CN104857524B - 使免疫原性组合物稳定且抑制其沉淀的新颖调配物 - Google Patents

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Abstract

本发明针对所属领域中改进诸如多糖‑蛋白质连结物和蛋白质免疫原等免疫原性组合物的稳定性的不断增长的需求。本发明大致涉及使免疫原性组合物稳定且抑制其沉淀的新颖调配物。更具体来说，下文所述的本发明针对所属领域中对于使免疫原性组合物稳定且抑制其微粒形成(例如，聚集、沉淀)的调配物的需求，所述免疫原性组合物在诸如发酵罐、生物反应器、小瓶、烧瓶、袋子、注射器、橡胶塞、管道等容器装置中加工、研制、调配、制造和/或存储。

Description

使免疫原性组合物稳定且抑制其沉淀的新颖调配物
本申请是申请号为201310587301.4、申请日为2007年4月19日、发明名称为“使免疫原性组合物稳定且抑制其沉淀的新颖调配物”的第一分案申请的第二分案申请。
所述第一分案申请是申请号为200780014734.3、申请日为2007年4月19日、发明名称为“使免疫原性组合物稳定且抑制其沉淀的新颖调配物”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明大体来说涉及免疫学、细菌学、疫苗调配、蛋白质稳定性和工艺过程开发领域。更具体来说，本发明涉及抑制免疫原性组合物沉淀的新颖调配物。
背景技术
生物制药领域一般公认，改进免疫原性组合物(例如，蛋白质免疫原、多糖-蛋白质连结物)的稳定性是一个必需且特别需要的目标。举例来说，免疫原性组合物当投与患者时，须看起来新鲜、品质优良且专门的。免疫原性组合物的稳定性和/或物理性质的任何改变(诸如颜色改变、变浑或浑浊)都可能使患者或用户对产品失去信心。此外，由于许多免疫原性调配物是分配于多剂量容器中，故必须确保随时间流逝活性成分(例如，多糖-蛋白质连结物)的剂量均匀(例如，浑浊溶液可导致不均匀的剂量模式)。另外，免疫原性组合物须在其“预期”保存期限内具活性，其中使免疫原性组合物失去活性或其它不合需要的形式(例如，聚集)的任何破坏都会降低产品的总浓度。
若干文献中的报道表明，特定免疫原性组合物(例如，蛋白质免疫原、多糖-蛋白质连结物)的稳定性至少部分取决于特定蛋白质或载体蛋白(胡(Ho)等人，2001；胡(Ho)等人，2002；波尔加诺(Bolgiano)等人，2001)。举例来说，与破伤风类毒素(tetanus toxoid，TT)或CRM197载体蛋白连结的C群脑膜炎球菌(meningococcal C，MenC)多糖和b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b，Hib)多糖的稳定性分析揭示视载体蛋白而定不同的稳定性概况(胡等人，2002)。在另一研究(胡等人，2001)中，分析来自两个不同制造商的MenC-CRM197连结物(胡等人，2001)，其中MenC-CRM197连结物的连结化学和连结物多糖的长度不同(二者具有相同的载体蛋白，CRM197)。来自这项研究的数据进一步表明，诸如连结化学(例如，直接或经由化学联接基团还原胺化)、连结位点的数量、多糖链长、pH值、存储缓冲剂、存储温度和冷冻/解冻循环等因素也会影响免疫原性组合物的稳定性。
因此，当研发用于免疫原性组合物的调配物时，须考虑许多因素以确保得到安全、稳定、稳固和节省成本的产物。所述考虑因素包括(但不限于)免疫原性组合物的化学稳定性(例如，糖水解、多糖解聚合、蛋白质的蛋白水解或发酵)、免疫原性组合物的物理/热稳定性(例如，聚集、沉淀、吸附)、免疫原性组合物与容器/密封物系统的相容性、免疫原性组合物与无活性成分(例如，缓冲剂、盐、赋形剂、防冻剂)之间的相互作用、制造工艺、剂型(例如，冻干形式、液体)、装运、存储和处理过程中所遇到的环境条件(例如，温度、湿度、剪切力)和制造与使用之间的时间长度。
所属领域中已提出，诱导蛋白质二级和三级构型改变的硅油可能会引起在某些蛋白质药物制剂中所见的聚集/沉淀(琼斯(Jones)等人，2005)。举例来说，19世纪80年代的若干报道涉及到由一次性塑料注射器释放的硅油为引起人类胰岛素聚集的病原体(辰特罗(Chantelau)和伯杰(Berger)，1985；辰特罗(Chantelau)等人，1986；辰特罗(Chantelau)，1989；伯恩思坦(Bernstein)，1987；鲍德温(Baldwin)，1988；科利尔(Collier)和道森(Dawson)，1985)。辰特罗等人(1986)观察到，在三次或三次以上从十剂量的胰岛素制剂抽出(使用硅化一次性注射器)后，小瓶会因硅油污染而开始变浑浊，从而导致胰岛素聚集和失活(辰特罗等人，1986)。不合理的是，硅油是塑料注射器的必需组分，因为其用于润滑橡胶柱塞并且便利将柱塞移下注射管(即，硅油改进调配物的可注射性)。
此外，由于硅油还用作用于使蛋白质吸附最小化的玻璃小瓶的涂层；在填充程序期间防止橡胶塞堆集的润滑剂；对玻璃和弹性密封物的可加工性/机械加工性至关重要的润滑剂；和便利针头穿透小瓶的橡胶塞的润滑剂，故硅油的使用不限于注射器。另外，注射器、玻璃小瓶、橡胶塞等的硅化并非充分可控制和标准化的过程，且因此各批次间存在硅油含量高可变性。
因此，所属领域中不断需要增强免疫原性组合物的稳定性且抑制其沉淀的调配物。
发明内容
本发明大致涉及使免疫原性组合物稳定且抑制其沉淀的新颖调配物。更具体来说，在某些实施例中，本发明针对抑制容器装置中所包含的免疫原性组合物沉淀的新颖调配物。在一个特定实施例中，本发明针对使免疫原性组合物对于硅油相互作用、剪切力、装运搅动等稳定的新颖调配物。
因此，在某些实施例中，本发明针对使多糖-蛋白质连结物稳定的调配物，所述调配物包含(i)pH值缓冲盐水溶液，其中所述缓冲液具有约3.5到约7.5的pKa值；(ii)表面活性剂；和(iii)一种或多种多糖-蛋白质连结物。在一个特定实施例中，多糖-蛋白质连结物调配物包含于容器装置中。在某些实施例中，所述容器装置选自一个或多个以下组成的群组：小瓶、小瓶塞、小瓶密封物(vial closure)、玻璃密封物、橡胶密封物、塑料密封物、注射器、注射器塞、注射器柱塞、烧瓶、烧杯、量筒、发酵罐、生物反应器、管道、导管、袋子、广口瓶、安瓿、药筒和一次性笔。在某些实施例中，所述容器装置经硅化。
在某些实施例中，调配物的pH值缓冲盐水溶液具有5.5到7.5的pH值。在其它实施例中，缓冲液为磷酸盐、琥珀酸盐、组氨酸或柠檬酸盐。在某些实施例中，缓冲液为最终浓度为1mM到10mM且pH值为5.8到6.0的琥珀酸盐。在一个特定实施例中，琥珀酸盐缓冲液的最终浓度为5mM。在其它实施例中，pH值缓冲盐水溶液中的盐包含氯化镁、氯化钾、氯化钠或其组合。在一个特定实施例中，pH值缓冲盐水溶液中的盐为氯化钠。
在另一实施例中，调配物中的表面活性剂选自由以下组成的群组：聚山梨醇酯20(polysorbate 20)(吐温20(TweenTM20))、聚山梨醇酯40(吐温40)、聚山梨醇酯60(吐温60)、聚山梨醇酯65(吐温65)、聚山梨醇酯80(吐温80)、聚山梨醇酯85(吐温85)))、曲通N-101(TritonTM N-101)、曲通X-100、氧托夕醇40(oxtoxynol 40)、壬苯醇醚-9(nonoxynol-9)、三乙醇胺、三乙醇胺多肽油酸盐、聚氧化乙烯-660羟基硬脂酸酯(PEG-15，索罗托H15(SolutolH15))、聚氧化乙烯-35-蓖麻油酸酯(克林莫佛EL(Cremophor ELTM))、大豆卵磷脂(soylecithin)和泊洛沙姆(poloxamer)。在一个特定实施例中，表面活性剂为聚山梨醇酯80。在另一实施例中，调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物至少0.01重量％到10重量％聚山梨醇酯80。在其它实施例中，调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物0.01重量％聚山梨醇酯80。在其它实施例中，调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物0.05重量％聚山梨醇酯80。在另一实施例中，调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物0.1重量％聚山梨醇酯80。在某些其它实施例中，调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物1.0重量％聚山梨醇酯80。在其它实施例中，调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物10.0重量％聚山梨醇酯80。
在另一实施例中，多糖-蛋白质连结物包含一种或多种肺炎球菌多糖。在某些实施例中，所述一种或多种肺炎球菌多糖为肺炎链球菌(S.pneumoniae)血清型4多糖、肺炎链球菌血清型6B多糖、肺炎链球菌血清型9V多糖、肺炎链球菌血清型14多糖、肺炎链球菌血清型18C多糖、肺炎链球菌血清型19F多糖、肺炎链球菌血清型23F多糖、肺炎链球菌血清型1多糖、肺炎链球菌血清型3多糖、肺炎链球菌血清型5多糖、肺炎链球菌血清型6A多糖、肺炎链球菌血清型7F多糖和肺炎链球菌血清型19A多糖。在某些实施例中，多糖-蛋白质连结物调配物中的蛋白质选自由以下组成的群组：CRM197、破伤风类毒素、霍乱类毒素、百日咳类毒素、大肠杆菌(E.coli)热敏性类毒素(LT)、肺炎球菌溶血素类毒素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌粘附蛋白A(PsaA)、来自链球菌(Streptococcus)的C5a肽酶、流感嗜血杆菌蛋白D、卵清蛋白、钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet haemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(BSA)和结核菌素纯蛋白衍生物(purified protein derivative of tuberculin，PPD)。
在一个特定实施例中，多糖-蛋白质连结物调配物为7价肺炎球菌连结物(7vPnC)调配物，其包含肺炎链球菌血清型4多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型6B多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型9V多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型14多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型18C多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型19F多糖与CRM197多肽的连结物和肺炎链球菌血清型23F多糖与CRM197多肽的连结物。
