KR20200040812A - 폐렴구균 접합체 백신 제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 완충제, 계면활성제, 당, 알칼리 또는 알칼리 염, 알루미늄 아주반트, 임의로 벌킹제 및 임의로 중합체를 포함하는 폴리사카라이드-단백질 접합체 백신 제제를 제공한다.

Description

폐렴구균 접합체 백신 제제

본 발명은 완충제, 계면활성제, 당, 알칼리 또는 알칼리 염, 알루미늄 아주반트, 임의로 벌킹제 및 임의로 중합체를 포함하는 폐렴구균 접합체 백신 제제를 제공한다.

피막화된 박테리아의 한 예인 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)는 전세계적으로 심각한 질환의 유의한 원인이다. 1997년에, 질환 제어 및 예방 센터 (CDC)는 미국에서 매년 3,000건의 폐렴구균성 수막염 사례, 50,000건의 폐렴구균성 박테리아혈증 사례, 7,000,000건의 폐렴구균성 중이염 사례 및 500,000건의 폐렴구균성 폐렴 사례가 있는 것으로 추정하였다. 문헌 [Centers for Disease Control and Prevention, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1997, 46(RR-8):1-13]을 참조한다. 추가로, 이들 질환의 합병증은 유의할 수 있으며, 일부 연구는 폐렴구균성 수막염에 의한 최대 8%의 사망률 및 25%의 신경계 후유증을 보고하고 있다. 문헌 [Arditi et al., 1998, Pediatrics 102:1087-97]을 참조한다.

수년 동안 허가되어 온 다가 폐렴구균 폴리사카라이드 백신은 성인, 특히 고령자 및 고위험자에서 폐렴구균성 질환을 예방하는데 매우 유용한 것으로 입증되었다. 그러나, 영아 및 소아는 접합되지 않은 폐렴구균 폴리사카라이드에 불량하게 반응한다. 박테리아 폴리사카라이드는 T-세포-비의존성 면역원이며, 영아에서 약한 반응을 도출하거나 반응을 전혀 도출하지 않는다. 박테리아 폴리사카라이드 면역원의 담체 단백질에의 화학적 접합은 영아에서의 면역 반응을 T-세포 의존성 면역 반응으로 전환시킨다. 디프테리아 톡소이드 (DTx, DT의 화학적으로 해독된 버전) 및 CRM₁₉₇은 그의 아미노산 서열 내 T-세포-자극 에피토프의 존재로 인해 박테리아 폴리사카라이드 면역원을 위한 담체 단백질로서 기재되었다.

그 당시 소아 및 영아에서 침습성 폐렴구균성 질환을 야기하는 7종의 가장 빈번하게 단리된 혈청형 (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F)을 함유하는 폐렴구균 접합체 백신인 프레브나르(Prevnar)®는 미국에서 2000년 2월에 처음 허가되었다.

프레브나르 13®은 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F를 포함하는 13가 폐렴구균 폴리사카라이드-단백질 접합체 백신이다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2006/0228380 A1, 문헌 [Prymula et al., 2006, Lancet 367:740-48 및 Kieninger et al., Safety and Immunologic Non-inferiority of 13-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Compared to 7-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Given as a 4-Dose Series in Healthy Infants and Toddlers, presented at the 48^th Annual ICAAC/ISDA 46^th Annual Meeting, Washington DC, October 25-28, 2008]을 참조한다. 또한, 문헌 [Dagan et al., 1998, Infect Immun. 66: 2093-2098 및 Fattom, 1999, Vaccine 17:126]을 참조한다.

중국 특허 출원 공개 번호 CN 101590224 A는 혈청형 1, 2, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9N, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F를 포함하는 14가 폐렴구균 폴리사카라이드-단백질 접합체 백신을 기재한다.

미국 특허 번호 8,192,746은 모두 개별적으로 CRM₁₉₇ 폴리펩티드에 접합된, 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F를 갖는 15가 폐렴구균 폴리사카라이드-단백질 접합체 백신을 기재한다.

다수의 담체 단백질 시스템이 또한 기재되었다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 20100209450, 20100074922, 20090017059, 20090010959 및 20090017072를 참조한다.

에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드-단백질 접합체 및 폴리소르베이트 80 (PS-80) 및 폴록사머 188 (P188)을 포함한 계면활성제를 포함하는 제제가 개시되었다. 각각 미국 특허 번호 8,562,999 및 미국 특허 출원 공개 번호 US20130273098을 참조한다.

본 발명은 (i) 1종 이상의 폴리사카라이드-단백질 접합체; (ii) 약 5.0 내지 7.5 범위의 pH를 갖는 완충제; (ii) 염화마그네슘, 염화칼슘, 염화칼륨, 염화나트륨 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 알칼리 또는 알칼리 염; (iii) 계면활성제; (iv) 수크로스, 트레할로스 및 라피노스로 이루어진 군으로부터 선택된 당; 임의로 (v) 벌킹제; 및 임의로 (vi) 카르복시메틸 셀룰로스 (CMC), 히드록시프로필 셀룰로스 (HPC), 히드록시프로필 메틸셀룰로스 (HPMC), 2-히드록시에틸 셀룰로스 (2-HEC), 크로스카르멜로스, 메틸 셀룰로스, 글리세롤, 폴리에틸렌 옥시드, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 프로필렌 글리콜 (PG) 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 중합체; 및 (vii) 알루미늄 아주반트를 포함하는 제제를 제공한다.

한 실시양태에서, 당 및 벌킹제의 총 농도는 적어도 약 50 mg/ml이다. 또 다른 실시양태에서, 당 및 벌킹제의 총 농도는 적어도 약 90 mg/ml이다. 추가 실시양태에서, 당 및 벌킹제의 총 농도는 약 50-400 mg/ml이고, 당에 대한 벌킹제 비는 1 이상이다. 추가 실시양태에서, 당 및 벌킹제의 총 농도는 약 50-150 mg/ml이고, 벌킹제 대 당 비는 약 2:1이다. 한 실시양태에서, 벌킹제는 만니톨, 글리신 또는 락토스이다. 추가 실시양태에서, 당은 트레할로스 또는 수크로스이다.

한 실시양태에서, 중합체는 약 1-25 mg/ml의 카르복시메틸 셀룰로스 (CMC), 히드록시프로필 셀룰로스 (HPC), 2-히드록시에틸 셀룰로스 (2-HEC), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 프로필렌 글리콜 (PG) 또는 그의 조합이다. 바람직한 실시양태에서, 중합체는 카르복시메틸 셀룰로스 (CMC)이다. 한 실시양태에서, 폴리사카라이드-단백질 농도는 2-704, 5-500 또는 4-92 μg/ml이다. 또 다른 실시양태에서, 폴리사카라이드-단백질 농도는 40-80 또는 4-92 μg/ml이다. 특정 실시양태에서, 제제는 0.1-0.5 mg/mL의 알루미늄 포스페이트 아주반트 (APA)를 포함한다.

특정 실시양태에서, 계면활성제는 1100 Da 내지 17,400 Da, 7,500 Da 내지 15,000 Da, 또는 7,500 Da 내지 10,000 Da 범위의 분자량을 갖는 폴록사머이다. 폴록사머는 폴록사머 188 또는 폴록사머 407일 수 있다. 특정 측면에서, 폴록사머의 최종 농도는 0.001 내지 50 mg/ml, 0.25 내지 10 mg/ml이다. 특정 실시양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20이다. 특정 측면에서, 폴리소르베이트 20의 최종 농도는 0.01 내지 100 mg/ml, 또는 0.25 내지 1 mg/ml, 또는 0.25 내지 5 mg/ml 범위이다.

특정 실시양태에서, pH 완충 염수 용액은 5.0 내지 7.5 범위의 pH를 가질 수 있다. 완충제는 포스페이트, 숙시네이트, L-히스티딘, MES, MOPS, HEPES, 아세테이트 또는 시트레이트로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 한 측면에서, 완충제는 5 mM 내지 50 mM의 최종 농도의 L-히스티딘, 또는 1 mM 내지 10 mM의 최종 농도의 숙시네이트이다. 구체적 측면에서, L-히스티딘은 20 mM ± 2 mM의 최종 농도로 존재한다. pH 완충 염수 용액 중의 염은 염화마그네슘, 염화칼륨, 염화나트륨 또는 그의 조합일 수 있다. 한 측면에서, pH 완충 염수 용액은 염화나트륨이다. 염수는 20 mM 내지 170 mM의 농도로 존재할 수 있다.

특정 실시양태에서, 폴리사카라이드-단백질 접합체는 담체 단백질에 접합된 1종 이상의 폐렴구균 폴리사카라이드를 포함한다. 특정 측면에서, 담체 단백질은 CRM₁₉₇, 디프테리아 독소 단편 B (DTFB), DTFB C8, 디프테리아 톡소이드 (DT), 파상풍 톡소이드 (TT), TT의 단편 C, 백일해 톡소이드, 콜레라 톡소이드, 수막구균 외막 단백질 (OMPC), 이. 콜라이(E. coli) LT (열-불안정성 장독소), 이. 콜라이 ST (열-안정성 장독소), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터의 외독소 A 및 그의 조합으로부터 선택된다. 한 구체적 측면에서, 폴리사카라이드-단백질 접합체 중 1종 이상은 CRM₁₉₇에 접합된다. 특정 측면에서, 폴리사카라이드 단백질 접합체 중 1종 이상은 수성 용매 또는 비-수성 용매, 예컨대 디메틸술폭시드 (DMSO)에서 환원성 아미노화를 사용하여 제조된다. 특정 측면에서, 혈청형 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F 및 23F로부터의 폴리사카라이드 단백질 접합체는 DMSO에서 환원성 아미노화를 사용하여 제조될 수 있고, 혈청형 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F 및 33F로부터의 폴리사카라이드 단백질 접합체는 수용액에서 환원성 아미노화를 사용하여 제조될 수 있다. 특정 측면에서, 각각의 용량은 4 μg/mL 또는 8 μg/mL의 각각의 사카라이드, 예외로 8 μg/mL 또는 16 μg/mL의 6B; 및 약 64 μg/mL 또는 128 μg/mL CRM₁₉₇ 담체 단백질을 함유하도록 제제화된다.

본 발명은 또한 CRM₁₉₇ 폴리펩티드에 접합된 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F로부터의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 또는 CRM₁₉₇에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에의 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 6E, 6G, 6H, 7F, 7A, 7B, 7C, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10F, 10A, 10B, 10C, 11F, 11A, 11B, 11C, 11D, 11E, 12F, 12A, 12B, 13, 14, 15F, 15A, 15B, 15C, 16F, 16A, 17F, 17A, 18F, 18A, 18B, 18C, 19F, 19A, 19B, 19C, 20A, 20B, 21, 22F, 22A, 23F, 23A, 23B, 24F, 24A, 24B, 25F, 25A, 27, 28F, 28A, 29, 31, 32F, 32A, 33F, 33A, 33B, 33C, 33D, 33E, 34, 35F, 35A, 35B, 35C, 36, 37, 38, 39, 40, 41F, 41A, 42, 43, 44, 45, 46, 47F, 47A, 48, CWPS1, CWPS2, CWPS3 중 적어도 1종으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하고, 4 μg/mL 또는 8 μg/mL의 각각의 사카라이드, 예외로 8 μg/mL 또는 16 μg/mL의 6B; 및 약 64 μg/mL 또는 128 μg/mL CRM₁₉₇ 담체 단백질; 약 5.0 내지 7.5 범위의 pH를 갖는 pH 완충 염수 용액, 약 150 mM NaCl, 약 2 mg/ml 폴리소르베이트 20, 250 μg/ml APA를 함유하고, 약 50 mg/ml 만니톨 및 약 20 mg/ml 수크로스; 약 60 mg/ml 만니톨, 약 40 mg/ml 수크로스; 약 90 mg/ml 수크로스, 약 5 mg/ml CMC; 약 90 mg/ml 수크로스, 약 5 mg/ml 2-HEC; 약 90 mg/ml 수크로스, 약 5 mg/ml HPC; 약 90 mg/ml 수크로스, 약 5 mg/ml CMC 및 약 5 mg/ml PG; 약 40 mg/ml 수크로스, 약 60 mg/ml 만니톨 및 약 5 mg/ml CMC; 또는 약 40 mg/ml 수크로스, 약 60 mg/ml 만니톨, 약 5 mg/ml CMC 및 약 5 mg/ml PG를 갖는 폐렴구균 접합체 제제에 관한 것이다. 특정 측면에서, 완충제는 히스티딘이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 약 20-150, 2-704 또는 4-92 μg/ml의 CRM₁₉₇에 접합된 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F로부터의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드로 본질적으로 이루어진 15가 폐렴구균 접합체 (15vPnC), 약 5.0 내지 7.5 범위의 pH를 갖는 pH 완충 염수 용액, 약 30-150 mM NaCl, 약 0.05-2 mg/ml 폴리소르베이트 20, 약 20-250 mg/ml 수크로스, 약 30-100 mg/ml 만니톨, 약 0.1-0.75 mg/ml APA, 약 1-10 mg/ml CMC 및 임의로 약 1-10 mg/ml PG를 포함하는 백신 제제를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 약 20-150, 4-92 또는 2-704 μg/ml의 CRM₁₉₇에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에의 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 6E, 6G, 6H, 7F, 7A, 7B, 7C, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10F, 10A, 10B, 10C, 11F, 11A, 11B, 11C, 11D, 11E, 12F, 12A, 12B, 13, 14, 15F, 15A, 15B, 15C, 16F, 16A, 17F, 17A, 18F, 18A, 18B, 18C, 19F, 19A, 19B, 19C, 20A, 20B, 21, 22F, 22A, 23F, 23A, 23B, 24F, 24A, 24B, 25F, 25A, 27, 28F, 28A, 29, 31, 32F, 32A, 33F, 33A, 33B, 33C, 33D, 33E, 34, 35F, 35A, 35B, 35C, 36, 37, 38, 39, 40, 41F, 41A, 42, 43, 44, 45, 46, 47F, 47A, 48, CWPS1, CWPS2, CWPS3 중 적어도 1종으로부터의 폴리사카라이드, 약 5.0 내지 7.5 범위의 pH를 갖는 pH 완충 염수 용액, 약 30-150 mM NaCl, 약 0.05-2 mg/ml 폴리소르베이트 20, 약 20-250 mg/ml 수크로스, 약 30-100 mg/ml 만니톨, 약 0.1-0.75 mg/ml APA, 약 1-10 mg/ml CMC 및 임의로 약 1-10 mg/ml PG를 포함하는 백신 제제를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 4-704 또는 4-92 μg의 CRM₁₉₇에 접합된 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F로부터의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드를 포함하는 폐렴구균 접합체 백신, 또는 CRM₁₉₇에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에의 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 6E, 6G, 6H, 7F, 7A, 7B, 7C, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10F, 10A, 10B, 10C, 11F, 11A, 11B, 11C, 11D, 11E, 12F, 12A, 12B, 13, 14, 15F, 15A, 15B, 15C, 16F, 16A, 17F, 17A, 18F, 18A, 18B, 18C, 19F, 19A, 19B, 19C, 20A, 20B, 21, 22F, 22A, 23F, 23A, 23B, 24F, 24A, 24B, 25F, 25A, 27, 28F, 28A, 29, 31, 32F, 32A, 33F, 33A, 33B, 33C, 33D, 33E, 34, 35F, 35A, 35B, 35C, 36, 37, 38, 39, 40, 41F, 41A, 42, 43, 44, 45, 46, 47F, 47A, 48, CWPS1, CWPS2, CWPS3 중 적어도 1종으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 폐렴구균 접합체 백신, 및 약 3.5 mg CMC, 약 62 mg 수크로스, 약 0.18 mg APA, 약 1.4 mg PS20, 약 6.3 mg NaCl, 약 2.2 mg 히스티딘; 약 3.5 mg CMC, 약 3.5 mg PG, 약 63 mg 수크로스, 약 0.18 mg APA, 약 1.4 mg PS20, 약 6.3 mg NaCl, 약 2.2 mg 히스티딘; 약 3.5 mg CMC, 약 28 mg 수크로스, 42 mg 만니톨, 약 0.18 mg APA, 약 1.4 mg PS20, 약 6.3 mg NaCl, 약 2.2 mg 히스티딘; 약 3.5 mg CMC, 및 약 3.5 mg PG, 약 28 mg 수크로스, 약 42 mg 만니톨, 약 0.18 mg APA, 약 1.4 mg PS20, 약 2.1 mg NaCl, 약 2.2 mg 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 제제를 포함하는 용기를 제공한다. 한 실시양태에서, 백신은 15 μm 미만 또는 10 μm 미만의 d(0.50)를 갖는다.

