ES2712956T3 - Formulaciones que estabilizan e inhiben la precipitación de composiciones inmunogénicas - Google Patents

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Abstract

Un medio de recipiente siliconado cargado con una formulación que inhibe la agregación inducida por silicona de un conjugado de polisacárido-proteína comprendido en un medio de recipiente siliconado, formulación que comprende (i) una solución salina con pH tamponado, en la que el tampón tiene un pKa de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 7,5, (ii) una sal de aluminio y (iii) uno o más conjugados de polisacárido-proteína en la que el conjugado de polisacárido-proteína comprende uno o más polisacáridos de neumococos

Description

DESCRIPCION
Formulaciones que estabilizan e inhiben la precipitacion de composiciones inmunogenicas
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere generalmente los campos de inmunologfa, bacteriologfa, formulacion de vacunas, estabilidad de protemas y desarrollo de procedimientos. Mas particularmente, la invencion se refiere a nuevas formulaciones que inhiben la precipitacion de composiciones inmunogenicas.
Antecedentes de la invencion
En las tecnicas biofarmaceuticas se acepta generalmente que la mejora de la estabilidad de una composicion inmunogenica (por ejemplo, un inmunogeno de protema, un conjugado de polisacarido-protema) es un objetivo necesario y altamente deseable. Por ejemplo, una composicion inmunogenica debe parecer recien preparada, elegante y profesional cuando se administra a un paciente. Cualquier cambio en la estabilidad y/o aspecto ffsico de la composicion inmunogenica, tal como cambio de color, opacidad o turbidez puede hacer que un paciente o consumidor pierda la confianza en el producto. Ademas, debido a que muchas formulaciones inmunogenicas se dispensan en recipientes de multiples dosis, con el tiempo se debe asegurar la uniformidad del contenido dosis del principio activo (por ejemplo, un conjugado polisacarido-protema) (por ejemplo, una solucion turbia puede conducir a un patron de dosis no uniforme). Ademas, la composicion inmunogenica debe ser activa durante su vida util "esperada", en la que cualquier descomposicion de la composicion inmunogenica a una forma inactiva o de otro modo no deseada (por ejemplo, un agregado) disminuye la concentracion total del producto.
Varios informes en la bibliograffa han sugerido que la estabilidad de una composicion inmunogenica en particular (por ejemplo, un inmunogeno de protema, un conjugado de polisacarido-protema) es al menos en parte dependiente de la protema espedfica o protema vehmulo (Ho y col., 2001; Ho y col., 2002; Bolgiano y col., 2001). Por ejemplo, el analisis de estabilidad de polisacaridos de meningococos C (MenC) y polisacaridos de tipo b de Haemophilus influenzae (Hib), conjugados a cualquiera de un toxoide del tetanos (TT) o una protema vehmulo de CRM197, revelo diferentes perfiles de estabilidad dependientes de la protema vehmulo (Ho y col., 2002). En otro estudio (Ho y col., 2001), se analizaron conjugados de MenC-CRMw de dos fabricantes diferentes (Ho y col., 2001), en los que los conjugados de MenCCRMw difenan en su qmmica de conjugacion y longitud del polisacarido conjugado (teniendo ambos la misma protema vehmulo, CRM197). Algunos datos de este estudio indicaban adicionalmente que algunos factores tales como la qmmica de conjugacion (por ejemplo, aminacion reductora ya sea directamente o a traves de un grupo espaciador qmmico), numero de sitios de conjugacion, longitud de la cadena de polisacaridos, pH, tampon de almacenamiento, temperatura o temperaturas de almacenamiento y ciclos de congelacion/descongelacion tambien influyen en la estabilidad de una composicion inmunogenica.
Por lo tanto, cuando se desarrolla una formulacion para una composicion inmunogenica, se deben considerar muchos factores para asegurar un producto seguro, estable, robusto y rentable. Tales consideraciones incluyen, pero no se limitan a, estabilidad qmmica de la composicion inmunogenica (por ejemplo, hidrolisis de sacaridos, despolimerizacion de polisacaridos, proteolisis o fragmentacion de protemas), estabilidad ffsica/termica de la composicion inmunogenica (por ejemplo, agregacion, precipitacion, adsorcion), compatibilidad de la composicion inmunogenica con el recipiente/sistema de cierre, interacciones entre composicion inmunogenica e ingredientes inactivos (por ejemplo, tampones, sales, excipientes, crioprotectores), el procedimiento de fabricacion, la forma de dosificacion (por ejemplo, liofilizada, lfquida), las condiciones ambientales encontradas durante el transporte, almacenamiento y manipulacion (por ejemplo, temperatura, humedad, fuerzas de cizallamiento), y el tiempo de duracion entre la fabricacion y el uso.
En la tecnica se ha sugerido, que el aceite de silicona, que induce cambios conformacionales en la estructura secundaria y terciaria de protemas, podnan ser responsables de la agregacion/precipitacion observada en ciertas preparaciones farmaceuticas de protemas (Jones y col., 2005). Por ejemplo, varios informes en la decada de 1980 implicaban a la liberacion de aceite de silicona desde jeringas de plastico desechables como el agente causal en la agregacion de insulina humana (Chantelau y Berger, 1985; Chantelau y col., 1986; Chantelau, 1989; Bernstein, 1987; Baldwin, 1988; Collier y Dawson, 1985). Chantelau y col. (1986) observaron que despues de tres o mas retiradas de una preparacion de insulina de diez dosis (usando una jeringa desechable siliconada), el vial comenzana a presentar turbidez debido a la contaminacion por aceite de silicon, dando como resultado de este modo agregacion y desactivacion de la insulina (Chantelau y col., 1986). De forma paradojica, en aceite de silicona es un componente necesario para las jeringas de plastico, ya que sirve para lubricar el embolo de goma y facilitar la transferencia del embolo hacia abajo desde el cilindro de la jeringa (es decir, el aceite de silicona mejora la inyectabilidad de la formulacion).
Ademas, el uso de aceite de silicona no se limita a jeringas, ya que se usa como revestimiento de viales de vidrio para reducir al mmimo la adsorcion de protemas, como un lubricante para evitar el conglomerado de los tapones de goma durante los procedimientos de llenado, como un lubricante fundamental para la procesabilidad/maquinabilidad de los cierres de vidrio y elastomeros y como un lubricante para facilitar la penetracion de la aguja de tapones de goma de los viales. Ademas, la siliconizacion de jeringas, viales de vidrio, tapones de goma y similares, no es un procedimiento bien controlado ni estandarizado, y como tal, existe un alto grado de variabilidad del contenido de aceite de silicona de un lote a otro
El documento EP2425856 (tecnica anterior bajo el Art. 53(3) EPC) desvela una composicion inmunogenica multivalente que comprende 13 conjugados polisacarido-protefna distintos.
El documento WO 2007/060548 (tecnica anterior bajo el Art. 53(3) EPC) desvela protefnas hfbridas y en tandem de una protefna de Neisseria meningitidis denominada NMB 1870.
El documento WO 01/41800 desvela composiciones y procedimientos para la preparacion de conjugado MenC-CRM197.
El documento US2004/047882 desvela una vacuna de dos componentes que contiene una primera vacuna, adyuvantada con una emulsion de aceite en agua que comprende un 5 % de escualeno, un 0,5 % de polisorbato 80 y un 0,5 % de trioleato de sorbitan en tampon de citrato acuoso a pH 6,5 y una segunda vacuna no adyuvantada como companeros de combinacion para aplicacion simultanea, separada o en fase para la inmunizacion contra enfermedades infecciosas vfricas, bacterianas o parasfticas.
El documento WO 02/05846 desvela una vacuna de combinacion cuadrivalente que comprende el toxoide de difteria, el toxoide del tetanos, celulas enteras de Pertussis y HBsAg y un procedimiento para preparar la misma. En la preparacion de la vacuna de combinacion DTwPH, el toxoide difterico y el toxoide tetanico se adsorben sobre geles de fosfato de aluminio (AlPO4) y el HBsAg se adsorbe sobre gel de hidroxido de aluminio (Al(OH)3).
Por lo tanto, existe una continua necesidad en la tecnica de formulaciones que aumenten la estabilidad inhiban la precipitacion de composiciones inmunogenicas.
Sumario de la invencion
La presente invencion se refiere ampliamente a formulaciones que estabilizan e inhiben la precipitacion de composicion inmunogenicas. De forma mas especffica en ciertas realizaciones, la presente invencion se refiere a nuevas formulaciones que inhiben la precipitacion de composiciones inmunogenicas contenidas en medios de recipiente. En una realizacion especffica, la invencion se refiere a nuevas formulaciones estabilizan las composiciones inmunogenicas frente a interacciones con aceite de silicona, fuerzas de cizallamiento y agitacion en el transporte.
Por lo tanto, en ciertos aspectos, la divulgacion se refiere a formulaciones que estabilizan un conjugado de polisacarido-protefna, formulacion que comprende (i) una solucion salina con pH tamponado, en la que el tampon tiene un pKa de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 7,5, (ii) un tensioactivo y (iii) uno o mas conjugados de polisacarido-protefna. En un aspecto especffico, la formulacion de conjugado de polisacarido-protefna esta contenida en un medio de recipiente. En ciertos aspectos, el medio de recipiente se selecciona entre uno o mas del grupo que consiste en un vial, un tapon de vial, un cierre de vial, un cierre de vidrio, un cierre de goma, un cierre de plastico, una jeringa, un tapon de jeringa, un embolo de jeringa, una matraz, un vaso de precipitados, un cilindro graduado, un fermentador, un biorreactor, tubo, una tuberfa, una bolsa, un frasco, una ampolla, un cartucho y un lapiz desechable. En ciertos aspectos, el medio de recipiente esta siliconado.
En ciertos aspectos, la solucion salina con pH tamponado de la formulacion s tiene un pH de 5,5 a 7,5. En otros aspectos, el tampon es fosfato, succinato, histidina o citrato. En ciertos aspectos, el tampon es succinato a una concentracion final de 1 mM a 10 mM y pH de 5,8 a 6,0. En un aspecto en particular, la concentracion final del tampon succinato es 5 mM. En otros aspectos, la sal en la solucion salina con pH tamponado comprende cloruro de magnesio, cloruro potasico, cloruro sodico o una combinacion de los mismos. En un aspecto en particular, la sal en la solucion salina con pH tamponado es cloruro sodico.
En otro aspecto, el tensioactivo de las formulaciones se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20 (Tween™20), polisorbato 40 (Tween™40), polisorbato 60 (Tween™60, polisorbato 6 5 (Tween™65), polisorbato 80 (Tween™80), polisorbato 85 (Tween™85), Triton™ N-101, Triton™ X-100, oxtoxinol 40, nonoxinol-9, trietanolamina, oleato de polipeptido de trietanolamina, hidroxiestearato de polioxietileno-660 (PEG-15, Solutol H15), polioxietilen-35-ricinoleato (cremophor EL™), lecitina de soja y un poloxamero. En un aspecto particular, el tensioactivo es polisorbato 80. En otro aspecto, la concentracion final del polisorbato 80 en la formulacion es de al menos un 0,01 % a un 10 % de polisorbato 80 en peso/volumen de la formulacion. En otros aspectos, la concentracion final del polisorbato 80 en la formulacion es un 0,01 % de polisorbato 80 en peso/volumen de la formulacion. Ademas, en otros aspectos, la concentracion final del polisorbato 80 en la formulacion es un 0,05 % de polisorbato 80 en peso/volumen de la formulacion. En otro aspecto, la concentracion final del polisorbato 80 en la formulacion es un 0,1 % de polisorbato 80 en peso/volumen de la formulacion. En ciertos aspectos distintos, la concentracion final del polisorbato 80 en la formulacion es un 1,0 % de polisorbato 80 en peso/volumen de la formulacion. Ademas, en otros aspectos, la concentracion final del polisorbato 80 en la formulacion es un 10,0 % de polisorbato 80 en peso/volumen de la formulacion.