在另一特定实施例中，多糖-蛋白质连结物调配物为13价肺炎球菌连结物(13vPnC)调配物，其包含肺炎链球菌血清型4多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型6B多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型9V多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型14多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型18C多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型19F多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型23F多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型1多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型3多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型5多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型6A多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型7F多糖与CRM197多肽的连结物和肺炎链球菌血清型19A多糖与CRM197多肽的连结物。
在其它实施例中，调配物另外包含一种或多种脑膜炎球菌多糖、一种或多种脑膜炎球菌抗原蛋白或其组合。在其它实施例中，调配物另外包含一种或多种链球菌多糖、一种或多种链球菌抗原蛋白或其组合。
在某些其它实施例中，调配物另外包含一种或多种佐剂。例示性适当佐剂将于下文中描述。
在其它实施例中，本发明针对使链球菌C5a肽酶(SCP)组合物稳定的调配物，所述调配物包含(i)pH值缓冲盐水溶液，其中所述缓冲液具有约3.5到约6.5的pKa值；(ii)表面活性剂；和(iii)链球菌C5a肽酶。在一个特定实施例中，SCP调配物包含于容器装置中。在某些实施例中，所述容器装置选自一个或多个以下组成的群组：小瓶、小瓶塞、小瓶密封物、玻璃密封物、橡胶密封物、塑料密封物、注射器、注射器塞、注射器柱塞、烧瓶、烧杯、量筒、发酵罐、生物反应器、管道、导管、袋子、广口瓶、安瓿、药筒和一次性笔。
在其它实施例中，调配物的pH值缓冲盐水溶液具有5.5到7.5的pH值。在其它实施例中，缓冲液为琥珀酸盐、组氨酸、磷酸盐或柠檬酸盐。在一个特定实施例中，缓冲液为最终浓度为1mM到10mM且pH值为5.8到6.0的琥珀酸盐。在另一特定实施例中，琥珀酸盐缓冲液的最终浓度为5mM。在其它实施例中，pH值缓冲盐水溶液中的盐包含氯化镁、氯化钾、氯化钠或其组合。
在某些实施例中，调配物中的表面活性剂选自由以下组成的群组：聚山梨醇酯20(吐温20)、聚山梨醇酯40(吐温40)、聚山梨醇酯60(吐温60)、聚山梨醇酯65(吐温65)、聚山梨醇酯80(吐温80)、聚山梨醇酯85(吐温85)、曲通N-101、曲通X-100、氧托夕醇40、壬苯醇醚-9、三乙醇胺、三乙醇胺多肽油酸盐、聚氧化乙烯-660羟基硬脂酸酯(PEG-15，索罗托H15)、聚氧化乙烯-35-蓖麻油酸酯(克林莫佛EL)、大豆卵磷脂和泊洛沙姆。在一个特定实施例中，表面活性剂为聚山梨醇酯80。在某些实施例中，调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物0.01重量％到10重量％聚山梨醇酯80。在其它实施例中，调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物0.01重量％聚山梨醇酯80。在其它实施例中，调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物0.05重量％聚山梨醇酯80。在其它实施例中，调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物0.1重量％聚山梨醇酯80。在另一实施例中，调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物1.0重量％聚山梨醇酯80。在另一实施例中，调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物10.0重量％聚山梨醇酯80。
在某些其它实施例中，SCP组合物另外包含一种或多种选自由以下多肽组成的群组的多肽：链球菌多肽、肺炎球菌多肽、脑膜炎球菌多肽和葡萄球菌多肽。在其它实施例中，SCP组合物另外包含一种或多种选自由以下多糖组成的群组的多糖：链球菌多糖、肺炎球菌多糖、脑膜炎球菌多糖和葡萄球菌多糖。
在另一实施例中，调配物另外包含一种或多种佐剂。例示性适当佐剂将于下文中描述。
在另一实施例中，本发明针对抑制聚硅氧(silicone)诱导的硅化容器装置中所包含的多糖-蛋白质连结物沉淀的调配物，所述调配物包含(i)pH值缓冲盐水溶液，其中所述缓冲液具有约3.5到约7.5的pKa值；(ii)铝盐；和(iii)一种或多种多糖-蛋白质连结物。在某些实施例中，所述硅化容器装置选自一个或多个以下组成的群组：小瓶、小瓶塞、小瓶密封物、玻璃密封物、橡胶密封物、塑料密封物、注射器、注射器塞、注射器柱塞、烧瓶、烧杯、量筒、发酵罐、生物反应器、管道、导管、袋子、广口瓶、安瓿、药筒和一次性笔。
在某些实施例中，调配物的pH值缓冲盐水溶液具有5.5到7.5的pH值。在其它实施例中，调配物中的缓冲液为磷酸盐、琥珀酸盐、组氨酸或柠檬酸盐。在其它实施例中，缓冲液为最终浓度为1mM到10mM且pH值为5.8到6.0的琥珀酸盐。在一个特定实施例中，琥珀酸盐缓冲液的最终浓度为5mM。在其它实施例中，pH值缓冲盐水溶液中的盐包含氯化镁、氯化钾、氯化钠或其组合。在一个特定实施例中，pH值缓冲盐水溶液中的盐为氯化钠。
在其它实施例中，铝盐为氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝。在一个特定实施例中，铝盐为磷酸铝。
在某些其它实施例中，调配物另外包含聚山梨醇酯80(吐温80)。在一个特定实施例中，调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物至少0.01重量％到10重量％聚山梨醇酯80。
在另一实施例中，多糖-蛋白质连结物包含一种或多种肺炎球菌多糖。在某些实施例中，所述一种或多种肺炎球菌多糖为肺炎链球菌血清型4多糖、肺炎链球菌血清型6B多糖、肺炎链球菌血清型9V多糖、肺炎链球菌血清型14多糖、肺炎链球菌血清型18C多糖、肺炎链球菌血清型19F多糖、肺炎链球菌血清型23F多糖、肺炎链球菌血清型1多糖、肺炎链球菌血清型3多糖、肺炎链球菌血清型5多糖、肺炎链球菌血清型6A多糖、肺炎链球菌血清型7F多糖和肺炎链球菌血清型19A多糖。
在某些其它实施例中，多糖-蛋白质连结物调配物中的蛋白质选自由以下组成的群组：CRM197、破伤风类毒素、霍乱类毒素、百日咳类毒素、大肠杆菌热敏性类毒素(LT)、肺炎球菌溶血素类毒素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌粘附蛋白A(PsaA)、来自链球菌的C5a肽酶、流感嗜血杆菌蛋白D、卵清蛋白、钥孔贝血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)和结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)。
在一个特定实施例中，多糖-蛋白质连结物调配物为7价肺炎球菌连结物(7vPnC)调配物，其包含肺炎链球菌血清型4多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型6B多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型9V多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型14多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型18C多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型19F多糖与CRM197多肽的连结物和肺炎链球菌血清型23F多糖与CRM197多肽的连结物。
在另一特定实施例中，多糖-蛋白质连结物调配物为13价肺炎球菌连结物(13vPnC)调配物，其包含肺炎链球菌血清型4多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型6B多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型9V多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型14多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型18C多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型19F多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型23F多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型1多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型3多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型5多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型6A多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型7F多糖与CRM197多肽的连结物和肺炎链球菌血清型19A多糖与CRM197多肽的连结物。
在其它实施例中，调配物另外包含一种或多种脑膜炎球菌多糖、一种或多种脑膜炎球菌抗原蛋白或其组合。
在另一实施例中，调配物另外包含一种或多种链球菌多糖、一种或多种链球菌抗原蛋白或其组合。
在某些其它实施例中，调配物另外包含一种或多种佐剂。例示性适当佐剂将于下文中描述。
在其它实施例中，本发明针对抑制聚硅氧诱导的硅化容器装置中所包含的链球菌C5a肽酶(SCP)组合物沉淀的调配物，所述调配物包含(i)pH值缓冲盐水溶液，其中所述缓冲液具有约3.5到约6.5的pKa值；(ii)铝盐；和(iii)链球菌C5a肽酶。在某些实施例中，所述容器装置选自一个或多个以下组成的群组：小瓶、小瓶塞、小瓶密封物、玻璃密封物、橡胶密封物、塑料密封物、注射器、注射器塞、注射器柱塞、烧瓶、烧杯、量筒、发酵罐、生物反应器、管道、导管、袋子、广口瓶、安瓿、药筒和一次性笔。
