MX2008013572A - Formulaciones novedosas que estabilizan e inhiben la precipitacion de composiciones inmunogenicas. - Google Patents

Formulaciones novedosas que estabilizan e inhiben la precipitacion de composiciones inmunogenicas.

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Lakshmi Khandke
Ying Chen
Hanyoung Han
Robert Chancey Seid Jr
Zhaowei Jin
Ronald Malone
Xudong Yang
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Abstract

La presente invención trata de la necesidad existente en el arte de mejorar la estabilidad de composiciones inmunogénicas tales como conjugados de polisacárido-proteína e inmunógenos de proteína. La invención trata ampliamente de formulaciones novedosas que estabilizan e inhiben la precipitación de composiciones inmunogénicas. Más particularmente, la invención descrita en lo sucesivo, trata de la necesidad en la técnica de formulaciones que estabilicen e inhiban la formación particulado (verbigracia, agregación, precipitación) de composiciones inmunogénicas que son procesadas, desarrolladas, formuladas, manufacturadas y/o almacenadas en recipientes tales como fermentadores, biorreactores, frascos, contenedores, bolsas, jeringas, tapones de caucho, tubería y similares.

Description

FORMULACIONES NOVEDOSAS QUE ESTABILIZAN E INHIBEN LA PRECIPITACION DE COMPOSICIONES INMUNOGE ICAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención trata generalmente de campos de la inmunología, bacteriología, formulación de vacunas, estabilidad de proteínas y desarrollo de procesos. Más particularmente, la invención trata de formulaciones novedosas que inhiben la precipitación de composiciones inmunogénicas . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Por lo general se acepta en el arte biofarmacéutico que la mejora de la estabilidad de una composición inmunogénica (verbigracia, un inmunógeno de proteína, un conjugado de polisacárido-proteína ) es un objetivo necesario y altamente deseable. Por ejemplo, una composición inmunogénica deberá parecer fresca, elegante y profesional al administrarse a un paciente. Cualesquiera cambios en la estabilidad y/o apariencia física de la composición inmunogénica, tal como cambio de color, turbidez, opacificidad, podrá hacer que el paciente o consumidor pierdan confianza en el producto. Además, debido a que muchas formulaciones inmunogénicas son surtidas en recipientes de dosis múltiples, deberá asegurarse con el tiempo, la uniformidad del contenido de la dosis del ingrediente activo (verbigracia, un conjugado de REF. : 197391 polisacárido-proteina) (verbigracia, una solución turbia puede conllevar a un patrón de dosificación desuniforme) . Adicionalmente , la composición inmunogénica deberá ser activa durante toda su vida en almacenamiento "esperada", donde cualquier desintegración de la composición inmunogénica hacia una forma inactiva u otra deseada (verbigracia, un agregado) baja la concentración total del producto. Varios informes en la literatura han sugerido que la estabilidad de una composición inmunogénica particular (verbigracia, un inmunógeno de proteína, un conjugado de polisacárido-proteina) depende por lo menos en parte de la proteína específica o proteína transportadora (Ho y colaboradores, 2001; Ho y colaboradores, 2002; Bolgiano y colaboradores, 2001) . Por ejemplo, el análisis de estabilidad de polisacáridos de meningococo C ( enC) y polisacáridos del tipo b (Hib) Haemophilus influenzae, conjugados o bien con un toxoide del tétano (TT) o una proteína transportadora RMÍ^1 , reveló diferentes perfiles de estabilidad dependientes de la proteína transportadora (Ho y colaboradores, 2002) . En otro estudio (Ho y colaboradores, 2001) , se analizaron los conjugados MenC-CRMi97 provenientes de dos fabricantes diferentes (Ho y colaboradores, 2001), donde los conjugados MenC-CRMi97 difirieron en su química de conjugación y longitud del polisacárido conjugado (ambos teniendo la misma proteína transportadora, CRMig7) . Los datos de este estudio indicaron además que factores tales como la química de la conjugación (verbigracia, aminación reductora o bien directamente o por medio de un grupo separador químico) , número de sitios de conjugación, longitud de la cadena de polisacárido, pH, tampón del almacenamiento, temperatura ( s ) del almacenamiento y ciclos de congelamiento/descongelamiento también influyen en la estabilidad de una composición inmunogénica . De este modo, cuando se desarrolla una formulación para una composición inmunogénica, muchos factores deberán ser considerados para asegurar un producto seguro, estable, robusto y efectivo en cuanto a costo. Tales consideraciones incluyen, pero sin limitación, estabilidad química de la composición inmunogénica (verbigracia, hidrólisis de sacáridos, despolimerización de polisacáridos , proteólisis o fragmentación de proteínas), estabilidad física/térmica de la composición inmunogénica (verbigracia, agregación, precipitación, absorción) , compatibilidad de la composición inmunogénica con el sistema de recipiente/cierre, interacciones entre la composición inmunogénica e ingredientes activos (verbigracia, tampones, sales, excipientes, crioprotectores ) , el proceso de fabricación, la forma de dosificación (verbigracia, liofilizada, líquida), las condiciones ambientales encontradas durante el envío, almacenamiento y manejo (verbigracia, temperatura, humedad, esfuerzos cortantes) y la duración de tiempo entre la manufactura y el uso. Se ha sugerido en el arte que el aceite de silicona, el cual induce cambios conformacionales secundarios y terciarios de la proteina, podría ser responsable de la agregación/precipitación vista en ciertas preparaciones farmacéuticas de proteínas (Jones y colaboradores, 2005) . Por ejemplo, varios informes en la década de 1980 implicaron la liberación del aceite de silicona a partir de jeringas plásticas desechables como el agente causante en la agregación de la insulina humana (Chantelau y Berger, 1985) ; Chantelau y colaboradores, 1986; Chantelau, 1989; Bernstein, 1987; Baldwin, 1988; Collier y Dawson, 1985) . Chantelau y colaboradores (1986) observaron que después de tres o más retiros de una preparación de diez dosis de insulina (utilizando jeringa desechable siliconada) , el frasco comenzaría a volverse turbio debido a la contaminación del aceite de silicona, resultando así en la agregación y desactivación de la insulina (Chantelau y colaboradores, 1986) . Paradójicamente, el aceite de silicona es un componente necesario de las jeringas plásticas, ya que sirve para lubricar el émbolo de caucho y facilitar la transferencia del émbolo bajando por el tambor de la jeringa (es decir, el aceite de silicona mejora la j eringabilidad de la formulación) . Además, el uso de aceite de silicona no está limitado a jeringas en vista de que se utiliza como revestimiento para frascos de vidrio con el fin de minimizar la absorción de proteina, como lubricante para evitar la conglomeración de tapones de caucho durante los procedimientos de llenado, como lubricante critico para la procesabilidad/maquinabilidad de cierres de vidrio y elastoméricos y como lubricante para facilitar la penetración de la aguja de los tapones de caucho para frascos. Adicionalmente, la siliconación de jeringas, frascos de vidrio, tapones de caucho y similares, no es un proceso bien controlado o estandarizado y como tal, existe un elevado grado de variabilidad del contenido de aceite de silicona de un lote a otro. Por consiguiente, existe una necesidad actual en el arte de formulaciones que mejoren la estabilidad e inhiban la precipitación de composiciones inmunogénicas . SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención trata ampliamente de formulaciones novedosas que estabilizan e inhiben la precipitación de composiciones inmunogénicas. Más específicamente en ciertas modalidades, la presente invención trata de formulaciones novedosas que inhiben la precipitación de composiciones inmunogénicas comprendidas en recipientes. En una modalidad específica, la invención trata de formulaciones novedosas que estabilizan composiciones inmunogénicas contra interacciones del aceite de silicona, esfuerzos cortantes, agitación del envió y similares. De este modo, en ciertas modalidades, la invención trata de formulaciones que estabilizan un conjugado de polisacárido-proteina, la formulación comprendiendo (i) una solución salina tamponada de pH, donde el tampón tiene un pKa aproximadamente de 3,5 hasta aproximadamente 7,5, (ii) un surfactante y (iii) uno o más conjugados de polisacárido-proteina. En una modalidad especifica la formulación de conjugado de polisacárido-proteina está comprendida en un recipiente. En ciertas modalidades, el recipiente se selecciona de uno o más del grupo que consiste en un frasco, tapón de frasco, cierre de frasco, cierre de vidrio, vidrio de caucho, cierre plástico, una jeringa, tapón de jeringa, émbolo de jeringa, un frasco, cubilete, cilindro graduado, termentador, biorreactor, tubería, tubo, bolsa, jarra, ampolla, cartucho y pluma desechable. En ciertas modalidades, el recipiente es siliconado. En ciertas modalidades, la solución salina tamponada de pH de las formulaciones tiene un pH de 5,5 a 7,5. En otras modalidades, el tampón es fosfato, succinato, histidina o citrato. En ciertas modalidades, el tampón es succinato a una concentración definitiva de 1 m a 10 mM y pH de 5,8 a 6,0. En una modalidad particular, la concentración final del tampón de succinato es 5 mM. En otras modalidades, la sal en la solución salina tamponada de pH comprende cloruro de magnesio, cloruro de potasio, cloruro de sodio o una combinación de los mismos. En una modalidad particular, la sal de la solución salina tamponada de pH es cloruro de sodio . En otra modalidad, el surfactante de las formulaciones se selecciona a partir del grupo que consiste en polisorbato 20 (Tween™20), polisorbato 40 (Tween™40), polisorbato 60 (Tween™60), polisorbato 65 (Tween™65), polisorbato 80 (Tween™80), polisorbato 85 (Tween™85), Tritón™ N-101, Tritón™ X-100, oxtoxinol 40, nonoxinol-9, trietanolamina , trietanolamina polipéptido oleato, polioxietileno-660 hidroxistearato (PEG-15, Solutol H15) , polioxietileno-35-ricinoleato (Cremophor EL™) , lecitina de soya y un poloxámero. En una modalidad particular, el surfactante es polisorbato 80. En otra modalidad, la concentración final del polisorbato 80 en la formulación es por lo menos el 0,01% al 10% polisorbato 80 peso /volumen de la formulación. En otras modalidades, la concentración final del polisorbato 80 en la formulación es el 0,01% polisorbato 80 peso/volumen de la formulación. Todavía en otras modalidades, la concentración final del polisorbato 80 en la formulación es el 0,05% polisorbato 80 peso/volumen de la formulación. En otra modalidad, la concentración final del polisorbato 80 en la formulación es el 0,1% polisorbato 80 peso/volumen de la formulación. En ciertas otras modalidades, la concentración final del polisorbato 80 en la formulación es el 1,0% polisorbato 80 peso/volumen de la formulación. Todavía en otras modalidades, la concentración final del polisorbato 80 en la formulación es el 10,0% polisorbato 80 peso/volumen de la formulación. En otra modalidad, el conjugado de polisacárido-proteína comprende uno o más polisacáridos de neumococo. En ciertas modalidades, el uno o más polisacáridos de neumococo son un polisacárido serotipo 4 S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 6B S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 9V S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 14 S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 18C S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 19F S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 23F S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 1 S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 3 S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 5 S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 6A S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 7F S. pneumoniae y un polisacárido serotipo 19A S. pneumoniae . En ciertas modalidades, la proteína de la formulación del conjugado de polisacárido-proteína se selecciona del grupo que consiste en CRM197, un toxoide del tétano, un toxoide del cólera, un toxoide de la tos ferina, un toxoide lábil al calor E. coli (LT) , un toxoide de neumolisina, una proteína superficial de neumococo A (PspA), proteína de adhesina del neumococo A (PsaA), peptidasa C5a de estreptococo, proteína D de Haemophilus influenzae, ovalbúmina, hemocianina de lapa californiana (KLH) , albúmina sérica bovina (BSA) y derivado proteico purificado de tuberculina (PPD) . En una modalidad especifica, la formulación del conjugado de polisacárido-proteina de valencia 7 (7vPnC) que comprende un polisacárido serotipo 4 S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CR i97, un polisacárido serotipo 6B S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRMi97, un polisacárido serotipo 9V S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CR i97, un polisacárido serotipo S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRMi97, un polisacárido serotipo 18C S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRMi97, un polisacárido serotipo 19F S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRMi97 y un polisacárido serotipo 23F S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CR i97. En otra modalidad especifica, la formulación de conjugado de polisacárido-proteina es un conjugado de neumococo de valencia 13 (13vPnC) que comprende un polisacárido serotipo 4 S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRMi97, un polisacárido serotipo 6B S. pneumoniae conjugado con polipéptido CRM197, un polisacárido serotipo 9V S. pneumoniae conjugado con polipéptido CRMi97, un polisacárido serotipo 14 S. pneumoniae conjugado con polipéptido CRMi97, un polisacárido serotipo 18C S. pneumoniae