. Em uma modalidade preferida, entre 65% e 80% do conjugado imunogênico de serotipo 22F possui um Kd abaixo ou igual a 0,3 em uma coluna de CL-4B.
[00213] Em uma modalidade preferida, o grau de conjugação o conjugado imunogênico está entre 2 e 15, 2 e 13, 2 e 10, 2 e 8, 2 e 6, 2 e 5, 2 e 4, 3 e 15, 3 e 13, 3 e 10, 3 e 8, 3 e 6, 3 e 5, 3 e 4, 4 e 7, 5 e 15, 5 e 10, 8 e 15, 8 e 12, 10 e 15 ou entre 10 e 12. Em uma modalidade preferida, o grau de conjugação do conjugado imunogênico está entre 4 e 7.
Conjugado imunogênico de serotipo 33F
[00214] Em uma modalidade preferida, o conjugado imunogênico inclui pelo menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 ou cerca de 0,8 mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 33F. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 33F ativado inclui pelo menos 0,5, 0,6 ou 0,7 mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 33F. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 33F ativado inclui pelo menos 0,6 mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 33F. Em uma modalidade preferida, o polissacarídeo de serotipo 33F ativado inclui pelo menos 0,7 mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 33F.
[00215] Em uma modalidade preferida, a razão de mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 33F no conjugado imunogênico para mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 33F no polissacarídeo isolado é de pelo menos 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, ou 0,95. Em uma modalidade preferida, a razão de mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 33F no conjugado imunogênico para mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 33F no polissacarídeo isolado é de pelo menos 0,7. Em uma modalidade preferida, a razão de mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 33F no conjugado imunogênico para mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 33F no polissacarídeo isolado é de pelo menos 0,9.
[00216] Em uma modalidade preferida, a razão de mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 33F no conjugado imunogênico para mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 33F no polissacarídeo ativado é de pelo menos 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, ou 0,95. Em uma modalidade preferida, a razão de mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 33F no conjugado imunogênico para mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 33F no polissacarídeo ativado é de pelo menos 0,7. Em uma modalidade preferida, a razão de mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 33F no conjugado imunogênico para mM de acetato por mM de polissacarídeo de serotipo 33F no polissacarídeo ativado é de pelo menos 0,9.
[00217] Em uma modalidade preferida, o conjugado imunogênico de serotipo 33F possui um peso molecular entre 500 e 30000; 500 e 25000; 500 e 20000; 500 e 15000; 500 e 10000; 1000 e 10000; 1000 e 8000; 1000 e 5000; 2000 e 10000 kDa; 2000 e 8000; ou entre 2000 e 5000 kDa. O peso molecular do conjugado imunogênico é medido por SEC-MALLS.
[00218] Em uma modalidade preferida, o conjugado imunogênico de serotipo 33F inclui menos de cerca de 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20 ou 15% de polissacarídeo de serotipo 33F livre quando comparado com a quantidade total de polissacarídeo de serotipo 33F. Em uma modalidade preferida, o conjugado imunogênico de serotipo 33F inclui menos de cerca de 25% de polissacarídeo de serotipo 33F livre quando comparado com a quantidade total de polissacarídeo de serotipo 33F. Em uma modalidade preferida, o conjugado imunogênico de serotipo 33F inclui menos de cerca de 20% de polissacarídeo de serotipo 33F livre quando comparado com a quantidade total de polissacarídeo de serotipo 33F. Em uma modalidade preferida, o conjugado imunogênico de serotipo 33F inclui menos de cerca de 15% de polissacarídeo de serotipo 33F livre quando comparado com a quantidade total de polissacarídeo de serotipo 33F.
[00219] Em uma modalidade preferida, a razão (em peso) de polissacarídeo de serotipo 33F para proteína carreadora no conjugado é de entre 0,4 e 3. Em uma modalidade preferida, a razão de polissacarídeo de serotipo 33F para proteína carreadora no conjugado é de entre 0,5 e 2, 0,5 e 1,5, 0,5 e 1, 1 e 1,5 ou entre 1 e 2. Em uma modalidade preferida, a razão de polissacarídeo de serotipo 33F para proteína carreadora no conjugado é de entre 0,5 e 1,5. Em uma modalidade preferida, a razão de polissacarídeo capsular de serotipo 33F para proteína carreadora no conjugado é de entre 0,5 e 1,2.
[00220] Em uma modalidade preferida, pelo menos 30% do conjugado imunogênico de serotipo 33F possui um Kd menor ou igual a 0,3 em uma coluna de CL-4B. Em uma modalidade preferida, pelo menos 40% do conjugado imunogênico possui um Kd abaixo ou igual a 0,3 em uma coluna de CL-4B. Em uma modalidade preferida, pelo menos 45%, 50%, 55%, 60%, ou 65% do conjugado imunogênico de serotipo 33F possui um Kd abaixo ou igual a 0,3 em uma coluna de CL-4B. Em uma modalidade preferida, pelo menos 60% do conjugado imunogênico de serotipo 33F possui um Kd abaixo ou igual a 0,3 em uma coluna de CL-4B. Em uma modalidade preferida, entre 40% e 80% do conjugado imunogênico de serotipo 33F possui um Kd abaixo ou igual a 0,3 em uma coluna de CL-4B. Em uma modalidade preferida, entre 45% e 60% do conjugado imunogênico de serotipo 33F possui um Kd abaixo ou igual a 0,3 em uma coluna de CL-4B.
[00221] Em uma modalidade preferida, o grau de conjugação o conjugado imunogênico está entre 1 e 15, 2 e 13, 2 e 10, 2 e 8, 2 e 6, 2 e 5, 2 e 4, 3 e 15, 3 e 13, 3 e 10, 3 e 8, 3 e 6, 3 e 5, 3 e 4, 5 e 15, 5 e 10, 8 e 15, 8 e 12, 10 e 15 ou entre 10 e 12. Em uma modalidade preferida, o grau de conjugação do conjugado imunogênico está entre 3 e 6.
Composição imunogênica
[00222] O termo “composição imunogênica” refere-se a qualquer composição farmacêutica contendo um antígeno, por exemplo, um microrganismo ou um componente deste, cuja composição pode ser usada para obter uma resposta imune em um sujeito.
[00223] Como usado aqui, “imunogênico” significa uma habilidade de um antígeno (ou um epitopo do antígeno), como, por exemplo, um polissacarídeo capsular bacteriano, ou um glicoconjugado ou composição imunogênica incluindo um antígeno, para obter uma resposta imune em um hospedeiro como, por exemplo, um mamífero, ou me-diada por células ou humoral, ou ambos.
[00224] Em uma modalidade preferida, a composição imunogênica inclui um conjugado de serotipo 10A, 22F ou 33F obtido por um processo divulgado aqui. Em uma modalidade preferida, a composição imunogênica incluindo um conjugado de serotipo 10A, 22F ou 33F é obtenível por um processo divulgado aqui.
[00225] Em uma modalidade, a composição imunogênica divulgada aqui, quando administrada a um sujeito, induz a formação de anticorpos capazes de se ligar ao serotipo 10A de Streptococcus pneumoniae. Em uma modalidade, a composição imunogênica divulgada aqui, quando administrada a um sujeito, induz a formação de anticorpos capazes de se ligar ao serotipo 10A de Streptococcus pneumoniae como medido por um ensaio de ELISA padrão.
[00226] Em uma modalidade, a composição imunogênica divulgada aqui, quando administrada a um sujeito, induz a formação de anticorpos capazes de matar o serotipo 10A de Streptococcus pneumoniae em um ensaio de opsonofagocitose como divulgado aqui.
[00227] Em uma modalidade, a composição imunogênica divulgada aqui, quando administrada a um sujeito, induz a formação de anticorpos capazes de se ligar ao serotipo 22F de Streptococcus pneumoniae. Em uma modalidade, a composição imunogênica divulgada aqui, quando administrada a um sujeito, induz a formação de anticorpos capazes de se ligar ao serotipo 22F de Streptococcus pneumoniae como medido por um ensaio de ELISA padrão.
[00228] Em uma modalidade, a composição imunogênica divulgada aqui, quando administrada a um sujeito, induz a formação de anticorpos capazes de matar o serotipo 22F de Streptococcus pneumoniae em um ensaio de opsonofagocitose como divulgado aqui.
[00229] Em uma modalidade, a composição imunogênica divulgada aqui, quando administrada a um sujeito, induz a formação de anticorpos capazes de se ligar ao serotipo 33F de Streptococcus pneumoniae. Em uma modalidade, a composição imunogênica divulgada aqui, quando administrada a um sujeito, induz a formação de anticorpos capazes de se ligar ao serotipo 33F de Streptococcus pneumoniae como medido por um ensaio de ELISA padrão.
[00230] Em uma modalidade, a composição imunogênica divulgada aqui, quando administrada a um sujeito, induz a formação de anticorpos capazes de matar o serotipo 33F de Streptococcus pneumoniae em um ensaio de opsonofagocitose como divulgado aqui.
[00231] A formulação da composição imunogênica da presente invenção pode ser alcançada usando métodos reconhecidos pela técnica. Por exemplo, os conjugados de serotipo 10A, 22F ou 33F podem ser formulados com um veículo fisiologicamente aceitável para preparar a composição. Exemplos de tais veículos incluem, mas não estão limitados a, água, solução salina tamponada, polióis (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicol líquido) e soluções de dextrose.
[00232] Em uma modalidade preferida, a composição imunogênica pode incluir pelo menos um antígeno adicional. Em uma modalidade preferida, a composição imunogênica pode incluir pelo menos um polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae adicional.