En otro aspecto, el conjugado de polisacarido-protefna comprende uno o mas polisacaridos de neumococos. En ciertas realizaciones, el uno o mas polisacaridos de neumococos son un polisacarido del serotipo 4 de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 6B de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 9V de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 14 de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 18C de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 19F de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 23F de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 1 de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 3 de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 5 de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 6A de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 7F de S. pneumoniae y un polisacarido del serotipo 19A de S. pneumoniae. En ciertas realizaciones, la protefna de la formulacion de conjugado de polisacarido-protefna se selecciona entre el grupo que consiste en CRM197, un toxoide del tetanos, un toxoide del colera, un toxoide del Pertussis, un toxoide labil al calor de E. coli (LT), un toxoide de neumolisina, protefna A de superficie de neumococos (PspA), protefna A de adhesina de neumococos (PsaA), una peptidasa C5a de Streptococcus, protefna D de Haemophilus influenzae, ovoalbumina, hemocianina de lapa californiana (KLH), albumina de suero bovino (BSA) y derivado de protefna purificada de tuberculina (PPD).
En un aspecto especffico, la formulacion de conjugado de polisacarido-protefna es una formulacion de conjugado de neumococos 7-valente (7vPnC) que comprende un polisacarido del serotipo 4 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 6B de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 9V de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 14 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 18C de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 19F de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197 y un polisacarido del serotipo 23F de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197.
En otro aspecto especffico, la formulacion de conjugado de polisacarido-protefna es una formulacion de conjugado de neumococos 13-valente (13vPnC) que comprende un polisacarido del serotipo 4 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 6B de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 9V de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 14 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 18C de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 19F de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 23F de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 1 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 3 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 5 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 6A de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 7F de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197 y un polisacarido del serotipo 19A de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197.
En otros aspectos, la formulacion comprende adicionalmente uno o mas polisacaridos de meningococos, una o mas protefnas antigenicas de meningococos, o una combinacion de los mismos. Ademas, en otros aspectos, la formulacion comprende adicionalmente uno o mas polisacaridos de estreptococos, una o mas protefnas antigenicas de estreptococos, o una combinacion de los mismos.
En otros determinados aspectos, la formulacion comprende adicionalmente uno o mas adyuvantes. Algunos adyuvantes adecuados a modo de ejemplo se describen a continuacion en el presente documento.
En otra realizacion, la invencion se dirige a formulaciones que inhiben la precipitacion inducida por silicona de un conjugado de polisacarido-protefna contenido en un medio de recipiente siliconado, formulacion que comprende (i) una solucion salina con pH tamponado, en la que el tampon tiene un pKa de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 7,5, (ii) una sal de aluminio y (iii) uno o mas conjugados de polisacarido-protefna. En ciertas realizaciones, el medio de recipiente siliconado se selecciona entre uno o mas del grupo que consiste en un vial, un tapon de vial, un cierre de vial, un cierre de vidrio, un cierre de goma, un cierre de plastico, una jeringa, un tapon de jeringa, un embolo de jeringa, una matraz, un vaso de precipitados, un cilindro graduado, un fermentador, un biorreactor, tubo, una tuberfa, una bolsa, un frasco, una ampolla, un cartucho y un lapiz desechable.
En ciertas realizaciones, la solucion salina con pH tamponado en las formulaciones tiene un pH de 5,5 a 7,5. En otras realizaciones, el tampon en las formulaciones es fosfato, succinato, histidina o citrato. Ademas, en otras realizaciones, el tampon es succinato a una concentracion final de 1 mM a 10 mM y pH de 5,8 a 6,0. En una realizacion en particular, la concentracion final del tampon succinato es 5 mM. En otras realizaciones mas, la sal en la solucion salina con pH tamponado comprende cloruro de magnesio, cloruro potasico, cloruro sodico o una combinacion de los mismos. En una realizacion en particular, la sal en la solucion salina con pH tamponado es cloruro sodico.
En otras realizaciones, la sal de aluminio es hidroxido de aluminio, fosfato de aluminio o sulfato de aluminio. En una realizacion especffica, la sal de aluminio es fosfato de aluminio.
En otras determinadas realizaciones, la formulacion comprende adicionalmente polisorbato 80 (Tween™80). En una realizacion especffica, la concentracion final del polisorbato 80 en la formulacion es de al menos un 0,01 % a un 10 % de polisorbato 80 en peso/volumen de la formulacion.
En otra realizacion, el conjugado de polisacarido-protefna comprende uno o mas polisacaridos de neumococos. En ciertas realizaciones, el uno o mas polisacaridos de neumococos son un polisacarido del serotipo 4 de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 6B de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 9V de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 14 de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 18C de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 19F de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 23F de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 1 de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 3 de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 5 de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 6A de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 7F de S. pneumoniae y un polisacarido del serotipo 19A de S. pneumoniae.
En otras determinadas realizaciones, la protefna de la formulacion de conjugado de polisacarido-protefna se selecciona entre el grupo que consiste en CRM197, un toxoide del tetanos, un toxoide del colera, un toxoide del Pertussis, un toxoide labil al calor de E. coli (LT),un toxoide de neumolisina, protefna A de superficie de neumococos (PspA), protefna A de adhesina de neumococos (PsaA), una peptidasa C5a de Streptococcus, protefna D de Haemophilus influenzae, ovoalbumina, hemocianina de lapa californiana (KLH), albumina de suero bovino (BSA) y derivado de protefna purificada de tuberculina (PPD).
En una realizacion en particular, la formulacion de conjugado de polisacarido-protefna es una formulacion de conjugado de neumococos 7-valente (7vPnC) que comprende un polisacarido del serotipo 4 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 6B de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 9V de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 14 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 18C de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 19F de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197 y un polisacarido del serotipo 23F de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197.
En otra realizacion especffica, la formulacion de conjugado de polisacarido-protefna es una formulacion de conjugado de neumococos 13-valente (13vPnC) que comprende un polisacarido del serotipo 4 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 6B de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 9V de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 14 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 18C de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 19F de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 23F de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 1 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 3 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 5 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 6A de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 7F de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197 y un polisacarido del serotipo 19a de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197.
Ademas, en otros aspectos, la formulacion comprende adicionalmente uno o mas polisacaridos de meningococos, una o mas protefnas antigenicas de meningococos, o una combinacion de los mismos.
En otro aspecto, la formulacion comprende adicionalmente uno o mas polisacaridos de estreptococos, una o mas protefnas antigenicas de estreptococos, o una combinacion de los mismos.
En otras determinadas realizaciones, la formulacion comprende adicionalmente uno o mas adyuvantes. Algunos adyuvantes adecuados a modo de ejemplo se describen a continuacion en el presente documento.
La presente invencion se define por las reivindicaciones adjuntas. Las materias objeto que no se abarcan por el ambito de las reivindicaciones no forman parte de la presente invencion.
Breve descripcion de las figuras
Referencia
La Figura 1 muestra la estabilidad de formulaciones de C5a peptidasa de Estreptococos (SCP) (cargada en jeringas) antes y despues de dos dfas de agitacion suave (60 cpm) en un agitador orbital horizontal. Los datos presentados en la FIG. 1A es la estabilidad de dos dfas de la SCP formulada sin nada de Tween™80 (es decir, un 0 %), mientras que los datos en la FIG. 1B son la estabilidad de dos dfas de la SCP formulada con un 0,025 % de Tween™80. Los tampones usados en las formulaciones mostrados en la FIG. 1A y 1B son solucion salina tamponada con succinato (SBS), solucion salina tamponada con fosfato (PBS) y tris(hidroximetil)aminometano (TRIS).
La Figura 2 muestra la perdida de antigenicidad total del 13vPnC formulado con AlPO4 (0,25 mg/ml) y cargado en una jeringa Hypak de Bd , despues de dos horas, ocho horas y veinticuatro horas de agitacion a 500 rpm y 2-8 °C.
La Figura 3 muestra la perdida de antigenicidad total del 13vPnC formulado con AlPO4 (0,25 mg/ml) y cargado en una jeringa no siliconada, despues de dos horas, ocho horas y veinticuatro horas de agitacion a 500 rpm y 2-8 °C.
La Figura 4 muestra la perdida de antigenicidad total del 13vPnC formulado con AlPO4 (0,25 mg/ml) y cargado en una jeringa Vetter, despues de dos horas, ocho horas y veinticuatro horas de agitacion a 500 rpm y 2-8 °C. La Figura 5 muestra la perdida de antigenicidad total del 13vPnC formulado con AlPO4 (0,25 mg/ml) y cargado en una jeringa TopPac de Schott, despues de dos horas, ocho horas y veinticuatro horas de agitacion a 500 rpm y 2-8 °C.
La Figura 6 muestra la perdida de antigenicidad total del 13vPnC formulado con (FIG. 6A) y sin (FIG. 6B) AlPO4 (0.25 mg/ml) y cargado en una jeringa BD al horno, despues de dos horas, ocho horas y veinticuatro horas de agitacion a 500 rpm y 2-8 °C.
La Figura 7 muestra la perdida de antigenicidad total del 13vPnC formulado con (FIG. 7A) y sin (FIG. 7B) AIPO4 (0,25 mg/ml) y cargado en una jeringa BunderGlas PS2, despues de dos horas, ocho horas y veinticuatro horas de agitacion a 500 rpm y 2-8 °C.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se dirige a una necesidad continua en la tecnica para mejorar la estabilidad de composiciones inmunogenicas tales como conjugados de polisacarido-protefna e inmunogenos de protefna. Por lo tanto, la presente invencion se refiere ampliamente a formulaciones de tensioactivo y/o nuevas formulaciones de sal de aluminio que estabilizan e inhiben la precipitacion de composiciones inmunogenicas. Mas particularmente, la invencion que se describe en lo sucesivo en el presente documento, se dirige a una necesidad en la tecnica de formulaciones que estabilicen e inhiban la formacion de partfculas (por ejemplo, agregacion, precipitacion) de composiciones inmunogenicas que se procesan, desarrollan, formulan, fabrican y/o almacenan en medios de recipiente siliconados tales como fermentadores, biorreactores, viales, matraces, bolsas, jeringas, tapones de goma y tubo.
Como se ha expuesto anteriormente en los Antecedentes de la Invencion, diversos factores influyen en la estabilidad de las composiciones inmunogenicas, que incluyen estabilidad qufmica de la composicion inmunogenica, estabilidad ffsica/termica de la composicion inmunogenica, compatibilidad de la composicion inmunogenica con el recipiente/sistema de cierre, interacciones entre composicion inmunogenica y principios inactivos (por ejemplo, tampones, sales, excipientes, crioprotectores), procedimientos de fabricacion, forma de dosificacion, condiciones ambientales encontradas durante el transporte, almacenamiento y manipulacion (por ejemplo, temperatura, humedad, fuerzas de cizallamiento), y el tiempo de duracion entre fabricacion y uso.