conjugado con polipéptido CRMi97, un polisacárido serotipo 19F S. pneumoniae conjugado con polipéptido CRMi97, , un polisacárido serotipo 23F S. pneumoniae conjugado con polipéptido CRM197, un polisacárido serotipo 1 S. pneumoniae conjugado con polipéptido CRM197, un polisacárido serotipo 3 S. pneumoniae conjugado con polipéptido CRMi97, un polisacárido serotipo 5 S. pneumoniae conjugado con polipéptido CRMig7, , un polisacárido serotipo 6A S. pneumoniae conjugado con polipéptido CR 197, un polisacárido serotipo 7F S. pneumoniae conjugado con polipéptido CRMi97, y un polisacárido serotipo 19A S. pneumoniae conjugado con polipéptido CRMi97. En otras modalidades, la formulación comprende además uno o más polisacáridos de meningococo, una o más proteínas antigénicas de meningococo o una combinación de las mismas. Todavía en otras modalidades, la formulación comprende además uno o más polisacáridos, una o más proteínas antigénicas de estreptococo o una combinación de las mismas. En ciertas otras modalidades, la formulación comprende además uno o más adyuvantes. A continuación se describen ejemplos de adyuvantes adecuados. En otras modalidades, la invención trata de formulaciones que estabilizan una composición de peptidasa C5a de estreptococo (SCP) , la formulación comprendiendo (i) una solución salina tamponada de pH, donde el tampón tiene un pKa aproximadamente de 3,5 aproximadamente a 6,5, (ii) un surfactante y (iii) una peptidasa C5a de estreptococo. En una modalidad especifica, una formulación de SCP va comprendida en un recipiente. En ciertas modalidades, el recipiente se selecciona de uno o más del grupo que consiste en un frasco, tapón de frasco, cierre de frasco, cierre de vidrio, vidrio de caucho, cierre plástico, una jeringa, tapón de jeringa, émbolo de jeringa, un frasco, cubilete, cilindro graduado, termentador, biorreactor, tubería, tubo, bolsa, jarra, ampolla, cartucho y pluma desechable. En otras modalidades, la solución salina tamponada de pH de la formulación tiene un pH de 5,5 a 7,5. En otras modalidades, el tampón es succinato, histidina, fosfato o citrato. En una modalidad específica, el tampón es succinato a una concentración final de 1 mM a 10 mM y pH 5,8 a 6,0. En otra modalidad específica, la concentración final del tampón de succinato es 5 mM. Todavía en otras modalidades, la sal en la solución salina tamponada de pH comprende cloruro de magnesio, cloruro de potasio, cloruro de sodio o una combinación de los mismos. En ciertas modalidades, el surfactante de las formulaciones se selecciona a partir del grupo que consiste en polisorbato 20 (Tween™20), polisorbato 40 (Tween™40), polisorbato 60 (Tween™60), polisorbato 65 (Tween™65) , polisorbato 80 (Tween™80), polisorbato 85 (Tween™85), Tritón™ N-101, Tritón™ X-100, oxtoxinol 40, nonoxinol-9, trietanolamina , trietanolamina polipéptido oleato, polioxietileno-660 hidroxistearato (PEG-15, Solutol H15), polioxietileno-35-riconoleato (Creraophor EL™) , lecitina de soya y un poloxámero . En una modalidad especifica, el surfactante es polisorbato 80. En ciertas modalidades, la concentración final del polisorbato 80 en la formulación es el 0,01% al 10% de polisorbato 80 peso/volumen de la formulación. Todavía en otras modalidades, la concentración final del polisorbato 80 en la formulación es el 0,01% polisorbato 80 peso/volumen de la formulación. En otras modalidades, la concentración final del polisorbato 80 en la formulación es el 0,05% polisorbato 80 peso/volumen de la formulación. Todavía en otras modalidades, la concentración final del polisorbato 80 en la formulación es el 0,1% polisorbato 80 peso/volumen de la formulación. En otra modalidad, la concentración final del polisorbato 80 en la formulación es el 1,0% polisorbato 80 peso/volumen de la formulación. Todavía en otra modalidad, la concentración final del polisorbato 80 en la formulación es el 10,0% polisorbato 80 peso/volumen de la formulación. En ciertas otras modalidades, la composición SCP comprende además uno o más polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en un polipéptido de estreptococo, un polipéptido de neumococo, un polipéptido de meningococo y un polipéptido de estafilococo. Todavía en otras modalidades, la composición SCP comprende además uno o más polisacáridos seleccionados del grupo que consiste en un polisacárido de estreptococo, un polisacárido de neumococo, un polisacárido de meningococo y un polisacárido de estafilococo. En otra modalidad, la formulación comprende además uno o más adyuvantes. A continuación se describen ejemplos de adyuvantes adecuados. En otra modalidad, la invención trata de formulaciones que inhiben la precipitación inducida por silicona de un conjugado de polisacárido-proteina comprendido en un recipiente siliconado, la formulación comprendiendo (i) una solución salina tamponada de pH, donde el tampón tiene un pKa aproximadamente de 3,5 hasta aproximadamente 7,5, (ii) una sal de aluminio, y (iii) uno o más conjugados de polisacárido-proteina. En ciertas modalidades, el recipiente siliconado se selecciona de uno o más del grupo que consiste en un frasco, tapón de frasco, cierre de frasco, cierre de vidrio, vidrio de caucho, cierre plástico, una jeringa, tapón de jeringa, émbolo de jeringa, un frasco, cubilete, cilindro graduado, fermentador, biorreactor, tubería, tubo, bolsa, jarra, ampolla, cartucho y pluma desechable. En ciertas modalidades, la solución salina tamponada de pH en las formulaciones tiene un pH de 5,5 a 7,5. En otras modalidades, el tampón de las formulaciones es fosfato, succinato, histidina o citrato. Todavía en otras modalidades, el tampón es succinato a una concentración final de 1 mM a 10 mM y pH 5,8 a 6,0. En una modalidad particular, la concentración final del tampón de succinato es 5 mM. Todavía en otras modalidades, la sal de la solución salina tamponada con pH comprende cloruro de magnesio, cloruro de potasio, cloruro de sodio o una combinación de los mismos. En una modalidad particular, la sal de la solución salina tamponada de pH es cloruro de sodio. En otras modalidades, la sal de aluminio es hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio o sulfato de aluminio. En una modalidad específica, la sal de aluminio es fosfato de aluminio . En ciertas otras modalidades, la formulación comprende además polisorbato 80 (Tween™80) . En una modalidad específica, la concentración final del polisorbato 80 en la formulación es por lo menos el 0,01% al 10% polisorbato 80 peso/volumen de la formulación. En otra modalidad, el conjugado de polisacárido-proteína comprende uno o más polisacáridos de neumococo. En ciertas modalidades, el uno o más polisacáridos de neumococo son un polisacárido serotipo 4 S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 6B S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 9V S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 14 S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 18C S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 19F S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 23F S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 1 S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 3 S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 5 S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 6A S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 7F S. pneumoniae y un polisacárido serotipo 19A S. pneumoniae . En ciertas otras modalidades, la proteína de la formulación de conjugado de polisacárido-proteína se seleccionado a partir del grupo que consiste en CRMi97, un toxoide del tétano, un toxoide de la tos ferina, un toxoide lábil al calor E. coli (LT) , un toxoide de neumolisina, proteína superficial de neumococo A (PspA), proteína de adhesina de neumococo (PsaA), una peptidasa C5a proveniente de Estreptococo, proteína D Haemophilus influenzae, ovalbúmina, hemocianina de lapa californiana (KLH) , albúmina sérica bovina (BSA) y derivado de proteína purificada de tuberculina (PPD) . En una modalidad particular, la formulación del conjugado de polisacárido-proteína es una formulación de conjugado de neumococo de valencia 7 (7vPnC) que comprende un polisacárido serotipo 4 S. pneumoniae conjugado con polipéptido CRM197 , un polisacárido serotipo 6B S. pneumoniae conjugado con polipéptido CRM197, un polisacárido serotipo 9V S. pneumoniae conjugado con polipéptido CRM197 , un polisacárido serotipo 14 S. pneumoniae conjugado con polipéptido CRMi97,un polisacárido serotipo 18C S. pneumoniae conjugado con polipéptido CRMi97, un polisacárido serotipo 19F S. pneumoniae conjugado con polipéptido CRMi97 y un polisacárido serotipo 23F S. pneumoniae conjugado con polipéptido CRMi97- En otra modalidad especifica, la formulación de conjugado de polisacárido-proteína es un conjugado de neumococo de valencia 13 (13vPnC) que comprende un polisacárido serotipo 4 S. pneumoniae conjugado con polipéptido CRMi97, , un polisacárido serotipo 6B S. pneumoniae conjugado con polipéptido CRM197, , un polisacárido serotipo 9V S. pneumoniae conjugado con polipéptido CRMi97í un polisacárido serotipo 14 S. pneumoniae conjugado con polipéptido CR- 197, , un polisacárido serotipo 18C S. pneumoniae conjugado con polipéptido CRMi97, un polisacárido serotipo 19F S. pneumoniae conjugado con polipéptido CRMi97( un polisacárido serotipo 23F S. pneumoniae conjugado con polipéptido CRM197, un polisacárido serotipo 1 S. pneumoniae conjugado con polipéptido CRMig7, un polisacárido serotipo 3 S. pneumoniae conjugado con polipéptido CRMi97) un polisacárido serotipo 5 S. pneumoniae conjugado con polipéptido CRMi97, un polisacárido serotipo 6A S. pneumoniae conjugado con polipéptido CRMig7, un polisacárido serotipo 7F S. pneumoniae conjugado con polipéptido CRMi97, y un polisacárido serotipo 19A S. pneumoniae conjugado con polipéptido CRMi97.
Todavía en otras modificaciones, la formulación comprende además uno o más polisacáridos de meningococo, una o más proteínas antigénicas de meningococo o una combinación de las mismas. En otra modalidad, la formulación comprende además uno o más polisacáridos de estreptococo, una o más proteínas antigénicas de estreptococo o una combinación de las mismas.
En ciertas otras modalidades, la formulación comprende además uno o más adyuvantes. A continuación se describen ejemplos de adyuvantes adecuados. En otras modalidades, la presente invención trata de formulaciones que inhiben la precipitación inducida por silicona de una composición de peptidasa C5a de estreptococo (SCP) comprendida en un recipiente siliconado, la formulación comprendiendo (i) una solución salina tamponada de pH, donde el tampón tiene un pKa aproximadamente de 3,5 hasta aproximadamente 6,5, (ii) una sal de aluminio y (iii-) una peptidasa de estreptococo C5a. En ciertas modalidades, se selecciona el recipiente a partir de uno o más del grupo que consiste en un frasco, tapón de frasco, cierre de frasco, cierre de vidrio, vidrio de caucho, cierre plástico, una jeringa, tapón de jeringa, émbolo de jeringa, un frasco, cubilete, cilindro graduado, fermentador, biorreactor, tubería, tubo, bolsa, jarra, ampolla, cartucho y pluma desechable.
En otra modalidad, la solución salina tamponada de pH de la formulación tiene un pH de 5,5 a 7,5. En otras modalidades, el tampón es succinato, histidina, fosfato o citrato. En ciertas modalidades, el tampón es succinato s una concentración final de 1 mM hasta 10 mM y pH 5,8 a 6,0. En otra modalidad, la sal en la solución salina tamponada de pH comprende cloruro de magnesio, cloruro de potasio, cloruro de sodio o una combinación de los mismos. En ciertas otras modalidades, la formulación comprende además polisorbato 80 (Tween™80). En una modalidad especifica, la concentración final del polisorbato 80 en la formulación es el 0,01% al 10% polisorbato 80 peso /volumen de la formulación. Todavía en otras modalidades, la composición SCP comprende además uno o más polipéptidos seleccionados a partir del grupo que consiste en polipéptido de estreptococo, polipéptido de neumococo, polipéptido de meningococo y polipéptido de estafilococo. En ciertas otras modalidades, la composición SCP comprende además uno o más polisacáridos seleccionados del grupo que consiste en un polisacárido de estreptococo, un polisacárido de neumococo, polisacárido de meningococo y un polisacárido de estafilococo. Todavía en otra modalidad, la formulación comprende además uno o más adyuvantes. A continuación se describen ejemplos de adyuvantes adecuados. En otras modalidades, la invención trata de formulaciones que estabilizan una composición de proteina de N. meningitidis 2086, la formulación comprendiendo (i) una solución salina tamponada de pH, donde el tampón tiene un pKa aproximadamente de 3,5 hasta aproximadamente 6,5, (ii) un surfactante y (iii) una proteina de N. meningitidis 2086. A continuación se describen proteínas de N. meningitidis 2086. En una modalidad específica, la formulación de proteína de N. meningitidis 2086 va comprendida en un recipiente. En ciertas modalidades, el recipiente se selecciona de uno o más del grupo que consiste en un frasco, tapón de frasco, cierre de frasco, cierre de vidrio, vidrio de caucho, cierre plástico, una jeringa, tapón de jeringa, émbolo de jeringa, un frasco, cubilete, cilindro graduado, fermentador, biorreactor, tubería, tubo, bolsa, jarra, ampolla, cartucho y pluma desechable . En otras modalidades, la solución salina tamponada de pH tiene un pH de 5,5 a 7,5. En otras modalidades, el tampón es succinato, histidina, fosfato o citrato. En una modalidad específica, el tampón es succinato a una concentración final de 1 mM a 10 mM y pH de 5,8 a 6,0. En otra modalidad específica, la concentración final del tampón de succinato es 5 mM. Todavía en otras modalidades, la sal de la solución salina tamponada de pH comprende cloruro de magnesio, cloruro de potasio, cloruro de sodio o una combinación de los mismos.
