KR20130136011A - 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 19ａ 폴리사카라이드 분자량을 조절하는 방법 - Google Patents

스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 19ａ 폴리사카라이드 분자량을 조절하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고분자량의 단리된 스트렙토코커스 뉴모니에( Streptococcus pneumoniae) 19A 캡슐형 폴리사카라이드를 함유하는 용액을 제조하는 개선된 방법을 제공한다. 특정 방법에서, 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드를 생성하는 스트렙토코커스 뉴모니에 세균 세포의 발효 배양물을 6 시간 미만동안 발효시킨 다음 세균 세포를 용해시키고 캡슐형 폴리사카라이드를 수거한다. 다른 방법에서는, CO2를 발효 배양물에 공급한다. 발효 배양물에 CO2를 공급하는 것은 발효 배양물에 중탄산염 이온의 첨가, 발효 배양물에 탄산염 이온의 첨가, 발효 배양물에 중탄산염과 탄산염 이온의 혼합물의 첨가, 및 발효 배양물을 CO2로 덮는 것을 포함한다.

Description

스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 19Ａ 폴리사카라이드 분자량을 조절하는 방법{METHOD FOR CONTROLLING STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE SEROTYPE 19A POLYSACCHARIDE MOLECULAR WEIGHT}
본 발명은 수거 시간을 조절함으로써, 단리된 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae) 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드의 분자량을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
유기체 스트렙토코커스 뉴모니에(폐렴구균(pneumococcus)으로도 알려져 있음)에 의해 야기된 침윤성 질환의 예방과 관련된 다가 접합체 폐렴구균 백신의 제조에 있어서 선택된 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형을 성장시켜 백신의 제조에 필요한 폴리사카라이드를 공급한다. 세포는 발효조에서 성장시키며 발효 마지막에 나트륨 데옥시콜레이트 또는 대체 세포용해제를 첨가하여 세포용해를 유도한다. 이어서, 후속 정제 및 세균 세포를 둘러싸고 있는 캡슐형 폴리사카라이드의 회수를 위해 세포용해액을 수거한다. 폴리사카라이드는 담체 단백질과 접합된 후 최종 백신 생성물에 함유되고, 백신의 표적 개체군에서 선택 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형에 대해 면역성을 부여한다.
폴리사카라이드 크기는 각각의 제조 배치에서 분석되고 적절히 제어되어야 하는 품질 특성이다. 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 19A 폴리사카라이드에 관하여, 폴리사카라이드의 크기는 발효 pH, 발효 온도 및 유지 온도와 같은 파라미터에 의해 영향받을 수 있다. 또한, 19A 폴리사카라이드의 열 분해가 발효/회수 및 정제 과정 둘 다에 걸쳐 일어나서, 19A 폴리사카라이드의 대규모 제조를 위해 생산 공정을 규모 확대할 때 다양한 파라미터를 성공적으로 처리하고 제어하기 위한 추가의 노력이 필요하다.
따라서, 세포성 스트렙토코커스 뉴모니에 세포용해물로부터 고분자량 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드를 회수하기 위한 개선된 방법이 요구된다.
세포성 스트렙토코커스 뉴모니에 세포용해물로부터 고분자량 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드를 회수하기 위한 개선된 방법이 제공된다. 한 방법에서, 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드를 생성하는 스트렙토코커스 뉴모니에 세균 세포의 발효 배양물을 6 시간 미만동안 발효시킨 후 세균 세포를 용해시키고 캡슐형 폴리사카라이드를 수거한다. 따라서, 본 발명의 한 태양에서, 상기 방법은 1) 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드를 생성하는 스트렙토코커스 뉴모니에 세균 세포의 발효 배양물을 제조하고; 2) 발효 배양물을 6 시간 미만동안 발효시키고; 3) 발효 배양물 중 세균 세포를 용해시키고; 4) 발효 배양물로부터 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드를 단리함으로써; 고분자량의 단리된 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드를 함유하는 용액을 제조하는 단계를 포함한다. 특정 태양에서, 발효 배양물을 5 시간 미만동안 배양시킨다. 다른 태양에서는, 발효 배양물을 4 시간 미만동안 발효시킨다. 또 다른 태양에서는, 발효 배양물을 3 내지 6 시간동안 발효시킨다. 또 다른 태양에서, 단리된 스트렙토코커스 뉴모니에 캡슐형 폴리사카라이드의 분자량은 480 kDa 이상이다.
본 발명의 또 다른 태양에서, 상기 방법은 또한 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 19A 폴리사카라이드를 생성하는 세균 세포의 발효 배양물에 CO2를 공급하는 것을 포함한다. 따라서, 한 태양에서, 본 발명의 방법은 1) 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드를 생성하는 스트렙토코커스 뉴모니에 세균 세포의 발효 배양물을 제조하고; 2) 발효 배양물에 CO2를 공급하고; 3) 발효 배양물을 6 시간 미만동안 발효시키고; 4) 발효 배양물 중 세균 세포를 용해시키고; 5) 발효 배양물로부터 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드를 단리함으로써; 고분자량의 단리된 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드를 함유하는 용액을 제조하는 단계를 포함한다. 특정 태양에서, 발효 배양물에 CO2를 공급하는 것은 발효 배양물에 중탄산염 이온(HCO3 _)을 첨가하는 것, 예를 들면, 발효 배양물에 NaHCO3(중탄산나트륨)을 첨가하는 것을 포함한다. 다른 태양에서, 발효 배양물에 CO2를 공급하는 것은 발효 배양물에 탄산염 이온(CO3 2 -)을 첨가하는 것, 예를 들면, 발효 배양물에 Na2CO3(탄산나트륨)을 첨가하는 것을 포함한다. 또 다른 태양에서, 발효 배양물에 CO2를 공급하는 것은 NaHCO3의 1차 첨가 및 Na2CO3의 2차 첨가를 포함한다. 또 다른 태양에서, 발효 배양물에 CO2를 공급하는 것은 발효 배양물을 CO2로 덮는 것을 포함한다. 또 다른 태양에서, 단리된 스트렙토코커스 뉴모니에 캡슐형 폴리사카라이드의 분자량은 480 kDa 이상이다.