[00233] Em uma modalidade preferida, a composição imunogênica pode incluir pelo menos um polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae adicional conjugado com uma proteína carreadora. Em uma modalidade preferida, tal proteína carreadora é CRM197.
[00234] Em certas modalidades, a composição imunogênica inclui um ou mais adjuvantes. Como definido aqui, um “adjuvante” é uma substância que serve para aprimorar a imunogenicidade de uma composição imunogênica desta invenção. Logo, adjuvantes são geralmente fornecidos para aumentar a resposta imune e são bem conhecidos para o técnico versado. Adjuvantes apropriados para aprimorar a eficiência da composição incluem, mas não estão limitados a:
[00235] (1) sais de alumínio (alum), como, por exemplo, hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio, etc.;
[00236] (2) formulações de emulsão óleo-em-água (com ou sem outros agentes imunoestimulantes específicos como, por exemplo, peptídeos de muramila (definidos abaixo) ou componentes de parede celular bacteriana), como, por exemplo,
[00237] (a) MF59 (Pub. PCT No. WO 90/14837), contendo 5% de Esqualeno, 0,5% de Tween 80, e 0,5% de Span 85 (opcionalmente contendo várias quantidades de MTP-PE (ver abaixo, embora não necessário)) formulado em partículas submícron usando um microfluidizador como, por exemplo, microfluidizador Modelo 11OY (Microfluidics, Newton, MA),
[00238] (b) SAF, contendo 10% de Esqualeno, 0,4% de Tween 80, 5% de polímero L121 plurônico-bloqueado, e thr-MDP (ver abaixo) ou microfluidizado em uma emulsão submícron ou vortexado para gerar uma emulsão de tamanho de partícula maior, e
[00239] (c) Sistema de adjuvante RibiTM (RAS) (Corixa, Hamilton, MT), contendo 2% de Esqualeno, 0,2% de Tween 80, e um ou mais componentes de parede celular bacteriana do grupo consistindo em monofosforilipídeo 3-O-deailado (MPLTM) descrito na Patente Norte- Americana No. 4,912,094 (Corixa), dimicolato de trealose (TDM), e esqueleto de parede celular (CWS), preferivelmente MPL + CWS (DetoxTM);
[00240] (3) adjuvantes de saponina, como, por exemplo, Quil A ou STIMULONTM QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) (Patente Norte- Americana No. 5,057,540) podem ser usados ou partículas geradas destas como, por exemplo, ISCOMs (complexos imunoestimulantes);
[00241] (4) bacterialipopolissacarídeos, análogos de lipídeo A sintéticos como, por exemplo, compostos de aminoalquil glicosamina fosfato (AGP), ou derivados ou análogos destes, que estão disponíveis de Corixa, e que são descritos na Patente Norte-Americana No. 6.113.918; um tal AGP sendo 2-[(R)-3- tetradecanoiloxitetradecanoilamino]etil 2-desoxi-4-ofosfono-3-O-[(R)-3- tetradecanoiloxitetradecanoil]-2-[(R)-3- tetradecanoiloxitetradecanoilamino]-b-D-glucopiranosídeo, que também é conhecido como 529 (anteriormente conhecido como RC529), que é formulado como uma forma aquosa ou como uma emulsão estável, polinucleotídeos sintéticos como, por exemplo, oligonucleotídeos contendo motivo(s) CpG (Patente Norte-Americana No. 6.207.646);
[00242] (5) citocinas como, por exemplo, interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, etc.), interferonas (por exemplo, gama interferona), fator de estimulação de colônia de macrófago de granulócito (GM-CSF), fator de estimulação de colônia de macrófago (M-CSF), fator de necrose de tumor (TNF), moléculas coestimulatórias 87-1 e 87-2, etc.;
[00243] (6) mutantes detoxificados de uma toxina ADP-ribosilante bacteriana como, por exemplo, uma toxina de cólera (CT) ou em forma de tipo selvagem ou mutante, por exemplo, onde o ácido glutâmico na posição de aminoácido 29 é substituído por outro aminoácido, preferivelmente uma histidina, de acordo com a aplicação de patente internacional publicada número WO 00/18434 (ver também WO 02/098368 e WO 02/098369), uma toxina de pertussis (PT), ou uma toxina termicamente lábil de E. coli (LT), particularmente LT-K63, LT- R72, CT-S109, PT-K9/G129 (ver, por exemplo, em WO 93/13302 e WO 29/19265); e
[00244] (7) outras substâncias que ajam como agentes imunoestimulantes para aprimorar a eficiência da composição.
[00245] Peptídeos de muramila incluem, mas não estão limitados a N- acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L- alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP- PE), etc.
[00246] Em uma modalidade da presente invenção, as composições imunogênicas como descritas aqui incluem um oligonucleotídeo CpG como adjuvante. Um oligonucleotídeo CpG como usado aqui refere-se a um oligodesoxinucleotídeo CpG imunoestimulatório (CpG ODN), e, de acordo com isto, estes termos são usados intercambiavelmente a menos que indicado de outra maneira. Oligodesoxinucleotídeos CpG imunoestimulatórios contêm um ou mais motivos CpG imunoestimulatórios que são dinucleotídoes de citosinaguanidina não metilados, opcionalmente dentro de certos contextos bases preferidos. O estado de metilação do motivo imunoestimulatório CpG geralmente se refere ao resíduo de citosina no dinucleotídeo. Um oligonucleotídeo imunoestimulatório contendo pelo menos um dinucleotídeo CpG não metilado é um nucleotídeo que contém uma citosina não metilada 5’ ligada por uma ligação de fosfato a uma guanidina 3’, e que ativa o sistema imune através da ligação com o receptor semelhante à ToII 9 (TLR-9). Em outra modalidade, o ologonucleotídeo imunoestimulatório pode conter um ou mais dinucleotídeos CpG metilados, que ativarão o sistema imune através de TLR9, mas não tão forte quanto o caso de o(s) motivo(s) CpG estiver(em) não metilado(s). Oligonucleotídeos imunoestimulatórios CpG podem incluir um ou mais palíndromos que, por sua vez, podem incluir o dinucleotídeo CpG. Oligonucleotídeos CpG foram descritos em um número de patentes publicadas, aplicações de patente publicadas, e outras publicações, incluindo as Patentes Norte- Americanas Nos. 6.194.388; 6.207.646; 6.214.806; 6.218.371; 6.239.116; e 6.339.068.
[00247] Em uma modalidade da presente invenção, as composições imunogênicas como descritas aqui incluem qualquer um dos oligonucleotídeos CpG descritos na página 3, linha 22 até a página 12, linha 36 de WO2010/125480.
[00248] Diferentes classes de oligonucleotídeos imunoestimulatórios CpG foram identificadas. Estas são referenciadas como classes A, B, C e P, e são descritas em maior detalhe na página 3, linha 22 até a página 12, linha 36 de WO2010/125480. Métodos da invenção englobam o uso destas classes diferentes de oligonucleotídeos imunoestimulatórios CpG.
[00249] Em uma modalidade da presente invenção, as composições imunogênicas como descritas aqui incluem um oligonucleotídeo CpG de classe A. Preferivelmente, o oligonucleotídeo CpG de “classe A” da invenção possui a seguinte sequência de ácido nucleico: GGGGACGACGTCGTGGGGGGG 3’ (SEQ ID NO: 1). Alguns exemplos não limitantes de oligonucleotídeos de classe A incluem 5’ G*G*G_G_A_C_G_A_C_G_T_C_G_T_G_G*G*G*G*G*G 3’ (SEQ ID NO: 2); em que * refere-se a uma ligação de fosforotioato e _ refere-se a uma ligação de fosfodiéster.
[00250] Em uma modalidade da presente invenção, as composições imunogênicas como descrito aqui incluem um oligonucleotídeo CpG de classe B. Em uma modalidade, o oligonucleotídeo CpG para uso na presente invenção é um oligonucleotídeo CpG de classe B representado por pelo menos a fórmula: 5' X1X2CGX3X4 3’, em que X1, X2, X3, e X4 são nucleotídeos. Em uma modalidade, X2 é adenina, guanidina ou timina. Em outra modalidade, X3 é citosina, adenina ou timina.
[00251] As sequências de oligonucleotídeo CpG de classe B da invenção são aquelas amplamente descritas acima nas Patentes Norte-Americanas Nos. 6.194.388, 6.207.646, 6.214.806, 6.218.371, 6.239.116 e 6.339.068. Sequências exemplares incluem, mas não estão limitadas àquelas divulgadas em aplicações e patentes posteriores.
[00252] Em uma modalidade, o oligonucleotídeo CpG de “classe B” da invenção possui a seguinte sequência de ácido nucleico: 5’ TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3’ (SEQ ID NO: 3), ou 5’ TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3’ (SEQ ID NO: 4), ou 5’ TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3’ (SEQ ID NO: 5), ou 5’ TCGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTT 3’ (SEQ ID NO: 6), ou 5’ TCGTCGTTTTGTCGTTTTTTTCGA 3’ (SEQ ID NO: 7).
[00253] Em qualquer uma destas sequências, todas as ligações podem ser ligações de fosforotioato. Em outra modalidade, em qualquer uma destas sequências, uma ou mais ligações podem ser de fosfodiéster, preferivelmente entre o “C” e o “G” do motivo CpG, produzindo um oligonucleotídeo CpG semimole. Em qualquer uma destas sequências, uma etil-uridina ou um halogênio pode substituir o 5’ T; exemplos de substituições de halogênio incluem, mas não estão limitadas às substituições de bromo-uridina ou iodo-uridina.