En ciertas modalidades, el surfactante de las formulaciones se selecciona a partir del grupo que consiste en polisorbato 20 (Tween™20), polisorbato 40 (Tween™40), polisorbato 60 (Tween™60), polisorbato 65 (Tween™65), polisorbato 80 (Tween™80), polisorbato 85 (Tween™85), Tritón™ N-101, Tritón™ X-100, oxtoxinol 40, nonoxinol-9, trietanolamina, trietanolamina polipéptido oleato, poli-oxietileno-660 hidroxistearato (PEG-15, Solutol H15), polioxietileno-35-ricinoleato (Cremophor EL™) , lecitina de soya y un poloxámero. En una modalidad especifica, el surfactante es polisorbato 80. En ciertas modalidades, la concentración final del polisorbato 80 en la formulación es del 0,01% al 10% de polisorbato 80 peso/volumen de la formulación. Todavía en otras modalidades, la concentración final del polisorbato 80 en la formulación es el 0,01% polisorbato 80 peso/volumen de la formulación. En otras modalidades, la concentración final del polisorbato 80 en la formulación es del 0,05% polisorbato 80 peso/volumen de la formulación. Todavía en otras modalidades, la concentración final del polisorbato 80 en la formulación es del 0,1% polisorbato 80 peso/volumen de la formulación. En otra modalidad, la concentración final del polisorbato 80 en la formulación es del 1,0% polisorbato 80 peso/volumen de la formulación. Todavía en otra modalidad, la concentración final del polisorbato 80 en la formulación es del 10,0% polisorbato 80 peso/volumen de la formulación. En ciertas otras modalidades, la composición de proteina N. meningitidis 2006 comprende además uno o más polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en un polipéptido de estreptococo, un polipéptido de neumococo, un polipéptido de meningococo y un polipéptido de estafilococo. Todavía en otras modalidades, la composición de proteína N. meningitidis 2086 comprende además uno o más polisacáridos seleccionados del grupo que consiste en un polisacárido de estreptococo, un polisacárido de neumococo, un polisacárido de meningococo y un polisacárido de estafilococo. Todavía en otra modalidad, la formulación comprende además uno o más adyuvantes. A continuación se describen ejemplos de adyuvantes adecuados. En otras modalidades, la presente invención trata de formulaciones que inhiben la precipitación inducida por silicona de una composición de proteína N. meningitidis 2086 comprendida en un recipiente siliconado, la formulación comprendiendo (i) una solución salina tamponada de pH, donde el tampón tiene un pKa aproximadamente de 3,5 hasta aproximadamente 6,5, (ii) una sal de aluminio y (iii) una proteína de N. meningitidis 2086. En ciertas modalidades, el recipiente se selecciona a partir de uno o más del grupo que consiste en un frasco, tapón de frasco, cierre de frasco, cierre de vidrio, vidrio de caucho, cierre plástico, una jeringa, tapón de jeringa, émbolo de jeringa, un frasco, cubilete, cilindro graduado, fermentador, biorreactor, tubería, tubo, bolsa, jarra, ampolla, cartucho y pluma Todavía en otra modalidad, la solución salina tamponada de pH de la formulación tiene un pH de 5,5 a 7,5. En otras modalidades, el tampón es succinato, histidina, fosfato o citrato. En ciertas modalidades, el tampón es succinato a una concentración final de 1 mM a 10 mM y pH de 5,8 a 6,0. En otra modalidad, la sal de la solución salina tamponada de pH comprende cloruro de magnesio, cloruro de potasio, cloruro de sodio o una combinación de los mismos. En ciertas otras modalidades, la formulación comprende además polisorbato 80 (Tween™80) . En una modalidad específica, la concentración final del polisorbato 80 en la formulación es del 0,01% al 10% polisorbato 80 peso/volumen de la formulación. Todavía en otras modalidades, la composición de proteína N. meningitidis 2086 comprende además uno o más polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en un polipéptido de estreptococo, un polipéptido de neumococo, un polipéptido de meningococo y un polipéptido de estafilococo. En ciertas otras modalidades, la composición de proteína N. meningitidis 2086 comprende además uno o más polisacáridos seleccionados del grupo que consiste en un polisacárido de estreptococo, un polisacárido de neumococo, un polisacárido de meningococo y un polisacárido de estafilococo. Todavía en otra modalidad, la formulación comprende además uno o más adyuvantes. A continuación se describen ejemplos de adyuvantes adecuados. Otras características y ventajas de la invención resultarán aparentes de la siguiente descripción detallada, a partir de sus modalidades y de las reivindicaciones. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A-1B muestran la estabilidad de las formulaciones de peptidasa C5a de estreptococo (SCP) (llenadas en jeringas) antes y después de dos días de agitación suave (60 cpm) en un agitador orbital horizontal. Los datos presentados en la FIG. 1A es la estabilidad de dos días de la SCP formulada sin cualquier Tween™80 (es decir, el 0%) , por cuanto los datos de la FIG. IB es la estabilidad de dos días de la SCP formulada con el 0,025% Tween™80. Los tampones usados en las formulaciones mostradas en la FIG. 1A y IB son salina tamponada de succinato (SBS) , salina tamponada de fosfato (PBS) y tris (hidroximetil) aminometano (TRIS). La Figura 2 muestra la pérdida de antigenicidad total del 13vPnC formulado con AIP04 (0,25 mg/ml) y llenado en una jeringa BD Hypak, después de dos horas, ocho horas y veinticuatro horas de agitación a 500 rpm y 2-8aC. La Figura 3 muestra la pérdida de antigenicidad total en el 13 PnC formulado con AIP04 (0,25 mg/ml) y llenado en una jeringa sin siliconar, después de dos horas, ocho horas y veinticuatro horas de agitación a 500 rpm y 2-8aC. La Figura 4 muestra la pérdida de antigenicidad total del 13vPnC formulado con AIPO4 (0,25 mg/ml) y llenado en un jeringa Vetter, después de dos horas, ocho horas y veinticuatro horas de agitación a 500 rpm y 2-8 aC. La Figura 5 muestra la pérdida de antigenicidad total del 13vPnC formulado con AIPO4 (0,25 mg/ml) y llenado en una jeringa Schott TopPac, después de dos horas, ocho horas y veinticuatro horas de agitación a 500 rpm y 2-8aC. Las Figuras 6A-6B muestran la pérdida de antigenicidad total del 13vPnC formulado con (FIG. 6A) y sin (FIG. 6B) AIPO4 (0,25 mg/ml) y llenado en una jeringa BD Estufada, después de dos horas, ocho horas y veinticuatro horas de agitación a 500 rpm y 2-82C. Las Figuras 7A-7B muestran la antigenicidad total del 13vPnC formulado con (FIG. 7A) y sin (FIG. 7B) AIPO4 (0,25 mg/ml) y llenado en una jeringa BünderGlas PS2, después de dos horas, ocho horas y veinticuatro horas de agitación a 500 rpm y 2-8 eC. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención trata de una necesidad existente en el arte de mejorar la estabilidad de composiciones inmunogénicas tales como conjugados de polisacárido-proteína e inmunógenos de proteina. De este modo, la presente invención trata ampliamente de formulaciones surfactantes novedosas y/o formulaciones de sal de aluminio novedosas que estabilizan e inhiben la precipitación de composiciones inmunogénicas incluyendo, pero sin limitación, estabilidad química de la composición inmunogénica , estabilidad física/térmica de la composición inmunogénica, compatibilidad de la composición inmunogénica con el sistema de recipiente/cierre, interacciones entre la composición inmunogénica y los ingredientes inactivos (verbigracia, tampones, sales, excipientes, crioprotectores ) , procesos de manufactura, forma de dosificación, condiciones ambientales encontradas durante el envío, almacenamiento y manejo (verbigracia, temperatura, humedad, esfuerzos cortantes) y el tiempo de duración entre la manufactura y el uso. La estabilidad de una composición inmunogénica de la invención es fácilmente determinada utilizando técnicas estándares, que son bien conocidas y rutinarias para aquellos que tienen conocimiento en el arte. Por ejemplo, se evalúa una composición inmunogénica con respecto a su estabilidad, agregación, inmunogenicidad, formación de particulado, pérdida de proteína (concentración) y similar, mediante métodos que incluyen, pero sin limitación, dispersión de luz, densidad óptica, centrifugación de la velocidad de sedimentación, centrifugación del equilibrio de sedimentación, dicroismo circular (CD) , ensayo de Lowry, ensayo con ácido bicinconinico (BCA) , aglutinación de anticuerpos y similar. Conforme se indica detalladamente aquí, la presente invención trata de los resultados inesperados y sorprendentes de que la formulación de una composición inmunogénica con un surfactante tal como Tween™80 mejora significativamente la estabilidad e inhibe la precipitación de una composición inmunogénica. Por ejemplo, se observó en la presente invención (verbigracia, véanse el Ejemplo 2), que un conjugado de neumococo de valencia trece (13vPnC) formulado en salina tamponada y llenado en una jeringa de dosis única, comenzaría a precipitarse de la solución dentro de diez minutos a 2-8°C previa agitación suave por medio de un agitador orbital horizontal. (Se utilizó el agitador orbital horizontal para simular condiciones típicas del proceso, envío y almacenamiento de una composición inmunogénica de 13vPnC) . Sin embargo, se observó sorprendentemente que el 13vPnC, formulado en salina tamponada y el 0,001% Tween™80, llenado en una jeringa de dosis única y agitado suavemente a 2-8°C, fue estable durante veinticinco días sin señales visibles de precipitación (datos no mostrados) . De este modo, estos datos demostraron que la adición de un surfactante (verbigracia, Tween™80) a una formulación de composición inmunogénica mejora la estabilidad de la composición inmunogénica . Un segundo estudio de estabilidad del 13vPnC confirmó adicionalmente que la adición de un surfactante a la formulación mejoró significativamente la estabilidad del 13vPnC. Por ejemplo, se analizó la estabilidad (es decir, ensayada mediante medición del cambio en la ant igenicidad del 13vPnC) de una formulación de 13vPnC con el 0,05% Tween™80 (Tabla 19 y sin Tween™80 (0,0%, Tabla 1) en un periodo de dos horas. Conforme se muestra en la Tabla 1, hubo una disminución significativa de la ant igenicidad de los 13 polisacáridos serotipos (formulados sin Tween™80) dentro del ensayo de dos horas. Bastante dramáticamente, sin embargo, la formulación de 13vPnC que comprende el 0,05% Tween™80 (Tabla 1) demostró estabilidad robusta durante todo el ensayo de antigenicidad de dos horas. También se observó que el 13vPnC formulado en botellas de vidrio de 250 mL o bien con el 0,01% Tween™80 ó 0,05% Tween™80 podía soportar esfuerzos cortantes significativos inducidos por medio de formación de torbellino con las formulaciones durante treinta minutos a 2-8°C con poca o ninguna o pérdida de antigenicidad (verbigracia, véase el Ejemplo 2, Tabla 2) . En otros experimentos (Ejemplo 3) , se demostró que la estabilidad de una composición de peptidasa inmunogénica de estreptococo C5a (SCP) se vio enormemente mejorada cuando se formuló con un surfactante tal como Tween™80. Por ejemplo, conforme se muestra en la FIG. 1A, después de dos días de formación de torbellino con una SCP (55 µ?/p??,) formulada o bien en 5 mM tampón de succinato (pH 6,0), un tampón de fosfato 10 mM (pH 7,0) o un tampón Tris 10 mM (pH 7,5), hubo una disminución significativa (verbigracia, superior al 90%) en la concentración de SCP. Sin embargo, conforme se muestra en la FIG. IB, la adición del 0,025% Tween™80 a las formulaciones de succinato de SCP, fosfato de SCP y Tris SCP, antes de la formación de torbellino durante dos días, inhibió totalmente la pérdida de SCP que fuera observada en la FIG. 1A. También podrá formularse una composición inmunogénica de 13vPnC con o sin un adyuvante, tal como fosfato de aluminio (AIP04) . De este modo, en una serie por separado de experimentos (Ejemplo 4), se formularon composiciones inmunogénicas de 13vPnC en un tampón de succinato 5 mM (pH 5,8), 0,85% NaCl y AIP04 (0,25 mg de aluminio/ml ) , sin la adición de un surfactante (verbigracia, no se incluyó Tween™80 en la formulación) . En estos experimentos, la composición inmunogénica de 13vPnC (formulada en la presencia de AIP04) se llenó en varios recipientes siliconados y no-siliconados (verbigracia, véase la Tabla 3) y se sometieron a condiciones simuladas de envío y manejo por medio de agitación a 2-8°C. Se observó en estos experimentos (Ejemplo 4) que el recipiente con mayor contenido de silicona presentó un mayor grado de formación de particulado del 13vPnC y mayor porcentaje de pérdida de antigenicidad del 13vPnC. Un análisis FTIR de los particulados indicó que los particulados consistieron en proteína y silicona (datos no mostrados) y que aproximadamente el 85% del 13vPnC se aglutina con AIPO4, donde el restante 15% quedó como 13vPnC libre (no aglutinado al AIPO4) en la solución. En otro experimento comparando las composiciones inmunogénicas de 13vPnC formuladas con y sin AIPO4, que fueron luego llenadas en jeringas idénticas, se observó que el 13vPnC formulado sin AIP04 sostuvo mayores pérdidas de antigenicidad que el 13vPnC con AIPO4 en las jeringas ensayadas (véanse, verbigracia, la FIGS. 6A-6B y las FIGS. 7A-7B) . De este modo, la invención conforme se indica aquí, está dirigida a formulaciones novedosas que estabilizan e inhiben la agregación o precipitación de composiciones inmunogénicas tales como conjugados de polisacárido-proteína (verbigracia, un 13vPnC) e inmunógenos de proteína (verbigracia, peptidasa C5a de estreptococo, una proteína N. meningitidis ORF 2086) , contra los varios factores que influyen sobre la estabilidad de composiciones inmunogénicas (verbigracia, esfuerzos cortantes, agitación del envío, interacciones con el aceite de silicona, absorción, procesos de manufactura, temperatura, humedad, tiempo entre la manufactura y el uso, etc.) En ciertas modalidades, la invención trata de una formulación que estabiliza un conjugado de polisacárido-proteina, la formulación comprendiendo una solución salina tamponada de pH, donde el tampón tiene un pKa aproximadamente de 3,5 a 7,5, un surfactante y uno o más conjugados de polisacárido-proteina . En otras modalidades, la formulación de conjugado de polisacárido-proteina va comprendida en recipientes. En otra modalidad, la invención trata de una formulación que estabiliza una composición de estreptococo C5a peptidasa (SCP) , la formulación comprendiendo una solución salina tamponada de pH, donde el tampón tiene un pKa aproximadamente de 3,5 aproximadamente a 6,5, un surfactante y una peptidasa C5a de estreptococo. En ciertas modalidades, un surfactante y una peptidasa C5a de estreptococo. En otra modalidad, la invención trata de una formulación que estabiliza una composición de proteina N. meningitidis 2086, la formulación comprendiendo una solución salina tamponada de pH, donde el tampón tiene un pKa aproximadamente de 3,5 hasta aproximadamente 7,5, un surfactante y una proteina de N. meningitidis 2086. En ciertas modalidades, la formulación de meningococo 2086 va comprendida en un recipiente. En ciertas otras modalidades, la invención trata de una formulación que inhibe la precipitación inducida por silicona de un conjugado de polisacárido-proteina comprendido en un recipiente siliconado, la formulación comprendiendo una solución salina tamponada de pH, donde el tampón tiene un pKa aproximadamente de 3,5 hasta aproximadamente 7,5, una sal de aluminio y uno o más conjugados de polisacárido-proteina . En otra modalidad, la invención trata de una formulación que inhibe precipitación inducida por silicona de una composición de estreptococo C5a peptidasa (SCP) comprendida en un recipiente siliconado, la formulación comprendiendo una solución salina tamponada de pH, donde el tampón tiene un pKa aproximadamente de 3,5 aproximadamente a 6,5, una sal de aluminio y una peptidasa C5a de estreptococo. En ciertas otras modalidades, la invención trata de una formulación que inhibe la precipitación inducida por silicona de una composición de proteina N. meningitidis 2086 comprendida en un recipiente siliconado, la formulación comprendiendo una solución salina tamponada de pH, donde el tampón tiene un pKa aproximadamente de 3,5 hasta aproximadamente 7,5, una sal de aluminio y una proteina de N. meningitidis 2086. Todavía en otras modalidades, la invención trata de una formulación que optimiza la estabilidad de antígeno y el porcentaje de aglutinación con un adyuvante de sal de aluminio (verbigracia, AIP04) de una proteína de N. meningitidis 2086, la formulación comprendiendo una solución salina tamponada de pH, donde el tampón tiene un pKa aproximadamente de 3,5 hasta aproximadamente 7,5, un surfactante, una sal de aluminio y una proteína de N. meningitidis 2086. En ciertas modalidades, la formulación está en un recipiente. Conforme se define en lo sucesivo, los términos "precipitación", "precipitado", "formación de particulado", "turbidez" y "agregación" podrán ser utilizados intercambiablemente y tienen por objeto referirse a cualquier interacción física o reacción química que resulte en la "agregación" de un conjugado de polisacárido-proteína o un inmunógeno de proteína (o polipéptido) . El proceso de agregación (verbigracia, agregación de proteína) es bien conocido (pero no bien entendido) y descrito en el arte y a menudo es influenciado por numerosas tensiones fisicoquímicas incluyendo el calor, presión, pH, agitación, esfuerzos cortantes, congelamiento-descongelamiento, deshidratación, metales pesados, compuestos fenólicos, aceite de silicona, desnaturalizantes y similares. Conforme se define en lo sucesivo, un "conjugado de polisacárido-proteína", un "conjugado de neumococo", un "conjugado de neumococo de valencia 7 (7vPnC)", un "conjugado de neumococo de valencia 13 (13vPnC)", una "composición inmunogénica de estreptococo C5a peptidasa (SCP)" y una "composición de proteína N. meningitidis 2086" de la invención incluye formulaciones líquidas, formulaciones líquidas congeladas y formulaciones sólidas (verbigracia, secadas por congelamiento o liofilizadas ) .
