KR102093269B1 - 면역원성 조성물을 안정화시키고 이의 침전을 억제하는 신규 제형 - Google Patents

면역원성 조성물을 안정화시키고 이의 침전을 억제하는 신규 제형 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다당류-단백질 접합체 및 단백질 면역원과 같은 면역원성 조성물의 안정성을 향상시키기 위한 당업계의 계속되는 요구를 다룬 것이다. 본 발명은 대체로 면역원성 조성물을 안정화시키고 이의 침전을 억제하는 신규 제형에 관한 것이다. 보다 특히, 이하 기술되는 본 발명은 발효조, 생물반응기, 바이알, 플라스크, 백(bag), 주사기, 고무 마개, 튜브 등과 같은 용기 수단에서 가공, 개발, 제형화, 제조 및/또는 보관되는 면역원성 조성물을 안정화시키고 이의 미립자 형성(예: 응집, 침전)을 억제하는 제형에 대한 당업계의 요구를 다룬 것이다.

Description

면역원성 조성물을 안정화시키고 이의 침전을 억제하는 신규 제형{Novel formulations which stabilize and inhibit precipitation of immunogenic compositions}
본 발명은 면역학, 세균학, 백신 제형, 단백질 안정성 및 공정 개발 분야에 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 면역원성 조성물의 침전을 억제하는 신규 제형에 관한 것이다.
면역원성 조성물(예: 단백질 면역원, 다당류-단백질 접합체)의 안정성 개선이 필요하며 매우 희망하는 목표라는 것은 생물의약 분야에 공인된 사실이다. 예를 들어, 면역원성 조성물은 환자에게 투여될 때 신선하고 명확하며 전문적이어야 한다. 면역원성 조성물의 안정성 및/또는 물리적 외관, 예컨대 색 변화, 흐려짐 또는 불투명화 등의 임의의 변화는 환자나 소비자로 하여금 제품의 신뢰를 잃어버리게 한다. 더욱이, 많은 면역원성 제형들은 다회용량 용기에 분배되어 있기 때문에, 시간이 경과함에 따른 활성 성분(예: 다당류-단백질 접합체)의 용량 함유량의 균일성이 보장되어야 한다(예컨대, 혼탁한 용액은 불균일한 투여량 패턴을 유도할 수 있다). 또한, 면역원성 조성물은 "예상" 저장기간 동안 활성이어야 하며, 면역원성 조성물의 불활성 또는 다른 바람직하지 않은 형태(예: 응집물)로의 임의의 분해(breakdown)는 생성물의 총 농도를 저하시킨다.
여러 문헌의 보고들은 특정 면역원성 조성물(예: 단백질 면역원, 다당류-단백질 접합체)의 안정성이 적어도 부분적으로 특정 단백질 또는 담체 단백질에 의존적이라는 것을 시사했다(참조: Ho et al., 2001; Ho et al., 2002; Bolgiano et al., 2001). 예를 들면, 파상풍 톡소이드(TT) 또는 CRM197 담체 단백질에 접합된 수막구균 C(MenC) 다당류 및 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 타입 b(Hib) 다당류의 안정성 분석은 담체 단백질에 따라 상이한 안정성 프로필을 나타냈다(참조: Ho et al., 2001). 다른 연구(참조: Ho et al., 2001)에서는 다른 두 제조업체의 MenC-CRM197 접합체가 분석되었고(참조: Ho et al., 2001), 여기서 사용된 MenC-CRM197 접합체의 차이는 접합 화학 및 접합체 다당류의 길이이다(둘 모두 동일한 담체 단백질인 CRM197을 보유한다). 이 연구의 데이터는 또한 접합 화학(예: 직접적인 또는 화학적 스페이서 그룹을 통한 환원적 아민화), 접합 부위의 수, 다당류 쇄 길이, pH, 저장 완충액, 저장 온도(들) 및 동결/해동 사이클과 같은 요인들도 면역원성 조성물의 안정성에 영향을 미친다는 것을 보여주었다.
따라서, 면역원성 조성물용 제형 개발시, 제품의 안전성, 안정성, 건실성 및 비용 효율을 보장하기 위해서는 다수의 요인들이 고려되어야만 한다. 이러한 고려 사항으로는, 면역원성 조성물의 화학적 안정성(예: 당류의 가수분해, 다당류의 해중합, 단백질분해 또는 단백질의 단편화), 면역원성 조성물의 물리적/열적 안정성(예: 응집, 침전, 흡착), 면역원성 조성물과 용기/밀봉장치(closure) 시스템과의 적합성, 면역원성 조성물과 불활성 성분(예: 완충액, 염, 부형제, 동결방지제) 사이의 상호작용, 제조 공정, 투여형(예: 동결건조물, 액체), 운송, 보관 및 취급 중에 직면하는 환경 조건(예: 온도, 습도, 전단력) 및 제조부터 사용까지의 시간 길이 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
당업계에서는, 단백질 2차 및 3차 형태 변화를 유도하는 실리콘 오일이 특정 단백질 약제에서 관찰되는 응집/침전의 원인일 수 있음이 시사되어 있다(참조: Jones et al., 2005). 예를 들면, 1980년대의 여러 보고서들은 일회용 플라스틱 주사기로부터의 실리콘 오일의 방출이 사람 인슐린의 응집에 있어서 원인 인자인 것으로 관련시켰다(참조: Chantelau and Berger, 1985; Chantelau et al., 1986; Chantelau, 1989; Bernstein, 1987; Baldwin, 1988; Collier and Dawson, 1985). 찬텔라우(Chantelau) 등(1986)은 인슐린의 10회 용량 제제로부터 3회 이상의 인출(실리콘처리된 일회용 주사기를 이용하여) 후에, 바이알이 실리콘 오일 오염으로 인해 흐려지기 시작했고, 이로써 인슐린이 응집 및 비활성화된다는 것을 관찰했다(참조: Chantelau et al., 1986). 역설적으로, 실리콘 오일은 고무 플런저(plunger)를 윤활시키고 이 플런저가 주사기 몸통 아래로 용이하게 이동하도록 하는 작용을 하는 바, 플라스틱 주사기의 필수 구성요소이다(즉, 실리콘 오일은 제형의 주사능을 향상시킨다).
더욱이, 실리콘 오일의 사용은 주사기에만 국한되지 않고, 단백질 흡착을 최소화하기 위해 유리 바이알의 코팅제로서, 충전 과정 동안 고무 마개의 응괴 방지를 위한 윤활제로서, 유리와 탄성중합체 밀봉장치의 가공능/절삭성에 중요한 윤활제로서, 그리고 바이알 고무 마개의 주사바늘 침투를 용이하게 하는 윤활제로도 사용된다. 또한, 주사기, 유리 바이알, 고무 마개 등의 실리콘처리는 충분히 제어되지도 않고 표준화된 방법도 없으며, 로트(lot)마다 실리콘 오일 함유량의 가변성 정도가 높다.
이에, 당업계에서는 면역원성 조성물의 안정성을 향상시키고 이의 침전을 억제하는 제형의 필요성이 계속되고 있다.
본 발명은 대체로 면역원성 조성물을 안정화시키고 이의 침전을 억제하는 신규 제형에 관한 것이다. 더 상세하게는, 특정 양태로 본 발명은 용기 수단에 포함된 면역원성 조성물의 침전을 억제하는 신규 제형에 관한 것이다. 구체적인 한가지 양태에 따르면, 본 발명은 실리콘 오일 상호작용, 전단력, 운송 동요 등에 대하여 면역원성 조성물을 안정화시키는 신규 제형에 관한 것이다.
따라서, 특정 양태의 본 발명은 다당류-단백질 접합체를 안정화시키는 제형으로서, (i) pKa가 약 3.5 내지 약 7.5인 완충액으로 pH 완충된 식염수 용액, (ii) 계면활성제 및 (iii) 하나 이상의 다당류-단백질 접합체를 포함하는 제형에 관한 것이다. 한가지 구체적인 양태에서, 다당류-단백질 접합체 제형은 용기 수단에 포함되어 있다. 특정 양태에 따르면, 용기 수단은 바이알, 바이알 마개(stopper), 바이알 밀봉장치, 유리 밀봉장치, 고무 밀봉장치, 플라스틱 밀봉장치, 주사기, 주사기 마개, 주사기 플런저, 플라스크, 비이커, 눈금실린더, 발효조, 생물반응기, 튜브, 파이프, 백(bag), 자(jar), 앰풀, 카트리지 및 일회용 펜으로 이루어진 그룹 중의 하나 이상 중에서 선택된다. 특정 양태에 따르면, 용기 수단은 실리콘처리된 것이다.
특정 양태에서, 제형의 pH 완충된 식염수 용액은 pH가 5.5 내지 7.5이다. 다른 양태에서, 완충액은 포스페이트, 석시네이트, 히스티딘 또는 시트레이트이다. 특정 양태에 따르면, 완충액은 최종 농도가 1mM 내지 10mM이고 pH가 5.8 내지 6.0인 석시네이트이다. 한가지 특정 양태에 따르면, 석시네이트 완충액의 최종 농도는 5mM 이다. 다른 양태에 따르면, pH 완충된 식염수 용액 중의 염은 염화마그네슘, 염화칼륨, 염화나트륨 또는 이들의 배합물을 포함한다. 한가지 특정 양태에 따르면, pH 완충된 식염수 용액의 염은 염화나트륨이다.
다른 양태에 따르면, 당해 제형의 계면활성제는 폴리소르베이트 20(Tween™20), 폴리소르베이트 40 (Tween™40), 폴리소르베이트 60 (Tween™60), 폴리소르베이트 65 (Tween™65), 폴리소르베이트 80(Tween™80), 폴리소르베이트 85 (Tween™85), Triton™ N-101 , Triton™ X-100, 옥스톡시놀 40, 노녹시놀-9, 트리에탄올아민, 트리에탄올아민 폴리펩타이드 올레에이트, 폴리옥시에틸렌-660 하이드록시스테아레이트(PEG-15, Solutol H15), 폴리옥시에틸렌-35-리신올레에이트(Cremophor EL™), 대두 레시틴 및 폴록사머로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 한가지 특정 양태에 따르면, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다. 다른 양태에 따르면, 제형 중에 폴리소르베이트 80의 최종 농도는 제형 용적당 적어도 0.01중량% 내지 10중량% 폴리소르베이트 80이다. 다른 양태에 따르면, 제형 중의 폴리소르베이트 80의 최종 농도는 제형 용적당 0.01중량% 폴리소르베이트 80이다. 또 다른 양태에 따르면, 제형 중의 폴리소르베이트 80의 최종 농도는 제형의 용적당 0.05중량% 폴리소르베이트 80이다. 다른 양태에 따르면, 제형 중의 폴리소르베이트 80의 최종 농도는 제형 용적당 0.1중량%의 폴리소르베이트 80이다. 다른 양태에 따르면, 제형 중의 폴리소르베이트 80의 최종 농도는 제형 용적당 1.0중량%의 폴리소르베이트 80이다. 또 다른 양태에 따르면, 제형 중의 폴리소르베이트 80의 최종 농도는 제형 용적당 10.0중량%의 폴리소르베이트 80이다.
다른 양태에 따르면, 다당류-단백질 접합체는 하나 이상의 폐렴구균 다당류를 포함한다. 특정 양태에서, 하나 이상의 폐렴구균 다당류는 에스.뉴모니에(S. pneumoniae) 혈청형 4 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 6B 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 9V 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 14 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 18C 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 19F 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 23F 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 1 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 3 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 5 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 6A 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 7F 다당류 및 에스.뉴모니에 혈청형 19A 다당류이다. 특정 양태에서, 다당류-단백질 접합체 제형의 단백질은 CRM197, 파상풍 톡소이드, 콜레라 톡소이드, 백일해 톡소이드, 이.콜라이(E.coli) 열 불안정 톡소이드(LT), 뉴모라이신 톡소이드, 폐렴구균 표면단백질 A(PspA), 폐렴구균 부착소 단백질 A(PsaA), 연쇄상구균 유래의 C5a 펩티다제, 헤모필러스 인플루엔자 단백질 D, 오브알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 소 혈청 알부민(BSA) 및 튜베르쿨린의 정제된 단백질 유도체(PPD)로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
하나의 구체적인 양태에 따르면, 다당류-단백질 접합체 제형은 CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 4 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 6B 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 9V 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 14 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 18C 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 19F 다당류 및 CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 23F 다당류를 포함하는 7가 폐렴구균 접합체(7vPnC) 제형이다.
다른 구체적인 양태에 따르면, 다당류-단백질 접합체 제형은 CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 4 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 6B 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 9V 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 14 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 18C 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 19F 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 23F 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 1 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 3 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 5 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 6A 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 7F 다당류 및 CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 19A 다당류를 포함하는 13가 폐렴구균 접합체(13vPnC) 제형이다.
다른 양태에서, 당해 제형은 하나 이상의 수막구균 다당류, 하나 이상의 수막구균 항원 단백질 또는 이들의 배합물을 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 제형은 하나 이상의 연쇄상구균 다당류, 하나 이상의 연쇄상구균 항원 단백질 또는 이들의 배합물을 추가로 포함한다.
