KR0137963B1 - 인간의 호흡기 합포체성 바이러스에 대한 당단백질 면역 단편을 함유하는 키메라(chimeric) 당단백질 - Google Patents
인간의 호흡기 합포체성 바이러스에 대한 당단백질 면역 단편을 함유하는 키메라(chimeric) 당단백질Info
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Abstract
내용없음
Description
[발명의 명칭]
인간의 호흡기 합포체성 바이러스에 대한 당단백질 면역 단편을 함유하는 키메라(chimeric) 당단백질
[발명의 상세한 설명]
[발명의 분야]
본 발명은 인간의 호흡기 합포체성 바이러스(human respiratory syncytial virus, HRSV)에 대해 바이러스 특이성 면역 반응을 일으키는데 유용한, 신규의 카메라 당단백질을 암호화하는(encoding) DNA 조성물에 관한 것이다. 이 DNA 조성물은 당단백질을 암호화하는 구조 유전자와 이 구조 유전자를 함유하는 발현 및 복제 플라스미드를 포함한다. 또한, 상기 DNA 조성물로 형질전환된 숙주 세포, 당단백질로부터 제조한 백신 및 상기 백신을 접종하므로써 인간을 보호하는 방법이 본 발명의 일부로 포함된다.
[발명의 배경]
HRSV는 1956년에 발견되어 전세계에 널리 존재한다. HRSV는 특히 유아 및 소아에게서 상부 및 하부기도 질환을 유발시킨다. 급성 기도 질환으로 입원한 소아의 약 30%가 호흡기 합포체성 바이러스 감염증이있다. 이 질병은 이보다 나이가 많은 어린이나 성인에게 보다 덜 심각하며, 유아에게는 중증으로 종종 입원치료가 요구된다.
호흡기 합포체성 바이러스로 인한 감염은 기도의 모든 분절에 관계하며, 보통 열, 기침, 콧물 및 피로를 동반하고, 임상적으로는 기관지염, 기관지초염, 폐렴, 크루프(croup), 또는 바이러스성 감염증으로 진단된다. 이보다 나이가 많은 어린이나 성인에게 바이러스는 일반적으로 상부 기도에서의 복제에 국한된다. 상기 바이러스가 유아의 폐에까지 미치는 경우, 보다 더 증세가 심각해질 수 있다. 폐 손상은 영구적일 수 있다.
호흡기 합포체성 바이러스로 인한 최초의 감염은 어릴때, 보통 4세 미만에서 발생한다. 어린이들 사이에는, 이 바이러스에 의해 야기되는 질병이 매년 적어도 한번 폭발적으로 발생하여 수개월간 지속되는 경향이 있다. 유행 기간은 일반적으로 3 내지 5개월간으로 뚜렷히 구별이 된다. 가계연구에 의하면, 저학년의 어린이가 종종 집으로 바이러스를 들여와 가족중의 더 어린 가족원에게 더 심하게 감염시키는 것으로 밝혀졌다. 감염의 임상 결과에 의하면 첫번 경험때 가장 증세가 심하며 면역학적으로 경험이 있는 보다 나이 많은 사람에게서는 보다 증세가 약해진다.
호흡기 합포체성 바이러스의 2차적인 작용은 비외견상 감염에서부터 심한 폐렴 및 사망에 이르기까지 다양할 수 있다. 기도 염증은 대부분의 증상의 원인이 될 수 있다. 대부분의 경우, 일생을 통해 존속되는 것으로 보이는 항체의 생산으로 완전히 회복하는데 1주 내지 3주가 걸린다. 미합중국에서는 1세 유사의 약 30% 및 5세 어린이의 95%가 퍼져있는 호흡기 합포체성 바이러스 항체를 갖는다. 항체를 가진 유아, 어린이 및 성인에게 있어서 재감염은 대부분 감기형태의 가벼운 상부 호흡기 질환으로 나타난다.
세포 배양물에서 바이러스의 수율이 낮은 것이 HRSV 연구의 장애요인이었지만, 이 바이러스는 충분히 연구되어 왔다. HRSV는 1개의주로모노시스트론성(monocistronic)인 메신저(messenger)에 전사되는, RNA의 네가티브 1본쇄를 함유하는 파라믹소바이러스(parpmyxovirus)이다. 상기 메신저는 분리하여 실험실에서 번역되었다. 이 생성물은 겔 전기영동, 펩티드 지도화 및 면역 침전에 의해, 비리온(virion)에서 분리한 구조단백질과유사한것으로특징지워졌다.구조단백질은주요뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 단백질(N : 분자량 대략 42,000), 뉴클레오캡시드 인단백질(P분자량대략34,000), 거대 뉴클레오캡시드 단백질(L : 분자량 대략 200,000), 인벨로프 매트릭스(envelope matrix) 단백질(M : 분자량 대략 26,000), 매트릭스 당단백질(대략 22,000) 및 2개의 인벨로프 당단백질, 융합 당단백질(F : 분자량 대략 68,000 내지 70,000) 및 제2의 메티오닌이 부족한 당단백질(G : 분자량 대략 84,000 내지 90,000)을 포함한다. 또한, 약 9,500달턴(dalton)의 바이러스가 암호화한 단백질과 기타 적은 분자량의 단백질이 감염 세포에 존재하는 것으로 콜린스(Collins) 등의 문헌(참고로 본 발명에 인용함)에 나와있다[참조문헌 : Identification of a tenth mRNA of HRSV and assignment of polypeptides to the 10 viral genes, J. of Virol. 49 : 572-578(1984)]. HRSV의 분자 생물학을 기술하는 연구들은 예를들면 또한 하기에 기술된 연구가 포함된다:
(1) F 당단백질의 유전자 서열을 나타내는 콜린스 등의 문헌[Nucleotide Sequence of the gene encoding the fusion(F) glycoprotein of human respiratory syncytial virus, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81 : 7683-7687(1984년 12월)] ;
(2) 1A 단백질의 유전자 서열을 나타내는, 콜린스 등의 문헌[The 1A Protein Gene of Human Respiratory Syncytial Virus : Nucleotide Sequence of the mRNA and a Related Polycistronic Transcript, Virology, 141 : 283-291(1985)] ;
(3) 22K 단백질의 유전자 서열을 나타내는, 콜린스 등의 문헌[The Envelope-Associated 22K Protein of Human Respiratory Syncytial Virus : Nucleotide Sequence of the mRNA and a Related Polytranscript, Virology, 141 : 283-291(1985)] ;
(4) G 당단백질의 유전자 서열을 나타내는, 콜린스 등의 문헌[Nucleotide sequence of the G protein gene of human respiratory syncytial virus reveals an unusual type of viral membrane protein, Proc. matl. Acad. Sci., USA, 82 : 4075-4079(1984년 6월)] ; 및
(5) 단백질의 유전자 서열을 나타내는 콜린스 등의 문헌[Correct Sequence for the Major Nucleocapsid Protein mRNA of Respiratory Syncytial Virus, Virology, 146 : 69-77(1985)].
HRSV의 F 및 G 당단백질은 다른 파라믹소바이러스에서도 유사한 상당물을 갖는다. HRSV와 같이, 다른 파라믹소바이러스는 세포막의 융합과 관련된 F 당단백질을 갖는다[문헌 참조 : 피, 더블유, 쇼핀(P.W.Choppin)과 에이, 쉴드(a, Scheid)의 Rev. Infect. Dis. 2 : 40-61, 1980) ; 메르쯔(Merz) 등의 J. Exp. Med. 151 : 275-288(1980)]. 활성 파라믹소바이러스 F 단백질은 세포의 포르테아제에 의한 특이한 내부 분열에 의해 불활성 전구체(Fo)로부터 발생된, 디설파이드로 연결된 2개의 소단위 F1과 F2로 구성된다.[문헌 참조 : Scheid and Choppin, Virol. 80 : 54-66(1977)]. 대부분의 파라믹소바이러스에서 두번째로 주요한 당단백질을 HN 단백질이라 부르는데, 이는 상기 바이러스의혈구응집소및뉴라미니다제(neuraminidase)의 활성과 관련이 있다. 상기 HRSV G 단밸질은 상기 효소 활성 갖지 못하지만, G 및 HN 당단백질은 바이러스의 부착과 관계가 있다. 또한, 이들 당단백질은 이들이 그들의 아미노-종결점에서 색다른 소수성 신호/앵커(anchor) 지대를 갖는다는 점에서 구조적으로 유사하다고 문헌(Wertz, et al., PNAS 82 : 4075-4079(1985) : Elango, et al., j. Virol. 57 : 481-489(1986)]에 나와있다.
현재 효과적으로 HRSV를 퇴치할 수 있는 어떠한 백신도 구입할 수 없다. HRSV에 효과적인 백신을 얻고자 여러차례 시도해 왔다.프리드왈드(Friedwald)등은문헌[Journal of the American Medical Association, 204 : 690-94(1968년 5월 20일)]에 소의 태아(embryonic) 신장 조직 배양물에서의 호흡기 합포체성 바이러스 전파를 기술하고 있다. 34℃ 또는 28℃에서 생육한 바이러스는 감염성 또는 독성이 감소되지 않았다. 26℃에서 생육한 HRSV는 성인의 경우 감염성이 감소하지만, 이 바이러스는 한정된 감염성을 가지며 불충분한 면역성을 갖기 때문에 성인의 감염 예방에 사용할 수 있는 것으로 생각될 수 없었다.
김(Kim) 등은 문헌[Prediatrics, 48 : 748-755(1971년 11월)]에서, 26℃에서 생육한 바이러스로부터 제조한 불활성화시킨 호흡기 합포체성 바이러스 백신이 6개월 내지 13세살의 유아 및 어린이에게서는 높은 수준의 혈청 항체의 발생을 촉진시키지만 감염을 예방하지는 못했다고 공개하고 있다.
맥킨토쉬(McIntosh) 등은 문헌[Pediatric Research, 8 : 689-696(1974)]에서 실험용의 살아있는 호흡기 합포체성 바이러스 백신 2가지를 기술하고 있는데, 하나는 26℃에서 생육한 바이러스로부터 제조하고, 다른 하나는 32℃에서는 잘 생육하지만 37℃이상에서는 전혀 생육하지 않은 감온성 돌연변이체로부터 제조한 것이다. 첫번째 백신은 백신주사와 공격사이의 간격이 4개월 이상일때 감염을 예방하지 못하기 때문에 만족스럽지 못하다. 또한 두번째 백신은 백신주사를 맞은 일부 사람에게서 백신의 온도 감성이 또렷이 상실되는 점에서 만족스럽지 못하다.
크레이그헤드(Craighead)는 1966년에 여러 연구 그룹들이 조직 배양물에서 생육한, 포름알데하이드 처리, 알룸(alum)-침전시킨 바이러스를 유아 및 소아에게 시험했음을 문헌[Journal of Infection Disease, 131 : 749-753(1975년 6월)]에 나타냈다. 차후에 야생 바이러스에 노출시키면, 백신 수용자들은 강화된 유형의 기도 질환을 나타낸다. 크레이드헤드 포름알데하이드 처리 바이러스로의 면역법이 질환의 중증도를 악화시킨다고 결론지었다.
라이트(Wright) 등은 감온성의 살아있는, 약화시킨 호흡기 합포체성 바이러스 백신을 유아에게 평가시험했음을 문헌[Journal of Pediatrics, 88 : 931-936(1976년 6월)]에 나타냈다. 이 백신을 모든 혈청음성 유아를 감염시키기에 충분한 투여량으로 투여하는 경우 이 백신은 완화된 상부 기도 질환을 야기시키지만, 투여량을 낮추면 허용할 수 있는 수준의 감염성을 얻지 못했다. 또한, 백신주사를 맞은 어떤 사람에게는 감온성을 상실하는 증후가 있기 때문에 이 바이러스는 유전적으로 불안정하였다. 자연적인 병 및 백신을 맞은 사람중에서 발생된 재감염을 이 백신으로 상승시킨 어떤 증거는 없었다.
미합중국 특허 제4,122,167호 및 제4,145,252호는 인간의 2배체 폐 섬유 아세포를 연속 통과시키므로써 비리온을 약화시키는방법을 기술하고 있으며,미합중국특허제4,517,304호는 배양물에서 생육된 감수성 세포의 세포막 위에서 면역학적으로 활성이 있는 HRSV 단백질의 제조방법을 기술하고 있다. 이어서 이 세포를 숙주에 주입하여 면역반응을 일으킨다.
[정보 공개서]
재조합 우두종 바이러스 발현 시스템은 HRSV의 G 및 F 당단백질을 독립적으로 발현시키는 것으로 문헌[Ball, et al, Expression of the Major Glycoprotein G of Human Respiratory Syncytial Virus from Recombinant Vaccinia Virus Vectors, P.N.A.S., USA, 83 : 246-250(1986) 및 Olmsted, et al., Expression of the F Glycoprotein of Respiratory Syncytial Virus by a Recombinant Vaccinia Virus : Comparison of the Individual Contributions of the F and G glycoproteins to Host Immunity, P.N.A.S., USA, 83 : 7462-7466(1986)]에 공지되어 있다. 상기 2개의 당단백질은 또한 살아있는 HRSV 바이러스 공격에 대해 포유동물을 면역 예방시키는 것으로 문헌에 나와있다. : [Stott, et al., Human Respiratory Syncytial Virus Glycoprotein G Expressed from Recombinant Vaccinia Virus Vector Protects Mice Against Live-virus Challenge, Journal of Virology 67 : 607-613(1986) ; Walsh, et al., Immunization with Glycoprotein Subunits of Respiratory Syncytial Virus to Protect Cotton Rate Against Viral Infection, Journal of infectious Diseases, 1198-1204(1987) ; Wertz, e al,. Expression of the Fusion Protein of Human Respiratory Syncytial Virus from Recombinant Vaccinia Virus Vectors and Protection of Vaccinated Mice, Journal of Virology, 293-301(1987) ; Elango, at al., Resistance to Human Respiratory Syncytial Virus(RSV) Infection Induced by Immunization of Cotton Rats with a Recombinant Vaccinia Virus Expressing the RSV G Glycoprotein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1906-1910(1986)].