A. SURFACTA TES Conforme se indica anteriormente, la invención trata de formulaciones que estabilizan e inhiben la agregación de composiciones inmunogénicas contra los varios factores que influencian la estabilidad de las composiciones inmunogénicas (verbigracia, esfuerzos cortantes, agitación del envío, interacciones del aceite de silicona, absorción, procesos de manufactura, temperatura, humedad, tiempo entre la manufactura y el uso, etc.). En ciertas modalidades, la invención trata de formulaciones que comprenden un surfactante . Un surfactante (o agente activo en superficie) generalmente se define como (a) una molécula o compuesto que comprende un grupo o mitad hidrofílico y un grupo o mitad lipofílico (hidrofóbico) y/o (b) una molécula, sustancia o compuesto que baje o reduzca la tensión superficial de una solución. Conforme se define aquí, un "surfactante" d" la presente invención es cualquier molécula o compuesto que baje la tensión superficial de una formulación de composición inmunogénica . Un surfactante usado en una formulación de la presente invención comprende cualquier surfactante o cualquier combinación de surfactantes que estabilice e inhiba la agregación de una composición inmunogénica descrita aquí. De este modo, un surfactante de la invención incluye, pero sin limitación, polisorbato 20 (Tween 20), polisorbato 40 (Tween™40), polisorbato 60 (Tween™60), polisorbato 65 (Tween™65), polisorbato 80 (Tween™80), polisorbato 85 (Tween™85), Tritón™ N-101, Tritón™ X-100, oxtoxinol 40, nonoxinil-9, trietanolamina , trietanolamina polipéptido oleato, polioxetileno-660 hidroxistearato (PEG-15, Solutol H15), polioxetileno-35-ricinoleato (Cremophor EL™), lecitina de soya, poloxámero, hexadecilamina, octadecilamina , ésteres de octadecil aminoácido, lisolecitina , bromuro de dimetil-dioctadecilaminio, metoxihexadeciglicerol , polioles plurónicos, poliaminas (verbigracia, pirano, dextransulfato, poli IC, carbopol), péptidos (verbigracia, péptido de muramilo y dipéptido, dimetilglicina, tuftsina), emulsiones de aceite, geles minerales (verbigracia, fosfato de aluminio) y complejos estimulantes inmunes (ISCOMS). Una persona versada en el arte podrá determinar fácilmente un surfactante adecuado o combinación de surfactante midiendo la tensión superficial de una formulación de composición inmunogénica particular en la presencia o ausencia del o de los surfactante ( es ) . Alternativamente, se evalúa un surfactante cualitativamente (verbigracia, inspección visual de la formación del particulado) o cuantitativamente (verbigracia, dispersión de luz, centrifugación de la velocidad de sedimentación, densidad óptica, antigenicidad) con respecto a su capacidad para reducir, inhibir o prevenir la agregación de una composición inmunogénica . B. RECIPIENTES En ciertas modalidades, la invención trata de formulaciones de composiciones inmunogénicas comprendidas en un recipiente. Conforme se define aquí, "recipiente" de la presente invención incluye cualquier composición que sea utilizada para "contener", "sujetar", "mezclar", "mixturar", "surtir", "inyectar", "transferir", "nebulizar", etc. una composición inmunogénica durante investigación , procesamiento, desarrollo, formulación, manufactura, almacenamiento y/o administración. Por ejemplo, un recipiente de la presente invención incluye, pero sin limitación, cristalería general de laboratorio, frascos, cubiletes, cilindros graduados, termentadores, biorreactores , tubos, tuberías, bolsas, jarras, frascos, cierres de frasco (verbigracia, tapón de caucho, tornillo en la tapa) , ampollas, jeringas, tapones de jeringas, émbolos de jeringas, cierres de caucho, cierres de plástico, cierres de vidrio y similares. Un recipiente de la presente invención no está limitado por material de fabricación e incluye materiales tales como vidrio, metales (verbigracia, acero, acero inoxidable, aluminio, etc.) y polímeros (verbigracia, termoplásticos , elastómeros, elastómeros termoplásticos ) . El técnico versado apreciará que la enumeración de recipientes que antecede no es exhaustiva de manera alguna sino que meramente sirve como orientación para el técnico con respecto a la variedad de recipientes que se utilizan para contener, sostener, mixturar, mezclar, surtir, inyectar, transferir, nebulizar, etc. un inmunógeno o composición inmunogénica durante la investigación, procesamiento, desarrollo, formulación, manufactura, almacenamiento y/o administración de la composición. Los recipientes adicionales contemplados para su uso en la presente invención podrán ser encontrados en catálogos publicados por vendedores y fabricantes de equipos para laboratorio tales como United States Plástic Corp. (Lima, OH), VWR™ (West Chester, PA) , BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ) , Fisher Scientific International, Inc. (Hampton, NY) y Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) . De este modo, las formulaciones novedosas de la presente invención son particularmente ventajosas en que estabilizan e inhiben la precipitación de formulaciones inmunogénicas comprendidas en un recipiente en todas las varias etapas de la investigación, procesamiento, desarrollo, formulación, manufactura, almacenamiento y/o administración de la composición. Las formulaciones novedosas de la invención no solamente estabilizan las composiciones inmunogénicas contra tensiones físicas/térmicas (verbigracia, temperatura, humedad, esfuerzos cortantes, etc.), sino que también mejoran la estabilidad e inhiben la precipitación de composiciones inmunogénicas contra factores o influencias negativas tales como incompatibilidad de la composición inmunogénica con el sistema de recipiente/cierre (verbigracia, un recipiente siliconado) . De este modo, las formulaciones novedosas de la presente invención son particularmente útiles en la estabilización del inmunógeno (es decir, un conjugado de polisacárido-proteina , una o antigeno de polipéptido) contra un antigeno de polipéptido) contra la precipitación inducida por el aceite de silicona y la precipitación descrita anteriormente. Por ejemplo, la Solicitud americana copendiente No. 60/795.098, presentada el 26 de abril de 2006, incorporada específicamente aquí, por referencia, describe la agregación de composiciones inmunogénicas en la presencia de aceite de silicona encontrado en recipientes tales como jeringa, frascos de vidrio, tapones de caucho y similares, donde la adición de un surfactante al recipiente evitó la agregación inducida por el aceite de silicona de estas composiciones inmunogénicas. C. ADYUVANTES Y VEHÍCULOS/EXCIPIENTES FARMACÉUTICOS En ciertas modalidades, las composiciones inmunogénicas de la invención son formuladas adicionalmente con un adyuvante. Un adyuvante es una sustancia que mejora la respuesta inmune cuando se administra junto con un inmunógeno o antígeno. Se han demostrado que varias citocinas o linfocinas tienen actividad moduladora inmune y de este modo podrán ser utilizadas como adyuvantes incluyendo, pero sin limitación, las interleucinas 1-a, 1-ß, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (véase, verbigracia, la Patente americana No. 5.723.127), 13, 14, 15, 16, 17 y 18 (y sus formas mutantes), las interferonas-a, ß y ?, el factor estimulante de la colonia de granulocito-macrófago (GMCSF, véase, verbigracia, la Patente americana No. 5.078.996 y el Número de Acceso ATCC 39900), factor estimulante de colonia de macrófago (MCSF) , factor estimulante de colonia de granulocito (GCSF) y los factores de necrosis de tumor a y ß (TNF) . Todavía otros adyuvantes útiles en la presente invención incluyen quimiocinas, incluyendo sin limitación MCP-1, MIP-la, MIP-?ß y RANTES. En ciertas modalidades, un adyuvante utilizado para mejorar una respuesta inmune de una formulación de composición inmunogénica incluye, sin limitación, MPL™ (3-0-lípido de monofosforil desacilado A; Corixa, Hamilton, MT) , que se describe en la Patente americana No. 4.912.094, la cual queda incorporada aquí por referencia. Igualmente adecuados para usarse como adyuvantes son los análogos de lípido A sintéticos o compuestos de aminoalquilo glucosamina fosfato (AGP) o sus derivados o análogos, que están disponibles en Corixa (Hamilton, MT) y que se describen en la Patente americana No. 6.113.918, la cual queda incorporada aquí por referencia. Uno de esos AGP es 2-[(R)-3-Tetradecanoiloxitetradecanoilamino ] etil 2-Deoxi-4 -0-fosfono-3-0- [ (R) -3-tetradecanoioxitetradeca-noil ] -2- [ (R) -3-tetradecanoiloxitetradecanoil-amino] -b-D-glucopiranosida, que también se conoce como 529 (anteriormente conocido como RC529) . Este adyuvante 529 es formulado como una forma acuosa o una emulsión estable (RC529-SE) . Todavía otros adyuvantes incluyen emulsiones de aceite mineral y agua, sales de aluminio (alum) , tal como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc., Amphigen, Avridine, L121/escualeno, D-láctido-poliláct ido/glucosida , polioles plurónicos, dipéptido de muramilo, Bortedella destruida, saponinas, tal como Stimulon™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) , descritos en la Patente americana No. 5.057.540, la cual queda incorporada aquí por referencia y partículas generadas de allí tales como ISCOMS (complejos inmunoestimulantes ) , ISCOMATRIX (CSL Limited, Parkville, Australia), descritas en la Patente americana No. 5.524.339, Mycobacterium tuberculosis, lipopolisacáridos bacteriales, polinucleótidos sintéticos tales como oligonucleótidos que contienen un motivo CpG (Patente americana No. 6.207.64, la cual queda incorporada aquí por referencia), IC-31 (Intercell AG, Viena, Austria), descritos en las Patentes europeas Nos. 1.296.713 y 1.326.634, una toxina de tos ferina (PT) o un toxina lábil al calor E. coli (LT), particularmente LT-K63, LT-R72, PT-K9/G129; véase, verbigracia, la Publicación de Patente Internacional Nos. WO 93/13302 y WO 92/19265, incorporadas aquí por referencia. Igualmente útiles como adyuvantes (y proteínas portadoras) son toxinas del cólera y sus mutantes, incluyendo aquellas descritas en la Solicitud de Patente Internacional publicada número WO 00/18434 (donde el ácido glutámico en la posición 29 es reemplazado por otro aminoácido (distinto al ácido aspártico) , preferiblemente una histidina) . Toxinas CT o mutantes similares se describen en la Solicitud de Patente Internacional publicada número WO 02/098368 (donde la isoleucina en el aminoácido posición 16 es reemplazada por otro aminoácido, o bien solo o en combinación con el reemplazo de la serina en la posición 68 mediante otro aminoácido; y/o donde la valina en la posición 72 del aminoácido es reemplazada por otro aminoácido) . Otras toxinas CT son descritas en la Solicitud de Patente Internacional publicada número WO 02/098369 (donde la arginina en la posición 25 del aminoácido es reemplazada por otro aminoácido; y/o se inserta un aminoácido en la posición 49 del aminoácido; y/o se insertan dos aminoácidos en las posiciones 35 y 36 de aminoácido) . En ciertas modalidades, las formulaciones de composición inmunogénica comprenden un diluente de aceptación farmacéutica, excipiente o un vehículo de aceptación farmacéutica. En una modalidad, el diluente de aceptación farmacéutica es agua estéril, agua para inyección, salina isotónica estéril o un tampón biológico. Los conjugados de polisacárido-proteína y/o inmunogénicos de proteína se mezclan con esos diluentes o vehículos de forma convencional. Conforme se utiliza aquí, la terminología "vehículo de aceptación farmacéutica" está destinada a incluir todos y cualesquiera disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacteriales y antihongos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares, compatibles con la administración a humanos u otros huéspedes vertebrados. El vehículo apropiado es evidente para aquellos versados en el arte y dependerán en gran parte de la vía de administración. Por ejemplo, los excipientes que podrán estar presentes en la formulación de la composición inmunogénica son preservativos, estabilizadores químicos y agentes de suspensión o dispersión. Típicamente, los estabilizadores, preservativos y similares son optimizados para determinar la mejor formulación para su eficacia en el recipiente blanco (verbigracia, sujeto humano) . Ejemplos de preservativos incluyen clorbutanol, sorbato de potasio, ácido sórbico, dióxido de azufre, galato de propilo, los parabenes, vanilina de etilo, glicerina, fenol y paraclorfenol . Ejemplos de ingredientes estabilizadores incluyendo ácidos de casamino, sucrosa, gelatina, rojo de fenol, amina N-Z, difosfato de monopotasio, lactosa, hidrolisato de lactalbúmina y leche seca . En ciertas modalidades, se prepara una formulación de composición inmunogénica para su administración a sujetos humanos en la forma, por ejemplo, de líquidos, polvos, aerosoles, tabletas, cápsulas, tabletas o cápsulas revestidas con entérico o supositorios. De este modo, las formulaciones de composición inmunogénica también podrán incluir, pero sin limitación, suspensiones, soluciones, emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, pastas y formulaciones implantables de liberación sostenida o biodegradables . Las composiciones inmunogénicas de la presente invención no son limitadas por la selección de los vehículos, diluentes y excipientes convencionales y de aceptación farmacéutica tales como disolventes, tampones, adyuvantes u otros ingredientes útiles en las preparaciones farmacéuticas de los tipos descritos anteriormente. La preparación de estas composiciones de aceptación farmacéutica, a partir de los componentes descritos anteriormente, que tienen isotonicidad de pH, estabilidad y otras características convencionales adecuadas está dentro del conocimiento del arte. D . I U OGENOS En ciertas modalidades, una formulación de conjugado de polisacárido-proteina de la invención comprende uno o más polisacáridos de neumococo. En otras modalidades, una formulación de conjugado de polisacárido-neumococo de la invención comprende uno o más polisacáridos de estreptococo. Todavía en otras modalidades, una formulación de conjugado de polisacárido-proteina de la invención comprende uno o más polisacáridos de meningococo. Todavía en otras modalidades, una formulación de conjugado de polisacárido-proteina de la invención comprende una combinación de uno o más polisacáridos de neumococo, uno o más polipéptidos de neumococo, uno o más polisacáridos de estreptococo, uno o