La estabilidad de una composicion inmunogenica de la invencion se determina facilmente usando tecnicas convencionales, que son bien conocidas y de rutina para los expertos en la materia. Por ejemplo, una composicion inmunogenica se somete a ensayo para estabilidad, agregacion, inmunogenicidad, formacion de partfculas, perdida de protefna (concentracion) y procedimientos que incluyen dispersion de luz, densidad optica, centrifugacion con velocidad de sedimentacion, centrifugacion con equilibrio de sedimentacion, dicrofsmo circular (CD), ensayo de Lowry, ensayo de acido bicinconfnico (BCA) y union a anticuerpos.
Como se establece con detalle en el presente documento, la presente divulgacion se refiere a los resultados inesperados y sorprendentes de que la formulacion de una composicion inmunogenica con un tensioactivo tal como Tween™80 aumenta de forma significativa la estabilidad e inhibe la precipitacion de una composicion inmunogenica. Por ejemplo, en la presente divulgacion se observo (por ejemplo, vease el Ejemplo 2), que un conjugado de neumococos trece-valente (13vPnC), formulado en solucion salina tamponada y cargado en una jeringa de un solo uso, comenzarfa a precipitar de la solucion en diez minutos a 2-8 °C despues de agitacion suave a traves de un agitador orbital horizontal. (El agitador orbital horizontal se uso para simular condiciones habituales de procedimiento, transporte y almacenamiento de una composicion inmunogenica de 13vPnC). Sin embargo, se observo de forma sorprendente que el 13vPnC, formulado en solucion salina tamponada y un 0,001 % de Tween™80, cargado en una jeringa de una sola dosis y agitado suavemente a 2-8 °C, era estable durante veinticinco dfas sin signos visibles de precipitacion (los datos no se muestran). Por lo tanto, estos datos demostraban que la adicion de un tensioactivo (por ejemplo, Tween™80) a una formulacion de composicion inmunogenica aumenta la estabilidad de la composicion inmunogenica.
Un segundo estudio de estabilidad del 13vPnC confirmo adicionalmente que la adicion de un tensioactivo a la formulacion aumentaba de forma significativa la estabilidad del 13vPnC. Por ejemplo, la estabilidad (es decir, sometida al ensayo midiendo cambios en la antigenicidad de 13vPnC) de una formulacion de 13vPnC con un 0,05 % de Tween™80 (Tabla 1) y sin Tween™80 (0,0 %, Tabla 1) se sometio a ensayo durante un periodo de tiempo de dos horas. Como se muestra en la Tabla 1, se produjo una disminucion significativa de la antigenicidad de los trece polisacaridos de serotipo (formulados sin Tween™80) dentro del ensayo de dos horas. Sin embargo, de forma bastante drastica, la formulacion de 13vPnC que comprendfa un 0,05 % de Tween™80 (Tabla 1), demostraba una robusta estabilidad a traves del ensayo de antigenicidad de dos horas. Tambien se observo que el 13vPnC formulado en frascos de vidrio de 250 ml con cualquiera de Tween™80 al 0,01 % o Tween™80 al 0,05 % podrfa soportar fuerzas de cizallamiento significativas inducidas a traves de agitacion vorticial de las formulaciones durante treinta minutos a 2-8 °C, con poca o ninguna perdida de antigenicidad (por ejemplo, vease el Ejemplo 2, Tabla 2).
En otros experimentos (Ejemplo 3), se demostro que la estabilidad de una composicion inmunogenica de C5a peptidasa de estreptococos (SCP) aumentaba en gran medida cuando se formulaba con un tensioactivo tal como Tween™80. Por ejemplo, como se muestra en la FIG. 1A, despues de dos dfas de agitacion vorticial de un SCP (y 35 pg/ml) formulado con cualquiera de un tampon de succinato 5 mM buffer (pH 6,0), un tampon de fosfato 10 mM (pH 7,0 y 7,4) o un tampon de Tris 10 mM (pH 7,5), se producfa una disminucion significativa (por ejemplo, superior a un 90 %) en la concentracion de SCP. Sin embargo, como se muestra en la FIG. 1B, la adicion de Tween™80 al 0,025 % a las formulaciones de succinato de SCP, fosfato de SCP y SCP Tris, antes de agitacion vorticial durante dos dfas, inhibfan completamente la perdida de SCP que se observaba en la FIG. 1A.
Una composicion inmunogenica de 13vPnC de la invencion tambien se fue de formula con o sin un adyuvante, tal como fosfato de aluminio (APO4). Por lo tanto, en una serie de experimentos separados (Ejemplo 4), algunas composiciones inmunogenicas de 13vPnC se formularon en tampon de 5 mM (pH 5,8), NaCl al 0,85 % y AlPO4 (0,25 mg de aluminio/ml), sin la adicion de un tensioactivo (por ejemplo, en la formulacion no se inclufa Tween™80).
En estos experimentos, la composicion inmunogenica de 13vPnC (formulada en presencia de AlPO4) se cargo en diversos medios de recipiente siliconados y no siliconados (por ejemplo, vease la Tabla 3) y se sometio a condiciones de transporte y manipulacion simuladas a traves de agitacion a 2-8 °C. En estos experimentos se observo (Ejemplo 4), que el medio de recipiente con contenido de silicona mas elevado presentaba un grado mas elevado de formacion de partfculas de 13vPnC y un porcentaje mas elevado de perdida de antigenicidad de 13vPnC. Un analisis de FTIR de las partfculas indicaba que las partfculas consistfan en protefna y silicona (los datos no se muestran) y que aproximadamente un 85 % del 13vPnC se une al AlPO4, en el que el 15 % restante estaba libre de (no unido al APO4) 13vPnC en solucion.
En otro experimento que compara algunas composiciones inmunogenicas de 13vPnC formuladas con y sin AlPO4, que a continuacion se cargaron en jeringas identicas, se observaba que el 13vPnC formulado sin APO4 mantenfa perdidas de antigenicidad mayores que 13vPnC con AlPO4 en las jeringas sometidas a ensayo (por ejemplo, vease la FIG. 6 y FIG. 7).
Por lo tanto, la invencion como se establece en el presente documento, se refiere a nuevas formulaciones que estabilizan e inhiben la agregacion o precipitacion de composiciones inmunogenicas conjugados de polisacaridoprotefna (por ejemplo, un 13vPnC) frente a los diversos factores que influyen en la estabilidad de las composiciones inmunogenicas (por ejemplo, fuerzas de cizallamiento, agitacion en el transporte, interacciones del aceite de silicona, adsorcion, procedimientos de fabricacion, temperatura, humedad, periodo de tiempo entre fabricacion y uso, etc.).
En ciertas realizaciones, la invencion se refiere a una formulacion que inhibe la precipitacion inducida por silicona de un conjugado de polisacarido-protefna comprendido en un medio de recipiente siliconado, formulacion que comprende una solucion salina con pH tamponado, en la que el tampon tiene un pKa de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 7,5, una sal de aluminio y uno o mas conjugados de polisacarido-protefna en la que el conjugado de polisacarido-protefna comprende uno o mas polisacaridos de neumococos. Como se define en lo sucesivo en el presente documento, los terminos "precipitacion", "precipitado" "formacion de partfculas", "turbidez" y "agregacion" se pueden usar indistintamente y pretenden hacer referencia a cualquier interaccion ffsica o reaccion qufmica que de como resultado la "agregacion" de un conjugado de polisacarido-protefna o un inmunogeno de protefna (o polipeptido). El proceso de agregacion (por ejemplo, agregacion de protefnas) se conoce bien (pero no se entiende bien) y se describe en la tecnica, y a menudo esta influido por numerosas tensiones fisicoqufmicas, que incluyen calor, presion, pH, agitacion, fuerzas de cizallamiento, congelacion-descongelacion, deshidratacion, metales pesados, compuestos fenolicos, aceite de silicona y agentes desnaturalizantes.
Como se define en lo sucesivo en el presente documento, un "conjugado de polisacarido-protefna", un "conjugado de neumococos", un "conjugado de neumococos 7-valente (7vPnC)", un "conjugado de neumococos 13-valente (13vPnC)", una "composicion inmunogenica de C5a peptidasa de estreptococos (SCP)" y una "composicion inmunogenica de protefnas 2086 de N. meningitidis" incluye formulaciones lfquidas, formulaciones lfquidas congeladas y formulaciones solidas (por ejemplo, secadas por congelacion o liofilizadas).
A. TENSIOACTIVOS
Como se ha expuesto anteriormente, la invencion se refiere a formulaciones que estabilizan e inhiben la agregacion de composiciones inmunogenicas frente a los diversos factores que influyen en la estabilidad de las composiciones inmunogenicas (por ejemplo, fuerzas de cizallamiento, agitacion en el transporte, interacciones del aceite de silicona, adsorcion, procedimientos de fabricacion, temperatura, humedad, periodo de tiempo entre fabricacion y uso, etc.). En ciertas realizaciones, la invencion se refiere a formulaciones que comprenden un tensioactivo.
Un tensioactivo (o un agente de superficie activa) se define generalmente como (a) una molecula o compuesto que comprende un grupo o resto hidrofilo y un grupo o resto lipofilo (hidrofobo) y/o (b) una molecula, sustancia o compuesto que disminuye o reduce la tension superficial de una solucion. Como se define en el presente documento, un "tensioactivo" de la presente invencion es cualquier molecula o compuesto que disminuye la tension superficial de una formulacion de composicion inmunogenica.
Un tensioactivo usado en una formulacion puede comprender cualquier tensioactivo o cualquier combinacion de tensioactivos que estabilice e inhiba la agregacion de una composicion inmunogenica que se describe en el presente documento. Por lo tanto, un tensioactivo incluye polisorbato 20 (Tween™20), polisorbato 40 (Tween™40), polisorbato 60 (Tween™60), polisorbato 65 (Tween™65), polisorbato 80 (Tween™80), polisorbato 85 (Tween™85), Triton™ N-101, Triton™ X-100, oxtoxinol 40, nonoxinol-9, trietanolamina, oleato de polipeptido de trietanolamina, hidroxiestearato de polioxietileno-660 (PEG-15, Solutol H15), polioxietileno-35-ricinoleato (Cremophor EL™), lecitina de soja, Poloxamer, hexadecilamina, octadecilamina, esteres de octadecil aminoacido, lisolecitina, bromuro de dimetil-dioctadecilamonio, metoxihexadecilglicerol, polioles de Pluronic, poliaminas (por ejemplo, pirano, dextranosulfato, poli IC, carbopol), peptidos (por ejemplo, peptido y dipeptido de muramilo, dimetilglicina, tuftsina), emulsiones de aceite, geles minerales (por ejemplo, fosfato de aluminio) y complejos de estimulacion inmune (ISCOMS).
Una persona experta en la materia puede determinar facilmente un tensioactivo o combinacion de tensioactivos adecuados midiendo la tension superficial de una formulacion de composicion inmunogenica en particular en presencia y ausencia del tensioactivo o tensioactivos. Como alternativa, un tensioactivo se evalua cualitativamente (por ejemplo, inspeccion visual de formacion de partfculas) o cuantitativamente (por ejemplo, dispersion de luz, centrifugacion con velocidad de sedimentacion, densidad optica, antigenicidad) para su capacidad para reducir, inhibido evitar la agregacion de una composicion inmunogenica.