본 발명은 또한 가시적 비등 징후를 갖지 않는 건조 동결건조구 및/또는 케이크를 수득하기 위해 진공 챔버에서 진행파 포맷의 마이크로웨이브 방사선의 적용을 통해 알루미늄 아주반트 상에 사전흡수된 건조 접합된 백신을 수득하는 방법을 제공한다.

본 발명은 부분적으로 알루미늄 아주반트를 갖는 접합체 백신 제제 내의 당 및 벌킹제가 동결건조, 마이크로웨이브 건조 및 동결건조구 형성 동안 응집되는 그의 경향을 감소시킬 수 있다는 발견에 기초한다.

용어 "약"은 물질 또는 조성물의 양 (예를 들어, mM 또는 M), 제제 성분의 백분율 (v/v 또는 w/v), 용액/제제의 pH, 또는 방법에서의 단계를 특징화하는 파라미터의 값 등을 변형시키는 경우, 예를 들어 물질 또는 조성물의 제조, 특징화 및/또는 사용에 수반되는 전형적인 측정, 취급 및 샘플링 절차를 통해; 이들 절차에서의 의도치 않은 오차를 통해; 조성물을 제조 또는 사용하거나 절차를 수행하는데 사용되는 성분의 제조, 공급원 또는 순도에서의 차이 등을 통해 발생할 수 있는 수치 양의 변동을 지칭한다. 특정 실시양태에서, "약"은 ± 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5% 또는 10%의 변동을 의미할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "폴리사카라이드" (Ps)는 "사카라이드", "올리고사카라이드", "폴리사카라이드", "리포사카라이드", "리포-올리고사카라이드 (LOS)", "리포폴리사카라이드 (LPS)", "글리코실레이트", "당접합체" 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 면역학적 및 박테리아 백신 분야에서 통상적으로 사용되는 임의의 항원성 사카라이드 요소 (또는 항원성 단위)를 포함하는 것으로 의도된다.

본원에 사용된 바와 같이, 본 발명의 면역원성 조성물과 함께 사용된 경우의 용어 "포함하다"는 임의의 다른 성분 (항원 혼합물에 대해 "로 이루어진"이라는 표현의 제한을 받음), 예컨대 아주반트 및 부형제를 포함함을 지칭한다. 다가 폴리사카라이드-단백질 접합체 혼합물과 함께 사용되는 경우의 용어 "로 이루어진"은 특정한 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 가지며 상이한 혈청형으로부터의 다른 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체는 갖지 않는 혼합물을 지칭한다.

용어 "벌킹제"는 동결-건조 생성물의 구조를 제공하는 작용제를 포함한다. 벌킹제에 사용되는 통상의 예는 만니톨, 글리신 및 락토스를 포함한다. 제약상 우아한 케이크를 제공하는 것 이외에, 벌킹제는 또한 붕괴 온도를 변형시키는 것과 관련하여 유용한 품질을 부여하여, 동결-해동 보호, 수분 감소를 제공하고 장기 저장에 걸쳐 단백질 안정성을 증진시킬 수 있다. 이들 작용제는 또한 장성 개질로서의 역할을 할 수 있다.

본원에 정의된 용어 "침전", "침전화", "미립자 형성", "응집화", "혼탁" 및"응집"은 상호교환가능하게 사용될 수 있고, 폴리사카라이드-단백질 접합체의 응집을 유발하는 임의의 물리적 상호작용 또는 화학적 반응을 지칭하는 것으로 의도된다. 응집 (예를 들어, 단백질 응집) 과정은 열, 압력, pH, 교반, 전단력, 동결-해동, 탈수, 중금속, 페놀계 화합물, 실리콘 오일, 변성제 등을 포함한 수많은 물리화학적 스트레스에 의해 유도될 수 있다.

용어 "동결건조", "동결건조된" 및 "동결-건조"는 건조될 물질을 먼저 동결시킨 다음 얼음 또는 동결 용매를 진공 환경에서의 승화에 의해 제거하는 공정을 지칭한다. 저장시 동결건조 생성물의 안정성을 증진시키기 위해 사전-동결건조 제제 내에 부형제가 포함될 수 있다.

본원에 사용된 "동결건조구"는 실질적으로 구형 또는 타원-형상인 치료 활성제를 포함하는 건조 동결된 단일체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 동결건조구 직경은 약 2 내지 약 12 mm, 바람직하게는 2 내지 8 mm, 예컨대 2.5 내지 6 mm 또는 2.5 내지 5 mm이다. 일부 실시양태에서, 동결건조구의 부피는 약 20 내지 550 μL, 바람직하게는 20 내지 100 μL, 예컨대 20 내지 50 μL이다. 동결건조구가 실질적으로 구형이 아닌 실시양태에서, 동결건조구의 크기는 보다 짧은 치수에 대한 보다 긴 치수의 비인 그의 종횡비에 관해 기재될 수 있다. 동결건조구의 종횡비는 0.5 내지 2.5, 바람직하게는 0.75 내지 2, 예컨대 1 내지 1.5일 수 있다. 예를 들어, 액적 형태의 액체의 분취량 (예를 들어, 약 20, 50, 100 또는 250 마이크로리터)을 액적이 무손상 상태로 유지되도록 하는 방식으로 고체 편평 표면 상에 로딩함으로써 동결건조구가 제조될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 표면은 예를 들어 약 -180℃ 내지 약 -196℃ 또는 약 -180℃ 내지 약 -273℃의 온도의 플레이트, 예를 들어 금속 플레이트이다. 예를 들어, 본 발명의 실시양태에서, 액체는 분배 팁에 의해 표면 상에 로딩된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 액체는 약 3 ml/분 내지 약 75 ml/분, 약 5 ml/분 내지 약 75 ml/분; 약 3 ml/분 내지 약 60 ml/분, 약 20 ml/분 내지 약 75 ml/분; 및 약 20 ml/분 내지 약 60 ml/분의 분배 속도로 분배된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 분배되는 분취량은 250 마이크로리터이고, 분배 속도는 약 5 ml/분 내지 약 75 ml/분이거나, 또는 분취량은 100 마이크로리터이고, 분배 속도는 약 3 ml/분 내지 약 60 ml/분이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 분배 팁과 액체가 분배되는 표면 사이의 갭은 약 0.1 cm 이상 (예를 들어, 약 0.5 cm 또는 0.1 cm 내지 1 cm 또는 0.1 cm 내지 0.75 cm)이다. 표면 상에 있으면, 액적은 동결된 다음 건조된다. 동결건조구의 제조 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, US5656597; WO2013066769; WO2014093206; WO2015057540; WO2015057541 또는 WO2015057548을 참조한다.

"재구성된" 제제는 재구성된 제제 중에 백신이 분산되도록 건조된 백신 제제를 희석제 중에 용해시켜 제조된 것이다. 재구성된 제제는 투여 (예를 들어 근육내 투여)에 적합하고, 임의로 피하 투여에 적합할 수 있다.

본원에 정의된 바와 같이, 본 발명의 "계면활성제"는 면역원성 조성물 제제의 표면 장력을 낮추는 임의의 분자 또는 화합물이다. "계면활성제 시스템"은 계면활성제를 포함하지만 계면활성제의 효과를 증가시키는 폴리올과 같은 추가의 부형제를 포함하도록 할 수 있다.

본원에 사용된 "x% (w/v)"는 x g/100 ml와 동등하다 (예를 들어, 0.2% w/v PS20은 2 mg/ml PS20과 동일함).

본원에 사용된 "마이크로웨이브 진공 건조"는 승화를 통해 백신 제제의 건조 백신 생성물 (바람직하게는, < 6% 수분)을 형성하기 위해 마이크로웨이브 방사선 (또한 방사 에너지 또는 비-이온화 방사선으로 공지됨)을 이용하는 건조 방법을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 마이크로웨이브 건조는 US2016/0228532에 기재된 바와 같이 수행된다.

본 발명의 면역원성 조성물은 1종 이상의 담체 단백질에 접합된 1종 이상의 항원을 함유하는 다가 조성물일 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 항원은 피막화된 박테리아로부터의 사카라이드이다. 이러한 백신에서, 사카라이드는 특정 유형의 박테리아의 표면과 유사한 당 분자의 장쇄로 구성된다. 피막화된 박테리아는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 네이세리아 메닌기티데스(Neisseria meningitides) 및 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae) 유형 b를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다른 실시예에서, 폴리사카라이드는 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 살모넬라 파라티피(Salmonella paratyphi) A, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O157, 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae) O1 및 O139로부터의 것이다. 항원은 동일한 유기체로부터의 것일 수 있거나 또는 상이한 유기체로부터의 것일 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 항원은 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 피막 폴리사카라이드이다.

2종의 담체 단백질이 사용되는 실시양태에서, 제1 담체 단백질에 접합되지 않은 각각의 피막 폴리사카라이드는 동일한 제2 담체 단백질에 접합된다 (예를 들어, 각각의 피막 폴리사카라이드 분자는 단일 담체 단백질에 접합된다). 또 다른 실시양태에서, 제1 담체 단백질에 접합되지 않은 피막 폴리사카라이드는 2종 이상의 담체 단백질에 접합된다 (각각의 피막 폴리사카라이드 분자는 단일 담체 단백질에 접합된다). 이러한 실시양태에서, 동일한 혈청형의 각각의 피막 폴리사카라이드는 전형적으로 동일한 담체 단백질에 접합된다.

코리네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diphtheriae)에 의해 분비된 외독소인 디프테리아 독소는 디술피드 가교에 의해 연결되고 3개의 도메인을 갖는 2개의 서브유닛 (단편)으로 구성된 전형적인 A-B 독소이다. 단편 A (DTFA)는 ADP-리보스 촉매 C 도메인을 함유하고, 한편 단편 B (DTFB)는 중심 전위 T 도메인 및 카르복시 말단 수용체-결합 R 도메인을 함유한다. DTFB는 DT의 총 아미노산 서열의 대략 60%를 구성하는 비-독성 모이어티이다. 예를 들어, 문헌 [Gill, D. M. and Dinius, L. L., J. Biol. Chem., 246, 1485-1491 (1971), Gill, D. M. and Pappenheimer, Jr., A. M., J. Biol. Chem., 246, 1492-1495 (1971), Collier, R. J. and Kandel, J., J. Biol. Chem., 246, 1496-1503 (1971); 및 Drazin, R., Kandel, J., and Collier, R. J., J. Biol. Chem., 246, 1504-1510 (1971)]을 참조한다.

디프테리아 독소의 완성된 아미노산 서열이 공개되었다. 문헌 [Greenfield, L., Bjorn, M.J., Horn, G., Fong, D., Buck, G.A., Collier, R.J. and Kaplan, D.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 6853-6857 (1983)]을 참조한다. 구체적으로, DTFB는 DT의 아미노산 잔기 194 내지 535를 포함한다.

CRM₁₉₇ 담체 단백질은 잔기 52에서의 단편 A에서 단일 아미노산 치환에 의해 비독성이 된 DT의 돌연변이체 형태이다. CRM₁₉₇ 및 DT는 단편 B에서 완전한 서열 상동성을 공유한다. 주요 T-세포 에피토프는 DT 아미노산 서열의 B 단편에서 우세하게 발견되었다. 문헌 [Bixler et al., Adv Exp Med Biol. (1989) 251:175-80; Raju et al., Eur. J. Immunol. (1995) 25: 3207-3214; Diethelm-Okita et al., J Infect Dis (2000) 181:1001-9; 및 McCool et al., Infect. and Immun. 67 (Sept. 1999), p. 4862-4869]을 참조한다.

본원에 기재된 바와 같은 DTFB의 사용은 ADP-리보실화 활성 도메인의 디프테리아 독소 결실을 포함한다. DTFB의 사용은 또한 결실, 치환 및 부가를 포함한, 적어도 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 변이체를 포함한다. 변이체의 예는 시스테인 201의 결실 또는 돌연변이이다. DTFB (C8)는 ADP-리보실화 활성화 도메인의 디프테리아 독소가 결실되고, 시스테인 201이 제거되거나 돌연변이된 것을 의미한다. DTFB의 사용은 또한 공개된 T-세포 에피토프를 포함하는 DT의 서열 265-450을 포함하는 단편을 포함한다 (문헌 [Bixler et al., Adv Exp Med Biol. (1989) 251:175-80; Raju et al., Eur. J. Immunol. (1995) 25: 3207-3214] 참조). DTFB는 또한 단량체, 이량체 또는 올리고머의 상태를 포함한다. DTFB의 사용은 또한 임의의 단백질 복합체 (전장 DT 또는 CRM₁₉₇ 제외), 하이브리드 단백질, 또는 DTFB 또는 단편을 함유하는 접합된 단백질을 포함한다. DTFB의 사용은 또한 화학적으로 변형된 DTFB 또는 단편 (즉, PEG화, 비천연 아미노산 변형)을 포함한다.

특정 실시양태에서, DTFB는 천연 DT 또는 돌연변이체 CRM₁₉₇의 효소적 소화 및 환원 후 흡착 크로마토그래피에 의한 정제로부터 생성된다. 따라서, DT C201 잔기에서의 돌연변이를 갖거나 갖지 않는 정제된 DTFB는 전장 천연 또는 C201-돌연변이된 DT 또는 CRM₁₉₇, 또는 A-단편이 말단절단된 그의 변이체로부터 유사하게 제조될 수 있는 것으로 생각된다. 캅토(Capto)™어드히어 및 캅토™MMC로 판매되는 다중모드 수지 및 크로마토그래피 주기 동안 50 mM 초과의 트리스 농도는 절단된 천연 DTFB를 정제하는 예외적인 모드를 제공하는 것으로 구체적으로 공지되어 있다.

특정 실시양태에서, DTFB의 제제는 최대 10 mM DTT를 포함한다. DTT는 잔기 위치 201에서의 유리 시스테인으로 인한 DTFB 단량체들 사이의 디술피드 결합 형성에 의해 야기되는 이량체화를 방지한다. 이러한 경우에, 니켈은 접합 반응 혼합물에 첨가되지 않는다. 그러나, 접합 반응은 그 외에는 동일한 방법에 의해 진행된다. DTT가 사용되지 않는 경우에, 이량체화된 DTFB가 Ps 및 니켈에 접합될 수 있고, 바람직한 실시양태에서 잔류 억제성 시아나이드를 격리시키기 위해 첨가되어 접합의 정도를 개선시킬 것이다.

DTFB에서의 유리 시스테인의 제거 (DT C201의 돌연변이)는 다중모드 수지에서 유사한 거동을 제공할 것으로 예상된다. 유리 시스테인의 제거는 DTT에 대한 필요성을 제거할 것으로 예상되며, 이는 유리 시스테인 사이의 디술피드 결합 형성에 의한 이량체화가 실행가능하지 않을 것이기 때문이다. 트리스 완충제 농도 및 염화나트륨 용리 완충제 농도를 증가시키는 것은 캅토 MMC 크로마토그래피 수지로부터 DTFB 단백질의 회수를 개선시키는 것으로 입증되었다. DTFB 정제는 다른 다중모드 수지를 사용하여 달성될 수 있는 것으로 예상된다.

특정 실시양태에서, DTFB는 DT C201 잔기의 돌연변이와 함께 또는 그 없이 재조합적으로 발현되고, 후속적으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 기술에 의해 정제된다.

본 발명의 특정한 실시양태에서, CRM₁₉₇이 담체 단백질로서 사용된다. CRM₁₉₇은 디프테리아 독소의 비-독성 변이체 (즉, 톡소이드)이다. 한 실시양태에서, 이는 카사미노산 및 효모 추출물-기재 배지에서 성장한 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria) 균주 C7 (β197)의 배양물로부터 단리된다. 또 다른 실시양태에서, CRM₁₉₇은 미국 특허 번호 5,614,382에 기재된 방법에 따라 재조합적으로 제조된다. 전형적으로, CRM₁₉₇은 한외여과, 황산암모늄 침전 및 이온-교환 크로마토그래피의 조합을 통해 정제된다. 일부 실시양태에서, CRM₁₉₇은 페넥스 발현 기술(Pfenex Expression Technology)™ (페넥스 인크.(Pfenex Inc.), 캘리포니아주 샌디에고)을 사용하여 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)에서 제조된다.