특정 다른 양태에 따르면, 제형은 하나 이상의 애주번트(adjuvant)를 추가로 포함한다. 적당한 애주번트의 예는 후술된다.
다른 양태로서, 본 발명은 연쇄상구균 C5a 펩티다제(SCP) 조성물을 안정화시키는 제형으로서, (i) pKa가 약 3.5 내지 약 6.5인 완충액으로 pH 완충된 식염수 용액, (ii) 계면활성제 및 (iii) 연쇄상구균 C5a 펩티다제를 포함하는 제형에 관한 것이다. 한가지 구체적인 양태에서, SCP 제형은 용기 수단에 포함되어 있다. 특정 양태에 따르면, 용기 수단은 바이알, 바이알 마개, 바이알 밀봉장치, 유리 밀봉장치, 고무 밀봉장치, 플라스틱 밀봉장치, 주사기, 주사기 마개, 주사기 플런저, 플라스크, 비이커, 눈금실린더, 발효조, 생물반응기, 튜브, 파이프, 백, 자, 앰풀, 카트리지 및 일회용 펜으로 이루어진 그룹 중의 하나 이상 중에서 선택된다.
다른 양태에서, 제형의 pH 완충된 식염수 용액은 pH가 5.5 내지 7.5이다. 다른 양태에서, 완충액은 석시네이트, 히스티딘, 포스페이트 또는 시트레이트이다. 한가지 구체적인 양태에 따르면, 완충액은 최종 농도가 1mM 내지 10mM이고 pH가 5.8 내지 6.0인 석시네이트이다. 다른 구체적 양태에 따르면, 석시네이트 완충액의 최종 농도는 5mM 이다. 또 다른 양태에 따르면, pH 완충된 식염수 용액 중의 염은 염화마그네슘, 염화칼륨, 염화나트륨 또는 이들의 배합물을 포함한다.
특정 양태에 따르면, 당해 제형의 계면활성제는 폴리소르베이트 20(Tween™20), 폴리소르베이트 40 (Tween™40), 폴리소르베이트 60 (Tween™60), 폴리소르베이트 65 (Tween™65), 폴리소르베이트 80(Tween™80), 폴리소르베이트 85 (Tween™85), Triton™ N-101 , Triton™ X-100, 옥스톡시놀 40, 노녹시놀-9, 트리에탄올아민, 트리에탄올아민 폴리펩타이드 올레에이트, 폴리옥시에틸렌-660 하이드록시스테아레이트(PEG-15, Solutol H15), 폴리옥시에틸렌-35-리신올레에이트(Cremophor EL™), 대두 레시틴 및 폴록사머로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 한가지 특정 양태에 따르면, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다. 다른 양태에 따르면, 제형 중의 폴리소르베이트 80의 최종 농도는 제형 용적당 0.01중량% 내지 10중량% 폴리소르베이트 80이다. 또 다른 양태에 따르면, 제형 중의 폴리소르베이트 80의 최종 농도는 제형 용적당 0.01중량% 폴리소르베이트 80이다. 다른 양태에 따르면, 제형 중의 폴리소르베이트 80의 최종 농도는 제형의 용적당 0.05중량% 폴리소르베이트 80이다. 또 다른 양태에 따르면, 제형 중의 폴리소르베이트 80의 최종 농도는 제형 용적당 0.1중량%의 폴리소르베이트 80이다. 다른 양태에 따르면, 제형 중의 폴리소르베이트 80의 최종 농도는 제형 용적당 1.0중량%의 폴리소르베이트 80이다. 또 다른 양태에 따르면, 제형 중의 폴리소르베이트 80의 최종 농도는 제형 용적당 10.0중량%의 폴리소르베이트 80이다.
다른 특정 양태에서, SCP 조성물은 연쇄상구균 폴리펩타이드, 폐렴구균 폴리펩타이드, 수막구균 폴리펩타이드 및 포도상구균 폴리펩타이드로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드를 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, SCP 조성물은 연쇄상구균 다당류, 폐렴구균 다당류, 수막구균 다당류 및 포도상구균 다당류로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 다당류를 추가로 포함한다.
다른 양태에 따르면, 제형은 하나 이상의 애주번트를 추가로 포함한다. 적당한 애주번트의 예는 후술된다.
다른 양태에서, 본 발명은 실리콘처리된 용기 수단 내에 포함되어 있는 다당류-단백질 접합체의 실리콘 유도되는 침전을 억제하는 제형으로서, (i) pKa가 약 3.5 내지 약 7.5인 완충액으로 pH 완충된 식염수 용액, (ii) 알루미늄 염 및 (iii) 하나 이상의 다당류-단백질 접합체를 포함하는 제형에 관한 것이다. 특정 양태에 따르면, 실리콘처리된 용기 수단은 바이알, 바이알 마개, 바이알 밀봉장치, 유리 밀봉장치, 고무 밀봉장치, 플라스틱 밀봉장치, 주사기, 주사기 마개, 주사기 플런저, 플라스크, 비이커, 눈금실린더, 발효조, 생물반응기, 튜브, 파이프, 백, 자, 앰풀, 카트리지 및 일회용 펜으로 이루어진 그룹 중의 하나 이상 중에서 선택된다.
특정 양태에서, 제형의 pH 완충된 식염수 용액은 pH가 5.5 내지 7.5이다. 다른 양태에서, 제형 중의 완충액은 포스페이트, 석시네이트, 히스티딘 또는 시트레이트이다. 또 다른 양태에 따르면, 완충액은 최종 농도가 1mM 내지 10mM이고 pH가 5.8 내지 6.0인 석시네이트이다. 한가지 특정 양태에 따르면, 석시네이트 완충액의 최종 농도는 5mM 이다. 다른 양태에 따르면, pH 완충된 식염수 용액 중의 염은 염화마그네슘, 염화칼륨, 염화나트륨 또는 이들의 배합물을 포함한다. 한가지 특정 양태에 따르면, pH 완충된 식염수 용액의 염은 염화나트륨이다.
다른 양태에 따르면, 알루미늄 염은 수산화알루미늄, 인산알루미늄 또는 황산알루미늄이다. 한가지 구체적인 양태에 따르면, 알루미늄 염은 인산알루미늄이다.
다른 특정 양태에서, 당해 제형은 폴리소르베이트 80(Tween™80)을 추가로 포함한다. 한가지 구체적 양태에 따르면, 제형 중의 폴리소르베이트 80의 최종 농도는 제형 용적당 적어도 0.01중량% 내지 10중량% 폴리소르베이트 80이다.
다른 양태에 따르면, 다당류-단백질 접합체는 하나 이상의 폐렴구균 다당류를 포함한다. 특정 양태에서, 하나 이상의 폐렴구균 다당류는 에스.뉴모니에 혈청형 4 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 6B 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 9V 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 14 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 18C 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 19F 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 23F 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 1 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 3 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 5 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 6A 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 7F 다당류 및 에스.뉴모니에 혈청형 19A 다당류이다.
다른 특정 양태에서, 다당류-단백질 접합체 제형의 단백질은 CRM197, 파상풍 톡소이드, 콜레라 톡소이드, 백일해 톡소이드, 이.콜라이 열 불안정 톡소이드(LT), 뉴모라이신 톡소이드, 폐렴구균 표면단백질 A(PspA), 폐렴구균 부착소 단백질 A(PsaA), 연쇄상구균 유래의 C5a 펩티다제, 헤모필러스 인플루엔자 단백질 D, 오브알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 소 혈청 알부민(BSA) 및 튜베르쿨린의 정제된 단백질 유도체(PPD)로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
하나의 구체적인 양태에 따르면, 다당류-단백질 접합체 제형은 CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 4 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 6B 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 9V 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 14 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 18C 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 19F 다당류 및 CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 23F 다당류를 포함하는 7가 폐렴구균 접합체(7vPnC) 제형이다.
다른 구체적인 양태에 따르면, 다당류-단백질 접합체 제형은 CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 4 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 6B 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 9V 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 14 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 18C 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 19F 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 23F 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 1 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 3 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 5 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 6A 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 7F 다당류 및 CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 19A 다당류를 포함하는 13가 폐렴구균 접합체(13vPnC) 제형이다.
또 다른 양태에서, 당해 제형은 하나 이상의 수막구균 다당류, 하나 이상의 수막구균 항원 단백질 또는 이들의 배합물을 추가로 포함한다.
다른 양태에서, 제형은 하나 이상의 연쇄상구균 다당류, 하나 이상의 연쇄상구균 항원 단백질 또는 이들의 배합물을 추가로 포함한다.
특정 다른 양태에 따르면, 제형은 하나 이상의 애주번트를 추가로 포함한다. 적당한 애주번트의 예는 후술된다.
다른 양태에서, 본 발명은 실리콘처리된 용기 수단 내에 포함되어 있는 연쇄상구균 C5a 펩티다제(SCP) 조성물의 실리콘 유도되는 침전을 억제하는 제형으로서, (i) pKa가 약 3.5 내지 약 6.5인 완충액으로 pH 완충된 식염수 용액, (ii) 알루미늄 염 및 (iii) 연쇄상구균 C5a 펩티다제를 포함하는 제형에 관한 것이다. 특정 양태에 따르면, 용기 수단은 바이알, 바이알 마개, 바이알 밀봉장치, 유리 밀봉장치, 고무 밀봉장치, 플라스틱 밀봉장치, 주사기, 주사기 마개, 주사기 플런저, 플라스크, 비이커, 눈금실린더, 발효조, 생물반응기, 튜브, 파이프, 백, 자, 앰풀, 카트리지 및 일회용 펜으로 이루어진 그룹 중의 하나 이상 중에서 선택된다.
다른 양태에서, 제형의 pH 완충된 식염수 용액은 pH가 5.5 내지 7.5이다. 다른 양태에서, 완충액은 석시네이트, 히스티딘, 포스페이트 또는 시트레이트이다. 특정 양태에 따르면, 완충액은 최종 농도가 1mM 내지 10mM이고 pH가 5.8 내지 6.0인 석시네이트이다. 다른 양태에 따르면, pH 완충된 식염수 용액 중의 염은 염화마그네슘, 염화칼륨, 염화나트륨 또는 이들의 배합물을 포함한다.
다른 특정 양태에서, 당해 제형은 폴리소르베이트 80(Tween™80)을 추가로 포함한다. 한가지 구체적 양태에 따르면, 제형 중의 폴리소르베이트 80의 최종 농도는 제형 용적당 0.01중량% 내지 10중량% 폴리소르베이트 80이다.
또 다른 양태에서, SCP 조성물은 연쇄상구균 폴리펩타이드, 폐렴구균 폴리펩타이드, 수막구균 폴리펩타이드 및 포도상구균 폴리펩타이드로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드를 추가로 포함한다.
다른 특정 양태에서, SCP 조성물은 연쇄상구균 다당류, 폐렴구균 다당류, 수막구균 다당류 및 포도상구균 다당류로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 다당류를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에 따르면, 제형은 하나 이상의 애주번트를 추가로 포함한다. 적당한 애주번트의 예는 후술된다.
다른 양태로서, 본 발명은 엔.메닌지티디스(N. meningitidis) 2086 단백질 조성물을 안정화시키는 제형으로서, (i) pKa가 약 3.5 내지 약 6.5인 완충액으로 pH 완충된 식염수 용액, (ii) 계면활성제 및 (iii) 엔.메닌지티디스 2086 단백질을 포함하는 제형에 관한 것이다. 엔.메닌지티디스 2086 단백질의 예는 후술된다. 한가지 구체적인 양태에서, 엔.메닌지티디스 2086 단백질 제형은 용기 수단에 포함되어 있다. 특정 양태에 따르면, 용기 수단은 바이알, 바이알 마개, 바이알 밀봉장치, 유리 밀봉장치, 고무 밀봉장치, 플라스틱 밀봉장치, 주사기, 주사기 마개, 주사기 플런저, 플라스크, 비이커, 눈금실린더, 발효조, 생물반응기, 튜브, 파이프, 백, 자, 앰풀, 카트리지 및 일회용 펜으로 이루어진 그룹 중의 하나 이상 중에서 선택된다.
다른 양태에서, 제형의 pH 완충된 식염수 용액은 pH가 5.5 내지 7.5이다. 다른 양태에서, 완충액은 석시네이트, 히스티딘, 포스페이트 또는 시트레이트이다. 한가지 특정 양태에 따르면, 완충액은 최종 농도가 1mM 내지 10mM이고 pH가 5.8 내지 6.0인 석시네이트이다. 다른 구체적 양태에 따르면, 석시네이트 완충액의 최종 농도는 5mM이다. 또 다른 양태에 따르면, pH 완충된 식염수 용액 중의 염은 염화마그네슘, 염화칼륨, 염화나트륨 또는 이들의 배합물을 포함한다.