B. MEDIOS DE RECIPIENTE
En ciertas realizaciones, la invencion se refiere a formulaciones de composiciones inmunogenicas contenidas en un medio de recipiente. Como se define en el presente documento, un "medio de recipiente" de la presente invencion incluye cualquier composicion de materia que se usa para "contener", "albergar", "mezclar", "combinar", "distribuir", "inyectar", "transferir", "nebulizar", etc. una composicion inmunogenica durante investigacion, procesamiento, desarrollo, formulacion, fabricacion, almacenamiento y/o administracion. Por ejemplo, un medio de recipiente de la presente invencion incluye, pero no se limita a, arterial de cristal de laboratorio en general, Matraces, vasos de precipitados, cilindros graduados, fermentadores, biorreactores, tubos, tuberfas, bolsas, frascos, viales, cierres de vial (por ejemplo, un tapon de goma, un tornillo en la tapa), ampollas, jeringas, tapones de jeringa, embolos de jeringa, cierres de goma, cierres de plastico y cierres de vidrio. Un medio de recipiente de la presente invencion no se limita al material de fabricacion, e incluye materiales tales como vidrio, metales (por ejemplo, acero, acero inoxidable, aluminio, etc.) y polfmeros (por ejemplo, termoplasticos, elastomeros, termoplastico-elastomeros).
El experto en la materia observara que el medio de recipiente que se ha expuesto anteriormente no es en modo alguno una lista exhaustiva, sino simplemente sirve como gufa para el experto con respecto a la variedad de medios de recipiente que se usan para contener, alojar, mezclar, combinar, distribuir, inyectar, transferir, nebulizar, etc. un inmunogeno o composicion inmunogenica durante investigacion, procesamiento, desarrollo, formulacion, fabricacion, almacenamiento y/o administracion de la composicion. Algunos medios de recipiente adicionales contemplados para uso en la presente invencion se pueden encontrar en catalogos publicados de vendedores y fabricantes de equipo de laboratorio tales como United States Plastic Corp. (Lima, OH), VWR™ (West Chester, PA), BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ), Fisher Scientific International Inc. (Hampton, NH) y Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Por lo tanto, las nuevas formulaciones de la presente invencion son particularmente ventajosas porque estabilizan e inhiben la precipitacion de formulaciones inmunogenicas contenidas en un medio de recipiente a traves de las diversas etapas de investigacion, procesamiento, desarrollo, formulacion, fabricacion, almacenamiento y/o administracion de la composicion. Las nuevas formulaciones de la invencion no solamente estabilizan algunas composiciones inmunogenica es frente a tensiones ffsicas/termicas (por ejemplo, temperatura, humedad, fuerzas de cizallamiento, etc.), sino que tambien aumentan la estabilidad e inhiben la precipitacion de algunas composiciones inmunogenicas frente a factores o influencias negativas tales como incompatibilidad de la composicion inmunogenica con el recipiente/sistema de cierre (por ejemplo, un medio de recipiente siliconado).
Por lo tanto, las formulaciones de la presente invencion son particularmente utiles para estabilizar el inmunogeno (es decir, un conjugado de polisacarido-protefna) frente a la precipitacion inducida por aceite de silicona y la precipitacion que se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, la solicitud de Estados Unidos en tramite junto con la presente N° 60/795.098, presentada el 26 de abril de 2006, describe la agregacion de algunas composiciones inmunogenicas en presencia de aceite de silicona encontrado en el medio de recipiente tal como jeringas, viales de vidrio, tapones de goma y similares, en las que la adicion de un tensioactivo al medio de recipiente evitaba la agregacion inducida por el aceite de silicona de estas composiciones inmunogenicas.
C. ADYUVANTES Y VEHICULOS/EXCIPIENTES FARMACEUTICOS
En ciertas realizaciones, las composiciones inmunogenicas de la invencion se formulan adicionalmente con un adyuvante. Un adyuvante es una sustancia que aumenta la respuesta inmune cuando se administra junto con un inmunogeno o antfgeno. Se ha mostrado que una serie de citoquinas o linfoquinas tienen actividad de modulacion inmune, y por lo tanto se pueden usar como adyuvantes, que incluyen las interleuquinas 1-a, 1-p, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (vease, por ejemplo, el documento de Patente de Estados Unidos N° 5.723.127), 13, 14, l5, 16, 17 y 18 (y sus formas mutantes), los interferones a, p y y, factor de estimulacion de colonias de granulocitos-macrofagos (GMCSF, vease, por ejemplo, el documento de Patente de Estados Unidos N° 5.078.996 y el Numero de Referencia 39900 de la ATCC), factor de estimulacion de colonias de macrofagos (MCSF), factor de estimulacion de colonias de granulocitos (GCSF), y los factores de necrosis tumoral a y p (TNF). Ademas, otros ayudantes utiles en la presente invencion incluyen quimioquinas MCP-1, MIP-1a, MIP-1 p, y Ra NTeS.
En ciertas realizaciones, un adyuvante usado para aumentar la respuesta inmune de una formulacion de composicion inmunogenica incluye MPL™ (monofosforil lfpido A 3-O-desacilado; Corixa, Hamilton, MT), que se describe en el documento de Patente de Estados Unidos N° 4.912.094. Tambien adecuados para su uso como adyuvantes son algunos analogos sinteticos de lfpido A o compuestos de fosfato de aminoalquil glucosamina (AGP), o derivados o analogos de los mismos, que estan disponibles en Corixa (Hamilton, MT), y que se describen en el documento de Patente de Estados Unidos N° 6.113.918. Uno de estos a Gp es el 2-[(R)-3-Tetradecanoiloxitetradecanoilamino] etil 2-Desoxi-4-O-fosfono-3-O-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil]-2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil-amino]-b-D-glucopiranosido, que tambien se conoce como 529 (anteriormente se conocfa como RC529). Este adyuvante 529 se formula como una forma acuosa o como una emulsion estable (RC529-SE).
Ademas, otros adyuvantes incluyen emulsiones de aceite mineral y agua, sales de aluminio (alum), tales como hidroxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio etc., Anffgeno, Avridina, L121/escualeno, D-lactidapolilactida/glicosido, polioles de Pluronic, dipeptido de muramilo, Bordetella destruida, saponinas, tales como Stimulon™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA.), que se describen en el documento de Patente de Estados Unidos N° 5.057.540 y partfculas generadas a partir de los mismos tales como ISCOMS (complejos de inmunoestimulacion), ISCOMATRIX (CSL Limited, Parkville, Australia), que se describen en el documento de Patente de Estados Unidos N° 5.254.339, Mycobacterium tuberculosis, lipopolisacaridos bacterianos, polinucleotidos sinteticos tales como oligonucleotidos que contienen un motivo de CpG (documento de Patente de Estados Unidos N° 6.207.646), IC-31 (Intercell AG, Viena, Austria), que se describe en los documentos de Patente Europea N.° 1.296.713 y 1.326.634, una toxina de Pertussis (PT), o una toxina labil al calor de E. colio(LT), en particular LT-K63, LT-R72, PT-K9/G129; veanse, por ejemplo, las Publicaciones de Patente Internacional N.° w O 93/13302 y WO 92/19265.
Como adyuvantes (y protefnas vehfculo) tambien son utiles algunas toxinas del colera y mutantes de las mismas, que incluyen las que se describen en la Solicitud de Patente Internacional numero WO 00/18434 (en la que el acido glutamico en la posicion 29 del aminoacido se sustituye con otro aminoacido (distinto del acido aspartico), preferentemente una histidina). Algunas toxinas o mutantes de CT similares se describen en la Solicitud de Patente Internacional publicada con numero WO 02/098368 (en la que la isoleucina en la posicion 16 del aminoacido se sustituye con otro aminoacido, ya sea solo o en combinacion con la sustitucion de la serina en la posicion 68 del aminoacido por otro aminoacido; y/o en la que la valina en la posicion 72 del aminoacido se sustituye con otro aminoacido). Otras toxinas de CT se describen en la Solicitud de Patente Internacional publicada con numero WO 02/098369 (en la que la arginina en la posicion 25 del aminoacido se sustituye con otro aminoacido; y/o un aminoacido se inserta en la posicion 49 del aminoacido; y/o dos aminoacidos se insertan en las posiciones 35 y 36 del aminoacido).
En ciertas realizaciones, las formulaciones de composicion inmunogenica comprenden un diluyente, excipiente o un vehfculo farmaceuticamente aceptable. En una realizacion, el diluyente farmaceuticamente aceptable es agua esteril, agua para inyeccion, solucion salina isotonica esteril o un tampon biologico. Los conjugados de polisacarido-protefna y/o inmunogeno es de protefna se mezclan con tales diluyentes o vehfculos de manera convencional. Como se usa en el presente documento, la expresion "vehfculo farmaceuticamente aceptable" pretende incluir todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersion, revestimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y de retraso de la absorcion compatibles con la administracion a seres humanos u otros hospedadores vertebrados. El vehfculo apropiado es evidente para los expertos en la materia y dependera en gran parte de la via de administracion.
Por ejemplo, algunos excipientes que pueden estar presentes en la formulacion de la composicion inmunogenica son conservantes, estabilizantes qufmicos y agentes de suspension o dispersion. Por lo general, estabilizantes y conservantes se optimizan para determinar la mejor formulacion para su eficacia en el receptor al que se dirigen (por ejemplo, un sujeto humano). Algunos ejemplos de conservantes incluyen clorobutanol, sorbato potasico, acido sorbico, bioxido de azufre, galato de propilo, los parabenos, etil vainillina, glicerina, fenol, y paraclorofenol. Algunos ejemplos de ingredientes estabilizantes incluyen casaminoacidos, sacarosa, gelatina, rojo fenol, N-Z amina, difosfato monopotasico, lactosa, hidrolizado de lactoalbumina, y leche seca.
En ciertas realizaciones, una formulacion de composicion inmunogenica se prepara para administracion a sujetos humanos en forma de goma por ejemplo, lfquidos, polvos, aerosoles, comprimidos, capsulas, comprimidos o capsulas revestidos de forma enterica, o supositorios. Por lo tanto, las formulaciones de composicion inmunogenica tambien pueden incluir, pero no se limitan a, suspensiones, soluciones, emulsiones en vehfculos oleosos u acuosos, pastas, y formulaciones implantables de liberacion sostenida o biodegradables.
D. INMUNOGENOS
Una formulacion de conjugado de polisacarido-protefna de la invencion comprende uno o mas polisacaridos de neumococos. En otros aspectos, una formulacion de conjugado de polisacarido-protefna de la invencion comprende uno o mas polisacaridos de estreptococos. Ademas, en otros aspectos, una formulacion de conjugado de polisacarido-protefna de la divulgacion comprende uno o mas polisacaridos de meningococos. En otras realizaciones mas, una formulacion de conjugado de polisacarido-protefna de la invencion comprende una combinacion de uno o mas polisacaridos de neumococos.
Como se define en lo sucesivo en el presente documento, el termino "polisacarido" pretende incluir cualquier elemento sacarido antigenico (o unidad antigenica) usada normalmente en las tecnicas de vacunas inmunologicas y bacterianas, que incluye, pero no se limita, un "sacarido", un "oligosacarido", un "polisacarido", a "liposacarido", a "lipo-oligosacarido (LOS)", un "lipopolisacarido (LPS)", un "glicosilato", un "glicoconjugado" y similares.
En una realizacion en particular de la invencion, el uno o mas polisacaridos de neumococos son un polisacarido del serotipo 4 de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 6B de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 9V de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 14 de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 18C de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 19F de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 23F de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 1 de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 3 de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 5 de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 6A de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 7F de S. pneumoniae y un polisacarido del serotipo 19A de S. pneumoniae.
