JPH04211364A

JPH04211364A - サイトメガロウイルスに対するヒト・モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ

Info

Publication number: JPH04211364A
Application number: JP3036610A
Authority: JP
Inventors: Yasuhiko Masuyasu; 安彦増保; Toru Sugano; 徹菅野; Yoichi Matsumoto; 洋一松本; Shigeki Fujinaga; 藤永　茂樹
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1991-02-07
Filing date: 1991-02-07
Publication date: 1992-08-03
Anticipated expiration: 2011-09-18
Also published as: JP2535455B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、サイトメガロウイルス
（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏ−ｖｉｒｕｓ、以下ＣＭＶと略
記する）に対するヒト・モノクローナル抗体（ｍｏｎｏ
ｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　、以下ＭＣＡと略記
する）を産生するハイブリドーマに関する。

【０００２】

【従来の技術】ＣＭＶはヘルペス・ウイルス属に属する
ウイルスの一つであり、ＤＮＡ、コアタンパク、カプシ
ッドとエンビロープからなっている。このウイルスが人
間に感染しても、多くの場合何の疾病も引き起こさない
。しかしながら、免疫能力の低下した新生児では肝炎を
起こしたり、臓器移植のために免疫抑制された患者に間
質性肺炎を起こし、しばしば致命的な感染症を引き起こ
す。従って、この感染症の診断、予防および治療は大き
な治療ニーズがある。Ｃｏｎｄｉら（Ａｍｅｒｉｃａｎ
　Ｊ．　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｍａｒｃｈ３０，１３４─
１４１，１９８４参照）は骨髄移植患者に抗ＣＭＶ抗体
価の高いヒト血清グロブリンを投与し、ＣＭＶ感染とそ
れによる間質性肺炎を防ぐことに成功している。高力価
のヒト血清グロブリンは、血清提供者の抗体価をあらか
じめチエックし、高力価である血漿のみを収集して分画
される。この方法で得られる血清グロブリンの、ＣＭＶ
に対する抗体価はランダムに収集されたものの高々１０
倍にしか過ぎず、かつこのように高力価血清グロブリン
を収集することは非常に困難であり、安定に供給するこ
とができない。

【０００３】ＭｉｌｓｔｅｉｎとＫｏｅｈｌｅｒ　によ
って確立されたハイブリドーマ法によって、高純度の抗
体、すなわちＭＣＡが作製できるようになった。Ｒａｓ
ｍｕｓｓｅｎ　ら（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　，８１，８７６−８８０，１９８
４参照）はＣＭＶをマウスに免疫し、そのマウス脾細胞
とマウス・ミエローマ細胞を融合することによってＣＭ
Ｖ特異的ＭＣＡを産生するハイブリドーマを作製した。彼女ら以外にもいくつかの研究グループがＣＭＶに対す
るマウスのＭＣＡを得ている（例えば、Ｇｏｌｄｓｔｅ
ｉｎ　ら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉ
ｔｙ　，３８，２７３−２８１，１９８２；Ｐｅｒｅｉ
ｒａ　ら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉ
ｔｙ　，３６，９２４−９３２，１９８２参照）。これ
らのＭＣＡの中にあって、ウイルスを中和する活性を有
するＭＣＡは少ないが、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ　らのＭＣ
Ａは、約１０μｇ　／ｍｌでＣＭＶを中和する能力があ
る。これは高力価血清グロブリンと比較したとき、極め
て高い中和活性であり、このようなＭＣＡによるＣＭＶ
感染症の予防あるいは治療が期待される。しかしながら
、これらはマウス由来のＭＣＡであり、人体に投与した
とき異物として認識され不都合な副作用を引き起こす。そこで、マウス由来でなく、ヒト由来の抗ＣＭＶ／ＭＣ
Ａが望まれる。