또 다른 태양으로, 본 발명은 전술한 벙법들 중 임의의 방법에 의해 제조된, 고분자량 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드를 함유하는 용액에 관한 것이다.
도 1은 3 L 규모의 실험실 연구에서 적정 염기로서 Na2CO3를 사용한 발효 단계동안 흡광도(OD), 염기 및 글루코스 수준을 나타낸 것이다. 그램(g)으로 나타낸 염기는 플롯팅을 위해 10으로 나눈 것이다.
도 2는 3 L 규모의 실험실 연구에서 적정 염기로서 NaOH를 사용한 발효 단계동안 흡광도(OD), 염기 및 글루코스 수준을 나타낸 것이다. 그램(g)으로 나타낸 염기는 플롯팅을 위해 10으로 나눈 것이다.
도 3은 Na2CO3 또는 NaOH의 대체 염기 공급물에 대한 다양한 pH 조정값에서 총 단백질 및 폴리사카라이드 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 19A 폴리사카라이드의 제조시 발효 회수 시간의 함수로서 분자량을 나타낸 것이다.
도 5는 19A 폴리사카라이드의 제조시 회수 시간의 함수로서 흡광도(OD) 당 시간 당 특정 염기 소모량을 나타낸 것이다. 그램(g)으로 나타낸 염기는 플롯팅을 위해 10으로 나눈 것이다.
도 6은 19A 폴리사카라이드 제조시 특정 염기 사용량의 함수로서 분자량을 나타낸 것이다.
스트렙토코커스 뉴모니에는 통상적으로 쌍으로(쌍구균) 뿐 아니라 단쇄 또는 단세포로 존재하는 그램-양성의 란셋(lancet)형 구균이다. 이들은 반짝이는 콜로니를 형성하면서 혈액 한천 플레이트에서 순조롭게 성장하며, 혐기적으로(이때는 베타 용혈반응을 나타낸다) 성장하지 않는 한 알파 용혈반응을 나타낸다. 대부분의 폐렴구균 혈청형을 갖는 세포는 각 세포를 둘러싸고 있는 폴리사카라이드 코팅인 캡슐을 갖는다. 이 캡슐은 항체가 세균 세포에 부착하는 것을 방지함으로써 식균작용을 방해하기 때문에 인간에서 독성의 결정요인이다. 현재, 90종을 초과하는 공지된 폐렴구균 캡슐형 혈청형이 확인되어 있으며, 23종의 가장 흔한 혈청형이 전세계에 침윤성 질환의 약 90%를 차지한다.
백신으로서, 폐렴구균 폴리사카라이드 코팅은 발현되거나 미손상된 면역 시스템을 갖는 개체에서 스트렙토코커스 뉴모니에에 대해 적당한 정도의 면역성을 제공할 수 있으나, 폴리사카라이드와 접합된 단백질은 또한 대부분 폐렴구균 감염에 위험한 유아 및 노인에서 면역 반응을 가능케 한다. 폐렴구균 세포는 발효조에서 성장시키며 발효 마지막에 세포용해를 유도한다. 이어서, 세포용해액을 후속 정제 및 캡슐형 폴리사카라이드 회수를 위해 수거한다.
폴리사카라이드 크기는 각각의 제조 배치에서 분석되고 적절히 제어되어야 하는 품질 특성이다. 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드의 분자량은 발효 공정의 파라미터에 의해 영향받을 수 있다. 본 발명의 방법은 세포성 스트렙토코커스 뉴모니에 세포용해물로부터 고분자량의 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드의 회수를 가능케 한다.
본 발명의 방법을 개발할 때, 최종 폴리사카라이드 수율 및 분자량을 조절하기 위한 시도로 하이소이(HySoy)의 농도 및 염기 적정제의 선택을 변형하였다. 4가지의 발효 방법을 시험하였다. 첫 번째는 28 g/L 하이소이와 함께 기준치 NaOH 공정을 이용하였다. 두 번째 방법은 염기 적정제로서 20% 탄산나트륨 및 20 g/L 하이소이를 사용하였다. 세 번째 방법은 중탄산나트륨의 배치공정 전체에 걸쳐 탄산염을 도입하고 혼합 NaOH/탄산염 염기 적정제를 사용함으로써 처음 2가지 방법의 이점을 결합시켰다. 네 번째 방법은 성장을 강화하기 위해 10 mM 중탄산염을 첨가하면서 염기 적정제로서 탄산염을 사용하였다.