En ciertas realizaciones, una formulacion de conjugado de polisacarido-protefna es una formulacion de conjugado de neumococos 7-valente (7vPnC) que comprende un polisacarido del serotipo 4 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 6B de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 9V de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 14 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 18C de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 19F de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197 y un polisacarido del serotipo 23F de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197.
En otras determinadas realizaciones, una formulacion de conjugado de polisacarido-protefna es una formulacion de conjugado de neumococos 13-valente (13vPnC) que comprende un polisacarido del serotipo 4 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 6B de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 9V de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 14 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 18C de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 19F de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 23F de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 1 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 3 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 5 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 6A de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 7F de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197 y un polisacarido del serotipo 19a de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197.
Algunos polisacaridos se preparan mediante tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, los polisacaridos capsulares que se exponen en la presente invencion se preparan a partir de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F de Streptococcus pneumoniae, en las que cada serotipo se cultivan en un medio basado en soja y los polisacaridos individuales se purifican a continuacion a traves de centrifugacion, precipitacion, ultrafiltracion y cromatograffa en columna. A continuacion los polisacaridos purificados se activan qufmicamente (por ejemplo, mediante aminacion reductora) para fabricar los sacaridos capaces de reaccionar con la protefna vehfculo. Una vez activado, cada polisacarido capsular se conjuga por separado con una protefna vehfculo (por ejemplo, CRM197) para formar un glicoconjugado (o como alternativa, cada polisacarido capsular se conjuga con la misma protefna vehfculo) y se formula una formulacion de forma de dosificacion individual.
La activacion qufmica de los polisacaridos y la posterior conjugacion a la protefna vehfculo (es decir, un conjugado de polisacarido-protefna) se consiguen mediante medios convencionales. Veanse, por ejemplo, los documentos de Patente de Estados Unidos N° 4.673.574 y 4.902.506.
Algunas protefnas vehfculo son preferentemente protefnas que no son toxicas y no son reactogenicas y se pueden obtener en una cantidad y pureza suficientes. Las protefnas vehfculo deberfan ser responsables de algunos procedimientos de conjugacion convencionales. En una realizacion en particular de la presente invencion, el CRM197 se usa como la protefna vehfculo.
El CRM197 (Wyeth, Sanford, NC) es una variante no toxica (es decir, toxoide) de la toxina de difteria aislada de cultivos de la cepa C7 de Corynebacterium diphtheria (p197) cultivada en casaminoacidos y medio basado en extracto de levadura. El CRM197 se purifica a traves de ultrafi ltracion, precipitacion con sulfato de amonio, y cromatograffa de intercambio ionico. Como alternativa, el CRM197 se prepara de forma recombinante de acuerdo con el documento de Patente de Estados Unidos N° 5.614.382. Otros toxoides de difteria tambien son adecuados para uso como protefnas vehfculo.
En otros aspectos, una protefna vehfculo de la invencion es una C5a peptidasa de estreptococos (SCP) enzimaticamente inactiva (por ejemplo, una o mas de las variantes de SCP que se describen en el documento de Patente de Estados Unidos N° 6.951.653, documento de Patente de Estados Unidos N° 6.355.255 y documento de Patente de Estados Unidos N° 6.270.775).
Otras protefnas vehfculo adecuadas incluyen toxinas bacterianas inactivas tales como toxoide del tetanos, toxoide de Pertussis, toxoide del colera (por ejemplo, CT E29H, que se describe en la Solicitud de Patente Internacional WO2004/083251), LT de E. coli, ST de E. coli, y exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa. Tambien se pueden usar algunas protefnas de membrana externa bacteriana tales como el complejo c de la membrana externa (OMPC), porinas, protefnas de union a transferrina, neumolisina, protefna A de superficie de neumococos (PspA), protefna adhesina de neumococos (PsaA), o protefna D de Haemophilus influenzae. Otras protefnas, tales como ovoalbumina, hemocianina de lapa californiana (KLH), albumina de suero bovino (BSA) o derivado de protefna purificada de tuberculina (PPD) tambien se pueden usar como protefnas vehfculo.
Despues de la conjugacion del polisacarido capsular a la protefna vehfculo, los conjugados de polisacarido-protefna se purifican (se enriquecen con respecto a la cantidad de conjugado de polisacarido-protefna) mediante una diversidad de tecnicas. Estas tecnicas incluyen operaciones de concentracion/diafiltracion, precipitacion/elucion, cromatograffa en columna, y filtracion en profundidad.
Despues de purificar los glicoconjugados individuales, se forman compuestos con estos para formular la composicion inmunogenica de la presente invencion. La formulacion de los conjugados de polisacarido-protefna de la presente invencion se puede realizar usando procedimientos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, los 13 conjugados de neumococos individuales se pueden formular con un vehfculo fisiologicamente aceptables para preparar la composicion. Algunos ejemplos de tales vehfculos incluyen agua, solucion salina tamponada, polioles (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol lfquido) y soluciones de dextrosa.
Los aspectos particulares de la divulgacion se exponen en los siguientes parrafos numerados:
1. Una formulacion que estabiliza un conjugado polisacarido-protefna, comprendiendo la formulacion (i) una solucion salina con pH tamponado, en la que el tampon tiene un pKa de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 7,5, (ii) un tensioactivo y (ii) uno o mas conjugados polisacarido-protefna.
2. La formulacion del parrafo 1, en la que la formulacion del conjugado polisacarido-protefna esta comprendida en un medio de recipiente seleccionado de uno o mas del grupo que consiste en un vial, un tapon de vial, un cierre de vial, un cierre de vidrio, un cierre de goma, un cierre de plastico, una jeringa, un tapon de jeringa, un embolo de jeringa, una matraz, un vaso de precipitados, un cilindro graduado, un fermentador, un biorreactor, tubo, una tuberfa, una bolsa, un frasco, una ampolla, un cartucho y un lapiz desechable.
3. La formulacion del parrafo 1, en la que el medio de recipiente esta siliconado.
4. La formulacion del parrafo 1, en la que el tampon es succinato a una concentracion final de 1 mM a 10 mM y pH 5,8 a 6,0.
5. La formulacion del parrafo 1, en la que el tensioactivo es polisorbato 80.
6. La formulacion del parrafo 5, en la que la concentracion final del polisorbato 80 en la formulacion es al menos del 0,01 % al 10 % de polisorbato 80 en peso/volumen de la formulacion.
7. La formulacion del parrafo 1, en la que el conjugado polisacarido-protefna comprende uno o mas polisacaridos de neumococos.
8. La formulacion del parrafo 1, que comprende ademas uno o mas polisacaridos de meningococos, una o mas protefnas antigenicas de meningococos o una combinacion de los mismos.
9. La formulacion del parrafo 1, que comprende ademas uno o mas polisacaridos de estreptococos, una o mas protefnas antigenicas de estreptococos o una combinacion de los mismos.
10. La formulacion del parrafo 1, en la que la formulacion del conjugado polisacarido protefna es una formulacion de conjugado de neumococos 7-valente (7vPnC) que comprende un polisacarido del serotipo 4 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 6B de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 9V de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 14 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 18C de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 19F de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197 y un polisacarido del serotipo 23F de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197.
11. La formulacion del parrafo 1, en la que la formulacion de conjugado de polisacarido-protefna es una formulacion de conjugado de neumococos 13-valente (13vPnC) que comprende un polisacarido del serotipo 4 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 6B de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 9V de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 14 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 18C de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 19F de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 23F de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 1 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 3 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 5 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 6A de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 7F de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197 y un polisacarido del serotipo 19A de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197.
12. La formulacion del parrafo 1, en la que la formulacion comprende ademas un adyuvante.
13. La formulacion del parrafo 12, en la que el adyuvante es fosfato de aluminio.
14. Una formulacion que inhibe la agregacion inducida por silicona de un conjugado sacarido-protefna comprendida en un medio de recipiente siliconado, comprendiendo la formulacion (i) una solucion salina con pH tamponado, en la que el tampon tiene un pKa de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 7,5, (ii) un tensioactivo y (ii) uno o mas conjugados polisacarido-protefna.
15. La formulacion del parrafo 14, en la que el tampon es succinato a una concentracion final de 1 mM a 10 mM y pH 5,8 a 6,0.
16. La formulacion del parrafo 14, que comprende ademas polisorbato 80 (Tween™80), en la que la concentracion final del polisorbato 80 en la formulacion es al menos del 0,01 % al 10 % de polisorbato 80 en peso/volumen de la formulacion.
17. La formulacion del parrafo 14, en la que el conjugado polisacarido-protefna comprende uno o mas polisacaridos de neumococos.
18. La formulacion del parrafo 14, que comprende ademas uno o mas polisacaridos de meningococos, una o mas protefnas antigenicas de meningococos o una combinacion de los mismos.
19. La formulacion del parrafo 14, que comprende ademas uno o mas polisacaridos de estreptococos, una o mas protefnas antigenicas de estreptococos o una combinacion de los mismos.
20. La formulacion del parrafo 14, en la que la formulacion comprende ademas un adyuvante.
E. Ejemplos
Los siguientes ejemplos se realizan usando tecnicas convencionales, que se conocen bien and y son de rutina para los expertos en la materia, excepto cuando se describa de otro modo con detalle.
Ejemplo de referencia 1
LAS FORMULACIONES INMUNOGENICAS QUE COMPRENDEN UN 0,001 %-0,05 % DE TWEEN™ 80 ESTABILIZAN Y PREVIENEN LA AGREGACION DEL INMUNOGENO
El conjugado de polisacarido-protefna usado en este ejemplo era un conjugado de polisacarido de neumococos trece-valente (13vPnC) que comprende polisacaridos capsulares de los serotipos 4, 6B, 9V, 18C, 19F, 14, 23F, 1, 3, 5, 6A, 7F y 19A de S. pneumoniae, cada uno de los cuales se conjugaban con CRM197. Los polisacaridos capsulares se prepararon mediante tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia. En resumen, cada serotipo de polisacarido de neumococos se cultivo en un medio basado en soja, a continuacion, los polisacaridos individuales se purificaron mediante centrifugacion, precipitacion, ultrafiltracion, y cromatograffa en columna. Los polisacaridos purificados se activaron qufmicamente para conjugacion y cada polisacarido se conjugo por separado a una protefna vehfculo de CRM197 para formar un glicoconjugado y se formularon en una formulacion de dosificacion individual.
La activacion qufmica de los polisacaridos y la posterior conjugacion con la protefna de vehfculos se consiguieron por medios convencionales (por ejemplo, veanse los documentos de patente de Estados Unidos N.° 4.673.574 y 4.902.506). CRM197 (Wyeth, Sanford, NC) es una variante no toxica (es decir, toxoide) de toxina de difteria aislada de cultivos de la cepa C7 de Corynebacterium diphtheria (p197) cultivada en casaminoacidos y medio basado en extracto de levadura. CRM197 se purifica a traves de ultrafiltracion, precipitacion con sulfato de amonio, y cromatograffa de intercambio ionico.
Los experimentos de antigenicidad que se describen a continuacion se realizaron mezclando las muestras de 13vPnC con uno de los trece antisueros (Ab) especfficos para cada uno de los serotipos del polisacarido y a continuacion detectando los complejos inmunes mediante medidas de dispersion de luz en un sistema Array® 360 (Beckman Coulter, Inc.; Fullerton, CA). Las medidas de dispersion de luz detectada para cada uno de los trece serotipos se compararon a continuacion con una curva patron y se informaron como antigenicidad (pg/ml).