【０００４】一般にヒト由来のＭＣＡはマウス・ミエロ
ーマ細胞、ヒト・ミエローマ細胞あるいは他のリンパ系
樹立細胞とヒト・リンパ球とを細胞融合して得られるハ
イブリドーマから産生される。あるいはヒト・リンパ球
をＥＢウイルスによって変異させたリンパ芽球細胞から
も産生される。１９８０年から現在まで、多くのヒトＭ
ＣＡ作製の試みがなされてきたが、いずれの方法もそれ
ぞれ固有の問題をかかえている。マウス・ミエローマと
ヒト・リンパ球との細胞融合で得られたハイブリドーマ
のＭＣＡ産生は不安定であるし、ヒト・ミエローマ細胞
とヒト・リンパ球との細胞融合は極めて効率が悪い。ま
たＥＢウイルスによって得られるリンパ芽球細胞のＭＣ
Ａ産生は量が少なく、かつ不安定である。その上、ＥＢ
ウイルスは腫瘍を引き起こす能力を有しており、安全性
上大きな問題がある。このようにＭＣＡ産生細胞を樹立
する技術において大きな障害があるが、さらにもう一つ
、特定抗原に特異的なヒトＭＣＡを得るためには大きな
障害がある。それは充分に免疫されたヒト・リンパ球を
得るという課題である。一般に正常人のリンパ球はＣＭ
Ｖによって感作されていることが多いが、その免疫度合
いは極めて低い。従って、正常人のリンパ球からハイブ
リドーマあるいはリンパ芽球細胞を樹立しても、抗ＣＭ
Ｖ・ＭＣＡを産生する細胞を得られる見込みはほとんど
ない。

【０００５】ＣＭＶに対するヒトＭＣＡについては一つ
だけ産生細胞株が得られたとの報告がある。（Ｊ．　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．　，　１３３，２２０２−２２０５，１
９８４参照）。これによると、正常人リンパ球をＥＢウイルスで変異さ
せて、ＭＣＡ産生細胞株が得られている。しかしながら
、記載されている内容は一葉の蛍光抗体写真のみであり
、ＭＣＡを安定に産生している細胞株が樹立できたのか
否か明白ではない。さらに前述したように、ＥＢウイル
ス由来の発癌性も問題があり、人体に投与することは大
きな危険を伴う。また、この方法によって得られたＭＣ
Ａは、ＣＭＶに結合するとしてもＣＭＶを中和する能力
を全く有していないことが明らかにされている。以上の
如く、目的とする特異性を有するヒトＭＣＡを効率よく
取得する上で最も大きな問題は、ヒト・リンパ球を特定
の抗原で充分免疫することが困難であるということであ
る。マウスの場合には、生体にとって有害な抗原であっ
ても投与しうるし、さらに都合のよい投与スケジュール
で免疫することができるが、人間の場合にはこれができ
ない。ＣＭＶは病原体であり、ワクチンができていない
現在、人間にＣＭＶを故意に投与し、免疫することは倫
理上許されない。ヒトＭＣＡを作製する上で、次に問題
となる点は、ヒトＭＣＡを安定に産生する細胞を樹立す
る方法である。ハイブリドーマ法もＥＢＶ法も一長一短
があることは前にも述べたとおりである。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＣＭ
Ｖ感染症の診断、予防および治療に役立つところの、Ｃ
ＭＶに特異的な、かつ人体にとって安全なヒトＭＣＡを
産生するハイブリドーマを提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、抗ＣＭＶ
・ヒトＭＣＡを取得することを目的として鋭意研究を行
った結果、ｉｎ　　ｖｉｔｒｏでマイト−ジエン存在下
に、ＣＭＶまたはＣＭＶ由来の蛋白もしくは糖蛋白で感
作したヒト・リンパ球と、マウス・ミエローマ細胞とを
融合させる方法によって、抗ＣＭＶ・ヒトＭＣＡを産生
するハイブリドーマを得ることができた。そして、この
ハイブリドーマ及び／又はそれに由来する細胞株を培養
し、培養上清から抗ＣＭＶ・ヒトＭＣＡを採取すること
ができた。本発明のハイブリドーマの産生するヒトＭＣ
Ａは、ＣＭＶ及び／又はＣＭＶ感染細胞に反応する抗体
である。本発明のハイブリドーマの産生する抗ＣＭＶ・
ヒトＭＣＡのなかで好ましいのはＩｇＧ１型のものであ
り、これはまた分子量約１３０，０００と約５５，００
０のＣＭＶ抗原蛋白を認識し、ＣＭＶを中和する能力を
有する。本発明のハイブリドーマは、アメリカンタイプ
　　カルチャー　　コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託番
号ＨＢ９２１５として寄託されているハイブリドーマＣ
４１、またはそれと同様な抗体産生能を有するハイブリ
ドーマである。