발효동안 염기 적정제로서 NaOH를 사용하는 것은 단백질을 제거하고 여과를 개선하기 위해 기포형성없이 데옥시콜레이트 세포용해물을 pH 5.0으로 저하시킬 수 있다는 이점을 갖지만, 저분자량 폴리사카라이드(<450 kDa)를 생성하였다. Na2CO3는 보다 고분자량을 제공하지만, 데옥시콜레이트 세포용해물의 pH가 저하되는 경우 기포형성 문제를 나타내었다. 6.6의 보다 높은 pH 유지 단계에서, Na2CO3를 사용하는 발효는 후속 여과 문제와 함께, 겔-유사 물질을 형성하였다. pH 적정제로서 NaOH와 Na2CO3의 블렌드를 사용하여 Na2CO3의 양을 최소화한 경우, 대량의 CO2의 갑작스런 방출로 인한 기포형성 및 여과 문제가 배제되면서 Na2CO3의 분자량 크기 이점이 제공되었다. 성장을 강화하기 위한 10 mM NaHCO3 첨가와 함께 염기 적정제로서 20% Na2CO3(w/v)의 사용(네 번째 방법)은 일관된 고분자량 폴리사카라이드를 고수율로 생성하였다.
하이소이 농도 및 염기 적정제 이외에, 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드 분자량에 대한 수거 시간의 영향 또한 연구하였다. 세균 세포를 용해시키기 전에 6 시간 미만동안 발효 배양물을 발효시키는 것이 세포성 스트렙토코커스 뉴모니에 세포용해물로부터 고분자량 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드를 생성하는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은 세포성 스트렙토코커스 뉴모니에 세포용해물로부터 고분자량 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드를 회수하는 개선된 방법을 제공한다. 한 방법에서, 하기의 단계를 포함하는, 고분자량의 단리된 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드를 함유하는 용액을 제조하는 방법이 제공된다: 1) 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드를 생성하는 스트렙토코커스 뉴모니에 세균 세포의 발효 배양물을 제조하고; 2) 발효 배양물을 6 시간 미만동안 발효시키고; 3) 발효 배양물 중 세균 세포를 용해시키고; 4) 발효 배양물로부터 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드를 단리함으로써; 고분자량의 단리된 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드를 함유하는 용액을 제조하는 단계. 특정 태양에서, 발효 배양물은 약 7 시간 미만, 약 6.5 시간 미만, 약 6 시간 미만, 약 5.5 시간 미만, 약 5 시간 미만, 약 4.5 시간 미만, 약 4 시간 미만 또는 약 3.5 시간 미만 동안 발효시킨다. 또 다른 태양에서, 발효 배양물은 3 내지 7 시간동안, 3 내지 6.5 시간동안, 3 내지 6 시간동안, 3 내지 5.5 시간동안, 3 내지 5 시간동안, 3 내지 4.5 시간동안, 3 내지 4 시간동안, 또는 3 내지 3.5 시간동안 발효시킨다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 전술한 방법에 의해 제조된, 고분자량 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드를 함유하는 용액에 관한 것이다.
또 다른 태양에서, 본 발명의 방법은 또한 하기의 단계를 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 19A 폴리사카라이드를 생성하는 세균 세포의 발효 배양물에 CO2를 공급하는 것을 포함한다: 1) 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드를 생성하는 스트렙토코커스 뉴모니에 세균 세포의 발효 배양물을 제조하고; 2) 발효 배양물에 CO2를 공급하고; 3) 발효 배양물을 6 시간 미만동안 발효시키고; 4) 발효 배양물 중 세균 세포를 용해시키고; 5) 발효 배양물로부터 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드를 단리함으로써; 고분자량의 단리된 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드를 함유하는 용액을 제조하는 단계. 또 다른 태양에서, 본 발명은 전술한 방법에 의해 제조된, 고분자량 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드를 함유하는 용액에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 고분자량 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드를 생성한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "고분자량"은 적어도 약 480 kDa, 약 490 kDa, 약 500 kDa, 약 510 kDa, 약 520 kDa, 약 525 kDa, 약 550 kDa, 약 575 kDa, 약 600 kDa, 약 625 kDa, 약 650 kDa, 약 675 kDa, 약 700 kDa, 약 725 kDa, 약 750 kDa, 약 775 kDa, 약 800 kDa, 약 825 kDa, 약 850 kDa, 약 875 kDa, 약 900 kDa, 약 925 kDa, 약 950 kDa, 약 975 kDa 또는 약 1000 kDa인 분자량을 말한다.
특정 방법에서, 발효 배양물에 CO2를 공급하는 것은 발효 배양물에 중탄산염 이온(HCO3 _)을 첨가하는 것, 예를 들면, 발효 배양물에 NaHCO3를 첨가하는 것을 포함한다. 5 내지 50 mM, 예를 들면, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM 또는 50 mM의 NaHCO3 첨가를 이용할 수 있다. 다른 방법에서, 발효 배양물에 CO2를 공급하는 것은 발효 배양물에 탄산염 이온(CO3 2 -)을 첨가하는 것, 예를 들면, 발효 배양물에 Na2CO3를 첨가하는 것을 포함한다. 0.1 내지 2.0 M, 예를 들면, 0.1 M, 0.2 M, 0.4 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.9 M, 1.0 M, 1.5 M, 1.8 M 또는 2.0 M의 Na2CO3 첨가를 이용할 수 있다. 중량/부피(w/v) 등가량, 예를 들면, 5%(w/v) Na2CO3, 10%(w/v) Na2CO3, 또는 20%(w/v) Na2CO3 또한 사용할 수 있다. 또 다른 방법에서, 발효 배양물에 CO2를 공급하는 것은 발효 배양물에 NaHCO3의 1차 첨가 및 Na2CO3의 2차 첨가를 포함한다. 다른 방법에서, 발효 배양물에 CO2를 공급하는 것은 발효 배양물을 CO2로 덮는 것을 포함한다. 5 내지 100%, 예를 들면, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 CO2로 덮을 수 있다.