[00254] Alguns exemplos não limitantes de oligonucleotídeos de classe B incluem: 5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3’ (SEQ ID NO: 8), ou 5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T 3’ (SEQ ID NO: 9), ou 5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3’ (SEQ ID NO: 10), ou 5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3’ (SEQ ID NO: 11), ou 5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*T*T*T*C*G*A 3’ (SEQ ID NO: 12), em que * refere-se a uma ligação de fosforotioato.
[00255] Em uma modalidade da presente invenção, as composições imunogênicas como divulgadas aqui incluem um oligonucleotídeo CpG de classe C. Em uma modalidade, os oligonucleotídeos CpG de “classe C” da invenção possuem a seguinte sequência de ácido nucleico: 5’ TCGCGTCGTTCGGCGCGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 13), ou 5’ TCGTCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 14), ou 5’ TCGGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 15), ou 5’ TCGGACGTTCGGCGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 16), ou 5’ TCGCGTCGTTCGGCGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 17), ou 5’ TCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 18), ou 5’ TCGACGTTCGGCGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 19), ou 5’ TCGCGTCGTTCGGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 20), ou 5’ TCGCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 21), ou 5’ TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 22), ou 5’ TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 23), ou 5’ TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG 3’ (SEQ ID NO: 24), ou 5’ TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGT 3’ (SEQ ID NO: 25).
[00256] Em qualquer uma destas sequências, todas as ligações podem ser ligações de fosforotioato. Em outra modalidade, em qualquer uma destas sequências, uma ou mais das ligações podem ser de fosfodiéster, preferivelmente entre o “C” e o “G” do motivo CpG, produzindo um oligonucleotídeo CpG semimole.
[00257] Alguns exemplos não limitantes dos oligonucleotídeos de classe C incluem: 5’ T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 26), ou 5’ T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 27), ou 5’ T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 28), ou 5’ T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 29), ou 5’ T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 30), ou 5’ T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 31), ou 5’ T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 32), ou 5’ T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 33), ou 5’ T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 34), ou 5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 35), ou 5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 36), ou 5’ T*C*G*T*C_G*T*T*T*T*A*C_G*G*C*G*C*C_G*T*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 37), ou 5’ T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3’ (SEQ ID NO: 38), em que * refere-se a uma ligação de fosforotioato e _ refere-se a uma ligação de fosfodiéster.
[00258] Em qualquer uma destas sequências, uma etil-uridina ou um halogênio pode substituir o 5’ T; exemplos de substituições de halogênio incluem, mas não estão limitadas às substituições de bromo-uridina ou iodo-uridina.
[00259] Em uma modalidade da presente invenção, as composições imunogênicas como divulgadas aqui incluem um oligonucleotídeo CpG de classe P. Em uma modalidade, o oligonucleotídeo CpG para uso na presente invenção é um oligonucleotídeo CpG de classe P contendo um domínio de ativação 5’ TLR e pelo menos duas regiões palindrômicas, uma região palindrômica sendo uma região palindrômica 5’ de pelo menos 6 nucleotídeos de comprimento e conectada a uma região palindrômica 3’ de pelo menos 8 nucleotídeos de comprimento ou diretamente ou através de um espaçador, em que o oligonucleotídeo inclua pelo menos um dinucleotídeo de YpR. Em uma modalidade, tal oligonucleotídeo não é T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G (SEQ ID NO: 27). Em uma modalidade, o oligonucleotídeo CpG de classe P inclui pelo menos um dinucleotídeo CpG não metilado. Em outra modalidade, o domínio de ativação de TLR é TCG, TTCG, TTTCG, TYpR, TTYpR, TTTYpR, UCG, UUCG, UUUCG, TTT, ou TTTT. Em ainda outra modalidade, o domínio de ativação de TLR é imediatamente 5’ à região palindrômica 5’. Em uma modalidade, os oligonucleotídeos CpG de “classe P” da invenção possuem a seguinte sequência de ácido nucleico: 5’ TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 39).
[00260] Em tais sequências, todas as ligações podem ser ligações de fosfodiéster. Em outra modalidade, uma ou mais ligações podem ser de fosfodiéster, preferivelmente entre “C” e “G” do motivo CpG, produzindo um oligonucleotídeo semimole. Em qualquer uma destas sequências, uma etil-uridina ou um halogênio pode substituir o 5’ T; exemplos de substituições de halogênio incluem, mas não estão limitadas às substituições de bromo-uridina ou iodo-uridina.
[00261] Um exemplo não limitante de oligonucleotídeo CpG de classe P inclui: 5’ T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 40) em que * refere-se a uma ligação de fosforotioato e _ refere-se a uma ligação de fosfodiéster.
[00262] Em uma modalidade, o oligonucleotídeo inclui pelo menos uma ligação de fosforotioato. Em outra modalidade, todas as ligações internucleotídeo do oligonucleotídeo são ligações de fosforotioato. Em outra modalidade, o oligonucleotídeo inclui pelo menos uma ligação semelhante à fosfodiéster. Em outra modalidade, a ligação semelhante à fosfodiéster é uma ligação fosfodiéster. Em outra modalidade, um grupo lipofílico é conjugado ao oligonucleotídeo. Em uma modalidade, o grupo lipofílico é colesterol.
[00263] Em uma modalidade, todas as ligações dos oligonucleotídeos CpG divulgadas aqui são ligações de fosfodiéster (oligonucleotídeos “moles”, como descrito na aplicação de PCT WO2007/026190). Em outra modalidade, oligonucleotídeos CpG da invenção são tornados resistentes à degradação (por exemplo, são estabilizados). Um “oligonucleotídeo estabilizado” refere-se a um oligonucleotídeo que é relativamente resistente à degradação in vivo (por exemplo, através de uma exo- ou endo-nuclease). A estabilização de ácido nucleico pode ser alcançada através de modificações no esqueleto. Oligonucleotídeos possuindo ligações de fosforotioato fornecem atividade máxima e protegem o oligonucleotídeo de degradação por exo- e endo-nucleases intracelulares.
[00264] Os oligonucleotídeos imunoestimulatórios podem possuir um esqueleto quimérico, que possui combinações de ligações de fosfodiéster e fosforotioato. Para propósitos da invenção atual, um esqueleto quimérico refere-se a um esqueleto parcialmente estabilizado, em que pelo menos uma ligação internucleotídeo é de fosfodiéster ou semelhante à fosfodiéster, e em que pelo menos uma outra ligação internucleotídeo é uma ligação internucleotídeo estabilizada, em que pelo menos uma ligação de fosfodiéster ou semelhante à fosfodiéster e pelo menos uma ligação estabilizada são diferentes. Quando a ligação de fosfodiéster está preferencialmente localizada dentro do motivo CpG, tais moléculas são chamadas “semimoles”, como descrito na aplicação de PCT WO2007/026190.
[00265] O tamanho do nucleotídeo CpG (ou seja, o número de resíduos de nucleotídeo ao longo do comprimento do oligonucleotídeo) também pode contribuir para a atividade estimuladora do oligonucleotídeo. Para a facilitação de acúmulo nas células, o oligonucleotídeo CpG da invenção preferivelmente possui um comprimento mínimo de 6 resíduos de nucleotídeo. Oligonucleotídeos com qualquer tamanho maior que 6 nucleotídeos (até mesmo com grande comprimento em kb) são capazes de induzir uma resposta imune se motivos imunoestimulatórios suficientes estiverem presentes, devido ao fato de oligonucleotídeos maiores serem degradados dentro das células. Em certas modalidades, os nucleotídeos CpG possuem 6 a 100 nucleotídeos de comprimento, preferivelmente 8 a 30 nucleotídeos de comprimento. Em modalidades importantes, ácidos nucleicos e oligonucleotídeos da invenção não são plasmídeos ou vetores de expressão.
[00266] Em uma modalidade, os oligonucleotídeos CpG divulgados aqui incluem substituições ou modificações como, por exemplo, nas bases e/ou açucares como descrito nos parágrafos 134 a 147 de WO2007/026190.
[00267] Em uma modalidade, o oligonucleotídeo CpG da presente invenção é quimicamente modificado. Exemplos de modificações químicas são conhecidos para a pessoa versada e são descritas, por exemplo, em Uhlmann E. et al. (1990), Chem. Rev. 90:543, S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa, EUA 1993; Crooke, S.T. et al. (1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36:107-129; e Hunziker J. et al., (1995), Mod. Synth. Methods 7:331-417. Um oligonucleotídeo de acordo com a invenção pode possuir uma ou mais modificações, em que cada modificação esteja localizada em uma ponte internucleosídeo de fosfodiéster particular e/ou em uma unidade de β- D-ribose particular e/ou em uma posição de base de nucleosídeo natural particular em comparação com um oligonucleotídeo da mesma sequência que é composto de DNA ou RNA natural.
[00268] Em algumas modalidades da invenção, ácidos nucleicos contendo CpG podem ser simplesmente misturados com carreadores imunogênicos de acordo com métodos conhecidos para aqueles versados na técnica (ver, por exemplo, em WO03/024480).
[00269] Em uma modalidade particular da presente invenção, qualquer uma das composições imunogênicas divulgadas aqui incluem de 2 μg a 100 mg de oligonucleotídeo CpG, preferivelmente de 0,1 mg a 50 mg de oligonucleotídeo CpG, preferivelmente de 0,2 mg a 10 mg de oligonucleotídeo CpG, preferivelmente de 0,3 mg a 5 mg de oligonucleotídeo CpG, ainda mais preferivelmente de 0,5 mg a 2 mg de oligonucleotídeo CpG, ainda mais preferivelmente de 0,75 mg a 1,5 mg de oligonucleotídeo CpG. Em uma modalidade preferida, a composição imunogênica divulgada aqui inclui aproximadamente 1 mg de oligonucleotídeo CpG.