【０００８】本発明において用いられるヒト・リンパ球
は脾臓、リンパ節、末梢血、骨髄、扁桃、アデノイド等
の中に含まれている。本発明の目的のためには、いかな
るソースのリンパ球でも用いることができるが、望まし
くは脾臓、骨髄または扁桃である。マウスのミエローマ
細胞としては、８−アザグアニン耐性株を用いるのが有
利であり、公知のものとしては、ＢＡＬＢ／マウスのＰ
３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１株、Ｐ３×６３ＡｇＵ１株
、ＳＰ２／０Ａｇ１４株、Ｐ３×６３Ａｇ８．６．５．
３株、ＭＰＣ１１−４５．６．ＴＧ１．７株、ＳＰ−１
株等がある。

【０００９】本発明においては、ヒトのリンパ球とマウ
スのミエローマ細胞とを融合させるに先立って、ヒトの
リンパ球をｉｎ　　ｖｉｔｒｏでマイト−ジエン存在下
に抗原感作する。ヒトの場合、正常人ではＣＭＶに対す
る抗体を産生し得る能力のあるリンパ球は存在しても、
その数が極めて少ない。そのため目的とするハイブリド
ーマが得られる可能性が極端に低い。これに対して本発
明のｉｎ　　ｖｉｔｒｏでヒト・リンパ球を感作する方
法を採ったときには、その抗原に特異的な抗体を産生す
るリンパ球が選択的に分化、増殖し、その結果、効率よ
く目的のＭＣＡ産生ハイブリドーマを得ることができる
。

【００１０】本発明の実施例においては、感作抗原とし
てＣＭＶのＡＤ１６９株が用いられているが、他の実験
用ＣＭＶ株あるいは臨床分離ＣＭＶ株でも感作できる。さらにＣＭＶそのものでなく、その構成蛋白もしくは構
成糖蛋白を用いてもよい。マイト−ジエンとしては、リ
ンパ球の分化および増殖を促進させるものならば何でも
よいが、例えば、ポークウイードマイト−ジエン（ＰＷ
Ｍ）、Ｂ細胞増殖因子（Ｂ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　
ｆａｃｔｏｒｓ，ＢＣＧＦ）、プロテインＡ，フィトヘ
ムアグルチニン（ＰＨＡ）、コンカナバリンＡがある。好ましいのは２〜２００μｇ　／ｍｌのＰＷＭあるいは
１００分の１容から３分の１容のＢＣＧＦである。

【００１１】感作の方法条件は特に限定されるものでは
ないが、抗原（ＣＭＶまたはＣＭＶ由来の蛋白もしくは
糖蛋白）の濃度は１μｇ　／ｍｌ〜１ｎｇ／ｍｌ、ＰＷ
Ｍは２〜２００μｇ　／ｍｌ、ＢＣＧＦは１００分の１
容から３分の１容、リンパ球（抗体産生細胞）の濃度は
１×１０５　〜１×１０７　個／ｍｌが適当であり、培
養温度は３５〜４０℃で、培養時間は４〜１０日、好ま
しくは６〜８日である。培養液は人、牛、馬などの血清
を含むものなら何でもよいが、特に胎児牛血清（ＦＣＳ
）を含む培養液（例えばＲＰＭＩ１６４０）が好ましい
。

【００１２】かくして得られたＣＭＶで感作したヒトの
抗体産生細胞とマウスのミエローマ細胞とは、次いで公
知の方法に従って細胞融合せしめられる。例えばリンパ
球とミエローマ細胞を１０：１〜１：１００、好ましく
は１：１〜１：１０の比率で混合し、適当な細胞融合溶
液、例えば約３５％ポリエチレングリコール（分子量１
，０００〜６，０００程度）および約７．５％ジメチル
スルホキシドを含むＲＰＭＩ１６４０を加えて、室温〜
３７℃で１〜数分間攪拌し、その後１０％ＦＣＳを加え
ＲＰＭＩ１６４０で徐々に希釈し、洗浄の後、ＨＡＴ（
ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）選択培養
液にて細胞濃度が１〜５×１０５　個／ｍｌとなるよう
に調整する。これを０．２ｍｌずつ、例えば９６穴プレ
ートに分注し、５％ＣＯ２　を含む空気中で３５〜３８
℃で３〜４週間培養する。ＨＡＴ培養液中ではハイブリ
ドーマのみが生存し、８−アザグアニン耐性のミエロー
マ細胞およびミエローマ同士の融合細胞は生存しえない
（未融合の抗体産生細胞は数日で死滅する）。