在另一实施例中，调配物的pH值缓冲盐水溶液具有5.5到7.5的pH值。在其它实施例中，缓冲液为琥珀酸盐、组氨酸、磷酸盐或柠檬酸盐。在某些实施例中，缓冲液为最终浓度为1mM到10mM且pH值为5.8到6.0的琥珀酸盐。在另一实施例中，pH值缓冲盐水溶液中的盐包含氯化镁、氯化钾、氯化钠或其组合。
在某些其它实施例中，调配物另外包含聚山梨醇酯80(吐温80)。在一个特定实施例中，调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物0.01重量％到10重量％聚山梨醇酯80。
在其它实施例中，SCP组合物另外包含一种或多种选自由以下多肽组成的群组的多肽：链球菌多肽、肺炎球菌多肽、脑膜炎球菌多肽和葡萄球菌多肽。
在某些其它实施例中，SCP组合物另外包含一种或多种选自由以下多糖组成的群组的多糖：链球菌多糖、肺炎球菌多糖、脑膜炎球菌多糖和葡萄球菌多糖。
在另一实施例中，调配物另外包含一种或多种佐剂。例示性适当佐剂将于下文中描述。
在其它实施例中，本发明针对使脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)2086蛋白组合物稳定的调配物，所述调配物包含(i)pH值缓冲盐水溶液，其中所述缓冲液具有约3.5到约6.5的pKa值；(ii)表面活性剂；和(iii)脑膜炎奈瑟菌2086蛋白。例示性脑膜炎奈瑟菌2086蛋白将于下文中描述。在一个特定实施例中，脑膜炎奈瑟菌2086蛋白调配物包含于容器装置中。在某些实施例中，所述容器装置选自一个或多个以下组成的群组：小瓶、小瓶塞、小瓶密封物、玻璃密封物、橡胶密封物、塑料密封物、注射器、注射器塞、注射器柱塞、烧瓶、烧杯、量筒、发酵罐、生物反应器、管道、导管、袋子、广口瓶、安瓿、药筒和一次性笔。
在其它实施例中，调配物的pH值缓冲盐水溶液具有5.5到7.5的pH值。在其它实施例中，缓冲液为琥珀酸盐、组氨酸、磷酸盐或柠檬酸盐。在一个特定实施例中，缓冲液为最终浓度为1mM到10mM且pH值为5.8到6.0的琥珀酸盐。在另一特定实施例中，琥珀酸盐缓冲液的最终浓度为5mM。在其它实施例中，pH值缓冲盐水溶液中的盐包含氯化镁、氯化钾、氯化钠或其组合。
在某些实施例中，调配物中的表面活性剂选自由以下组成的群组：聚山梨醇酯20(吐温20)、聚山梨醇酯40(吐温40)、聚山梨醇酯60(吐温60)、聚山梨醇酯65(吐温65)、聚山梨醇酯80(吐温80)、聚山梨醇酯85(吐温85)、曲通N-101、曲通X-100、氧托夕醇40、壬苯醇醚-9、三乙醇胺、三乙醇胺多肽油酸盐、聚氧化乙烯-660羟基硬脂酸酯(PEG-15，索罗托H15)、聚氧化乙烯-35-蓖麻油酸酯(克林莫佛EL)、大豆卵磷脂和泊洛沙姆。在一个特定实施例中，表面活性剂为聚山梨醇酯80。在某些实施例中，调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物0.01重量％到10重量％聚山梨醇酯80。在其它实施例中，调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物0.01重量％聚山梨醇酯80。在其它实施例中，调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物0.05重量％聚山梨醇酯80。在其它实施例中，调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物0.1重量％聚山梨醇酯80。在另一实施例中，调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物1.0重量％聚山梨醇酯80。在另一实施例中，调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物10.0重量％聚山梨醇酯80。
在某些其它实施例中，脑膜炎奈瑟菌2086蛋白组合物另外包含一种或多种选自由以下多肽组成的群组的多肽：链球菌多肽、肺炎球菌多肽、脑膜炎球菌多肽和葡萄球菌多肽。在其它实施例中，脑膜炎奈瑟菌2086蛋白组合物另外包含一种或多种选自由以下多糖组成的群组的多糖：链球菌多糖、肺炎球菌多糖、脑膜炎球菌多糖和葡萄球菌多糖。
在另一实施例中，调配物另外包含一种或多种佐剂。例示性适当佐剂将于下文中描述。
在其它实施例中，本发明针对抑制聚硅氧诱导的硅化容器装置中所包含的脑膜炎奈瑟菌2086蛋白组合物沉淀的调配物，所述调配物包含(i)pH值缓冲盐水溶液，其中所述缓冲液具有约3.5到约6.5的pKa值；(ii)铝盐；和(iii)脑膜炎奈瑟菌2086蛋白。在某些实施例中，所述容器装置选自一个或多个以下组成的群组：小瓶、小瓶塞、小瓶密封物、玻璃密封物、橡胶密封物、塑料密封物、注射器、注射器塞、注射器柱塞、烧瓶、烧杯、量筒、发酵罐、生物反应器、管道、导管、袋子、广口瓶、安瓿、药筒和一次性笔。
在另一实施例中，调配物的pH值缓冲盐水溶液具有5.5到7.5的pH值。在其它实施例中，缓冲液为琥珀酸盐、组氨酸、磷酸盐或柠檬酸盐。在某些实施例中，缓冲液为最终浓度为1mM到10mM且pH值为5.8到6.0的琥珀酸盐。在另一实施例中，pH值缓冲盐水溶液中的盐包含氯化镁、氯化钾、氯化钠或其组合。
在某些其它实施例中，调配物另外包含聚山梨醇酯80(吐温80)。在一个特定实施例中，调配物中聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积调配物0.01重量％到10重量％聚山梨醇酯80。
在其它实施例中，脑膜炎奈瑟菌2086蛋白组合物另外包含一种或多种选自由以下多肽组成的群组的多肽：链球菌多肽、肺炎球菌多肽、脑膜炎球菌多肽和葡萄球菌多肽。
在某些其它实施例中，脑膜炎奈瑟菌2086蛋白组合物另外包含一种或多种选自由以下多糖组成的群组的多糖：链球菌多糖、肺炎球菌多糖、脑膜炎球菌多糖和葡萄球菌多糖。
在另一实施例中，调配物另外包含一种或多种佐剂。例示性适当佐剂将于下文中描述。
本发明的其它特征和优势将自以下实施方式、其实施例和权利要求书显而易见。
附图说明
图1绘示在水平旋转式振荡器上轻柔搅动(60cpm)2天前和之后链球菌C5a肽酶(SCP)调配物(填充于注射器中)的稳定性。图1A所提供的数据为未用任何吐温80(即0％)调配的SCP的2天稳定性，而图1B所提供的数据为用0.025％吐温80调配的SCP的2天稳定性。图1A和1B中所示的调配物中所使用的缓冲液为琥珀酸盐缓冲盐水(SBS)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)和三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)。
图2绘示在2-8℃下以500rpm搅动2小时、8小时和24小时后用AlPO4(0.25mg/ml)调配且填充于BD海派(Hypak)注射器中的13vPnC的总抗原性损失。
图3绘示在2-8℃下以500rpm搅动2小时、8小时和24小时后用AlPO4(0.25mg/ml)调配且填充于未硅化的注射器中的13vPnC的总抗原性损失。
图4绘示在2-8℃下以500rpm搅动2小时、8小时和24小时后用AlPO4(0.25mg/ml)调配且填充于维特(Vetter)注射器中的13vPnC的总抗原性损失。
图5绘示在2-8℃下以500rpm搅动2小时、8小时和24小时后用AlPO4(0.25mg/ml)调配且填充于肖特拓普派克(Schott TopPac)注射器中的13vPnC的总抗原性损失。
图6绘示在2-8℃下以500rpm搅动2小时、8小时和24小时后用AlPO4(0.25mg/ml)(图6A)和未用AlPO4(0.25mg/ml)(图6B)调配且填充于BD贝克特注射器中的13vPnC的总抗原性损失。
图7绘示在2-8℃下以500rpm搅动2小时、8小时和24小时后用AlPO4(0.25mg/ml)(图7A)和未用AlPO4(0.25mg/ml)(图7B)调配且填充于邦吉PS2(BünderGlas PS2)注射器中的13vPnC的总抗原性损失。
具体实施方式
本发明针对一种用于改进诸如多糖-蛋白质连结物和蛋白质免疫原等免疫原性组合物的稳定性的所属领域中的不断增加的需求。因此，本发明大致涉及使免疫原性组合物稳定且抑制其沉淀的新颖表面活性剂调配物和/或新颖铝盐调配物。更具体来说，下文所述的本发明针对所属领域中关于使免疫原性组合物稳定且抑制其微粒形成(例如，聚集、沉淀)的调配物的需求，所述免疫原性组合物在诸如发酵罐、生物反应器、小瓶、烧瓶、袋子、注射器、橡胶塞、管道等容器装置中经加工、研制、调配、制造和/或存储。
如上文本发明技术背景中所述，多个因素会影响免疫原性组合物的稳定性，包括(但不限于)免疫原性组合物的化学稳定性、免疫原性组合物的物理/热稳定性、免疫原性组合物与容器/密封物系统的相容性、免疫原性组合物与无活性成分(例如，缓冲剂、盐、赋形剂、防冻剂)之间的相互作用、制造工艺、剂型、装运、存储和处理过程中所遇到的环境条件(例如，温度、湿度、剪切力)和制造与使用之间的时间长度。
易于使用对于所属领域技术人员为熟知且常规的标准技术测定本发明免疫原性组合物的稳定性。举例来说，可通过包括(但不限于)以下方法来分析免疫原性组合物的稳定性、聚集、免疫原性、微粒形成、蛋白质(浓度)损失等：光散射、光密度、沉降速度离心、沉降平衡离心、圆二色性(CD)、洛瑞分析(Lowry assay)、二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)分析、抗体结合等。
如本文所详述，本发明涉及利用诸如吐温80等表面活性剂调配免疫原性组合物显著增强免疫原性组合物的稳定性且抑制其沉淀的出人意料且意外的结果。举例来说，在本发明(例如参看实例2)中观察到，在2-8℃下当经由水平旋转式振荡器轻柔搅动时，在缓冲盐水中调配且填充于单剂量注射器中的13价肺炎球菌连结物(13vPnC)将在10分钟内从溶液中沉淀析出。(水平旋转式振荡器用于模拟13vPnC免疫原性组合物的典型加工、装运和存储条件)。然而，意外地观察到，在2-8℃下轻柔搅动的在缓冲盐水和0.001％吐温80中调配且填充于单剂量注射器中的13vPnC可稳定25天而无可见的沉淀迹象(资料未显示)。因此，此资料表明，将表面活性剂(例如，吐温80)添加到免疫原性组合物调配物中会增强免疫原性组合物的稳定性。
关于13vPnC的第二稳定性研究进一步证实，将表面活性剂添加到调配物中会显著增强13vPnC的稳定性。举例来说，评定2小时时间段内存在0.05％吐温80(表1)和不存在吐温80(0.0％，表1)的13vPnC调配物的稳定性(即，通过测量13vPnC抗原性的改变来分析)。如表1中所示，在2小时的分析中，13种血清型多糖(未用吐温80调配)的抗原性显著降低。然而，特别引人注目的是，包含0.05％吐温80(表1)的13vPnC调配物在2小时的抗原性分析中展现稳固的稳定性。还观察到，在250mL玻璃瓶中用0.01％吐温80或0.05％吐温80调配的13vPnC可经受经由在2-8℃下涡旋所述调配物30分钟所诱导的显著剪切力，存在极少或无抗原性损失(例如参看实例2，表2)。