[00270] Em uma modalidade preferida, o adjuvante é um adjuvante baseado em alumínio selecionado do grupo consistindo em fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio. Em uma modalidade, as composições imunogênicas descritas aqui incluem o fosfato de alumínio adjuvante.
[00271] Em modalidades preferidas, as composições imunogênicas da invenção incluem adicionalmente pelo menos um tampão, um crioprotetor, um sal, um cátion divalente, um detergente não iônico, um inibidor de oxidação de radical livre, um diluente ou um carreador.
[00272] A composição imunogênica opcionalmente pode incluir um carreador farmaceuticamente aceitável. Carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem carreadores aprovados por uma agência reguladora do governo federal ou estadual, ou outra agência reguladora, ou listada na Farmacopeia Norte-Americana ou outras farmacopeias geralmente reconhecidas para uso em animais, incluindo humanos, bem como mamíferos não humanos. O termo carreador pode ser usado para se referir a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual a composição farmacêutica é administrada. Água, soluções salinas e soluções de glicerol e dextrose aquosas podem ser empregadas como carreadores líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Exemplos de carreadores farmacêuticos apropriados são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. A formulação deve se adaptar ao modo de administração.
[00273] A composição imunogênica pode opcionalmente incluir um ou mais tensoativos não iônicos, incluindo, mas não limitado a ésteres de ácido graxo de polioxietileno sorbitano, Polissorbato-80 (Tween 80), Polissorbato-60 (Tween 60), Polissorbato-40 (Tween 40), Polissorbato- 20 (Tween 20), alquil éteres de polioxietileno, incluindo, mas não limitado a, Brij 58, Brij 35, bem como outros como, por exemplo, Triton X-100; Triton X- 114, NP40, Span 85 e a série Pluronic de tensoativos não iônicos (por exemplo, Pluronic 121), tendo como componentes preferidos Polissorbato-80 em uma concentração de cerca de 0,001% a 2% (com até cerca de 0,25% sendo preferido) ou Polissorbato-40 em uma concentração de cerca de 0,001% a 1% (com até cerca de 0,5% sendo preferido).
[00274] A invenção refere-se adicionalmente a vacinas incluindo a composição imunogênica da invenção.
Métodos para indução de uma resposta imune e proteção contra infecção
[00275] A presente divulgação também inclui métodos para uso das composições imunogênicas descritas aqui. Por exemplo, uma modalidade da divulgação fornece um método de indução de uma resposta imune contra Streptococcus pneumoniae, os métodos incluindo a administração de uma quantidade imunogênica de qualquer uma das composições imunogênicas descritas aqui a um sujeito.
[00276] Uma modalidade da divulgação fornece um método para proteção de um sujeito contra uma infecção de Streptococcus pneumoniae, ou um método de redução da severidade ou atraso do princípio de pelo menos um sintoma associado com uma infecção causada por Streptococcus pneumoniae, os métodos incluindo a administração de uma quantidade imunogênica de qualquer composição imunogênica descrita aqui a um sujeito.
[00277] Uma modalidade da divulgação fornece um método de proteção de um sujeito contra uma infecção com serotipo 10A de Streptococcus pneumoniae, ou um método de prevenção de infecção com serotipo 10A de Streptococcus pneumoniae, ou um método de redução da severidade ou atraso do princípio de pelo menos um sintoma associado com uma infecção causada por serotipo 10A de Streptococcus pneumoniae, os métodos incluindo a administração de uma quantidade imunogênica de qualquer composição imunogênica descrita aqui a um sujeito.
[00278] Uma modalidade da divulgação fornece um método de tratamento ou prevenção de uma infecção, doença ou condição de Streptococcus pneumoniae associada com serotipo 10A de Streptococcus pneumoniae em um sujeito, o método incluindo a etapa de administração de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficiente de uma composição imunogênica descrita aqui para o sujeito. Outra modalidade fornece um método de tratamento ou prevenção de uma infecção, doença ou condição de Streptococcus pneumoniae associada com um serotipo 10A de Streptococcus pneumoniae em um sujeito, o método incluindo a geração de uma preparação de anticorpo policlonal ou monoclonal da composição imunogênica descrita aqui, e o uso de tal preparação de anticorpo para conferir imunidade passiva ao sujeito.
[00279] Em uma modalidade, a divulgação refere-se ao uso do conjugado imunogênico ou composição imunogênica divulgada aqui para a manufatura de um medicamento para proteção de um sujeito contra uma infecção com Streptococcus pneumoniae, e/ou prevenção de infecção com Streptococcus pneumoniae, e/ou redução da severidade ou atraso do princípio de pelo menos um sintoma associado com uma infecção causada por Streptococcus pneumoniae, e/ou proteção de um sujeito contra uma infecção com serotipo 10A de Streptococcus pneumoniae e/ou prevenção da infecção com serotipo 10A de Streptococcus pneumoniae, e/ou redução da severidade ou atraso do princípio de pelo menos um sintoma associado com uma infecção causada por serotipo 10A de Streptococcus pneumoniae.
[00280] Uma modalidade da divulgação fornece um método de proteção de um sujeito contra uma infecção com serotipo 22F de Streptococcus pneumoniae, ou um método de prevenção de infecção com serotipo 22F de Streptococcus pneumoniae, ou um método de redução da severidade ou atraso do princípio de pelo menos um sintoma associado com uma infecção causada por serotipo 22F de Streptococcus pneumoniae, os métodos incluindo a administração de uma quantidade imunogênica de qualquer composição imunogênica descrita aqui a um sujeito.
[00281] Uma modalidade da divulgação fornece um método de tratamento ou prevenção de uma infecção, doença ou condição de Streptococcus pneumoniae associada com serotipo 22F de Streptococcus pneumoniae em um sujeito, o método incluindo a etapa de administração de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficiente de uma composição imunogênica descrita aqui para o sujeito. Outra modalidade fornece um método de tratamento ou prevenção de uma infecção, doença ou condição de Streptococcus pneumoniae associada com um serotipo 22F de Streptococcus pneumoniae em um sujeito, o método incluindo a geração de uma preparação de anticorpo policlonal ou monoclonal da composição imunogênica descrita aqui, e o uso de tal preparação de anticorpo para conferir imunidade passiva ao sujeito.
[00282] Em uma modalidade, a divulgação refere-se ao uso do conjugado imunogênico ou composição imunogênica divulgada aqui para a manufatura de um medicamento para proteção de um sujeito contra uma infecção com Streptococcus pneumoniae, e/ou prevenção de infecção com Streptococcus pneumoniae, e/ou redução da severidade ou atraso do princípio de pelo menos um sintoma associado com uma infecção causada por Streptococcus pneumoniae, e/ou proteção de um sujeito contra uma infecção com serotipo 22F de Streptococcus pneumoniae e/ou prevenção da infecção com serotipo 22F de Streptococcus pneumoniae, e/ou redução da severidade ou atraso do princípio de pelo menos um sintoma associado com uma infecção causada por serotipo 22F de Streptococcus pneumoniae.
[00283] Uma modalidade da divulgação fornece um método de proteção de um sujeito contra uma infecção com serotipo 33F de Streptococcus pneumoniae, ou um método de prevenção de infecção com serotipo 33F de Streptococcus pneumoniae, ou um método de redução da severidade ou atraso do princípio de pelo menos um sintoma associado com uma infecção causada por serotipo 33F de Streptococcus pneumoniae, os métodos incluindo a administração de uma quantidade imunogênica de qualquer composição imunogênica descrita aqui a um sujeito.
[00284] Uma modalidade da divulgação fornece um método de tratamento ou prevenção de uma infecção, doença ou condição de Streptococcus pneumoniae associada com serotipo 33F de Streptococcus pneumoniae em um sujeito, o método incluindo a etapa de administração de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficiente de uma composição imunogênica descrita aqui para o sujeito. Outra modalidade fornece um método de tratamento ou prevenção de uma infecção, doença ou condição de Streptococcus pneumoniae associada com um serotipo 33F de Streptococcus pneumoniae em um sujeito, o método incluindo a geração de uma preparação de anticorpo policlonal ou monoclonal da composição imunogênica descrita aqui, e o uso de tal preparação de anticorpo para conferir imunidade passiva ao sujeito.
[00285] Em uma modalidade, a divulgação refere-se ao uso do conjugado imunogênico ou composição imunogênica divulgada aqui para a manufatura de um medicamento para proteção de um sujeito contra uma infecção com Streptococcus pneumoniae, e/ou prevenção de infecção com Streptococcus pneumoniae, e/ou redução da severidade ou atraso do princípio de pelo menos um sintoma associado com uma infecção causada por Streptococcus pneumoniae, e/ou proteção de um sujeito contra uma infecção com serotipo 33F de Streptococcus pneumoniae e/ou prevenção da infecção com serotipo 33F de Streptococcus pneumoniae, e/ou redução da severidade ou atraso do princípio de pelo menos um sintoma associado com uma infecção causada por serotipo 33F de Streptococcus pneumoniae.