본 발명의 방법에서, 세균 세포는 임의의 세포용해제를 사용하여 용해시킬 수 있다. "세포용해제"는, 예를 들면, 세제를 포함하여, 세포벽 파괴, 및 세포 용해를 야기하는 자가분해효소의 방출을 돕는 임의의 약제이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "세제"는 세균 세포의 용해를 유도할 수 있는 임의의 음이온성 또는 양이온성 세제를 말한다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 상기 세제의 대표적인 예로는 데옥시콜레이트 나트륨(DOC), N-라우릴 사르코신(NLS), 케노데옥시콜산 나트륨 및 사포닌이 포함된다.
본 발명의 한 태양에서, 세균 세포를 용해시키기 위해 사용되는 세포용해제는 DOC이다. DOC는 담즙산 데옥시콜산의 나트륨염으로, 통상적으로 암소 또는 황소와 같은 생물학적 공급원으로부터 얻어진다. DOC는 스트렙토코커스 뉴모니에에서 세포벽 성장 및 분열에 수반되는 자가분해효소인 LytA 단백질을 활성화시킨다. LytA 단백질은 이의 C-말단부에 콜린 결합 영역을 가지며, lytA 유전자의 돌연변이는 DOC에 의한 세포용해에 내성을 나타내는 LytA 돌연변이체를 생성하는 것으로 알려져 있다.
스트렙토코커스 뉴모니에 폴리사카라이드를 정제할 때 DOC를 사용하는 것이 건강상 위험을 야기한다는 증거는 없지만, 상기 생물학적으로 유래된 시약의 사용은 잠재적인 조절 문제를 일으킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 태양에서, 세균 세포를 용해하기 위해 사용된 세포용해제는 비-동물 유래 세포용해제이다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 비-동물 유래 세포용해제로는 DOC와 유사한 작용 방식을 갖는(즉, LytA 기능에 영향을 미치고 스트렙토코커스 뉴모니에 세포의 용해를 야기하는) 비-동물 공급원으로부터 얻어진 약제들이 포함된다. 상기 비-동물 유래 세포용해제로는 DOC 유사체, 계면활성제, 세제, 및 콜린의 구조적 유사체가 포함되나 이로 한정되지는 않으며, 본원 하기의 실험 부분에 기술된 바와 같은 절차를 이용하여 결정될 수 있다. 한 태양에서, 비-동물 유래 세포용해제는 데칸설폰산, 3급-옥틸페녹시 폴리(옥시에틸렌)에탄올(예를 들면, 이게팔(Igepal, 등록상표) CA-630, CAS #:9002-93-1, 미주리 세인트 루이스 소재의 시그마 앨드리치(Sigma Aldrich)에서 시판), 옥틸페놀 에틸렌 옥사이드 축합물(예를 들면, 트리톤(Triton, 등록상표) X-100, 미주리 세인트 루이스 소재의 시그마 앨드리치에서 시판), N-라우릴 사르코신 나트륨(NLS), 라우릴 이미노디프로피오네이트, 나트륨 도데실 설페이트, 케노데옥시콜레이트, 하이오데옥시콜레이트, 글라이코데옥시콜레이트, 타우로데옥시콜레이트, 타우로케노데옥시콜레이트 및 콜레이트로 이루어진 군에서 선택된다. 또 다른 태양에서, 비-동물 유래 세포용해제는 NLS이다.
본 발명의 방법에 있어서, 스트렙토코커스 뉴모니에 캡슐형 폴리사카라이드는 당해 분야에 숙련된 자에게 공지된 표준 기술을 사용하여 단리한다. 예를 들면, 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드를 생성하는 세균 세포를 발효시킨 후, 세균 세포를 용해시켜 세포용해물을 생성한다. 이어서, 원심분리, 침전, 한외여과 및 컬럼 크로마토그래피의 사용을 포함하여 당해 분야에 공지된 정제 기술을 사용하여 세포 용해물로부터 캡슐형 폴리사카라이드를 단리할 수 있다(예를 들면, 미국 특허출원 공개공보 제 20060228380 호, 제 20060228381 호, 제 20070184071 호, 제 20070184072 호, 제 20070231340 호 및 20080102498 호 참조).
전술한 공정의 변화들은 세포성 스트렙토코커스 뉴모니에 세포용해물로부터 고분자량 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드의 회수를 가능케 한다. 이것은 폐렴구균 폴리사카라이드의 생성을 매우 증대시킬 수 있는 발효/회수 공정의 확실한 개선이다.
하기의 실시예는 예로서 제공되며 제한하기 위한 것이 아니다.