[발명의 요약]
본 발명은 인간의 호흡기 합포체성 바이러스 당단백질 F 및 G로부터의 면역단편 하나 이상과 신호서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 또한 본 발명은 이 단백질의 백신으로서의 용도, HRSV 관련 질환의 예방방법 및 재조합 기술을 사용하는 이 단백질의 제조방법을 그 일부로 포함한다.
[발명의 상세한 설명]
하기에는 정의한 용어를 본 명세서에서 사용한다. 세포 배양물은 세포가 원래의 식물 또는 동물 밖에서 생존할 수 있도록 다세포 식물 또는 동물로부터 유도한 세포를 성장시키는 용기를 말한다. 하향스트림(downstream)이란 용어는 발현하는 방향으로 서열이 더 멀리 진행함으로 나타낸다; 예를들면, 암호화 지대는 개시 코돈으로부터 하향스트림한다. 미생물이란 세균, 방선균 및 효모와 같은 단세포 원핵생물 및 진핵생물 모두를 포함한다. 오페론(operon)이란 구조유전자, 조절유전자 및 조절유전자의 산물이 인식한 DNA 중의 조정성분을 포함하는 유전자 발현 및 조절의 완전한 단위이다. 플라스미드란 자율적으로 자기 복제하는 염색체 외부의 원형 DNA를 말하며 발현 및 비발현 타입을 모두 포함한다. 발현 플라스미드가 재조합 미생물 또는 세포 배양물에 기생하는 것으로 기술된 경우에, 발현 플라스미드란 용어는 염색체외 원형 DNA 및 숙주 염색체에 혼입된 DNA를 모두 포함한다. 플르스미드가 숙주세포에 의해 유지되는 경우, 이 플라스미드는 체세포분열시 자율구조로 또는 숙주 게놈(genome)의 혼입부분으로 세포에 의해 안정하게 복제된다. 프로모터란 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라제의 결합에 포함되는 DNA 지대이다. DNA 서열이란 뉴클레오티드 염기, 아데노신, 티미딘, 시토신 및 구아노신으로 구성된 1본쇄 또는 2본쇄 DNA 분자를 말한다. 본질적으로 순수한이란 원하는 재조합 키메라 당단백질과는 다른 어떠한 파라믹소바이러스 단백질로 함유하지 않는 단백질 조성물을 말한다. 본질적으로 순수한 단백질이 낮은 수준의 숙주세포 성분으로 오염될 수 있지만, 이 단백질은 파라믹소바이러스를 복제함으로써 생성된 구조 및 비구조 바이러스 단백질을 오염시키는 성분은 함유하지 않는다. 적합한 숙주란 재조합 플라스미드와 양립할 수 있는 세포 배양물 또는 미생물을 말하며 적합한 숙주는 플라스미드가 복제하고, 그의 게놈으로 혼입되거나 또는 발현되도록 허용한다. 상향스트립(upstream)이란 용어는 발현하는 방향과 반대방향으로 진행하는 서열을 나타낸다 ; 예를들면, 세균의 프로모터는 전사단위로부터 상향스트림이며, 개시코돈은 암호화 지대로부터 상향스트림이다.
본 발명은 다양한 공지방법에 의해 이룩할 수 있는 일련의 분자 유전자 조작을 수반한다. 이 조작은 단백질의 cDNA를 수득하고, 대장균중에서 cDNA를 클로닝(cloning) 및 복제하고 적합한 숙주에서 원하는 cDNA를 발현하는 것으로 요약할 수 있다. 다음의 설명은 단백질을 발현시키는데 사용할 수 있는 여러 방법을 상세히 설명한 것이며 이어서 바람직한 방법의 구체예를 나타낸다. 특정 폴리펩티드, 당단백질 FG에 대한 구체적인 서열과 염기의 번호를 붙힌 위치를 챠트 9에 나타낸다.
일반적으로 본 발명에서 필요한 명명법 및 일반적인 실험 방법은 문헌[Maniatis, et al., Molecular Clopning A Latoratory Manual, Cold Spring Harbor Labaratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982(Maniatis)]에서 찾을 수 있다.
모든 대장균 균주들을 루리아(Luria) 육즙(LB)[글루코즈, 디프코즈 안티바이오틱 매디움 #2(Difco's Antibiotic Medium #2) 및 글루코즈와 산-가수분해된 카제인 아미노산이 보충된 M9배지 함유]에서 성장시킨다. 항생물질에 저항성인 균주들을 마니아티스에 기재된 약물 농도에서 유지시켰다. 형질전환은 문헌[Rowekamp and Firtel, Dev. Biol., 79 ; 409-418(1980)]에 기재된 방법에 따라 수행했다.
모든 효소들은 제조업자들의 지시에 따라 사용했다. 형질 전환체는 문헌[Grunstein and Wallis, Methods in Enzymology, 68 : 379-388]에 기재된 바와 같이 콜로니 잡종화(colony hybridization)로 분석했다.
잡종화후, 탐침을 떼어놓고, 필터를 0.1% SDS, 0.2×SSC에서 각각 400ml씩 5번 교환하면서 총 3시간동안 세척했다. 필터를 완전히 공기건조시키고, 장치하여 -70℃에서 16시간동안 다음장치(Kodak X-OMATAR film and Dupont Cronex Lightening Plus intensifying screens)를 사용하여 방사선 사진을 찍었다.
플라스미드를 서열화시키기 위해, 마니티스에 나타낸 방법에 따라 정제된 플라스미드 DNA를 제조한다.
말단-표지된 DNA 단편을 제조하여 막샘과 길버트(Maxam and Gilbert)의 화학적 서열화 방법 및 문헌[Collins and Wertz, J. Virol. 54 : 65-71(1985)]에 기재된 변법에 의해 분석했다.
뉴클레오티드의 크기는 킬로베이스(kb) 또는 염기쌍(bp)중 어느 하나로 나타낸다. 이는 아가로즈 겔 전기영동에 의해 평가한다.
단백질의 발현을 달성하는 제1단계는 cDNA 클론으로부터 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 수득하는 것이다. 이어서, 이 서열을, 유전자의 전사를 명령할 수 있고 효과적으로 전사체를 번역하는 발현 플라스미드로 클로닝시킨다. cDNA 암호화 단백질을 수득하는 문헌에 의한 방법은 일반적으로, 마니아티스에 기재되어 있으며, 구체적으로는 문헌[Collins and Wertz, cDNA cloning and Transcriptional Mapping of Nine Polyadenylated RNAs Encoded by the Genome of HRSV, Porc. Natl. Acad. USA 80 : 3208-3212(1983)] 및 관련 문헌[Elango, N., et al., Resistance to Human Respiratory Syncytial Virus(RSV) Infection induced by Immunization of Cotton Rats with a Recombinant Vaccinia Virus Expressing the RSV G Glycoprotein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1906-1910(1986) 및 Olmstead R.A et al., Expression of the F Glycoprotein of Respiratory Synctyial Virus by a Recombinant Vaccinia Virus : Comparison of the Individual Contributions of the F and G glycoproteins to Host Immunity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7462-7466(1986)]에 기술되어 있다.
클론은 절단부위의 3' 말단에 dGTP의 호모 폴리머 트랙(tract)를 효소적으로 첨가한, PstI절단 pBR322에 cDNA를 삽입하므로써 제조했다. dCTP의 호모폴리머 트랙을 마니아트스에 기술된 방법에 따라 cDNA분자의 3'말단에 효소적으로 첨가했다. 클로닝 효율을 극대화시키기 위해서 이상적으로는 10 내지 30잔기를 갖는 dCTP 또는 dGTP를 가해야 한다. cDNA와 플라스미드를 함께 어닐링(annealing)시키고 대장균에 형질전환시킨다. 전 길이의 cDNA 함유 클론을 표지된 바이러스 cDNA 탐침 또는 상기 유전자 서열 부위와 상보적인 올리고뉴클레오티드에 의해 검출한뒤 제한 효소 분석 및 DNA 서열화를 수행한다.
올리고뉴클레오티드는 문헌[Needham-VanDevanter, et al., Nucleic Acids Res., 12 : 6159-6168(1984)]에 기재된 바와 같이 자동 합성기를 사용하고 문헌[Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters, 22(20) : 1859-1862(1981)]에 첫째로 기재된 고상 포스포르아미다이트 트리에스테르(solid phase phosphoramidite triester)방법에 따라 화학적으로 합성한다. 올리고뉴클레오티드의 정제는 천연 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 문헌(Pearson and Regnier, J. Chrom., 255 : 137-149(1983)]에 기재된 바와 같은 음이온-교환 HPLC에 의한다.
합성 올리고뉴클레오티드의 서열은 문헌[Maxam and Gilbert, Grossman and Moldave, eds., Academic Press, New York, Methods in Enzymology, 65 : 499-560(1980)의 화학적 분해(degradation)방법을 사용하여 입증할 수 있다.
원핵(prokaryotic) 시스템에서 클롬화된 유전자를 높은 수준으로 발현시키기 위해서는, 최소한, mRNA전사를 명령하는 강력한 프로모터, 전사 개시를 위한 리보좀 결합부위 및 전사 종결부위(terminator)를 함유하는 발현 벡타를 제작하는 것이 필수적이다. 이러한 목적에 적합한 조절지대를 예를들면 문헌[Yanofsky, Kelley and Horn, J. Bacteriol., 158 : 1018-1024(1984)]에 기재된 대장균 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터(operator) 지대와 문헌(Herskowitz and Hagen, Ann, Rev. Genet., 14 : 399-445(1980)]에 기재된 람다 파아지의 좌측 프로모터(PL)이다.
대장균에서 생산된 단백질은 시스테인 전기의 존재와 번역후 적당한 변형의 부족으로 인해 알맞게 접히지(folding) 못할 것이다. 대장균으로부터 정제하는 동안, 발현된 단백질은 먼저 변성된후 원형이 재현되어야만 한다. 이 과정은 대장균에서 생성된 단백질을 구아니딘 HCl에 용해시키고 모든 시스테인 잔기를 β-머캅토에탄올로 환원시킴으로써 수행할 수 있다. 이어서, 느린속도의 투석 또는 겔 여과에 의해 이 단백질을 원형 재현시킨다.(미합중국 특허 제4,511,503호).
단백질의 검출은 방사면역분석, 또는 웨스턴 블럿팅 기법(Western blotting techniques)또는 면역침전과 같은 이 분야에 공지된 방법으로 수행한다. 대장균으로부터의 정체는 미합중국 특허 제4,511,503호에 기재된 방법에 따라 수행할 수 있다.
효모에서 이종 단백질을 발현시키는 것은 잘 알려져 있으며 또한 문헌에 기재되어 있다. 효모에서 단백질을 생산하는데 사용된 여러가지 방법을 기술하는 잘 인식된 연구로는 문헌[Scherman, et al., cold Spring Harbor Laboratory, (1982)]에 기재된 방법(Methods in Yeast Genetics)이 있다.
효모에서 유전자를 높은 수준으로 발현시키기 위해서는, 원핵세포에서와 같은 유전자를 강력한 프로모터시스템에 연결시키고, 또 한 효모 유전자로부터 효율적으로 전사 종결/폴리아데닐화(polyadenylation) 서열을 제공하는 것이 필요하다. 유용한 프로모터를 예를들면, GAL1 10, [Johnston and Davis, Mol. and Cell. Biol., 4 : 1440-1448(1984)], ADH2, [Russell, et al., J. Biol. Chem. 258 : 2674-2682(1983)], PHO5, [EMBOJ, 6 : 675-680, (1982)], 및 MF1이 있다. Lue-2, URA-3, Trp-1 또는 His-3과 같은 선택적 표시유전자(marker)를 갖는 다복사(multicopy) 플라스미드도 또한 바람직하다. MF1 프로모터가 바람직하다.
MFI 프로모터는 교배형의 숙주에서는 구성성분이지만, a 교배형의 이배체 또는 세포에서는 구성성분이 아니다. 그러나 이것은 SIR 위치중 한곳에서 ts 돌연변이 하는 숙주세포에 대해 온도를 상승시키거나 또는 하강시키므로 조절할 수 있다. 35℃에서의 상기와 같은 돌연변이의 형 세포에 대한 효과는 a 교배형으로 암호화하는 통상적인 사일런트(silent) 유전자를 활성화시킨다. 사일런트 유전자가 a 교배형 유전자로 발현되면 이번에는 MFα1 프로모터가 불활성화 된다. 생육온도를 27℃로 낮추면 전체 공정은 역전된다. 즉, a 교배형이 불활성화 되고 MFα1이 활성화 된다.[Hrskowitz and Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Strathern, Jones, and Broach, eds., Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY, 181-209, (1982)].
폴리아데닐화 서열은 ASH1, MFα1, 또는 TPI와 같이 고도로 발현된 유전자중 어느 하나의 3'-말단 서열에 의해 제공된다.[Alber and Kawasaki, J. of Mol. and Appl. Genet. 1 : 419-434, (1982)].
YEP6, YEP14, YEP24와 같은 다수의 효모 발현 플라스미드를 벡타로 사용할 수 있다. 우리가 관심을 갖고 있는 유전자를 상기에서 언급한 프로모터중 어느하나에 융합시킨후, 여러 효모 숙주에서 발현하기 위해 플라스미드에 연결(ligate)시킬 수 있다. 이러한 플라스미드들은 문헌[Botstein, et al., Gene, 8 : 17-24, (1979) ; Broach, et al., Gene, 8 : 121-133, (1979)]에 충분히 기재되어 있다.