DTFB 및 그의 변이체는 단백질 (펩티드) 및 사카라이드를 포함한 항원에 대한 담체 단백질로서 사용될 수 있다. 다른 적합한 담체 단백질은 추가의 불활성화된 박테리아 독소, 예컨대 DT (디프테리아 톡소이드), TT (파상풍 톡소이드) 또는 TT의 단편 C, 백일해 톡소이드, 콜레라 톡소이드 (예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2004/083251에 기재된 바와 같음), 이. 콜라이 LT, 이. 콜이라 ST, 및 슈도모나스 아에루기노사로부터의 외독소 A를 포함한다. 박테리아 외막 단백질, 예컨대 외막 복합체 c (OMPC), 포린, 트랜스페린 결합 단백질, 폐렴구균 표면 단백질 A (PspA; 국제 특허 출원 공개 번호 WO 02/091998 참조), 폐렴구균 어드헤신 단백질 (PsaA), A군 또는 B군 스트렙토코쿠스로부터의 C5a 펩티다제, 또는 헤모필루스 인플루엔자에 단백질 D, 폐렴구균 뉴모리신 (Kuo et al., 1995, Infect Immun 63; 2706-13), 예를 들어 일부 방식으로 해독된 ply, 예를 들어 dPLY-GMBS (국제 특허 출원 공개 번호 WO 04/081515 참조) 또는 dPLY-포르몰, PhtX, 예를 들어 PhtA, PhtB, PhtD, PhtE 및 Pht 단백질의 융합체, 예를 들어 PhtDE 융합체, PhtBE 융합체 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 01/98334 및 WO 03/54007 참조)가 또한 사용될 수 있다. 다른 단백질, 예컨대 오브알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 투베르쿨린 (PPD)의 정제된 단백질 유도체, PorB (엔. 메닌기티디스로부터의 것), PD (헤모필루스 인플루엔자에 단백질 D; 예를 들어, 유럽 특허 번호 EP 0 594 610 B 참조), 또는 그의 면역학상 기능적 등가물, 합성 펩티드 (유럽 특허 번호 EP0378881 및 EP0427347 참조), 열 쇼크 단백질 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 93/17712 및 WO 94/03208 참조), 백일해 단백질 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 98/58668 및 유럽 특허 번호 EP0471177 참조), 시토카인, 림포카인, 성장 인자 또는 호르몬 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 91/01146 참조), 다양한 병원체 유래 항원으로부터의 다중 인간 CD4+ T 세포 에피토프를 포함하는 인공 단백질 (문헌 [Falugi et al., 2001, Eur J Immunol 31:3816-3824] 참조), 예컨대 N19 단백질 (문헌 [Baraldoi et al., 2004, Infect Immun 72:4884-7] 참조), 철 흡수 단백질 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 01/72337 참조), 씨. 디피실레(C. difficile)의 독소 A 또는 B (국제 특허 공개 번호 WO 00/61761 참조), 및 플라젤린 (문헌 [Ben-Yedidia et al., 1998, Immunol Lett 64:9] 참조)이 또한 담체 단백질로서 사용될 수 있다.

제2 담체 단백질로서 다른 DT 돌연변이체, 예컨대 CRM₁₇₆, CRM₂₂₈, CRM₄₅ (Uchida et al., 1973, J Biol Chem 218:3838-3844); CRM₉, CRM₄₅, CRM₁₀₂, CRM₁₀₃ 및 CRM₁₀₇ 및 문헌 [Nicholls and Youle in Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992]에 기재된 다른 돌연변이; 결실 또는 Glu-148에서 Asp, Gln 또는 Ser로의 돌연변이 및/또는 Ala 158에서 Gly로의 돌연변이 및 미국 특허 번호 4,709,017 또는 미국 특허 번호 4,950,740에 개시된 다른 돌연변이; 적어도 1개 이상의 잔기 Lys 516, Lys 526, Phe 530 및/또는 Lys 534의 돌연변이 및 미국 특허 번호 5,917,017 또는 미국 특허 번호 6,455,673에 개시된 돌연변이; 또는 미국 특허 번호 5,843,711에 개시된 단편이 사용될 수 있다. 이러한 DT 돌연변이체는 또한 DTFB 변이체를 제조하는데 사용될 수 있으며, 여기서 변이체는 에피티프 영역을 함유하는 B 단편을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에의 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 6E, 6G, 6H, 7F, 7A, 7B, 7C, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10F, 10A, 10B, 10C, 11F, 11A, 11B, 11C, 11D, 11E, 12F, 12A, 12B, 13, 14, 15F, 15A, 15B, 15C, 16F, 16A, 17F, 17A, 18F, 18A, 18B, 18C, 19F, 19A, 19B, 19C, 20A, 20B, 21, 22F, 22A, 23F, 23A, 23B, 24F, 24A, 24B, 25F, 25A, 27, 28F, 28A, 29, 31, 32F, 32A, 33F, 33A, 33B, 33C, 33D, 33E, 34, 35F, 35A, 35B, 35C, 36, 37, 38, 39, 40, 41F, 41A, 42, 43, 44, 45, 46, 47F, 47A, 48, CWPS1, CWPS2, CWPS3 중 적어도 1종으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 폴리사카라이드-단백질 접합체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에의 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F 및 38 중 적어도 1종으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 폴리사카라이드-단백질 접합체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물은 CRM₁₉₇에 개별적으로 접합된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 또는 44 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어진다. 본 발명의 특정 측면에서, CRM₁₉₇은 사용된 유일한 담체 단백질이다. 다른 실시양태에서, 폴리사카라이드-단백질 접합체 제제는 CRM₁₉₇에 접합된 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F로부터의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드로 본질적으로 이루어진 13가 폐렴구균 접합체 (13vPnC) 제제이다. 추가 실시양태에서, 폴리사카라이드-단백질 접합체 제제는 비피막형 헤모필루스 인플루엔자에로부터의 단백질 D에 접합된 혈청형 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F로부터의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드로 본질적으로 이루어진 10가 폐렴구균 접합체 (10vPnC) 제제이다.

특정 실시양태에서, 상기 기재된 면역원성 조성물은 임의로, 제2 담체 단백질 (이는 제1 담체 단백질과 적어도 1개의 아미노산에서 상이함)에 접합된 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F 및 38 중 적어도 1종으로부터 선택된 1종의 추가의 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 특정한 혈청형으로부터의 사카라이드는 1종 초과의 담체 단백질에 접합되지 않는다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 제2 담체 단백질에 접합된 적어도 1종의 추가의 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 추가로 포함한다. 이들 실시양태에서, 면역원성 조성물은 CRM₁₉₇이 아닌 제2 담체 단백질에 개별적으로 접합된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 또는 44 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어진다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물은 N이 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 또는 44인 N 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어지고; 각각의 N 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드는 CRM₁₉₇인 제1 단백질 담체에 접합된다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 1, 2, 3 ... 또는 N-1 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드는 제1 단백질 담체에 접합되고, N-1, N-2, N-3 ... 1 혈청형으로부터의 폴리사카라이드는 CRM₁₉₇과 상이한 제2 단백질 담체에 접합된다.

본 발명의 하나의 구체적 실시양태에서, 본 발명은 CRM₁₉₇에 접합된 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어진 15가 면역원성 조성물을 제공한다.

스트렙토코쿠스 뉴모니아에로부터의 피막 폴리사카라이드는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 표준 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 폴리사카라이드는 박테리아로부터 단리될 수 있고, 공지된 방법 (예를 들어, 유럽 특허 번호 EP497524 및 EP497525 참조); 및 바람직하게는 균질화기를 사용하여 수행되는 미세유동화에 의해 또는 화학적 가수분해에 의해 어느 정도 크기조정될 수 있다. 한 실시양태에서, 각각의 폴리사카라이드 혈청형에 상응하는 에스. 뉴모니아에 균주는 대두-기재 배지에서 성장된다. 이어서, 개별 폴리사카라이드가 원심분리, 침전 및 한외-여과를 포함한 표준 단계를 통해 정제된다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0286838 및 미국 특허 번호 5,847,112를 참조한다. 폴리사카라이드는 점도를 감소시키고/거나 후속 접합된 생성물의 여과성을 개선시키기 위해 크기조정될 수 있다. 본 발명에서, 피막 폴리사카라이드는 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F 및 38 중 1종 이상으로부터 제조된다.

정제된 폴리사카라이드는 담체 단백질과 반응할 수 있는 관능기를 도입하기 위해 화학적으로 활성화된다. 활성화되면, 각각의 피막 폴리사카라이드는 담체 단백질에 개별적으로 접합되어 당접합체를 형성한다. 폴리사카라이드 접합체는 공지된 커플링 기술에 의해 제조될 수 있다.

한 실시양태에서, 폴리사카라이드의 화학적 활성화 및 이후 담체 단백질에의 접합은 미국 특허 번호 4,365,170, 4,673,574 및 4,902,506에 기재된 수단에 의해 달성된다. 간략하게, 폐렴구균 폴리사카라이드는 퍼아이오데이트-기재 산화제, 예컨대 과아이오딘산나트륨, 과아이오딘산칼륨 또는 과아이오딘산과 반응하여 이웃자리 히드록실 기의 무작위 산화적 절단을 유발함으로써 반응성 알데히드 기를 생성한다.

산화된 폴리사카라이드를 단백질 담체 상의 1급 아민 기 (주로 리신 잔기)에 직접적으로 아미노화 커플링시키는 것은 환원성 아미노화에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 활성화된 폴리사카라이드 및 담체 단백질의 혼합물을 니켈의 존재 하에 환원제, 예컨대 소듐 시아노보로히드라이드와 반응시킴으로써 접합이 수행된다. 접합 반응은 수용액 또는 유기 용매, 예컨대 디메틸술폭시드 (DMSO)에서 수행될 수 있다. 예를 들어, US2015/0231270 A1, EP 0471 177 B1, US2011/0195086 A1을 참조한다. 접합 반응의 종결 시에, 미반응 알데히드는 강한 환원제, 예컨대 수소화붕소나트륨의 첨가에 의해 캡핑된다.

한 실시양태에서, 제제화 전에, 각각의 폐렴구균 피막 폴리사카라이드 항원은 에스. 뉴모니아에로부터 개별적으로 정제되고, 활성화되어 반응성 알데히드를 형성하고, 이어서 니켈의 존재 하에 소듐 시아노보로히드라이드에 의한 환원성 아미노화를 사용하여 제1 또는 제2 담체 단백질에 공유 접합된다. 니켈은 환원성 아미노화에 사용되는 소듐 시아노보로히드라이드 환원제로부터의 잔류 억제성 시아나이드와 착물을 형성한다.

특정 실시양태에서, 접합 반응은 보다 큰 접합 반응 효율을 위해 및 유리 시아나이드 제거 보조를 위해 니켈이 사용되는 환원성 아미노화에 의해 수행된다. 전이 금속은 시아나이드와 안정한 착물을 형성하는 것으로 공지되어 있고, 소듐 시아노보로히드라이드에 의한 단백질 아미노 기 및 포름알데히드의 환원성 메틸화를 개선시키는 것으로 공지되어 있다 (Gidley et al., 1982, Biochem J. 203: 331-334; Jentoft et al., 1980, Anal Biochem. 106: 186-190). 니켈의 첨가는, 잔류 억제성 시아나이드와 착물을 형성함으로써, 접합 동안 단백질의 소비를 증가시키고 보다 큰, 잠재적으로 보다 면역원성인 접합체의 형성을 유도한다.

상업적 소듐 시아노보로히드라이드 시약 로트에서 유리 시아나이드 수준의 가변성은 일관되지 않은 접합 성능을 유도하여, 가변적인 접합체 속성, 예컨대 분자 질량 및 폴리사카라이드-대-단백질 비를 생성한다. 접합 반응에 니켈을 첨가하는 것은 유리 시아나이드의 수준을 감소시키고, 따라서 로트-대-로트 접합체 일관성의 정도를 개선시킨다.

또 다른 실시양태에서, 접합 방법은 1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트 (CDAP)에 의한 폴리사카라이드의 활성화를 사용하여 시아네이트 에스테르를 형성할 수 있다. 활성화된 사카라이드는 담체 단백질 상의 아미노 기에 직접 커플링될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 반응성 동종이관능성 또는 이종이관능성 기는 시아네이트 에스테르를 여러 이용가능한 양식 중 임의의 것과 반응시킴으로써 활성화된 폴리사카라이드 상에 도입될 수 있다. 예를 들어, 시스타민 또는 시스테아민이 사용되어 티올화된 폴리사카라이드를 제조할 수 있으며, 이는 말레이미드-활성화된 담체 단백질 (예를 들어 GMBS를 사용함) 또는 할로아세틸화된 담체 단백질 (예를 들어 아이오도아세트이미드 [예를 들어, 에틸 아이오도아세트이미드 HCl] 또는 N-숙신이미딜 브로모아세테이트 또는 SIAB, 또는 SIA, 또는 SBAP를 사용함)과의 반응 후에 수득된 티오에테르 연결을 통해 담체에 커플링될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 시아네이트 에스테르는 헥산 디아민 또는 아디프산 디히드라지드 (ADH)와 반응하고, 생성된 아미노-유도체화된 사카라이드는 카르보디이미드 (예를 들어 EDAC 또는 EDC) 화학을 사용하여 담체 단백질 상의 유리 카르복시기에 접합된다. 이러한 접합체는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 93/15760, WO 95/08348 및 WO 96/29094; 및 문헌 [Chu et al., 1983, Infect. Immunity 40:245-256]에 기재되어 있다.

다른 적합한 접합 방법은 카르보디이미드, 히드라지드, 활성 에스테르, 노르보란, p-니트로벤조산, N-히드록시숙신이미드, S--NHS, EDC, TSTU를 사용한다. 다수가 국제 특허 출원 공개 번호 WO 98/42721에 기재되어 있다. 접합은 사카라이드의 유리 히드록실 기와 CDI의 반응에 의해 형성될 수 있는 카르보닐 링커를 포함할 수 있고 (문헌 [Bethell et al., 1979, J. Biol. Chem. 254:2572-4; Hearn et al., 1981, J. Chromatogr. 218:509-18] 참조), 이는 이어서 담체 단백질과 반응하여 카르바메이트 연결을 형성할 수 있다. 이러한 화학은 탄수화물의 아노머 말단의 환원으로 1급 히드록실 기를 형성하고, 이어서 1급 히드록실과 CDI의 반응으로 카르바메이트 중간체를 형성하고, 이후 단백질 담체 아미노 기에 커플링하는 것으로 이루어진다. 반응은 사카라이드 상의 다른 1급 히드록실 기의 임의적인 보호/탈보호를 필요로 할 수 있다.

접합 후에, 폴리사카라이드-단백질 접합체는 농축/투석여과 작업, 한외여과, 침전/용리, 칼럼 크로마토그래피 및 심층 여과를 포함한, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 임의의 기술 중 1종 이상에 의해 정제되어 과량의 접합 시약 뿐만 아니라 잔류 유리 단백질 및 유리 폴리사카라이드를 제거한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,146,902를 참조한다.

개별 당접합체가 정제된 후에, 이들은 배합되어 본 발명의 면역원성 조성물로 제제화된다. 이들 폐렴구균 접합체는 개별 공정에 의해 제조되고, 단일 투여 제제로 벌크 제제화된다.

제약/백신 조성물

본 발명은 제약상 허용되는 담체 및 아주반트와 함께 상기 기재된 임의의 폴리사카라이드 혈청형 조합물을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 대안적으로 그로 이루어진 제약, 면역원성 및 백신 조성물을 포함한 조성물을 추가로 제공한다. 한 실시양태에서, 조성물은 제약상 허용되는 담체 및 아주반트와 함께, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 6E, 6G, 6H, 7F, 7A, 7B, 7C, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10F, 10A, 10B, 10C, 11F, 11A, 11B, 11C, 11D, 11E, 12F, 12A, 12B, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 또는 44종의 별개의 폴리사카라이드-단백질 접합체를 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 이루어지며, 여기서 각각의 접합체는 제1 담체 단백질 또는 제2 담체 단백질에 접합된 상이한 피막 폴리사카라이드를 함유하고, 여기서 스트렙토코쿠스 뉴모니아에의 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F 및 38 중 적어도 1종으로부터의 피막 폴리사카라이드는 CRM₁₉₇로부터 선택된 제1 담체 단백질에 접합되고, 임의로 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 7B, 7C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 21, 22A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 27, 28A, 31, 33F, 34, 35A, 35B, 35F 및 38로부터 선택된 추가의 에스. 뉴모니아에 혈청형을 갖는 피막 폴리사카라이드는 제2 담체 단백질 (이는 제1 담체 단백질과 적어도 1개의 아미노산에서 상이함)에 접합된다.

본 발명의 폴리사카라이드-단백질 접합체의 제제화는 관련 기술분야에 인식된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 15종의 개별 폐렴구균 접합체를 생리학상 허용되는 비히클과 함께 제제화하여 조성물을 제조할 수 있다. 이러한 비히클의 예는 물, 완충 염수, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 덱스트로스 용액을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

바람직한 실시양태에서, 백신 조성물은 염화나트륨을 갖는 L-히스티딘 완충제에서 제제화된다.