[실시예]
백신에 포함되는 캡슐형 혈청형으로 인해 스트렙토코커스 뉴모니에에 의해 야기된 침윤성 질환에 대한 능동 면역화를 위한 백신의 제조에 필요한 폴리사카라이드를 공급하기 위해 혈청형 19A를 생성하는 스트렙토코커스 뉴모니에 세균 세포를 성장시켰다. 세포를 발효조에서 성장시키고 발효 마지막에 세포용해를 유도하였다. 이어서, 후속 정제 및 캡슐형 폴리사카라이드의 회수를 위해 세포용해액을 수거하였다. 폴리사카라이드 크기는 각 제조 배치에서 분석되는 품질 특성이기 때문에, 폴리사카라이드 크기는 적절히 조절되어야 한다. 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드에 대한 분자량은 발효 공정의 파라미터들에 의해 영향받는 것으로 나타났다. 하기의 실시예는 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 19A의 발효시 수거 시간 및 CO2의 공급에 관한 연구를 기술한다.
실시예 1: 폴리사카라이드 분자량에 대한 이산화탄소 공급 효과
발효
실험실 작업은 3 L 브라운 바이오스태트(Braun Biostat) B 발효조(비. 브라운 바이오테크(B. Braun Biotech), 펜실베이니아 알렌타운)에서 수행하였다. 이 발효조들을 1.8 L의 HYS 배지(20 g/L 하이소이, 2.5 g/L NaCl, 0.5 g/L KH2PO4, 0.013 g/L CaCl2·2H2O, 0.15 g/L L-시스테인 HCl)로 채웠다. 이어서, 발효조를 121 ℃에서 60 분간 오토클레이빙하였다. 냉각시킨 후, 40 또는 60 mL/L의 50% 글루코스 + 1% 황산마그네슘(w/v)(DMS) 용액을 각각의 유니트에 첨가하였다. 필요한 경우, 접종하기 전에 중탄산나트륨을 첨가하였다.
1 L의 HYS 배지를 함유하는 2 L 종균 병을 19A형 냉동 종균 저장액으로 접종하고, 진탕시키기 않고 36 ℃에서 약 6 내지 8 시간동안 배양하였다. 발효조 접종은 0.3 내지 0,9의 OD600 및 4.75 내지 5.60의 pH하에 병으로부터 분취한 100 mL(약 5.2% v/v)의 부피로 수행하였다. 발효 온도 및 pH는 목적 설정값에서 제어하였다. 36 ℃, 1 L/분의 공기 주입, 7로 제어된 pH 및 75 rpm의 교반의 표준 조건을 이용하였다. 2개의 교반날개를 교반기 축 상의 하부 및 중간 위치에 설치하였다. 적절한 염기 적정제(3 N NaOH, 다양한 농도의 NaHCO3와 블렌딩된 3 N NaOH, 다양한 농도의 Na2CO3 및 NaHCO3와 블렌딩된 3 N NaOH, 및 20% Na2CO3)를 함유하는 병을 자동 pH 제어를 위해 연결하였다. 외부 pH, OD600, 글루코스, 폴리사카라이드 및 단백질을 위해 다양한 시점에서 발효조를 샘플링하였다. 글루코스 농도가 거의 고갈되었을 때 또는 시간에 따른 OD의 증가가 관찰되지 않을 때 작업을 종료하였다.
흡광도( OD 600 ) 측정
시마주(Shimadzu)(미들랜드 콜롬비아) UV-1601(2 nm 밴드폭) 또는 스펙트로닉스(Spectronics)(뉴욕 웨스트버리) 제네시스(Genesys) 5 분광광도계(5 nm 밴드폭)를 사용하여 600 nm에서 샘플의 흡광도를 판독함으로써 발효액의 세포 밀도를 측정하였다. 샘플의 필요한 희석률에 맞춰지도록 탈이온(DI)수로 희석된 HYS 배지로 유니트를 블랭크화하였다. 샘플을 희석시켜, 분광광도계의 직선 범위 내에 충분히 포함되는 0.4의 판독치 이하로 흡광도를 유지하였다.
글루코스 농도
세포를 원심분리하고 상등액을 직접 사용하거나 탈이온수로 3배 희석시켜 사용함으로써 글루코스 수준을 측정하였다. 샘플을 노바 바이오메디칼(Nova Biomedical, 매사추세츠 월탐) 바이오프로필(BioProfile) 400 상에서 분석하였다.
폴리사카라이드 분석
최종 발효 판독 시 샘플을 취하고 12% 나트륨 데옥시콜레이트(DOC)로 처리하여 0.13%(w/v)의 농도로 만들고 약하게 교반하였다. 샘플들을 5 ℃에서 8 내지 24 시간동안 유지시킨 후 50% 아세트산을 사용하여 pH를 5.0으로 조정하여 대부분의 DOC 및 단백질을 침전시켰다. 5 ℃에서 12 내지 24 시간동안 더 유지시킨 후, 샘플을 원심분리하였다(14000 rpm, 소르발(Sorvall)(터모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), 매사추세츠 월탐) SS34 회전자, 15 ℃에서 10 분). 상등액의 pH를 6.0으로 조정하였다. 이어서, 상등액을 0.45 ㎛ 폴(Pall)(뉴욕 이스트 힐즈) HT 터프린(Tuffryn) 막 주사기 필터(저 단백질 결합)를 통해 여과시켰다. 여과된 생성물을 당해 분야에 공지된 표준 방법(예를 들면, 문헌 [Aquilar, M. "HPLC of Peptides and Proteins: Methods and Protocols" Totowa, NJ: Humana Press (2004)] 참조)을 이용하여 고성능 크기 배제 크로마토그래피(HPLC-SEC)로 분석하였다.