在其它实验(实例3)中，表明当用诸如吐温80等表面活性剂调配时，免疫原性链球菌C5a肽酶(SCP)组合物的稳定性极大增强。举例来说，如图1A所示，将在5mM琥珀酸盐缓冲液(pH 6.0)、10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0和7.4)或10mM Tris缓冲液(pH 7.5)中调配的SCP(55μg/mL)涡旋2天后，SCP浓度明显降低(例如，大于90％)。然而，如图1B所示，在2天的涡旋之前，将0.025％吐温80添加到SCP琥珀酸盐、SCP磷酸盐和SCP Tris调配物中完全抑制SCP损失，这与图1A中所观察的相同。
也可在存在或不存在佐剂(诸如磷酸铝(AlPO4))的情况下调配本发明的13vPnC免疫原性组合物。因此，在一系列单独实验(实例4)中，在不添加表面活性剂(例如，调配物中不包括吐温80)的情况下，在5mM琥珀酸盐缓冲液(pH 5.8)、0.85％NaCl和AlPO4(0.25mg铝/ml)中调配13vPnC免疫原性组合物。
在这些实验中，将13vPnC免疫原性组合物(在存在AlPO4的情况下调配)填充于各种硅化和未硅化容器装置(例如参看表3)中并且经由在2-8℃下搅动使其经历模拟的装运和处理条件。在这些实验(实例4)中观察到，具有较高聚硅氧含量的容器装置展现较高程度的13vPnC微粒形成和较高的13vPnC抗原性损失百分比。对于微粒的FTIR分析表明，所述微粒是由蛋白质和聚硅氧组成(资料未显示)，且约85％的13vPnC与AlPO4结合，其中剩余15％为在溶液中游离(未结合AlPO4)的13vPnC。
在比较在存在与不存在AlPO4的情况下调配的13vPnC免疫原性组合物(其随后被填充于相同注射器中)的另一实验中，观察到在所测试的注射器中，在不存在AlPO4的情况下调配的13vPnC保持比在存在AlPO4的情况下调配的13vPnC高的免疫原性损失(例如参看图6和图7)。
因此，如本文所述，本发明针对使诸如多糖-蛋白质连结物(例如13vPnC)和蛋白质免疫原(例如，链球菌C5a肽酶、脑膜炎奈瑟氏菌ORF 2086蛋白)等免疫原性组合物对于各种影响免疫原性组合物的稳定性的因素(例如，剪切力、装运搅动、硅油相互作用、吸附、制造工艺、温度、湿度、制造与使用之间的时间长度等)稳定且抑制其聚集或沉淀的新颖调配物。
在某些实施例中，本发明针对使多糖-蛋白质连结物稳定的调配物，所述调配物包含pH值缓冲盐水溶液，其中所述缓冲液具有约3.5到约7.5的pKa值；表面活性剂；和一种或多种多糖-蛋白质连结物。在其它实施例中，多糖-蛋白质连结物调配物包含于容器装置中。在另一实施例中，本发明针对使链球菌C5a肽酶(SCP)组合物稳定的调配物，所述调配物包含pH值缓冲盐水溶液，其中所述缓冲液具有约3.5到约6.5的pKa值；表面活性剂；和链球菌C5a肽酶。在某些实施例中，SCP调配物包含于容器装置中。在另一实施例中，本发明针对使脑膜炎奈瑟菌2086蛋白组合物稳定的调配物，所述调配物包含pH值缓冲盐水溶液，其中所述缓冲液具有约3.5到约7.5的pKa值；表面活性剂；和脑膜炎奈瑟菌2086蛋白。在某些实施例中，脑膜炎球菌2086调配物包含于容器装置中。
在某些其它实施例中，本发明针对抑制聚硅氧诱导的硅化容器装置中所包含的多糖-蛋白质连结物沉淀的调配物，所述调配物包含pH值缓冲盐水溶液，其中所述缓冲液具有约3.5到约7.5的pKa值；铝盐；和一种或多种多糖-蛋白质连结物。在另一实施例中，本发明针对抑制聚硅氧诱导的硅化容器装置中所包含的链球菌C5a肽酶(SCP)组合物沉淀的调配物，所述调配物包含pH值缓冲盐水溶液，其中所述缓冲液具有约3.5到约6.5的pKa值；铝盐；和链球菌C5a肽酶。在某些其它实施例中，本发明针对抑制聚硅氧诱导的硅化容器装置中所包含的脑膜炎奈瑟菌2086蛋白组合物沉淀的调配物，所述调配物包含pH值缓冲盐水溶液，其中所述缓冲液具有约3.5到约7.5的pKa值；铝盐；和脑膜炎奈瑟菌2086蛋白。
在其它实施例中，本发明针对使脑膜炎奈瑟菌2086蛋白的抗原稳定性以及与铝盐佐剂(例如AlPO4)的结合百分比优化的调配物，所述调配物包含pH值缓冲盐水溶液，其中所述缓冲液具有约3.5到约7.5的pKa值；表面活性剂；和脑膜炎奈瑟菌2086蛋白。在某些实施例中，调配物包含于容器装置中。
如下文所定义，术语“沉淀”、“沉淀物”、“微粒形成”、“变浑”和“聚集”可互换使用，且意欲指引起多糖-蛋白质连结物或蛋白质(或多肽)免疫原“聚集”的任何物理相互作用或化学反应。聚集(例如蛋白质聚集)的过程已为所属领域众所周知(但尚未完全了解)且描述，并且其通常受多种物理化学应力的影响，包括热、压力、pH值、搅动、剪切力、冷冻-解冻、脱水、重金属、酚系化合物、硅油、变性剂等。
如下文所定义，本发明的“多糖-蛋白质连结物”、“肺炎球菌连结物”、“7价肺炎球菌连结物(7vPnC)”、“13价肺炎球菌连结物(13vPnC)”、“链球菌C5a肽酶(SCP)免疫原性组合物”和“脑膜炎奈瑟菌2086蛋白免疫原性组合物”包括液体调配物、经冷冻液体调配物和固体(例如，冷冻干燥或冻干)调配物。
A.表面活性剂
如上文所述，本发明针对使免疫原性组合物对于影响免疫原性组合物稳定性的多个因素(例如，剪切力、装运搅动、硅油相互作用、吸附、制造工艺、温度、湿度、制造与使用之间的时间长度等)稳定且抑制其聚集的调配物。在某些实施例中，本发明针对包含表面活性剂的调配物。
表面活性剂(surfactant或surface-active agent)通常定义为(a)包含亲水基团或部分以及亲脂(疏水)基团或部分的分子或化合物，和/或(b)减小或降低溶液表面张力的分子、物质或化合物。如本文所定义，本发明的“表面活性剂”为降低免疫原性组合物调配物的表面张力的任何分子或化合物。
本发明的调配物中所使用的表面活性剂包含使本文所述的免疫原性组合物稳定且抑制其聚集的任何表面活性剂或任何表面活性剂的组合。因此，本发明的表面活性剂包括(但不限于)聚山梨醇酯20(吐温20)、聚山梨醇酯40(吐温40)、聚山梨醇酯60(吐温60)、聚山梨醇酯65(吐温65)、聚山梨醇酯80(吐温80)、聚山梨醇酯85(吐温85)、曲通N-101、曲通X-100、氧托夕醇40、壬苯醇醚-9、三乙醇胺、三乙醇胺多肽油酸盐、聚氧化乙烯-660羟基硬脂酸酯(PEG-15，索罗托H15)、聚氧化乙烯-35-蓖麻油酸酯(克林莫佛EL)、大豆卵磷脂、泊洛沙姆、十六烷基胺、十八烷基胺、氨基酸十八烷酯、溶血卵磷脂、二甲基-二十八烷基溴化铵、甲氧基十六烷基甘油、普流尼克多元醇(pluronic polyol)、聚胺(例如，吡喃、硫酸右旋糖苷、多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyIC)、卡伯波(carbopol))、肽(例如，胞壁肽和二肽、二甲基甘氨酸、促吞噬素(tuftsin)、油乳液、矿物凝胶(例如磷酸铝)和免疫刺激复合物(ISCOM)。
所属领域技术人员可易于通过测量在存在和不存在表面活性剂的情况下特定免疫原性组合物调配物的表面张力来确定适当表面活性剂或表面活性剂组合。或者，针对表面活性剂降低、抑制或防止免疫原性组合物聚集的能力定性(例如目视检查微粒的形成)或定量(例如，光散射、沉降速度离心、光密度、抗原性)评估表面活性剂。
B.容器装置
在某些实施例中，本发明针对包含于容器装置中的免疫原性组合物的调配物。如本文所定义，本发明的“容器装置”包括在研究、加工、研制、调配、制造、存储和/或投药期间用于“含有”、“保存”、“混合”、“掺合”、“分配”、“注射”、“传递”、“喷雾”等免疫原性组合物的任何相关组合物。举例来说，本发明的容器装置包括(但不限于)常用实验室玻璃器具，烧瓶、烧杯、量筒、发酵罐、生物反应器、管道、导管、袋子、广口瓶、小瓶、小瓶密封物(例如，橡胶塞、螺旋盖)、安瓿、注射器、注射器塞、注射器柱塞、橡胶密封物、塑料密封物、玻璃密封物等。本发明的容器装置不受制造材料的限制，且包括诸如玻璃、金属(例如，钢、不锈钢、铝等)和聚合物(例如，热塑性塑料、弹性体、热塑性塑料-弹性体)。
所属领域技术人员将了解，上述容器装置并不是详尽列表，而只是充当所属领域技术人员对于了解在研究、加工、研制、调配、制造、存储和/或投与免疫原或免疫原性组合物期间用于含有、保存、混合、掺合、分配、注射、传递、喷雾等所述组合物的多种容器装置的指导。预期用于本发明中的其它容器装置可见于诸如以下实验室设备供应商和制造商的公开目录中：美国塑料公司(United States Plastic Corp.)(俄亥俄州利马(Lima，OH))、VWRTM(宾西法尼亚州西切斯特(West Chester，PA))、BD生物技术公司(BD Biosciences)(新泽西州弗兰克林湖(Franklin Lakes，NJ))、菲舍尔科技国际有限公司(Fisher ScientificInternational Inc.)(新罕布什尔州汉普顿(Hampton，NH))和西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(密苏里州圣路易斯(St.Louis，MO))。
因此，本发明的新颖调配物因其使容器装置中所包含的免疫原性调配物在研究、加工、研制、调配、制造、存储和/或投与所述组合物的各个阶段中始终稳定且抑制其沉淀而特别有益。本发明的新颖调配物不仅使免疫原性组合物对于物理/热应力(例如温度、湿度、剪切力等)稳定，而且还增强免疫原性组合物对于诸如免疫原性组合物与容器/密封物系统(例如，硅化容器装置)不相容等不利因素或影响的稳定性且抑制其沉淀。
因此，本发明的新颖调配物对于使免疫原(即，多糖-蛋白质连结物、蛋白质或多肽抗原)对于硅油诱导的沉淀和上文所述的沉淀稳定特别有用。举例来说，2006年4月26日申请的共同待决的美国申请案第60/795,098号(特别以引用的方式并入本文中)描述免疫原性组合物在容器装置(诸如注射器、玻璃小瓶、橡胶塞等)上所见的硅油存在下发生聚集，其中将表面活性剂添加到容器装置中防止硅油诱导的这些免疫原性组合物聚集。
C.佐剂和医药载剂/赋形剂
在某些实施例中，进一步在存在佐剂的情况下调配本发明的免疫原性组合物。佐剂为当与免疫原或抗原一起投与时增强免疫反应的物质。经证实，多种细胞因子或淋巴因子具有免疫调节活性且因此可用作佐剂，包括(但不限于)白细胞介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、12(例如参看美国专利第5,723,127号)、13、14、15、16、17和18(和其突变形式)；干扰素-α、β、γ；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF，例如参看美国专利第5,078,996号和ATCC登记号39900)；巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)；粒细胞集落刺激因子(GCSF)；和肿瘤坏死因子α和β(TNF)。适用于本发明中的其它佐剂包括趋化因子，包括(但不限于)MCP-1、MIP-1α、MIP-1β和RANTES。