[00286] Uma “resposta imune” a uma composição imunogênica é o desenvolvimento de uma resposta imune mediada por células e/ou humoral a moléculas presentes na composição imunogênica ou composição de vacina de interesse em um sujeito. Para propósitos da presente divulgação, uma “resposta imune humoral” é uma resposta imune mediada por anticorpo e envolve a indução e geração de anticorpos que reconhecem e se ligam com alguma afinidade ao antígeno na composição imunogênica ou vacina da divulgação, enquanto que uma “resposta imune mediada por células” é uma mediada por células-T e/ou outras células sanguíneas brancas. Uma “resposta imune mediada por células” é obtida pela apresentação dos epitopos antigênicos em associação com moléculas de classe I ou classe II do complexo de histocompatibilidade maior (MHC), CD1 ou outras moléculas semelhantes à MHC não clássicas. Isto ativa células auxiliares CD4+ T antígeno-específicas ou células de linfócito T citotóxicas CD+ (“CTLs”). CTLs possuem especificidade para antígenos de peptídeo que são apresentados em associação com proteínas codificadas por MHCs clássicas ou não clássicas e são expressas na superfície das células. CLTs ajudam a induzir e promover a destruição intracelular de micróbios intracelulares, ou a lise de células infectadas com tais micróbios. Outro aspecto da imunidade celular envolve uma resposta antígeno-específica por células-T auxiliares. Células-T auxiliares agem para auxiliar no estímulo da função, e focam a atividade de células efetuadoras não específicas contra células apresentando peptídeos ou outros antígenos em associação com moléculas de MHC clássicas ou não clássicas em usa superfície. Uma “resposta imune mediada por células” também se refere à produção de citocinas, quimiocinas, e outras tais moléculas produzidas por células-T ativadas e/ou outras células sanguíneas brancas, incluindo aquelas derivadas de células-T CD4+ e CD8+. A habilidade de um antígeno ou composição particular estimular uma resposta imunológica mediada por células pode ser determinada por um número de ensaios, como, por exemplo, ensaios de linfoproliferação (ativação de linfócito), ensaios de célula citotóxica CTL, pelo ensaio de T-linfócitos específicos para o antígeno em um sujeito sensibilizado, ou por medição da produção de citocina por células-T em resposta ao reestímulo com antígeno. Tais ensaios são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, em Erickson et al. (1993) J. Immunol. 151:4189-4199; e Doe et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:2369-2376.
[00287] Como usado aqui, “tratamento” (incluindo variações deste, por exemplo, “tratar” ou “tratado”) significa qualquer um ou mais dos seguintes: (i) prevenção de infecção ou reinfecção, como em uma vacina tradicional, (ii) redução da severidade de, ou na eliminação dos sintomas, e (iii) substancial ou completa eliminação do patógeno ou desordem em questão. Então, o tratamento pode ser efetuado profilaticamente (antes da infecção) ou terapeuticamente (após a infecção). Na presente divulgação, o tratamento profilático é o modo preferido. De acordo com uma modalidade particular da presente invenção, são fornecidos composições e métodos que tratam, incluindo a imunização profilática e/ou terapêutica, de um animal hospedeiro contra uma infecção de serotipo 10A de Streptococcus pneumoniae. De acordo com uma modalidade particular da presente divulgação, são fornecidos composições e métodos que tratam, incluindo a imunização profilática e/ou terapêutica, de um animal hospedeiro contra uma infecção de serotipo 22F de Streptococcus pneumoniae. De acordo com uma modalidade particular da presente divulgação, são fornecidos composições e métodos que tratam, incluindo a imunização profilática e/ou terapêutica, de um animal hospedeiro contra uma infecção de serotipo 33F de Streptococcus pneumoniae. Os métodos da presente divulgação são úteis para conferir imunidade profilática e/ou terapêutica a um sujeito. Os métodos da presente divulgação também podem ser praticados em sujeitos para aplicações em pesquisa biomédica.
[00288] Uma “quantidade imunogênica”, e uma “quantidade imunologicamente eficiente”, ambas as quais sendo usadas intercambiavelmente aqui, referem-se à quantidade de antígeno ou composição imunogênica suficiente para obter uma resposta imune, ou uma resposta humoral (de célula-B ou anticorpo) ou celular (célula- T), ou ambos, como medido por ensaios padrão conhecidos por alguém versado na técnica.
[00289] Em uma modalidade preferida, tal sujeito é um humano. Em uma modalidade mais preferida, tal sujeito é um recém-nascido (ou seja, com menos de três meses de idade), um bebê (de 3 meses a um ano de idade) ou uma criança (ou seja, de um ano a quatro anos de idade).
[00290] Em uma modalidade, as composições imunogênicas divulgadas aqui são para uso como uma vacina.
[00291] Em tal modalidade, o sujeito a ser vacinado pode ter menos de 1 ano de idade. Por exemplo, o sujeito a ser vacinado pode ter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses de idade. Em uma modalidade, o sujeito a ser vacinado tem cerca de 2, 4 ou 6 meses de idade. Em outra modalidade, o sujeito a ser vacinado tem menos de 2 anos de idade. Por exemplo, o sujeito a ser vacinado pode ter cerca de 12-15 meses de idade. Em alguns casos, apenas uma dose de composição imunogênica de acordo com a invenção é necessária, mas sob algumas circunstâncias, uma segunda, terceira ou quarta dose pode ser dada (ver a seção de regime).
[00292] Em uma modalidade da presente invenção, o sujeito a ser vacinado é um adulto humano de 50 anos de idade ou mais, mais preferivelmente um adulto humano de 55 anos de idade ou mais. Em uma modalidade, o sujeito a ser vacinado é um adulto humano de 65 anos de idade ou mais, 70 anos de idade ou mais, 75 anos de idade ou mais, ou 80 anos de idade ou mais.
[00293] Em uma modalidade, o sujeito a ser vacinado é um indivíduo imunocomprometido, em particular um humano. Um indivíduo imunocomprometido é geralmente definido como uma pessoa que exibe uma habilidade atenuada ou reduzida de montar uma defesa celular ou humoral normal para desafiar os agentes infecciosos.
[00294] Em uma modalidade da presente invenção, o sujeito imunocomprometido a ser vacinado sofre de uma doença ou condição que prejudica o sistema imune e resulta em uma resposta de anticorpo que insuficiente para proteger contra ou tratar a doença de pneumococo.
[00295] Em uma modalidade, tal doença é uma desordem de imunodeficiência primária. Preferivelmente, tal desordem de imunodefi-ciência primária é selecionada do grupo consistindo em: imunodefi-ciências de células-B e T combinadas, deficiências de anticorpo, síndromes bem definidas, doenças de desregulação imune, desordens de fagócito, deficiências de imunidade inatas, desordens autoinflamatórias, e deficiências de complemento. Em uma modalidade, tal desordem de imunodeficiência primária é selecionada daquela divulgada a página 24, linha 11 À página 25, linha 19 da aplicação de PCT WO2010/125480.
[00296] Em uma modalidade particular da presente invenção, o sujeito imunocomprometido a ser vacinado sofre de uma doença selecionada dos grupos consistindo em: infecção de HIV, síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), câncer, desordens cardíacas ou pulmonares crônicas, falha cardíaca congestiva, diabete mellitus, doença de fígado crônica, alcoolismo, cirrose, vazamentos de fluidos espinhais, cardiomiopatia, bronquite crônica, enfisema, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), disfunção de baço (como, por exemplo, anemia falciforme), ausência de função de baço (asplenia), malignidade sanguínea, leucemia, mieloma múltiplo, doença de Hodgkin, linfoma, falha nos rins, síndrome nefrótica e asma.
[00297] Em uma modalidade da presente invenção, o sujeito imunocomprometido a ser vacinado sofre de má-nutrição.
[00298] Em uma modalidade particular da presente invenção, o sujeito imunocomprometido a ser vacinado está sendo tratado por um fármaco ou tratamento que diminui a resistência do corpo para infecção. Em uma modalidade, tal fármaco é selecionado daquele divulgado na página 26, linha 33 à página 26, linha 40 da aplicação de PCT WO2010/125480.
[00299] Em uma modalidade particular da presente invenção, o sujeito imunocomprometido a ser vacinado possui uma contagem de células sanguíneas brancas (contagem de leucócitos) abaixo de 5 x 109 células por litro, ou abaixo de 4 x 109 células por litro, ou abaixo de 3 x 109 células por litro, ou abaixo de 2 x 109 células por litro, ou abaixo de 1 x 109 células por litro, ou abaixo de 0,5 x 109 células por litro, ou abaixo de 0,3 x 109 células por litro, ou abaixo de 0,1 x 109 células por litro.
[00300] Contagem de células sanguíneas brancas (contagem de leucócitos): número de células sanguíneas brancas (WBCs) no sangue. As WBCs são geralmente medidas como parte da CBC (contagem sanguínea completa). Células sanguíneas brancas são as células que lutam contra infecções no sangue e são distintas das células sanguíneas vermelhas (carregadoras de oxigênio), conhecidas como eritrócitos. Há diferentes tipos de células sanguíneas brancas, incluindo neutrófilos (leucócitos polimorfonucleares; PMNs), células de banda (neutrófilos levemente imaturos), linfócitos tipo T (células-T), linfócitos tipo B (células-B), monócitos, eosinófilos, e basófilos. Todos os tipos de células sanguíneas brancas são refletidas na contagem de células sanguíneas brancas. A faixa normal para a contagem de células sanguíneas brancas está geralmente entre 4.300 e 10.800 células por milímetro cúbico de sangue. Isto pode também ser referenciado como a contagem de leucócitos e pode ser expressa em unidades internacionais como 4,3 - 10,8 x 109 células por litro.
[00301] Em uma modalidade particular da presente invenção, o sujeito imunocomprometido a ser vacinado sofre de neutropenia. Em uma modalidade particular da presente invenção, o sujeito imunocomprometido a ser vacinado possui uma contagem de neutrófilos abaixo de 2 x 109 células por litro, ou abaixo de 1 x 109 células por litro, ou abaixo de 0,5 x 109 células por litro, ou abaixo de 0,1 x 109 células por litro, ou abaixo de 0,05 x 109 células por litro.