특정 양태에 따르면, 당해 제형의 계면활성제는 폴리소르베이트 20(Tween™20), 폴리소르베이트 40 (Tween™40), 폴리소르베이트 60 (Tween™60), 폴리소르베이트 65 (Tween™65), 폴리소르베이트 80(Tween™80), 폴리소르베이트 85 (Tween™85), Triton™ N-101 , Triton™ X-100, 옥스톡시놀 40, 노녹시놀-9, 트리에탄올아민, 트리에탄올아민 폴리펩타이드 올레에이트, 폴리옥시에틸렌-660 하이드록시스테아레이트(PEG-15, Solutol H15), 폴리옥시에틸렌-35-리신올레에이트(Cremophor EL™), 대두 레시틴 및 폴록사머로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 한가지 특정 양태에 따르면, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다. 특정 양태에 따르면, 제형 중의 폴리소르베이트 80의 최종 농도는 제형 용적당 0.01중량% 내지 10중량% 폴리소르베이트 80이다. 또 다른 양태에 따르면, 제형 중의 폴리소르베이트 80의 최종 농도는 제형 용적당 0.01중량% 폴리소르베이트 80이다. 다른 양태에 따르면, 제형 중의 폴리소르베이트 80의 최종 농도는 제형의 용적당 0.05중량% 폴리소르베이트 80이다. 또 다른 양태에 따르면, 제형 중의 폴리소르베이트 80의 최종 농도는 제형 용적당 0.1중량%의 폴리소르베이트 80이다. 다른 양태에 따르면, 제형 중의 폴리소르베이트 80의 최종 농도는 제형 용적당 1.0중량%의 폴리소르베이트 80이다. 또 다른 양태에 따르면, 제형 중의 폴리소르베이트 80의 최종 농도는 제형 용적당 10.0중량%의 폴리소르베이트 80이다.
다른 특정 양태에서, 엔.메닌지티디스 2086 단백질 조성물은 연쇄상구균 폴리펩타이드, 폐렴구균 폴리펩타이드, 수막구균 폴리펩타이드 및 포도상구균 폴리펩타이드로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드를 추가로 포함한다. 또 다른 특정 양태에서, 엔.메닌지티디스 2086 단백질 조성물은 연쇄상구균 다당류, 폐렴구균 다당류, 수막구균 다당류 및 포도상구균 다당류로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 다당류를 추가로 포함한다.
다른 양태에 따르면, 제형은 하나 이상의 애주번트를 추가로 포함한다. 적당한 애주번트의 예는 후술된다.
다른 양태로서, 본 발명은 엔.메닌지티디스 2086 단백질 조성물의 실리콘 유도되는 침전을 억제하는 제형으로서, (i) pKa가 약 3.5 내지 약 6.5인 완충액으로 pH 완충된 식염수 용액, (ii) 알루미늄 염 및 (iii) 엔.메닌지티디스 2086 단백질을 포함하는 제형에 관한 것이다. 특정 양태에 따르면, 용기 수단은 바이알, 바이알 마개, 바이알 밀봉장치, 유리 밀봉장치, 고무 밀봉장치, 플라스틱 밀봉장치, 주사기, 주사기 마개, 주사기 플런저, 플라스크, 비이커, 눈금실린더, 발효조, 생물반응기, 튜브, 파이프, 백, 자, 앰풀, 카트리지 및 일회용 펜으로 이루어진 그룹 중의 하나 이상 중에서 선택된다.
다른 양태에서, 제형의 pH 완충된 식염수 용액은 pH가 5.5 내지 7.5이다. 다른 양태에서, 완충액은 석시네이트, 히스티딘, 포스페이트 또는 시트레이트이다. 특정 양태에 따르면, 완충액은 최종 농도가 1mM 내지 10mM이고 pH가 5.8 내지 6.0인 석시네이트이다. 다른 양태에 따르면, pH 완충된 식염수 용액 중의 염은 염화마그네슘, 염화칼륨, 염화나트륨 또는 이들의 배합물을 포함한다.
다른 특정 양태에서, 당해 제형은 폴리소르베이트 80(Tween™80)을 추가로 포함한다. 한가지 구체적 양태에 따르면, 제형 중의 폴리소르베이트 80의 최종 농도는 제형 용적당 0.01중량% 내지 10중량% 폴리소르베이트 80이다.
또 다른 양태에서, 엔.메닌지티디스 2086 단백질 조성물은 연쇄상구균 폴리펩타이드, 폐렴구균 폴리펩타이드, 수막구균 폴리펩타이드 및 포도상구균 폴리펩타이드로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드를 추가로 포함한다.
다른 특정 양태에서, 엔.메닌지티디스 2086 단백질 조성물은 연쇄상구균 다당류, 폐렴구균 다당류, 수막구균 다당류 및 포도상구균 다당류로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 다당류를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에 따르면, 제형은 하나 이상의 애주번트를 추가로 포함한다. 적당한 애주번트의 예는 후술된다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 이하 상세한 설명, 이의 구체적 양태 및 청구의 범위로부터 분명해질 것이다.
본 발명은 다당류-단백질 접합체 및 단백질 면역원과 같은 면역원성 조성물의 안정성을 향상시키기 위한 당업계의 계속되는 요구를 해결하기 위한 것이다. 따라서, 본 발명은 일반적으로 면역원성 조성물을 안정화시키고 이의 침전을 억제하는 신규 계면활성제 제형 및/또는 신규 알루미늄 염 제형에 관한 것이다. 더 상세하게는, 후술되는 본 발명은 발효조, 생물반응기, 바이알, 플라스크, 백, 주사기, 고무 마개, 튜브 등과 같은 용기 수단 내에서 가공, 개발, 제형화, 제조 및/또는 보관되는 면역원성 조성물을 안정화시키고 이의 미립자 형성(예: 응집, 침전)을 억제하는 제형에 대한 당업계의 요구를 해결하기 위한 것이다.
배경기술 부문에서 전술한 바와 같이, 면역원성 조성물의 화학적 안정성, 면역원성 조성물의 물리적/열적 안정성, 면역원성 조성물과 용기/밀봉장치 시스템과 의 적합성, 면역원성 조성물과 불활성 성분(예: 완충액, 염, 부형제, 동결방지제) 사이의 상호작용, 제조 공정, 투여형(예: 동결건조물, 액체), 운송, 보관 및 취급 중에 직면하는 환경 조건(예: 온도, 습도, 전단력) 및 제조부터 사용까지의 시간 길이 등이 있으나, 이에 국한되지 않는 각종 요인이 면역원성 조성물의 안정성에 영향을 미친다.
본 발명의 면역원성 조성물의 안정성은 당업자에게 공지된 통상적인 표준 기술을 사용하여 쉽게 측정된다. 예를 들어, 면역원성 조성물은 광산란법, 광학밀도, 침강속도 원심분리, 침강평형 원심분리, 원편광 이색법(CD), 로우리(Lowry) 분석법, 비신코닌산(BCA) 분석법, 항체 결합 등을 비롯하여, 이에 국한되지 않는 방법에 의해 안정성, 응집, 면역원성, 미립자 형성, 단백질(농도) 상실 등이 분석된다.
본 명세서에 상세히 기술된 바와 같이, 본 발명은 Tween™ 80과 같은 계면활성제의 존재하에 면역원성 조성물을 제형화하면 유의적으로 면역원성 조성물의 안정성이 증가되며 침전이 억제된다는 예상치못한 놀라운 결과에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명에 따르면(실시예 2 참조), 완충된 식염수에 제형화되고 1회 용량 주사기에 충전된 13가 폐렴구균 접합체(13vPnC)가 수평 궤도 진탕기에서 완만한 교반 하에 2 내지 8℃에서 10분 이내에 용액으로부터 침전되기 시작하는 것으로 관측되었다(수평 궤도 진탕기는 13vPnC 면역원성 조성물의 통상적인 가공, 운송 및 보관 조건을 모의실험하는데 사용되었다). 하지만, 놀랍게도, 완충 식염수 및 0.001% Tween™80 중에 제형화되고 1회 용량 주사기에 충전되어 2 내지 8℃에서 완만한 속도로 교반된 13vPnC가 25일 동안 어떠한 가시적인 침전의 징후없이 안정한 것으로 관측되었다(데이터 미제시됨). 따라서, 이러한 데이터로부터, 면역원성 조성물에의 계면활성제(예: Tween™80)의 첨가가 면역원성 조성물의 안정성을 증가시킨다는 것이 증명되었다.
13vPnC의 제2 안정성 연구도 역시, 제형에의 계면활성제의 첨가가 13vPnC의 안정성을 유의적으로 증가시킨다는 것을 확인시켜 주었다. 예를 들어, 0.05% Tween™80의 존재하에(표 1) 및 Tween™80의 부재하에(0.0%, 표 1) 제형화된 13vPnC의 안정성(즉, 13vPnC 항원성의 변화를 측정하여 분석함)을 2시간 시간 동안에 걸쳐 평가했다. 표 1에 제시된 바와 같이, 2시간의 분석 동안 13가지 혈청형 다당류(Tween™80의 부재하에 제형화됨)의 항원성은 유의적으로 감소되었다. 그러나, 매우 극적으로, 0.05% Tween™80을 포함하는 13vPnC 제형(표 1)은 2시간 항원성 분석을 통해 건실한 안정성을 보여주었다. 또한, 0.01% Tween™80 또는 0.05% Tween™80의 존재하에 250mL 유리병에 제형화된 13vPnC는 2 내지 8℃에서 30분 동안 제형의 와동을 통해 유도된 유의적인 전단력을 항원성의 상실을 거의 또는 전혀 일으킴이 없이 견딜 수 있는 것으로 관측되었다(실시예 2, 표 2 참조).
다른 실험(실시예 3)에서는 Tween™80과 같은 계면활성제의 존재하에 제형화된 경우 면역원성 연쇄상구균 C5a 펩티다제(SCP) 조성물의 안정성이 크게 증가되었음을 증명했다. 예를 들어, 도 1a에 도시된 바와 같이, 5mM 석시네이트 완충액(pH 6.0), 10mM 포스페이트 완충액(pH 7.0 내지 7.4) 또는 10mM 트리스 완충액(pH 7.5)에 제형화된 SCP(55㎍/ml)를 2일간 와동시킨 후, SCP 농도는 상당히 감소되었다(예컨대, 90% 넘게). 하지만, 도 1b에 도시된 바와 같이, 2일 동안 와동시키기 전, SCP 석시네이트, SCP 포스페이트 및 SCP 트리스 제형에의 0.025% Tween™80의 첨가는 도 1a에서 관측된 SCP 상실을 완전하게 억제했다.
또한, 본 발명의 13vPnC 면역원성 조성물은 알루미늄 포스페이트(AlPO4)와 같은 애주번트의 존재 또는 부재하에 제형화될 수도 있다. 따라서, 다른 일련의 실험(실시예 4)에서, 13vPnC 면역원성 조성물을 5mM 석시네이트 완충액(pH 5.8), 0.85% NaCl 및 AlPO4(0.25mg 알루미늄/ml)에, 계면활성제의 첨가 없이(예컨대, Tween™80은 제형에 전혀 포함되지 않았다) 제형화했다.
이러한 실험에서, 13vPnC 면역원성 조성물(AlPO4의 존재 하에 제형화됨)은 각종 실리콘처리된 및 실리콘 미처리된 용기 수단(예컨대, 표 3 참조) 내에 충전하여, 2 내지 8℃에서 교반을 통해 모의적인 운송 및 취급 조건으로 처리되었다. 이러한 실험(실시예 4)에서는 실리콘 함량이 더 높은 용기 수단이 더 많은 13vPnC 미립자 형성과 더 높은 13vPnC 항원성 상실률을 나타낸 것으로 관측되었다. 미립자의 FTIR 분석 결과, 미립자는 단백질과 실리콘으로 구성되어 있었고(데이터는 제시되지 않음), 13vPnC의 약 85%가 AlPO4에 결합되어 있고 나머지 15%는 용액 중의 유리(AlPO4에 결합되지 않은) 13vPnC였다.
AlPO4의 존재 및 부재하에 제형화된 다음, 동일한 주사기에 충전된 13vPnC 면역원성 조성물을 비교하는 다른 실험에서는, AlPO4 부재하에 제형화된 13vPnC가 검사된 주사기에서 AlPO4의 존재하에 제형화된 13vPnC보다 더 큰 항원성 상실을 유지하는 것으로 관측되었다(예: 도 6 및 도 7 참조).
따라서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 본 발명은 면역원성 조성물의 안정성에 영향을 미치는 다양한 요인(예: 전단력, 운송 교반, 실리콘 오일 상호작용, 흡착, 제조 공정, 온도, 습도, 제조부터 사용까지의 시간 길이 등)에 대하여, 다당류-단백질 접합체(예: 13vPnC) 및 단백질 면역원(예: 연쇄상구균 C5a 펩티다제, 엔.메닌지티디스 ORF 2086 단백질)과 같은 면역원성 조성물을 안정화시키고 이의 응집 또는 침전을 억제하는 신규 제형에 관한 것이다.