在某些实施例中，用于增强免疫原性组合物调配物的免疫反应的佐剂包括(但不限于)MPLTM(3-O-脱酰基单磷酰脂A；科里沙公司(Corixa)，蒙大拿州汉弥敦(Hamilton，MT))，其描述于美国专利第4,912,094号中，所述专利以引用的方式并入本文中。适用作佐剂的还包括合成脂质A类似物，或氨基烷基葡糖胺磷酸酯化合物(AGP)或其衍生物或类似物，其购自科里沙公司(Corixa)，蒙大拿州汉弥敦(Hamilton，MT)且描述于美国专利第6,113,918号中，所述专利以引用的方式并入本文中。一种所述AGP为2-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰基氨基]乙基2-脱氧-4-O-膦基-3-O-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰基]-2-[(R)-3-十四烷酰氧基十四烷酰基-氨基]-b-D-吡喃葡萄糖苷，其也称为529(曾称为RC529)。此529佐剂是调配为水溶液形式或稳定乳液形式(RC529-SE)。
其它佐剂包括矿物油和水乳液；铝盐(alum)，诸如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；爱菲金(Amphigen)；阿夫立定(Avridine)；L121/角鲨烯；D-丙交酯-聚丙交酯/糖苷；普流尼克多元醇；胞壁酰二肽；灭活博德特氏菌(killed Bordetella)；皂草苷，诸如契木伦QS-21(StimulonTM QS-21)(马萨诸塞州弗拉明汉的安帝君斯公司(Antigenics，Framingham，MA.)，描述于美国专利第5,057,540号中，其以引用的方式并入本文中；和由其产生的颗粒，诸如ISCOMS(免疫刺激复合物)、ISCOMATRIX(澳大利亚派克威尔CSL有限公司(CSLLimited，Parkville，Australia))，描述于美国专利第5,254,339号中；结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)细菌脂多糖；合成聚核苷酸，诸如含有CpG基元的寡核苷酸(美国专利第6,207,646号，其以引用的方式并入本文中)、IC-31(奥地利维也纳英特塞尔AG公司(Intercell AG，Vienna，Austria)，描述于欧洲专利第1,296,713号和第1,326,634号中；百日咳毒素(PT)，或大肠杆菌热敏性毒素(LT)，尤其LT-K63、LT-R72、PT-K9/G129；例如参看国际专利公开案第WO 93/13302号和第WO 92/19265号，其以引用的方式并入本文中。
适用作佐剂(和载体蛋白)的还有霍乱毒素和其突变体，包括已公开的国际专利申请案第WO 00/18434号中所述者(其中第29位氨基酸处的谷氨酸经另一氨基酸(除天冬氨酸外)、优选组氨酸置换)。类似CT毒素或突变体描述于已公开的国际专利申请案第WO 02/098368号中(其中单独第16位氨基酸处的异亮氨酸经另一氨基酸置换，或者所述置换与第68位氨基酸处的丝氨酸经另一氨基酸置换的组合；和/或其中第72位氨基酸处的缬氨酸经另一氨基酸置换)中。其它CT毒素描述于已公开的国际专利申请案第WO 02/098369号(其中第25位氨基酸处的精氨酸经另一氨基酸置换；和/或将一个氨基酸插入第49位氨基酸处；和/或将两个氨基酸插入第35位和第36位氨基酸处)。
在某些实施例中，免疫原性组合物调配物包含医药学上可接受的稀释剂、赋形剂或医药学上可接受的载剂。在一个实施例中，医药学上可接受的稀释剂为无菌水、注射用水、无菌等渗盐水或生物缓冲剂。将多糖-蛋白质连结物和/或蛋白质免疫原与所述稀释剂或载剂以常规方式混合。如本文所使用，短语“医药学上可接受的载剂”意欲包括与对人类或其它脊椎动物宿主投药相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸附延迟剂等。所属领域技术人员显而易见适当载剂且其在很大程度上视投药途径而定。
举例来说，可存在于免疫原性组合物调配物中的赋形剂为防腐剂、化学稳定剂和悬浮剂或分散剂。通常，将稳定剂、防腐剂等优化以确定有效用于对目标受者(例如人类个体)的最佳调配物。防腐剂的实例包括氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香兰素、甘油、苯酚和对氯苯酚。稳定成分的实例包括酪蛋白氨基酸(casamino acid)、蔗糖、明胶、酚红、N-Z胺、二磷酸一钾、乳糖、水解乳白蛋白和奶粉。
在某些实施例中，制备例如液体、散剂、气雾剂、片剂、胶囊、肠衣片剂或胶囊或栓剂形式的免疫原性组合物调配物以对人类个体投与。因此，免疫原性组合物调配物还可包括(但不限于)油性或水性媒剂中的悬浮液、溶液、乳液，糊剂和可植入持续释放或生物可降解调配物。
本发明的免疫原性组合物不受适用于上述类型的医药制剂中的常规、生理学上可接受的载剂、稀释剂和赋形剂(诸如溶剂、缓冲剂、佐剂或其它成分)的选择的限制。由上述组分制备具有适当pH值、等渗性、稳定性和其它常规特征的所述医药学上可接受的组合物在所属领域的技术范围内。
D.免疫原
在某些实施例中，本发明的多糖-蛋白质连结物调配物包含一种或多种肺炎球菌多糖。在其它实施例中，本发明的多糖-蛋白质连结物调配物包含一种或多种链球菌多糖。在其它实施例中，本发明的多糖-蛋白质连结物调配物包含一种或多种脑膜炎球菌多糖。在其它实施例中，本发明的多糖-蛋白质连结物调配物包含一种或多种肺炎球菌多糖、一种或多种肺炎球菌多肽、一种或多种链球菌多糖、一种或多种链球菌多肽、一种或多种脑膜炎球菌多糖和/或一种或多种脑膜炎球菌多肽的组合。
如下文所定义，术语“多糖”意欲包括免疫学和细菌疫苗领域中常用的任何抗原糖成分(或抗原单元)，包括(但不限于)“糖”、“寡糖”、“多糖”、“脂糖”、“脂寡糖(LOS)”、“脂多糖(LPS)”、“糖基化物”、“糖连结物”等。
在本发明的一个特定实施例中，所述一种或多种肺炎球菌多糖为肺炎链球菌血清型4多糖、肺炎链球菌血清型6B多糖、肺炎链球菌血清型9V多糖、肺炎链球菌血清型14多糖、肺炎链球菌血清型18C多糖、肺炎链球菌血清型19F多糖、肺炎链球菌血清型23F多糖、肺炎链球菌血清型1多糖、肺炎链球菌血清型3多糖、肺炎链球菌血清型5多糖、肺炎链球菌血清型6A多糖、肺炎链球菌血清型7F多糖和肺炎链球菌血清型19A多糖。
在某些实施例中，多糖-蛋白质连结物调配物为7价肺炎球菌连结物(7vPnC)调配物，其包含肺炎链球菌血清型4多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型6B多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型9V多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型14多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型18C多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型19F多糖与CRM197多肽的连结物和肺炎链球菌血清型23F多糖与CRM197多肽的连结物。
在某些其它实施例中，多糖-蛋白质连结物调配物为13价肺炎球菌连结物(13vPnC)调配物，其包含肺炎链球菌血清型4多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型6B多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型9V多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型14多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型18C多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型19F多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型23F多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型1多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型3多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型5多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型6A多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型7F多糖与CRM197多肽的连结物和肺炎链球菌血清型19A多糖与CRM197多肽的连结物。
多糖是通过所属领域技术人员已知的标准技术制备。举例来说，本发明中所述的荚膜多糖是由肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F制备，其中使各血清型在含大豆的培养基中生长，且随后将个别多糖通过离心、沉淀、超滤和柱色谱纯化。类似地，使用所属领域技术人员已知的常用技术和方法由临床相关血清型或血清群制备链球菌多糖(例如，一种或多种来自诸如A群链球菌、B群链球菌、C群链球菌和G群链球菌等乙型溶血性链球菌(β-hemolytic Streptococcus)的多糖(或寡糖))和脑膜炎球菌糖(例如，脑膜炎奈瑟菌脂寡糖(LOS)或脂多糖(LPS))。随后将经纯化多糖化学活化(例如，经由还原胺化)以使所述糖能够与载体蛋白反应。活化后，即将各荚膜多糖与载体蛋白(例如CRM197)单独连结以形成糖连结物(或者，将各荚膜多糖与相同载体蛋白连结)并且将其调配成单剂量调配物。
多糖的化学活化和随后与载体蛋白的连结(即，多糖-蛋白质连结物)是通过常规方式实现。例如参看美国专利第4,673,574号和第4,902,506号。
载体蛋白优选为无毒且无反应性并且可以足量和纯度获得的蛋白质。载体蛋白可接受标准连结程序。在本发明的特定实施例中，将CRM197用作载体蛋白。
CRM197(北卡罗来纳州桑福德惠氏公司(Wyeth，Sanford，NC))为从生长于含酪蛋白氨基酸和酵母提取物的培养基中的白喉杆菌(Corynebacterium diphtheria)菌株C7(β197)的培养物中分离的白喉毒素的无毒变体(即，类毒素)。将CRM197通过超滤、硫酸铵沉淀和离子交换色谱纯化。或者，根据美国专利第5,614,382号(其以引用的方式并入本文中)重组制备CRM197。其它白喉毒素也适于用作载体蛋白。