más polipéptidos de estreptococo, uno o más polisacáridos de meningococo y/o uno o más polipéptidos de meningococo. Conforme se define en lo sucesivo, el término "polisacárido" está destinado a incluir cualquier elemento de sacárido antigénico (o unidad antigénica) comúnmente utilizado en las artes de vacunas inmunológicas y bacteriales incluyendo, pero sin limitación, un "sacárido", un "oligosacárido", un "polisacárido", un "liposacárido", un "lipo-oligosacárido (LOS)", un " lipopolisacárido LPS)", un "glicosilato" , un "glicoconj ugado" y similares. En una modalidad en particular de la invención, el uno o más polisacáridos de neumococo son un polisacárido serotipo 4 S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 9V S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 14 S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 18C S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 19F S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 23F S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 1 S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 3 S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 5 S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 6A S. pneumoniae, un polisacárido serotipo 7F S. pneumoniae y un polisacárido serotipo 19A S. pneumoniae . En ciertas modalidades, una formulación de conjugado de polisacárido-proteina es una formulación de conjugado de neumococo de valencia 7 (7vPnC) que comprende un polisacárido serotipo 4 S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRMi97, un polisacárido serotipo 6B S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CR 197, un polisacárido. serotipo 9V S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRM197 , un polisacárido serotipo 14 conjugado con un polipéptido CRM197 , un polisacárido serotipo 18C S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRM197 , un polisacárido serotipo 19F S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRM197 y un polisacárido serotipo 23F S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CR 197. En ciertas modalidades, una formulación de conjugado de polisacárido-proteina es una formulación de conjugado de neumococo de valencia 13 (13vPnC) que comprende un polisacárido serotipo 4 S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRM197, un polisacárido serotipo 6B S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRM197, un polisacárido serotipo 9V S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRM197 , un polisacárido serotipo 14 S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRM197 , un polisacárido serotipo 18C S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRM197 , un polisacárido serotipo 19F conjugado con un polipéptido CR 197 , un polisacárido serotipo 23F conjugado con un polipéptido CRM197 , un polisacárido serotipo 1 S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRM197 , un polisacárido serotipo 3 S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRM197 , un polisacárido serotipo 5 S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRM197 , un polisacárido serotipo 6A S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRMi97, un polisacárido serotipo polisacárido serotipo 7F S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRM197 , y un polisacárido serotipo 19A S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRM197 . Los polisacáridos son preparados mediante técnicas estándares conocidas por aquellos versados en el arte. Por ejemplo, los polisacáridos capsulares contemplados en la presente invención son preparados a partir de serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F. y 23F de Streptococcus pneumoniae, donde se desarrolla cada serotipo en un medio basado en soya y los polisacáridos individuales son luego purificados a través de centrifugación, precipitación, ultrafiltración y cromatografía por columna. Igualmente, los polisacáridos de estreptococo (verbigracia, uno o más polisacáridos (u oligosacáridos ) provenientes de Streptococcus ß-hemolítico tal como Streptococcus del grupo A, Streptococcus del grupo B, Streptococcus del grupo C y Streptococcus del grupo G) y los sacáridos de meningococo (verbigracia, oligo-sacárido de N. meningitidis (LOS) o lipo-polisacárido (LPS) ) son preparados a partir de serotipos o serogrupos clínicamente relevantes, utilizando técnicas y métodos generales conocidos por la persona versado en el arte. Los polisacáridos purificados son luego activados químicamente (verbigracia, por medio de aminación reductora) para hacer los sacáridos capaces de reaccionar con la proteína transportadora. Una vez activado, el polisacárido capsular es conjugado por separado con una proteína transportadora (verbigracia, CRMi97) para formar un glicoconj ugado (o alternativamente, cada polisacárido capsular se conjuga con la misma proteína transportadora) y se formula en formulación de dosificación única. La activación química de los polisacáridos y la subsiguiente conjugación con la proteína transportadora (es decir, un conjugado de polisacárido-proteína ) se logran mediante medios convencionales. Véase, por ejemplo, las Patentes americanas 4.673.574 y 4.902.506. Las proteínas transportadoras son preferiblemente proteínas que son no-tóxicas y no-reactogénicas y obtenibles en suficiente cantidad y pureza. Las proteínas transportadoras deben ser susceptibles de procedimientos de conjugación estándares. En una modalidad particular de la presente invención, se utiliza CRM197 como la proteina transportadora . CRM197 (Wyeth, Sanford, NC) es una variante no-tóxica (es decir, toxoide) de la toxina de difteria aislada de los cultivos de la cepa C7 de Corynebacterium (ß197) desarrollada en ácidos de casamino y medio basado en extracto de levadura. Se purifica CRM197 a través de ultrafiltración, precipitación de sulfato de amonio y cromatografía de intercambio de iones. Alternativamente, se prepara CRM197 en forma recombinante de conformidad con la Patente americana No. 5.614.382, la cual queda por este medio incorporada por referencia. Otros toxoides de difteria también son adecuados para usarse como proteínas transportadoras. En otras modalidades, una proteína transportadora de la invención es una peptidasa C5a de estreptococo (SCP) (verbigracia, una o más de las variantes de la SCP descritas en la Patente americana No. 6.951.643, Patente americana No. 6.355.255 y la Patente americana No. 6.270.775). Otras proteínas transportadoras adecuadas incluyen toxinas bacteriales inactivadas tales como toxoide del tétano, toxoide la tos ferina, toxoide del cólera (verbigracia, CT E29H, descrito en la Solicitud de Patente Internacional W02004 /083251 ) , LT E. coli, ST E. coli, y exotoxina A proveniente de Pseudomonas aeruginosa. También pueden usarse las proteínas de membrana externa bacterial tales como complejo c de la membrana externa (OMPC) , porinas, proteínas aglutinantes con transíerrina, neumolisina, proteína superficial de neumococo A (PsPA), proteína de adhesión a neumococo (PsaA), o proteína D de Haemophilus influenzae. También pueden usarse como proteínas transportadoras, otras proteínas tales como ovalbúmina, hemocianina de lapa californiana (KLH) , albúmina sérica bovina (BSA) o derivado de proteína purificada de tuberculina (PPD) . Después de la conjugación del polisacárido capsular con la proteína transportadora, los conjugados de polisacárido-proteína son purificados (enriquecidos con respecto a la cantidad de conjugado de polisacárido-proteína ) mediante una variedad de técnicas. Estas técnicas incluyen operaciones de concentración/diafiltración, precipitación/levigación, cromatografía por columna y filtración profunda. Después de purificarse los glicoconj ugados individuales, son transformados en compuestos para formular la composición inmunogénica de la presente invención. La formulación de los conjugados de polisacárido-proteína de la presente invención puede ser lograda utilizando los métodos reconocidos en el arte. Por ejemplo, los 13 conjugados de neumococo individuales con un vehículo de aceptación fisiológica para preparar la composición. Ejemplos de esos vehículos incluyen, pero sin limitación, agua, salina tamponada, polioles (verbigracia, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido) y soluciones de dextrosa. En otras modalidades, la invención trata de formulaciones que estabilizan una composición inmunogénica de peptidasa C5a de estreptococo (SCP) , donde las formulaciones comprenden una solución salina tamponada de pH, donde el tampón tiene un pKa aproximadamente de 3,5 aproximadamente a 6,5, un surfactante y una peptidasa de estreptococo C5a. La peptidasa C5a es una proteasa de serina altamente conservada y se expresa en todos los Estreptococos ß-hemolíticos (verbigracia, Grupos de estreptococo A, B, C y G) . Por ejemplo, la secuencia de nucleótido que codifica una peptidasa C5a de estreptococo (GBS) del Grupo B es el 98% idéntica a la secuencia de nucleótido que codifica una peptidasa C5a de estreptococos' del Grupo A. De este modo, en ciertas modalidades de la invención, una composición inmunogénica contra infección causada por Estreptococos ß-hemolíticos comprende un inmunógeno (o antígeno) de peptidasa . En una modalidad particular, una peptidasa C5a de la invención es una peptidasa C5a de estreptococo enzimáticamente inactiva (verbigracia, una o más de las variantes SCP descritas en la Patente americana No. 6.951.653, Patente americana No. 6.355.255 y Patente americana No. 6.270.775, cada una específicamente incorporada aquí por referencia) . En otra modalidad específica, la SCP utilizada en las formulaciones novedosas de composición inmunogénica de la invención es clonada a partir de un estreptococo del Grupo B. En otra modalidad, la secuencia de SCP de estreptococos del Grupo B ha sido genéticamente mutada para hacerla pr o t e o 1 í t i camen t e inactiva (verbigracia, véanse las Patentes americanas Nos. 6.951.653; 6.355.255 y 6.270.775) y se expresa como una proteína recombinante en E . col i . En otra modalidad, la invención trata de formulaciones que estabilizan una composición inmunogénica de proteína de N. meningitidis 2086, donde las formulaciones comprenden una solución salina tamponada de pH, en la cual el tampón tiene un pKa aproximadamente de 3, 5 aproximadamente a 7,5, un surfactante y una proteína de N. meningitidis 2086. Las proteínas de N. meningitidis 2086 son codificadas mediante un marco de lectura abierta de secuencia de ácido nucleico (ORF) identificada como "ORF 2086" (verbigracia, véase la Publicación Internacional No. WO 03/063766 (Solicitud Internacional No.
PCT/US02/32369) , Publicación Internacional No. WO 04/094596 A2 (Solicitud Internacional No.
PCT/US04/11901) , y Publicación Internacional No. WO 04/065603 A2 (Publicación Internacional No. PCT/US04 /000800 ) , cada una específicamente incorporada aquí por referencia). En una modalidad adicional, la invención trata de formulaciones que optimizan la estabilidad de antígeno y el porcentaje de aglutinación con un adyuvante de sal de aluminio (verbigracia, AIP04) de una proteína de N. meningitidis 2086, donde las formulaciones comprenden una solución salina tamponada de pH, en la cual el tampón tiene un pKa aproximadamente de 3,5 hasta aproximadamente 7,5, un surfactante, una sal de aluminio y una proteína de N. meningitidis 2086. Todas las patentes y publicaciones citadas aquí quedan por este medio incorporadas por referencia. E . E JEMPLO S Se llevan a cabo los siguientes ejemplos utilizando técnicas estándares, que son bien conocidas y de rutina para aquellos versados en el arte, salvo los casos que lo contrario se describen detalladamente. Se presentan los siguientes ejemplos para fines ilustrativos y no deben ser interpretados de manera alguna como limitantes del alcance de la presente invención.
EJEMPLO 1 FORMULACIONES INMUNOGENICAS QUE COMPRENDEN EL 0,001%-0,05% TWEEN™80 ESTABILIZAN Y PREVIENEN LA AGREGACIÓN DEL INMUNOGENO El conjugado de polisacárido-proteína utilizado en este ejemplo fue un conjugado de polisacárido de neumococo de valencia trece (13vPnC) que comprende polisacáridos capsulares provenientes de los serotipos de S. pneumoniae 4, 6B, 9V, 18C, 19F, 14, 23F, 1,3, 5, 6A, 7F y 19A, cada uno de ellos conjugado con CRMi97. Los polisacáridos capsulares fueron preparados mediante técnicas estándares conocidas por aquellos versados en el arte. En resumen, se desarrolló cada serotipo de polisacárido de neumococo en un medio basado en soya, los polisacáridos individuales fueron luego purificados a través de centrifugación, precipitación, ultrafilt ración y cromatografía por columna. Los polisacáridos fueron activados químicamente para su conjugación y cada polisacárido fue conjugado separadamente con una proteína transportadora CRMi97 para formar un glicoconj ugado y se formularse en una formulación de dosis única. La activación química de los polisacáridos y subsiguiente conjugación con la proteína transportadora se lograron a través de medios convencionales (verbigracia, véase las Patentes americanas Nos. 4.673.574 y 4.902.506) . CRMi97 (Wyeth, Sanford, NC) es una variante no-tóxica (es decir, toxoide) de la toxina de difteria aislada de los cultivos de la cepa C7 de Corynebacterium diphteria (ß197) desarrollados en ácidos de casamino y medio basado en extracto de levadura. Se purifica CRMi97 a través de la ultrafiltración, precipitación de sulfato de amonio y cromatografía de intercambio de iones. Los experimentos de ant igenicidad descritos a continuación fueron realizados mezclando las muestras de 13vPnC con uno de trece antisueros (ab) específicos para cada uno de los serotipos de polisacárido y detectando los complejos inmunes por medio de mediciones de dispersión de luz en un sistema Array® 360 (Beckman Coulter, Inc.; Fullerton, CA) . Las mediciones de dispersión de luz detectadas para cada uno de los trece serotipos fueron luego comparadas con una curva estándar y reportadas como antigenicidad (]ig/mL) . Las jeringas (BD Hypak SCF™) y tapones de jeringa (BD Hypak SCF™) fueron comprados en BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ) . Los frascos de borosilicato claros (VWR TraceClean™, 40 mL) con cierres forrados con Teflon® fuero comprados en VWR™ (Wester Chester, PA) . El polisorbato 80 (Tween™80) fue comprado en J.T. Baker (Mallin-ckrodt Baker, Inc.; Phillipsburg, NJ) . La salina tamponada fue succinato (5 mM) y NaCl (0,85%) a pH 5,8.