특정 양태에서, 본 발명은 pKa가 약 3.5 내지 약 7.5인 완충액으로 pH 완충된 식염수 용액, 계면활성제 및 하나 이상의 다당류-단백질 접합체를 포함하고, 다당류-단백질 접합체를 안정화시키는 제형에 관한 것이다. 다른 양태에서, 다당류-단백질 접합체 제형은 용기 수단에 포함되어 있다. 다른 양태에서, 본 발명은 pKa가 약 3.5 내지 약 6.5인 완충액으로 pH 완충된 식염수 용액, 계면활성제 및 연쇄상구균 C5a 펩티다제를 포함하고, 연쇄상구균 C5a 펩티다제(SCP) 조성물을 안정화시키는 제형에 관한 것이다. 특정 양태에서, SCP 제형은 용기 수단에 포함되어 있다. 다른 양태에서, 본 발명은 pKa가 약 3.5 내지 약 7.5인 완충액으로 pH 완충된 식염수 용액, 계면활성제 및 엔.메닌지티디스 2086 단백질을 포함하고, 엔.메닌지티디스 2086 단백질 조성물을 안정화시키는 제형에 관한 것이다. 특정 양태에서, 수막구균 2086 제형은 용기 수단에 포함되어 있다.
다른 특정 양태에서, 본 발명은 pKa가 약 3.5 내지 약 7.5인 완충액으로 pH 완충된 식염수 용액, 알루미늄 염 및 하나 이상의 다당류-단백질 접합체를 포함하고, 실리콘처리된 용기 수단에 포함되어 있는 다당류-단백질 접합체의 실리콘 유도되는 침전을 억제하는 제형에 관한 것이다. 다른 양태에서, 본 발명은 pKa가 약 3.5 내지 약 6.5인 완충액으로 pH 완충된 식염수 용액, 알루미늄 염 및 연쇄상구균 C5a 펩티다제를 포함하고, 실리콘처리된 용기 수단에 포함되어 있는 연쇄상구균 C5a 펩티다제(SCP) 조성물의 실리콘 유도되는 침전을 억제하는 제형에 관한 것이다. 다른 특정 양태에서, 본 발명은 pKa가 약 3.5 내지 약 7.5인 완충액으로 pH 완충된 식염수 용액, 알루미늄 염 및 엔.메닌지티디스 2086 단백질을 포함하고, 실리콘처리된 용기 수단에 포함되어 있는 엔.메닌지티디스 2086 단백질의 실리콘 유도되는 침전을 억제하는 제형에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 pKa가 약 3.5 내지 약 7.5인 완충액으로 pH 완충된 식염수 용액, 계면활성제, 알루미늄 염 및 엔.메닌지티디스 2086 단백질을 포함하고, 엔.메닌지티디스 2086 단백질의 알루미늄 염 애주번트(예: AlPO4)에 대한 결합 백분율 및 항원 안정성을 최적화한 제형에 관한 것이다. 특정 양태에서, 제형은 용기 수단에 포함되어 있다.
이하에 정의된 바와 같이, "침전", "침전물", "미립자 형성", "흐려짐" 및 "응집"이란 용어는 호환 사용될 수 있으며, 다당류-단백질 접합체 또는 단백질(또는 폴리펩타이드) 면역원의 "응집"을 초래하는 임의의 물리적 상호작용 또는 화학적 반응을 의미하는 것이다. 응집(예컨대, 단백질 응집)과정은 당업계에 공지되고(하지만, 충분히 규명된 것은 아니다) 설명되어 있으며, 종종 다양한 물리화학적 스트레스, 예컨대 열, 압력, pH, 교반, 전단력, 동결-해동, 탈수, 중금속, 페놀성 화합물, 실리콘 오일, 변성제 등에 의한 영향을 받는다.
후술되는 바와 같이, 본 발명의 "다당류-단백질 접합체", "폐렴구균 접합체", "7가 폐렴구균 접합체(7vPnC)", "13가 폐렴구균 접합체(13vPnC)", "연쇄상구균 C5a 펩티다제(SCP) 면역원성 조성물" 및 "엔.메닌지티디스 2086 단백질 면역원성 조성물"은 액체 제형, 동결 액체 제형 및 고체(예: 동결건조 또는 냉동건조) 제형을 포함한다.
A. 계면활성제
전술한 바와 같이, 본 발명은 면역원성 조성물의 안정성에 영향을 미치는 다양한 요인(예: 전단력, 운송 교반, 실리콘 오일 상호작용, 흡착, 제조 공정, 온도, 습도, 제조부터 사용까지의 시간의 길이 등)에 대해 면역원성 조성물을 안정화시키고 이의 응집을 억제하는 제형에 관한 것이다. 특정 양태에서, 본 발명은 계면활성제를 포함하는 제형에 관한 것이다.
계면활성제(또는 표면활성제)는 일반적으로 (a) 친수성 그룹 또는 잔기 및 친지성(소수성) 그룹 또는 잔기를 포함하는 분자 또는 화합물 및/또는 (b) 용액의 표면장력을 저하 또는 감소시키는 분자, 물질 또는 화합물로서 정의된다. 본 명세서에 정의된 바와 같이, 본 발명의 "계면활성제"는 면역원성 조성물 제형의 표면장력을 저하시키는 임의의 분자 또는 화합물이다.
본 발명의 제형에 사용된 계면활성제는 본 명세서에 기술된 면역원성 조성물을 안정화시키고 이의 응집을 억제하는 임의의 계면활성제 또는 임의의 계면활성제의 배합을 포함한다. 즉, 본 발명의 계면활성제는 폴리소르베이트 20(Tween™20), 폴리소르베이트 40 (Tween™40), 폴리소르베이트 60 (Tween™60), 폴리소르베이트 65 (Tween™65), 폴리소르베이트 80(Tween™80), 폴리소르베이트 85 (Tween™85), Triton™ N-101, Triton™ X-100, 옥스톡시놀 40, 노녹시놀-9, 트리에탄올아민, 트리에탄올아민 폴리펩타이드 올레에이트, 폴리옥시에틸렌-660 하이드록시스테아레이트(PEG-15, Solutol H15), 폴리옥시에틸렌-35-리신올레에이트(Cremophor EL™), 대두 레시틴, 폴록사머, 헥사데실아민, 옥타데실아민, 옥타데실 아미노산 에스테르, 리소레시틴, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드, 메톡시헥사데실글리세롤, 플루로닉 폴리올, 폴리아민(예: 피란, 덱스트란설페이트, 폴리 IC, 카르보폴), 펩타이드(예: 뮤라밀 펩타이드 및 디펩타이드, 디메틸글리신, 터프트신), 오일 에멀젼, 미네랄 겔(예: 알루미늄 포스페이트) 및 면역 자극성 복합체(ISCOMS)를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
당업자라면, 적당한 계면활성제 또는 계면활성제 배합의 결정은 계면활성제(들)의 존재 및 부재 하에서 특정 면역원성 조성물 제형의 표면장력을 계측함으로써 용이하게 수행할 수 있다. 또는, 계면활성제가 면역원성 조성물의 응집을 감소, 억제 또는 방지하는 역량에 대해 정성적(예: 미립자 형성의 육안 조사) 또는 정량적(예: 광산란, 침강속도 원심분리, 광학밀도, 항원성)으로 평가한다.
B. 용기 수단
특정 양태에서, 본 발명은 용기 수단에 포함되어 있는 면역원성 조성물의 제형에 관한 것이다. 본 명세서에 정의된 바와 같이, 본 발명의 "용기 수단"은 면역원성 조성물을 연구, 가공, 개발, 제형화, 제조, 보관 및/또는 투여하는 동안 "함유", "보유", "혼합", "블렌드", "분배", "주사", "이동", "분무" 등을 위해 사용되는 임의의 물질 조성물을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 용기 수단은 일반 실험실의 유리제품, 플라스크, 비이커, 눈금실린더, 발효조, 생물반응기, 튜브, 파이프, 백, 자, 바이알, 바이알 밀봉장치(예: 고무 마개, 캡 상의 스크류), 앰풀, 주사기, 주사기 마개, 주사기 플런저, 고무 밀봉장치, 플라스틱 밀봉장치, 유리 밀봉장치 등을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 용기 수단은 제조 재료에 의해 제한되지 않으며, 유리, 금속(예: 강철, 스테인리스강, 알루미늄 등) 및 중합체(예: 열가소성재, 탄성중합체, 열가소성-탄성중합체)와 같은 물질을 포함한다.
당업자는, 전술한 용기 수단이 한정적인 목록이 아니며, 면역원 또는 면역원성 조성물을 연구, 가공, 개발, 제형화, 제조, 보관 및/또는 투여하는 동안 함유, 유지, 혼합, 블렌드, 분배, 주사, 이동, 분무 등을 위해 사용되는 다양한 용기 수단에 대한 단순한 안내자로서 역할하는 것임을 잘 알고 있을 것이다. 본 발명에 사용될 수 있는 추가적인 용기 수단은 실험실 장치 공급자 및 제조업자, 예컨대 유나이티드 스테이츠 프라스틱 코포레이션(United States Plastic Corp.)(오하이오주, 리마), VWR™(펜실베이니아주, 웨스트 체스터), 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences)(뉴저지주, 프랭클린 레이크스), 피셔 사이언티픽 인터내셔널 인코포레이티드(Fisher Scientific International Inc.)(뉴햄프셔주, 햄튼) 및 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)(미주리주, 세인트 루이스)의 공개 카탈로그에서 찾아볼 수 있다.
따라서, 본 발명의 신규 제형은 조성물의 각종 연구, 가공, 개발, 제형화, 제조, 보관 및/또는 투여 단계 동안 용기 수단에 포함되어 있는 면역원성 조성물을 안정화시키고 이의 침전을 억제한다는 점에서 특히 유리하다. 본 발명의 신규 제형은 면역원성 조성물을 물리적/열적 스트레스(예: 온도, 습도, 전단력 등)에 대해 안정화시킬 뿐만 아니라, 좋지 않은 요인 또는 영향, 예컨대 용기/밀봉장치 시스템(예: 실리콘처리된 용기 수단)과 면역원성 조성물과의 불적합성 등에 대하여 면역원성 조성물의 안정성을 향상시키고 침전을 억제한다.
따라서, 본 발명의 신규 제형은 실리콘 오일 유도된 침전 및 전술한 침전에 대하여 면역원(예: 다당류-단백질 접합체, 단백질 또는 폴리펩타이드 항원)을 안정화시키는데 특히 유용하다. 예를 들어, 특히 본 발명에 참고인용된 2006년 4월 26일에 출원된 공동계류중인 미국 특허출원 제60/795,098호는 주사기, 유리 바이알, 고무 마개 등과 같은 용기 수단에서 발견되는 실리콘 오일의 존재하의 면역원성 조성물의 응집에 대해 기술하고 있고, 여기서 상기 면역원성 조성물의 실리콘 오일 유도된 응집의 방지는 용기 수단에의 계면활성제의 첨가를 통해 수행했다.
C. 애주번트 및 약제학적 담체/부형제
특정 양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 추가로 애주번트의 존재하에 제형화된다. 애주번트는 면역원 또는 항원과 함께 투여했을 때 면역반응을 증가시키는 물질이다. 수많은 사이토카인 또는 림포카인이 면역 조절 활성을 보유하는 것으로 밝혀져 있으며, 이에 따라 애주번트로서, 인터루킨 1-α, 1-β, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12(예: 미국 특허 제5,723,127호 참조), 13, 14, 15, 16, 17 및 18(및 이의 돌연변이 형태), 인터페론-α, β 및 γ, 과립구-대식세포 콜로니 자극인자(GMCSF, 예: 미국 특허 제5,078,996호 참조, ATCC 수탁번호 39900), 대식세포 콜로니 자극인자(MCSF), 과립세포 콜로니 자극인자(GCSF) 및 종양괴사인자 α 및 β(TNF) 등을 사용할 수 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명에 유용한 또 다른 애주번트로는 케모카인, 예컨대 MCP-1, MIP-1α, MIP-1β 및 RANTES 등을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
특정 양태에 따르면, 면역원성 조성물 제형의 면역반응을 증가시키는데 사용된 애주번트는, 본 발명에 참고인용된 미국 특허 제4,912,094호에 기술된 MPL™(3-O-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A; 판매원: 코릭사(Corixa), 몬태나주, 헤밀턴)을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 코릭사(몬태나주, 헤밀턴)로부터 입수가능하고 본 발명에 참고인용된 미국 특허 제6,113,918호에 기술되어 있는 합성 지질 A 유사체 또는 아미노알킬 글루코사민 포스페이트 화합물(AGP) 또는 이의 유도체 또는 유사체도 애주번트로서 사용하기에 적합하다. 이러한 AGP 중 하나는 2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일아미노] 에틸 2-데옥시-4-O-포스포노-3-O-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일]-2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일-아미노]-b-D-글루코피라노사이드이며, 이는 529로도 알려진 것이다 (기존에는 RC529로 알려짐). 이 529 애주번트는 수성 형태로서 또는 안정한 에멀젼으로 제형화된다(RC529-SE).