在其它实施例中，本发明的载体蛋白为无酶活性的链球菌C5a肽酶(SCP)(例如，美国专利第6,951,653号、美国专利6,355,255和美国专利6,270,775中所述的一种或多种SCP变体)。
其它适当载体蛋白包括无活性细菌毒素，诸如破伤风类毒素、百日咳类毒素、霍乱类毒素(例如，CT E29H，其描述于国际专利申请案WO2004/083251中)、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST和来自绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A。也可使用细菌外膜蛋白，诸如外膜复合物c(OMPC)、孔蛋白、转铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌粘附蛋白(PsaA)或流感嗜血杆菌蛋白D。也可将诸如卵清蛋白、钥孔戚血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)用作载体蛋白。
在将荚膜多糖与载体蛋白连结后，通过各种技术纯化(关于多糖-蛋白质连结物的量富集)多糖-蛋白质连结物。这些技术包括浓缩/透滤操作、沉淀/洗脱、柱色谱和深部过滤。
在纯化个别糖连结物后，将其混合以调配本发明的免疫原性组合物。可使用所属领域认可的方法得到本发明的多糖-蛋白质连结物的调配物。举例来说，可将13种个别肺炎球菌连结物与生理学上可接受的媒剂一起调配来制备所述组合物。所述媒剂的实例包括(但不限于)水、缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)和右旋糖溶液。
在其它实施例中，本发明针对使链球菌C5a肽酶(SCP)免疫原性组合物稳定的调配物，其中所述调配物包含pH值缓冲盐水溶液，其中所述缓冲液具有约3.5到约6.5的pKa值；表面活性剂；和链球菌C5a肽酶。C5a肽酶为高度保守的丝氨酸蛋白酶且其在所有乙型溶血性链球菌(例如A群、B群、C群和G群链球菌)中表达。举例来说，编码B群链球菌(GBS)C5a肽酶的核苷酸序列与编码A群链球菌(GAS)C5a肽酶的核苷酸序列98％一致。因此，在本发明的某些实施例中，针对由乙型溶血性链球菌所引起的感染的免疫原性组合物包含C5a肽酶免疫原(或抗原)。
在一个特定实施例中，本发明的C5a肽酶为无酶活性的链球菌C5a肽酶(例如，美国专利第6,951,653号、美国专利6,355,255和美国专利6,270,775中所述的一种或多种SCP变体，所述专利各自特定地以引用的方式并入本文中)。在另一特定实施例中，用于本发明的新颖免疫原性组合物调配物中的SCP是从B群链球菌克隆。在另一实施例中，已使B群链球菌SCP序列基因突变以使其无蛋白分解活性(例如参看美国专利6,951,653、6,355,255和6,270,775)且在大肠杆菌中表达为重组蛋白。
在另一实施例中，本发明针对使脑膜炎奈瑟菌2086蛋白免疫原性组合物稳定的调配物，其中所述调配物包含pH值缓冲盐水溶液，其中所述缓冲液具有约3.5到约7.5的pKa值；表面活性剂；和脑膜炎奈瑟菌2086蛋白。通过鉴别为“ORF 2086”的核酸序列开放式阅读框(ORF)编码脑膜炎奈瑟菌2086蛋白(例如参看国际公开案第WO 03/063766 A2号(国际申请案第PCT/US02/32369号)、国际公开案第WO 04/094596 A2号(国际申请案第PCT/US04/011901号)和国际公开案第WO 04/065603 A2号(国际申请案第PCT/US04/000800号)，其各自特定地以引用的方式并入本文中)。在另一实施例中，本发明针对使脑膜炎奈瑟菌2086蛋白的抗原稳定性以及与铝盐佐剂(例如AlPO4)的结合百分比优化的调配物，其中所述调配物包含pH值缓冲盐水溶液，其中所述缓冲液具有约3.5到约7.5的pKa值；表面活性剂；和脑膜炎奈瑟菌2086蛋白。
本文中所引用的所有专利和公开案都是以引用的方式并入本文中。
E.实例
以下实例是使用标准技术进行，除非另外详述，否则所述技术为所属领域技术人员众所周知且常用。以下实例是出于说明的目的提供且不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
实例1
包含0.001％-0.05％吐温80的免疫原性调配物使免疫原稳定且防止其聚集
用于本实例中的多糖-蛋白质连结物为13价肺炎球菌多糖连结物(13vPnC)，其包含来自肺炎链球菌血清型4、6B、9V、18C、19F、14、23F、1、3、5、6A、7F和19A的荚膜多糖，所述多糖各自与CRM197连结。荚膜多糖是通过所属领域技术人员已知的标准技术制备。简单来说，使各肺炎球菌多糖血清型在含大豆的培养基中生长，随后通过离心、沉淀、超滤和柱色谱来纯化个别多糖。将经纯化多糖化学活化以供连结，且将各多糖与CRM197载体蛋白单独连结以形成糖连结物，并将其调配成单剂量调配物。
多糖的化学活化和随后与载体蛋白的连结是通过常规方式完成(例如参看美国专利第4,673,574号和第4,902,506号)。CRM197(北卡罗来纳州桑福德惠氏公司(Wyeth，Sanford，NC))为从生长于含酪蛋白氨基酸和酵母提取物的培养基中的白喉杆菌菌株C7(β197)的培养物中分离的白喉毒素的无毒变体(即，类毒素)。通过超滤、硫酸铵沉淀和离子交换色谱将CRM197纯化。
通过将13vPnC样本与13种对各多糖血清型具特异性的抗血清(Ab)中的一种混合且经由在360系统(贝克曼库尔特有限公司(Beckman Coulter，Inc.)；加州富尔顿(Fullerton，CA))上进行光散射测量以检测免疫复合物来进行下文所述的抗原性实验。随后将所检测的13种血清型中每一种的光散射测量值与标准曲线相比较并报导为抗原性(μg/ml)。
注射器(BD海派公司SCFTM)和注射器塞(BD海派公司SCFTM)是购自BD生物技术公司(BD Biosciences)(新泽西州弗兰克林湖(Franklin Lakes，NJ))。具有内衬有特氟隆密封物的透明硼硅酸盐小瓶(VWR TraceCleanTM，40mL)是购自VWRTM(宾西法尼亚州西切斯特(West Chester，PA))。聚山梨醇酯80(吐温80)是购自J.T.Baker(马林克罗特贝克有限公司(Mallinckrodt Baker，Inc.)；新泽西州菲利斯堡(Phillipsburg，NJ))。缓冲盐水为pH 5.8的琥珀酸盐(5mM)和NaCl(0.85％)。
如下所述在不同表面活性剂浓度(吐温80；0.001％、0.005％、0.01％和0.05％重量/体积)下调配13vPnC(500mL总体积)：将0.85％盐水(150mM NaCl)添加到1升派热克斯玻璃烧杯中，随后添加50mM琥珀酸盐缓冲液(最终浓度5mM)和13vPnC。各血清型连结物的最终浓度为4.4μg/mL(血清型6B除外，其为8.8μg/mL)。随后将13vPnC调配物分到5个单独玻璃小瓶(每瓶50mL)中，其中将0.0％、0.001％、0.005％、0.01％或0.05％吐温80(w/v)添加到5个小瓶中的一个中，且使各溶液过滤通过0.22μm杜鲁珀过滤器(密理博公司(Millipore)；马萨诸塞州毕莱卡(Billerica，MA))。接着，将0.65mL各溶液填充于分开的具有w4432灰色塞子的3mL BD海派SCFTM玻璃注射器(BD医疗器械公司(BDMedical Pharmaceutical Systems)；新泽西州弗兰克林湖(Franklin Lakes，NJ))中，并在2℃到8℃下将注射器放于水平旋转式振荡器(60cpm)上达100小时。
目视检查观察到(资料未显示)，在2-8℃下当经由水平旋转式振荡器轻柔搅动后，在不存在吐温80(即0.0％)的情况下调配的13vPnC将在10分钟内自溶液中沉淀析出。相比之下，在0.001％、0.005％、0.01％或0.05％吐温80中调配且在2-8℃下轻柔搅动的13vPnC可稳定长达25天，而无可见的沉淀迹象(资料未显示)。因此，此资料表明，将表面活性剂(例如，吐温80)添加到免疫原性组合物调配物中会增强免疫原性组合物的稳定性。
关于13vPnC的第二稳定性实验进一步证实，将表面活性剂添加到调配物中会显著增强13vPnC的稳定性。在此实验中，在存在和不存在0.05％吐温80的情况下调配13vPnC。在不存在吐温80(即0.0％)的情况下调配的13vPnC制备如下：将0.85％盐水(150mM NaCl)添加到1升派热克斯玻璃烧杯中，随后添加50mM琥珀酸盐缓冲液(最终浓度5mM)和13vPnC，总体积为500mL。具有0.05％吐温80的13vPnC调配物制备如下：将0.85％盐水(150mM NaCl)添加到1升派热克斯玻璃烧杯中，随后添加50mM琥珀酸盐缓冲液(最终浓度5mM)、0.05％吐温80和13vPnC，总体积为500mL。500mL调配物中各血清型连结物的最终浓度为4.4μg/mL(血清型6B除外，其为8.8μg/mL)。经由转子/定子均质机以6,000rpm(2-8℃)将500mL调配物均质化120分钟。均质化过程产生空气-液体界面(具有气泡)。
如下评定2小时时间段内具有(表1)和不具有(表1)0.05％吐温80的13vPnC调配物的稳定性：在0、30分钟和120分钟时将样本(20-30mL)从0.0％和0.05％吐温80调配物中移出，将样本以1∶2稀释于蛋白质稀释剂(360蛋白质稀释剂(目录号663630)；贝克曼库尔特有限公司(Beckman Coulter，Inc.)；加州富尔顿(Fullerton，CA))中，且在360系统上分析13vPnC的所有13种血清型的抗原性。
如表1中所示，在2小时的分析中，13种血清型多糖(未用吐温80调配)的抗原性显著降低。然而，特别引人注目的是，包含0.05％吐温80(表1)的13vPnC调配物在2小时的抗原性分析中展现稳固的稳定性，不存在抗原性的降低。
表1
具有和不具有吐温80的13VPNC调配物的稳定性分析
进一步测试13vPnC/吐温80调配物对于高剪切力的稳定性。在本实验中，将100mL13vPnC组合物(4.4μg/mL血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F和8.8μg/mL血清型6B、5mM琥珀酸盐缓冲液、150mM NaCl和0.25mg/mL AlPO4)添加到3个包含0.0％、0.01％或0.05％吐温80的250mL玻璃瓶中。随后在涡旋振荡器(2；科技工业有限公司(Scientific Industries，Inc.)；纽约州波希米亚(Bohemia，NY))上将3个瓶涡旋30分钟(2-8℃)并在最高速度设定下产生空气-液体界面。30分钟后，从各瓶中取出10-30mL样本，以1∶2稀释于360蛋白质稀释剂中且在360系统上分析13种血清型的抗原性。