Se formuló el 13vPnC (500 mL de volumen total) a diferentes concentraciones de surfactante (Tween™80; 0,001%, 0,005%, 0,01% y 0,05%, peso/volumen) de la manera siguiente; se añadió el 0,85% salina (150 mM Nací) a un cubilete de vidrio Pyrex® de un litro, seguida de 50 mM tampón de succinato (concentración final 5 mM) y el 13vPnC. La concentración final de cada conjugado serotipo fue 4,4 µg/mL (salvo para el serotipo 6B, gue fue de 8,8 µg/mL) . La formulación de 13vPnC fue luego dividida en cinco frascos de vidrio por separado (50 mL por frasco), donde se añadió o bien el 0,0%, 0,001%, 0,005%, 0,01% ó 0,05% Tween™80 (p/v) a uno de los cinco frascos y cada solución fue filtrada a través de un filtro Ducapor® de 0,22 µ?? (Millipore; Billerica, MA) . En lo subsiguiente, se llenó 0,65 mL de cada solución en una jeringa de vidrio de 3 mL BD HYPAK™ SCF™ con tapones grises w4432 (BD Medical Pharmaceutical Systems; Franklin Lakes, NJ) y se colocaron las jeringas en un agitador orbital horizontal (60 cpm) durante 100 horas de 2°C a 8°C. Se observó mediante inspección visual (datos no mostrados) que el 13vPnC formulado en la ausencia de Tween™80 (es decir, el 0,0%) comenzaría a precipitarse de la solución dentro de diez minutos a 2-8°C previa agitación suave por medio de un agitador orbital horizontal. En contraste, el 13vPnC, formulado en el 0,001%, 0,005%, 0,01% ó 0,05% Tween™80 y agitado suavemente a 2-8°C, resultó estable durante hasta veinticinco días sin señales visibles de precipitación (datos no mostrados). De este modo, estos datos demostraron que la adición de un surfactante (verbigracia, Tween™80) a una formulación de composición inmunogénica mejora la estabilidad de la misma. Un segundo experimento de estabilidad del 13vPnC confirmó adicionalmente que la adición del surfactante a la formulación mejoró significativamente la estabilidad del 13vPnC. En este experimento, se formuló el 13vPnC con y sin el 0,05% Tween™80. El 13vPnC formulado sin Tween™80 (es decir, 0,0%) fue preparado de la manera siguiente: se añadió el 0,85% salina (150 mM NaCl) a un cubilete de vidrio Pyrex® de un litro, seguido de 50 mM tampón de succinato (concentración final 5 mM) y el 13vPnC, a un volumen total de 500 mL. La formulación de 13vPnC con el 0,05% Tween™80 fue preparada de la manera siguiente: se añadió el 0,85% salina (150 mM NaCl) a un cubilete de vidrio Pyrex® de un litro, seguida de 50 mM tampón de succinato (concentración final 5 mM) , el 0,05% Tween™80 y el 13vPnC, a un volumen total de 500 mL. La concentración final de cada conjugado de serotipo en las formulaciones de 500 mL fue 4,4 pg/mL (salvo el serotipo 6B, que fue 8,8 pg/mL) . Las formulaciones de 500 mL fueron homogeneizadas por medio de un homogenei zador de rotor/estator a 6.000 rpm (2-8°C) durante 120 minutos. El proceso de homogeneización creó una interfaz de aire-liquido (con burbujas de aire) . La estabilidad de la formulación de 13vPnC con (Tabla 1) y sin (Tabla 1) el 0,05% Tween™80 fue analizada en un periodo de dos horas de la manera siguiente: Se removieron muestras (20-30 mL) a cero, treinta y ciento veinte minutos a partir del 0,0% y 0,05% de las formulaciones de Tween™80, las muestras fueron diluidas 1:1 en diluente de proteina (diluente de proteina Array® 360 (Cat. No. 663630); Beckman Coulter Inc.; Fullerton, CA) y se analizó la antigenicidad de todos los trece serotipos del 13vPnC (véase la Tabla 1) en el sistema de Array® 360.
TABLA 1 ENSAYO DE ESTABILIDAD DE 13vPnC FORMULADO CON Y SIN TWEE 13vPnC sin Tween80 13vPnC con el 0,05% Tween80 Serotipo AntigeniciAntigeniciAntigeniciSerotipo ^Antigenici- Antigenici- Antigenicidad 0 min dad 30 min dad 120 min .. dad min dad 120 min 1 4.8 ua/m) 4.2 ug/ml 2.4 ug/ml 1 5.1 ug/ml 5.0 ug/ml 5.2 ug/ml 3 4.8 ugml 4.1 µßml 1.7 ug/ml 3 5.0 ug/ml 5.0 ug/ml 5.2 ug/ml 4 5.8 ug/ml 5.0 ug/ml 3.1 ug/ml 4 6.1 ug/ml 6.1 ug/ml 6.2 ufl/ml 5 3.4 ufl/ml 3.0 ug/ml 2.0 ug/ml 5 3.6 ug/ml 3.6 ug/ml 3.7 ugml 6A 4.9 ufl/ml 3.8 gml 1.3 ug/ml 6A 5.4 ug/ml 5.4 ug/ml 5.6 ugml 6B 10.0 ug/ml 5.6 ug/ml 1.4 /ml 6B 10.6 ug/ml 10.6 ug/ml 10.5 /ml 7F 4.7 ugml 3.4 ug/ml 1.0 ug/ml 7F 5.3 ug/ml 5.2 ug/ml 5.3 / l 9V 5.6 ugml 4.7 ugml 2.5 ug/ml 8V 6.1 ug/ml 6.1 ug/ml 6.2 ug/ml 14 7.6 ug/ml 6.4 ug/ml 3.0 ug/ml 14 8.2 ug/ml 8.3 ugmi 8.3 ugml 18C 5.6 ugml 4.4 ug/ml 1.7 ug/ml 8C 6.2 ug/ml 61 ug/ml 6.2 / l 1T? 6.4 g/ml 45 ug/ml 1.9 ug/ml 19A 6.8 ug/ml 6.8 ug/ml 6.8 ug/ml 19F 5.4 g/ml 2.6 ugml 0.0 ug/ml 19F 6.1 ug/ml 6.2 ugml 6.0 ug/ml 23F 4.5 ug/ml 2.8 ua/ml 0.9 ugml 23F 5.2 ug/ml 5.2 ug/ml 5.2 ug/ml La formulación de 13vPnC/Tween 80 fue ensayada adicionalmente con respecto a la estabilidad con esfuerzos cortantes elevados. En este experimento, se añadió una composición de 100 mL de 13vPnC (4,4 g/mL serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 23F y 8,8 pg/mL serotipo 6B, 5 mM tampón de succinato, 150 mM NaCl y 0,25 mg/mL AIP04) a tres botellas de vidrio de 250 mL que comprenden o bien el 0,0%, 0,01% o el 0,05% Tween™80. Las tres botellas fueron luego sometidas a torbellino durante treinta minutos (2-8°C) en un torbellinador ( Vortex-Genie® 2; Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY) y se creó una interfaz de aire-liquido al ajuste de máxima velocidad. Después de treinta minutos, se tomaron muestras de 10-30 mL de cada botella, diluyeron 1:2 en diluente de proteiná Array® 360 y se analizó la antigenicidad de los trece serotipos en un sistema Array® 360. Conforme se ve en la Tabla 2 que sigue, el 13vPnC formulado sin Tween™80 (0,0%) presentó en promedio una disminución del 20% en antigenicidad después de someterse a torbellino. El 13vPnC formulado con el 0,01% Tween™80 presentó una disminución de antigenicidad que oscila del 2-10% (promedio 8%) y el 13vPnC formulado con el 0,05% Tween™80 presentó una disminución de antigenicidad que oscila del 0-8% (promedio 3%) . De este modo, los datos presentados en la Tabla 2 demuestran que el 13vPnC formulado o bien con el 0,01% ó 0,055 Tween™80 fueron significativamente estabilizados contra esfuerzos cortantes, con relación al 13vPnC formulado en la ausencia de Tween™80.
TABLA 2 EFECTO ESTABILIZADOR DE TWEEN™80 CONTRA ESFUERZOS CORTANTES EJEMPLO 2 FORMULACIONES QUE COMPRENDEN SURFACTANTE ESTABILIZAN Y PREVIENEN LA AGREGACIÓN DE PEPTIDASA C5A DE ESTREPTOCOCO La peptidasa C5a de estreptococo (SCP) utilizada en este ejemplo fue expresada y purificada de la manera siguiente. Se expresó la SCP recombinantemente en E. coli utilizando un sistema inducible de arabinosa. Se siguieron los protocolos estándares de fermentación para E. coli utilizando medio definido libre de animal y subsiguiente lisis celular. Se purificó la SCP recombinante a partir de la fracción soluble del lisato celular mediante saturación hasta el 60% (aproximadamente 3 M) de sulfato de amonio mientras se agita durante 12-24 horas. El lisato saturado fue centrifugado, el supernatante retenido y cargado en una columna de interacción hidrofóbica de Se-pharosa fenilo. Luego se levigó el material aglutinado con 1 M sulfato de amonio, 20mM Tris-Cl, pH 7,5, concentró y diafiltró contra PBS , pH 7,4. La SCP recombinante purificado (rSCP) fue diluida hasta -10 mg/mL con PBS, pH 7,4 y pasada a través de un filtro Posidyne para remover la endotoxina, seguido de una filtración final (0,2 mM) con respecto a esterilidad y se almacenó congelada (-252C). La SCP purificada (55 yg/mL) fue luego formulada con el 0,025% Tween™80 o sin Tween™80 (0,0%) en los siguientes tampones : 5 mM tampón de succinato a pH 6 , 0 , 10 mM tampón de fosfato a pH 7,0, 10 mM tampón de fosfato a 7,4 ó 10 mM tampón Tris a pH 7,5 y se llevó en jeringas BD Hypak SCF™. Las jeringas fueron luego colocadas en un agitador orbital horizontal a 2-8aC, agitada a 180 cpm durante 2 días y la concentración de proteína SCP determinada mediante el ensayo Lowry modificado. Conforme se muestra en las Figs. 1A-1B, la estabilidad de la SCP fue enormemente mejorada cuando se formuló con Tween™80. por ejemplo, después de dos días en el agitador orbital, la SCP formulada sin Tween 80 (FIG. 1A) demostró una disminución significativa (verbigracia, más del 90%) en la concentración de SCP de cada uno de los tampones ensayados. Sin embargo, conforme se muestra en la Fig. IB, la adición de 0,025% Tween™80 a las formulaciones tampones de SCP, antes de colocarse en el agitador orbital durante dos días, inhibió totalmente la pérdida de SCP que fue observada en la FIG. 1A.
La estabilidad en almacenamiento de la formulación de SCP/Tween™80 (0,025%) también fue analizada a 25°C y 37°C durante ocho semanas y seis semanas, respectivamente (datos no mostrados) . En resumen, la SCP (200 vq) fue formulada o bien en tampón de succinato o tampón de fosfato de la manera siguiente: tampón de succinato (5 mM, pH 6,0) o tampón de fosfato (15 mM, pH 7,4), 0,9% NaCl y el 0,025% Tween™80. La estabilidad de las formulaciones de SCP/Tween™80 fue analizada mediante tamaño-exclusión-HPLC, ensayo de proteina total Lowry modificado e inspección visual con respecto a la precipitación. Se observó en este estudio que las formulaciones de SCP/Tween™80 (o bien tampón) fueron totalmente estables a 25°C y 37°C durante todo el estudio de estabilidad (es decir, hasta ochos emanas y seis semanas, respectivamente) . EJEMPLO 3 LA INFLUENCIA DE RECIPIENTES SILICONAOOS SOBRE LA ESTABILIDAD DE 13vPnC Los experimentos anteriores indicaron (datos no mostrados) que las composiciones inmunogénicas de 13vPnC se precipitaron y/o agregaron cuando se llenaron en jeringas de vidrio de borosilato (dosis única) Becton Dickinson® (BD) Hypak Tipo 1 tratadas con silicona Dow Corning® grado médico DC 360 y tapadas con tapones (clorbutilo) libres de látex West 4432/50 y protector de aguja EZ West 7025/65 (Mezcla de Isopreno Bromobutilo Sintético; West Pharmaceutical®, Lionville, PA) . En estos experimentos, se formuló el 13vPnC en 5 mM tampón de succinato que contiene el 0,85% NaCl y 4,4 ^g/ l de S. pneumoniae serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F y 8,8 pg/ml de serotipo 6B S. pneumoniae, con y sin 0.25 mg/mL de fosfato de aluminio como un adyuvante. Se observó que, en la ausencia de AIPO4, los particulados de 13vPnC fueron fácilmente observables por cuanto en la presencia de AIP04, los particulados de 13vPnC fueron significativamente disminuidos y más difíciles de detectarse . En el presente ejemplo, se examinó una serie de componentes de recipiente y cierre (es decir, recipientes) para identificar cuáles componentes estaban induciendo o contribuyendo con la formación de particulado de 13vPnC. Los recipientes ensayados comprendieron jeringas, tapones y frascos y se enumeran en la Tabla 3. Los tapones BD y West enumerados en la Tabla 3 fueron siliconados, utilizando o bien el proceso Huber o Jar. El proceso Huber de siliconación es más controlado y rindió 30 a 60 µq/c 2 de silicona en la superficie del tapón, mientras el proceso Jar de siliconación resultó en 150 a 300 g/cm2 de silicona en la superficie del tapón. En base a los cálculos teóricos, se expone cerca del 15% del área superficial del tapón al producto en la jeringa, sugiriendo que para el proceso Huber y Har entre 4,5 a 9 g y 22,5 a 45 µg de silicona es extraible de los tapones, respectivamente . Materiales La silicona fue Fluido Médico Dow Corning® 360 1000 centistokes (lote No. 0001846266) . Se formuló el 7vPnC en 5 mM tampón de succinato contentivo del 0,85% NaCl y 4,4 µg/ml de serotipos 4, 9, 14, 18C, 19F y 23F S. pneumoniae y 8,8 pg/ml de serotipo 6B S. pneumoniae, con y sin 0,25 mg/ml de fosfato de aluminio. Se formuló el 13vPnC en 5 mM de tampón de succinato contentivo del 0,85% NaCl y 4,4 g/ml de serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F y 8,8 µg/ml de serotipo 6B S. pneumoniae, con y sin 0,25 mg/ml de fosfato de aluminio. Se formuló el serotipo S. pneumoniae monovalente (5 mM de tampón de succinato contentivo del 0.85% NaCl, sin fosfato de aluminio) a una concentración de 61 µg/ml para simular la concentración de sacárido total de las formulaciones de 13vPnC. Métodos Se formularon el 7vPnC y 13vPnC de la forma descrita anteriormente y se añadieron 35 mi de una formulación dada a una botella clara de 250 mi Nalgene®. A cada botella Nalgene®, se añadieron los componentes de los recipientes enumerados en la Tabla 3. Las botellas Nalgene® fueron luego colocadas en un Agitador de Órbita Labline® y remolinadas durante la noche a 50 rpm. Los resultados se resumen en la Tabla 3. Apariencia Visual. Las botellas Nalgene®, cada una contentiva de los componentes de recipiente, fueron mantenidas a una luz de fluorescencia en el laboratorio. Un rayo de luz (efecto Tindel) que pasa por las muestras permitió la detección de particulados. Ensayo de Proteína. La proteína total y proteína aglutinadas con el aluminio fue determinada midiendo la concentración de proteína total en la composición inmunogénica formulada y la proteína asociada con la pastilla de aluminio (respectivamente) una alícuota de la composición inmunogénica fue centrifugada y la pastilla fue resuspendida en salina) . Se realizaron ensayos utilizando el ensayo de proteína Pierce Modified Lowry (catálogo #23240) con albúmina de suero bovino como un estándar. RESULTADOS En la primera serie de experimentos, se formularon las composiciones inmunogénicas sin AIP04 y expusieron a una serie de recipientes enumerados a continuación en la Tabla 3. Resultó claramente evidente de los datos (Tabla 3) que los componentes de recipientes que fueron tratados con aceite de silicona indujo la formación de partículas blancas. En contraste, no se detectaron particulados en la presencia de los tapones Daikyo® no-siliconados (Daikyo Seiko, Ltd., Japón) y frascos Schott (Schott North America Inc., Lebanon, PA) .