또 다른 애주번트는 광유 및 수성 에멀젼, 알루미늄 염(명반), 예컨대 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 설페이트 등, 암피젠(Amphigen), 아브리딘(Avridine), L121/스쿠알렌, D-락타이드-폴리락타이드/글리코사이드, 플루로닉 폴리올, 뮤라밀 디펩타이드, 사멸된 보르데텔라(Bordetella), 사포닌, 예컨대 Stimulon™ QS-21(안티제닉스(Antigenics), 매사추세츠주, 프라밍햄)(본 발명에 참고인용된 미국 특허 제5,057,540호에 기술됨), 및 이로부터 생성된 입자, 예컨대 ISCOMS(면역자극 복합체), ISCOMATRIX(CSL 리미티드(CSL Limited), 오스트레일리아 파크빌)(미국 특허 제5,254,339호에 기술되어 있음), 마이코박테리움 튜베르큘로시스(Mycobacterium tuberculosis), 세균 지질다당류, 합성 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 CpG 모티프(motif)를 포함하는 올리고뉴클레오타이드(참고인용된 미국 특허 제6,207,646호 참조), IC-31(인터셀 아게(Intercell AG), 오스트리아 비엔나)(유럽 특허 제1,296,713호 및 제1,326,634호에 기술됨), 백일해 독소(PT) 또는 이.콜라이 열불안정성 독소(LT), 특히 LT-K63, LT-R72, PT-K9/G129[예컨대 참고인용되는 국제특허공보 제WO93/13302호 및 제WO92/19265호 참조] 등을 포함한다.
또한, 콜레라 독소 및 이의 돌연변이체, 예컨대 공개된 국제특허출원 제WO 00/18434호에 기술된 것(아미노산 위치 29의 글루탐산이 다른 아미노산(아스파르트산 제외), 바람직하게는 히스티딘으로 치환된 것)도 애주번트(및 담체 단백질)로서 유용하다. 유사한 CT 독소 또는 돌연변이체는 공개된 국제특허출원 제WO 02/098368호에 기술되어 있다(아미노산 위치 16의 이소류신만이 다른 아미노산으로 치환되거나 또는 이와 함께 아미노산 위치 68의 세린이 다른 아미노산으로 치환되고/되거나 아미노산 위치 72의 발린이 다른 아미노산으로 치환되어 있다). 다른 CT 독소는 공개된 국제특허출원 제WO 02/098369호에 기술되어 있다(아미노산 위치 25의 아르기닌이 다른 아미노산으로 치환되고/되거나 하나의 아미노산이 아미노산 위치 49에 삽입되고/되거나 2개의 아미노산이 아미노산 위치 35 및 36에 삽입되어 있음).
특정 양태에 따르면, 당해 면역원성 조성물 제형은 약제학적으로 허용되는 희석제, 부형제 또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 한가지 양태에 따르면, 약제학적으로 허용되는 희석제는 멸균수, 주사용수, 멸균 등장 식염수 또는 생물학적 완충액이다. 당해의 다당류-단백질 접합체 및/또는 단백질 면역원은 상기 희석제 또는 담체와 통상의 방식에 따라 혼합된다. 본 명세서에 사용된 "약제학적으로 허용되는 담체"란 용어는 사람 또는 다른 척추동물 숙주에 투여하기에 적합한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 피복물, 항세균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수지연제 등을 포함하는 의미한다. 적당한 담체는 당업자에게 자명하며 대부분 투여 경로에 따라 달라질 것이다.
예를 들어, 면역원성 조성물 제형에 존재할 수 있는 부형제는 보존제, 화학 안정화제 및 현탁화제 또는 분산제이다. 일반적으로, 안정화제, 보존제 등은 표적 수용자(예: 사람 피험자)에서 효능이 최상인 제형이 되도록 최적화된다. 보존제의 예에는 클로로부탄올, 칼륨 소르베이트, 소르브산, 이산화황, 프로필 갈레이트, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀 및 파라클로로페놀이 있다. 안정화 성분의 예에는 카사미노산, 슈크로스, 젤라틴, 페놀 레드, N-Z 아민, 모노칼륨 디포스페이트, 락토스, 락트알부민 가수분해물 및 분유가 있다.
특정 양태에 따르면, 면역원성 조성물 제형은 예컨대 액제, 산제, 에어로졸제, 정제, 캡슐제, 장용피복된 정제 또는 캡슐제, 좌제 등의 형태로 사람 피험자에게 투여할 수 있도록 제조된다. 따라서, 면역원성 조성물 제형은 추가로 현탁액제, 용액제, 유성 비히클 또는 수성 비히클 중의 에멀젼제, 페이스트제 및 이식가능한 지속방출 제형 또는 생분해성 제형 등도 포함할 수 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 면역원성 조성물은 통상의 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제 및 부형제, 예컨대 용매, 완충액, 애주번트 또는 전술한 종류의 약제에 유용한 다른 성분의 선택에 의해 제한되지 않는다. 전술한 성분으로부터 적당한 pH 등장성, 안정성 및 다른 통상적인 특징을 보유하는 상기 약제학적으로 허용되는 조성물의 제조는 당업계의 기술범위 내에 있다.
D. 면역원
특정 양태에서, 본 발명의 다당류-단백질 접합체 제형은 하나 이상의 폐렴구균 다당류를 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명의 다당류-단백질 접합체 제형은 하나 이상의 연쇄상구균 다당류를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 다당류-단백질 접합체 제형은 하나 이상의 수막구균 다당류를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 다당류-단백질 접합체 제형은 하나 이상의 폐렴구균 다당류, 하나 이상의 폐렴구균 폴리펩타이드, 하나 이상의 연쇄상구균 다당류, 하나 이상의 연쇄상구균 폴리펩타이드, 하나 이상의 수막구균 다당류 및/또는 하나 이상의 수막구균 폴리펩타이드의 배합물을 포함한다.
이하에 정의된 바와 같이, "다당류"란 용어는 면역학 및 세균 백신 기술분야에서 통용되는 임의의 항원성 당류 요소(또는 항원성 단위), 예컨대 "당류", "올리고당류", "다당류", "지질당류", "지질-올리고당류(LOS)", "지질다당류(LPS)", "글리코실레이트", "당접합체" 등을 포함하는 것을 의미하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 한가지 특정 양태에 따르면, 하나 이상의 폐렴구균 다당류는 에스.뉴모니에 혈청형 4 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 6B 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 9V 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 14 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 18C 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 19F 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 23F 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 1 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 3 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 5 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 6A 다당류, 에스.뉴모니에 혈청형 7F 다당류 및 에스.뉴모니에 혈청형 19A 다당류이다.
특정 양태에서, 다당류-단백질 접합체 제형은 CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 4 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 6B 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 9V 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 14 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 18C 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 19F 다당류 및 CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 23F 다당류를 포함하는 7가 폐렴구균 접합체(7vPnC) 제형이다.
다른 특정 양태에 따르면, 다당류-단백질 접합체 제형은 CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 4 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 6B 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 9V 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 14 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 18C 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 19F 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 23F 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 1 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 3 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 5 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 6A 다당류, CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 7F 다당류 및 CRM197 폴리펩타이드에 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 19A 다당류를 포함하는 13가 폐렴구균 접합체(13vPnC) 제형이다.
다당류는 당업자에게 공지된 표준 기술에 의해 제조된다. 예를 들어, 본 발명에 기술된 협막 다당류(capsular polysaccharide)는 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae)의 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F로부터 제조되며, 여기서 각 혈청형은 대두계 배지에서 증식되고, 그 다음 각 다당류는 원심분리, 침전, 한외여과 및 칼럼 크로마토그래피를 통해 정제된다. 이와 마찬가지로, 연쇄상구균 다당류(예컨대, 그룹 A 스트렙토코커스, 그룹 B 스트렙토코커스, 그룹 C 스트렙토코커스 및 그룹 G 스트렙토코커스와 같은 β-용혈성 스트렙토코커스 유래의 하나 이상의 다당류(또는 올리고당류)) 및 수막구균 당류(예: 엔.메닌지티디스 지질올리고당류(LOS) 또는 지질다당류(LPS))는 임상적으로 관련이 있는 혈청형 또는 혈청군으로부터 당업자에게 공지된 일반적인 기술 및 방법을 사용함으로써 제조된다. 정제된 다당류는 그 다음 담체 단백질과 반응할 수 있는 당류를 제조하기 위해 화학적으로 활성화시킨다(예: 환원적 아민화를 통해). 일단 활성화되면, 각 협막 다당류를 각각 담체 단백질(예: CRM197)에 접합시켜 당접합체를 형성시킨 다음(또는, 각 협막 다당류를 동일한 담체 단백질에 접합시킨 다음), 1회 투여량 제형으로 제형화한다.
다당류의 화학적 활성화 및 담체 단백질과의 후속적인 접합(즉, 다당류-단백질 접합체)은 통상의 방법으로 수행한다(예컨대, 미국 특허 제4,673,574호 및 제4,902,506호 참조).
담체 단백질은 무독성이며 비반응원성이고 충분한 양과 순도로 수득될 수 있는 단백질인 것이 바람직하다. 담체 담백질은 표준 접합 절차를 따를 수 있어야 한다. 본 발명의 특정 양태에서, CRM197은 담체 단백질로서 사용된다.
CRM197(와이어스(Wyeth), 노스캐롤라이나주, 샌포드)은 카사미노산과 효모 추출물계 배지에서 증식된 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria) 균주 C7(β197)의 배양물로부터 분리된 디프테리아 독소의 무독성 변이체(즉, 톡소이드)이다. CRM197은 한외여과, 황산암모늄 침전 및 이온교환 크로마토그래피를 통해 정제된다. 또는, CRM197은 본 발명에 참고인용된 미국 특허 제5,614,382호에 따라 재조합적으로 제조된다. 다른 디프테리아 톡소이드도 담체 단백질로서 사용하기에 적합하다.
다른 양태에 따르면, 본 발명의 담체 단백질은 효소적으로 불활성인 연쇄상구균 C5a 펩티다제(SCP)(예: 미국 특허 제6,951,653호, 제6,355,255호 및 제6,270,775호에 기술된 하나 이상의 SCP 변이체)이다.
다른 적당한 담체 단백질에는 불활성화된 세균 독소, 예컨대 파상풍 톡소이드, 백일해 톡소이드, 콜레라 톡소이드(예: CT E29H, 국제특허출원 제WO2004/083251호에 기술된 것), 이.콜라이 LT, 이.콜라이 ST 및 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래의 외독소(exotoxin) A가 있다. 세균 외막 단백질, 예컨대 외막 복합체 c(OMPC), 포린, 트랜스페린 결합 단백질, 뉴모라이신, 폐렴구균 표면 단백질 A(PspA), 폐렴구균 부착소 단백질(PsaA) 또는 헤모필러스 인플루엔자 단백질 D도 사용될 수 있다. 오브알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 소혈청 알부민(BSA) 또는 튜베르쿨린의 정제된 단백질 유도체(PPD)도 담체 단백질로서 사용될 수 있다.
협막 다당류를 담체 단백질에 접합시킨 후, 다당류-단백질 접합체를 다양한 기술로 정제한다(다당류-단백질 접합체의 함량 면에서 농축됨). 이러한 기술에는 농축/정용여과(diafiltration) 조작, 침전/용출, 칼럼 크로마토그래피 및 심층여과가 있다.
각 당접합체를 정제한 후, 혼합하여 본 발명의 면역원성 조성물로 제형화한다. 본 발명의 다당류-단백질 접합체의 제형화는 당업계에 공인된 방법으로 달성할 수 있다. 예를 들어, 13개의 각 폐렴구균 접합체는 생리학적으로 허용되는 비히클과 함께 조성물로 제형화될 수 있다. 이러한 비히클의 예에는 물, 완충 식염수, 폴리올(예: 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 덱스트로스 용액이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
다른 양태에서, 본 발명은 pKa가 약 3.5 내지 약 6.5인 완충액으로 pH 완충된 식염수 용액, 계면활성제 및 연쇄상구균 C5a 펩티다제를 포함하고, 연쇄상구균 C5a 펩티다제(SCP) 면역원성 조성물을 안정화시키는 제형에 관한 것이다. C5a 펩티다제는 고도로 보존된 세린 프로테아제이며 모든 β-용혈성 연쇄상구균(예: 연쇄상구균 그룹 A, B, C 및 D)에 걸쳐 발현된다. 예를 들면, 그룹 B 연쇄상구균(GBS) C5a 펩티다제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 그룹 A 연쇄상구균(GAS) C5a 펩티아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 98% 동일하다. 따라서, 본 발명의 특정 양태에 따르면, β-용혈성 연쇄상구균이 원인인 감염에 대한 면역원성 조성물은 C5a 펩티다제 면역원(또는 항원)을 포함한다.
한가지 특정 양태에 따르면, 본 발명의 C5a 펩티다제는 효소적으로 불활성인 연쇄상구균 C5a 펩티다제(예: 각각 참고인용되는 미국 특허 제6,951,653호, 제6,355,255호 및 제6,270,775호에 기술된 하나 이상의 SCP 변이체)이다. 다른 구체적 양태에서, 본 발명의 신규 면역원성 조성물 제형에 사용된 SCP는 그룹 B 연쇄상구균으로부터 클로닝된다. 다른 양태에 따르면, 그룹 B 연쇄상구균 SCP 서열은 단백질분해적으로 불활성화되도록 유전자 돌연변이된 것이며(예: 미국 특허 제6,951,653호; 제6,355,255호 및 제6,270,775호 참조), 이.콜라이에서 재조합 단백질로서 발현된다.