[00302] Uma contagem de células sanguíneas brancas baixa ou “neutropenia” é uma condição caracterizada por níveis anormalmente baixos de neutrófilos no sangue circulante. Neutrófilos são um tipo especial de células sanguíneas brancas que ajudam a prevenir e lutar contra infecções. A razão mais comum em que pacientes de câncer experimentam neutropenia é como um efeito adverso de quimioterapia. A neutropenia induzida por quimioterapia aumenta o risco de infecção do paciente e perturba o tratamento do câncer.
[00303] Em uma modalidade particular da presente invenção, o sujeito imunocomprometido a ser vacinado possui uma contagem de células CD4+ abaixo de 500/mm3, ou uma contagem de células CD4+ abaixo de 300/mm3, ou uma contagem de células CD4+ abaixo de 200/mm3, ou uma contagem de células CD4+ abaixo de 100/mm3, ou uma contagem de células CD4+ abaixo de 75/mm3, ou uma contagem de células CD4+ abaixo de 50/mm3.
[00304] Testes de célula CD4 são normalmente relatados como o número de células em mm3. Contagens de CD4 normais estão entre 500 e 1600, e contagens de CD8 estão entre 375 e 1100. As contagens de CD4 caem dramaticamente em pessoas com HIV.
[00305] Em uma modalidade da invenção, qualquer sujeito imunocomprometido divulgado aqui é um macho humano ou uma fêmea humana.
[00306] A quantidade de conjugado em uma composição é geralmente calculada baseada no polissacarídeo total, conjugado e não conjugado para aquele conjugado. Por exemplo, um conjugado com 20% de polissacarídeo livre possuirá cerca de 80 mcg de polissacarídeo conjugado e cerca de 20 mcg de polissacarídeo não conjugado em uma dose de polissacarídeo de 100 mcg. A contribuição de proteína ao conjugado geralmente não é considerara ao calcular a dose de um conjugado. Geralmente, cada dose incluirá 0,1 a 100 mcg de polissacarídeo, particularmente 0,1 a 10 mcg, e mais particularmente 1 a 10 mcg e mais particularmente 1 a 5 μg. Preferivelmente, cada dose incluirá cerca de 1,1, 2, 2,2, 3, 3,3, 4, 4,4 μg de polissacarídeo.
[00307] Quantidades ótimas de componentes para uma composição imunogênica particular ou vacina podem ser determinadas por estudos padrão envolvendo a observação de respostas imunes apropriadas em sujeitos. Após vacinação inicial, os sujeitos podem receber uma ou várias imunizações amplificadoras adequadamente espaçadas.
[00308] A eficiência de um antígeno como um imunogênio pode ser medida ou por ensaios de proliferação, por ensaios citolíticos, como, por exemplo, ensaios de liberação de cromo para medir a habilidade de uma célula-T lisar sua célula alvo específica, ou por medição dos níveis de atividade de célula-B pela medição dos níveis de anticorpos circulantes específicos para o antígeno no soro. Uma resposta imune pode também ser detectada pela medição dos níveis de soro de anticorpo antígeno específico induzidos após a administração do antígeno e, mais especificamente, pela medição da habilidade dos anticorpos então induzidos aprimorarem a habilidade opsonofagocítica de células sanguíneas brancas particulares, como descrito aqui. O nível de proteção da resposta imune pode ser medido pelo desafio do hospedeiro imunizado com o antígeno que foi administrado. Por exemplo, se o antígeno ao qual uma resposta imune é desejada for uma bactéria, o nível de proteção induzida pela quantidade imunogênica de antígeno é medido pela detecção da sobrevivência percentual ou da mortalidade percentual após desafio dos animais com as células bacterianas. Em uma modalidade, a quantidade de proteção pode ser medida pela medição de pelo menos um sintoma associado com a infecção bacteriana, por exemplo, uma febre associada com a infecção. A quantidade de cada um dos antígenos na vacina multiantígeno ou multicomponente ou composições imunogênicas variará com respeito a cada um dos outros componentes e pode ser determinada por métodos conhecidos pelo técnico versado. Tais métodos incluiriam procedimentos para a medição de imunogenicidade e/ou eficiência in vivo.
[00309] A divulgação fornece adicionalmente anticorpos e composições de anticorpos que se ligam específica e seletivamente aos polissacarídeos capsulares ou glicoconjugados da presente divulgação. Em algumas modalidades, anticorpos são gerados sob administração dos polissacarídeos ou glicoconjugados da presente divulgação a um sujeito. E, algumas modalidades, a divulgação fornece anticorpos purificados ou isolados direcionados contra um ou mais dos polissacarídeos capsulares ou glicoconjugados da presente divulgação. Em algumas modalidades, os anticorpos da presente divulgação são funcionais, como medido pela morte de bactérias ou em um modelo de eficiência animal ou através de um ensaio de mortalidade opsonofagocítica. Em algumas modalidades, os anticorpos da divulgação oferecem imunidade passiva a um sujeito. A presente divulgação fornece adicionalmente moléculas de polinucleotídeo codificando um anticorpo ou fragmento de anticorpo da divulgação, e uma célula, linhagem celular (como, por exemplo, células de hibridoma ou outras linhagens celulares modificadas para produção recombinante de anticorpos) ou um animal transgênico que produz um anticorpo ou composição de anticorpo da divulgação usando técnicas bem conhecidas por aqueles versados na técnica.
Exemplos Exemplo 1: preparação de conjugado de polissacarídeo de serotipo 22F-CRMi97 1.1 Preparação de polissacarídeo de serotipo 22F de Streptococcus pneumoniae isolado
[00310] Polissacarídeos capsulares de serotipo 22F podem ser obtidos diretamente de bactérias usando procedimentos de isolamento conhecidos por alguém ordinariamente versado na técnica (ver, por exemplo, os métodos divulgados nas Pub. de Apl. de Patentes Norte- Americanas Nos. 20060228380, 20060228381, 20070184071, 20070184072, 20070231340, e 20080102498 ou WO2008118752). O serotipo 22F de Streptococcus pneumoniae foi cultivado em um frasco de semente e então transferido a um fermentador de sementes. Uma vez que a densidade óptica alvo foi alcançada, as células foram transferidas para um fermentador de produção. O broto de fermentação foi inativado pela adição de N-lauroil sarcosina e purificado por ultrafiltração e diafiltração.
[00311] O polissacarídeo de serotipo 22F de Streptococcus pneumoniae foi dimensionado por homogeneização a alta pressão usando o homogeneizador PANDA 2K® (GEA Niro Soavi) para produzir o polissacarídeo de serotipo 22F de Streptococcus pneumoniae.
1.2 Oxidação de polissacarídeo de serotipo 22F de Streptococcus pneumoniae isolado
[00312] A oxidação do polissacarídeo foi realizada em tampão de fosfato de potássio 100 mM (pH 5,8 ± 0,2) obtido pela adição sequencial da quantidade calculada de tampão de fosfato de potássio 500 mM (pH 5,8) e WFI para gerar uma concentração de polissacarídeo final de 2,0 g/L. Se necessário, o pH de reação é ajustado para aproximadamente 5,8. Após o ajuste de pH, a temperatura de reação foi reduzida para 5 ± 3°C. A oxidação foi iniciada pela adição de 0,10 ± 0,02 equivalentes molares (MEq) de periodato de sódio. O tempo de reação de oxidação alvo é de 16 ± 1 h a 5 ± 3°C.
[00313] A reação de oxidação foi extinta com 2 MEq de 2.3- butadienol sob agitação contínua a 5 ± 3°C por 1-2 h.
[00314] A concentração e diafiltração do polissacarídeo ativado foi realizada usando cassetes de ultrafiltração 100K MWCO. A diafiltração foi realizada contra um diavolume de 35 vezes de WFI. O polissacarídeo ativado purificado foi armazenado a 5 ± 3°C. O sacarídeo ativado purificado é caracterizado interalia por (i) peso molecular por SEC-MALLS, (ii) presença de O-acetila e (iii) grau de oxidação.
[00315] SEC-MALLS é usada para a determinação do peso molecular de polissacarídeos e conjugados de polissacarídeo-proteína. SEC é usada para separar os polissacarídeos por volume hidrodinâmico. Detectores de índice refrativo (RI) e espalhamento de luz laser multiangular (MALLS) são usados para a determinação do peso molecular. Quando a luz interage com a matéria, ela se espalha e a quantidade de luz espalhada está relacionada com a concentração, o quadrado do dn/dc (incrementos de índice refrativo específicos), e a massa molar da matéria. A medida de peso molecular é calculada baseada em leituras de sinal de luz espalhada do detector de MALLS e o sinal de concentração do detector de RI.
[00316] O grau de oxidação (DO = mols de unidade de repetição de açúcar/mols de aldeído) do polissacarídeo ativado foi determinado como a seguir:
[00317] Os mols de unidade de repetição de açúcar são determinados por vários métodos colorimétricos como, por exemplo, usando o método de antrona. O polissacarídeo é primeiro quebrado em monossacarídeos pela ação de ácido sulfúrico e calor. O reagente de antrona reage com as hexoses para formar um complexo de cor amarelo-esverdeada cuja absorbância é lida espectofotometricamente a 625 nm. Dentro da faixa do ensaio, a absorbância é diretamente proporcional à quantidade de hexose presente.
[00318] Os mols de aldeído também são determinados simultaneamente usando o método colorimétrico de MBTH. O ensaio de MBTH envolve a formação de um composto de azina pela reação de grupos aldeído (de uma dada amostra) com uma 3-metil-2- benzotiazolona hidrazona (reagente de ensaio de MBTH). A 3-metil-2- benzotiazolona hidrazona em excesso é oxidada para formar um cátion reativo. O cátion reativo e a azina reagem para formar um cromóforo azul. O cromóforo formado é então lido espectroscopicamente a 650 nm.