효모 세포를 형질전환시키는데 2가지 방법을 사용한다. 첫번째 방법은, 효모 세포를 효소절단효소(zymolyase), 용해효소(lyticase) 또는 글루술라제(glusulase)를 사용하여 원형질체로 먼저 전환시킨뒤 DNA 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)를 첨가한다. 이어서, PEG 처리 원형질체를 선택적 조건하에 3% 한천 배지에서 재싱시킨다. 이 방법에 대한 상세한 설명은 논문[Beggs, Nature(London), 275 : 104-109(1978) ; and Hinnen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 : 1929-1933(1978)]에 나와있다. 두번째 방법은 세포벽의 제거를 포함하지 않는다. 그대신, 염화리튬 또는 아세테이트 및 PEG로 세포를 처리하고 선택적 플레이트위에 놓는다.[Ito, et al., J Bact., 153 : 163-168, (1983)].
숙주세포 배양물을 형질전환시키는데 유용한 여러가지 발현 벡타에 cDNA를 연결시킬 수 있다. 모든 벡타는 단백질의 전사 및 번역을 개시할 수 있는 유전자 서열을 포함하며, 이는 형질전환될 숙주 세포와 양립할 수 있다.
또한, 벡터는 형질전환된 숙주세포를 선별하기 위해 표현 특징을 제공할 표시 유전자(예를들면, 디하이드로폴레이트(dihydrofolate) 환원효소 또는 메탈로티오네인(metallothionein)를 함유하는 것이 바람직하다. 또한 복제 벡터는 리플리콘(replicon)을 함유할 수 있다.
단백질을 생산하는데 유용한 세포 배양물을 예시하면 곤충 또는 포유동물 기원(origin)의 세포들이 있다. 포유동물 세포 시스템은 종종 단일 세포층 형태이지만 또한 포유동물의 세포 현탁액도 사용할 수 있다. 포유동물 세포주를 예를들면 VERO 및 HeLa 세포, 차이니즈 함스터 난소(Chinese hamster ovary, CHO)세포주, WI38, BHK, COS-7 또는 MDCK 세포주가 포함된다.
상기에서 나타낸 바와 같이, 숙주세포를 형질전환시키는데 사용된 벡터는 단백질의 유전 서열을 전자 및 번역 개시할 유전자 서열을 함유하는 것이 바람직하다. 이러한 서열을 발현조절 서열이라 부른다. 숙주 세포가 포유동물 또는 곤충기원의 세포일때, 유용한 발현조절 서열을 예를들면 SV-40 프로모터[Science, 222, 524-527(1983)], CMV I.E. 프로모터[Proc. Natl. Acad. Sci. 81 : 659-663(1984)] 메탈로티오네인 프로모터[Nature, 296 : 39-42(1982)] 또는 바큘로바이러스 폴리헤드린(baculovirus polyhedrin) 프로모터(곤충세포)[Virol., 131, 561-565(1983)]로부터 얻을 수 있다. 발현 조절 서열을 함유하는 플라스미드 또는 복제 또는 삽입 DNA 물질을, 제한 효소를 사용하여 절단하고 필요하거나 또는 원하는 크기로 조절하여 이 분야에 잘 알려진 방법에 의해 단백질을 암호화하는 cDNA와 연결시킨다.
효모와 같이 고등동물 숙주 세포를 사용한다면, 공지된 포유동물 유전자로부터의 폴리아데닐화 또는 전사종결 부위 서열을 벡터에 혼입시키는 것이 필요하다. 종결 부위 서열을 예를들면 소의 성장 호르몬 유전자로부터의 폴리아데닐화 서열이다.
소의 파필로마바이러스(papilomavirus)형-벡터에서 발견된 것과 같은, 숙주 세포의 복제를 조절하는 유전 서열을 벡터에 추가로 혼입시킬 수 있다[Saveria-Campo, Bovine papilomavirus DNA : aeukaryotic cloning vecter, DNA Cloning vol. Ⅱ-A practical approach, Glover. ed., IRL Press, Arlington, Virginia 213-238(1985)].
차이니즈 함스터 난소(CHO) 세포에서 단백질을 발현시키는데 유용한 발현 벡터로는, 대장균 및 CHO 세포 각각에서 표시 유전자로 암피실린 저항성 및 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자를 이용하여 CHO 및 대장균 세포에서 모두 복제하는 셔틀(shuttle) 벡터 pSVCOW7이 바람직하다. 플라스미드 pSVCOW7은 또한 CHO 세포에서 발현하는데 필요한 소의 성장 호르몬으로부터의 폴리아데닐화 서열도 제공한다. 플라스미드 pSVCOW7를 절단하여 바이러스 프로모터와 cDNA를 삽입한다.
곤충세포에서 단백질을 발현시키기 위해 재조합 바큘로바이러스를 생성하는데 유용한 발현 벡터로는 pAc373[Smith et al., Mol. Cell. Biol. 3 : 2156-2165(1983)]이 바람직하다. 이 플라스미드는 암피실린 저항성을 이용하여 대장균 세포를 복제하며 유전자를 발현시키기 위해 바큘로바이러스 폴리헤드린 유전자로부터 진핵성(eukaryotic) 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 제공한다. 플라스미드 pAc373을 절단하여 cDNA를 상기 프로모터에 인접하게 삽입한다. 이 새로운 플라스미드를 칼슘 포스페이트 침전에 의해 바큘로바이러스(오토그라파 칼리포니카(Autograpa californica) 다면성 비루스종) DNA와 함께 곤충세포에 형질감염시킨다. 동종 재조합에 의해 정주(定住, resident) 바이러스 폴리헤드린 유전자를 cDNA 함유 pAc373 폴리헤드린 유전자로 치환한 재조합 바큘로바이러스는 탐침으로서 32P-표지된 cDNA를 사용하여 도트 블럿 잡종화(dot blot hybridization)에 의해 검출한다[Summers and Smith, A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Inset Cell Culture Procedures, Texas A M University, College Station, TX, 29-30(1986)]. 또한 cDNA를 폴리헤드린 유전자로 삽입하면 폐색 생성 단백질의 합성이 방지되기 때문에 재조합 바큘로바이러스로 감염된 곤충세포는 이들의 폐색-네가티브 형태학으로 구별할 수 있다.
단백질을 발현시키기 위해 소의 유두종 바이러스(bovine papilloma virus, BPV)와 함께 사용한 발현 벡터로는 pTFW9가 바람직하다[플라스미드 pTFW9는 부다페스트 조약에 따라 기탁되었다. 플라스미드 pTFW9는 대장균 숙주에서 유지되며 노던 레져날 리써어치 센터(Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, USA)에 1986년 11월 17일 기탁되었으며, 지정된 수탁번호는 NRRL B-18141이다]. 이 플라스미드는 대장균에서 암피실린 저항성을 이용하여 복제하고 유전자의 발현을 위해 마우스 메탈로티오네인 프로모터 및 SV40 폴리아데닐화 신호를 제공한다. 플라스미드 pTFW9를 절단하여 cDNA를 프로모터에 인접하게 삽입한다. 이어서, 신규한 이 플라스미드를 절단하고 BPV를 삽입한다. 칼슘포스페이트 침전에 의해 재조합 플라스미드를 동물 세포에 형질감염시키고 형질전환된 세포의 병소(foci)를 선별한다.
숙주 세포는 외래 DNA를 받아들일 능력이 있거나(competent) 또는 여러 수단에 의한 형질감염시 외래 DNA를 받아들일 능력를 갖게 된다. DNA를 동물 세포에 도입하는 잘 알려진 방법이 여러가지 있다. 여기에는 칼슘포스페이트 침전, 수용체 세포와 DNA 함유 세균 원형질체의 융합, 수용체 세포를 DNA 함유 리포좀으로 처리하는 방법, 및 DNA를 세포로 직접 마이크로주입(microinjection)하는 방법이 있다. 형질 감염된 세포는 이 분야에 잘 알련진 방법으로 배양한다[Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Kuchler, Dowden, Hutchinsod and Ross, Inc., (1977)]. 상기 진핵성 발현 시스템중 하나에서 발현된 재조합 당단백질은 잘 알려진 기계적 또는 효소수단에 의해 숙주세포 시스템을 붕괴시킴으로써 생성된 세포 현탁액으로부터 분리한다. 당단백질을 정제하기 위해서, 당단백질과 특이적으로 결합하는 렌틸 렉틴(lentil lectin)컬럼에 세포질 단편을 먼저 작용하는 것이 편리하다. 이어서 용출된 당단백질을 항체를 함유하는 친화성 컬럼에 적용한다.
전형적인 당단백질은 3개의 지대로 나눌수 있다. 아미노 종결말단에 신호 서열이라 부르는 소수성 지대가 있다. 이 아미노산 서열을 당단백질을 세포막으로 운반하는 것을 나타낸다. 운반후, 신호 서열은 절단에 의해 제거된다. 신호 서열로부터의 하향스트림이 성숙한 당단백질의 세포외 영역이다. 여기에 항체가 접근할 수 있으므로, 이곳이 당단백질의 면역부위이다. 당단백질의 카복시 종결 말단에 당단백질을 세포막에 잔류시키는 소수성 앵커(anchor)지대가 있다. HRSV F는 아미노 종결 신호 서열과 카복시 종결 앵커 서열을 함유하는 전형적인 당단백질이다.[Collins, et al., PNAS 82 : 7683-7687, (1984)]. 그러나 HRSV G 당단백질은 그의 아미노 종결 말단이 신호 및 앵커 지대 모두로 작용하기 때문에 색다른 당단백질이다[Wertz, et al., PNAS 81 : 4075-7079, (1985)].
당단백질은 세포로부터 주위의 배지로 분비되도록 디자인될 수 있다. 이것은 앵커 지대를 전사하기 전에 당단백질을 조기 종결시킴으로써 이룩한다.(Lasky, et al., Biotechnoligy, 2 : 527-532(1984)]. 일반적인 번역 종결부위 올리고뉴클레오티드를 유전자 DNA의 적당한 부위에 삽입시키므로써 조기 종결을 이룩할 수 있다. 이 올리고뉴클레오티드는 상업적으로 구입할 수 있다. 또한 판독 플레임(reading frame)을 변화시킴으로써 번역 종결 코돈을 발생시켜 조기 종결시킬 수 있다.
하기에 기술하는 키메라 당단백질은 HRSV G의 세포외 영역과 HRSV F의 신호영역 및 세포의 영역을 연결시킨 것으로 이루어지며 이를 FG라 부른다. G 당단백질의 세포외 영역의 대부분은 Dde I(뉴클레오티드 위치 302) 및 FoK I(뉴클레오티드 위치 850) 제한 효소 부위에 의해 결정되는 (spanned) 암호화 지대내에 포함된다. 이 서열은 당단백질의 신호/앵커 지대를 암호화하지 못한다. F 당단배질의 세포외 영역의 대부분은 Nsi I(뉴클레오티드 위치 1479) 제한 효소 부위 앞의 암호화 지대내에 포함된다. 이 서열은 신호 지대와 항원 지대의 대부분을 암호화하지만, 당단백질의 앵커 지대는 암호화하지 못한다.
G 당단백질 서열을 F 당단백질에 삽입시키기 위해, HRSV gpG 함유 플라스미드 G-16를 Dde I 및 FoK I로 절단하고 말단을 클레노우(klenow) 폴리머라제로 평활하게 만든다. 이어서 550bp 단편을 아가로즈 겔 전기영동으로 분리한다. HRSV gpF 유전자 함유 플라스미드 pGPF-4를 Nai I으로 절단한다. 말단을 T4 DNA 폴리머라제로 평활하게 만들고 세균성 알카리 포스파타제로 탈인산화 했다. 이어서 G-16으로부터의 550bp 단편을 pGPF-4 플라스미드와 연결하고 대장균 HB101에서 형질전환시킨다. 막샘-길버트 서열화에 의하면 형질전환으로부터 분리된 클론중 하나인 pGPFG-1은 정확하게 연결된 것으로 입증되었다.
상기에서 언급한 FG 유전자를 진행 발현 벡터에 적절히 놓으면, FG 유전자는 세포의 표면으로 운반되어 배지에 분비될 수 있는 키메라 당단백질을 발현하도록 고안되어 있다.
상기 제한 효소 부위들이 많은 부분의 F 및 G 당단백질 관련지대를 발현시키기 때문에 이 부위들을 선택했다. 그러나 상기 유전자 융합시에 F 및 G 암호화 서열내의 다른 제한 효소 부위를 선택함으로써 다른 부분의 당단백질을 발현시킬 수 있었다. 예를 들면, gpG 유전자의 5' 말단을 전달하는데 제한 효소 Alu I, Hinc II, 또는 Hinf I 을 사용할 수 있었다. gpG 유전자의 3' 말단을 절단하는데 제한 효소 Hph I, Mbo II 또는 XhoII를 사용할 수 있었다. 효소는 각각의 그룹으로부터 나온 하나의 효소를 2개로 조합하여 면역 단백질 단편을 얻는데 사용할 수 있었다. gpF 유전자의 경우, Hinf III, Hinc II, Ava II, Ssp I 또는 Hph I 제한 효소를 Nsi I 대신에 사용할 수 있었다. 접합 지대에서 판독 프레임을 보정하는데 링커 올리고뉴클레오티드를 첨가할 수 있었다. 2개의 가능한 프레임 이동(frame shift)을 보정할 수 있는 2개의 올리고뉴클레오티드는 하기의 Sal I 연결효소(상업적으로 구입할 수 있음)이다.
G G T C G A C C 및 C G G T C G A C C G
C C A G C T G G G C C A G C T G G C
또한 당단백질에서 앵커 지대가 필요하다면, gpF 앵커 지대를 합성하기 위해서 두번째 접합점에서 링커 올리고뉴클레오티드를 첨가한다. 다른 방법으로는 여러 서열을 삽입하거나 결실(deletion)시켜 FG 융합 단백질을 발현하도록 고안할 수 있었다. 이 단백질의 주요 기준(criterion)은 상기 두가지 당단백질의 면역학적으로 중요한 지대와 신호서열의 보유에 있다.