단백질 분석
당해 분야에 공지된 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 방법에 의해 단백질 수준을 분석하였다(예를 들면, 문헌 [Walker, J.M. "The Protein Protocols Handbook" Totowa, NJ: Humana Press(2002)]참조). 상기와 같이 제조된, 여과된 세포 용해물(상등액)을 65 μL/관으로 미세원심분리관내에 분취하였다. 환원제(10 μL 디티오트레이톨(DTT)) 및 뉴페이지(NuPAGE, 등록상표)(인비트로겐(Invitrogen), 캘리포니아 칼스배드), 4x 리튬 도데실 설페이트(LDS) 샘플 완충액(25 μL)을 각 샘플에 첨가하였다. 샘플을 볼텍싱하고 10 분간 가열한 후 뉴페이지(등록상표) 4-12% 비스-트리스(Bis-Tris) 12 웰 겔 상에 10 μL/레인 상에 적재하였다. 겔을 150 V 한계에서 뉴페이지(등록상표) MED-SDS 완충액중에서 약 60 분간 작업하고 계속하여 조이온(Zoion) 염색 프로토콜(조이온 바이오테크(Zoion Biotech), 매사추세츠 워세스터)을 사용하여 염색하였다. 해당 특정 단백질 밴드의 대략의 농도를 수득하기 위해 랩웍스(LabWorks, 등록상표)(UVP 인코포레이티드) V.3 소프트웨어와 함께 UVP 이메이저(Imager)(UVP 인코포레이티드, 캘리포니아 업랜드)를 사용하여 샘플 분석을 수행하였다. 소 혈청 알부민(BSA) 분획 V를 사용하여 단백질 표준 곡선을 전개시켜 샘플 중(용해된 세포배양액 중) 대략적인 단백질 값을 계산하였다.
분자량 분석
1 내지 2 L의 발효 샘플을 200 rpm으로 교반하면서 12% 나트륨 DOC로 0.13%(w/v)의 농도가 되도록 처리하였다. 샘플은 5 ℃ 또는 20 ℃에서 8 내지 24 시간동안 유지시켰다. 이어서, 샘플을 50% 아세트산을 사용해 pH를 5.0 또는 6.6으로 조정하여 대부분의 DOC 및 단백질을 침전시켰다. 5 ℃에서 12 내지 24 시간동안 더 유지시킨 후에, 샘플을 원심분리하였다(11000 rpm, 소르발(터모 피셔 사이언티픽, 매사추세츠 월탐) SLA-3000 회전자, 10℃에서 15 분). 이어서, 상등액 샘플을 3 N NaOH를 사용해 pH를 6.0으로 조정하고, 0.45 ㎛ 밀리포어(Millipore)(매사추세츠 빌레리카) MP60 필터를 사용하여 여과하였다. 그 다음, 100K 분획 분자량(MWCO) 정용여과(diafiltration)(5배 농축 후 탈이온수로 7.5배 정용여과), 0.1% HB 침전, 및 탄소 여과로 이루어진 변형된 정제 공정에 샘플을 적용하였다. 이어서, 정제된 물질을 다각도 레이저 광산란(Multi Angle Laser Light Scattering, MALLS) 분석에 적용하였다.
발효 공정 연구
선행 연구를 근거로, 염기 적정제로 Na2CO3에서 NaOH로 전환함으로써 발효 공정을 최적화하였다. NaOH의 사용은 회수 pH를 5.0으로 저하시켜 상당한 단백질 침전을 야기하였다. Na2CO3는 CO2를 낮은 pH(<6.6)에서 방출하여 기포 형성을 야기할 것이다. 19A형 폴리사카라이드 및 단백질 수준에 대한 염기 적정제의 영향을 시험하였다. 2개의 3 L 발효조를 준비하여, 하나의 발효조는 염기 공급물로서 20% Na2CO3 용액(w/v)을 사용하여 원래의 공정 대조군으로 제공하였다. 다른 발효조는 염기 공급물로서 3 N NaOH를 사용하였다.
회수 단계동안, 발효조를 36 ℃에서 30 분간 유지하면서 세포를 발효조에서 DOC(최종 농도 0.13%(w/v))로 용해시켰다. 상기 단계 후에, 세포용해물을 주위 온도(22 ℃)에서 교반하면서 밤새 유지하였다. 세포용해물을 유지한 후, 샘플을 다양한 pH 설정값에서 취하면서 세포용해물을 미조정값에서 4.5까지의 범위에 걸쳐 pH를 적정하였다. 이들 샘플을 주위 온도에서 밤새 유지시킨 후 처리하고 폴리사카라이드 및 단백질 농도에 대해 분석하였다. 발효 단계동안 OD, 염기 및 글루코스 수준을 도 1 및 도 2에 나타내었다. 주된 차이점은 탄산염 작업의 경우에 더 높은 최종 OD였다.
총 단백질 수준에 대한 후 DOC 세포용해물 pH 조정의 영향도 시험하였으며, 도 3에 나타내었다. 낮은 pH 수준은 NaOH 작업 및 Na2CO3 작업 둘 다에 대해 세포 비함유 배양액중 단백질 적재를 감소시켰다. 낮은 pH(<6.6)는 폴리사카라이드 수율에 대해서는 어떤 부정적인 영향도 미치지 않았다. 발효 분석 결과는 NaOH 염기 공급물이 발효동안 Na2CO3 염기 공급물을 사용하는 공정에 대한 허용가능한 대안이지만, Na2CO3 공급물을 사용하여 수득된 것보다 낮은 수율을 제공하였음을 보여주었다.