TABLA 3 EFECTO DE DIFERENTES COMPONENTES DE LOS RECIPIENTES SOBRE 13vPnC FORMULADO SIN AIP04 Componentes de los Número de Apariencia Recipientes Componentes de (Inspección RecipienVisual) tes Añadidos Control-13vPnC sin Ninguno Sin AIP04 Particulado Tapones BD Hypak BSCF 1-3 10 Particulados mi 4432/50 Grey Si W D Tapones Procesados BD 10 Particulados Hypak 1-3 mi 3332/59 Grey Si Huber Tapones West 890 Listos 10 Particulados para Esterilizarse Se seleccionó el serotipo 6B S. pneumoniae monovalente como un modelo para el 13vPnC y se formuló a 61,6 g/ml (sin AIP04) para simular la concentración d sacárido total en la formulación 13vPnC. Se añadió silicona (Fluido Médico Dow Corning 360) a alícuotas del monovalente 6B formulado, oscilando de 2 ppm a 100 ppm. Las mezclas fueron colocadas en un Agitador de Órbita Labline® durante 2 horas a 50 rpm. Conforme se indica a continuación en la Tabla 4, se observaron particulados blancos como fibras a todas las concentraciones de silicona (Si).
TABLA 4 EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SILICONA SOBRE LA FORMACIÓN PARTICULADOS Concentración de Silicona Apariencia (Inspección Visual 2 ppm (1 µ? de Si en 500 mL Particulados blancos como de fibra La Formulación 5 ppm (2,5 µ? de Si en 500 Particulados blancos como mL de fibra La Formulación 10 ppm (5 µ? de Si en 500 Particulados blancos como mL de fibra La Formulación 15 ppm (7,5 µ? de Si en 500 Particulados blancos como mL de fibra La Formulación 20 ppm (10 µ? de Si en 599 Particulados blancos como mL de fibra La Formulación) 100 ppm (2 µ? de Si en 20 Particulados blancos como mL de fibra La Formulación) También se examinó la cantidad de silicona en las formulaciones de 13vPnC (sin AIP04) . Se determinó la concentración de silicona mediante Espectroscopia de Emisión de Plasma DC (datos no mostrados) . En este método, se combinó el contenido de 25 jeringas y extrajo con dos porciones de 50 mi de mezcla de ciclohexano/isopropilo . Los extractos fueron combinados y evaporados. El residuo fue solubilizado y ensayado según los métodos existente para la determinación de silicona en tapones de caucho. Los resultados indicaron que entre 15,8 a 19,0 g de silicona es extraible de cada jeringa. Esta cantidad corresponde del 2,7% al 3,3% de silicona . En una serie por separado de experimentos, en los cuales se formuló el 13vPnC en la presencia de AIP04 y se sometió al mismo recipiente indicado en la Tabla 3, se elucidó que la silicona y la proteina "libre" (13vPnC) en la solución fue responsable de la formación de los particulados (datos no mostrados) . El análisis FTIR de los particulados también indicó que los particulados consistieron en proteina y silicona (datos no mostrados) . Se determinó en estos experimentos que aproximadamente el 85% del 13vPnC se aglutina con el AIP04, donde el restante 15% resultó ser 13vPnC libre (no aglutinando al AIP04) en solución. En contraste, se observó que el 7vPnC formulado con AIP04 se aglutinó al 100% con el AIPO4 (datos no mostrados) .
Para elucidar el efecto de la proteina-polisacárido libre sobre la formación de los particulados, se hicieron alícuotas con 25 mi tanto de 7vPnC como 13vPnC y transfirieron a un tubo centrífugo de 50 mi. Las muestras fueron centrifugadas durante 10 minutos a 3.000 rpm y el supernatante fue extraído cuidadosamente y transferido a una botella Nalgene®. Se añadieron diez tapones siliconados (Tapones 4432) a cada botella y se colocaron en agitador orbital a 50 rpm. Previa inspección visual cuidadosa, se observó que el supernatante 7vPnC no presentó formación de particulados, quedando así claro e incoloro. Sin embargo, el supernatante 13vPnC comenzó a mostrar bajos niveles de particulado en la cuarta hora de observación (datos no mostrados). Este resultado sugirió que la proteína-polisacárido libre en solución, junto con la silicona, es responsable de la formación de los particulados. Para elucidar adicionalmente la contribución de la proteina-polisacárido libre en solución a la formación de particulados, se seleccionaron serotipos 4 y 6B S. pneumoniae monovalentes por su elevada y baja aglutinación al aluminio, respectivamente. Estos dos monovalentes fueron formulados a una concentración de proteína que oscila de 25 g/ml a 200 g/ml en la ausencia y presencia de AIP04. Se colocaron diez tapones siliconados (tapones 4432) en cada formulación, los cuales fueron luego colocados en el agitador de órbita a 50 rpm. Conforme se indica a continuación en la Tabla 5, se observaron los particulados blancos como fibra para ambos serotipos monovalentes a todas las concentraciones de proteina en la ausencia de AIP04. Sin embargo, en la presencia de AIPO4, se detectaron particulados a concentraciones más bajas para el serotipo 4 (100 g/ml) versus serotipo 6B (200 g/ml), datos no mostrados.
TABLA 5 EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNA SOBRE LA FORMACIÓN DE PARTICULADOS Apariencia (Inspección Visual) Sin AIPO4 Con AIPO4 25 g/mL de 6B Particulados blancos Sin como fibra Particulados 50 pg/mL d 6B Particulados blancos Sin como fibra particulados 75 µg/m de 6B Particulados blancos Sin como fibra Particulados 100 g/mL de 6B Particulados blancos Sin como fibra Particulados 200 g/mL de 6B Particulados blancos Particulados como fibra blancos como fibra 25 pg/mL del Tipo Particulados blancos Sin 4 como fibra Particulados 50 pg/mL del Tipo Particulados blancos Sin 4 como fibra Particulados 75 pg/mL del Tipo Particulados blancos Sin 4 como fibra Particulados 100 pg/mL del Particulados blancos Particulados Tipo 4 como fibra blancos como fibra 200 ug/mL del Particulados blancos Particulados Tipo 4 como fibra blancos como fibra EJEMPLO 4 LOS ADYUVANTES DE ALUMINIO INHIBEN LA FORMACIÓN DE PARTICULADOS 13vPnC EN LA PRESENCIA DE RECIPIENTES SILICONADOS Conforme se indica anteriormente en el Ejemplo 3, una composición inmunogénica 13vPnC es una formación liquida que comprende 4,4 pg/mL de serotipos 1, 3, 4, 5, 6a, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 23F y 8,8 S. pneumoniae y 8 pg/mL del tipo 6B en 5 mM de tampón de succinato (pH 5,8) y 0,85% NaCl, que también podrá formularse con o sin un adyuvante (verbigracia, un adyuvante de aluminio) . También podrá formularse el 13vPnC con o sin un adyuvante, tal como 0,25 mg de aluminio/ml fosfato de aluminio (AIP04) . Se observó en el Ejemplo 3 que el 13vPnC formulado sin AIP04 y llenado en jeringas BD Hypak SCF™ (tapadas con émbolos Hypak) no aprobaron la inspección visual debido a la observación de particulados, donde estudios adicionales revelaron que los particulados fueron en parte como resultado de interacciones de proteina-polisa-cárido con la silicona. En el siguiente ejemplo, se evaluaron jeringas (y émbolos) de varios vendedores con formulaciones de 13vPnC, donde se simularon por medio de agitación condiciones de envió y manejo (descritas a continuación).
Materiales Se formuló el 13vPnC en 5 mM tampón de succinato contentivo del 0,85% NaCl y 4,4 µ?/ml de serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F y 8,8 ug/ml de serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F S. pneumoniae y 8,8 g/ml de serotipo 6B S. pneumoniae, con y sin 0,25 mg/ml de fosfato de aluminio. Los recipientes ensayados se enumeran a continuación en la Tabla 6.
TABLA 6 RECIPIENTES Recipientes Descripción 1 Jeringas Vetter Formato a granel Tipo vidrio sin tratar 1 mi de largo 2 Jeringas Schott TopPac® Jeringas plásticas 3 Jeringas BD Estufadas 0,1 mg silicona/ Tipo 1 vidrio sin tratar Tambor 4 Jeringas BD Estufadas 0,04 mg silicona/ Tipo 1 vidrio sin tratar Tambor 5 Jeringas con viscosidad Jeringas de 2,25 mi BD Tipo 1 vidrio sin tratar 12599 cst silicona 6 Jeringas con viscosidad Elevada Jeringas de 1,0 mi BD Tipo 1 vidrio sin tratar 12500 cst silicona 7 Jeringas BünderGlas, PS2 0,056 mg silicona/ Tipo 1 vidrio sin tratar Tambor 8 Jeringas BünderGlas, PS4 0,14 mg silicona/ Tipo 1 vidrio sin tratar Tambor 1 Émbolos West 4023/50 Flurotec® Embolos Flurotec® B2-40 2 Émbolos West 4023/50 Flurotec® Embolos Flurotec® B2-40 1 13vPnC con ???04 en jeringas BD Control positivo, Hypak elevado con émbolos West 4432 listos contenido de para se silicona usados y protectores de tapas 7025/65 EZ 2 13vPnC con AIPO4 en jeringas sin Control negativo, silicona con émbolos West sin 4023/50 tratamiento con Flurotec® B2-40 silicona Métodos Formulación y Procedimiento de Llenado. A continuación se enumera en la Tabla 7 la receta para una formulación de 2 litros de 13vPnC. En resumen, primero se añadió el 0,85% salina a un cubilete de vidrio, seguido de 5 mM tampón de succinato (pH 5,8) y luego en secuencia cada uno de los conjugados de serotipos S. pneumoniae . La formulación fue luego mezclada suavemente en una placa agitadora y filtrada en una unidad de filtro de 0,22 m Millipore®. Para la formulación que comprende AIP04, el AIP04 (0,25 mg/ml de concentración final) fue luego añadido y se mezcló la formulación suavemente. Luego se llenaron las jeringas de prueba (0,58 ml/jeringa) y taparon con los émbolos. Simulación de Envió con Agitación. Se utilizó un torbellinador Digital Mult itubefirma VWR® (Catálogo No. 14005-826) para agitar las muestra. Las jeringas llenadas con 13vPnC fueron colocadas horizontalmente y fijadas por dos placas de soporte del torbellinador. Se mantuvieron muestras en la posición horizontal y agitaron a 500 rpm con modo de pausa a 2-8°C durante veinticuatro horas. Nefelometría. Se determinaron las ant igenicidades especificas del serotipo mediante en ensayo de nefelometría de ritmo utilizando anticuerpos específicos del tipo. Para el 13vPnC con AIPO4, se solubilizó el fosfato de aluminio añadiendo 1N NaOH. La solución fue inmediatamente neutralizada añadiendo M ácido cítrico. Para el 13vPnC sin AIPO4, no se realizaron procedimientos de solubilización y neutralización. El ensayo mide la tasa de cambio de la intensidad de dispersión de la luz derivada del complejo de anticuerpo-antigeno formado en la muestra utilizando nefelometro Beckman Array 360.