FG 유전자를 CHO, BPV, 또는 바큘로바이러스 발현 벡터에 삽입하는 것은 이미 기술한 바와 같다.
FG 키메라 당단백질은 개개의 당단백질을 발현하는 것보다 이점이 있다. FG는 단일 단백질이기 때문에, 별개의 F 및 G 당단백질에 비해 정제하는데 노동력과 시약이 절반으로 든다. 또한, FG 키메라 당단백질은 정제하기 편리하게 배지에서 분비된다. 앵커 지대 서열 앞에서 절단(truncation) 시킴으로써 F 당단백질을, 분비된 당단백질로 엔지니어링할 수 있다. 그러나 HRSV G 당단백질은 그의 아미노 종결 말단에서 신호/앵커 지대를 함유한다. 그러므로, 이 당단백질의 절단은 분비된 형태의 것을 생성하지 못한다. 신호/앵커 지대를 외래 당단백질의 신호 지대로 치환할 수 있지만, 이는 외래 단백질 서열을 가능성 있는 백신으로 도입시킬 것이다.
유두종 바이러스 발현 시스템을 사용하여 HRSV F 및 G 당단백질을 발현시켜 HRSV 감염으로부터 코튼(cotton) 래트를 보호하는데 백신으로 이 재조합 바이러스를 사용할 수 있다.[Olmsted, et al., PNAS 83 : 7462-7466, (1986)]. F 당단백질을 발현시키는 유두종 바이러스는 G 당단백질을 발현시키는 유두종 바이러스보다 훨씬 더 면역성이 있으며, 보다 우수한 보호력을 제공했다[Olmsted, et al., PNAS 83 : 7462-7466, (1986)]. 2개의 바이러스로 백신 주사하면 상기 올름스테드 등의 문헌에 기재된 바와같이 F 발현 바이러스 단독 이상의 추가 효과를 나타내지 못했다. 대조적으로, 분비된 FG 당단백질은 F 당단백질의 분비된 형태보다 더 면역성이 있고 보다 우수한 보호력을 제공했다. 또한 FG 단백질을 코튼 래트에 백신주사하면 보다 더 높은 백분율로 중화 항체를 생산했다[ELISA에서 중화비율로 정의함].
FG와 절단한 F(Ft)의 면역성을 비교하도록 실험을 고안했다. 재조합 당단백질을 ConA(당단백질과 결합하는 렉틴)에서 검출할 수 없었기 때문에, SDS-PAGE 겔 전기영동시킨 단백질을 코마씨 블루(Commassie blue) 염색함으로써 추출물(아마도 단백질 1%미만)을 정제시키는 간접방법을 당단백질의 당량측정에 사용했다. 샘플내의 FG 및 Ft의 상대적 함량을 측정하기 위해, SDS-PAGE 겔에서 전기영동시킨 35S-메티오닌 표지 단백질을 함유한 자기방사선진단의 음영농도계측기로 추적했다(FG 및 Ft는 같은 수의 메티오닌을 함유한다). 이어서 같은 샘플을 ELISA로 검정했는데 ELISA 분석에서는 FG의 당량이 Ft보다 3배 더 우수하게 반응하는 것으로 측정되었다. 이어서, 백신주사를 위해 준비한 샘플에서 FG 또는 Ft의 양을 ELISA로 측정하여 상기 비율에 따라 균등하게 했다. 실험에서 각 그룹은 FG, Ft(높은 투여량), Ft(낮은 투여량), 및 gp50(네가티브 대조물)이었다. 코튼 래트에 프로운드(Freund) 보조제중의 단백질 총 500㎍/투여량을 3번 백신주사했다. FG 그룹에서 특정 당단백질의 함량은 Ft 그룹(낮은 투여량)과 같았다. Ft 그룹(높은 투여량)은 3배 더 많은 특정 당단백질을 수용했다. 이 연구로부터 나온 데이타를 요약하여 하기에 나타낸다.
상기 실험은 프로운드 보조제 중의 FG조(粗) 체제를 사용하여 키메라 FG 당단백질의 효율을 입증한 것이다. 높은 역가로 중화 항체를 유도하는 FG의 효율 및 RSV 공격으로부터 코튼 래트를 보호하는 FG의 효율을 측정하기 위해, 인간에게 사용할 수 있는 보조제(알룸)에서 제형화한, 보다 더 정제시킨 FG 제제를 사용하여 실험을 수행했다. FG는 양이온 교환 및 모노클론 항체 친화성 컬럼을 포함하는 2단계 과정을 이용하여 50%의 균질도로 정제했다. Ft 당단백질은 렌틸 렉틴 크로마토그래피한 후 모노클론 항체 친화성 크로마토그래피하여 50%의 균질도로 정제했다. 알룸(2.5mg 알룸/투여량)에 흡착시킨 상기 당단백질을 코튼 래트에 2번 백신주사했다. 한 그룹의 래트에게 양성(positive) 대조물로서, 살아있는 RSV를 코속으로 백신주사했다. 또 한그룹의 래트에세는 음성(negative) 대조물로서 알룸 보조제를 백신주사했다. 각 그룹의 래트를 혈청과 중화 항체에 대해 시험했다. 래트에 RSV를 공격하고 바이러스에 대해 폐를 검정했다.
차트 1 내지 6에서 플라스미드 및 단편을 나타내기 위해 사용한 약정들은 플라스미드 및 이들의 단편에 대해 통상적으로 원형으로 표시하는 것과 같은 의미를 나타낸다. 원형으로 표시된 것과는 달리, 챠트상의 일직선 표시는 왼쪽에서 오른쪽(5'에서 3'으로)으로 일어나는 개시 또는 전사와 함께 원형 및 선형 2본쇄 DNA를 모두 나타낸다. 별표(*)는 원형의 플라스미드를 완성하기 위해 뉴클레오티드가 가교결합함을 나타낸다. 단편은 이들이 2본쇄 DNA의 선형 조각이기 때문에 별표 표시가 없다. 엔도뉴클레아제 제한 효소는 선위에 나타낸다. 표시유전자(gene marker)는 선아래에 나타낸다. 플라스미드 또는 단편을 나타내는 도표밑에 나타낸 세로줄은 DNA의 2점 사이의 염기쌍 숫자를 나타내는데 사용한다. 특이한 유전형질 사이의 상대적인 공간은 실제거리가 아니라 단지 도시한 DNA 서열상의 상대적 위치를 나타낸다.
[실시예들]
[실시예 Ⅰ]
F 당단백질 유전자로부터 G-C꼬리의 제거
F 당단백질의 최대발현을 얻기 위해서는, cDNA를 플라스미드, pBR322에 삽입하는데 사용한 G-C 뉴클레오티드를 cDNA의 5'말단(원래의 mRNA와 관련된)으로부터 제거해야 한다. CHO 세포용의 바람직한 발현벡터인 pSVCOW7(후술함)에 gpFG cDNA를 편리하게 삽입하기 위하여, 단백질 암호화 서열로부터의 BamH I 부위 상향스트림을 제공할 필요가 있다. 이를 수행하기 위해서는 F 당단백질을 cDNA를 pUC12(PL Pharmacia Labs, Piscataway, NJ)에 삽입한다. F 당단백질에 대한 전체서열을 함유하는 cDNA 클론 F5-25의 합성방법은 문헌[Collins, et al., Nucleotide sequence of the gene encoding the fusion (F) glycoprotein of human respiratory syncytial virus, J. Virol., 81 : 7683-7687(December 1984)]에 기재되어 있다.
A. pGPF2의 제작-챠트 1
F 당단백질의 cDNA를 Pst I 부위로 플랭크(flank) 시켰으나(챠트 1), 내부 Pst I 부위들도 있었다. 그러므로 플라스미드 pF5-25를 Pst I로 부분절단시키고 단편 1(1.9kb)을 겔로부터 단리시켰다. Pst I로 절단시킨 플라스미드 pUC12(Bethesda Res. Labs., Rockville, MD)와 단편 1을 연결시켰다. pUC12의 Xba I부위에 인접한 gpF 유전자의 5'말단을 갖는 플라스미드를 선별하여 pGPF2(4.6kb)라 부른다. 이 배향(orientation)은 약 400bp의 단편을 생성시키는 Nsi I 및 Hind III으로의 절단에 의해 확인되었다.
B. pGPF3 및 pGPF4의 제작-챠트 2
cDNA의 5' 말단으로부터 G-C 뉴클레오티드를 제거하기 위해 pGPF2를 Xba I로 절단개환시키고 말단들을 세균성 알칼리 포스파타제로 처리하여 단편 3을 얻었다. 이어서, Xba I 부위와 Pst I 부위사이를 소편으로 절단시키는 Sal I로 단편 3을 절단하고 클레노우(Klenow) 효소로 처리하여 말단들을 평활(flush)하게 만들었다. 클레노우 효소로 처리한후, 5' 포스페이트를 필요로 하고 3'돌출부로 남기는 람다 엑소뉴클레아제로 단편 3을 절단시켰다. gpF로부터 말단 상향스트림상의 5' 포스페이트를 제거했기 때문에 엑소뉴클레아제는 gpF 서열의 하향스트림을 절단할 것이다. 충분한 시간동안 엑소뉴클레아제가 G/C 꼬리 지대너머의 뉴클레오티드를 선도서열로 제거하도록 한다. 선도 서열의 처음 15개 염기를 함유하는 합성 서열 단편 3으로 잡종화시키고, 빠진 염기들을 클레노우 효소로 채우고, 말단을 T4 연결효소로 연결시켜 pGPF3(4.6kb)을 수득하고 이를 대장균(E. coli)에 형질전환시킨 다음 그의 서열을 확인하였다.
cDNA의 3' 말단으로부터 G-C 뉴클레오티드를 제거하기 위해 pGPF3을 Hind III으로 절단개환시키고 충분산 시간동안 엑소뉴클레아제 Bal31로 처리하여 G-C 뉴클레오티드를 통해 절단시켰다. 클레노우 효소로 말단을 평활하게 만들고, cDNA 클론을 BamH I 로 절단시켜 벡터 DNA로부터 유리시켰다. cDNA 단편을 겔로부터 단리시키고, BamH I 및 Hinc II(Hinc II는 평활말단에 사용할 수 있다)로 절단시킨 플라스미드 pUC12와 연결시켜 pGPF4를 수득했다. 이 플라스미드를 대장균에 형질전환시키고 Bal31로 충분히 절단시킨 적절한 클론을 서열화로 확인하였다. 다른 방법으로는, G-C 뉴클레오티드로부터의 독특한 부위 상향스트림을 갖는 제한효소로 절단시켜 G-C뉴클레오티드를 제거할 수 있다. gpF의 경우 그러한 효소가 HaeIII일 것이다. HaeIII 은 F 유전자의 보통 번역종결 신호로부터의 신호로부터의 상향스트림을 절단하기 때문에, 보편적인 번역종결 올리고뉴클레오티드(New England Biolabs)는 HaeIII으로 절단시킨후 F cDNA 상에 연결시킨다. 이어서, DNA를 BamH I로 절단시키고 pGPF-4를 생성하기 위한 상술해 바대로 처리한다.
[실시예 2]
HRSV 키메라 FG 당단백질 유전자의 제작-챠트 3
A. HRSV G 당단백질 유전자의 제조
HRSV G 당단백질에 대한 전체 암호부위를 함유하는 클론 G2B-16이 문헌[Wertz, et al., Nucleotide sequence of the G protein gene of human respiratory syncytial virus reveals an unusual type of viral membrane protein, PNAS, 82 : 4075-4079(1985)]에 기재되어 있다. G 당단백질 cDNA를 함유하는 클론 G2B-16을 Dde I 및 Fok I로 절단시키고, 대장균 DNA 폴리머라제로 말단을 평활하게 만들었다(클레노우단편). 이어서, DNA를 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동시켰다. G 유전자의 관련부위를 함유하는 550bp 단편(단편 4)을 겔로부터 잘라내어 이 DNA를 아가로스로부터 정제하였다.
B. G cDNA 단편의 HRSV F 당단백질 유전자로의 삽입
플라스미드 pGPF4(챠트 2)를 Nsi I로 절단시켰다. T4 DNA 폴리머라제로 말단을 평활하게 만든다음 세균성 알카리 포스파타제로 탈인산화시켰다. 이어서 G cDNA의 550bp 단편을 플라스미드 pGPF4에 연결시켜 키메라 FG유전자(pGPFG-1)를 수득했다. 이 플라스미드를 대장균 HB101에 형질전환시켰다. 클론을 단리시키고, 875bp 및 186bp 접합 단편을 생성시키는 Hinf I로 절단시킴으로써 F 유전자내에서 옳은 배향의 G cDNA를 선별하였다. 틀린 배향의 G 단편은 Hinf I로 절단시킴으로써 F 유전자내에서 옳은 배향의 G cDNA를 선별하였다. 틀린 배향의 G 단편은 Hinf I 절단후 650bp 및 400bp의 접합 단편을 생성할 것이다. 이어서, 적절히 배향된 클론의 접합지대가 옳은 것으로 막샘-길버트(Maxam-Gilbert) 서열화에 의해 확인되었다.
상기 실시예는 G 당단백질의 면역지대에 연결된 F 당단백질의 신호 및 면역지대를 함유하는 키메라 당단백질에 대해 암호화한 유전자를 생성할 것이다. 두번째 접합부(G에서 F로)가 프레임 이동(frame shift) 및 번연종결을 야기시키므로 당단백질에는 앵커지대가 없을 것이다.
[실시예 3]
HRSV 키메라 FG 당단백질의 판독 프레임을 조절하기 위한 DNA 올리고뉴클레오티드 링커의사용-차트 4
실시예2에 제시된 제한효소 이외의 제한효소를 F 및 G 유전자의 연결에 사용하는 경우 F와 G 사이의 첫번째 접합부에서 프레임 이동이 일어나 시기상조의 당단백질 번역종결이 일어난다. 이는 옳은 판독프레임을 복구시켜주는 올리고뉴클레오티드 링커를 사용함으로써 극복할 수 있다.