1.3 Conjugação de um polissacarídeo de serotipo 22F de Streptococcus pneumoniae ativado com CRM197
[00319] O processo de conjugação consiste nas seguintes etapas:
[00320] a. Composição com excipiente de sacarose e liofilização.
[00321] b. Reconstituição do polissacarídeo liofilizado e CRM197.
[00322] c. Conjugação de polissacarídeo ativado com CRM197 e terminação.
[00323] d. Purificação do conjugado
[00324] a. Composição com excipiente de sacarose e liofilização
[00325] O polissacarídeo ativado foi composto com sacarose (50% p/v em WFI) para uma razão de 25 gramas de sacarose por grama de polissacarídeo ativado. O frasco da mistura composta foi então liofilizado. Após a liofilização, as garrafas contendo polissacarídeo ativado liofilizado foram armazenadas a -20 ± 5°C. A quantidade calculada de proteína CRM197 (razão de entrada S/P alvo = 1) foi congelada e liofilizada separadamente. A CRM197 liofilizada foi armazenada a -20 ± 5°C.
[00326] b. Reconstituição do polissacarídeo liofilizado e CRM197
[00327] O polissacarídeo ativado liofilizado foi reconstituído em dimetil sulfóxido (DMSO) anidro. Após dissolução completa do polissacarídeo, uma quantidade igual de DMSO anidro foi adicionada à CRM197 liofilizada para reconstituição.
[00328] c. Conjugação de polissacarídeo ativado com CRM197 e terminação
[00329] A CRM197 reconstituída (em DMSO) foi combinada em um vaso de reação de conjugação com o polissacarídeo ativado reconstituído. A concentração de polissacarídeo final na solução de reação foi de 1 g/L. A conjugação foi iniciada pela adição de 1,5 ± 0,1 MEq de cianoboroidreto de sódio à mistura de reação e a reação foi incubada a 23 ± 2°C por 20 ± 2 h. A terminação da reação de conjugação é realizada pela adição de 2 MEq de boroidreto de sódio. A reação de terminação foi incubada a 23 ± 2°C por 3 ± 1 h.
[00330] d. Purificação do conjugado
[00331] A solução de conjugado foi diluída 1:5 com succinato 5 mM- 0,9% de salmoura (pH 6,0) resfriado em preparação para purificação por filtração com fluxo tangencial usando membranas 100K MWCO e uma diafiltração 20X foi realizada usando succinato 5 mM-0,9% de salmoura (pH 6,0) como meio. Após a conclusão da diafiltração, o retentado de conjugado foi adicionalmente diluído, filtrado através de um filtro de 0,22 μm e armazenado a 2-8°C.
[00332] A Tabela 1 inclui os dados de caracterização de conjugados de polissacarídeo de serotipo 22F-CRM197 obtidos pelo método da invenção. Em particular, os conjugados 5 e 6 da tabela foram obtidos como divulgado no Exemplo 1.
[00333] Os conjugados de polissacarídeo de serotipo 22F-CRM197 gerados pelo processo de RAC-DMSO forneceram rendimentos melhores e exibiram melhor consistência entre bateladas no MW ao longo de níveis de % de sacarídeos livres significantemente menores pelo processo de RAC-aquoso, como mostrado na Tabela 1. % de rendimento de conjugado é calculada como a seguir: (quantidade de polissacarídeo no conjugado x 100) / quantidade de polissacarídeo ativado.
Exemplo 2: Preparação de conjugado de polissacarídeo de serotipo IOA-CRM197 2.1 Preparação de polissacarídeo de serotipo 10A de Streptococcus pneumoniae isolado
[00334] Polissacarídeos de serotipo 10A isolados foram obtidos como divulgado no Exemplo 1.1 exceto que o polissacarídeo purificado não foi dimensionado.
2.2 Oxidação de polissacarídeo capsular de serotipo 10A de Streptococcus pneumoniae isolado
[00335] Um volume calculado de tampão de fosfato de potássio 0,1M (pH 6,0) e água para injeção (WFI) foi adicionado à solução de polissacarídeo para alcançar uma concentração de polissacarídeo final de 2,5 g/L e uma concentração final de tampão de fosfato de potássio 25 mM e, se necessário, o pH necessário foi ajustado para aproximadamente 6,0. O polissacarídeo diluído foi então resfriado para 5 ± 3°C. A oxidação foi iniciada pela adição de 0,25 ± 0,02 equivalentes molares (MEq) de solução de periodato de sódio. O tempo de reação de oxidação foi de aproximadamente 4 h a 5 ± 3°C. A reação de oxidação foi extinta com 1 MEq de 2,3-butanodiol sob agitação contínua a 5 ± 3°C por 1-2 h.
[00336] Após a reação pelo tempo de reação, o polissacarídeo ativado foi concentrado usando cassetes de filtração de 20K MWCO Millipore. A diafiltração foi então realizada contra um diavolume de 20 vezes de WFI. O polissacarídeo ativado purificado foi armazenado a 5 ± 3°C. O sacarídeo ativado purificado é caracterizado interalia por (i) peso molecular por SEC-MALLS e (ii) grau de oxidação.
2.3 Conjugação de um polissacarídeo de serotipo 10A de Streptococcus pneumoniae ativado com CRM197
[00337] O processo de conjugação consiste nas seguintes etapas:
[00338] a. Composição com excipiente de sacarose e liofilização.
[00339] b. Reconstituição do polissacarídeo liofilizado e CRM197.
[00340] c. Conjugação de polissacarídeo ativado com CRM197 e terminação.
[00341] d. Purificação do conjugado
[00342] a. Composição com sacarose
[00343] O polissacarídeo ativado foi composto com sacarose para uma razão de 25 ± 2,5 gramas de sacarose por grama de polissacarídeo ativado. O frasco da mistura composta foi então liofilizado. Após a liofilização, as garrafas contendo polissacarídeo ativado liofilizado foram armazenadas a -20 ± 5°C.
[00344] b. Reconstituição do polissacarídeo liofilizado ativado e a proteína CRM197
[00345] O polissacarídeo ativado liofilizado foi reconstituído em dimetil sulfóxido (DMSO) anidro. Após dissolução completa do polissacarídeo, uma quantidade igual de DMSO anidro foi adicionada à CRM197 calculada para reconstituição.
[00346] c. Conjugação de polissacarídeo ativado com CRM197 e terminação
[00347] A CRM197 reconstituída (em DMSO) foi adicionada ao polissacarídeo ativado reconstituído no reator de conjugação. A concentração de polissacarídeo final foi de 1 g/L. A conjugação foi realizada pela adição de 1,2 ± 0,1 MEq de cianoboroidreto de sódio à mistura de reação. A terminação da reação de conjugação é realizada pela adição de 2 MEq de boroidreto de sódio. A reação de terminação foi incubada a 23 ± 2°C por 3 ± 1 h.
[00348] A terminação da reação de conjugação é realizada pela adição de 2 MEq de boroidreto de sódio. Esta reação de terminação procedeu por 3 ± 1 h a 23 ± 2°C.
[00349] d. Purificação do conjugado
[00350] A solução de conjugado foi então diluída 5x (em volume) com succinato 5 mM-0,9% de salmoura (pH 6,0) resfriado (pH 6,0 e uma diafiltração 20X foi realizada usando succinato 5 mM-0,9% de salmoura (pH 6,0)). Após a diafiltração final ter sido completada, o retentado conjugado foi transferido através de um filtro de 0,22 μm. O conjugado foi diluído adicionalmente com succinato 5 mM / 0,9% de salmoura (pH 6), e após a etapa de filtração a 0,22 μm final, ele foi armazenado a 2-8°C.
[00351] A Tabela 2 inclui os dados de caracterização de conjugados de polissacarídeo de serotipo 10A-CRM197 obtidos pelo método da invenção. Em particular, os conjugados 4 a 6 da Tabela 2 foram obtidos como divulgado no Exemplo 2.
[00352] Os conjugados de polissacarídeo de serotipo 10A-CRM197 gerados pelo processo de RAC-DMSO forneceram rendimentos melhores e exibiram melhor consistência entre bateladas no MW ao longo de níveis de % de sacarídeos livres significantemente menores e de modificação de proteína carreadora (Lisina) maiores, quando comparado aos conjugados gerados pelo processo RAC-aquoso, como mostrado na Tabela 2.
Exemplo 3: Preparação de conjugado de polissacarídeo de serotipo 33F-CRM197 3.1 Preparação de polissacarídeo de serotipo 33F de Streptococcus pneumoniae isolado
[00353] Polissacarídeos de serotipo 33F isolados foram obtidos como divulgado no Exemplo 1.1.
3.2 Oxidação polissacarídeo capsular de serotipo 33F de Streptococcus pneumoniae isolado
[00354] Um volume calculado de tampão de fosfato de sódio 0,1M (pH 6,0) e água para injeção (WFI) foi adicionado à solução de polissacarídeo para alcançar uma concentração de polissacarídeo final de 2 g/L. Se necessário, o pH foi ajustado para aproximadamente 6,0. O polissacarídeo diluído foi então resfriado para 5 ± 3°C. A oxidação foi iniciada pela adição de 0,1 equivalentes molares (MEq) de solução de periodato de sódio. A reação de oxidação foi extinta com 1 MEq de 2,3-butanodiol sob agitação contínua a 5 ± 3°C por cerca de 1 hora. Após a reação pelo tempo de reação, o polissacarídeo ativado foi concentrado usando cassetes de filtração de 100K MWCO Millipore. A diafiltração foi então realizada contra um diavolume de 40 vezes de WFI. O polissacarídeo ativado purificado foi armazenado a 5 ± 3°C. O sacarídeo ativado purificado é caracterizado interalia por (i) peso molecular por SEC-MALLS e (ii) grau de oxidação.