다른 양태에 따르면, 본 발명은 pKa가 약 3.5 내지 약 7.5인 완충액으로 pH 완충된 식염수 용액, 계면활성제 및 엔.메닌지티디스 2086 단백질을 포함하고, 엔.메닌지티디스 2086 단백질 면역원성 조성물을 안정화시키는 제형에 관한 것이다. 엔.메닌지티디스 2086 단백질은 "ORF 2086"으로 동정된 개방 판독 프레임(ORF) 핵산 서열에 의해 암호화된다(예컨대, 국제공개공보 제WO 03/063766 A2호(국제 출원 제PCT/US02/32369호), 국제공개공보 제WO 04/094596 A2호(국제출원 제PCT/US04/011901호) 및 국제공개공보 제WO 04/065603 A2호(국제출원 제PCT/US04/000800호), 각각 본 발명에 참고인용됨) 참조). 또 다른 양태에서, 본 발명은 pKa가 약 3.5 내지 약 7.5인 완충액으로 pH 완충된 식염수 용액, 계면활성제, 알루미늄 염 및 엔.메닌지티디스 2086 단백질을 포함하고, 엔.메닌지티디스 2086 단백질의 알루미늄 염 애주번트(예: AlPO4)에 대한 결합률 및 항원 안정성을 최적화하는 제형에 관한 것이다.
본 명세서에서 인용된 모든 특허문헌 및 공보는 참고인용된 것이다.
본원 발명은 실리콘처리된 용기 수단 속에 포함된 다당류-단백질 접합체의 실리콘-유도된 응집을 억제하는 신규 제형 및 다당류-단백질 접합체를 안정화시키는 신규 제형을 제공한다.
도 1은 수평 궤도 진탕기에서 완만한 교반(60cpm) 전과 2일간의 완만한 교반 후의 연쇄상구균 C5a 펩티다제(SCP) 제형(주사기에 충전된 것)의 안정성을 도시한 것이다. 도 1a에 제시된 데이터는 Tween™80 부재하에(즉, 0%) 제형화된 SCP의 2일 안정성을 나타낸 것이고, 이에 반해 도 1b에 제시된 데이터는 0.025% Tween™80 존재하에 제형화된 SCP의 2일 안정성을 도시한 것이다. 도 1a 및 도 1b에 제시된 제형에 사용된 완충액은 석시네이트 완충 식염수(SBS), 포스페이트 완충 식염수(PBS) 및 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(TRIS)이다.
도 2는 AlPO4(0.25mg/ml) 존재하에 제형화되고 BD Hypak 주사기에 충전된 13vPnC를 500rpm 및 2 내지 8℃에서 2시간, 8시간 및 24시간 교반한 후에 총 항원성 상실을 도시한 것이다.
도 3은 AlPO4(0.25mg/ml) 존재하에 제형화되고 실리콘 미처리된 주사기에 충전된 13vPnC를 500rpm 및 2 내지 8℃에서 2시간, 8시간 및 24시간 교반한 후에 총 항원성 상실을 도시한 것이다.
도 4는 AlPO4(0.25mg/ml) 존재하에 제형화되고 Vetter 주사기에 충전된 13vPnC를 500rpm 및 2 내지 8℃에서 2시간, 8시간 및 24시간 교반한 후에 총 항원성 상실을 도시한 것이다.
도 5는 AlPO4(0.25mg/ml) 존재하에 제형화되고 Schott TopPac 주사기에 충전된 13vPnC를 500rpm 및 2 내지 8℃에서 2시간, 8시간 및 24시간 교반한 후에 총 항원성 상실을 도시한 것이다.
도 6은 AlPO4(0.25mg/ml)의 존재하에(도 6a) 및 부재하에(도 6b) 제형화되고 BD Baked 주사기에 충전된 13vPnC를 500rpm 및 2 내지 8℃에서 2시간, 8시간 및 24시간 교반한 후에 총 항원성 상실을 도시한 것이다.
도 7은 AlPO4(0.25mg/ml)의 존재하에(도 7a) 및 부재하에(도 7b) 제형화되고 BunderGlas PS2 주사기에 충전된 13vPnC를 500rpm 및 2 내지 8℃에서 2시간, 8시간 및 24시간 교반한 후에 총 항원성 상실을 도시한 것이다.
이하 실시예는 상세한 다른 기술이 없는 한, 당업자에게 공지된 통상적인 표준 기술에 의해 수행된다. 이하 실시예는 예시 목적으로 제공된 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 간주되어서는 안된다.
실시예 1
면역원을 안정화시키고 이의 응집을 방지하는 0.001% 내지 0.05% Tween™80을 포함하는 면역원성 제형
본 실시예에 사용된 다당류-단백질 접합체는 CRM197에 각각 접합된 에스.뉴모니에 혈청형 4, 6B, 9V, 18C, 19F, 14, 23F, 1, 3, 5, 6A, 7F 및 19A 유래의 협막 다당류를 포함하는 13가 폐렴구균 다당류 접합체(13vPnC)였다. 이 협막 다당류는 당업자에게 공지된 표준 기술로 제조했다. 간략히 설명하면, 각 폐렴구균 다당류 혈청형은 대두계 배지에서 증식시키고, 그 다음 원심분리, 침전, 한외여과 및 칼럼 크로마토그래피를 통해 각 다당류를 정제했다. 정제된 다당류는 접합을 위해 화학적으로 활성화시키고 각 다당류를 CRM197 담체 단백질에 각각 접합시켜 당접합체를 형성시킨 뒤, 1회 투여량 제형으로 제형화했다.
다당류의 화학적 활성화 및 담체 단백질에의 후속적인 접합은 통상의 방법으로 수행한다(예컨대, 미국 특허 제4,673,574호 및 제4,902,506호 참조). CRM197(와이어스, 노스캐롤라이나, 샌포드)은 카사미노산과 효모 추출물계 배지에서 증식된 코리네박테리움 디프테리아 균주 C7(β197)의 배양물로부터 분리된 디프테리아 독소의 무독성 변이체(즉, 톡소이드)이다. CRM197은 한외여과, 황산암모늄 침전 및 이온교환 크로마토그래피를 통해 정제된다.
후술된 항원성 실험은 각 다당류 혈청형에 특이적인 13가지 항혈청(Ab) 중 하나와 13vPnC 시료를 혼합한 뒤, 면역 복합체를 Array® 360 시스템(판매원: Beckman Coulter, Inc.; Fullerton, CA)에서의 광산란 측정을 통해 검출하여 수행했다. 검출된 13가지 혈청형 각각의 광산란 측정값을 그 다음 표준 곡선과 비교하고 항원성(㎍/ml)으로 기록했다.
주사기(BD Hypak SCF™) 및 주사기 마개(BD Hypak SCF™)는 비디 바이오사이언시스(뉴저지주, 프랭클린 레이크스)로부터 구입했다. Teflon®-라이닝(lining)된 밀봉장치를 구비한 투명한 보로실리케이트 바이알(VWR TraceClean™, 40mL)은 VWR™(펜실베이니아주, 웨스트 체스터)로부터 구입했다. 폴리소르베이트 80(Tween™80)은 제이.티.베이커(J.T. Baker)(Mallinckrodt Baker, Inc.; Phillipsburg, NJ)로부터 구입했다. 완충된 식염수는 pH 5.8의 석시네이트(5mM) 및 NaCl(0.85%)이었다.
13vPnC는 다음과 같이 상이한 계면활성제 농도(Tween™80; 0.001%, 0.005%, 0.01% 및 0.05%, 중량/용적)로 제형화했다(총 용적 500mL): 0.85% 식염수(150mM NaCl)를 1리터의 Pyrex® 유리 비이커에 첨가한 뒤, 50mM 석시네이트 완충액(최종 농도 5mM) 및 13vPnC를 첨가했다. 각 혈청형 접합체의 최종 농도는 4.4㎍/mL(단, 혈청형 6B는 8.8㎍/mL)였다. 그 다음, 13vPnC 제형을 5개의 별도의 유리 바이알(각 바이알당 50mL)에 나누고, 5개 바이알 중 하나에 0.0%, 0.001%, 0.005%, 0.01% 또는 0.05% Tween™80(w/v)을 첨가한 다음, 각 용액을 0.22㎛ Durapore® 필터(판매원: Millipore; Billerica, MA)를 통해 여과했다. 이어서, 각 용액 0.65mL를 w4432 회색 마개(판매원: BD Medical Pharmaceutical Systems; Franklin Lakes, NJ)를 구비한 3mL BD HYPAK™ SCF™ 유리 주사기에 각각 충전하고, 각 주사기를 수평 궤도 진탕기(60cpm)에 2 내지 8℃ 하에 100시간 동안 넣어두었다.
육안 조사 결과(데이터는 미제시), Tween™80의 부재(즉, 0.0%) 하에 제형화된 13vPnC는 수평 궤도 진탕기에서 완만한 속도의 교반시에, 2 내지 8℃에서 10분 이내에 용액으로부터 침전되기 시작하는 것으로 관측되었다. 이에 반해, 0.001%, 0.005%, 0.01% 또는 0.05% Tween™80에 제형화되고 2 내지 8℃에서 완만한 속도로 교반된 13vPnC는 25일까지도 어떠한 침전의 가시적 징후 없이(데이터는 미제시) 안정적이었다. 따라서, 이 데이터는 면역원성 조성물에의 계면활성제(예: Tween™80)의 첨가가 면역원성 조성물의 안정성을 증가시킨다는 것을 입증했다.
또한, 13vPnC의 제2 안정성 실험은 제형에의 계면활성제의 첨가가 13vPnC의 안정성을 유의적으로 증가시킨다는 것을 확인시켜 주었다. 이 실험에서, 13vPnC를 0.05% Tween™80의 존재 및 부재하에 제형화했다. Tween™80의 부재하에(즉, 0.0%) 제형화된 13vPnC는 다음과 같이 제조했다: 0.85% 식염수(150mM NaCl)를 1리터의 Pyrex® 유리 비이커에 첨가한 뒤, 50mM 석시네이트 완충액(최종 농도 5mM) 및 13pPnC를 첨가하여 총 용적을 500mL로 만들었다. 0.05% Tween™80의 존재하에 제형화된 13vPnC 제형은 다음과 같이 제조했다: 0.85% 식염수(150mM NaCl)를 1리터의 Pyrex® 유리 비이커에 첨가한 뒤, 50mM 석시네이트 완충액(최종 농도 5mM), 0.05% Tween™80 및 13vPnC를 첨가하여 총 용적을 500mL로 만들었다. 500mL 제형 중의 각 혈청형 접합체의 최종 농도는 4.4㎍/mL였다(단, 혈청형 6B는 8.8㎍/mL였다). 500mL 제형을 로터/스테이터(rotor/stator) 균질기를 통해 6,000rpm(2 내지 8℃)으로 120분 동안 균질화했다. 균질화 공정은 공기-액체 계면(공기 기포 포함)을 형성시켰다.
0.05% Tween™80의 존재(표 1) 및 부재(표 1) 하의 13vPnC 제형의 안정성을 다음과 같이 2시간의 기간 동안 평가했다: 0.0% 및 0.05% Tween™80 제형으로부터 0분, 30분 및 120분째에 시료(20 내지 30mL)를 채취하고, 이 시료를 단백질 희석제(Array® 360 단백질 희석제(카탈로그 번호 663630); 판매원: Beckman Coulter, Inc.; Fullerton, CA)로 1:2로 희석하고, 13vPnC의 13가지 혈청형 모두의 항원성을 Array® 360 시스템 상에서 분석했다(표 1 참조).
표 1에 제시된 바와 같이, 13가지 혈청형 다당류(Tween™80의 부재하에 제형화됨)의 2시간 분석 동안의 항원성은 유의적으로 감소되었다. 하지만, 0.05% Tween™80을 포함하는 13vPnC 제형(표 1)은 2시간 항원성 분석 동안 항원성의 어떠한 감소없이 건실한 안정성을 상당히 보여주었다.
Figure 112018118905052-pat00001
추가로, 13vPnC/Tween™80 제형을 높은 전단력에 대한 안정성에 대해 검사했다. 이 실험에서, 100mL의 13vPnC 조성물(4.4㎍/mL의 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F, 및 8.8㎍/mL의 혈청형 6B, 5mM 석시네이트 완충액, 150mM NaCl 및 0.25mg/ml AlPO4)을 0.0%, 0.01% 또는 0.05% Tween™80을 포함하는 3개의 250mL 유리병에 첨가했다. 이 3개의 병을 그 다음 와동기(vortexer)(Vortex-Genie®2; 판매원: Scientific Industries, Inc.; Bohemia, NY)에서 30분(2 내지 8℃) 동안 와동시켰고, 최대 속도 세팅에서 공기-액체 계면이 형성되었다. 30분 후, 각 병마다 10 내지 30ml 시료를 채취하고, Array® 360 단백질 희석제에 1:2로 희석하고, 13가지 혈청형의 항원성을 Array® 360 시스템에서 분석했다.