A. HRSV G 당단백질 유전자의 제조
G 당단백질 cDNA를 함유하는 클론 플라스미드 G2B-16을 Hph I로 절단시키고 T4 DNA 폴리머라제로 말단을 평활하게 만들었다.
Sal I
C G G T C G A C C G
G C C A G C T G G C
(New England Biolabs)를 DNA의 말단에 연결시켰다. DNA를 Sal I로 절단시키고 1.5% 아가로서 겔에서 전기영동시켰다. G 유전자의 관련지대를 함유하는 410bp 단편(단편 5)을 겔로부터 잘라내고 DNA를 아가로스로부터 정제시켰다.
B. G cDNA 단편의 HRSV F 당단백질 유전자로의 삽입
플라스미드 pGPF4를 Nsi I로 절단시키고 T4 DNA 폴리머라제로 말단을 평활하게 만들었다. 상기한 Sal I 링커를 PGPF4 DNA의 말단에 연결시켰다. DNA를 Sal I 로 절단시키고 1% 아가로스 겔에서 전기영동시켯다. 4.4kb 단편을 겔로부터 잘라내고 DNA를 아가로스로부터 정제시켰다. 4.4kb pGPF4 DNA 단편과 410bp G 단편을 연결시켜 pGPFG-2를 형성하고 이를 대장균 HB101에 형질전환시켰다. 클론을 단리시키고, 768bp 및 220bp의 접합단편을 생성시키는 Hinf I로 절단시킴으로써 F 유전자내에서 옳은 배향의 G cDNA를 선별하였다. 틀린 배향의 G 단편은 Hinf I로 절단시킨후 550bp 및 430bp의 접합 단편을 생성할 것이다. 이어서, 이 클론의 접합부위가 옳은 것으로 막샘-길버트 서열화에 의해 확인되었다.
상기 실시예에서는 실시예 2에서와 유사한 키메라 FG 당단백질에 대해 암호화한 유전자를 생성할 것이다. 이 실시예에서 생성된 키메라 당단백질은 실시예 2에서 생성된 키메라 당단백질 보다 G 당단백질의 면역지대를 덜 함유할 것이다. 상기 두 당단백질의 기타지대를 함유하는 키메라 당단백질 상세한 설명란에 열거한 효소를 사용하여 실시예 2 및 3에서 기술한 바 대로 제조할 수 있다.
[실시예 4]
각종 길이의 키메라 FG 당단백질에 대한 암호화한 유전자를 제조하기 위한 DNA 올리고뉴클레오티드의 사용-챠트 5
F 및 G 당단백질의 각종지대를 함유하는 키메라 FG 당단백질에 대히 암호화한 유전자를 제한효소와 올리고뉴클레오티드의 조합을 사용하여 제조할 수 있다. 이 과정에서는 숙주 면역 시스템에 의해 인식될 에피토프(epitope)를 함유하기 쉬운 지대를 혼입 또는 제거시키면서 F 및 G 당단백질이 그들의 아미노산 주쇄상의 어떠한 원하는 부위에서 연결되게 한다. 원한다면, 각 아미노산을 변경할 수도 있다. 올리고뉴클레오티드는 DNA 서열에 따라 원하는 결합점으로부터 편리한 제한효소 부위에 이르기까지 합성하였다. 당단백질 유전자를 상기 제한 효소로 절단시키고 제한효소 부위에서 올리고뉴클레오티드를 유전자와 연결시켜 원하는 길이의 DNA 단편을 제조하였다. 올리고뉴클레오티드는 용이한 연결을 위헤 제한효소 부위와 양립할 수 있는 말단을 갖도록 합성한다.
A. HRSV F 당단백질 유전자의 제조
플라스미드 pGPF4를 Nsi I로 절단하고 올리고뉴클레오티드 1(cDNA 뉴클레오티드 1483-1519) 또는 올리고뉴클레오티드 1 및 2의 혼합물과 연결시켰다. 올리고뉴클레오티드 1 및 2(cDNA 뉴클레오티드 1483-1564)는 키메라 유전자에 혼입된 당단백질 F DNA를 F 당단백질의 앵커-암호화 부위직전까지의 DNA 서열로 연장시킬 것이다. 이들 두개의 올리고뉴클레오티드내의 DNA 서열은 F 당단백질상에서 발견된 추가의 에피토프에 대해 암호화할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 1의 3' 말단상의 뉴클레오티드(만일 이것이 종결 올리고뉴클레오티드였다면 포함될 것임)를 괄호안에 넣는다. 표시된 뉴클레오티드 HindⅢ 제한 효소 부위에 대해 암호화 한다. 올리고뉴클레오티드 2도 포함되어야 하는 경우, 올리고뉴클레오티드 1상의 상기 뉴클레오티드를 제외시켜 올리고뉴클레오티드 1의 3' 말단과 올리고뉴클레오티드 2의 5' 말단을 연결되도록 한다. 올리고뉴클레오티드 2의 3' 말단도 Hind Ⅲ 부위를 포함한다.
올리고뉴클레오티드(들)의 연결에 이어서, DNA를 Hind Ⅲ으로 절단시키고(F 유전자의 3' 말단에 있는 올리고뉴클레오티드 및 pUC12 플라스미드의 폴리핑커 지대의 Hind Ⅲ부위), 플라스미드를 다시 연결시켰다.
DNA를 대장균 HB101에 형질전환시키고 F 유전자와 연결된 올리고뉴클레오티드(들)를 함유하는 클론을 단리시켰다(pGPF5). 클론에서의 올리고뉴클레오티드(들)의 존재를 클론을 32P-표지된 올리고뉴클레오티드(들)로 잡종화시켜 확인할 수 있었다.
B. 당단백질 G cDNA의 F 당단백질 유전자로의 삽입
클론 G2B-16을 Hinf I 및 Xho Ⅱ로 절단시켰다. 뉴클레오티드 위치 377 내지 654의 cDNA 지대를 나타내는 277bp 단편을 겔정제시켰다. 이어서, G cDNA의 인접 지대를 나타내는 올리고뉴클레오티드를 G 단편의 각 말단에 연결시켰다. 이들 올리고뉴클레오티드내의 DNA 서열은 G 당단백질상에서 발견된 추가의 에피토프에 대해 암호화할 수 있다. 독특한 에피토프를 함유할 수 있는 지대에 혼입하도록 각각의 올리고뉴클레오티드를 고안하였다. G cDNA의 5'말단에 연결된 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 3(cDNA 뉴클레오티드 297-377) 또는 올리고뉴클레오티드 4와 연결된 올리고뉴클레오티드 3(cDNA 뉴클레오티드 213-377)으로 구성될 수 있다. G cDNA의 3' 말단에 연결된 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 5(cDNA 뉴클레오티드 654-774), 올리고뉴클레오티드 5-6(cDNA 뉴클레오티드 654-774), 올리고뉴클레오티드 5-6-7(cDNA 뉴클레오티드 654-843) 또는 올리고튜클레오티드 5-6-7-8(cDNA 뉴클레오티드 645-912)로 구성될 수 있다. 괄호안은 종결 올리고뉴클레오티드에만 포함되는 뉴클레오티드이다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 6이 첨가되어야 하는 경우 괄호안의 뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 5상에 포함되지 않을 것이다. 이들 괄호안의 뉴클레오티드는 HindⅢ 부위에 대해, 그리고 올리고뉴클레오티드 5, 6, 7 및 8의 경우에는 번역종결 코돈에 대해 암호화한다. 올리고뉴클레오티드의 양립성 말단사이의 연결시키기 위해 추가의 올리고뉴클레오티드(들)를 첨가해야 하는 경우 괄호안의 뉴클레오티드는 포함되지 않는다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 3의 5'말단이 올리고뉴클레오티드 4의 3'말단과 양립하는 경우 괄호안의 뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 3에 포함되지 않는다.
올리고뉴클레오티드를 G cDNA 단편에 연결시킨후, DNA를 HindⅢ으로 절단시키고, 확장된 G cDNA단편(단편 7)을 겔 정제시켰다. 이어서, 새로운 G cDNA 단편을 이 실시예, A 부에서 제조된 HindⅢ으로 절단시킨 F-클론(pGPF-5)에 연결시켰다. DNA를 대장균 HB101에 형질전환시키고 F 유전자내에 옳은 배향의 G 유전자를 함유하는 클론을 단리시켰다(pGPF-3). 배향은 적절한 제한효소로 절단시켜 측정한다. 키메라 유전자의 새로 합성된 지대가 옳은 것으로 막샘-길버트 서열화에 의해 확인되었다. 이어서, 클론을 하기하는 바와같이 각종 발현벡터에 배치할 수 있다.
C. 올리고뉴클레오티드
[실시예 5]
앵커지대를 함유하는 HRSV 키메라 FG 당단백질 유전자의 제작-챠트 6
실시예 2, 3, 및 4는 앵커지대를 함유하지 않고, 따라서 발현세포는 매질로 분비될 키메라 FG 당단백질에 대해 암호화한 유전자의 합성을 설명하고 있다. 앵커지대를 함유하는 키메라 FG 당단백질에 대해 암호화한 유전자를 합성할 수 있다. 앵커지대는 F 및 G 당단백질과 유사한 방식으로 세포막내에 키메라 당단백질의 보유를 야기시킬 것이다. 앵커지대는 대부분의 바이러스성 당단백질 둘다로부터의 키메라 분자의 면역지대가 세포외액쪽으로 돌출되도록 당단백질의 카복시-종결말단상에 있을 수 있다. 하기한 유전자는 HRSV F의 세포외지대, HRSV G의 세포외지대 및 HRSV F의 앵커지대로 구성(상기 순서대로 아미노-종결부로부터 카복시-종결부까지)된 키메라 당단백질에 대해 암호화할 것이다.
A. G cDNA 단편의 HRSV F 당단백질 유전자로의 삽입
클론 G2B-16을 Dde I 및 FOK I로 절단시켰다. 이어서, 하기 올리고뉴클레오티드를 DNA 단편의 말단과 연결시켰다.
9) ATGCATCACC
TACGRAGTGGAGT
10) CAAGTCGATGCAT
AGCTACGTA
연결에 이어서, DNA를 Nsi I로 절단시키고 G cDNA의 550bp 단편(단편 8)을 겔 정제시켰다. 이어서 550bp 단편을 Nsi I 절단된 pGPF4에 연결시켰다. DNA를 대장균 HB101에 형질전환시킨다. 클론을 단리시켜 실시예 2에 기술된 바와 같이 옳은 배향을 갖는 것을 선별하였다. 적절히 배향된 클론의 접합지대가 옳은 것으로 막샘-길버트 서열화에 의해 확인되었다. 이 클론(pGPFG-4)은 후술하는 바와같이 각종 발현섹터에 배치시킬 수 있다.
[실시예 6]
HRSV 키메라 GF 당단백질 유전자의 제작
HRSV F 당단백질의 세포외 지대의 일부를 G 당단백질의 카복시-종결 말단에 배치시킬 수 있다. 이 키메라 당단백질은 G의 아미노-종결부로부터의 신호/앵커지대, G의 세포외 지대의 대부분 및 F의 세포외 지대의 일부로 구성(상기 순서대로 아미노-종결부위로부터 카복시-종결부튀까지)될 것이다.
A. HRSV G 당단백질 유전자의 제조-챠트 7
발현용 클론 G2B-16을 제조하기 위해 cDNA 클로닝에 사용된 G-C 꼬리를 제거하고 양립가능한 제한 효소부위를 그의 말단상에 배치해야 한다. 클론 G2B-16을 NlaⅢ 및 FoK I로 절단시켰다. cDNA 유전자 서열상에서 N1AⅢdms 18위치를 절단하고 FoK I는 846 위치를 절단한다. 이어서 하기 올리고뉴클레오티드를 cDNA 단편과 연결시켰다.
11) G A T C C A A A T G C A A A C A T G
G T T T A C G T T T
12) C A A G T C T C T C T A C A G
A G A G A G A T G T C A G C T
올리고뉴클레오티드 11은 NlaⅢ 부위와 연결되어 cDNA 단편의 5' 말단상에 BamH I 제한효소 부위를 생성할 것이다. 올리고뉴클레오티드 12는 FoK I 부위와 연결되어 cDNA 단편의 3' 말단상에 Sal I 제한효소부위를 생성할 것이다. DNA를 1.5% 아가로스겔에서 전기영동시켰다. 850bp G cDNA 단편(단편 9)을 겔로부터 잘라내고 DNA를 아가로스부터 정제시켰다. 이어서, BamH I 및 Sal I로 절단시킨 pUC12에 G cDNA 단편을 연결시켜 pGPG-1을 제조하였다. 이 플라스미드를 대장균 HB101에 형질전환시키고 플라스미드 DNA를 단리시켰다.
B. F cDNA 단편의 HRSV G 당단백질 유전자로의 삽입-챠트 8
클론 F5-25를 Xho Ⅱ 및 Nsi I로 절단시켰다. Xho Ⅱ는 F cDNA 유전자 서열상의 446 위치를, Nsi I는 1483 위치를 절단하였다. 이어서 하기 올리고뉴클레오티드를 cDNA 단편에 연결시켰다.