Las jeringas (BD Hypak SCF™) y los tapones de jeringa (BD Hypak SCF™) se adquirieron en BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ). Los viales de borosilicato transparente (VWR TraceClean™, 40 ml) con cierres revestidos con Teflon® se adquirieron en VWR™ (West Chester, Pa ). El Polisorbato 80 (Tween™80) se adquirio en J.T. Baker (Mallinckrodt Baker, Inc.; Phillipsburg, NJ). La solucion salina tamponada era succinato (5 mM) y NaCl (0,85 %) a pH 5,8.
El 13vPnC se formulo (volumen total de 500 ml) a diferentes concentraciones de tensioactivo (Tween™80; 0,001 %, 0,005 %, 0,01 % y 0,05 %, en peso/volumen) como sigue a continuacion: se anadio solucion salina al 0,85 % (NaCl 150 mM) a un vaso de precipitados de vidrio Pirex® de un litro, seguido de tampon succinato 50 mM (concentracion final 5 mM) y el 13vPnC. La concentracion final de cada conjugado de serotipo era de 4,4 pg/ml (excepto para el serotipo 6B, que era de 8,8 pg/ml). A continuacion, la formulacion de 13vPnC se dividio en cinco viales de vidrio separados (50 ml por vial), en los que se anadio cualquiera de Tween™80 al 0,0 %, al 0,001 %, al 0,005 %, al 0,01 % o al 0,05 % en (p/v) a uno de los cinco viales y cada solucion se filtro a traves de un filtro Durapore® de 0,22 pm (Millipore; Billerica, MA). Posteriormente, se cargaron 0,65 ml de cada solucion en una jeringa de vidrio HYPAK™ SCF™ de BD de 3 ml separada con tapones de color gris w4432 (BD Medical Pharmaceutical Systems; Franklin Lakes, NJ), y las jeringas se colocaron en un agitador orbital horizontal (60 cpm) durante 100 horas de 2 °C a 8 °C.
Mediante inspeccion visual se observo (los datos no se muestran), que el 13vPnC formulado en ausencia de Tween™80 (es decir, un 0,0 %), comenzarfa a precipitar de la solucion a los diez minutos a 2-8 °C despues de agitacion suave mediante un agitador orbital horizontal. Por el contrario, el 13vPnC formulado en Tween™80 al 0,001 %, al 0,005 %, al 0,01 % o al 0,05 % y agitados suavemente a 2-8 °C, era estable hasta veinticinco dfas sin signos visibles de precipitacion (los datos no se muestran). Por lo tanto, estos datos demostraban que la adicion de un tensioactivo (por ejemplo, Tween™80) a una formulacion de composicion inmunogenica aumenta la estabilidad de la composicion inmunogenica.
Un segundo experimento de estabilidad del 13vPnC confirmaba adicionalmente que la adicion de tensioactivo a la formulacion aumentaba de forma significativa la estabilidad del 13vPnC. En este experimento, el 13vPnC se formulo con y sin Tween™80 al 0,05 %. El 13vPnC formulado sin Tween™80 (es decir, un 0,0 %) se preparo como sigue a continuacion: se anadio solucion salina al 0,85 % (NaCl 150 mM) a un vaso de precipitados de vidrio Pirex® de un litro, seguido de tampon succinato 50 mM (concentracion final 5 mM) y el 13vPnC, hasta un volumen total de 500 ml. la formulacion de 13vPnC con Tween™80 al 0,05 % se preparo como sigue a continuacion: 0 se anadio solucion salina al 0,85 % (NaCl 150 mM) a un vaso de precipitados de vidrio Pirex® de un litro, seguido de tampon succinato 50 mM (concentracion final 5 mM), Tween™80 al 0,05 % y el 13vPnC, hasta un volumen total de 500 ml. La concentracion final de cada conjugado de serotipo en las formulaciones de 500 ml era de 4,4 pg/ml (excepto para el serotipo 6B, que era de 8,8 pg/ml). Las formulaciones de 500 ml se homogeneizaron mediante un homogeneizador de rotor/estator a 6.000 rpm (2-8 °C) durante 120 minutos. El procedimiento de homogeneizacion creo una superficie de contacto de aire-lfquido (con burbujas de aire).
La estabilidad de la formulacion de 13vPnC con (Tabla 1) y sin (Tabla 1) Tween™80 al 0,05 % se evaluo durante un periodo de tiempo de dos horas como sigue a continuacion: Las muestras (20-30 ml) se retiraron a cero, treinta y ciento veinte minutos a partir de las formulaciones de Tween™80 al 0,0 % y al 0,05 %, las muestras se diluyeron a 1:2 en diluyente de protefna (diluyente de protefna Array® 360 (N° de Cat. 663630); Beckman Coulter Inc.; Fullerton, CA) y la antigenicidad de los trece serotipos del 13vPnC se sometio a ensayo (vease, Tabla 1) en un sistema Array® 360.
Como se muestra en la Tabla 1, se produjo una disminucion significativa de la antigenicidad de los trece polisacaridos del serotipo (formulados sin Tween™80) dentro del ensayo de dos horas. Sin embargo, de forma bastante significativa, la formulacion de 13vPnC que comprende Tween™80 al 0,05 % (Tabla 1), demostro una fuerte estabilidad sin reduccion de la antigenicidad durante todo el ensayo de antigenicidad de dos horas.
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La formulacion de 13vPnC/Tween™80 se sometio a ensayo adicionalmente para estabilidad frente a fuerzas de cizallamiento elevadas. En este experimento, una composicion de 13vPnC de 100 ml (4,4 pg/ml de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 23F y 8,8 pg/ml del serotipo 6B, tampon succinato 5 mM, NaCl 150 mM y 0,25 mg/ml de AlPO4) se anadieron a tres frascos de vidrio de 250 ml que comprendfan Tween™80 ya sea al 0,0 %, 0,01 % o 0,05 %. A continuacion, los tres frascos se sometieron a agitacion vorticial durante treinta minutos (2-8 °C) en un agitador vorticial (Vortex-Genie® 2; Scientific Industries, Inc.; Bohemia, NY) y se creo una superficie de contacto de aire-lfquido en el maximo ajuste de la velocidad. Despues de treinta minutos se tomaron muestras de 10-30 ml de cada frasco, se diluyeron a 1:2 en diluyente de protefna Array® 360 y la antigenicidad de los trece serotipos sometidos a ensayo en un sistema Array® 360.
Como se observa en la Tabla 2 que sigue a continuacion, el 13vPnC formulado sin Tween™80 (0,0 %) presentaba como promedio una disminucion de la antigenicidad de un 20 % despues de agitacion vorticial. El 13vPnC formulado con Tween™80 al 0,01 % presentaba una disminucion de la antigenicidad que variaba en un 2-10 % (promedio de un 8 %) y el 13vPnC formulado con Tween™80 al 0,05 % presentaba una disminucion de la antigenicidad que variaba en un 0-8 % (promedio de un 3 %). Por lo tanto, los datos presentados en la Tabla 2 demuestran que el 13vPnC formulado con cualquiera de Tween™80 al 0,01 % o al 0,05 % estaban significativamente estabilizados frente a fuerzas de cizallamiento, con respecto al 13vPnC formulado en ausencia de Tween ™80.
TABLA 2
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Ejemplo de referencia 2
LAS FORMULACIONES QUE COMPRENDEN TENSIOACTIVO ESTABILIZAN Y PREVIENEN LA AGREGACION DE C5A PEPTIDASA DE ESTREPTOCOCOS
La C5a peptidasa de estreptococos (SCP) usada en este ejemplo se expreso y se purifico como sigue a continuacion. La SCP se expreso de forma recombinante en E. coli usando un sistema inducible por arabinosa. A continuacion siguieron protocolos de fermentacion convencionales para E. coli usando medio definido libre de animal y posterior lisis celular. La SCP recombinante se purifico a partir de la fraccion soluble del celular mediante saturacion hasta un 60 % (aproximadamente 3 M) de sulfato de amonio a la vez que se agitaba durante 12-24 horas. El lisado saturado se centrifugo, el sobrenadante se retuvo y se cargo en una columna de interaccion hidrofoba de fenil Sepharose. El material unido se diluyo a continuacion con sulfato de amonio 1 M, Tris-Cl 20 mM, pH 7,5, se concentro, y se diafiltro frente a PBS, pH 7,4. La SCP recombinante purificada (rSCP) se diluyo hasta ~10 mg/ml con PBS, pH 7,4 y se paso a traves de un filtro Posidyne para retirar la endotoxina, seguido de una filtracion final (0,2 mM) para esterilidad y se almaceno congelado (-25 °C).
La SCP purificada (55 pg/ml) se formulo a continuacion con Tween™80 al 0,025 % o sin Tween™80 (0,0 %) en los siguientes tampones: tampon succinato 5 mM a pH 6,0, tampon fosfato 10 mM a pH 7,0, tampon fosfato 10 mM a 7,4 o tampon Tris 10 mM a pH 7,5 y se lleno en jeringas Hypak SCF™ separadas de BD. A continuacion, las jeringas se colocaron en un agitador orbital horizontal a 2-8 °C, agitadas a 180 cpm durante dos dfas y la concentracion de la protefna SCP se determino mediante el ensayo de Lowry modificado.
Como se muestra en la FIG. 1, la estabilidad de SCP aumentaba en gran medida cuando se formulaba con Tween™80. Por ejemplo, despues de dos dfas en el agitador orbital, la SCP formulada sin Tween™80 (FIG. 1A) demostro una disminucion significativa (por ejemplo, superior a un 90 %) en la concentracion de SCP de cada uno de los tampones sometidos a ensayo. Sin embargo, como se muestra en la FIG. 1B, la adicion de Tween™80 al 0,025 % a las formulaciones de tampon de SCP, antes de su colocacion en el agitador orbital durante dos dfas, inhibfa completamente la perdida de SCP que se observa en la FIG. 1A.
La estabilidad en el almacenamiento de la formulacion de SCP/Tween™80 (0,025 %) tambien se sometio a ensayo a 25 °C y 37 °C durante ocho semanas y seis semanas, respectivamente (los datos no se muestran). En resumen, la SCP (200 pg) se formulo ya sea en tampon de succinato o tampon de fosfato como sigue a continuacion: tampon de succinato (5 mM, pH 6,0) o tampon fosfato (15 mM, pH 7,4), NaCl al 0,9 % y Tween™80 al 0,025 %. La estabilidad de las formulaciones de SCP/Tween™80 se sometio a ensayo mediante HPLC de exclusion por tamano, ensayo de protefna total de Lowry modificado la inspeccion visual para precipitacion. En este estudio se observo que las formulaciones de SCP/Tween™80 (en cualquier tampon) eran completamente estables a 25 °C y 37 °C durante todo el estudio de estabilidad (es decir, hasta ocho semanas y seis semanas, respectivamente).