본원에 정의된 바와 같이, "아주반트"는 본 발명의 면역원성 조성물의 면역원성을 증진시키는 역할을 하는 물질이다. 면역 아주반트는 단독으로 투여시 약하게 면역원성인 항원에 대한 면역 반응을 증진시킬 수 있고/거나, 예를 들어 항체 역가 또는 세포-매개 면역 반응을 유도하지 않거나 약하게 유도할 수 있고/거나, 항원에 대한 항체 역가를 증가시킬 수 있고/거나, 개체에서 면역 반응을 달성하는데 효과적인 항원의 용량을 낮출 수 있다. 따라서, 아주반트는 종종 면역 반응을 부스팅하기 위해 제공되고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 조성물의 유효성을 증진시키기 위한 적합한 아주반트는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다:

(1) 알루미늄 염 (명반), 예컨대 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산알루미늄 등;

(2) 수중유 에멀젼 제제 (다른 특정 면역자극제, 예컨대 무라밀 펩티드 (하기 정의됨) 또는 박테리아 세포벽 성분이 있거나 없음), 예컨대, 예를 들어, (a) 미세유동화기, 예컨대 모델 110Y 미세유동화기 (마이크로플루이딕스(Microfluidics), 매사추세츠주 뉴턴)를 사용하여 서브마이크로미터 입자로 제제화된, 5% 스쿠알렌, 0.5% 트윈 80 및 0.5% 스팬 85를 함유 (임의로 다양한 양의 MTP-PE 함유)하는 MF59 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 90/14837), (b) 서브마이크로미터 에멀젼으로 미세유동화되거나 보다 큰 입자 크기 에멀젼을 생성하기 위해 볼텍싱된, 10% 스쿠알렌, 0.4% 트윈 80, 5% 플루로닉-차단된 중합체 L121 및 thr-MDP를 함유하는 SAF, (c) 2% 스쿠알렌, 0.2% 트윈 80, 및 미국 특허 번호 4,912,094에 기재된 3-O-데아실화 모노포스포리피드 A (MPL™), 트레할로스 디미콜레이트 (TDM) 및 세포벽 골격 (CWS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 박테리아 세포벽 성분, 바람직하게는 MPL+CWS (디톡스(Detox)™)를 함유하는 리비(Ribi)™ 아주반트 시스템 (RAS) (코릭사(Corixa), 몬타나주 해밀턴); 및 (d) 몬타니드 ISA;

(3) 사포닌 아주반트, 예컨대 퀼(Quil) A 또는 스티물론(STIMULON)™ QS-21 (안티제닉스(Antigenics), 매사추세츠주 프레이밍햄) (예를 들어, 미국 특허 번호 5,057,540 참조), 또는 그로부터 생성된 입자, 예컨대 ISCOM (콜레스테롤, 사포닌, 인지질 및 양친매성 단백질의 조합에 의해 형성된 면역자극 복합체) 및 이스코매트릭스(Iscomatrix)® (ISCOM과 본질적으로 동일한 구조를 갖지만 단백질이 없는 것)가 사용될 수 있음;

(4) 박테리아 리포폴리사카라이드, 합성 지질 A 유사체, 예컨대 아미노알킬 글루코사민 포스페이트 화합물 (AGP), 또는 그의 유도체 또는 유사체, 이는 코릭사로부터 입수가능하고 미국 특허 번호 6,113,918에 기재됨; 하나의 이러한 AGP는 2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일아미노]에틸 2-데옥시-4-O-포스포노-3-O-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일]-2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일아미노]-b-D-글루코피라노시드이며, 이는 또한 529로 공지되어 있고 (이전에 RC529로서 공지됨), 수성 형태 또는 안정한 에멀젼으로서 제제화됨;

(5) 합성 폴리뉴클레오티드, 예컨대 CpG 모티프(들)를 함유하는 올리고뉴클레오티드 (미국 특허 번호 6,207,646); 및

(6) 시토카인, 예컨대 인터류킨 (예를 들어, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 등), 인터페론 (예를 들어, 감마 인터페론), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 종양 괴사 인자 (TNF), 공동자극 분자 B7-1 및 B7-2 등; 및

(7) 보체, 예컨대 보체 성분의 삼량체 C3d.

또 다른 실시양태에서, 아주반트는 상기 아주반트 중 2, 3종 또는 그 초과의 혼합물, 예를 들어 SBAS2 (3-탈아실화 모노포스포릴 지질 A 및 QS21을 또한 함유하는 수중유 에멀젼)이다.

무라밀 펩티드는 N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP), N-아세틸-노르무라밀-L-알라닌-2-(1'-2' 디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민 (MTP-PE) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

특정 실시양태에서, 아주반트는 알루미늄 염이다. 알루미늄 염 아주반트는 명반-침전된 백신 또는 명반-흡착된 백신일 수 있다. 한 실시양태에서, 백신은 알루미늄 아주반트 상에 사전-흡수된다. 알루미늄-염 아주반트는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Harlow, E. and D. Lane (1988; Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory) and Nicklas, W. (1992; Aluminum salts. Research in Immunology 143:489-493)]에 기재되어 있다. 알루미늄 염은 수화 알루미나, 알루미나 수화물, 알루미나 3수화물 (ATH), 알루미늄 수화물, 알루미늄 3수화물, 알히드로겔(Alhydrogel)®, 슈퍼포스, 암포겔(Amphogel)®, 알루미늄 (III) 히드록시드, 알루미늄 히드록시포스페이트 술페이트 (알루미늄 포스페이트 아주반트 (APA)), 무정형 알루미나, 3수화 알루미나 또는 트리히드록시알루미늄을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

APA는 알루미늄 히드록시포스페이트의 수성 현탁액이다. APA는 인산알루미늄 및 인산나트륨을 1:1 부피비로 블렌딩하여 알루미늄 히드록시포스페이트를 침전시킴으로써 제조된다. 블렌딩 공정 후에, 물질은 고-전단 혼합기로 크기-감소되어 단분산 입자 크기 분포를 달성한다. 이어서, 생성물은 생리 염수에 대해 투석여과되고, 증기 멸균된다.

특정 실시양태에서, 상업적으로 입수가능한 Al(OH)₃ (예를 들어, 뉴욕주 웨스트베리 소재 덴마크/아큐레이트 케미칼 앤 사이언티픽 캄파니(Denmark/Accurate Chemical and Scientific Co.)의 알히드로겔® 또는 슈퍼포스)이 단백질을 50 - 1000 ug 단백질/mg 수산화알루미늄의 비로 흡착시키는데 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 단백질의 흡착은 단백질의 pI (등전 pH) 및 배지의 pH에 좌우된다. 보다 낮은 pI를 갖는 단백질은 보다 높은 pI를 갖는 단백질보다 양으로 하전된 알루미늄 이온에 더 강하게 흡착한다. 알루미늄 염은 2-3주의 기간에 걸쳐 서서히 방출되는 Ag의 데포를 확립할 수 있고/거나, 대식세포 및 보체 활성화의 비특이적 활성화에 관여할 수 있고/거나, 선천성 면역 메카니즘을 자극할 수 있다 (가능하게는 요산의 자극을 통해). 예를 들어, 문헌 [Lambrecht et al., 2009, Curr Opin Immunol 21:23]을 참조한다.

1가 벌크 수성 접합체는 전형적으로 함께 블렌딩되고 희석된다. 희석되면, 배치가 멸균 여과된다. 8 μg/mL를 표적으로 희석되는 6B를 제외한 모든 혈청형에 대해 4 μg/mL의 최종 농도 및 250 μg/mL의 최종 알루미늄 농도를 표적으로 알루미늄 포스페이트 아주반트가 무균으로 첨가된다. 아주반트첨가된 제제화된 배치는 바이알 또는 시린지 내에 충전될 것이다.

특정 실시양태에서, 아주반트는 CpG-함유 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 CpG-함유 올리고뉴클레오티드, 특히 CpG-함유 올리고데옥시뉴클레오티드 (CpG ODN)이다. 또 다른 실시양태에서, 아주반트는 ODN 1826이며, 이는 콜리 파마슈티칼 그룹(Coley Pharmaceutical Group)으로부터 획득될 수 있다.

"CpG-함유 뉴클레오티드", " CpG-함유 올리고뉴클레오티드", " CpG 올리고뉴클레오티드" 및 유사 용어는 비메틸화 CpG 모이어티를 함유하는 6-50개 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 분자를 지칭한다. 예를 들어, 문헌 [Wang et al., 2003, Vaccine 21:4297]을 참조한다. 또 다른 실시양태에서, 용어의 임의의 다른 관련 기술분야에서 허용되는 정의가 의도된다. CpG-함유 올리고뉴클레오티드는 임의의 합성 뉴클레오시드간 연결, 변형된 염기 및/또는 변형된 당을 사용하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

CpG 올리고뉴클레오티드의 사용 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Sur et al., 1999, J Immunol. 162:6284-93; Verthelyi, 2006, Methods Mol Med. 127:139-58; 및 Yasuda et al., 2006, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 23:89-110]에 기재되어 있다.

투여/투여량

본 발명의 조성물 및 제제는 전신 또는 점막 경로를 통해 백신을 투여함으로써 감염, 예를 들어 폐렴구균 감염에 걸리기 쉬운 인간을 보호하거나 치료하기 위해 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 면역학적 유효량의 본 발명의 면역원성 조성물을 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 에스. 뉴모니아에 피막 폴리사카라이드 접합체에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 면역학적 유효량의 본 발명 면역원성 조성물을 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 폐렴구균 감염에 대해 인간을 백신접종하는 방법을 제공한다.

특정한 백신에 대한 성분의 최적량은 대상체에서의 적절한 면역 반응의 관찰을 수반하는 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 또 다른 실시양태에서, 인간 백신접종을 위한 투여량은 동물 연구로부터 인간 데이터로의 외삽에 의해 결정된다. 또 다른 실시양태에서, 투여량은 경험적으로 결정된다. 실시예에 제공된 새끼 레서스 원숭이 동물 데이터는 백신이 면역원성이라는 것을 입증한다.

본 발명의 조성물의 "유효량"은 후속 챌린지 동안 미생물, 예를 들어 에스. 뉴모니아에의 감염성의 가능성 또는 중증도를 유의하게 감소시키는 항체를 도출하는데 요구되는 용량을 지칭한다.

본 발명의 방법은 침습성 감염 (수막염, 폐렴 및 박테리아혈증) 및 비침습성 감염 (급성 중이염 및 부비동염)을 둘 다 포함한, 미생물, 예를 들어 에스. 뉴모니아에 의해 야기되는 1차 임상 증후군의 예방 및/또는 감소를 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여는 근육내, 복강내, 피내 또는 피하 경로를 통한 주사; 또는 구강/소화기, 호흡기도 또는 비뇨생식관에 대한 점막 투여를 통한 것 중 1종 이상을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 비강내 투여는 폐렴 또는 중이염의 치료를 위해 사용된다 (폐렴구균의 비인두 담지가 보다 효과적으로 예방될 수 있어, 그의 가장 초기 단계에서 감염을 약화시킬 수 있으므로).

각각의 백신 용량 내 접합체의 양은 유의한 유해 효과 없이 면역보호 반응을 유도하는 양으로서 선택된다. 이러한 양은 폐렴구균 혈청형에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 폴리사카라이드-기재의 접합체의 경우, 각각의 용량은 각각의 폴리사카라이드 0.1 내지 100 μg, 특히 0.1 내지 10 μg, 보다 특히 1 내지 5 μg을 포함할 것이다. 예를 들어, 각각의 용량은 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 또는 750 ng, 또는 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7.5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 μg을 포함할 수 있다.

특정한 백신에 대한 성분의 최적량은 대상체에서의 적절한 면역 반응의 관찰을 수반하는 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 또 다른 실시양태에서, 인간 백신접종을 위한 투여량은 동물 연구로부터 인간 데이터로의 외삽에 의해 결정된다. 또 다른 실시양태에서, 투여량은 경험적으로 결정된다.

한 실시양태에서, 알루미늄 염의 용량은 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70, 100, 125, 150, 200, 300, 500 또는 700 μg, 또는 1, 1.2, 1.5, 2, 3, 5 mg 또는 그 초과이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 알루미늄 염의 용량은 재조합 단백질 μg당이다.

본 발명의 특정한 실시양태에서, PCV15 백신은 CRM₁₉₇에 개별적으로 접합된 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F의 폐렴구균 피막 폴리사카라이드의 멸균 제제이다. 한 측면에서, 각각의 용량은 4 μg/mL 또는 8 μg/mL의 각각의 사카라이드, 예외로 8 μg/mL 또는 16 μg/mL의 6B; 및 약 64 μg/mL 또는 128 μg/mL CRM₁₉₇ 담체 단백질을 함유하도록 제제화된다. 한 측면에서, 각각의 0.5 mL 용량은 2 μg의 각각의 사카라이드, 예외로 4 μg의 6B; 약 32 μg CRM₁₉₇ 담체 단백질 (예를 들어, 32 μg ± 5 μg, ± 3 μg, ± 2 μg, 또는 ± 1 μg), 0.125 mg의 원소 알루미늄 (0.5 mg 알루미늄 포스페이트) 아주반트; 및 염화나트륨 및 L-히스티딘 완충제를 함유하도록 제제화된다. 염화나트륨 농도는 약 150 mM (예를 들어, 150 mM ± 25 mM, ± 20 mM, ± 15 mM, ± 10 mM, 또는 ± 5 mM)이고, L-히스티딘 완충제는 약 20 mM (예를 들어, 20 mM ± 5 mM, ± 2.5 mM, ± 2 mM, ± 1 mM, 또는 ± 0.5 mM)이다.

본 발명의 임의의 방법에 따르면, 한 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 인간 대상체는 영아 (1세 미만), 유아 (대략 12 내지 24개월), 또는 소아 (대략 2 내지 5세)이다. 다른 실시양태에서, 인간 대상체는 고령 환자 (> 65세)이다. 본 발명의 조성물은 또한 아동, 청소년 및 성인 (예를 들어, 18 내지 45세 또는 18 내지 65세)에서 사용하기에 적합하다.

본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 단일 접종으로서 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 백신은 적절하게 간격을 두어 2회, 3회 또는 4회 또는 그 초과로 투여된다. 예를 들어, 조성물은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개월 간격으로 또는 그의 임의의 조합으로 투여될 수 있다. 면역화 스케줄은 폐렴구균 백신에 대해 지정된 것을 따를 수 있다. 예를 들어, 에스. 뉴모니아에에 의해 야기된 침습성 질환에 대한 영아 및 유아의 통상적 스케줄은 2, 4, 6 및 12-15개월의 연령이다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 조성물은 2, 4, 6 및 12-15개월의 연령에서 4-용량 시리즈로서 투여된다.

본 발명의 조성물은 또한 에스. 뉴모니아에로부터의 1종 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 포함시키기에 적합한 에스. 뉴모니아에 단백질의 예는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 02/083855 및 WO 02/053761에서 확인된 것들을 포함한다.

제제

본 발명의 조성물은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 1종 이상의 방법에 의해, 예컨대 비경구로, 경점막으로, 경피로, 근육내로, 정맥내로, 피부내로, 비강내로, 피하로, 복강내로 대상체에게 투여될 수 있고, 그에 따라 제제화될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 액체 제제의 표피 주사, 근육내 주사, 정맥내, 동맥내, 피하 주사, 또는 호흡기내 점막 주사를 통해 투여된다. 주사용 액체 제제는 용액 등을 포함한다. 본 발명의 조성물은 단일 용량 바이알, 다중-용량 바이알 또는 사전-충전된 시린지로서 제제화될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 경구로 투여되고, 따라서 경구 투여에 적합한 형태로, 즉, 고체 또는 액체 제제로서 제제화된다. 고체 경구 제제는 정제, 캡슐, 환제, 과립, 펠릿 등을 포함한다. 액체 경구 제제는 용액, 현탁액, 분산액, 에멀젼, 오일 등을 포함한다.