13) T C G A C G G T G G T G
G C C A C C A C C T A G
14) T C A A T A T C T T A G
A C G T A G T T A T A G A A T C A G C T
올리고뉴클레오티드 13은 Xho Ⅱ부위와 연결되어 cDNA 단편의 5' 말단상에 Sal I 제한효소 부위를 생성할 것이다. 올리고뉴클레오티드 14는 Nsi I 부위와 연결되어 cDNA 단편의 3' 말단상에 Sal I 제한효소 부위 및 번역종결 코돈을 생성할 것이다. 이어서 DNA를 Sal I로 절단시키고 960bp F cDNA 단편(단편 10)을 겔 정제시켰다. 이어서, F cDNA 단편을 Sal I로 절단시킨 pGPG-1에 연결시켰다. 이 플라스미드를 대장균 HB101에 형질전환시켰다. 클론을 단리시키고 1.8kb 단편을 생성시키는 BamH I 및 Nsi I의 절단에 의해 G 유전자내의 옳은 배향의 F cDNA를 선별했다. 틀린 배향은 850bp 단편을 생성할 것이다. 적절히 배향된 클론의 접합부분이 옳은 것으로 막샘-길버트 서열화에 의해 확인되었다. 이 클론(pGPGF-1)은 하기한 바와 같이 각종 발현 벡터에 배치시킬 수 있다.
[실시예 7]
HRSV의 키메라 FG 당단백질의 CHO 세포에서의 발현
A. pSVCOW7의 제작
출발 플라스미드 pSVsdhfr(ATCC로부터 구입가능하거나 S. Subramani, et al.,의 Expression of the Mouse Dihydrofolate Reductase Complementary Deoxyribonucleic Acid in Simian Virus 40, Molecular and Cellualr Biology 2 : 854-864(1981년 9월)에 기재된 과정에 따라 제조함)을 BamH I 및 EcoR I로 절단시켜 암피실린 내성 유전자, SV40 기원유전자 및 dhfr 유전자를 함유하는 5.0kb의 단편을 제조하였다. pSVCOW7의 두번째 부분은 플라스미드 pλGH2R2로부터 수득했는데 이 플라스미드를, pSV2dhfr을 절단하는데 사용된 것과 동일한 제한 엔도뉴클레아제로 절단시켜 게놈성 소 성장호르몬 유전자의 3' 말단 즉, BGH gDNA를 함유하는 2.1kb의 단편을 제조하였다. 플라스미드 pλGH2R2는 일리노이주 페노리아의 NRRL에 기탁(NRRL B-15154)되어 있는 대장균 HB101 숙주로부터 공공연히 얻을 수 있다. 5.0kb와 2.1kb의 단편들을 연결시켜 pSVCOW7(7.1kb)을 수득하였다.
B. pGPFG-IE-PA의 제작
CHO 세포에서 키메라 당단백질을 발현하는데 실시예 2 내지 6에서 제작된 유전자를 사용할 수 있다. 하기 실시예에서는 플라스미드 pGPFG-1을 사용할 것이다. 달리 명시하지 않는한, 다른 키메라 유전자는 pGPFG-1에 대해 기술한 바와같이 처리하였다. pGPFG-IE-PA의 조립을 2단계로 수행했다. 우선, pGPFG1로부터의 fpFG CDNA를 pSVCOW7에 삽입하여 pGPFG-PA를 생성하고 이어서 시토메갈로비루스(cytomegalovirus)의 직접 초기 프로모터(immediate early promoter)를 삽입함으로써 HRSV-형 단백질의 복제를 시작하여 pGPFG-IEPA를 제조하였다.
1단계 :
플라스미드 pSVCOW7을 EcoR I 및 Pvu Ⅱ로 절단시키고, BGH 유전자의 3' 최대 액손(exon)에 있는 Pvu Ⅱ부위에서 3'말단으로부터의 Eco R I 부위 하향스트림까지 뻗은 소성장호르몬의 폴리아데닐화 서열을 함유하는 단편 11(660bp)를 단리시켰다. BGH 폴리아데닐화 서열에 대한 상세한 설명은 하기 문헌을 참조할 것.
(1) BGH 게놈성 DNA의 존재확인 및 특징이 개시되어 있는, 1984년 6월 27일자 공고된 유럽 특허원 제0112012호 : (2)Woychik, R.P. et al., Requiremint for the 3' Flanking Region of Bovine Growth Hormone Gene for Accurate Polyadenylation, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 3944-3948(1984년 7월) ; 및 O. R. Higgs, et. al., Nature 306 : 398-400(1983년 11월 24일) 및 뉴클레오티드 서열 AATAAA가 BGH 유전자의 3' 말단으로부터의 11 내지 30개의 뉴클레오티드의 상향스트림(5'말단쪽으로) 위치에서의 폴리아데닐화 신호의 특징을 묘사한, 상기 문헌속에 인용된 문헌들.
pSVCOW7의 제2샘플을 EcoR I 및 BamH I 로 절단하여 단편 12(5.8kb)를 얻었다. 다른 방법으로, 베데스타 리서어치 래보라토리즈(Bethesda Research Laboratoies)로부터 구입가능한 모(母) 플라스미드 pSV2dhfr로부터의 EcoR I/BamH I 단편으로부터 단편 12를 유도할 수 있다. 단편 12는 pBR322로부터의 복제기원 유전자 및 대장균에서 발현되는 암피실린 내성 유전자(이 유전자 때문에 대장균에서 이 플라스미드의 선별이 가능하다)를 함유한다. 이 단편은 또한 포유동물 세포에서 발현할 수 있도록 하는 구조의 마우스 디하이드로플레이트 환원효소 cDNA를 함유한다. 참조문헌 : Subramani, et al., Mil. Cell. Biol. 1 : 854-864(1981).
플라스미드 pGPFG1을 HindⅢ으로 절단하고(pGPFG-3은 Hpa I로 절단시킨다) 클레노우 효소로 처리한 다음 Bam I로 재절단하여 단편(2.2kb)을 얻고 이를 겔 단리시켰다. BamH I 부위는 바로 FG mRNA의 5' 미번역된 서열에 대해 암호화한 cDNA로부터 상향스트림이고, HindⅢ 부위는 pUC12 벡터에서 gpFG cDNA의 3' 말단기까지의 Pst I 부위에서 몇개의 염기쌍을 지난 곳이다(pGPFG-3의 HpaⅡ부위는 FG cDNA의 3' 말단으로 부터의 95bp이다).
단편 11, 12 및 13을 연결하여 대장균과 CHO 세포 사이에 차단역할을 할 수 있는 복제 벡터인 pGPFG-PA(8.6kb)를 형성하였다. 플라스미드 pGPFG-PA를 대장균에 형질전환시켰다.
2단계 :
2단계에서는 인간 시토메칼로바이러스로부터의 직접 초기 유전자 프로모터(CMV I.E. 프로모터)를 삽입하므로써 pGPFG-PA를 발현 플라스미드 pGPFG-IE-PA로 전환시켰다. CMV I.E. 프로모터는 CMV 게놈의 Pst I 절단에 의해 얻는다. 주요 직접 초기 유전자(CMV I.E.)를 함유하는 인간 시토메칼로바이러스(CMV) 게놈지대의 제한 엔도뉴클레아제 절단지도는 문헌[Stinski, et al., J. Virol. 46 : 1-14, 1983 ; Stenberg, et al., J. Virol. 49 : 190-199, 1984 : 및 Thomsen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 : 659-663, 1984]에 상세히 기재되어 있다.
스틴스키(Stinski) 문헌 및 톰슨(Thomsen)문헌에는 주요 직접 초기 유전자에 대한 프로모터를 함유하는 2.0킬로베이스 Pst I 단편이 기재되어 있다. 이 2.0kb Pst I 단편을 단리시켜 Sau3A I로 절단시키면 생성물중에 760 염기쌍 단편이 얻어진다. 이 760 염기쌍 단편은 그의 크기 및 단편내의 Sac I 절단부위 및 Bal I 절단부위의 존재에 의해 다른 생성물들과 구별될 수 있다. 이 Sau3A I 단편을 이용하는 것이, 그의 편리한 확인방법 때문에 본 명세서에 기술한 바와 같이 CMV I.E 프로모터를 사용하는 바람직한 방법이다.
플라스미드 pGPFG-PA를 BamH I로 절단시키고 CMV 직접 초기 프로모터를 함유하는 Sau3A I 단편을 양립가능한 BamH I 부위에 연결시켰다. 프로모터로부터의 전사에 의해 HRSV-형 단백질에 대한 mRNA를 합성하도록 하는 배향의 CMV 프로모터 단편을 함유하는 플라스미드를 Sac I에 의한 플라스미드의 절단으로 확인하였다. 생성된 플라스미드를 PGPFG-IE-PA라 칭하는데 이 플라스미드는 cDNA의 5'말단에 CMV I. E. 프로모터와 2의 3'말단상에 BGH 폴리아데닐화 신호를 갖는다. CHO 세포내에 형질 감염될때까지 상기 플라스미드를 대장균내에서 유지시켰다.
C. CHO 세포의 형질감염 및 배양
플라스미드 pGPFG-IE-PA를 문헌[Graham, et al., Introduction of Macromolecules into Viable Mammalian Cells, Alan R. Liss Inc., N.Y., 1980, pp 3-25]에 상세히 기술된, DNA의 세포내 형질감염을 위한 칼슘 포스페이트 방법을 사용하여 디하이드로플레이트 환원효소(dhfr)가 결핍된 차이니즈 함스터 난소(CHO) 세포에 형질감염시켰다. 사용된 세포주는 컬럼비아 대학의 엘, 챠신(L. Chasin)으로부터 구입가능하고 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 : 4216-4220(1980)]에 상세히 기술된 변이주 DXB-11이다. 상기 형질감염 방법은 형질감염된 플라스미드를 혼입하는 세포가 더이상 dhfr가 결핍되지 않고 둘베코(Dulbecco)의 변형된 이글(Eagle) 배지 프롤린에서 자랄것이라는 사실에 근거를 둔 것이다.
만일 키메라 당단백질이 앵커지대를 함유하지 않는 경우 분비된 키메라 FG 당단백질을 발현하는 CHO 세포포부터의 상등액을 저속 원심분리로 맑게 만든다. 상등액을 콘콘아발린 A(또는 렌틸 렉틴) 컬럼에 적용한다. 당단백질을 선상구배의 상기 완충액중의 α-D-메틸글루코시드(0 내지 0.5M)로 광범위하게 세척한다음 용출시켰다. 용출된 당단백질을 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS에 대해 투석시키고 친화성 컬럼에 적용시켰다. 친화성 컬럼은 공지된 기법에 의해 세파로즈 4B 비드(Pharmacia, Piscataway, New Jersey)와 연결된 HRSV에 대항하는 폴리클론 또는 모노클론 항체로 구성되어 있다. 이 컬럼을 투석완충액에서 세척하고 HRSV FG 당단백질을 0.1M 글리신(pH 2.5) 및 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS로 용출시켰다. 당단백질을 염수에 대해 투석시키고 SDS-PAGE 겔상의 전기영동에 의해 순도를 조사하였다.
키메라 당단백질이 앵커지대를 함유하는 경우, 당단백질을 발현하는 CHO 세포를 인산염 완충 염수(PBS)로 세척하고 1.0% 트리톤 X-100 및 0.1% 나트륨 데옥시콜레이트를 함유하는 PBS에 용해시켰다. 세포핵을 펠렛화 한후 세포질 추출물을 콘콘아발린 A 컬럼에 적용시키고, 분비된 당단백질에 대해 상기 기술한 바와같이 정제하였다.
[실시예 8]
소 유두종 바이러스(BPV)를 사용한 HRSV GPFG의 발현
A. 대장균에서 복제하기에 적합한 비전사용 발현 카세트를 함유하는 클로닝 벡터의 제작
pTFW8 및 pTFW9를 제작하면 BPV를 사용한 HRSV 단백질의 발현에 편리한 출발물질이 된다. 기탁된 플라스미드의 전사 종결 부위는 HRSV 단백질의 발현을 억제하므로 1단계의 절단 및 연결에 의해 제거하여야 한다.
1. pTFW8의 제작
플라스미드 pdBPV-MMTneo(342-12)는 문헌[Mol. and Cell Biol., Vol 3(No.11) : 2110-2115(1983)]에 기술되어 있고 미합중국 매릴랜드, 베데스타의 국립 암센터의 피터 호울리(peter Howley)로부터 구입할 수 있다. 플라스미드 pdBPV-MMTneo(342-12)는 하기 3부분으로 구성되어 있다 : 독특한 BamH I 부위에서 절단개환된 전체 BPV-1 게놈(100%) ; pML2(pBR322의 포이즌-마이너스 유도체) ; 및 뮤린 메탈로티오네인 I 유전자 프로모터, Tn5의 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 Ⅱ 유전자 및 원숭이바이러스 40 초기-지대 전사진행신호로 구성된 전자카세트, 플라스미드 pdBPV-MMTneo(342-12)를 우선 BamH I로 절단시켜 BPV 서열을 제거하고, 이 서열을 단리시켜 후속 삽입을 위해 보관하였다. T4 연결효소를 사용하여 나머지 단편을 재연결시켜 pMMpro.npt Ⅱ(6.7kb)를 형성하였다. BPV 게놈을 제거하면 나머지 플라스미드에 독특한 제한부위를 발생시켜 후속 유전조작이 용이하게 된다. 재조합이 완결된후 BPV 게놈을 제자리에 놓았다.
플라스미드 pMMpro.nptⅡ를 BglⅡ로 절단시키고, 독특한 제한부위를 함유하는 합성 DNA 단편 14를 삽입하고 T4 연결효소를 사용하여 연결시켜 pTFW8(6.7)을 수득했다. 플라스미드 pTFW8은 뮤린 메탈로티오네인 I 유전자 프로모터와 네오마이신 내성유전자 사이의 독특한 제한 부위의 삽입을 제외하고는 pMMpro.npt Ⅱ와 동일하다.