이하 표 2에서 관찰할 수 있듯이, Tween™80의 부재하에(0.0%) 제형화된 13vPnC는 와동 후 평균 20% 감소된 항원성을 나타냈다. 0.01% Tween™의 존재하에 제형화된 13vPnC는 2 내지 10% 범위(평균 8%)의 항원성 감소를 나타냈고, 0.05% Tween™80의 존재하에 제형화된 13vPnC는 0 내지 8% 범위(평균 3%)의 항원성 감소를 나타냈다. 따라서, 표 2에 제시된 데이터는 0.01% 또는 0.05% Tween™80의 존재하에 제형화된 13vPnC가 Tween™80의 부재하에 제형화된 13vPnC에 비해 전단력에 대하여 상당히 안정화되었다는 것을 보여준다.
Figure 112018118905052-pat00002
실시예 2
계면활성제를 포함하는 제형은 연쇄상구균 C5a 펩티다제를 안정화시키고 이의 응집을 방지한다.
본 실시예에 사용된 연쇄상구균 C5a 펩티다제(SCP)는 다음과 같이 발현 및 정제했다. SCP는 아라비노스 유도성 시스템을 이용하여 이.콜라이에서 재조합 발현시켰다. 이어서, 비동물성 제한 배지를 이용한 이.콜라이의 표준 발효 프로토콜과 후속 세포 용균을 수행했다. 세포 용균물의 가용성 분획으로부터 12 내지 24시간 동안 교반 하에 60% 황산암모늄(약 3M)까지의 포화도를 이용하여 재조합 SCP를 정제했다. 포화 용균물을 원심분리하고, 상청액을 유지시켜 페닐 세파로스 소수성 상호작용 칼럼 위에 로딩했다. 결합된 물질을 그 다음 1M 황산암모늄, 20mM Tris-Cl, pH 7.5로 용출시키고, 농축한 다음, PBS(pH 7.4)에 대해 정용여과했다. 정제된 재조합 SCP(rSCP)를 PBS(pH 7.4)로 약 10mg/ml로 희석하고, 포시다인(Posidyne) 필터를 통해 통과시켜 내독소를 제거한 다음, 멸균을 위해 최종 여과(0.2mM)한 뒤, 동결보관(-25℃)했다.
이어서, 정제된 SCP(55㎍/ml)를 다음과 같은 완충액, 즉 5mM 석시네이트 완충액(pH 6.0), 10mM 포스페이트 완충액(pH 7.0), 10mM 포스페이트 완충액(pH 7.4) 또는 10mM 트리스 완충액(pH 7.5)에서 0.025% Tween™80의 존재 또는 Tween™80의 부재(0.0%)하에 제형화하고, 별도의 BD Hypak SCF™ 주사기에 충전했다. 그 다음, 주사기를 수평 궤도 진탕기에 놓고 2 내지 8℃에서, 180cpm으로 2일 동안 진탕하고, SCP 단백질 농도를 변형된 로우리 분석법으로 측정했다.
도 1에 도시된 바와 같이, SCP의 안정성은 Tween™80의 존재하에 제형화되었을 때 크게 향상되었다. 예를 들어, 궤도 진탕기에서 2일 후, Tween™80의 부재하에 제형화된 SCP(도 1a)는 검사된 각 완충액의 SCP 농도가 유의적으로 감소된 것으로 확인되었다(예컨대, 90% 넘는 감소). 하지만, 도 1b에 도시된 바와 같이, 2일간 궤도 진탕기에 배치하기 전에 SCP 완충액 제형에의 0.025% Tween™80의 첨가는 도 1a에서 관찰된 SCP 상실을 완전하게 억제했다.
또한, SCP/Tween™80(0.025%) 제형의 보관 안정성을 25℃와 37℃에서 각각 8주 및 6주 동안 평가했다(데이터는 미제시). 간략히 설명하면, SCP(200㎍)를 다음과 같은 석시네이트 완충액 또는 포스페이트 완충액에 제형화했다; 석시네이트 완충액(5mM, pH 6.0) 또는 포스페이트 완충액(15mM, pH 7.4), 0.9% NaCl 및 0.025% Tween™80. SCP/Tween™80 제형의 안정성을 크기 배제 HPLC, 변형된 로우리 총 단백질 분석법 및 침전의 육안조사를 통해 분석했다. 본 연구에서, SCP/Tween™80 제형(어떠한 완충액에서든지)은 전체 안정성 연구 기간 동안(즉, 각각 8주 및 6주까지) 25℃ 및 37℃에서 완전하게 안정한 것으로 관측되었다.
실시예 3
실리콘처리된 용기 수단이 13vPnC의 안정성에 미치는 영향
사전 실험에서는 Dow Corning® 의료 등급의 DC 360 실리콘으로 처리되고 West 4432/50 라텍스 미함유 마개(클로로부틸) 및 EZ 팁 캡 West 7025/65(합성 이소프렌 브로모부틸 블렌드; West Pharmaceutical®, Lionville, PA)로 캡이 씌워진 즉시 사용가능한 (1회 용량) Becton Dickinson®(BD) Hypak 1형 보로실리케이트 유리 주사기에 13vPnC 면역원성 조성물을 충전하면, 그 조성물이 침전하고/하거나 응집하는 것으로 나타났다(데이터는 미제시). 이 실험에서 13vPnC는 0.85% NaCl 및 4.4㎍/mL 에스.뉴모니에 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F, 및 8.8㎍/mL 에스.뉴모니에 혈청형 6B를 함유하고 애주번트로서 0.25mg/ml 알루미늄 포스페이트가 존재 및 부재하는 5mM 석시네이트 완충액에 제형화했다. AlPO4의 부재 하에서는 13vPnC 미립자를 쉽게 관측할 수 있는 반면, AlPO4의 존재 하에서는 13vPnC 미립자가 유의적으로 감소되어 검출하기가 더욱 어려운 것으로 관측되었다.
본 실시예에서는 일련의 용기 및 밀봉장치 구성요소(즉, 용기 수단)를 조사하여 어떠한 구성요소가 13vPnC 미립자 형성을 유도하거나 이에 관여하는지를 확인했다. 검사한 용기수단은 주사기, 마개 및 바이알을 포함하며, 이하 표 3에 열거한 바와 같다. 표 3에 열거된 BD 및 West 마개는 후버(Huber)법 또는 자(Jar)법을 이용하여 실리콘처리했다. 실리콘화의 후버법은 제어성이 좋고 마개 표면에 30 내지 60㎍/㎠의 실리콘을 제공한 반면, 실리콘화의 자법은 마개의 표면에 150 내지 300㎍/㎠의 실리콘을 초래했다. 이론적 계산에 따르면, 마개 표면적의 약 15%가 주사기 내의 생성물에 노출되는 바, 후버법 및 자법의 경우 마개로부터 각각 4.5 내지 9㎍ 및 22.5 내지 45㎍의 실리콘이 추출될 수 있음을 시사한다.
재료
실리콘은 Dow Corning® 360 Medical Fluid 100 센티스트로크(배치(batch) 번호 0001846266)였다. 7vPnC를 0.85% NaCl 및 4.4㎍/mL 에스.뉴모니에 혈청형 4, 9, 14, 18C, 19F 및 23F, 및 8.8㎍/mL 에스.뉴모니에 혈청형 6B를 함유하고 0.25mg/ml 알루미늄 포스페이트가 존재 및 부재하는 5mM 석시네이트 완충액에 제형화했다. 13vPnC는 0.85% NaCl 및 4.4㎍/mL 에스.뉴모니에 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F, 및 8.8㎍/mL 에스.뉴모니에 혈청형 6B를 함유하고 0.25mg/ml 알루미늄 포스페이트가 존재 및 부재하는 5mM 석시네이트 완충액에 제형화했다. 1가 에스.뉴모니에 혈청형 6B를 13vPnC 제형의 총 당류 농도를 모의실험하기 위해 61㎍/ml의 농도로 제형화했다(알루미늄 포스페이트 부재하에 0.85% NaCl을 함유하는 5mM 석시네이트 완충액).
방법
7vPnC 및 13vPnC를 전술한 바와 같이 제형화하고, 주어진 제형 35ml를 투명한 250ml Nalgene® 병에 첨가했다. 각 Nalgene® 병에, 표 3에 열거된 용기 수단 구성요소를 부가했다. 그 다음, Nalgene® 병을 Labline® Orbit Shaker에 놓고 하룻밤 동안 50rpm으로 회전시켰다. 결과는 표 3에 정리했다.
가시적 외관. 각 용기 수단 구성요소를 포함하는 Nalgene® 병을 실험실의 형광 조명 하에 유지시켰다. 시료를 통해 통과하는 광선의 경로(틴들 효과)에 의해 미립자의 검출이 가능하였다.
단백질 분석. 총 단백질 및 알루미늄에 결합된 단백질은 제형화된 면역원성 조성물에 존재하는 총 단백질 농도 및 알루미늄 펠릿에 결합된 단백질을 각각 계측하여 측정했다(면역원성 조성물의 일정량을 원심분리하고 펠릿을 식염수에 재현탁시켰다). 표준물질로서 소 혈청 알부민을 사용하여 피어스(Pierce)사의 변형된 로우리 단백질 분석법(카탈로그 #23240)으로 분석을 수행했다.
결과
1차 실험에서, 13vPnC 면역원성 조성물을 AlPO4 부재하에 제형화하고 이하 표 3에 열거된 일련의 용기 수단에 노출시켰다. 실리콘 오일로 처리된 용기 수단 구성요소가 백색 입자의 형성을 유도한다는 것을 데이터로부터 분명하게 알 수 있었다(표 3). 이에 반해, 실리콘 미처리된 Daikyo® 마개(판매원: Daikyo Seiko, Ltd., 일본) 및 쇼트(Schott) 바이알(판매원: Schott North America Inc.; Lebanon, PA)의 존재 하에서는 어떠한 미립자도 검출되지 않았다.
Figure 112018118905052-pat00003
1가 에스.뉴모니에 혈청형 6B를 13vPnC의 모델로서 선택하여 13vPnC 제형의 총 당류 농도를 모의실험하기 위해 61.6㎍/ml(AlPO4 부재) 농도로 제형화했다. 제형화된 1가 6B의 일정량에 실리콘(Dow Corning 360 Medical Fluid)을 2ppm 내지 100ppm 범위로 첨가했다. 이 혼합물을 Lablie® Orbit Shaker에 놓고 50rpm으로 2시간 동안 진탕했다. 이하 표 4에 제시된 바와 같이, 모든 실리콘(Si) 농도에서 섬유형 백색 미립자가 관측되었다.
Figure 112018118905052-pat00004
또한, 13vPnC 제형(AlPO4 부재)에 존재하는 실리콘의 양도 조사했다. 이 실리콘 농도는 DC Plasma Emission Spectroscopy로 측정했다(데이터는 미제시). 이 방법에서, 25개 주사기의 내용물을 모아서, 사이클로헥산/이소프로필 알콜 혼합물의 50ml 2분획으로 추출했다. 추출물을 합하여 증발시켰다. 잔류물을 가용화하고 고무 마개의 실리콘 측정에 관한 종래 방법에 따라 검사했다. 결과는 각 주사기로부터 15.8 내지 19.0㎍의 실리콘이 추출될 수 있는 것으로 나타났다. 이 양은 실리콘의 2.7% 내지 3.3%에 해당한다.
다른 일련의 실험으로서, 13vPnC를 AlPO4의 존재하에 제형화하고 표 3에 제시된 동일한 용기 수단으로 처리한 결과, 용액 중의 실리콘 및 "유리" 단백질(13vPnC)이 미립자 형성의 원인인 것으로 밝혀졌다(데이터는 미제시). 미립자의 FTIR 분석 결과에서도 미립자가 단백질과 실리콘으로 구성되어 있는 것으로 나타났다(데이터 미제시). 이러한 실험을 통해, 약 85%의 13vPnC가 AlPO4에 결합되어 있고, 나머지 15%가 유리(AlPO4에 결합되지 않음) 13vPnC로 용액에 존재하는 것으로 측정되었다. 이에 반해, AlPO4의 존재하에 제형화된 7vPnC는 AlPO4에 100% 결합된 것으로 관측되었다(데이터 미제시).
미립자의 형성에 미치는 유리 단백질-다당류의 효과를 밝히기 위해, 7vPnC 및 13vPnC를 각각 25ml씩 분취하여 50ml 원심분리 관에 옮겨 담았다. 시료를 3,000rpm 하에 10분 동안 원심분리하고 상청액을 조심스럽게 추출하여 Nalgene® 병에 담았다. 10개의 실리콘 처리된 마개(4432 마개)를 각 병에 부가하고 궤도 진탕기에서 50rpm 하에 진탕했다. 신중한 육안 조사 후, 7vPnC 상청액에는 어떠한 미립자 형성도 나타나지 않아서 투명한 무색을 유지하는 것으로 관측되었다. 하지만, 13vPnC 상청액은 4시간의 관측이 지나서 낮은 수준의 미립자를 나타내기 시작했다(데이터는 미제시). 이러한 결과는 실리콘과 함께 용액 중의 유리 단백질-다당류가 미립자 형성의 원인이라는 것을 시사했다.