본 발명의 한 측면에서, 제제는 동결건조, 동결, 마이크로웨이브 건조로부터 또는 동결건조구의 생성을 통해 제조된 고체 건조 제제이다. 제제는 -70℃, -20℃, 2-8℃ 또는 실온에서 저장될 수 있다. 건조 제제는 단위 용량 바이알 내의 성분의 중량 면에서 표현될 수 있지만, 이는 상이한 용량 또는 바이알 크기에 따라 달라진다. 대안적으로, 본 발명의 건조 제제는 동일한 샘플 (예를 들어 바이알) 내의 약물 물질 (DS)의 중량과 비교한 성분의 중량 비로서의 성분의 양으로 표현될 수 있다. 이러한 비는 백분율로서 표현될 수 있다. 이러한 비는 바이알 크기, 투여 및 재구성 프로토콜과 관계없이 본 발명의 건조 제제의 고유의 특성을 반영한다. 한 실시양태에서, 제제는 20, 15, 10 또는 5 μm 미만의 d(0.5) μm를 갖는다. 다른 실시양태에서, 제제는 동결건조구이다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 제제는 재구성된 용액이다. 건조 고체 제제는 임상 인자, 예컨대 투여 또는 투약 경로에 따라 상이한 농도로 재구성될 수 있다. 예를 들어, 건조 제제는 피하 투여를 위해 필요한 경우 고농도 (즉 적은 부피)로 재구성될 수 있다. 또한, 특정한 대상체에 대해 높은 투여가 요구되는 경우, 특히 주사 부피가 최소화되어야 하는 피하로 투여되는 경우, 고농도가 또한 필요할 수 있다. 이어서, 물 또는 등장성 완충제에 의한 후속 희석을 용이하게 사용하여 약물 제품을 더 낮은 농도로 희석할 수 있다. 더 낮은 농도의 약물 제품에서 등장성이 요망되는 경우, 건조 분말을 표준 저부피 물 중에 재구성시킨 다음, 등장성 희석제, 예컨대 0.9% 염화나트륨으로 추가로 희석할 수 있다.

재구성은 완전한 수화를 보장하도록 일반적으로 약 25℃의 온도에서 수행되지만, 원한다면 다른 온도가 사용될 수 있다. 재구성에 요구되는 시간은, 예를 들어 희석제의 유형, 부형제(들) 및 단백질의 양에 좌우될 것이다. 예시적인 희석제는 멸균수, 정박테리아 주사용수 (BWFI), pH 완충 용액 (예를 들어 포스페이트-완충 염수), 멸균 염수 용액, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다. 재구성 부피는 약 0.5-1.0 ml, 바람직하게는 0.5 ml 또는 0.7 ml일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 제제는 동결건조, 동결, 마이크로웨이브 건조 또는 동결건조구의 생성 전에 제조된 수용액이다.

제약 조성물은 등장성, 저장성 또는 고장성일 수 있다. 그러나, 주입 또는 주사용 제약 조성물이 투여될 때 본질적으로 등장성인 것이 종종 바람직하다. 따라서, 저장을 위해 제약 조성물은 바람직하게는 등장성 또는 고장성일 수 있다. 제약 조성물이 저장을 위해 고장성인 경우에, 이는 투여 전에 등장성 용액이 되도록 희석될 수 있다.

등장화제는 이온성 등장화제, 예컨대 염 또는 비-이온성 등장화제, 예컨대 탄수화물일 수 있다. 이온성 등장화제의 예는 NaCl, CaCl₂, KCl 및 MgCl₂를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

적어도 1종의 제약상 허용되는 첨가제는 완충제인 것이 또한 바람직하다. 일부 목적을 위해, 예를 들어, 제약 조성물이 주입 또는 주사를 위해 의도되는 경우에, 조성물은 용액을 4 내지 10, 예컨대 5 내지 9, 예를 들어 6 내지 8 범위의 pH로 완충할 수 있는 완충제를 포함하는 것이 종종 바람직하다.

완충제는, 예를 들어 트리스, 아세테이트, 글루타메이트, 락테이트, 말레에이트, 타르트레이트, 포스페이트, 시트레이트, 카르보네이트, 글리시네이트, L-히스티딘, 글리신, 숙시네이트 및 트리에탄올아민 완충제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

완충제는 또한, 예를 들어, 특히 제약 제제가 비경구 용도를 위한 것인 경우에, 비경구 용도를 위한 USP 상용성 완충제로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 완충제는 일염기성 산, 예컨대 아세트산, 벤조산, 글루콘산, 글리세르산 및 락트산; 이염기성 산, 예컨대 아코니트산, 아디프산, 아스코르브산, 탄산, 글루탐산, 말산, 숙신산 및 타르타르산, 다염기성 산, 예컨대 시트르산 및 인산; 및 염기, 예컨대 암모니아, 디에탄올아민, 글리신, 트리에탄올아민 및 트리스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

비경구 비히클 (피하, 정맥내, 동맥내 또는 근육내 주사용)은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트화 링거 및 고정 오일을 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양소 보충제, 전해질 보충제, 예컨대 링거 덱스트로스를 기재로 하는 것 등을 포함한다. 예는 계면활성제 및 다른 제약상 허용되는 아주반트를 첨가하거나 첨가하지 않은 멸균 액체, 예컨대 물 및 오일이다. 일반적으로, 물, 염수, 수성 덱스트로스 및 관련 당 용액, 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리소르베이트 80 (PS-80), 폴리소르베이트 20 (PS-20) 및 폴록사머 188 (P188)이 특히 주사가능한 용액을 위한 바람직한 액체 담체이다. 오일의 예는 동물, 식물 또는 합성 기원의 것, 예를 들어 땅콩 오일, 대두 오일, 올리브 오일, 해바라기 오일, 어류-간 오일, 또 다른 해양 오일, 또는 우유 또는 난으로부터의 지질이다.

본 발명의 제제는 또한 계면활성제를 함유할 수 있다. 바람직한 계면활성제는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제 (통상적으로 트윈으로 지칭됨), 특히 PS-20 및 PS-80; 에틸렌 옥시드 (EO), 프로필렌 옥시드 (PO) 및/또는 부틸렌 옥시드 (BO)의 공중합체, 다우팍스(DOWFAX)™ 상표명으로 판매됨, 예컨대 선형 EO/PO 블록 공중합체; 반복 에톡시 (옥시-1,2-에탄디일) 기의 수가 다양할 수 있는 옥톡시놀, 옥톡시놀-9 (트리톤 X-100 또는 t-옥틸페녹시폴리에탄올)가 특히 관심대상임; (옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올 (이게팔 CA-630/NP-40); 인지질, 예컨대 포스파티딜콜린 (레시틴); 노닐페놀 에톡실레이트, 예컨대 테르기톨(Tergitol)™ NP 시리즈; 라우릴, 세틸, 스테아릴 및 올레일 알콜로부터 유도된 폴리옥시에틸렌 지방 에테르 (브리즈 계면활성제로 공지됨), 예컨대 트리에틸렌글리콜 모노라우릴 에테르 (브리즈 30); 및 소르비탄 에스테르 (통상적으로 스팬으로 공지됨), 예컨대 소르비탄 트리올레에이트 (스팬 85) 및 소르비탄 모노라우레이트. 에멀젼에 포함시키기 위한 바람직한 계면활성제는 PS-80이다.

계면활성제의 혼합물, 즉 PS-80/스팬 85 혼합물이 사용될 수 있다. 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 (PS-80) 및 옥톡시놀, 예컨대 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 (트리톤 X-100)의 조합물이 또한 적합하다. 또 다른 유용한 조합물은 라우레트 9 플러스 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 및/또는 옥톡시놀을 포함한다.

계면활성제의 바람직한 양은 다음과 같다: 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 (예컨대 PS-80) 0.01 내지 1% w/v, 특히 약 0.1% w/v; 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올 (예컨대 트리톤 X-100, 또는 트리톤 시리즈의 다른 세제) 0.001 내지 0.1% w/v, 특히 0.005 내지 0.02% w/v; 폴리옥시에틸렌 에테르 (예컨대 라우레트 9) 0.1 내지 20% w/v, 바람직하게는 0.1 내지 10% w/v, 특히 0.1 내지 1% w/v 또는 약 0.5% w/v.

특정 실시양태에서, 계면활성제는 통상적으로 트윈(Tween)® 20으로 지칭되는, 상업적으로 입수가능한 계면활성제인 폴리소르베이트 20 (IUPAC 명칭: 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트; PS-20)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 제제 중 폴리소르베이트 20의 최종 농도는 0.001% 내지 10% w/v, 0.025% 내지 2.5% w/v, 0.1% 내지 0.2% w/v 또는 0.025% 내지 0.1% w/v 범위이다.

특정 실시양태에서, 계면활성제는 1100 Da 내지 17,400 Da 범위의 분자량을 갖는 폴록사머이다.

폴록사머는 폴리옥시에틸렌 (폴리(에틸렌 옥시드))의 2개의 친수성 쇄가 플랭킹되어 있는 폴리옥시프로필렌 (폴리(프로필렌 옥시드))의 중심 소수성 쇄로 구성된 비이온성 삼블록 공중합체이다. 폴록사머는 또한 상표명 플루로닉(Pluronic)®으로 공지되어 있다. 중합체 블록의 길이는 맞춤화될 수 있기 때문에, 약간 상이한 특성을 갖는 다수의 상이한 폴록사머가 존재한다. 일반적 용어 "폴록사머"의 경우, 이들 공중합체는 통상적으로 문자 "P" (폴록사머에 대한 것)에 이어서 3개의 숫자로 명명되고, 처음 2개의 숫자 x 100은 폴리옥시프로필렌 코어의 대략적인 분자 질량을 제공하고, 마지막 숫자 x 10은 폴리옥시에틸렌 함량 백분율을 제공한다 (예를 들어, P407 = 4,000 g/mol의 폴리옥시프로필렌 분자 질량 및 70% 폴리옥시에틸렌 함량을 갖는 폴록사머). 플루로닉® 상표명의 경우, 이들 공중합체의 부호화는 실온에서 그의 물리적 형태를 규정하기 위한 문자 (L = 액체, P = 페이스트, F = 박편 (고체))로 시작한 후 2 또는 3개의 숫자가 이어진다. 수치 지정에 있어서 처음 숫자 (3자리 숫자에서 2개의 숫자)에 300을 곱한 것은 소수성물질의 대략적인 분자량을 나타내고; 마지막 숫자 x 10은 폴리옥시에틸렌 함량 백분율을 나타낸다 (예를 들어, L61 = 1,800 g/mol의 폴리옥시프로필렌 분자 질량 및 10% 폴리옥시에틸렌 함량을 갖는 플루로닉®). 미국 특허 번호 3,740,421을 참조한다.

폴록사머의 예는 하기 화학식을 갖는다:

HO(C₂H₄O)_a(C₃H₆O)_b(C₂H₄O)_aH

여기서 a 및 b 블록은 하기 값을 갖는다:

본원에 사용된 분자량 단위는 달톤 (Da) 또는 g/mol이다.

제제의 경우, 폴록사머는 일반적으로 1100 Da 내지 17,400 Da, 7,500 Da 내지 15,000 Da, 또는 7,500 Da 내지 10,000 Da 범위의 분자량을 갖는다. 폴록사머는 폴록사머 188 또는 폴록사머 407로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 제제 중 폴록사머의 최종 농도는 0.001 내지 5% w/v, 또는 0.025 내지 1% w/v이다.

제제에 적합한 중합체는 중합체 폴리올, 특히 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하나 이에 제한되지는 않는 폴리에테르 디올, 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르이다. 프로필렌 글리콜은 ~425 내지 ~2700의 단량체의 분자량 범위에서 이용가능하다. 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르는 또한 PEG200, PEG300, PEG400, PEG1000, PEG MME 550, PEG MME 600, PEG MME 2000, PEG MME 3350 및 PEG MME 4000을 포함하나 이에 제한되지는 않는, ~200 내지 ~35000 범위의 분자량의 범위에서 이용가능하다. 바람직한 폴리에틸렌 글리콜은 폴리에틸린 글리콜 400이다. 본 발명의 제제 중 중합체의 최종 농도는 1 내지 20% w/v 또는 6 내지 20% w/v일 수 있다.

제제는 또한 pH-완충 염수 용액을 함유한다. 완충제는, 예를 들어 트리스, 아세테이트, 글루타메이트, 락테이트, 말레에이트, 타르트레이트, 포스페이트, 시트레이트, 카르보네이트, 글리시네이트, L-히스티딘, 글리신, 숙시네이트, HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산), MOPS (3-(N-모르폴리노)프로판술폰산), MES (2-(N-모르폴리노)에탄술폰산) 및 트리에탄올아민 완충제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 완충제는 용액을 4 내지 10, 5.2 내지 7.5, 또는 5.8 내지 7.0 범위의 pH로 완충시킬 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 완충제는 포스페이트, 숙시네이트, L-히스티딘, MES, MOPS, HEPES, 아세테이트 또는 시트레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 완충제는 또한, 예를 들어, 특히 제약 제제가 비경구 용도를 위한 것인 경우에, 비경구 용도를 위한 USP 상용성 완충제로부터 선택될 수 있다. 완충제의 농도는 1 mM 내지 50 mM 또는 5 mM 내지 50 mM 범위일 것이다. 특정 측면에서, 완충제는 5 mM 내지 50 mM의 최종 농도의 L-히스티딘, 또는 1 mM 내지 10 mM의 최종 농도의 숙시네이트이다. 특정 측면에서, L-히스티딘은 20 mM ± 2 mM의 최종 농도로 존재한다.

염수 용액 (즉, NaCl을 함유하는 용액)이 바람직하지만, 제제에 적합한 다른 염은 CaCl₂, KCl 및 MgCl₂ 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 적합한 염 범위는 25 mM 내지 500 mM 또는 40 mM 내지 170 mM을 포함하나 이에 제한되는 않는다. 한 측면에서, 염수는 임의로 20 mM 내지 170 mM의 농도로 존재하는 NaCl이다. 바람직한 실시양태에서, 제제는 염화나트륨을 갖는 L-히스티딘 완충제를 포함한다.

본원에 기재된 제제의 특정 실시양태에서, 폴리사카라이드-단백질 접합체는 담체 단백질에 접합된 1종 이상의 폐렴구균 폴리사카라이드를 포함한다. 담체 단백질은 CRM₁₉₇, 디프테리아 독소 단편 B (DTFB), DTFBC8, 디프테리아 톡소이드 (DT), 파상풍 톡소이드 (TT), TT의 단편 C, 백일해 톡소이드, 콜레라 톡소이드, 이. 콜라이 LT, 이. 콜라이 ST, 슈도모나스 아에루기노사로부터의 외독소 A 및 그의 조합으로부터 선택될 수 있다. 특정 측면에서, 폴리사카라이드-단백질 접합체 중 1종 이상은 DTFB에 접합된다. 한 측면에서, 폴리사카라이드-단백질 접합체 모두는 수성 화학을 사용하여 제조된다. 예로서, 폴리사카라이드-단백질 접합체 제제는 CRM₁₉₇ 폴리펩티드에 접합된 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F로부터의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드로 본질적으로 이루어진 15가 폐렴구균 접합체 (15vPnC) 제제일 수 있다. 또 다른 측면에서, 폴리사카라이드 단백질 접합체 중 1종 이상은 DMSO 화학을 사용하여 제조된다. 예로서, 폴리사카라이드-단백질 접합체 제제는 15가 폐렴구균 접합체 (15vPnC) 제제일 수 있으며, 여기서 혈청형 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F 및 23F로부터의 폴리사카라이드 단백질 접합체는 DMSO 화학을 사용하여 제조되고, 혈청형 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F 및 33F로부터의 폴리사카라이드 단백질 접합체는 수성 화학을 사용하여 제조된다.

또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 제어 방출 시스템으로 전달된다. 예를 들어, 작용제는 정맥내 주입, 경피 패치, 리포솜 또는 다른 투여 방식을 사용하여 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 중합체 물질이, 예를 들어 마이크로스피어에 또는 이식물에 사용된다.

본 발명의 조성물은 또한 에스. 뉴모니아에로부터의 1종 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 포함시키기에 적합한 에스. 뉴모니아에 단백질의 예는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 02/083855 및 WO 02/053761에서 확인된 것들을 포함한다.

동결건조구의 제조 공정

일부 실시양태에서, 공동을 함유하는 고체 요소 상에 수성 매질 혼합물을 함유하는 단일 부피를 형성한다. 고체 요소를 혼합물의 동결 온도 미만으로 냉각시키고, 공동에 혼합물을 충전하고, 혼합물을 공동에 존재하는 동안 고체화하여 단일 형태를 형성한다. 단일 형태를 진공에서 건조시켜 동결건조구를 제공한다. 미국 특허 번호 9,119,794 (이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)는 동결건조구를 형성하는 유사한 공정을 개시한다.

다른 실시양태에서, 동결건조구는 실질적으로 구형인 형상으로 형성되고, 목적하는 생물학적 물질의 액체 조성물의 액적을 편평 고체 표면, 특히 어떠한 공동도 갖지 않는 표면 상에서 동결시킨 후 단일 형태를 동결건조시킴으로써 제조된다. 미국 특허 출원 공개 번호 US2014/0294872 (이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)는 동결건조구를 형성하는 유사한 공정을 개시한다.