19A 분자량에 대한 염기 적정제의 효과
3 L 규모로 일련의 발효를 수행하여 염기 적정제, 하이소이 농도 및 pH 유지 단계가 혈청형 19A 분자량에 영향을 미치는 지를 측정하였다. 분자량 측정은 변형된 정제 공정 후에 MALLS 분석을 이용하여 수행하였다. 결과는 표 1에 나타내었다.
19A 분자량에 대한 염기 적정제의 영향(L29331-94)
작업 번호 pH/온도 하이소이 pH 유지값 염기 MALLS(kDa)
D 7.0/36℃ 28 g/L 5.0 3 N NaOH 340
E 7.0/36℃ 20 g/L 5.0 3 N NaOH 350
F 7.0/36℃ 20 g/L 5.0 20% Na2CO3 713
H 7.0/36℃ 20 g/L 6.6 20% Na2CO3 713
중탄산염 및 혼합 염기 pH 적정제의 효과
첫 번째 연구(작업 L29331-122 및 -139)에서, 초기 중탄산나트륨 및 수산화나트륨과 탄산나트륨의 염기 블렌드의 수준을 변화시키는 것을 DOC 유지 단계후 pH 5.0 유지 단계와 함께 이용하였다. 초기 중탄산염 첨가는 10 내지 50 mM의 범위였으며, 염기 적정제를 위한 3 N 수산화나트륨에 첨가된 탄산나트륨은 0.2 내지 1.8 M의 범위였다. 하나의 작업에 50 mM 초기 중탄산염이 포함되었으며 염기 적정제로 NaOH를 사용하였다. 상기 발효 마지막에 탄산염 수준은 14 내지 111 mM의 범위였다. 혈청형 19A 분자량은 520 내지 713 kDa의 범위였다. 작업 파라미터 및 결과는 표 2에 나타내었다.
Na2CO3 대 pH 적정제로서 혼합 염기
작업 번호 NaHCO3
(mM)		 염기 MALLS
(kDa)		 PS 수율
(mg/mL)
Na2CO3 NaOH

파트 I
L29331-122
20 g/L 하이소이		 E 0 20% 0 759 0.836
F 10 0.2 M 3 N 520 0.308
G 10 0.4 M 3 N 648 0.538
H 10 0.9 M 3 N 563 0.334

파트 II
L29331-139
28 g/L 하이소이		 C 20 0.9 M 3 N 662 1.027
D 20 1.8 M 3 N 611 0.903
G 50 0.9 M 3 N 713 0.924
H 50 0 M 3 N 713 1.051
두 번째 연구(L29331-159 및 -189)는 15 내지 30 mM의 초기 중탄산염 첨가 및 0.4 내지 1.0 M Na2CO3를 사용하는 염기 블렌드를 이용하였다. 발효 마지막에 탄산염 수준은 24 내지 62 mM의 범위였다. 혈청형 19A 분자량은 502 내지 763 kDa의 범위였다. 작업 파라미터 및 결과는 표 3에 나타내었다.
pH 적정제로서 혼합 염기와 함께 사용된 NaHCO3
작업 번호 하이소이/DMS NaHCO3
(mM)		 Na2CO3/NaOH MALLS
(kDa)		 PS 수율
(mg/mL)
G2 28 g/L/60 mL/L 15 1.0 M/3 N 657 0.853
H2 28 g/L/60 mL/L 15 0.4 M/3 N 605 0.755
C 20 g/L/60 mL/L 20 0.4 M/3 N 571 0.386
E 20 g/L/60 mL/L 20 1.0 M/3 N 763 0.439
F 20 g/L/60 mL/L 25 0.7 M/3 N 462 0.382
G 20 g/L/60 mL/L 30 0.4 M/3 N 502 0.355
H 20 g/L/60 mL/L 30 1.0 M/3 N 594 0.415
혼합 및 순수 탄산염 적정 염기 발효 공정의 비교
염기 블렌드 공정(0.7 M Na2CO3/3 N NaOH)을 탄산염 적정제 공정(20% Na2CO3 용액, w/v)과 비교하기 위해 실험을 수행하였다. 결과(표 4)는 탄산염 적정제 공정으로부터 얻은 분자량(778, 781 kDa)이 염기 블렌드 공정(561 내지 671 kDa)으로부터 얻은 분자량보다 높고 더 일관성이 있는 것으로 확인되었다. 폴리사카라이드 수율도 Na2CO3 공정보다 더 높았다.
작업 L29399-1 Na2CO3 대 혼합 염기
작업 번호 NaHCO3
(mM)		 염기 MW
(kDa)		 PS 수율
(mg/mL)
Na2CO3 NaOH
C 25 0.7 M 3 N 565 1.106
D 25 0.7 M 3 N 561 0.908
E 25 0.7 M 3 N 612 0.894
G 25 0.7 M 3 N 671 0.873
F 0 20% 0 778 1.282
H 0 20% 0 781 1.249
파일롯 규모 작업
다양한 염기 적정제를 사용하여 여러 혈청형 19A 파일롯 규모(100 L) 작업을 수행하였다. 분자량 측정은 완벽한 정제 공정 후에 MALLS 분석을 이용하여 수행하였으며 최종 정제된 배치로부터 기록하였다. 결과는 표 5에 나타내었다.