2. pRFW9의 제작
플라스미드 pTFW9는 메탈로티오네인 I 유전자 프로모터와 네오마이신 저항성 유전자 사이에 삽입된 람다 파아지로부터의 전사 종결부위 TI을 함유한다. 전사 종결부위는 미합중국, 매릴랜드, 베데스다 소재의 국립암센터의 도날드 코트(Donald Court)로부터 구입할 수 있다. 전사 종결부위를 문헌(Gene, 28 : 343-350(1984)]에 기재된 pUS6과 같이, 다만 tI이 문헌[Cuarneros et al., PNAS, 79 : 238-242(1982)]에 기재된 바와같이 sib3 돌연변이를 운반함을 제외하고 pKG1800 sib3에 공급한다. 람파 파아지의 통상적인 감염과정시에, tI 종결부위는 PL로부터 나온 박테리오 파지 λint 유전자 발현을 억제하고, PI으로부터 나온 int 유전자 전사를 종결시키는 작용을 한다. 종결부위는 단편 15(1.2kb)와 같이 Alu I 및 Pvu I을 사용하여 pKG1800 sin3로부터 잘라내고, 이를 겔 단리시키며 Xho I 링커를 단편의 어느 한쪽 말단위에 놓는다. 링커는 미합중국 매릴랜드 베버리 소재의 뉴잉글랜드 바이오랩스로부터 구입할 수 있다. 이어서, Xho I 보족 말단에 의해 결합된 종결부위 단편을 이미 Xho I으로 절단한 pTFW8에 삽입한다. 이어서 T4 DNA 연결효소를 사용하여 단편을 연결하여 pTFW9(7.9kb)를 얻었다. 플라스미드 pTFW9는 부다페스트 조약에 따라 기탁되었고, 대장균 숙주에서 유지되며 기탁기관[Norhtern Reginal Research Center, Peoria, Illinois, USA]에 1986년 11월 17일자로 기탁되었으며 수탁번호는 NRRL B-18141이다.
B. pTFW/GPFG의 제작
BPV를 사용하여 키메라 당단백질을 발현시키는데 실시예 2 내지 6에서 제작한 유전자를 사용할 수 있다. 이 실시예에서는 플라스미드 pGPFG-1을 사용한다. 달리 언급된 바 없으면, 다른 키메라 유전자는 pGPFG-1에 대해 기술한 바와 같이 처리했다. pTFW/GPFG를 제작하기 위해 pGPFG1을 BamH I 및 Hind Ⅲ로 절단했다(pGPFG3은 BamH I 및 Hpa Ⅱ로 절단했다). 말단은 클레노우 효소로 평활하게 만들고 합성 BgⅢ 링커(뉴잉글랜드 바이오랩스)를 클론의 말단에 연결했다. DNA를 BgⅢ으로 절단하여 단편 16(2.5kb)으로 표시했다. 이어서, gpFG 유전자를 함유하는 단편 16(2.2kb)을 겔로부터 단리시켰다. 정제시킨 단편을 BgⅢ으로 먼저 절단시킨 pTFW9에 연결하여 pTFW/GPFG(10.1kb)를 얻었다.
C. pRFW/GPFG를 진핵 발현 벡타로 전환
실시예 8A의 a단계에서 BamH I으로 절제한 전체 BPV-1 게놈(100%)을 다시 삽입시킴으로써 플라스미드 pTFW/GPFG를 진핵 발현 벡타로 전환시켰다. 플라스미드 pTFW/GPFG를 BamH I으로 절단하고 BPV-1 무상(無傷)게놈, 7.9kb 단편을 삽입하여 pTFW/GPFG/BPV*(18.0kb)를 얻었다. 이를 진핵세포가 당단백질 FG를 생산할때가지 대장규에서 복제시키는 것이 바람직하다.
D. 뮤린 C127 세포에서 GPFG의 발현
뮤린 C127 세포를 형질 감염시키기 전에, pTFW/GPFG/BPV*를 Xho I으로 절단하여 TI 종결부위를 절제하고 T4 DNA 연결효소를 다시 연결시켰다. 이제 생성된 플라스미드 pTFW/GPFG/BPV(16.9kb)는 배지에 분비되는 gpFG를 높은 수준으로 발현하도록 명령한다. C127 세포는 아메리칸 타입 걸쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)에서 구입할 수 있으며 10%의 송아지 태아 혈청을 함유한 둘베코(Dulbecco)의 변형된 최소 필수 배지에서 성장한다. C127 세포배지에서의 gpFG 단백질의 함량은 항-RSV 항체 및 125I-표지된 단백질 A를 사용하는 웨스턴 블롯 실험(Western blot experiment)에 의해 측정했다.
HRSV gpFG는 실시예 7에서 기술된 바와 같이 배지 또는 세포로부터 정제했다.
[실시예 9]
바큘로바이러스 바이러스를 사용한 HRSV GPFG의 발현
하기 실시예는 곤충 세포 배양물에서 당단백질 FG의 발현에 관한 것이다. 모든 과정은 문헌[Summers, M.D. and Smith, G.E., A Manual for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures Published by the College of Agriculture Texas Agricultural Experiment Station, Texas Agricultual Extension Service, College Station, Texas, 1986]에 상세히 기재되어 있다. 출발 플라스미드 pAC373(7.1kb)은 오트그라파 칼리포니카 뉴클리어 폴리헤드로시스 바이러스(Autograpga Californica nuclear polyhedrosis virus, AcNPV)의 경우 폴리헤드론 프로모터로부터 즉각적인 하향스트림의 독특한 BamH I 부위를 갖는 일반적인 바큘로바이러스 발현 벡터이다. 폴리헤드론 단백질은 생체외에서 바이러스의 감염 및 복제에 비필수적인 주형 단백질이다. 이 플라스미드는 텍사스 에이 앤드 엠 대학[College Station, Texas 77843], 효소학부의 막스 섬머즈(Max Summers) 교수로부터 구입할 수 있으며 문헌[Molecular and Cell. Biology, 3(12) : 2156-2165(1983)]에 상세히 기술되어 있다.
A. pAcGPFG의 제작
바큘로바이러스를 사용하여 키메라 당단백질을 발현시키는데 실시예 2 내지 6에서 제작한 유전자를 사용할 수 있다. 이 실시예에서는 플라스미드 pGPFG-1을 사용한다. 달리 언급된 바 없으면, pGPFG-1에 대해 기술한 바와같이 다른 키메라 유전자도 처리한다. 플라스미드 pGPFG-1을 HindⅢ으로 절단하고(pGPFG-3은 HpaⅡ로 절단했다) 말단을 클레노우 효소로 평활하게 만들었다. 합성 BamH I 링커(뉴잉글랜드 바이로랩스)를 DNA의 말단에 연결했다. DNA를 BamH I으로 절단하고 gpFG 유전자를 함유하는 단편 17(2.2kb)을 겔로부터 단리시켰다. 정제시킨 단편을 BamH I으로 절단사킨 pAc373에 연결했다.
B. 에쓰 푸르기펄다(S. Frugiperda)의 형질감염 및 배양
에쓰. 푸르기펄다에서 같이 형질감염시킴으로써 pAcGPFG의 gpFG cDNA 삽입물과 천연 AcNPV DNA을 재조합했다. 에쓰 푸르기펄다(SF 9 ; ATCC CRL 1711)는 10% 송아지 태아 혈청을 함유하고 디프코락트알부민 가수화물 및 이스톨레이트(yeastolate)를 보충한 그레이스 배지(Gibco Lab. Livonia, MI 48150)에서 배양했다. AcNPV DNA 및 pAcGPFG 각각 1㎍/ml 및 2㎍/ml로 세포를 같이 형질감염시켰다. 저속 원심분리에 의해 배지를 수집하고 세포 물질을 제거하므로써, 생성된 바이러스 입자를 수득했다.
이어서, 에쓰, 프루기펄다를 감염시키는데 바이러스 함유 배지를 사용했다. 천연 바이러스 DNA 및 당단백질 FG를 암호화 하는 cDNA로 재조합한 DNA 모두를 함유한 상기 바이러스 입자를 사용하는 에쓰, 푸르기펄다의 감염후 일부 세포에서 폴리헤드론 단백질 대신에 HRSV단백질이 발현된다.
재조합 바이러스 정제는 에쓰. 푸르기펄다 세포를 함유하는 96-웰(well) 조직 배양 플레이트에서 일련의 제한 희석 평판배양법(limited dilution platings)에 의해 수행했다. 재조합 바이러스 함유 웰은 탐침으로서 닉크(nick)번역에 의해 32p-dCTP로 표지시킨 pGPFG1을 사용하여 도트 블롯 잡종화(got bolt hybridization)에 의해 검출햇다. 충분히 순수하다면, 재조합 바이러스는 그의 독특한 폐색-네가티브 플라크 형태학으로 검출한다. 재조합 바큘로바이러스 감염 세포에서 합성된 HRSV 단백질은 항-RSV 항체 및 125I-표지 단백질 A(Amerssha corp.)을 사용하여 웨스턴 블롯 실험에 의해 검출했다.
HRSV 단백질은 실시예 7에 기술된 바와같이 배지 또는 세포로부터 정제했다.
[실시예 10]
천연 폴리헤드론 리더 서열(Natural Polyhedron Leader Sequence)을 함유한 pAcGPFG의 제작
실시예 8에서 기술한 플라스미드 pAc373은 외래 유전자를 용이하게 삽입하도록 폴리헤드론 리더의 -8위치에 BamH I 링커 서열을 함유한다. 그러나, 폴리헤드론 리더 서열을 파괴하면 천연 폴리헤드론 리더가 있을때 가능한 것보다 더 낮은 수준으로 삽입된 유전자가 발현될 수 있다. 천연 폴리헤드론 리더 서열을 HRSV FG 유전자의 개시 코돈에 연결시키는 방법을 하기에 기술한다. 키메라 당단백질을 발현시키기 위한 실례로 2 내지 6에서 제작한 유전자를 사용할 수 있다. 이 실시예에서는 플라스미드 pGPFG-1을 사용한다. 다른 키메라 유전자는 pGPFG-1에 대해 기술한 바와같이 처리했다.
A. pAcGPFG-2의 제조
플라스미드 pAcGPFG(실시예 8)를 EcoRV 및 Pst I으로 절단했다. EcoRV는 -93위치에서 폴리헤드론 리더 서열을 절단하고, Pst I은 FG 암호화 서열의 50, 636 및 1701 위치에서 HRSV FG 암호화 서열을 절단하고 또한 FG 유전자의 3'말단에 인접한 pUC12 폴리링커 지대에서 pUC12 폴리링커를 절단한다. DNA는 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하고 주로 플라스미드 pAc373을 함유하는 거대한 단편(9.8kb)은 겔로부터 정제했다.
-93(EcoRV 절단부위)위에서 1까지의 폴리헤드론 리더 서열과 0(개시코돈의 뉴클레오티드 A)위치에서 50(Pst I 절단부위)까지의 FG 유전자 서열을 연결시킨 올리고뉴클레오티드를 합성 및 제작했다. 이 서열을 길이로 인해 DNA는 여러개의 올리고뉴클레오티드로 합성되었으며, 그후 함께 연결시켰다. 무상 올리고뉴클레오티드를 상기에서 제조한 9.8kb 단편에 연결시켰다. DNA는 대장균 HB101에서 형질전환시켰다. 새로운 플라스미드(pAcGPFG-2)를 함유한 클론을 단리시키고 막샘-길버트 서열화에 의해 새롭게 합성한 지대가 정확한 것으로 입증되었다.
B. FG 유전자의 pAcGPFG-2로의 삽입
플라스미드 pGPFG-1(실시예 2)을 Pst I으로 부분 절단했다. Pst I은 FG 암호화 서열에서 50, 636 및 1701 위치를 절단하고 또한 FG 유전자의 3'말단에 인접한 pUC12 폴리링커 지대를 절단시킨다. DNA를 1.2% 아가로스 겔에서 전기영동시켰다. 거의 무상 FG 유전자에 부합하는 2.2kb의 단편(FG 50 위치에서 pUC12 폴리링커 중의 Pst I 부위까지)을 겔로부터 정제했다. 이어서, Pst I으로 절단한 플라스미드 pAcGPFG-2에 단편(2.2kb)을 연결시켰다. DNA를 대장균 HB101에서 형질전환시켰다. 클론을 단리시키고, EcoRV 및 Ssp I으로 절단하므로써 FG 유전자의 정확한 배향을 검사했다(2.3kb의 단편을 생성함). 정확하지 못한 배향은 130bp 단편을 생성한다. 실시예 8에 기술된 바와같이 HRSV 키메라 FG 당단백질을 발현시키기 위해 상기 유전자를 바큘로바이러스 게놈에 삽입했다.
[실시예 11]
백신의 제조
면역원은 잘 알려진 과정에 의해 백신 투여형으로 제조할 수 있다. 이 백신은 근육내, 정맥내 또는 코속으로 투여할 수 있다. 근육내 주사와 같이 비경구 투여하기 위해, 면역원과 적합한 담체를 배합시킬 수 있다. 예를들면, 여러가지 보조제 또는 면역조절제(예를들면, 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄, 황산 알루미늄 칼륨(알룸), 황산 베릴룸, 실리카, 카올린, 탄소, 수중유(oil-in-water)형 유제, 유중수(water-in-oil)형 유제, 뮤라밀 디펩티드, 세균 엔도톡신, 지질 X, 코리네박테리움 바븀(Corynebacterium parvum), 프로피오노박테리움아크니(Propionobacterium acnes), 보데텔라 펄튜씨스(Bordetella Pertussis), 폴리리보뉴클레오티드, 알긴산 나트륨, 라놀린, 리소레시틴, 비타민 A, 사포닌, 리포좀, 레바미졸, DEAE-덱스트란, 차단된 공중합체 또는 기타 합성 보조제)와 함께 또는 이 보조제 또는 면역조절제 없이 물, 염수 또는 완충 베히클로 투여할 수 있다. 상기 보조제는 여러가지 공급원, 예를들면 메르크 애쥬번트 65(Merck and Company, Inc., Rahway, NJ)로부터 상업적으로 구입할 수 있다.