如从下表2中可看出，在不存在吐温80(0.0％)的情况下调配的13vPnC在涡旋后抗原性具有平均20％的降低。在存在0.01％吐温80的情况下调配的13vPnC的抗原性在2-10％的范围内降低(平均8％)，且在存在0.05％吐温80的情况下调配的13vPnC的抗原性在0-8％的范围内降低(平均3％)。因此，表2中所提供的数据表明，相对于在不存在吐温80的情况下调配的13vPnC，在存在0.01％或0.05％吐温80的情况下调配的13vPnC明显对于剪切力稳定。
表2
吐温80对剪切力的稳定效应
实例2
包含表面活性剂的调配物使链球菌C5A肽酶稳定且防止其聚集
如下表达且纯化本实例中所使用的链球菌C5a肽酶(SCP)。在大肠杆菌中使用阿拉伯糖可诱导系统重组表达SCP。遵循有关使用无动物成分确定培养基和随后的细胞溶解的大肠杆菌标准发酵方案。通过在搅拌下饱和达到60％(约3M)硫酸铵达12-24小时从细胞溶解产物的可溶部分中纯化出重组SCP。将饱和溶解产物离心，保留上清液且将其装载于苯基琼脂糖凝胶(phenyl Sepharose)疏水相互作用柱上。随后用1M硫酸铵、20mM Tris-Cl(pH7.5)洗脱结合的物质，浓缩并对PBS(pH 7.4)透滤。将经纯化重组SCP(rSCP)用PBS(pH 7.4)稀释到约10mg/mL，且使其通过伯斯蒂尼过滤器(Posidyne filter)以去除内毒素，随后最终过滤(0.2mM)以使无菌且冷冻存储(-25℃)。
随后在存在0.025％吐温80或不存在吐温80(0.0％)的情况下，在以下缓冲液中调配经纯化SCP(55μg/mL)：5mM琥珀酸盐缓冲液(pH 6.0)、10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)、10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)或10mM Tris缓冲液(pH 7.5)；且将其填充于分开的BD海派SCFTM注射器中。接着在2-8℃下，将注射器放于水平旋转式振荡器上，以180cpm振荡2天且通过修正的洛瑞分析测定SCP蛋白浓度。
如图1所示，当用吐温80调配时，SCP的稳定性极大增强。举例来说，在旋转式振荡器上2天后，未用吐温80调配的SCP(图1A)展现SCP在各所测试的缓冲液中的浓度明显降低(例如大于90％)。然而，如图1B所示，在放于旋转式振荡器上达2天之前，将0.025％吐温80添加到SCP缓冲液调配物中完全抑制图1A中所观察的SCP损失。
还分别在25℃和37℃下评定SCP/吐温80(0.025％)调配物的存储稳定性达8周和6周(数据未显示)。简单来说，在如下琥珀酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液中调配SCP(200μg)：琥珀酸盐缓冲液(5mM，pH 6.0)或磷酸盐缓冲液(15mM，pH 7.4)、0.9％NaCl和0.025％吐温80。通过尺寸排阻HPLC、修正的洛瑞总蛋白分析和沉淀的目视检查来分析SCP/吐温80调配物的稳定性。在本研究中观察到，SCP/吐温80调配物(在任一缓冲液中)在25℃和37℃下于整个稳定性研究中完全稳定(即，分别长达8周和6周)。
实例3
硅化容器装置对13VPNC稳定性的影响
先前的实验表明(资料未显示)，当填充于用道康宁(Dow )医药级DC360聚硅氧处理且覆盖有西氏4432/50(West 4432/50)无乳胶塞(氯丁基)和EZ顶盖西氏7025/65(合成异戊二烯溴丁基掺合物；西氏医药(West )，宾夕法尼亚州市狮城(Lionville，PA))的立即可用(单剂量)贝克顿·迪金森(Becton BD)海派1型硼硅酸盐玻璃注射器中时，13vPnC免疫原性组合物沉淀和/或聚集。在这些实验中，在存在和不存在作为佐剂的0.25mg/mL磷酸铝的情况下，在含有0.85％NaCl和4.4μg/ml肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F以及8.8μg/ml肺炎链球菌血清型6B的5mM琥珀酸盐缓冲液中调配13vPnC。观察到，在不存在AlPO4的情况下，可易于观察到13vPnC微粒；而在存在AlPO4的情况下，13vPnC微粒明显减少且较难检测到。
在本实例中，检查一系列容器和密封物组分(即，容器装置)以鉴别何种组分诱导或引起13vPnC微粒形成。所测试的容器装置包含注射器、塞子和小瓶且列于下表3中。使用哈伯(Huber)或吉尔(Jar)方法使表3中所列的BD和西氏塞子硅化。哈伯硅化方法较易控制且在塞子表面上产生30到60μg/cm2聚硅氧，而吉尔硅化方法在塞子表面上产生150到300μg/cm2聚硅氧。根据理论计算，约15％塞子表面积暴露于注射器中的产物，表明对于哈伯和吉尔方法，分别可从塞子提取出4.5到9μg和22.5到45μg聚硅氧。
材料
聚硅氧为道康宁360医用流体1000厘斯(Dow 360Medical Fluid1000centistokes)(批号0001846266)。在存在和不存在0.25mg/mL磷酸铝的情况下，在含有0.85％NaCl和4.4μg/ml肺炎链球菌血清型4、9、14、18C、19F和23F以及8.8μg/ml肺炎链球菌血清型6B的5mM琥珀酸盐缓冲液中调配7vPnC。在存在和不存在0.25mg/mL磷酸铝的情况下，在含有0.85％NaCl和4.4μg/ml肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F以及8.8μg/ml肺炎链球菌血清型6B的5mM琥珀酸盐缓冲液中调配13vPnC。调配(在不存在磷酸铝的情况下，在含有0.85％NaCl的5mM琥珀酸盐缓冲液中)浓度为61μg/ml的单价肺炎链球菌血清型6B，以模拟13vPnC调配物的总糖浓度。
方法
如上文所述调配7vPnC和13vPnC，且将35ml给定调配物添加到250ml透明来劲瓶中。向各来劲瓶中，添加表3中所列的容器装置组分。随后将来劲瓶放于莱博莱恩旋转式振荡器上且以50rpm涡动整夜。结果概述于表3中。
外观 将含有各容器装置组分的来劲瓶举起到实验室中的荧光灯下。穿过样品的光束的路径(廷德尔效应(Tindel effect))使得能检测微粒。
蛋白质分析 通过分别测量经调配免疫原性组合物中总蛋白质的浓度和与铝片(aluminum pellet)缔合的蛋白质来测定总蛋白质和结合铝的蛋白质(将免疫原性组合物的等分试样离心且将离心块再悬浮于盐水中)。使用皮尔斯修正洛瑞蛋白质分析(PierceModified Lowry protein assay)(目录号23240)以及牛血清白蛋白作为标准物来进行分析。
结论
在第一系列实验中，在不存在AlPO4的情况下调配13vPnC免疫原性组合物，且将其暴露于表3中所列的一系列容器装置。从所述资料(表3)可清楚发现，用硅油处理的容器装置组分诱导形成白色微粒。相比之下，在存在未硅化大协塞子(日本大协精工株式会社(Daikyo Seiko，Ltd.，Japan))和肖特小瓶(北美肖特有限公司(Schott NorthAmerica Inc.)；宾西法尼亚州莱巴嫩(Lebanon，PA))的情况下，未检测到微粒。
表3
不同容器装置组分对在不存在AlPO4的情况下调配的13VPNC的影响
选择单价肺炎链球菌血清型6B作为13vPnC的模型且以61.6μg/ml调配(无AlPO4)以模拟13vPnC调配物中的总糖浓度。将聚硅氧(道康宁360医用流体)添加到2ppm到100ppm范围内的经调配单价6B的等分试样中。将混合物放于莱博莱恩旋转式振荡器上以50rpm涡动2小时。如下表4所示，在所有聚硅氧(Si)浓度下观察到纤维状白色微粒。
表4
聚硅氧浓度对微粒形成的影响
聚硅氧浓度 外观(目视检查)
2ppm(1μl Si比500mL调配物) 纤维状白色微粒
5ppm(2.5μl Si比500mL调配物) 纤维状白色微粒
10ppm(5μl Si比500mL调配物) 纤维状白色微粒
15ppm(7.5μl Si比500mL调配物) 纤维状白色微粒
20ppm(10μl Si比500mL调配物) 纤维状白色微粒
100ppm(2μl Si比20mL调配物) 纤维状白色微粒
还检查13vPnC调配物(无AlPO4)中聚硅氧的量。通过DC等离子体发射光谱法测定聚硅氧浓度(数据未显示)。在本方法中，汇集25个注射器的内容物且用2份50ml环己烷/异丙醇混合物提取。将提取液合并且蒸发。将残余物溶解且依据关于测定橡胶塞上聚硅氧的现有方法加以测试。结果表明，可从各注射器提取出15.8到19.0μg聚硅氧。这一量对应于2.7％到3.3％聚硅氧。
在一系列单独实验(其中在存在AlPO4的情况下调配13vPnC且使其经历表3中所述的相同容器装置)中说明，溶液中的聚硅氧和“游离”蛋白质(13vPnC)导致形成微粒(资料未显示)。微粒的FTIR分析也表明，微粒是由蛋白质和聚硅氧组成(资料未显示)。在这些实验中测定出，约85％13vPnC与AlPO4结合，其中剩余15％为在溶液中游离(未结合AlPO4)的13vPnC。相比之下，观察到在用AlPO4调配的7vPnC为100％与AlPO4结合(资料未显示)。
为说明游离蛋白质-多糖对微粒形成的影响，将25ml 7vPnC和13vPnC等分且转移到50ml离心管中。将样本以3,000rpm离心10分钟且小心提取上清液并将其转移到来劲瓶中。将硅化塞(4432塞子)添加到各瓶且将其放于50rpm的旋转式振荡器中。小心目视检查后，观察到7vPnC的上清液未形成微粒，因而保持澄清且无色。
然而，13vPnC上清液在观察第4小时时开始展现较少含量的微粒(资料未显示)。此结果表明，溶液中与聚硅氧结合的游离蛋白质-多糖导致形成微粒。
为进一步说明溶液中的游离蛋白质-多糖引起形成微粒，选择分别与铝高结合和低结合的单价肺炎链球菌血清型4和6B。在不存在和存在AlPO4的情况下，调配蛋白质浓度在25μg/ml到200μg/ml范围内的所述2种单价血清型。将硅化塞(4432塞子)放入各调配物中，随后将其放于50rpm的旋转式振荡器上。如下表5中所示，在不存在AlPO4的情况下，在所有蛋白质浓度下对两种单价血清型都观察到纤维状白色微粒。然而，在存在AlPO4的情况下，相对于血清型6B(200μg/ml)，血清型4(100μg/ml)在较低浓度时检测到微粒，数据未显示。
表5
蛋白质浓度对微粒形成的影响
实例4
铝佐剂在存在硅化容器装置的情况下抑制13VPNC微粒的形成
如上文实例3中所述，13vPnC免疫原性组合物为包含5mM琥珀酸盐缓冲液(pH5.8)和0.85％NaCl中的4.4μg/mL肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F和8.8μg/mL血清型6B的液体调配物，其也可在存在或不存在佐剂(例如，铝佐剂)的情况下调配。也可在存在或不存在诸如每毫升磷酸铝(AlPO4)0.25mg铝的佐剂的情况下调配13vPnC。在实例3中观察到，在不存在AlPO4的情况下调配且填充于BD海派SCFTM注射器(盖有海派柱塞)中的13vPnC因观察到微粒而未通过目视检查，其中其它研究揭示，所述微粒是部分由蛋白质-多糖与聚硅氧相互作用引起。在以下实例中，利用13vPnC调配物评估来自各种供应商的注射器(和柱塞)，其中经由搅动模拟装运和处理条件(下文所述)。