미립자 형성에 미치는 용액 중의 유리 단백질-다당류의 기여도를 더욱 밝히기 위하여, 알루미늄에 대한 높은 결합성 및 낮은 결합성으로 인해, 각각 1가 에스.뉴모니에 혈청형 4 및 6B를 선택했다. 이들 2가지 1가물을 AlPO4의 부재 및 존재 하에 25㎍/ml 내지 200㎍/ml 범위의 단백질 농도로 제형화했다. 10개의 실리콘처리된 마개(4432 마개)를 각 제형에 넣고, 그 다음 궤도 진탕기에 배치하여 50rpm으로 진탕했다. 이하 표 5에 제시된 바와 같이, AlPO4 부재하에 모든 단백질 농도에서 두 1가 혈청형의 경우 섬유형 백색 미립자가 관측되었다. 하지만, AlPO4의 존재 하에서는 혈청형 6B(200㎍/ml)에 비해 더 낮은 농도의 혈청형 4(100㎍/ml)에서 미립자가 검출되었고, 이 데이터는 제시하지 않았다.
Figure 112018118905052-pat00005
실시예 4
알루미늄 애주번트는 실리콘처리된 용기 수단의 존재 하에 13vPnC 미립자의 형성을 억제한다
실시예 3에서 전술한 바와 같이, 13vPnC 면역원성 조성물은 0.85% NaCl 및 5mM 석시네이트 완충액(pH 5.8) 중에 4.4㎍/mL 에스.뉴모니에 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F, 및 8.8㎍/mL 혈청형 6B를 포함하고, 애주번트(예: 알루미늄 애주번트)의 존재 또는 부재하에 제형화될 수도 있는 액체 제형이다. 또한, 13vPnC는 0.25mg 알루미늄/ml 알루미늄 포스페이트(AlPO4)와 같은 애주번트의 존재 또는 부재하에 제형화될 수도 있다. 실시예 3에서 관찰된 바와 같이, AlPO4 부재하에 제형화되어 BD Hypak SCF™ 주사기(Hypak 플런저로 캡이 씌워진)에 충전된 13vPnC는 미립자의 관찰로 인해 육안조사에 실패했고, 추가 연구를 통해 미립자가 부분적으로 실리콘과 단백질-다당류 상호작용의 결과인 것으로 밝혀졌다. 다음 실시예에서는 각종 공급업자로부터 입수한 주사기(및 플런저)를 13vPnC 제형을 사용하여 평가했으며, 여기서 운송 및 취급 조건은 교반을 통해 모의실험했다(이하에 설명됨).
재료
13vPnC를 0.85% NaCl 및 4.4㎍/mL 에스.뉴모니에 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F, 및 8.8㎍/mL 에스.뉴모니에 혈청형 6B를 함유하고 0.25mg/ml 알루미늄 포스페이트가 존재 및 부재하는 5mM 석시네이트 완충액에 제형화했다. 검사된 용기 수단은 이하 표 6에 열거했다.
Figure 112018118905052-pat00006
방법
제형화 및 충전 방법. 이하 표 7에는 2리터 13vPnC 제형의 제법이 열거되어 있다. 간략히 설명하면, 유리 비이커에 먼저 0.85% NaCl을 첨가한 다음, 5mM 석시네이트 완충액(pH 5.8)을 첨가하고, 이어서 각각의 에스.뉴모니에 혈청형 접합체를 첨가했다. 이 제형을 그 다음 교반기 판에서 완만한 속도로 혼합하고 0.22㎛ Millipore® 필터 단위를 통해 여과했다. AlPO4를 포함하는 제형을 위해, AlPO4(0.25mg/ml 최종 농도)를 이어서 첨가하고 이 제형을 완만한 속도로 혼합했다. 그 후, 검사 주사기에 충전하고(0.58ml/주사기), 플런저로 캡을 씌웠다.
교반을 통한 운송 모의실험. VWR® 시그너쳐 디지털 멀티튜브 와동기(signature Digital Multitube vortexer)(카탈로그 번호 14005-826)를 사용하여 시료를 교반했다. 13vPnC가 충전된 주사기를 수평으로 놓고 와동기의 두 지지판으로 고정시켰다. 시료를 수평 위치에 유지시키고 2 내지 8℃에서 24시간 동안 500rpm 중지 방식(pause mode)으로 교반했다.
비탁법. 혈청형 특이적 항원성을 혈청형 특이적 항체를 이용하여 비탁도 검정법(rate nephelometry assay)으로 측정했다. AlPO4 존재하의 13vPnC의 경우, 1N NaOH를 첨가하여 알루미늄 포스페이트를 용해시켰다. 이 용액에 1M 시트르산을 첨가하여 즉시 중화시켰다. AlPO4 부재하의 13vPnC의 경우에는 어떠한 가용화 및 중화 절차도 수행하지 않았다. 이 검정법은 Beckman Array 360 비탁계를 이용하여 시료 중에 형성된 항체-항원 복합체로부터의 광산란 강도의 변화율을 측정한다.
Figure 112018118905052-pat00007
결과
본 연구에서는 실리콘 수준이 상이한 여러 공급업자의 주사기(표 6)를 제어된 교반 조건으로 처리했다. 각 혈청형의 총 항원성을 교반전 및 교반후 시료에 대하여 비탁도 검정법으로 측정했다. 교반 후의 항원성 상실(백분율)을 계산했고, 도 2 내지 도 7에 제시했다.
이 연구 전에, 교반 조건을 다음의 2가지 대조군의 항원성 상실을 기초로 하여 최적화했다: (1) 최악의 대조군(양성 대조군, 높은 실리콘; 도 2) 및 (2) 최상의 대조군(음성 대조군, 실리콘 부재; 도 3). 이어서, 이 조건을 항원성 상실이 양성 대조군에서는 낮고 음성 대조군에서는 검출가능할 정도가 되도록 최적화했다. 이는 교반이 주사기에서 침전을 발생하기에 지나치게 약하거나, 실리콘 상호작용 외에 다른 요인(예: 전단력)에 의해 침전이 유발될 수 있을 정도로 지나치게 강하지 않도록 했다. 따라서, 500rpm(중지 방식)에서 24시간 동안의 교반을 가장 적합한 교반 조건으로 선택했고, 2 내지 8℃의 온도와 수평 위치를 사용하여 실시간 제품 운송 및 취급의 조건을 모의실험했다.
본 연구의 결과는 요약하면 다음과 같다: AlPO4 존재하에 제형화된 13vPnC의 최대 항원성 상실은 실리콘 수준이 더 높은 주사기에서 발생했다(데이터는 미제시). 예를 들어, 표 6에 열거된 주사기 중에서, BD Hypak 주사기(대조군 1), BD Baked 주사기(주사기 3; 0.1mg 실리콘), BD 고점도(주사기 5) 및 BunderGlas PS4 주사기(주사기 8, 0.14mg 실리콘)는 각각 10%가 넘는 항원성 상실을 나타내는 하나 이상의 13vPnC 혈청형을 보유했다. AlPO4 존재하에 제형화된 13vPnC의 가장 작은 항원성 상실은 실리콘 수준이 더 낮은 주사기에서 나타났다. 예컨대, Vetter 주사기(도 4) 및 Schott TopPac 플라스틱 주사기(도 5)는 AlPO4 존재하에 제형화된 13vPnC의 항원성 상실이 적게 나타나, 실리콘 미처리된 주사기(도 2)와 가장 유사했다.
실리콘처리된 주사기의 존재 하에 13vPnC를 안정화시키고 미립자 형성을 억제하는데 미치는 알루미늄 포스페이트의 영향을 0.25mg/ml AlPO4의 존재 및 부재 하에 제형화된 13vPnC를 이용한 실험에서 분석했고, 여기에 사용된 주사기는 BD Baked 저 실리콘 주사기(표 6의 주사기 4) 및 BunderGlas 저 실리콘 PS2 주사기(표 6의 주사기 7)였다. BD Baked 저 실리콘 주사기(0.04mg 실리콘/주사기통)는 통상적으로 AlPO4 존재하에 제형화된 13vPnC 혈청형(도 6a)의 항원성 상실률이 10% 미만인 반면, AlPO4 부재하에 제형화된 13vPnC 혈청형(도 6b)의 항원성 상실은 5%(혈청형 1) 내지 최대 약 50%(혈청형 23F)의 범위였다. BunderGlas 저실리콘 PS2(0.056mg 실리콘/주사기통) 주사기는 AlPO4 존재하에 제형화된 13vPnC(도 7a)의 항원성 상실이 5 내지 8% 미만(혈청형에 따라)인 반면, AlPO4 부재하에 제형화된 13vPnC 혈청형(도 7b)의 항원성 상실은 약 5% 내지 약 30%(혈청형에 따라) 범위였다.
따라서, 이러한 데이터를 종합해보면, (1) 13vPnC의 항원성 상실은 실리콘 수준이 높은 주사기에서 더 컸고, (2) AlPO4 부재하에 제형화된 13vPnC는 검사된 모든 주사기에서 AlPO4 존재하에 제형화된 13vPnC보다 더 큰 항원성 상실을 지속했다.
실시예 5
계면활성제를 포함하는 제형은 알루미늄 염 애주번트에 대한 수막구균 항원 단백질의 결합을 최적화한다.
본 실시예에서 사용된 재조합 지질화된 엔.메닌지티디스 2086 단백질(rLP2086)은 다음과 같이 발현 및 정제했다. rLP2086은 천연 리더 서열을 이용하여 이.콜라이에서 재조합 발현되었다. 비동물성 제한 배지를 이용한 이.콜라이의 표준 발효 프로토콜 및 후속 세포 용균은 다음과 같이 실시했다. 재조합 지질화된 엔.메닌지티디스 2086 단백질은 50mM 트리스-HCl/5mM EDTA/1% 사르코실 pH 8을 이용하여 막 펠릿으로부터 정제했다. 이 사르코실 추출물은 1% Zwittergent 3-14(Z3-14)로 조정하고 30배 과량의 50mM 트리스-HCl/5mM EDTA/1% Z3-14에 대해 2회 투석했다. 투석된 rLP2086 추출물을 90% 에탄올로 침전시켜 남은 사르코실을 제거하고, 50mM 트리스-HCl/5mM EDTA/1% Z3-14 pH 8로 용해시켰다. 불용성 물질을 원심분리로 제거하고, 상청액을 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼을 통해 통과시켜, rLP2086을 미결합 분획 중에 수집했다. 미결합 물질은 그 다음 30배 과량의 25mM NaAc/1% Z3-14 pH 4.5에 대해 2회 투석하고 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼을 통해 통과시켰다. rLP2086은 0 내지 0.3M NaCl 구배로 용출시키고 동결 보관했다(-25℃).
정제된 rLP2086은 그 다음 150mM NaCl, 0.020% Tween™80, 0.25mg Al/ml AlPO4의 존재하에 다음과 같은 완충액 중에 제형화했다: 10mM 포스페이트 완충액(pH 7.0) 및 5mM 석시네이트 완충액(pH 6.0). 표 8은 AlPO4 애주번트에 대한 단백질 결합 백분율을 비교한 것이다.
Figure 112018118905052-pat00008
참고문헌
Figure 112018118905052-pat00009
Figure 112018118905052-pat00010

Claims (8)

  1. (i) pH 완충된 식염수 용액 중의 염이 염화나트륨인, pKa가 3.5 내지 7.5이고, pH가 6.0인 완충액으로 pH 완충된 식염수 용액, (ii) 알루미늄 염, (iii) 폴리소르베이트 80, 및 (iv) 농도가 120 μg/ml인 재조합 지질화된 엔.메닌지티디스(N.meningitidis) 2086 단백질을 포함하며, 엔.메닌지티디스 2086 단백질의 항원 안정성 및 인산알루미늄에 대한 결합 백분율을 최적화하는 제형으로 충전된, 실리콘 처리된 용기.
  2. 제1항에 있어서, 완충액이 석시네이트, 히스티딘, 포스페이트 또는 시트레이트인, 실리콘 처리된 용기.
  3. 제1항에 있어서, 완충액이 최종 농도 1mM 내지 10mM인 석시네이트인, 실리콘 처리된 용기.
  4. 제1항에 있어서, 카사미노산, 슈크로스, 젤라틴, 페놀 레드, N-Z 아민, 모노칼륨 디포스페이트, 락토스, 락트알부민 가수분해물 또는 분유를 포함하는, 실리콘 처리된 용기.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 유리 주사기인, 실리콘 처리된 용기.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로 사용하기 위한, 실리콘 처리된 용기.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 백신으로 사용하기 위한, 실리콘 처리된 용기.
  8. 삭제
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