3.3 Conjugação de um polissacarídeo de serotipo 33F de Streptococcus pneumoniae ativado com CRM197
[00355] O conjugado de sacarídeo de serotipo 33F-CRM197 foi obtido por um processo similar ao processo do Exemplo 1.3 usando o polissacarídeo de 33F ativado obtido no Exemplo 3.2.
[00356] Os conjugados de polissacarídeo de serotipo 33F-CRM197 gerados pelo processo de RAC-DMSO forneceram rendimentos melhores e exibiram melhor consistência entre bateladas em termos da preservação dos níveis de O-acetila ao longo de níveis de % de sacarídeos livres significantemente menores e de modificação de proteína carreadora (Lisina) maiores, quando comparado aos conjugados gerados pelo processo RAC-aquoso, como mostrado na Tabela 3. LOQ = Limite de Quantificação
Exemplo 4: Efeito de extinção no peso molecular dos polissacarídeos de serotipo 22F e 33F ativados
[00357] A ativação dos polissacarídeos 22F e 33F foi realizada ou a 4°C ou a 22°C. Ambas as temperaturas resultaram em valores de DO similares. Entretanto, devido ao fato de que a temperatura elevada resultou em quebra mais rápida de polissacarídeo ativado, reduzindo, através disto, o MW do Poli (como mostrado quando comparando, por exemplo, a Figura 4 (22°C) e a Figura 5 (4°C)), 4°C foi geralmente preferido para a reação de ativação. Em adição a isto, dados de ativação mostraram que a extinção de NaIO4 não reagido após a oxidação é uma etapa essencial para ativação, especialmente para ativação usando uma quantidade maior de NaIO4. O gráfico mostrado na Figura 6 indica que o MW do polissacarídeo 33F ativado é relativamente estável com concentrações crescentes de periodato usadas para ativação (com extinção), enquanto que tal MW é altamente variável quando nenhuma etapa de extinção é usada. Em condições específicas ajustadas para se obter um grau de oxidação alvo, o peso molecular do polissacarídeo ativado é menos variável quando a etapa de extinção for usada. A adição de reagente de extinção após a oxidação auxilia na manutenção da integridade estrutural do polissacarídeo ativado até a conclusão da purificação, por exemplo, por ultrafiltração e diafiltração.
Exemplo 5: Ensaio de atividade opsonofagocítica (OPA)
[00358] A imunogenicidade dos conjugados obtidos pelos processos divulgados aqui pode ser avaliada usando o ensaio opsonofagocítico (OPA) descrito abaixo.
[00359] Grupos de trinta ratos Swiss Webster fêmeas de 67 semanas de idade foram imunizados com 0,001 μg, 0,01 μg ou 0,1 μg de conjugados de teste através da rota subcutânea na semana 0. Os ratos foram amplificados com a mesma dose de conjugado na semana 3 e então sangrados na semana 4. OPAs serotipo-específicos foram realizados nos soros da semana 4.
[00360] Ensaios de atividade opsonofagocítica (OPA) validados são usados para medir os anticorpos funcionais em soros de murinos específicos para serotipo 10A, 22F ou 33F de S. pneumoniae. O soro de teste é ajustado em reações de ensaio que medem a habilidade da imunoglobina específica para polissacarídeo capsular opsonizar bactérias e ativar a deposição de complementos, facilitando, através disso, a fagocitose e a morte de bactérias por fagócitos. O título de OPA é definido como a diluição recíproca que resulta em uma redução de 50% na contagem bacteriana em poços de controle sem o soro de teste. O título de OPA é interpolado de duas diluições que envolvem este corte de mortalidade de 50%.
[00361] Os procedimentos de OPA foram baseados em métodos descritos em Hu et al., Clin Diagn Lab Immunol 2005;12 (Fevereiro (2)):287-95, com as seguintes modificações: o soro de teste serialmente diluído em 2,5 vezes e adicionado a placas de ensaio de microtitulação. Linhagens bacterianas de serotipo 10A, 22F e 33F alvos vivas foram adicionadas aos poços e as placas foram agitadas ou a 25°C (serotipo 22F) ou a 37°C (serotipos 10A e 33F) por 30 minutos. Células HL-60 diferenciadas (fagócitos) e soro de bebê de coelho (3 a 4 semanas de idade, Pel-Freez®, concentração final de 12,5%) foram adicionados aos poços, e as placas foram agitadas a 37°C por 45 minutos (serotipos 22F e 33F) ou 60 minutos (serotipo 10A). Para terminar a reação, 80 μL de NaCl 0,9% foram adicionados a todos os poços, misturados, e uma alíquota de 10 μL foi transferida para os poços de placas de filtro MultiScreen HTS HV (Milipore®) contendo 200 μL de água. O líquido foi filtrado através das placas sob vácuo, e 150 μL de meio HySoy foi adicionado a cada poço e filtrado. As placas de filtro foram então incubadas a 37°C, com 5% de CO2 da noite para o dia e foram então fixas com solução de remoção de manchas (Bio-Rad). As placas foram então manchadas com Azul de Coomassie e tiveram suas manchas removidas uma vez. As colônias foram visualizadas e enumeradas em um Cellular Technology Limited (CTL) ImmunoSpot Analyzer®. Contagens de colônia brutas foram usadas para plotar curvas de mortalidade e calcular títulos de OPA.
[00362] Conjugados de polissacarídeo de serotipo 10A-CRM197, conjugados de polissacarídeo de serotipo 22F-CRM197 e conjugados de polissacarídeo de serotipo 33F-CRM197 obtidos como divulgado nos Exemplos 1 a 3 foram testados no ensaio de OPA divulgado acima e foram descobertos como sendo imunogênicos.

Claims (18)

1. Processo de preparação de um conjugado imunogênico compreendendo polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F de Streptococcus pneumoniae, covalentemente ligado com uma proteína carreadora, caracterizado pelo fato de que tal processo inclui as etapas de: (a) reação de um polissacarídeo capsular de serotipo 10A, 22F ou 33F isolado com 0,05 a 0,2 equivalentes molares de periodato para 22F, 0,1 a 0,3 equivalentes molares de periodato para 10A ou 0,05 a 0,2 equivalentes molares de periodato para 33F; (b) extinção da reação de oxidação pela adição de 1 a 3 equivalentes molares para 22F, 0,5 a 2 equivalentes molares para 10A, 0,5 a 2 equivalentes molares para 33F de um agente de extinção, onde o agente de extinção é butan-2,3-diol, resultando em um polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado, em que o grau de oxidação do serotipo ativado 10A, 22F ou 33F ativado está entre 8 e 14, o serotipo ativado 22F está entre 10 e 20 ou o serotipo ativado 33F está entre 9 e 18; (c) composição do dito polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F com uma proteína carreadora; e (b) reação do composto, polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado e proteína carreadora com um agente redutor selecionado do grupo consistindo em cianoboroidreto de sódio, triacetoxiboroidreto de sódio, boroidreto de sódio ou zinco na presença de ácidos de Bronsted ou Lewis para formar um conjugado de polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F: proteína carreadora.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração do polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F na etapa (a) é entre 0,5 e 5 mg/L.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o periodato é metaperiodato de sódio.
4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado pelo fato de que a reação de oxidação é extinta pela adição de 1 a 2 equivalentes molares de agente de extinção.
5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado pelo fato de que a temperatura da reação na etapa (b) é mantida entre 1 e 10°C.
6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado pelo fato de que a duração da etapa (b) está entre 0,5 a 2 horas.
7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo ativado é purificado depois da etapa (b).
8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado pelo fato de que o referido processo compreende ainda a etapa de: (e) terminação de aldeídos não reagidos no conjugado de polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F:proteína carreadora.
9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado pelo fato de que as etapas (c) e (d) são realizadas em DMSO ou em uma solução aquosa.
10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado pelo fato de que a concentração de polissacarídeo ativado na etapa (b) é entre 0,1 e 10 mg/mL, 0,5 e 5 mg/mL, ou 0,5 e 2 mg/mL.
11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado pelo fato de que a razão inicial de polissacarídeo de serotipo 10A, 22F ou 33F ativado para proteína carreadora está entre 5:1 e 0,1:1, 2:1 e 0,1:1, 2:1 e 1:1, 1,5:1 e 1:1, 0,1:1 e 1:1, 0,3:1 e 1:1, ou 0,6:1 e 1,2:1.
12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado pelo fato de que, na etapa (d), o polissacarídeo ativado é reagido com entre 0,5 a 2,5 equivalentes molares de cianoboroidreto de sódio.
13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma etapa de purificação do conjugado de polissacarídeo: proteína carreadora.
14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado pelo fato de que a proteína carreadora é CRM197.
15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado pelo fato de que o referido polissacarídeo isolado é um polissacarídeo de serotipo 22F de Streptococcus pneumoniae isolado.
16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado pelo fato de que o referido polissacarídeo isolado é um polissacarídeo de serotipo 10A de Streptococcus pneumoniae isolado.
17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado pelo fato de que o referido polissacarídeo isolado é um polissacarídeo de serotipo 33F de Streptococcus pneumoniae isolado.
18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado pelo fato de que o referido processo compreende ainda a etapa de formulação do conjugado em uma vacina multivalente.
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