Ejemplo 3
LA INFLUENCIA DEL MEDIO DE ENVASADO SILICONADO EN LA ESTABILIDAD DE 13VPNC
Los experimentos anteriores indicaban (los datos no se muestran) que algunas composiciones inmunogenicas de 13vPnC precipitaban y/o se agregaban cuando se llenaban en jeringas de vidrio de borosilicato de Tipo 1 Hypak Becton Dickinson® (BD) listas para usar (una sola dosis) tratadas con silicona DC 360 de calidad medica Dow Corning® y se tapaban con tapones libres de latex (clorobutilo) West 4432/50 y proteccion West 7025/65 para la punta EZ (Mezcla Sintetica de Isopreno y Bromobutilo; West Pharmaceutical®, Lionville, PA). En estos experimentos, el 13vPnC se formulo en tampon succinato 5 mM que contenfa NaCl al 0,85 % y 4,4 pg/ml de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F de S. pneumoniae y 8,8 pg/ml del serotipo 6B de S. pneumoniae, con y sincero, 25 mg/ml de fosfato de aluminio como un adyuvante. Se observo que, en ausencia de AlPO4, las partfculas de 13vPnC se podfan observar facilmente, mientras que, en presencia de AlPO4, las partfculas de 13vPnC disminufan de forma significativa y eran mas diffciles de detectar.
En el presente ejemplo, se examinaron una serie de recipientes y componentes de cierre (es decir, medios de recipiente) para identificar que componentes inducfan o contribuyan a la formacion de partfculas de 13vPnC. El medio de recipiente sometido a ensayo comprendfa jeringas, tapones y viales y se enumeran a continuacion en la Tabla 3. Los tapones de BD y West enumerados en la Tabla 3 se siliconaron, usando ya sea el procedimiento de Huber o de Jar. El procedimiento de Huber de siliconado es mas controlado y proporcionaba de 30 a 60 pg/cm2 de silicona en la superficie del tapon, mientras que el procedimiento de Jar de siliconado daba como resultado de 150 a 300 pg/cm2 de silicona en la superficie del tapon. Basandose en calculos teoricos, aproximadamente un 15 % del area superficial del tapon se expone al producto en la jeringa, lo que sugiere que para el procedimiento de Huber y Jar se pueden extraer de los tapones entre 4,5 y 9 pg y de 22,5 a 45 pg de silicona, respectivamente.
Materiales
La silicona era de Dow Corning® 360 Medical Fluid de 1000 centistokes (N° de lote 0001846266). El 7vPnC se formulo en tampon succinato 5 mM que contenfa NaCl al 0,85 % y 4,4 pg/ml de los serotipos 4, 9, 14, 18C, 19F y 23F de S. pneumoniae y 8,8 pg/ml del serotipo 6B de S. pneumoniae, con y sin 0,25 mg/ml de fosfato de aluminio. El 13vPnC se formulo en tampon succinato 5 mM que contenfa NaCl al 0,85 % y 4,4 pg/ml de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F de S. pneumoniae y 8,8 pg/ml del serotipo 6b de S. pneumoniae, con y sin 0,25 mg/ml de fosfato de aluminio. El serotipo 6B de S. pneumoniae monovalente se formulo (tampon succinato 5 mM que contenfa NaCl al 0,85 %, sin fosfato de aluminio) a una concentracion de 61 pg/ml para simular la concentracion de sacarido total de las formulaciones de 13vPnC.
Procedimientos
El 7vPnC y el 13vPnC se formularon como se ha descrito anteriormente, y se anadieron 35 ml de a una formulacion dada a un frasco Nalgene® transparente de 250 ml. En cada frasco Nalgene®, se anadieron los componentes del medio de recipiente enumerados en la Tabla 3. Los frascos Nalgene® se colocaron a continuacion en un agitador orbital Labline® y se agito dando vueltas durante una noche a 50 rpm. Los resultados se resumen en la Tabla 3.
Aspecto Visual. Cada uno de los frascos Nalgene® que contenfa los componentes del medio de recipiente se mantuvieron con una luz de fluorescencia en el laboratorio. Una trayectoria de un rayo de luz (efecto Tindel) que pasaba a traves de las muestras permitio la deteccion de las partfculas.
Ensayo de Protefna. La protefna total y la protefna unida al aluminio se determino midiendo la concentracion de protefna total en la composicion inmunogenica formulada y la protefna asociada con el sedimento de aluminio, respectivamente (una alfcuota de la composicion inmunogenica se centrifugo y el sedimento se volvio a suspender en solucion salina). Los ensayos se realizaron usando el ensayo de protefna de Lowry Modificado por Pierce (N° de catalogo 23240) con albumina de suero bovino como un patron.
RESULTADOS
En la primera serie de experimentos, las composiciones inmunogenicas de 13vPnC se formularon sin AlPO4 y se expusieron a una serie de medios de recipiente enumerados a continuacion en la Tabla 3. A partir de los datos era claramente evidente (Tabla 3), que los componentes del medio de recipiente que se trataban con aceite de silicona inducfan la formacion de partfculas de color blanco. Por el contrario, no se detectaban partfculas en presencia de los tapones Daikyo® no siliconados (Daikyo Seiko, Ltd., Japon) y viales de Schott (Schott North America Inc.; Lebanon, PA).
TABLA 3
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El serotipo 6B de S. pneumoniae monovalente se eligio como un modelo para el 13vPnC y se formulo a 61,6 pg/ml (sin AlPO4) para simular la concentracion total de sacarido en la formulacion de 13vPnC. Se anadio silicona (Dow Corning 360 Medical Fluid) a alfcuotas del 6B monovalente formulado, que variaban de 2 ppm a 100 ppm. Las mezclas se colocaron en un agitador orbital Labline® durante 2 horas a 50 rpm. Como se indica a continuacion en la Tabla 4, se observaron partfculas de color blanco de tipo fibra en todas las concentraciones de silicona (Si).
TABLA 4
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La cantidad de silicona en las formulaciones de 13vPnC (sin AIPO4) tambien se examino. La concentracion de silicona se determino mediante Espectroscopfa de Emision de Plasma DC. (Los datos no se muestran). En este procedimiento, se combino el contenido de 25 jeringas y se extrajo con dos porciones de 50 ml de una mezcla de ciclohexano/ alcohol isopropflico. Los extractos se combinaron y se evaporaron. El residuo se solubilizo y se sometio a ensayo del mismo modo que los procedimientos existentes para determinacion de silicona en tapones de goma. Los resultados indicaban que se pueden extraer entre 15,8 |jg y 19,0 |jg de silicona de cada jeringa. Esta cantidad corresponde a de un 2,7 % a un 3,3 % de silicona.
En una serie de experimentos separados, en los que el 13vPnC se formulo en presencia de AlPO4 y se sometio al mismo medio de recipiente que se establece en la Tabla 3, se elucido que la silicona y la protema "libre" (13vPnC) en solucion era responsable de la formacion de las partmulas (los datos no se muestran). El analisis de FTIR de las partmulas tambien indicaba que la particular consistfa en protema y silicona (los datos no se muestran). En estos experimentos se determino que aproximadamente un 85 % del 13vPnC se une al AlPO4, en los que el 15 % restante era 13vPnC libre (no unido a APO4) en solucion. Por el contrario, se observo que el 7vPnC formulado con AlPO4 estaba unido en un 100 % al AlPO4 (los datos no se muestran).
Para elucidar el efecto de la protema-polisacarido libre en la formulacion de las partmulas, se tomaron almuotas de 25 ml tanto de 7vPnC como de 13vPnC y se transfirieron a un tubo de centnfuga de 50 ml. Las muestras se centrifugaron durante 10 minutos a 3.000 rpm y el sobrenadante se extrajo cuidadosamente y se transfirio a un frasco Nalgene®. A cada frasco se le anadieron diez tapones siliconados (Tapones 4432) y se colocaron en un agitador orbital a 50 rpm. Despues de una inspeccion visual cuidadosa, se observo que el sobrenadante de 7vPnC no presentaba formacion de partmulas, permaneciendo de este modo transparente e incoloro. Sin embargo, el sobrenadante de 13vPnC comenzo a mostrar niveles bajos de partmulas la cuarta hora de observacion (los datos no se muestran). Este resultado sugiere que la protema-polisacarido libre en solucion, en conjunto con la silicona, es responsable de la formacion de las partmulas.
Para elucidar adicionalmente la contribucion de la protema-polisacarido libre en solucion para la formacion de partmulas, se eligieron los serotipos 4 y 6B de S. pneumoniae monovalente por su union al aluminio elevada y baja, respectivamente. Estos dos monovalentes se formularon a una concentracion de protema que variaba de 25 jg/ml a 200 jg/ml en ausencia y presencia de AlPO4. En cada formulacion se colocaron diez tapones siliconados (tapones 4432), que a continuacion se colocaron en un agitador orbital a 50 rpm. Como se indica a continuacion en la Tabla 5, se observaron partmulas de color blanco de tipo fibra para ambos serotipos monovalentes en todas las concentraciones de protema en ausencia de AlPO4. Sin embargo, en presencia de AlPO4, se detectaron partmulas a concentraciones mas bajas para el serotipo 4 (100 jg/ml) con respecto al serotipo 6B (200 jg/ml), los datos no se muestran.
TABLA 5
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continuacion
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Ejemplo 4
LOS ADYUVANTES DE ALUMINIO INHIBEN LA FORMACION DE PARTICULAS DE 13VPNC EN PRESENCIA DE MEDIOS DE ENVASADO SILICONADOS
Como se ha expuesto anteriormente en el Ejemplo 3, una composicion inmunogenica de 13vPnC es una formulacion lfquida que comprende 4,4 pg/ml de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 23F de S. pneumoniae y 8,8 pg/ml de tipo 6B en tampon succinato 5 mM (pH 5,8) y NaCl al 0,85 %, que tambien se puede formular con o sin un adyuvante (por ejemplo, un adyuvante de aluminio). El 13vPnC tambien se puede formular con o sin un adyuvante, tal como 0,25 mg de aluminio/ml de fosfato de aluminio (AlPO4). En el Ejemplo 3 se observo que 13vPnC formulado sin AlPO4 y cargado en jeringas Hypak SCF™ de BD (protegidas con embolos Hypak) fallaba en la inspeccion visual debido a la observacion de partfculas, en el que algunos estudios adicionales revelaron que las partfculas eran en parte un resultado de interacciones de protefna-polisacarido con silicona. En el siguiente ejemplo, se evaluaron jeringas (y embolos) de diversos vendedores con formulaciones de 13vPnC, en las que se simularon las condiciones de transporte y manipulacion mediante agitacion (se describe a continuacion).
Materiales
El 13vPnC se formulo en tampon de succinato 5 mM que contenfa NaCl al 0,85 % y 4,4 pg/ml de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F y 23F de S. pneumoniae y 8,8 pg/ml del serotipo 6B de S. pneumoniae, con y sin 0,25 mg/ml de fosfato de aluminio. El medio de recipiente sometido a ensayos se enumera a continuacion en la Tabla 6.
TABLA 6
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continuacion
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Procedimientos
Procedimiento de Formulacion y Llenado. En la Tabla 7 que sigue a continuacion se enumera la formula para una formulacion de 13vPnC de numero 2 litros. En resumen, la solucion salina al 0,85 % se anadio primero a un vaso de precipitados de vidrio, seguido del tampon de succinato 5 mM (pH 5,8), y a continuacion secuencialmente cada uno de los conjugados de serotipo de S. pneumoniae. La formulacion se mezclo suavemente en una placa agitadora y se filtro a traves de una unidad de filtro Millipore® de 0,22 pm. Para la formulacion que comprende AlPO4, a continuacion se anadio el AlPO4 (0,25 mg/ml de concentracion final) y la formulacion se mezclo suavemente. Las jeringas del ensayo se llenaron a continuacion (0,58 ml/jeringa) y se cerraron con embolos.