간략하게, 일부 실시양태에서, 공정은 실질적으로 구형인 형상을 갖는 적어도 1개의 액체 액적을 고체 편평 표면 (즉, 임의의 샘플 웰 또는 공동이 없음) 상에 분배하는 단계, 액적을 극저온 물질과 접촉시키지 않으면서 액적을 표면 상에서 동결시키는 단계 및 동결된 액적을 동결건조시켜 실질적으로 구형의 형상인 건조 펠릿을 생성하는 단계를 포함한다. 공정은 동시에 고체 편평 표면 상에 목적하는 수의 액적을 분배하고, 액적을 동결시키고, 동결된 액적을 동결건조시킴으로써 다수의 건조 펠릿을 제조하는 고처리량 모드로 사용될 수 있다. 이러한 공정에 의해 액체 제제로부터 제조된 펠릿은 고농도의 생물학적 물질 (예컨대 단백질 치료제)을 가질 수 있고, 건조 펠릿의 세트로 조합될 수 있다.

일부 실시양태에서, 고체 편평 표면은 금속 플레이트의 상부 표면을 -90℃ 이하의 온도에서 유지하도록 적합화된 히트 싱크와 물리적으로 접촉하고 있는 하부 표면을 포함하는 금속 플레이트의 상부 표면이다. 금속 플레이트의 상부 표면은 액체 제제의 동결점보다 훨씬 낮기 때문에, 액적은 본질적으로 액적의 하부 표면이 금속 플레이트의 상부 표면과 접촉하면서 즉각적으로 동결된다.

다른 실시양태에서, 고체 편평 표면은 소수성이고, 분배 단계 동안 0℃ 초과로 유지되는 박막의 상부 표면을 포함한다. 분배된 액적은 박막을 제제의 동결 온도 미만의 온도로 냉각시킴으로써 동결된다.

동결건조 공정

본 발명의 동결건조 제제는 사전-동결건조 용액의 동결건조 (동결-건조)에 의해 형성된다. 동결-건조는 제제를 동결시킨 후에 1차 건조에 적합한 온도에서 물을 승화시켜 달성된다. 이러한 조건 하에, 생성물 온도는 제제의 공융점 또는 붕괴 온도 미만이다. 전형적으로, 1차 건조에 대한 보관 온도는, 전형적으로 약 30 내지 250 mTorr 범위의 적합한 압력에서 약 -50 내지 25℃ 범위일 것이다 (단 생성물은 1차 건조 동안 동결된 상태로 유지됨). 제제, 샘플을 보유하는 용기 (예를 들어, 유리 바이알)의 크기 및 유형, 및 액체의 부피는 건조에 요구되는 시간을 좌우할 것이고, 이는 수시간 내지 수일 (예를 들어, 40-60시간) 범위일 수 있다. 2차 건조 단계는, 주로 사용된 용기의 유형 및 크기 및 단백질의 유형에 따라, 약 0-40℃에서 수행될 수 있다. 2차 건조 시간은 생성물 내의 목적하는 잔류 수분 수준에 의해 좌우되며, 전형적으로 적어도 약 5시간이 걸린다. 전형적으로, 동결건조 제제의 수분 함량은 약 5% 미만, 바람직하게는 약 3% 미만이다. 압력은 1차 건조 단계 동안 사용된 것과 동일할 수 있다. 동결-건조 조건은 제제, 바이알 크기 및 동결건조 트레이에 따라 달라질 수 있다.

일부 경우에, 전달 단계를 피하기 위해 재구성이 수행될 용기 내에서 단백질-폴리사카라이드 제제를 동결건조시키거나 마이크로웨이브 건조시키는 것이 바람직할 수 있다. 이 경우에 용기는, 예를 들어 2, 3, 5, 10 또는 20 ml 바이알일 수 있다.

첨부된 설명 및 도면을 참조하여 본 발명의 다양한 실시양태를 기재하였지만, 본 발명이 그러한 정확한 실시양태에 제한되지 않는다는 것, 및 그 안에서 다양한 변화 및 변형이 첨부된 청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 범주 또는 취지를 벗어나지 않으면서 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이루어질 수 있다는 것이 이해되어야 한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하지만, 제한하지는 않는다.

실시예

실시예 1: 에스. 뉴모니아에 피막 폴리사카라이드의 제조

폐렴구균을 배양하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Chase, 1967, Methods of Immunology and Immunochemistry 1:52]을 참조한다. 폐렴구균 피막 폴리사카라이드를 제조하는 방법도 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 유럽 특허 번호 EP0497524를 참조한다. 폐렴구균 하위유형의 단리물은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (버지니아주 마나사스)으로부터 입수가능하다. 박테리아는 혈액-한천 상에서 알파-용혈성인 피막화된, 비-운동성, 그람-양성, 란셋-형상 쌍구균으로서 확인되어 있다. 하위유형은 특정 항혈청을 사용하는 팽화 반응에 기초하여 구별될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,847,112를 참조한다.

관심있는 각각의 에스. 뉴모니아에 혈청형을 나타내는 세포 은행을 냉동 바이알 내의 것으로 머크 컬쳐 콜렉션(Merck Culture Collection) (뉴저지주 라웨이)으로부터 얻었다. 해동된 시드 배양물을 에스. 뉴모니아에에 적절한 사전-멸균된 성장 배지를 함유하는 시드 발효기로 옮겼다. 배양물을 온도 및 pH 제어 하의 시드 발효기에서 성장시켰다. 시드 발효기의 전체 부피를 사전-멸균된 성장 배지를 함유하는 생산 발효기로 옮겼다. 생산 발효는 공정의 최종 세포 성장 단계였다. 온도, pH 및 교반 속도를 제어하였다.

불활성화제의 첨가를 통해 발효 공정을 종결시켰다. 불활성화 후에, 배치를 불활성화 탱크로 옮겨 제어된 온도 및 교반 하에 유지하였다. 원심분리와 여과의 조합을 사용하여 세포 파편을 제거하였다. 배치를 한외여과하고 투석여과하였다. 이어서 배치를 용매-기반 분획화에 적용하여 불순물을 제거하고 폴리사카라이드를 회수하였다.

실시예 2: 수용액에서의 환원성 아미노화를 사용한 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F의 CRM₁₉₇에 대한 접합

공통 공정 흐름을 사용하여 상이한 혈청형 폴리사카라이드를 정제된 CRM₁₉₇ 담체 단백질에 개별적으로 접합시켰다. 폴리사카라이드를 용해시키고, 크기 감소시키고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 이어서, 정제된 CRM₁₉₇을 활성화된 폴리사카라이드에 반응 혼합물 중 NiCl₂ (2 mM)를 이용하여 접합시키고, 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2 마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 하기 섹션에서의 혈청형-특이적 값에 대해 제어하였다.

폴리사카라이드 크기 감소 및 산화

정제된 폐렴구균 피막 폴리사카라이드 분말을 물에 용해시키고, 혈청형 19A를 제외한 모든 혈청형을 0.45-마이크로미터 여과하였다. 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F를 균질화하여 폴리사카라이드의 분자 질량을 감소시켰다. 혈청형 18C를 ≥ 90℃에서 균질화 또는 산 가수분해에 의해 크기-감소시켰다. 혈청형 19A는 그의 비교적 낮은 출발 크기로 인해 크기 감소시키지 않았다. 균질화 압력 및 균질화기 통과 횟수를 혈청형-특이적 표적에 대해 제어하여 (150-1000 bar; 4-7회 통과) 혈청형-특이적 분자 질량을 달성하였다. 크기-감소된 폴리사카라이드를 0.2-마이크로미터 여과한 다음, 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다. 산-가수분해된 혈청형 18C에 대해서는 5 kDa NMWCO 막을 사용하였다.

이어서, 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제를 사용하여 혈청형-특이적 온도 (4-22℃) 및 pH (4-5)로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 모든 혈청형 (혈청형 4 제외)에 대해, 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트의 양은 폴리사카라이드 반복 단위 몰당 대략 0.1 내지 0.5 몰의 소듐 메타퍼아이오데이트 범위로, 혈청형-특이적이었다. 소듐 메타퍼아이오데이트의 혈청형-특이적 전하는 폴리사카라이드 활성화의 표적 수준 (폴리사카라이드 반복 단위 몰당 알데히드 몰)을 달성하기 위한 것이었다. 혈청형 4의 경우, 소듐 메타퍼아이오데이트 첨가 전에, 배치를 대략 50℃ 및 pH 4.1에서 인큐베이션하여 폴리사카라이드를 부분적으로 탈케탈화시켰다.

혈청형 5 및 7F를 제외한 모든 혈청형의 경우, 활성화된 생성물을 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하였다. 산-가수분해된 혈청형 18C에 대해서는 5 kDa NMWCO 막을 사용하였다. 혈청형 5 및 7F를 10 mM 아세트산나트륨에 대해 투석여과하였다. 모든 혈청형에 대한 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.

CRM₁₉₇에 대한 폴리사카라이드 접합

산화된 폴리사카라이드 용액을 혈청형에 따라 1.5 M 인산칼륨, pH 6.0 또는 pH 7.0 및 물과 혼합하였다. 선택된 완충제 pH는 접합 반응 동안 활성화된 폴리사카라이드의 안정성을 개선시키기 위한 것이었다. 이전에 기재된 바와 같이 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 2012/173876 A1 참조) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM₁₉₇을 0.2-마이크로미터 여과하고, 완충 폴리사카라이드 용액과, 혈청형에 따라 0.4 내지 1.0 w/v 범위의 CRM₁₉₇에 대한 폴리사카라이드 질량 비로 합하였다. 질량 비는 생성된 접합체에서 CRM₁₉₇에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 선택하였다. 폴리사카라이드 및 포스페이트 농도는 혈청형에 따라 각각 3.6 내지 10.0 g/L 및 100 내지 150 mM 범위로, 혈청형-특이적이었다. 혈청형-특이적 폴리사카라이드 농도는 생성된 접합체의 크기를 제어하도록 선택하였다. 이어서, 용액을 0.2-마이크로미터 여과하였다. 100 mM 염화니켈 용액을 사용하여 염화니켈을 대략 2 mM로 첨가하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 몰당 2몰)를 첨가하였다. 폴리사카라이드 및 단백질의 소비를 최대화하기 위해 혈청형-특이적 지속기간 (72 내지 120시간) 동안 접합을 진행시켰다.

산-가수분해된 혈청형 18C를 각각 대략 12.0 g/L 및 6.0 g/L의 폴리사카라이드 및 단백질 농도를 사용하여 소듐 시아노보로히드라이드를 갖는 대략 pH 8의 100 mM 인산칼륨에서 37℃에서 접합시켰다.

수소화붕소나트륨에 의한 환원

접합 반응 후, 배치를 대략 3.5 g/L의 폴리사카라이드 농도로 희석하고, 2-8℃로 냉각시키고, 1.2-마이크로미터 여과하였다. 모든 혈청형 (혈청형 5 제외)을 100 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2-8℃에서 100 mM 인산칼륨, pH 7.0에 대해 투석여과하였다. 이어서, 보유물에 회수된 배치를 대략 2.0 g 폴리사카라이드/L로 희석하고, 1.2 M 중탄산나트륨, pH 9.4의 첨가에 의해 pH-조정하였다. 수소화붕소나트륨 (폴리사카라이드 반복 단위 몰당 1몰)을 첨가하였다. 이후 1.5 M 인산칼륨, pH 6.0을 첨가하였다. 혈청형 5를 100 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 300 mM 인산칼륨에 대해 투석여과하였다.

최종 여과 및 생성물 저장

이어서, 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM L-히스티딘에 대해 투석여과하였다. 보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과하였다.

혈청형 19F를 22℃에서 대략 7일 동안 인큐베이션하고, 100 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM L-히스티딘에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.

배치를 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM L-히스티딘에 의해 1.0 g/L의 폴리사카라이드 농도로 조정하였다. 배치를 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.

실시예 3: 디메틸술폭시드에서의 환원성 아미노화를 사용한 혈청형 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F 및 23F의 CRM₁₉₇에 대한 접합 방법

공통 공정 흐름을 사용하여 상이한 혈청형 폴리사카라이드를 정제된 CRM₁₉₇ 담체 단백질에 개별적으로 접합시켰다. 폴리사카라이드를 용해시키고, 표적 분자 질량으로 크기조정하고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM₁₉₇을 개별적으로 동결건조시키고 디메틸술폭시드 (DMSO)에 재용해시켰다. 이어서, 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM₁₉₇ 용액을 합하고 하기 기재된 바와 같이 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 하기 섹션에서의 혈청형-특이적 값에 대해 제어하였다.

폴리사카라이드 크기 감소 및 산화

정제된 폐렴구균 피막 폴리사카라이드 분말을 물에 용해시키고, 혈청형 19A를 제외한 모든 혈청형을 0.45-마이크로미터 여과하였다. 혈청형 18C 및 19A를 제외한 모든 혈청형을 균질화하여 폴리사카라이드의 분자 질량을 감소시켰다. 균질화 압력 및 균질화기 통과 횟수를 혈청형-특이적 표적에 대해 제어하였다 (150-1000 bar; 4-7회 통과). 혈청형 18C를 ≥ 90℃에서 산 가수분해에 의해 크기-감소시켰다. 혈청형 19A는 크기-감소시키지 않았다.

크기-감소된 폴리사카라이드를 0.2-마이크로미터 여과한 다음, 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다. 혈청형 18C에 대해서는 5 kDa NMWCO 막을 사용하였다.

이어서, 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제를 사용하여 혈청형-특이적 온도 (4-22℃) 및 pH (4-5)로 조정하였다. 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트의 양은 폴리사카라이드 반복 단위 몰당 대략 0.1 내지 0.5 몰의 소듐 메타퍼아이오데이트 범위로, 혈청형-특이적이었다.

모든 혈청형에 대해, 활성화된 생성물을 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하였다. 혈청형 18C에 대해서는 5 kDa NMWCO 막을 사용하였다. 모든 혈청형에 대한 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.

CRM₁₉₇에 대한 폴리사카라이드 접합

이전에 기재된 바와 같이 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 2012/173876 A1 참조) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM₁₉₇을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.

산화된 폴리사카라이드 용액을 동결건조를 위한 제제로 물 및 수크로스와 함께 제제화하였다. 단백질 용액을 동결건조를 위한 제제로 물, 포스페이트 완충제 및 수크로스와 함께 제제화하여 동결건조 후 DMSO 중 최적 재용해를 달성하였다.

제제화된 폴리사카라이드 및 CRM₁₉₇ 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 폴리사카라이드 및 CRM₁₉₇ 물질을 DMSO 중에 재용해시키고, 티 혼합기를 사용하여 합하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 몰당 1몰)를 첨가하고, 혈청형-특이적 지속기간 (1 내지 48시간) 동안 접합을 진행시켜 표적으로 하는 접합체 크기를 달성하였다.

수소화붕소나트륨에 의한 환원

접합 반응 후에 수소화붕소나트륨 (폴리사카라이드 반복 단위 몰당 2 몰)을 첨가하였다. 배치를 대략 4℃에서 150 mM 염화나트륨 내로 희석하였다. 이어서, 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.

최종 여과 및 생성물 저장

이어서 각각의 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM L-히스티딘에 대해 투석여과하였다. 보유물 배치를 0.2-마이크로미터 여과하였다.

혈청형 19F를 대략 5일 동안 인큐베이션하고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 대략 4℃에서 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM L-히스티딘에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.

배치를 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM L-히스티딘으로 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.

실시예 4: 15가 폐렴구균 접합체 백신의 제제

혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F를 갖는 15가 폐렴구균 접합체 백신 (PCV15)의 제제에 상기 기재된 바와 같이 제조된 폐렴구균 폴리사카라이드-단백질 접합체를 사용하였다. 수용액에서의 환원성 아미노화 (실시예 3)에 의해 생성된 폐렴구균 폴리사카라이드-CRM₁₉₇ 접합체를 사용하여 제제를 제조하였다.

제제 부형제 원액 제조

13종의 농축된 부형제 원액을 부형제의 조합으로 제조하여, 20 mM 히스티딘, 150 mM NaCl, 0.2% w/v PS20 (2 mg/ml), pH 5.8의 최종 베이스 제제로, 표 1에 열거된 바와 같은 최종 백신 약물 제품 제제 농도를 생성하였다.

히스티딘, PEG400, 히드록시프로필메틸 셀룰로스 (HPMC), 2-히드록시에틸 셀룰로스 (2-HEC) 및 히드록시프로필 셀룰로스 (HPC)를 미주리주 세인트 루이스 소재 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 구입하였다. 카르복시메틸 셀룰로스 (CMC) 및 PEO100K를 아크로스 오가닉스(Acros Organics)로부터 구입하였다. 염화나트륨, 폴리소르베이트 20, 만니톨, 수크로스, 프로필렌 글리콜 및 글리세롤을 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)으로부터 구입하였다.