면역원과 보조제의 비율은 이들이 모두 효과적인 함량으로 존재한다면 광범위하게 변화시킬 수 있다. 예를들어, 수산화 암모늄은 백신 혼합물중에 약 0.5%의 양으로(Al2O3 기준)존재할 수 있다. 투여량 기준으로, 면역원의 농도는 약 0.015㎍ 내지 약 1.5㎎/환자 체중(㎏)으로 변화시킬 수 있다. 바람직한 투여량 범위는 약 1.5㎍ 내지 약 0.15㎎/환자 체중(㎏)이다. 인간의 경우 적합한 투여량 크기는 약 0.1 내지 1ml, 바람직하게는 약 0.1ml이다. 따라서, 정맥내 주사의 경우 투여량은 예를들어 0.5%의 수산화 알루미늄과 함께 면역원을 함유하는 0.1ml일 수 있다.
모성 항체를 자극하기 위해 상기 백신을 임신부 또는 가임여성에게 투여할 수 있다. 여성은 필요할때에 다시 백신 주사할 수 있다. 유아는 모성항체가 소멸된후 2 내지 3개월에 백신주사하고 필요할때, 바람직하게는 면역체계가 완성된후 6 내지 9개월에 다시 백신주사할 수 있다. 어머니가 백신주사를 맞지 않은 아기는 생후 2 내지 3개월에 백신주사할 수 있다. 또한 이 백신은 중년이나 노쇠한 환자와 같은 기타 민감한 집단에게도 유용할 수 있다.
또한, 다가(multivalent)백신을 생산하기 위해 상기 백신과 다른 질병을 위한 다른 백신을 배합할 수 있다. 또한 다른 약제(예를들면, 항생제)와 배합할 수도 있다.
챠트 1
pGPF2의 제작
(a) 플라스미드 pF5-25를 Pst I으로 절단하고 단편 1(1.9kb)을 겔 단리시켰다.
(b) 플라스미드 pUC12(2.7kb)를 Pst I으로 절단하여 단편 2를 수득하고 이를 겔 단리시켰다.
(c) 단편 1과 2를 연결하여 pGPF2(4.6kb)를 얻고, 이를 대장균에서 형질전환시켰다.
AmpR = 암피실린 저항성
T = 구아노신/시토신 꼬리
F = 당단백질 F
챠트 2
pGPF3 및 pGPF4의 제작
(a) 플라스미드 pGPF2를 Xba I으로 절단하고, 세균성 알카리 포스파타제로 처리하고, Sal I 으로 다시 절단한후 클레노우 효소로 처리하여 단편 3을 얻었다.
(b) 람다 엑소뉴클레아제를 사용하여 Sal I 부위로부터 하향스트림으로 단편 3을 절단하고 남아있는 3'꼬리는 GpF cDNA의 하기 서열을 갖는 선도 서열의 5' 부위와 부족적인 합성 올리고뉴클레오티드로 잡종했다.
5' - 말단 AAATAACAATGGAG
(c) 클레노우 효소를 사용하여 합성 올리고뉴클레오티드로부터 하향스트림으로 cDNA 3의 1본쇄 부분을 채우고 T4 연결효소를 사용하여 말단을 연결시켜 pGPF3(4.6kb)을 얻었다.
(d) 플라스미드 pGPF3을 Hind Ⅲ으로 절단하고 Bal3 I로 처리하여 gpF cDNA의 3'말단에서 G-C 뉴클레오티드 꼬리를 절단했다. gpF cDNA를 BamH I(1.7kb)로 절단하여 겔로부터 단리시키고 pUC12의 BamH I/Hinc Ⅱ로 다시 연결시켜 pGPF4(4.4kb)를 얻었다.
AmpR = 암피실린 저항성
T = 구아노신/시토신 꼬리
F = 당단백질 F
차트 3
키메라 FG 당단백질 유전자의 제작
플라스미드 G2B-16
(a) 플라스미드 G2B-16을 Dde I 및 FoK I로 절단하고 말단은 클레노우 효소를 사용하여 평활하게 만들었다. DNA를 1.5% 아가로즈 겔에서 전기영동시키고 단편 4(550bp)를 아가로즈로부터 정제했다.
(b) 플라스미드 pGPF-4(챠트 2)를 Nsi I로 절단했다. 말단은 T4 DNA 폴리머라제로 평활하게 만들고 세균성 알카리 포스파타제로 탈인산화했다. 이어서 단편 4를 플라스미드에 연결하여 pGPFG-1(5.0kb)를 생성시켰다.
플라스미드 GPFG-1
AmpR = 암피실린 저항성
TcR = 테트라사이클린 저항성
T = 구아노신/시토신 꼬리
G = G 당단백질의 DNA 서열
F = F 당단백질의 DNA 서열
Term = 번역 종결신호
챠트 4
FG의 판독 프레임을 조절하기 위한 링커의 사용
플라스미드 G2B-16
Sal I 링커 CGGTCGACCG
GCCAGCTGGC
(a) 플라스미드 G2B-16을 Hph I으로 절단하고 말단을 T4 DNA 폴리머라제로 평활하게 만들었다. Sal I 링커를 cDNA의 말단에 연결시켰다. DNA를 Sal I으로 절단하고 단편 5(410bp)를 겔 정제했다.
(b) 플라스미드 GPF4(챠트 2)를 Nsi I으로 절단하고 말단을 T4 DNA 폴리머라제로 평활하게 만들었다. Sal I 링커를 cDNA의 말단에 연결시켰다. DNA를 Sal I으로 절단하고 플라스미드(4.4kb)를 겔 정제했다. 이어서 단편 5를 겔 정제한 GPF4에 연결하여 pGPFG-2를 얻었다.
플라스미드 GPFG-2
AmpR = 암피실린 저항성
TcR = 테트라사이클린 저항성
T = 구아니딘/시토신 꼬리
F = F 당단백질의 DNA 서열
= G 당단백질의 DNA 서열
L = Sal I 링커
Term = 번역 종결신호
챠트 5
여러가지 길이의 FG 유전자를 생성하기 위해 올리고뉴클레오티드의 사용
(a) 올리고뉴클레오티드 A는 올리고뉴클레오티드 1(36bp) 또는 올리고뉴클레오티드 1과 2가 함께 연결된 것(81bp)으로 이루어졌다. 올리고뉴클레오티드 B는 올리고뉴클레오티드 3(80bp), 또는 올리고뉴클레오티드 3과 4가 함께 연결된 것(164bp)으로 이루어졌다. 올리고뉴클레오티드 C는 올리고뉴클레오티드 5(60bp), 또는 올리고뉴클레오티드 5와 6이 함께 연결된 것(120bp) 또는 올리고뉴클레오티드 5, 6 및 7이 함께 연결된 것(189bp), 또는 올리고뉴클레오티드 5, 6, 7 및 8이 함께 연결된 것(258bp)으로 이루어졌다. 올리고뉴클레오티드 A, B 및 C 를 겔 정제시켰다.
(b) 플라스미드 GPF-4를 Nsi I으로 절단하고 올리고뉴클레오티드 A를 Nsi I 부위에 연결시켰다. DNA를 Hind Ⅲ으로 절단하고 플라스미드를 다시 연결시켜 pGPF-5를 얻었다.
플라스미드 GPF-5
(c) 플라스미드 G2B-16을 hinf I 및 Xho Ⅱ로 절단하고, 단편 6(277bp)을 겔 정제시켰다.
(d) 올리고뉴클레오티드 B와 C를 단편 6에 연결시켰다. DNA를 hind Ⅲ으로 절단하고 단편 7을 겔 정제했다(단편 7의 길이는 올리고뉴클레오티드 B와 C에 함유된 올리고뉴클레오티드에 따라 417bp에서 700bp로 다양하다).
(e) 플라스미드 GPF-5를 Hind Ⅲ으로 절단하고 세균성 알카리 포스파타제로 탈인산화했다. 이어서 단편 7을 pGPF-5의 hind Ⅲ 부위에 연결시켜 pGPFG-3을 얻었다.
플라스미드 GPFG-3
AmpR = 암피실린 저항성
F = F 당단백질의 DNA 서열
G = G 당단백질의 DNA 서열
A = 올리고뉴클레오티드 A
B = 올리고뉴클레오티드 B
C = 올리고뉴클레오티드 C
Term = 번역 종결신호
챠트 6
앵커지대를 함유한 FG 유전자 제작
플라스미드 G2B-16
(a) 플라스미드 G2B-16을 Dde I 및 Fok I으로 절단했다. 올리고뉴클레오티드 9와 10을 DNA의 말단에 연결했다. DNA 를 Nsi I으로 절단하고 단편 8(550bp)을 겔 정제했다.
(b) 플라스미드 GPF-4를 Nsi I으로 절단하고 단편 8을 Nsi I 부위에 연결하여 pGPFG-4를 얻었다.
플라스미드 GPFG-4
AmpR = 암피실린 저항성
TcR = 테트라사이클린 저항성
T = 구아노신/시토신 꼬리
F = F 당단백질의 DNA 서열
G = G 당단백질의 DNA 서열
9 = 올리고뉴클레오티드 9
10 = 올리고뉴클레오티드 10
A = F 당단백질의 앵커 지대를 암호화하는 DNA 서열
Term = 번역 종결신호
챠트 7
GF 키메라 유전자를 제조하기 위한 G 유전자의 제조
플라스미드 G2B-16
(a) 플라스미드 G2B-16 을 Nla Ⅲ 및 FoK I으로 절단했다. 올리고뉴클레오티드 11과 12를 DNA의 말단에 연결하고 단편 9(850bp)를 겔 정제했다.
(b) 플라스미드 pUC12를 BamH I 및 Sal I으로 절단하고 세균성 알카리 포스파타제로 탈인산화했다. 단편 9를 이 플라스미드에 연결하여 pGPG-1을 얻었다.
플라스미드 GPG-1
AmpR = 암피실린 저항성
TcR = 테트라사이클린 저항성
T = 구아노신/시토신 꼬리
G = G 당단백질의 DNA 서열
11 = 올리고뉴클레오티드 11
12 = 올리고뉴클레오티드 12
챠트 8
G cDNA를 pGPG-1에 삽입
플라스미드 F5-25
(a) 플라스미드 F5-25를 Xho I 및 Nsi I으로 절단했다. 올리고뉴클레오티드 13과 14를 DNA의 말단에 연결시켰다. DNA를 Sal I으로 절단하고 단편 10(960bp)을 겔 정제했다.
(b) PGPF-1을 Sal I으로 절단하고 세균성 알카리 포스파타제로 탈인산화했다. 이어서 단편 10을 플라스미드에 연결시켜 pGPGF-1을 얻었다.
플라스미드 GPGF-1
AmpR = 암피실린 저항성
TcR = 테트라사이클린 저항성
T = 구아노신/시토신 꼬리
G = G 당단백질의 DNA 서열
F = F 당단백질의 DNA 서열
11 = 올리고뉴클레오티드 11
12 = 올리고뉴클레오티드 12
13 = 올리고뉴클레오티드 13
14 = 올리고뉴클레오티드 14
Term = 번역 종결 신호
챠트 9
당단백질 FG
Claims (16)
- 인간의 호흡기 합포체성 바이러스 키메라 당단백질 F의 Nsi I(뉴클레오티드 위치 1479번) 앞 서열에 해당하는 면역단편 및 G의 Dde I(뉴클레오티드 위치 302번)과 FoK I(뉴클레오티드 위치 850번) 사이의 서열에 해당하는 면역단편으로부터의 면역단편 하나 이상의 신호서열을 포함하는 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 N 종결 말단으로 시작하여, 당단백질 F로부터의 신호 서열, 당단백질 F의 면역단편 및 당단백질 G의 면역단편을 갖는 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, 하기 서열을 갖는 폴리펩티드 :
- 인간의 호흡기 합포체성 바이러스로부터 인간을 보호하는 약제를 제조하기 위한, 제1항의 폴리펩티드를 포함하는 인간용 백신
- 제4항에 있어서, 상기 폴리펩티드 N 종결 말단으로 시작하여, 당단백질 F로부터의 신호 서열, 당단백질 F의 면역단편 및 당단백질 G의 면역단편을 갖는 백신.
- 제1항의 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 DNA 서열을 함유하는, 세균 세포, 효모 세포, 포유동물 세포 및 곤충 세포로 이루어진 숙주 그룹에서 선택되는 숙주를 포함하는 형질전환체.
- 제6항에 있어서, 상기 DNA 서열이 N 종결 말단으로 시작하여, 당단백질 F로부터의 신호 서열, 당단백질 F의 면역단편 및 당단백질 G의 면역단편을 갖는 폴리펩티드를 생산하는 형질전환체.
- 제6항에 있어서 상기 적합한 숙주가, 대장균 세포, 챠이니즈 함스터 난소 세포(Chinese hamster ovary cells), 뮤린(murine) C127 세포 및 에쓰. 푸르기펄다(S. Frugiperda) 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 형질전환체.
- 제6항에 있어서, 상기 적합한 숙주가 상기 폴리펩티드를 분비하는 형질전환체.
- 제6항에 있어서, 상기 DNA 서열이 폴리펩티드에 포함된 형질전환체.
- 제10항에 있어서, 상기 플라스미드가 시토메갈로바이러스 프로모터의 조절하에 있는 형질전환체.
- 제10항에 있어서, 적합한 진핵 숙주내에서 상기 플라스미드의 복제가 소 유두종 바이러스 DNA 서열의 조절하에 있는 형질전한체.
- 제6항에 있어서, 상기 DNA 서열이 바큘로바이러스과의 재조합 바이러스내에 포함된 형질전환체.
- 제13항에 있어서, 상기 바이러스가 오토그라파 칼리포니카 뉴클리어 폴리헤드랄 바이러스(Autographa californica nuclear polyhedral virus)인 형질전환체.
- 인간의 호흡기 합포체성 바이러스로부터 인간을 보호하는 약제를 제조하기 위한, 제1항에 정의된 인간의 호흡기 합포체성 바이러스 키메라 당단백질 F 및 G로부터의 면역단편 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드.
- 제15항의 폴리펩티드를 포함하는 인간용 백신.
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