Simulacion de Transporte mediante Agitacion. Para agitar las muestras se uso un agitador vorticial Digital Multitube de la firma VWR® (N° de Catalogo 14005-826). Las jeringas llenadas con 13vPnC se colocaron de forma horizontal y se fijaron con las placas de los soportes del agitador vorticial. Las muestras se mantuvieron en posicion y se agitaron en modo pausa a 500 rpm a 2-8 °C durante veinticuatro horas.
Nefelometrfa. Las antigenicidades especfficas del serotipo se determinaron mediante un ensayo de nefelometrfa de la tasa usando anticuerpos especfficos del tipo. Para 13vPnC con AlPO4, el fosfato de aluminio se solubilizo mediante la adicion de NaOH 1 N. La solucion se neutralizo inmediatamente mediante la adicion de acido cftrico 1 M. Para 13vPnC sin AlPO4, no se realizaron procedimientos de solubilizacion ni de neutralizacion. El ensayo mide la tasa de cambio de la intensidad de la dispersion de luz derivada del complejo de antfgeno-anticuerpo formado en la muestra usando un nefelometro Array 360 de Beckman.
TABLA 7
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(continuacion)
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RESULTADOS
En este estudio, algunas jeringas de diferentes vendedores, que tienen diferentes niveles de silicona (Tabla 6), se sometieron a condiciones de agitacion controlada. La antigenicidad total de cada serotipo se midio mediante ensayos de Nefelometrfa para muestras tanto de agitacion previa como de agitacion posterior. La perdida de antigenicidad despues de agitacion (porcentaje) se calculo y se muestra en la FIG. 2 a FIG. 7.
Antes del estudio, las condiciones de agitacion se optimizaron basandose en la perdida de antigenicidad de los dos controles: (1) el control del peor caso (control positivo, alto contenido de silicona; FIG. 2) y (2) el control del mejor caso (control negativo, sin silicona; FIG. 3). A continuacion las condiciones se optimizaron de modo que la perdida de antigenicidad era baja en el control positivo, aunque detectable en el control negativo. Esto se hizo para asegurar que la agitacion no era ni demasiado debil para producir precipitacion en las jeringas; ni demasiado fuerte, de modo que la precipitacion la podrfan causar otros factores distintos de la interaccion de la silicona (por ejemplo, mediante fuerzas de cizallamiento). Por lo tanto, la agitacion a 500 rpm (modo pausa) durante veinticuatro horas se eligio como la condicion de agitacion mas adecuada, mientras que se usaron una temperatura de 2-8 °C y una posicion horizontal para simular las condiciones en tiempo real del transporte y la manipulacion del producto.
Los resultados del estudio se resumen como sigue a continuacion: Las perdidas de antigenicidad mas elevadas del 13vPnC formulado con AlPO4 se produjo en las jeringas con niveles de silicona mas elevados (los datos no se muestran). Por ejemplo, de las jeringas enumeradas en la Tabla 6, la jeringa Hypak de BD (control 1), la jeringa al horno de BD (jeringa 3; 0,1 mg de silicona), cada una de las jeringas de viscosidad elevada de BD (jeringa 5) y BunderGlas PS4 (jeringa 8, 0,14 mg de silicona), presentaba uno o mas de los serotipos de 13vPnC con una perdida de antigenicidad superior a un 10 %. Las perdidas de antigenicidad mas pequenas del 13vPnC formulado con AlPO4 se produjeron en las jeringas con niveles de silicona mas bajos. Por ejemplo, las jeringas de Vetter (FIG. 4) y las jeringas de plastico TopPac de Schott (FIG. 5) eran las mas similares a las jeringas sin siliconar (FIG. 2), demostrando ambas perdidas de antigenicidad menores para 13vPnC formulado con AlPO4.
La influencia del fosfato de aluminio en la estabilizacion del 13vPnC y la inhibicion de la formacion de partfculas en presencia jeringas siliconadas se analizo en experimentos usando el 13vPnC formulado con y sin 0,25 mg/ml de AlPO4, en los que las jeringas usadas eran las jeringas de bajo contenido de silicona al horno de BD (jeringa 4 en la Tabla 6) y las jeringas BunderGlas PS2 de bajo contenido de silicona (jeringa 7 en la Tabla 6). Las jeringas de bajo contenido en silicona al horno de BD (0,04 mg de silicona/cilindro) por lo general tenfan una perdida de antigenicidad inferior a un 10 % para los serotipos de 13vPnC formulados con AlPO4 (FIG. 6A), mientras que la perdida de antigenicidad para los serotipos de 13vPnC formulados sin AlPO4 (FIG. 6B) presentaba perdidas de antigenicidad que variaban de un 5 % (serotipo 1) hasta a aproximadamente un 50 % (serotipo 23F). Las jeringas BunderGlas PS2 de bajo contenido en silicona (0,056 mg de silicona/cilindro) presentaban una perdida de antigenicidad inferior a un 5-8 % (dependiendo del serotipo) para el 13vPnC formulado con AlPO4 (FIG. 7A), mientras que la perdida de antigenicidad para los serotipos de 13vPnC formulados sin AlPO4 (FIG. 7B) presentaba perdidas de antigenicidad que variaban de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 30 % (dependiendo del serotipo).
Por lo tanto, estos datos tomados en conjunto indican que: (1) la perdida de antigenicidad de 13vPnC era mayor en las jeringas con niveles de silicona mas elevados y (2) el 13vPnC formulado sin AlPO4 mantenfan perdidas de antigenicidad superiores a 13vPnC con AIPO4 en todas las jeringas sometidas a ensayo.
Ejemplo de referencia 5
LAS FORMULACIONES QUE COMPRENDEN TENSIOACTIVO OPTIMIZAN LA UNION DE PROTEINAS ANTIGENICAS DE MENINGOCOCOS A ADYUVANTES DE SAL DE ALUMINIO
La protefna 2086 lipidada recombinante de N. meningitidis (rLP2086) usada en este ejemplo se expreso y se purifico como sigue a continuacion. La rLP2086 se expreso de forma recombinante en E. coli usando una secuencia directora nativa. A continuacion siguieron protocolos de fermentacion convencionales para E. coli usando y la posterior lisis celular. La protefna 2086 lipidada recombinante de N. meningitidis se purifico a partir de sedimento de la membrana con Tris-HCl 50 mM/EDTA 5 mM/sarcosilo al 1 % a pH 8. Este extracto de sarcosilo se ajusto a Zwittergent 3-14 al 1 % (Z3-14) y se dializo dos veces con respecto a un exceso de 30 veces de Tris-HCl 50 mM/EDTA 5 mM/Z3-14 al 1 %. El extracto de rLP2086 dializado se precipito con etanol al 90 % para retirar el sarcosilo restante, y se solubilizo con Tris-HCl 50 mM/EDTA 5 mM/Z3-14 al 1 % a pH 8. El material insoluble se retiro por centrifugacion, el sobrenadante se paso sobre una columna de cromatograffa de intercambio anionico, y el rLP2086 se recogio en la fraccion sin unir. El material sin unir se dializo a continuacion dos veces frente al exceso de 30 veces de NaAc 25 mM/Z3-14 al 1 % a pH 4,5, y se paso sobre una columna de cromatograffa de intercambio cationico. El rLP2086 se eluyo con un gradiente de NaCl 0-0,3 M y se almaceno congelado (-25 °C).
A continuacion el rLP2086 purificado se formulo con NaCl 150 mM, Tween™80 al 0,020 %, 0,25 mg de Al/ml de AlPO4, y en los siguientes tampones: tampon fosfato 10 mM a pH 7,0 y tampon succinato 5 mM a pH 6,0. La Tabla 8 compara el porcentaje de union de protefna al adyuvante de AlPO4.
TABLA 8
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REFERENCIAS
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un medio de recipiente siliconado cargado con una formulacion que inhibe la agregacion inducida por silicona de un conjugado de polisacarido-protefna comprendido en un medio de recipiente siliconado, formulacion que comprende (i) una solucion salina con pH tamponado, en la que el tampon tiene un pKa de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 7,5, (ii) una sal de aluminio y (iii) uno o mas conjugados de polisacarido-protefna en la que el conjugado de polisacarido-protefna comprende uno o mas polisacaridos de neumococos.
2. El medio de recipiente siliconado de la reivindicacion 1, en el que la solucion salina con pH tamponado en la formulacion tiene un pH de 5,5 a 7,5.
3. El medio de recipiente siliconado de la reivindicacion 1 o 2, en el que el tampon en la formulacion es fosfato, succinato, histidina o citrato.
4. El medio de recipiente siliconado de la reivindicacion 1 en la que el tampon es succinato a una concentracion final de 1 mM a 10 mM y pH de 5,8 a 6,0.
5. El medio de recipiente siliconado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la sal en la solucion salina con pH tamponado comprende cloruro de magnesio, cloruro potasico, cloruro sodico o una combinacion de los mismos.
6. El medio de recipiente siliconado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la sal de aluminio es hidroxido de aluminio, fosfato de aluminio o sulfato de aluminio.
7. El medio de recipiente siliconado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que la sal de aluminio es fosfato de aluminio.
8. El medio de recipiente siliconado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en el que la formulacion comprende ademas polisorbato 80 (Tween™80).
9. El medio de recipiente siliconado de la reivindicacion 8 en la que la concentracion final del polisorbato 80 en la formulacion es de al menos un 0,01 % a un 10 % de polisorbato 80 en peso/volumen de la formulacion.
10. El medio de recipiente siliconado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el uno o mas polisacaridos de neumococos son un polisacarido del serotipo 4 de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 6B de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 9V de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 14 de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 18C de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 19F de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 23F de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 1 de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 3 de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 5 de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 6A de S. pneumoniae, un polisacarido del serotipo 7F de S. pneumoniae y un polisacarido del serotipo 19A de S. pneumoniae.
11. El medio de recipiente siliconado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la protefna de la formulacion de conjugado polisacarido-protefna se selecciona del grupo que consiste en CRM197, un toxoide del tetanos, un toxoide del colera, un toxoide del Pertussis, un toxoide labil al calor de E. coli (LT), un toxoide de neumolisina, protefna A de superficie de neumococos (PspA), protefna A de adhesina de neumococos (PsaA), una peptidasa C5a de Streptococcus, protefna D de Haemophilus influenzae, ovoalbumina, hemocianina de lapa californiana (KLH), albumina de suero bovino (BSA) y derivado de protefna purificada de tuberculina (PPD).
12. El medio de recipiente siliconado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la formulacion de conjugado de polisacarido-protefna es una formulacion de conjugado de neumococos 7-valente (7vPnC) que comprende un polisacarido del serotipo 4 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 6B de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 9V de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 14 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 18C de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 19F de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197 y un polisacarido del serotipo 23F de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197.
13. El medio de recipiente siliconado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la formulacion de conjugado de polisacarido-protefna es una formulacion de conjugado de neumococos 13-valente (13vPnC) que comprende un polisacarido del serotipo 4 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 6B de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 9V de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 14 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 18C de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 19f de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 23F de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 1 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 3 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 5 de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 6A de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197, un polisacarido del serotipo 7F de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197 y un polisacarido del serotipo 19A de S. pneumoniae conjugado con un polipeptido CRM197.
14. El medio de recipiente siliconado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en el que dicho recipiente es una jeringa.
15. El medio de recipiente siliconado de la reivindicacion 14 en el que dicho recipiente es una jeringa de vidrio.
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