표 1: PCV 제제 조성

모든 부형제 원액을 부피측정 방식으로 충분량 투입하여 100 mL로 만든 다음, 0.22 μm PES 여과 유닛 (밀리포어(Millipore), 매사추세츠주 빌레리카)을 통해 여과하고, 주위 실온에서 저장하였다.

아주반트첨가된 부형제 블렌드 및 PCV 백신의 제제화 및 충전

백신 제제를 제조하기 위해, 먼저 농축된 멸균 알루미늄 아주반트를 부형제 원액에 최종 제제 표적 부피를 수득하기 위한 부피비로 첨가함으로써 알루미늄 아주반트를 부형제 원액과 합하였다. 혼합물을 200 rpm에서 1시간 동안 혼합하여 균질성을 보장하고, 이후 멸균 여과된 폐렴구균 폴리사카라이드 접합체를 아주반트첨가된 부형제 블렌드에 첨가하였으며, 이는 최종 백신 제제 부피의 25%를 나타냈다. 백신 제제를 200 rpm에서 1시간 동안 추가로 혼합하였다. 최종 백신 제제는 pH 5.8에서 64 μg 폐렴구균 폴리사카라이드/mL (8 μg/mL 혈청형 6B 폴리사카라이드, 모든 다른 혈청형에 대해 4 μg/mL 폴리사카라이드) (바이알당 5.6 μg 혈청형 6B 폴리사카라이드, 모든 다른 혈청형에 대해 바이알당 2.8 μg 폴리사카라이드)를 함유하였다. 이어서, 제제를 0.7 mL의 멸균 유리 2R 바이알 내로 무균 충전하였다. 표 2는 제조된 개별 13종 제제 각각에 대한 부형제 성분 및 총 고체 함량을 기재한다.

표 2: 최종 백신 제제 부형제 및 고체 함량 백분율

알루미늄 아주반트에 대한 접합체 흡착 공정

알루미늄 아주반트에 접합체를 흡착시키는 공정은 먼저 농축된 알루미늄 아주반트를 생리 염수 (150-154 mM 염화나트륨) 중에 목적하는 부피비로 희석하여 알루미늄 아주반트의 최종 흡착된 백신 농도 0.1 내지 1.25 mg Al/mL를 생성하는 경우에 시작된다. 희석된 알루미늄 아주반트의 정확한 부피 및 질량은 아주반트의 목적하는 용량을 기초로 달라진다. 본 실시예에서는, 50 mL 최종 백신 제제를 표적화하고; 따라서 4.6 mL의 농축된 알루미늄 아주반트를 32.9 mL의 염수에 첨가하여 37.5 mL의 희석된 알루미늄 아주반트를 생성하였다. 공정에서의 다음 단계는, 희석된 아주반트를 멸균 유리 용기 내에서 1-2" 교반 막대를 사용하는 경우 200 rpm에서 1시간 동안 혼합하여 볼텍싱이 이루어지도록 하고, 이어서 1가 제제를 제조하는 경우 단독으로 일정하게 200 rpm 혼합을 유지하면서 희석된 알루미늄 아주반트에 멸균 여과된 접합체를 서서히 첨가하거나 또는 다가 백신 제제를 제조하는 경우 다가 혼합물로서 첨가하는 것을 포함한다. 본원에 제시된 실시예에서, 50 mL 최종 백신 제제의 경우, 12.5 mL의 멸균 다가 접합체 블렌드를 37.5 mL의 희석된 알루미늄 아주반트에 첨가하였다. 접합체 첨가 후, 이전에 기재된 바와 같은 200 rpm 혼합의 추가 1시간 동안 현탁액을 혼합하였다. 이어서, 제제화된 백신을 4℃에서 밤새 (또는 > 12시간) 저장하여 접합체의 추가 흡착이 일어나도록 하였다. 분배 및 사용 전에, 모든 백신 제제를 주위 실험실 온도 (21-25℃)로 다시 컨디셔닝하고, 적어도 1시간 동안 잘 혼합한다.

제제 저장 및 동결

제제를 액체 대조군으로서의 역할을 하도록 4℃에서 저장하였다. 충전 후 제제를 완전히 재현탁시킨 다음 즉시 -115℃에서 액체 질소 급속 동결에 의해 급속하게 동결시킴으로써 동결된 대조군 샘플을 제조하였다. 동결건조 및 마이크로웨이브 건조된 제제를 동결된 대조군과 동일한 방식으로 초기에 급속 동결시켰다. 동결건조구 제제를 4℃에서 꺼내고, 재현탁시키고, ≤ -180℃로 냉각시킨 저온 플레이트 상에 100 uL를 피펫팅함으로써 급속하게 동결시켰다. 모든 백신 제제 (바이알/동결건조, 바이알/REV 건조 및 동결건조구/동결건조용으로 제조됨)를 후속 건조 공정 개시시까지 -70℃에서 저장하였다.

백신 동결건조 및 통상적인 동결 건조

리오스타 III (SP 사이언티픽(SP Scientific), 뉴욕주 스톤 릿지)을 이용하여 동결건조를 수행하였다. 모든 동결된 바이알 제제를 -50℃에서 사전-냉각된 선반을 갖는 동결건조기 내에 로딩하였다. 보관 온도를 0.1℃/분의 경사 속도로 -50℃에서 -30℃로 상승시키고, 1차 건조를 -30℃/50 mTorr에서 수행하였다. 2차 건조를 위해, 보관 온도를 0.1℃/분의 경사 속도로 25℃ 설정점으로 상승시키고, 샘플을 6시간 동안 유지하였다. 1차 건조 전에 보관 온도를 0.5℃/분으로 -50℃에서 -20℃로 상승시키고, 180분 유지한 후, -50℃로 복귀함으로써 만니톨 함유 제제를 어닐링하였다.

백신의 마이크로웨이브 방사 에너지 진공 (REV) 건조

급속 동결 바이알을 방사 에너지 진공 (REV) 건조기 내에 배치하였다. REV 건조를 통해 동결된 백신을 진공, 압력 및 진행파 포맷의 마이크로웨이브 에너지 적용의 조합을 통해 건조시켰다. 모든 제제를 -70℃에서 로딩하고, 즉시 60-70 mTorr 하에 배치하고, 이후 200W의 방사 마이크로웨이브 에너지를 거의 7시간 동안 적용하고, 이어서 400W를 20분 동안 적용하였다.

백신 동결건조구의 생성 및 통상적인 동결 건조

제제를 200 rpm에서 1시간 동안 교반하여 재현탁시킨 다음 100 uL의 제제를 액체 질소 사전-냉각된 금속 웰 플레이트 상에 피펫팅함으로써 동결건조구를 생성하였다. 동결된 백신 구체의 생성 후, 개별 구체를 생물안전성 캐비넷 내의 각각의 개별 제제에 대한 별개 용기 내로 옮겼다. 이어서 동결건조구를 동결건조될 때까지 동결기 내 -70℃에서 저장하였다. 동결건조구 제제를 -70℃ 저장으로부터 꺼내고, 리오스타 III 동결건조 챔버 (SP 사이언티픽, 뉴욕주 스톤 릿지) 내 사전-냉각된 -50℃ 선반 상의 별개 서로 다른 금속 트레이 내에 배치하였다.

모든 제제를 로딩하고, 1차 건조 전 -50℃에서 유지시켰다. 모든 제제에 대해, 30 mTorr 하에 15℃에서 0.4℃/분 경사 속도로 1차 건조를 수행하고, 이어서 30 mTorr 하에 30℃ 설정점에서 0.2℃/분 경사 속도로 2차 건조시키고, 샘플을 6시간 동안 유지하였다. 1차 건조 전에 보관 온도를 0.5℃/분으로 -50℃에서 -20℃로 상승시키고, 60분 유지한 다음, 0.5℃/분으로 -45℃로 복귀시키고, 15분 동안 유지한 후, 30분 동안 -50℃로 복귀시켜 만니톨 함유 제제를 어닐링한 후에, 1차 건조를 개시하였다.

재구성 시간 분석

통상적인 동결건조, REV 건조 또는 동결-건조에 의해 건조시킨 동결건조구로서의 백신 제제를 -70℃ 저장으로부터 꺼내었다. 개별 제제를 700 uL의 멸균수로 재구성하였다. 재구성 후 농도는 건조 전의 것과 유사하다. 시각적 관찰 및 샘플의 완전 재구성에 대한 시간을 기록하였다.

입자 크기 분석

정적 광 산란 (SLS)의 사용을 통해 입자 크기를 측정함으로써 응집에 관한 아주반트첨가된 백신 제제의 물리적 안정성을 평가하였다. 샘플을 멸균-여과 및 탈기된 생리 염수 중에서 14.5 μg Al/mL의 최종 분석 농도로 제조하였다. 청색 레이저 검출이 장착된 말번(Malvern)

마스터사이저 2000 시스템을 사용하여 입자 크기 및 입자 크기 분포의 평가를 수행하였다. SLS 분석에서, 샘플을 투명한 유리의 유동 셀을 통해 재순환시켜 적색 및 청색 레이저 광이 통과하도록 한다. 큰 각도, 후방 산란 및 초점 평면 검출기의 어레이는 용액 중 입자의 다중-각도 광 산란을 수집하고, 회절 패턴이 수집된다. 방법은 회절각이 입자 크기에 반비례하는 원리에 의존한다. 광 산란 거동에 대한 굴절률의 영향, 상대 입자 투명성 및 입자의 흡광 효율을 설명하는 미(Mie) 이론의 적용을 사용하여 모든 입자의 레이저 회절로부터 생성된 산란 프로파일을 분석한다. 그 결과 계산된 입자 직경 결정치는 부피-기반 입자 크기 측정치이고, 이는 3회 실행의 평균이다.

SLS 분석에 의해 보고된 기록된 계산된 직경 값 사이의 차이에 대한 설명이 표 3에 기재된다. D[4,3] 값은 그것이 벌크의 샘플 부피를 구성하는 입자 크기를 반영하기 때문에 보고와 관련이 있다. 이는 입자 크기 분포에서 보다 큰 미립자의 존재에 대해 가장 민감하다. 추가로, D[3,2] 값은 입자 크기 분포에서 보다 작은 입자/미립자의 존재에 대해 관련이 있고 가장 민감하다. 추가로, d(0.5)는 샘플의 부피의 50% 미만이 존재하는 최대 입자 직경을 나타내기 때문에 보고와 관련이 있다. d(0.1) 및 d(0.9) 값은 각각 샘플의 10% 또는 90% 미만이 존재하는 입자 직경을 보고한다.

표 3. 정적 광 산란에 의해 제공된 입자 크기 직경의 설명

결과 및 논의

1) 추가의 부형제가 결여된 폐렴구균 접합체 백신의 입자 크기 및 분포

표 4는 비-동결 액체 대조군을 -70℃ 동결된 제제, 통상적으로 동결-건조된 제제, REV-건조된 제제 및 동결건조구 제제와 비교함으로써 백신 제제의 미가공 평균 입자 직경의 변화를 보고한다. 결과는 동결-건조 방법에 따른 백신 입자 크기의 변화를 설명한다. 부피 가중 평균 입자 크기 (D[4,3]) 및 중앙 입자 크기 (d(0.5))는 둘 다 동결-건조에 반응하여, 각각 동결건조구, REV-건조 및 통상적인 동결건조에 의해 8.3 μm에서 10.0, 12.2 및 15.0 μm로 증가한다. 각각의 동결-건조 방법은 백신이 동결될 때 관찰되는 응집 정도를 완화시키며, 그렇지 않으면 78.2 μm의 입자 크기를 생성한다. 그러나, 부형제가 없는 베이스 제제는 액체 대조군에 비해 동결-건조시 여전히 응집된다. 이러한 이유로, 동결-건조에 적용가능한 부형제를 함유하는 새로운 제제는 이러한 증가를 방지하거나 감소시키는데 이론적으로 유익할 것이다.

표 4: 동결-건조 폐렴구균 접합체 백신의 미가공 SLS 데이터

2) 핵심 부형제 조합은 동결된 폐렴구균 접합체 백신의 입자 크기 및 분포를 개선시킨다

동결된 백신의 평균 입자 크기는 특정한 부형제의 조합이 이용될 때 감소한다. 5% w/v 만니톨/2% w/v 수크로스 (F1), 또는 6% w/v 만니톨/4% w/v 수크로스 (F2)의 존재 하에 PCV를 동결시키는 것은 78.2 μm에서 12.1 μm (F1) 및 15.3 μm (F2)로 동결-응집의 유의한 감소를 유발한다. 추가로, 동결 제제 3, 10, 11 및 12는 심지어 대조군 제제보다 더 작은 평균 입자 크기, 5.2 내지 5.9 μm를 생성한다 (표 5). 이들 결과는 시험된 모든 제제가 동결된 부형제 무함유 PCV 제제 (F13)에 비해 입자 크기를 개선시킨다는 것을 시사한다. 제제 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8 및 9 모두는 백신의 동결-유도된 응집의 정도를 감소시킨다. 그러나, 제제 3, 10, 11 및 12는 응집의 정도를 추가로 감소시키고, -70℃ 동결 후 베이스 제제 입자 크기를 개선시킨다.

표 5: 동결 응집에 저항성인 폐렴구균 접합체 백신 제제의 미가공 SLS 데이터

3) 핵심 부형제 조합은 동결건조된 폐렴구균 접합체 백신의 입자 크기 및 분포를 개선시킨다

동결건조 공정은 PCV 백신 평균 입자 크기를 8.3 μm에서 15 μm로 증가시킨다. 제제 5 및 4를 이용하는 것은 액체 대조군과 유사한 동결건조 후 크기, 8.0 μm 내지 8.8 μm를 생성한다 (표 6). 4종의 제제, 즉 5.4 μm 내지 7.3 μm 평균 입자 크기에 걸친 F10, F3, F12 및 F11은 4C 액체 대조군의 경우 미만으로 입자 크기를 감소시킨다 (표 6). 결과는 제제 4 및 5가 동결건조 후 관찰된 입자 크기의 증가를 방지한다는 것을 나타낸다. 추가로, 제제 3, 10, 11 및 12는 관찰된 증가를 방지할 뿐만 아니라 백신의 입자 크기를 제어하고 액체 대조군의 것보다 훨씬 낮게 감소시킨다.

표 6: 동결건조-유도된 응집에 저항성인 폐렴구균 접합체 백신 제제의 미가공 SLS 데이터

2종의 제제, 즉 각각 2% w/v 만니톨 5% w/v 수크로스 또는 4% w/v 만니톨/6% w/v 수크로스를 함유하는 F1 및 F2는 특히 동결건조 유도된 응집의 정도를 증가시켰다. 생성된 입자 크기 및 불균질성은 백신 제제 각각에 대해 동결건조 후 15 μm에서 26.2 μm 및 28.2 μm로 증가하였다 (표 7). 제제 6, 7, 8 및 9는 동결건조 케이크를 생성하지 않았고, 또한 REV 건조 또는 동결건조구에 의한 추가의 평가를 위해 전달되지 않았다.

표 7: 동결건조에 의한 응집된 폐렴구균 접합체 백신 제제의 미가공 SLS 데이터

4) 핵심 부형제 조합은 REV-건조된 폐렴구균 접합체 백신의 입자 크기 및 분포를 개선시킨다

대조군 백신 제제의 입자 크기는 REV 건조시 8.3 μm에서 12.2 μm로 증가한다. 4% w/v 만니톨/6% w/v 수크로스를 함유하는 제제 2는 REV 건조로 인해 관찰된 응집의 정도를 유의하게 변경 또는 감소시키지 않았고, 12.0 μm 평균 입자 크기를 생성하였다 (표 8).

대조적으로, 2종의 제제, F4 및 F1은 REV 유도된 응집을 각각 9.1 μm 및 8.6 μm로 감소시켰다. 5종의 특정 제제 3, 5, 10, 11 및 12는 8.3 μm의 액체 대조군에 비해, 액체 대조군의 것 미만의 평균 입자 크기, 4.7 μm 내지 최대 7.7 μm로 감소시켰다. 이전에 언급된 바와 같이, 제제 6, 7, 8 및 9는 시험하지 않았다.