材料
在存在和不存在0.25mg/mL磷酸铝的情况下，在含有0.85％NaCl和4.4μg/ml肺炎链球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F以及8.8μg/ml肺炎链球菌血清型6B的5mM琥珀酸盐缓冲液中调配13vPnC。所测试的容器装置列于下表6中。
表6
容器装置
方法
调配和填充程序下表7中所列的为2升13vPnC调配物的配方。简单来说，首先将0.85％盐水添加到玻璃烧杯中，随后添加5mM琥珀酸盐缓冲液(pH 5.8)，且接着依次添加各肺炎链球菌血清型连结物。接着在搅拌盘上小心地混合调配物且使其滤过0.22μm密理博过滤元件。对于包含AlPO4的调配物，随后添加AlPO4(0.25mg/ml最终浓度)且小心混合调配物。接着填充测试注射器(0.58ml/注射器)且用柱塞封盖。
经由搅动模拟装运使用牌数字多管涡旋振荡器(目录号14005-826)搅动样本。将填充有13vPnC的注射器水平放置，且通过涡旋振荡器的两个支撑板固定。将样本保持在水平位置并在2-8℃下以500rpm暂停状态搅动24小时。
散射比浊法(nephelometry)通过速率散射比浊分析使用血清型特异性抗体测定血清型特异性抗原性。对于存在AlPO4的13vPnC来说，通过添加1N NaOH溶解磷酸铝。通过添加1M柠檬酸立即中和溶液。对于不存在AlPO4的13vPnC来说，不进行溶解和中和程序。所述分析使用贝克曼Array 360散射浊度计(Beckman Array 360 nephelometer)测量由样本中所形成的抗体-抗原复合物所引起的光散射强度的改变速率。
表7
13VPNC调配物表
结论
在本研究中，使来自不同供应商的具有不同聚硅氧含量(表6)的注射器经历受控搅动条件。通过关于搅动前和搅动后样本的散射比浊分析来测量各血清型的总抗原性。计算搅动后抗原性损失(百分比)并绘示于图2到图7中。
在研究前，根据以下两个对照的抗原性损失优化搅动条件：(1)最坏情况对照(阳性对照，高聚硅氧；图2)和(2)最佳情况对照(阴性对照，无聚硅氧；图3)。随后优化所述条件以使抗原性损失在阳性对照中低，而在阴性对照中可检测到。这确保搅动不会太弱而无法在注射器中产生沉淀，也不会太强以致沉淀可能是由除聚硅氧相互作用外的因素(例如，剪切力)引起。因此，选择以500rpm(暂停状态)搅动24小时作为最适合的搅动条件，同时使用2-8℃的温度和水平位置来模拟实时产品装运和处理条件。
研究结果概述如下：用AlPO4调配的13vPnC的最大抗原性损失出现于具有较高聚硅氧含量的注射器中(数据未显示)。举例来说，在表6中所列的注射器中，BD海派注射器(对照1)、BD贝克特注射器(注射器3；0.1mg聚硅氧)、BD高速(注射器5)和邦吉PS4(BünderGlasPS4)注射器(注射器8，0.14mg聚硅氧)各自具有抗原性损失高于10％的一种或多种13vPnC血清型。用AlPO4调配的13vPnC的最小抗原性损失出现于具有较低聚硅氧含量的注射器中。举例来说，维特注射器(图4)和肖特拓普派克塑料注射器(图5)与未经硅化的注射器(图2)最为相似，两者都展现用AlPO4调配的13vPnC的极小抗原性损失。
在使用用和未用0.25mg/ml AlPO4调配的13vPnC的实验中分析磷酸铝对稳定13vPnC且抑制在存在硅化注射器的情况下对微粒形成的影响，其中所使用的注射器为BD贝克特低聚硅氧注射器(表6中的注射器4)和邦吉低聚硅氧PS2注射器(表6中的注射器7)。BD贝克特低聚硅氧注射器(0.04mg聚硅氧/管)通常对于用AlPO4调配的13vPnC血清型(图6A)具有小于10％的抗原性损失，而对于未用AlPO4调配的13vPnC血清型(图6B)具有在从5％(血清型1)上至约50％(血清型23F)范围内的抗原性损失。邦吉低聚硅氧PS2(0.056mg聚硅氧/管)注射器对于用AlPO4调配的13vPnC(图7A)具有小于5-8％(视血清型而定)的抗原性损失，而对于未用AlPO4调配的13vPnC血清型(图7B)具有在约5％到约30％(视血清型而定)范围内的抗原性损失。
因此，将这些数据收集在一起表明：(1)13vPnC的抗原性损失在具有较高聚硅氧含量的注射器中较高，且(2)在所有所测试的注射器中，未用AlPO4调配的13vPnC保持比存在AlPO4的13vPnC高的抗原性损失。
实例5
包含表面活性剂的调配物优化脑膜炎抗原蛋白与铝盐佐剂的结合
如下表达且纯化本实例中所使用的重组脂化脑膜炎奈瑟菌2086蛋白(rLP2086)。在大肠杆菌中利用天然前导序列重组表达rLP2086。遵循有关使用无动物成分确定培养基和随后的细胞溶解的大肠杆菌标准发酵方案。利用50mM Tris-HCl/5mM EDTA/1％十二烷基肌氨酸钠(sarcosyl)(pH 8)自膜小球中纯化出重组脂化脑膜炎奈瑟菌2086蛋白。将此十二烷基肌氨酸钠提取物调节到1％两性洗涤剂3-14(Zwittergent 3-14，Z3-14)中且对30倍过量的50mM Tris-HCl/5mM EDTA/1％Z3-14透析2次。将经透析rLP2086提取物用90％乙醇沉淀以去除剩余十二烷基肌氨酸钠，并用50mM Tris-HCl/5mM EDTA/1％Z3-14(pH 8)溶解。通过离心去除不溶物质，使上清液通过阴离子交换色谱柱，且在未结合部分中收集rLP2086。随后对30倍过量的25mM NaAc/1％Z3-14(pH 4.5)透析未结合的物质2次，且使其通过阳离子交换色谱柱。用0-0.3M NaCl梯度洗脱rLP2086且冷冻存储(-25℃)。
随后，将经纯化rLP2086用150mM NaCl、0.020％吐温80、0.25mg Al/mL AlPO4且在以下缓冲液中调配：10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)和5mM琥珀酸盐缓冲液(pH6.0)。表8比较蛋白质与AlPO4佐剂的结合百分比。
表8
RLP2086与佐剂的结合
参考文献
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Claims (22)

1.一种抑制聚硅氧诱导的硅化容器装置中所包含的多糖-蛋白质连结物聚集的调配物，所述调配物包含(i)pH缓冲盐溶液，其中所述pH缓冲盐溶液具有3.5到7.5的pKa值；(ii)铝盐；和(iii)多糖-蛋白质连结物，其包含肺炎链球菌(S.pneumoniae)血清型4多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型6B多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型9V多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型14多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型18C多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型19F多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型23F多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型1多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型3多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型5多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型6A多糖与CRM197多肽的连结物、肺炎链球菌血清型7F多糖与CRM197多肽的连结物和肺炎链球菌血清型19A多糖与CRM197多肽的连结物。
2.根据权利要求1所述的调配物，其中所述pH缓冲盐溶液具有5.5-7.5的pH值。
3.根据权利要求1-2中任一权利要求所述的调配物，其中所述pH缓冲盐溶液为磷酸盐、琥珀酸盐、组氨酸或柠檬酸盐。
4.根据权利要求1-2中任一权利要求所述的调配物，其中pH缓冲盐溶液中的盐包含氯化镁、氯化钾、氯化钠或其组合。
5.根据权利要求1-2中任一权利要求所述的调配物，其中所述铝盐为氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝。
6.根据权利要求1-2中任一权利要求所述的调配物，其中所述铝盐为磷酸铝。
7.根据权利要求1所述的调配物，其中所述pH缓冲盐溶液为组氨酸，所述pH缓冲盐溶液中的盐为氯化钠以及所述铝盐为磷酸铝。
8.根据权利要求1所述的调配物，其中所述pH缓冲盐溶液为pH值5.8的组氨酸，所述pH缓冲盐溶液中的盐为氯化钠以及所述铝盐为磷酸铝。
9.根据权利要求1-2中任一权利要求所述的调配物，其另外包括表面活性剂，所述表面活性剂选自如下构成的群组：
聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯85、曲通N-101、曲通X-100、壬苯醇醚-9、三乙醇胺、三乙醇胺多肽油酸盐、聚氧化乙烯-660羟基硬脂酸酯、聚氧化乙烯-35-蓖麻油酸酯、大豆卵磷脂和泊洛沙姆。
10.根据权利要求1-2中任一权利要求所述的调配物，其另外包括聚山梨醇酯80。
11.根据权利要求10所述的调配物，其中所述调配物中的所述聚山梨醇酯80的最终浓度为每体积所述调配物至少0.001重量％到10重量％聚山梨醇酯80。
12.根据权利要求1-2中任一权利要求所述的调配物，其中所述pH缓冲盐溶液为最终浓度为1mM到10mM且pH值为5.8到6.0的琥珀酸盐。
13.根据权利要求12所述的调配物，其中所述琥珀酸盐为最终浓度为5mM的琥珀酸盐。
14.根据权利要求1-2中任一权利要求所述的调配物，其另外包含一种或多种脑膜炎球菌多糖、一种或多种脑膜炎球菌抗原蛋白或其组合。
15.根据权利要求1所述的调配物，其中所述pH缓冲盐溶液为组氨酸，所述pH缓冲盐溶液中的盐为氯化钠以及所述铝盐为磷酸铝。
16.根据权利要求1所述的调配物，其中所述pH缓冲盐溶液为pH值5.8的组氨酸，所述pH缓冲盐溶液中的盐为氯化钠以及所述铝盐为磷酸铝。
17.一种容器装置，其填充有权利要求1-16中任一权利要求所述的调配物。
18.根据权利要求17所述的容器装置，其选自如下构成的群组：小瓶、注射器、烧瓶、发酵罐、生物反应器、管道、导管、袋子、广口瓶、安瓿、药筒和一次性笔。
19.根据权利要求18所述的容器装置，其中所述容器由玻璃、金属或聚合物制备。
20.根据权利要求18所述的容器装置，所述容器为注射器。
21.根据权利要求18所述的容器装置，所述容器为玻璃注射器。
22.根据权利要求17-21中任一权利要求所述的容器装置，所述容器装置经硅化。
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