TABLA 7 TABLA DE FORMULACIÓN DEL 13vPnC Componente Tamaño Conc . Conc . 13vPnC 13vPnC Lote Lote Requer . con sin (L) (ng/mL) (pg/mL) AIPO4 AIPO4 Volumen Volumen (rtiL) (mL) serotipo 1 2.000 0, 506 4,4 17, 39 17, 39 serotipo 3 2.000 0.256 4,4 34, 38 34, 38 serotipo 4 2..000 0.530 4,4 16, 60 16, 60 serotipo 5 2.000 0,515 4,4 17,09 17, 09 serotipo 6A 2.000 0,519 4,4 16, 96 16, 96 serotipo 6B 2.000 9,489 8,8 35, 99 35, 99 serotipo 7F 2.000 0, 500 4,4 17, 60 17, 60 serotipo 9V 2.000 0, 521 4,4 16,89 16,89 serotipo 14 2.000 0, 518 4,4 16, 99 16, 99 serotipo 18C 2.000 0, 509 4,4 17,29 17, 29 serotipo 19A 2.000 0,511 4,4 17, 22 17, 22 serotipo 19F 2.000 0, 520 4,4 16, 92 16, 92 serotipo 23F 2.000 0,511 4,4 17, 22 17, 22 Tampón de 2.000 50, 0 5000 200, 0 200,0 Succinato en 0.85% Salina, pH 5,8 AIP04 2.000 3,250 250 153, 85 ND Salina 2.000 ND ND 1387, 62 1541,46 RESULTADOS En este estudio, las jeringas de diferentes vendedores, que tienen diferentes niveles de silicona (Tabla 6), fueron sometidas a condiciones de agitación controladas. La antigenicidad total de cada serotipo fue medida mediante ensayo de Nefelometría tanto para las muestras pre-agitación como postagitación. Se calculó la pérdida de antigenicidad siguiente a la agitación (porcentaje) y se muestra en la FIG. 2 a FIGS. 7A-7B. Antes del estudio, se optimizaron las condiciones de agitación basadas en la pérdida de antigenicidad de los dos controles: (1) el control del peor caso (control positivo, elevado contenido de silicona; FIG. 2) y (2) el control del mejor caso (control negativo, sin silicona; FIG. 3). Las condiciones fueron luego optimizadas de tal modo que la pérdida de antigenicidad fue baja en el control positivo, pero detectable en el control negativo. Esto fue para asegurar que la adición no fuera ni demasiado débil para producir precipitación en las jeringas; ni demasiado fuerte de tal modo que la precipitación pudiese ser causada por factores distintos a la interacción de la silicona (verbigracia, mediante esfuerzos cortantes) . De este modo, se seleccionó la agitación a 500 rpm (modo de pausa) durante veinticuatro horas como la condición de agitación más adecuada, mientras se utilizó una temperatura de 2-8sC y una posición horizontal para similar las condiciones de envió y manejo del producto en tiempo real. De la siguiente manera se resumen los resultados del estudio: Las mayores pérdidas de antigenicidad del 13vPnC formulado con AIP04 ocurrieron en las jeringas con los mayores de niveles de silicona (datos no mostrados) . Por ejemplo, de las jeringas enumeradas en la Tabla 6, la jeringa BD Hypak (control 1), la jeringa BD Estufada (jeringa 3; 0,1 mg de silicona) , la jeringa de elevada viscosidad BD (jeringa 5) y la jeringa BünderGlas PS4 (jeringa 8, 0,14 mg de silicona) , cada una tenia uno o más de los serotipos de 13vPnC con más del 10% de pérdida de antigenicidad. Las pérdidas de antigenicidad más pequeñas del 13vPnC formulado con AIPO4 ocurrieron en las jeringas con los niveles de silicona más bajos. Por ejemplo, las jeringas Vetter (FIG. 4) y las jeringas de plástico Schott TopPac (FIG. 5) fueron las más similares a las jeringas sin silicona (FIG. 2), demostrando ambas menos pérdidas de antigenicidad para el 13vPnC formulado con AIP04. Se analizó la influencia del fosfato de aluminio sobre la estabilización del 13vPnC y la inhibición de la formación de particulado en la presencia de jeringas siliconadas en experimentos utilizando 13vPnC formulado con y sin 0,25 mg/ml AIP04, donde las jeringas utilizadas fueron las jeringas Estufadas de bajo contenido de silicona (jeringa 4 en la Tabla 6) y las jeringas PS2 de bajo contenido de silicona BünderGlas (jeringa 7 en la Tabla 6) . Las jeringas Estufadas de bajo contenido de silicona BD (0,04 mg de silicona/tambo) típicamente presentaron menos del 10% de pérdida de antigenicidad para los serotipos 13vPnC formulados con AIP04 (FIG. 6A) , por cuanto la pérdida de antigenicidad para los serotipos 13vPnC formulados sin AIPO4 (FIG. 6B) presentaron pérdidas de antigenicidad que oscilan del 5% (serotipo 1) hasta aproximadamente el 59% (serotipo 23F) . Las jeringas PS2 de bajo contenido de silicona BünderGlas (0,056 mg de silicona/tambor ) presentaron menos del 5-8% de pérdida de antigenicidad (dependiendo del serotipo) para el 13vPnC formulado con AIP04 (FIG. 7A) , por cuanto la pérdida de antigenicidad para los serotipos 13vPnC formulado sin AIPO4 (FIG. 7B) presentó pérdidas de antigenicidad que oscilan aproximadamente del 5% aproximadamente al 30% (dependiendo del serotipo) . Así, estos datos tomados juntos indican que: (1) la pérdida de antigenicidad del 13vPnC fue más grande en las jeringas con los niveles más grandes de silicona y (2) el 13vPnC formulado sin AIPO4 sostuvo las pérdidas de antigenicidad superiores al 13vPnC con AIPO4 en todas las jeringas ensayadas.
EJEMPLO 5 LAS FORMULACIONES QUE COMPRENDEN SURFACTANTE OPTIMIZAN LA AGLUTINACIÓN DE LAS PROTEÍNAS ANTIGENICAS DE MENINGOCOCO CON LOS ADYUVANTES DE SAL DE ALUMINIO La proteina de N. meningitidis 2086 lipidado recombinante (rLP2086) utilizada en este ejemplo fue expresada y purificada de la manera siguiente. Se expresó rLP2086 recombinantmente en E. coli utilizando una secuencia líder nativa. Se siguieron los protocolos de fermentación estándares para E. coli utilizando medio definido libre de animales y subsiguiente lisis celular. Se purificó la proteína de N. meningitidis 2086 lipidado recombinante a partir de la pastilla de membrana con 50 mM Tris-HCl/5mM EDTA/1% sarcosilo pH 8. Este extracto de sarcosilo fue ajustado hasta el 1% Zwittergent 3-14 (Z3-14) y dializó dos veces contra un exceso de 30 veces de 50mM Tris-HCl/5mM EDTA/1% Z3-14. Se precipitó el extracto de rLP2086 dializado con el 90% etanol para remover el sarcosilo restante y se solubilizó con 50mM Tris-HCl/5mM EDTA/1% Z3-14 pH 8. Se removió el material insoluble mediante centrifugación, se pasó el supernatante por encima de una columna de cromatografía por intercambio de aniones y se recolectó la rLP2086 en la fracción sin aglutinarse. El material sin aglutinarse fue dializado dos veces contra un exceso de 30 veces de 25m NaAc/1% Z3-14 pH 4,5 y se pasó por encima de una columna de cromatografía por intercambio de cationes. Se levigó la rLP2086 con un gradiente de 0-0, 3M NACL y se almacenó congelada (-25°C) . La rLP2086 purificada fue luego formulada con 150 mM NaCl, 0,020% Tween™80, 0, 25 mg Al/mL de AIP04 y en los siguientes tampones: 10 mM de tampón de fosfato a pH 7 , 0 y 5 mM de tampón de succinato a pH 6,0. La Tabla 8 compara el porcentaje de aglutinante de la proteína con el adyuvante de AIP0 .
TABLA 8 AGLUTINACIÓN DE LA rLP2086 CON EL ADYUVANTE REFERENCIAS Baldwin, "Contaminat ion of insulin by silicone oil: A potential hazard of plástic insulin syringes", Diabet . Med., 5:789-790, 1988.
Bartzoka, Brook y McDormott, " Protein-Silicone Interactions at Liquid-Liquid Interfaces." In K.L. Mittal and P.
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Sun y colaboradores, "Protein Denaturation Induced by Cyclic Silicone", Biomaterials 18:1593-1597, 1998. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (40)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una formulación caracterizada porque estabiliza un conjugado de polisacárido-proteina , la formulación comprendiendo (I) una solución salina tamponada de pH, donde el tampón tiene un pKa aproximadamente de 3,5 aproximadamente a 7,5, (ii) un surfactante y (iii) uno o más conjugados de polisacárido-proteina.
  2. 2. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la formulación del conjugado de polisacárido-proteina va comprendida en un recipiente seleccionado a partir de uno o más del grupo que consiste en un frasco, tapón de frasco, cierre de frasco, cierre de vidrio, vidrio de caucho, cierre plástico, una jeringa, tapón de jeringa, émbolo de jeringa, un frasco, cubilete, cilindro graduado, fermentador, biorreactor, tubería, tubo, bolsa, jarra, ampolla, cartucho y pluma desechable.
  3. 3. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque se silicona el recipiente.
  4. 4. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el tampón es succinato a una concentración final de 1 mM a 10 mM y pH 5,8 a 6,0.
  5. 5. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el surfactante es polisorbato 80.
  6. 6. La formulación de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la concentración final del polisorbato 80 en la formulación es por lo menos del 0,001% al 10% de polisorbato 80 peso/volumen de la formulación.
  7. 7. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el conjugado de polisacárido-proteina comprende uno o más de los polisacáridos de neumococo.
  8. 8. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende además uno o más polisacáridos de meningococo, una o más proteínas antigénicas de meningococo o una combinación de los mismos.
  9. 9. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende además uno o más polisacáridos de estreptococo, una o más proteínas antigénicas de estreptococo o una combinación de los mismos.
  10. 10. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la formulación del conjugado de polisacárido-proteina es una formulación de conjugado de neumococo de valencia 7 (7vPnC) que comprende un polisacárido serotipo 4 S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRMi7, un polisacárido serotipo 6B S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRMi7, un polisacárido serotipo 9V S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRMi7, un polisacárido serotipo 14 conjugado con un polipéptido CRM17, un polisacárido serotipo 18C S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRM17 , un polisacárido serotipo 19F S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRM17 y un polisacárido serotipo 23F S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRM17 .
  11. 11. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la formulación del conjugado de polisacárido-proteina es una formulación de conjugado de neumococo (13vPnC) que comprende polisacárido serotipo 4 S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRM17 , un polisacárido serotipo 6B S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRM17 , un polisacárido serotipo 9V S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRM17 , un polisacárido serotipo 14 S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRM17 , un polisacárido serotipo 18C S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRM17 , un polisacárido serotipo 19F S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRM17 , un polisacárido serotipo 23F S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRM17 , un polisacárido serotipo 1 S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRM17 , un polisacárido serotipo 3 S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRM17 , un polisacárido serotipo 5 S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRM17 , un polisacárido serotipo 6A S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRM17 , un polisacárido serotipo 7F S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRM17 y un polisacárido serotipo 19A S. pneumoniae conjugado con un polipéptido CRM17 .
  12. 12. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la formulación comprende además un adyuvante .
  13. 13. La formulación de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el adyuvante es fosfato de aluminio.
  14. 14. Una formulación caracterizada porque estabiliza una composición de peptidasa C5a de estreptococo (SCP) , la formulación comprendiendo (i) una solución salina tamponada, donde el tampón tiene un pKa aproximadamente de 3,5 aproximadamente a 6,5, (ii) un surfactante y (iii) una peptidasa C5a de estreptococo.
  15. 15. La formulación de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la formulación SCP va comprendida en un recipiente seleccionado de uno o más del grupo que consiste en un frasco, tapón de frasco, cierre de frasco, cierre de vidrio, vidrio de caucho, cierre plástico, una jeringa, tapón de jeringa, émbolo de jeringa, un frasco, cubilete, cilindro graduado, termentador, biorreactor, tubería, tubo, bolsa, jarra, ampolla, cartucho y pluma desechable.
  16. 16. La formulación de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el recipiente es siliconado.
  17. 17. La formulación de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el tampón es succinato a una concentración final de 1 mM a 10 mM y pH 5,8 a 6,0.
  18. 18. La formulación de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el surfactante es polisorbato 80.
  19. 19. La formulación de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque la concentración final del polisorbato 80 en la formulación es del 0,01% al 10% de polisorbato 80 peso/volumen de la formulación.
  20. 20. La formulación de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la composición SCP comprende además uno o más polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en un polipéptido de estreptococo, un polipéptido de neumococo, un polipéptido de meningococo y un polipéptido de estafilococo .
  21. 21. La formulación de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la composición comprende además uno o más polisacáridos seleccionados del grupo que consiste en un polisacárido de estreptococo, un polisacárido de neumococo, un polisacárido de meningococo y un polisacárido de estafilococo.
  22. 22. La formulación de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la formulación comprende además un adyuvante .
  23. 23. La formulación de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque el adyuvante es hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio o sulfato de aluminio.
  24. 24. Una formulación caracterizada porque inhibe la agregación inducida por silicona de un conjugado de polisacárido-proteina comprendido en un medio siliconado, la formulación comprendiendo (i) una solución salina tamponada de pH, donde el tampón tiene un pKa aproximadamente de 3,5 hasta aproximadamente 7,5, (ii) una sal de aluminio y (iii) uno o más conjugados de polisacárido-proteina.
  25. 25. La formulación de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el tampón es succinato a una concentración final de 1 mM a 10 mM y pH de 5,8 a 6,0.
  26. 26. La formulación de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque comprende además polisorbato 89 (Tween™80 ) , donde la concentración final del polisorbato 80 en la formulación es por lo menos del 0,01% al 10% de polisorbato 80 peso/volumen de la formulación.
  27. 27. La formulación de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el conjugado de polisacárido-proteina comprende uno o más polisacáridos de neumococo.
  28. 28. La formulación de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque comprende además uno o más polisacáridos de meningococo, una o más proteínas antigénicas de meningococo o una combinación de los mismos.
  29. 29. La formulación de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque comprende además uno o más polisacáridos, una o más proteínas antigénicas de estreptococo o una combinación de los mismos.
  30. 30. La formulación de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la formulación comprende además un adyuvante .
  31. 31. Una formulación caracterizada porque inhibe la agregación inducida por silicona de una composición de peptidasa C5a de estreptococo (SCP) comprendida en un recipiente siliconado, la formulación comprendiendo (i) una solución salina tamponada de pH, donde el tampón tiene un pKa a de 3,5 aproximadamente a 6,5, (ii) una sal de aluminio y (iii) una peptidasa C5a de estreptococo.
  32. 32. La formulación de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque el tampón es succinato a una concentración final de 1 mM a 10 mM y pH 5,8 a 6,0.
  33. 33. La formulación de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque comprende además polisorbato 80 (Tween™80) , donde la concentración final del polisorbato 80 en la formulación es por lo menos del 0,01% al 10% de polisorbato 80 peso/volumen de la formulación.
  34. 34. La formulación de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque la composición SCP comprende además uno o más polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en un polipéptido de estreptococo, un polipéptido de neumococo, un polipéptido de meningococo y un polipéptido de estafilococo .
  35. 35. La formulación de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque la composición SCP comprende además uno o más polisacáridos seleccionados del grupo que consiste en un polisacárido de estreptococo, un polisacárido de neumococo, un polisacárido de meningococo y un polisacárido de estafilococo.
  36. 36. La formulación de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque la formulación comprende además un adyuvante .
  37. 37. Una formulación caracterizada porque estabiliza la composición de proteina de N. meningitidis 2086, la formulación comprendiendo (i) una solución salina tamponada de pH, donde el tampón tiene un pKa aproximadamente de 3,5 hasta aproximadamente 7,5, (ii) un surfactante y (iii) una proteina de N. meningitidis 2086.
  38. 38. La formulación de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque el surfactante es polisorbato 80.
  39. 39. La formulación de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque comprende además un adyuvante de sal de aluminio.
  40. 40. Una formulación caracterizada porque inhibe la agregación inducida por silicona de una composición de proteina de N. meningitidis 2086 comprendida en un recipiente siliconado, la formulación comprendiendo (i) una solución salina tamponada de pH, donde el tampón tiene un pKa aproximadamente de 3,5 aproximadamente a 7,5, (ii) una sal de aluminio y (iii) una proteina de N. meningitidis 2086.
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