표 8: REV 응집에 저항성인 폐렴구균 접합체 백신 제제의 미가공 SLS 데이터

5) 핵심 부형제 조합은 동결건조구 폐렴구균 접합체 백신의 입자 크기 및 분포를 개선시킨다

원래 표 4에 예시된 바와 같이, 동결건조구의 생성은 평가된 다른 건조 방법에 비해 가장 작은 정도의 응집을 유발한다. 동결건조구 형성시, 대조군 백신 입자 크기는 8.3 μm에서 10.0 μm까지 증가한다. 제제 1은 평균 입자 크기를 10.0 μm에서 9.1 μm로 약간 감소시킨다 (표 9). 제제 2, 3, 4, 5, 12, 3, 10 및 11은 모두 입자 크기 및 응집을 둘 다 8.3 μm 액체 대조군 미만인 4.4 μm 내지 7.9 μm로 감소시킨다. 8.3 μm에서 4.4-5.5 μm로 감소된 입자 크기를 생성하는 제제 3, 10, 11 및 12가 가장 주목할만하다.

표 9: 동결건조구 응집에 저항성인 폐렴구균 접합체 백신 제제의 미가공 SLS 데이터

6) 핵심 부형제 조합은 액체 폐렴구균 접합체 백신의 입자 크기 및 분포를 개선시킨다

특정한 부형제는 액체 PCV 제제의 입자 크기를 유지하거나 개선시키는 한편, 선택된 몇몇은 응집을 유도한다. 액체 PCV의 입자 크기는 각각 제제 10, 3, 2 및 4로서 제조될 경우, 8.3 μm에서 75.4 μm, 36.7 μm, 34.7 μm 및 24.2 μm로 유의하게 증가한다 (표 10). 대조적으로, 제제 8 및 9는 8.3-8.4 μm의 입자 크기를 유지한다. 액체 백신 입자 크기의 추가의 개선이 제제 1, 5, 6, 7, 11 및 12에 대해; 대조군 제제의 것 미만인 6.1-7.7 μm 범위에서 관찰된다.

최종적으로, 하기 표 11은 서로 비교한 제제의 성능, 제시형태 및 건조 방법을 요약한다. SLS를 사용하여 액체, 동결, 동결건조, REV 건조 및 동결건조구 샘플을 시험하였고, 비교된 결과 및 보고된 상대 성능을 표 11에 보고하였다. 관찰될 수 있는 바와 같이, 특정한 제제, 구체적으로 제제 11 및 12는 모든 제시형태에 걸쳐 성능이 우수하지만, 동결-건조 공정 크기만을 설명하는 경우에는 제제 3, 10, 11 및 12가 평가된 모든 다른 것을 능가한다. 추가로, 특정한 제제는 특히 동결-건조 적용에서 가장 최적의 성능을 나타낸다.

표 10: 액체 폐렴구균 접합체 백신 제제의 미가공 SLS 데이터

표 11: PCV 제제의 성능 순위화

기호설명:

[+++] d(0.5 및 4,3) ≤10 μm, [++] d(0.5 및 4,3) ≤15 μm, [+] d(0.5 및 4,3) ≤25 μm, [-] 응집

Claims (50)

1. (i) 1종 이상의 폴리사카라이드-단백질 접합체; (ii) 약 5.0 내지 7.5 범위의 pH를 갖는 완충제; (ii) 염화마그네슘, 염화칼슘, 염화칼륨, 염화나트륨 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 알칼리 또는 알칼리 염; (iii) 계면활성제; (iv) 수크로스, 트레할로스 및 라피노스로 이루어진 군으로부터 선택된 당; 임의로 (v) 벌킹제; 및 임의로 (vi) 카르복시메틸 셀룰로스 (CMC), 히드록시프로필 셀룰로스 (HPC), 히드록시프로필 메틸셀룰로스 (HPMC), 2-히드록시에틸 셀룰로스 (2-HEC), 크로스카르멜로스, 메틸 셀룰로스, 글리세롤, 폴리에틸렌 옥시드, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 프로필렌 글리콜 (PG) 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 중합체; 및 (vii) 알루미늄 아주반트를 포함하는 제제.
2. 제1항에 있어서, 제제가 벌킹제를 포함하고, 당 및 벌킹제의 총 농도가 적어도 약 50 mg/ml인 제제.
3. 제1항에 있어서, 제제가 벌킹제를 포함하고, 당 및 벌킹제의 총 농도가 적어도 약 90 mg/ml인 제제.
4. 제1항에 있어서, 제제가 벌킹제를 포함하고, 당 및 벌킹제의 총 농도가 약 50-400 mg/ml이고, 당에 대한 벌킹제 비가 1 이상인 제제.
5. 제1항에 있어서, 제제가 벌킹제를 포함하고, 당 및 벌킹제의 총 농도가 약 50-150 mg/ml이고, 벌킹제 대 당 비가 약 2:1인 제제.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 만니톨, 글리신 또는 락토스인 벌킹제를 포함하는 제제.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 당이 트레할로스 또는 수크로스인 제제.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1-25 mg/ml의 카르복시메틸 셀룰로스 (CMC), 히드록시프로필 셀룰로스 (HPC), 2-히드록시에틸 셀룰로스 (2-HEC), 글리세롤, 폴리에틸렌 옥시드, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 프로필렌 글리콜 (PG) 또는 그의 조합인 중합체를 포함하는 제제.
9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체가 약 1-10 mg/ml의 카르복시메틸 셀룰로스 (CMC), 히드록시프로필 셀룰로스 (HPC), 2-히드록시에틸 셀룰로스 (2-HEC) 또는 그의 조합인 제제.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제가 폴리소르베이트 또는 1100 Da 내지 17,400 Da 범위의 분자량을 갖는 폴록사머인 제제.
11. 제10항에 있어서, 폴록사머가 7,500 Da 내지 15,000 Da 범위의 분자량을 갖는 것인 제제.
12. 제10항에 있어서, 폴록사머가 폴록사머 188 또는 폴록사머 407인 제제.
13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 폴록사머의 최종 농도가 약 0.01 내지 50 mg/ml인 제제.
14. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 폴록사머의 최종 농도가 약 0.25 내지 10 mg/ml인 제제.
15. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제가 폴리소르베이트 20 또는 80인 제제.
16. 제15항에 있어서, 폴리소르베이트 20의 최종 농도가 약 0.01 내지 100 mg/ml 범위인 제제.
17. 제15항에 있어서, 폴리소르베이트 20의 최종 농도가 약 0.25 내지 25 mg/ml 범위인 제제.
18. 제15항에 있어서, 폴리소르베이트 20의 최종 농도가 약 1 내지 5 mg/ml 범위인 제제.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, pH 완충제가 약 5.0 내지 7.0 범위의 pH를 갖는 것인 제제.
20. 제19항에 있어서, 완충제가 포스페이트, 숙시네이트, 히스티딘, MES, MOPS, HEPES, 아세테이트 및 시트레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제제.
21. 제20항에 있어서, 완충제가 약 5 mM 내지 50 mM의 최종 농도의 히스티딘, 또는 약 1 mM 내지 10 mM의 최종 농도의 숙시네이트인 제제.
22. 제21항에 있어서, 히스티딘이 약 20 mM의 최종 농도로 존재하는 것인 제제.
23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 염이 염화나트륨인 제제.
24. 제23항에 있어서, NaCl이 약 20 mM 내지 170 mM의 농도로 존재하는 것인 제제.
25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 총 폴리사카라이드-단백질 농도가 2-704 ug/ml인 제제.
26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 총 폴리사카라이드-단백질 농도가 4-92 ug/ml인 제제.
27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 0.1-0.5 mg/mL의 알루미늄 포스페이트 아주반트 (APA)를 포함하는 제제.
28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리사카라이드-단백질 접합체가 담체 단백질에 접합된 1종 이상의 폐렴구균 폴리사카라이드를 포함하는 것인 제제.
29. 제28항에 있어서, 담체 단백질이 CRM₁₉₇, 디프테리아 독소 단편 B (DTFB), DTFB C8, 디프테리아 톡소이드 (DT), 파상풍 톡소이드 (TT), TT의 단편 C, 백일해 톡소이드, 콜레라 톡소이드, 수막구균 외막 단백질 복합체 (OMPC), 이. 콜라이 LT, 이. 콜라이 ST, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터의 외독소 A, 비피막형 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae)로부터의 단백질 D 및 그의 조합으로부터 선택된 것인 제제.
30. 제28항에 있어서, 폴리사카라이드-단백질 접합체 중 1종 이상이 CRM₁₉₇에 접합된 것인 제제.
31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리사카라이드-단백질 접합체 중 1종 이상이 1종 이상의 담체 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)의 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 6E, 6G, 6H, 7F, 7A, 7B, 7C, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10F, 10A, 10B, 10C, 11F, 11A, 11B, 11C, 11D, 11E, 12F, 12A, 12B, 13, 14, 15F, 15A, 15B, 15C, 16F, 16A, 17F, 17A, 18F, 18A, 18B, 18C, 19F, 19A, 19B, 19C, 20A, 20B, 21, 22F, 22A, 23F, 23A, 23B, 24F, 24A, 24B, 25F, 25A, 27, 28F, 28A, 29, 31, 32F, 32A, 33F, 33A, 33B, 33C, 33D, 33E, 34, 35F, 35A, 35B, 35C, 36, 37, 38, 39, 40, 41F, 41A, 42, 43, 44, 45, 46, 47F, 47A, 48, CWPS1, CWPS2, CWPS3 중 적어도 1종으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 것인 제제.
32. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리사카라이드-단백질 접합체 제제가 CRM₁₉₇에 접합된 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F로부터의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드로 본질적으로 이루어진 15가 폐렴구균 접합체 (15vPnC) 제제인 제제.
33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리사카라이드 단백질 접합체 중 1종 이상이 DMSO 조건 하에 환원성 아미노화를 사용하여 제조된 것인 제제.
34. 제33항에 있어서, 혈청형 6A, 6B, 7F, 18C, 19A, 19F 및 23F로부터의 폴리사카라이드 단백질 접합체가 DMSO 조건 하에 제조되고, 혈청형 1, 3, 4, 5, 9V, 14, 22F 및 33F로부터의 폴리사카라이드 단백질 접합체가 수성 조건을 사용하여 제조된 것인 제제.
35. 제34항에 있어서, 각각의 용량이 4 μg/mL 또는 8 μg/mL의 각각의 사카라이드, 예외로 8 μg/mL 또는 16 μg/mL의 6B; 및 약 64 μg/mL 또는 128 μg/mL CRM₁₉₇ 담체 단백질을 함유하도록 제제화되는 것인 제제.
36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5.0 내지 7.5 범위의 pH를 갖는 pH 완충 염수 용액, 약 150 mM NaCl, 약 2 mg/ml 폴리소르베이트 20, 약 50 mg/ml 만니톨 및 약 20 mg/ml 수크로스를 포함하는 제제.
37. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5.0 내지 7.5 범위의 pH를 갖는 pH 완충 염수 용액, 약 150 mM NaCl, 약 2 mg/ml 폴리소르베이트 20, 약 60 mg/ml 만니톨, 약 40 mg/ml 수크로스를 포함하는 제제.
38. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5.0 내지 7.5 범위의 pH를 갖는 pH 완충 염수 용액, 약 150 mM NaCl, 약 2 mg/ml 폴리소르베이트 20, 약 90 mg/ml 수크로스, 약 5 mg/ml CMC를 포함하는 제제.
39. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5.0 내지 7.5 범위의 pH를 갖는 pH 완충 염수 용액, 약 150 mM NaCl, 약 2 mg/ml 폴리소르베이트 20, 약 90 mg/ml 수크로스, 약 5 mg/ml 2-HEC를 포함하는 제제.
40. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5.0 내지 7.5 범위의 pH를 갖는 pH 완충 염수 용액, 약 150 mM NaCl, 약 2 mg/ml 폴리소르베이트 20, 약 90 mg/ml 수크로스, 약 5 mg/ml HPC를 포함하는 제제.
41. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5.0 내지 7.5 범위의 pH를 갖는 pH 완충 염수 용액, 약 150 mM NaCl, 약 2 mg/ml 폴리소르베이트 20, 약 90 mg/ml 수크로스, 약 5 mg/ml CMC 및 약 5 mg/ml PG를 포함하는 제제.
42. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5.0 내지 7.5 범위의 pH를 갖는 pH 완충 염수 용액, 약 150 mM NaCl, 약 2 mg/ml 폴리소르베이트 20, 약 40 mg/ml 수크로스, 약 60 mg/ml 만니톨 및 약 5 mg/ml CMC를 포함하는 제제.
43. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5.0 내지 7.5 범위의 pH를 갖는 pH 완충 염수 용액, 약 150 mM NaCl, 약 2 mg/ml 폴리소르베이트 20, 약 40 mg/ml 수크로스, 약 60 mg/ml 만니톨, 약 5 mg/ml CMC 및 약 5 mg/ml PG를 포함하는 제제.
44. 제1항에 있어서, 약 4-92 ug/ml의 CRM₁₉₇에 접합된 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F로부터의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드로 본질적으로 이루어진 15가 폐렴구균 접합체 (15vPnC), 약 5.0 내지 7.5 범위의 pH를 갖는 pH 완충 염수 용액, 약 30-150 mM NaCl, 약 0.05-2 mg/ml 폴리소르베이트 20, 약 20-250 mg/ml 수크로스, 약 30-100 mg/ml 만니톨, 약 0.1-0.75 mg/ml APA, 약 1-10 mg/ml CMC 및 임의로 약 1-10 mg/ml PG를 포함하는 제제
45. 제1항에 있어서, 약 4-92 ug/ml의 CRM₁₉₇에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에의 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 6E, 6G, 6H, 7F, 7A, 7B, 7C, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10F, 10A, 10B, 10C, 11F, 11A, 11B, 11C, 11D, 11E, 12F, 12A, 12B, 13, 14, 15F, 15A, 15B, 15C, 16F, 16A, 17F, 17A, 18F, 18A, 18B, 18C, 19F, 19A, 19B, 19C, 20A, 20B, 21, 22F, 22A, 23F, 23A, 23B, 24F, 24A, 24B, 25F, 25A, 27, 28F, 28A, 29, 31, 32F, 32A, 33F, 33A, 33B, 33C, 33D, 33E, 34, 35F, 35A, 35B, 35C, 36, 37, 38, 39, 40, 41F, 41A, 42, 43, 44, 45, 46, 47F, 47A, 48, CWPS1, CWPS2, CWPS3 중 적어도 1종으로부터의 피막 폴리사카라이드, 약 5.0 내지 7.5 범위의 pH를 갖는 pH 완충 염수 용액, 약 30-150 mM NaCl, 약 0.05-2 mg/ml 폴리소르베이트 20, 약 20-250 mg/ml 수크로스, 약 30-100 mg/ml 만니톨, 약 0.1-0.75 mg/ml APA, 약 1-10 mg/ml CMC 및 임의로 약 1-10 mg/ml PG를 포함하는 제제.
46. 제1항에 있어서, 약 4-92 ug/ml의 CRM₁₉₇에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에의 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 6D, 6E, 6G, 6H, 7F, 7A, 7B, 7C, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10F, 10A, 10B, 10C, 11F, 11A, 11B, 11C, 11D, 11E, 12F, 12A, 12B, 13, 14, 15F, 15A, 15B, 15C, 16F, 16A, 17F, 17A, 18F, 18A, 18B, 18C, 19F, 19A, 19B, 19C, 20A, 20B, 21, 22F, 22A, 23F, 23A, 23B, 24F, 24A, 24B, 25F, 25A, 27, 28F, 28A, 29, 31, 32F, 32A, 33F, 33A, 33B, 33C, 33D, 33E, 34, 35F, 35A, 35B, 35C, 36, 37, 38, 39, 40, 41F, 41A, 42, 43, 44, 45, 46, 47F, 47A, 48, CWPS1, CWPS2, CWPS3 중 적어도 1종으로부터의 피막 폴리사카라이드, 약 5.0 내지 7.5 범위의 pH를 갖는 완충제; (ii) 20-170 mM의 염화마그네슘, 염화칼슘, 염화칼륨, 염화나트륨 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 알칼리 또는 알칼리 염; (iii) 1 내지 5 mg/ml의 폴리소르베이트 20인 계면활성제; (iv) 수크로스, 트레할로스 및 라피노스로 이루어진 군으로부터 선택된 당; 임의로 (v) 만니톨인 벌킹제; 및 임의로 (vi) 1-25 mg/ml의 카르복시메틸 셀룰로스 (CMC), 히드록시프로필 셀룰로스 (HPC), 히드록시프로필 메틸셀룰로스 (HPMC), 2-히드록시에틸 셀룰로스 (2-HEC) 및 프로필렌 글리콜 (PG) 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 중합체를 포함하고; 여기서 당, 또는 당 및 벌킹제의 총 농도가 약 50-400 mg/ml인 제제.
47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조 또는 마이크로웨이브 에너지 건조 전 수용액인 제제.
48. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 용액 중 재구성된 제제인 제제.
49. 제1항에 있어서, 15 μm 미만의 d(0.50)를 갖는 제제.
50. 제1항에 있어서, 동결건조구 형태인 제제.