파일롯 규모에서 19A 분자량에 대한 염기 적정제의 영향
발효 배치 적정 염기 정제 배치 FBC MALLS (kDa)
RRP19A-0008 3 N NaOH L26563-10 390
RRP19A-0009 3 N NaOH L26563-11 380
IPPPN19A-005 3 N NaOH/0.6 M Na2CO3 L26260-37 492
IPPPN19A-006 3 N NaOH/0.6 M Na2CO3 L26260-38 480
IPPPN19A-007 3 N NaOH/0.6 M Na2CO3 L26260-39 490
IPPPN19A-014 20% Na2CO3 L26260-49 580
IPPPN19A-016 20% Na2CO3 L26260-50 559
IPPPN19A-017 20% Na2CO3 L26260-51 599
19A 분자량에 대한 염기 적정제 및 주입의 효과
염기 적정제 및 대기 주입이 분자량에 영향을 미치는 지를 측정하기 위해 3 L 규모에서 일련의 발효를 수행하였다. 분자량 측정은 변형된 정제 공정 후에 MALLS 분석을 이용하여 수행하였다. 결과는 표 6에 나타내었다.
19A 분자량에 대한 염기 적정제 및 주입의 영향
작업 번호 염기 주입 MALLS (kDa)
대조군 3 N NaOH 공기 350
C 0.7 M Na2CO3 공기 855
D 1.5 M Na2CO3/1.5 N NaOH 공기 710
E 3 N NaOH 100% CO2 634
F 3 N NaOH 50% CO2 646
G 3 N NaOH 20% CO2 567
H 3 N NaOH 10% CO2 547
19A 분자량에 대한 수거 시간의 효과
혈청형 19A 폴리사카라이드의 분자량에 대한 수거 시간의 영향도 또한 연구하였다. 표 7은 발효 OD 및 수거 시간의 함수로서 MW의 감소를 나타내는 하나의 작업으로부터 얻은 데이터를 요약한 것이다.
발효 OD 및 수거 시간의 함수로서 MW
OD(시간) MALLS
2.2(3 시간) 1065
4.2(4 시간) 845
5.5(5.5 시간) 756
5.9(6.6 시간) 653
여러 실험 작업을 행한 추가의 연구들도 또한 발효 OD 및 수거 시간의 함수로서 MW의 감소를 나타내었다. 도 4는 19A 폴리사카라이드의 생성에 있어서 발효 흡광도(OD) 및 수거 시간의 함수로서의 분자량을 나타낸 것이다. 도 5는 19A 폴리사카라이드의 생성에 있어서 수거 시간의 함수로서 흡광도(OD) 당 시간 당 특정 염기 소모량을 나타낸 것이다. 도 6은 19A 폴리사카라이드의 생성에 있어서 특정 염기 사용량의 함수로서 분자량을 나타낸 것이다.
"하나"는 본원에서 하나 또는 하나보다 많은(즉, 하나 이상의) 문법적 대상을 말하기 위해 사용된다. 예로써, "하나의 요소"는 하나 이상의 요소를 의미한다.
명세서에 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 본 발명이 관련된 당해 분야에 숙련된 자의 동일수준을 나타낸다. 본원에서 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개개 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참고로 인용되는 것과 동일한 정도로 참고로 인용된다.
상기 본 발명을 이해를 명확히 하기 위해 예시와 실례로써 다소 상세하게 기술하였지만, 첨부된 특허청구범위의 범주 내에서 특정한 변화 및 변경을 실행할 수 있다.

Claims (12)

  1. a) 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드를 생성하는 스트렙토코커스 뉴모니에 세균 세포의 발효 배양물을 제조하는 단계;
    b) 상기 발효 배양물에 CO2를 공급하는 단계;
    c) 상기 발효 배양물을 6 시간 미만동안 발효시키는 단계;
    d) 상기 발효 배양물 중 세균 세포를 용해시키는 단계; 및
    e) 상기 발효 배양물로부터 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드를 단리하는 단계
    를 포함하는, 고분자량의 단리된 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드를 함유하는 용액을 제조하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    고분자량의 단리된 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드가 480 kD 이상의 분자량을 갖는, 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    단계 c)가 발효 배양물을 5시간 미만의 시간 동안 발효시키는 것을 포함하는, 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    단계 c)가 발효 배양물을 4 시간 미만의 시간 동안 발효시키는 것을 포함하는, 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    단계 c)가 발효 배양물을 3 내지 6 시간 동안 발효시키는 것을 포함하는, 방법.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    발효 배양물에 CO2를 공급하는 단계가 발효 배양물에 중탄산염 이온(HCO3 _)을 첨가하는 것을 포함하는, 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    발효 배양물에 HCO3 _를 첨가하는 것이, NaHCO3를 첨가하는 것을 포함하는, 방법.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    발효 배양물에 CO2를 공급하는 단계가 발효 배양물에 탄산염 이온(CO3 2 -)을 첨가하는 것을 포함하는, 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    발효 배양물에 CO3 2 -를 첨가하는 것이, Na2CO3를 첨가하는 것을 포함하는, 방법.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    발효 배양물에 CO2를 공급하는 단계가 NaHCO3의 1차 첨가 및 Na2CO3의 2차 첨가를 포함하는, 방법.
  11. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    발효 배양물에 CO2를 공급하는 단계가 발효 배양물을 CO2로 덮는 것을 포함하는, 방법.
  12. 고분자량의 단리된 스트렙토코커스 뉴모니에 혈청형 19A 캡슐형 폴리사카라이드를 함유하는, 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 용액.
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