【００１３】培養後、培養液中の抗体価をチエックし、
目的とする抗体を産生しているハイブリドーマのみを選
択し単離する（クローニング）。培養液中の抗体価のチ
エックは、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）、酵素抗
体法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光抗体法などの、抗原への抗体
の結合そのものを検出する方法と、ウイルスの生物活性
を阻害する抗体の活性をみる方法などで行うことができ
る。クローニングによって選択された、本発明の抗ＣＭ
Ｖ・ヒトＭＣＡを産生するマウス−ヒトハイブリドーマ
は、凍結して保存することができる。かかるハイブリド
ーマのセルライン（細胞株）及び／又はそれに由来する
細胞株を適当な方法で大量に培養すると、培養上清から
本発明の目的とするヒトＭＣＡを得ることができる。ま
た、このハイブリドーマを動物に移植して腫瘍化し、そ
の腹水や血清からヒトＭＣＡを得ることもできる。

【００１４】以上の如くして得られた抗ＣＭＶ・ヒトＭ
ＣＡは、次のような特性を有する。本発明で得られた抗
ＣＭＶ・ヒトＭＣＡは、多くの実験用ＣＭＶ株および臨
床分離株に共通に反応する。しかし、他のヘルペス群ウ
イルスである単純ヘルペスウイルス、ＥＢウイルス、水
痘帯状疱疹ウイルスには反応しない。またＣＭＶ感染細
胞には反応するが、非感染細胞には反応しない。従って
これらのＭＣＡはＣＭＶに特異的であるといえる。この
ようにＣＭＶに特異的であることが明瞭に示されたヒト
ＭＣＡは、本発明において初めて得られたものである。

【００１５】ＣＭＶは多くの抗原物質によって構成され
ている。そこで、本発明のヒトＭＣＡがどのような構成
成分に対して反応するのか検討した結果、分子量約１３
０，０００の蛋白と分子量約５５，０００の蛋白に反応
し、この群のＭＣＡの中には強いウイルス中和活性を有
しているＭＣＡがあることがわかった。これらの特性か
ら考えて、ＣＭＶ感染の診断、ＣＭＶ感染の予防および
治療に適している。予防および治療という目的から考え
たとき、ＭＣＡにウイルス中和（不活化）活性があると
いう点は極めて重要な特性である。

【００１６】

【実施例】以下、実施例により本発明を詳述する。実施例１（１）ＣＭＶ抗原の作製単層に増殖したＨＥＬ細胞に、ＡＤ１６９株感染細胞を
７：１の割合で混ぜ、５日間ＣＯ２　インキュベーター
中で培養した。こうして得られた感染細胞を、０．１％
ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝生理食塩水ではがし、集めた
。次いで、４５秒間超音波破砕し、３，０００ｒｐｍ　で
２０分間遠心した上清を得た。これを６０％と２０％の
重層ショ糖溶液の上に乗せ、１０，０００×ｇで１時間
遠心した。６０％層と２０％層の間にウイルスは集まる
ので、これを採取し、再度超音波処理によってよく分散
させた。これを１．２８ｇ　／ｃｍ３　のＣｓＣｌ２　
溶液の上に乗せて、１００，０００×ｇで４２時間遠心
した。その結果、密度勾配が形成されたＣｓＣｌ２　溶
液の１．２９ｇ　／ｃｍ３　濃度のところにＣＭＶが集
まったので、これを採取し、ｉｎ　　ｖｉｔｒｏ感染作
用抗原として用いた。またＥＬＩＳＡ用の抗原は次のように調製された。ＡＤ
１６９を感染させたＨＥＬ細胞をＣＯ２　インキュベー
ター中で培養し、細胞変性がすべての細胞に観察される
ようになった時点で、感染細胞を集めた。この感染細胞
を３分間超音波処理し、３，０００ｒｐｍ　で２０分間
遠心し、その上清を得た。これをＥＬＩＳＡ用抗原とし
て用いた。

【００１７】（２）ＣＭＶによるリンパ球感作ヒトの脾
臓リンパ球を培養液Ａ（ＲＰＭＩ１６４０＋２０％胎児
牛血清＋２０ｍＭ　　ＨＥＰＥＳ＋２ｍＭグルタミン＋
１ｍＭ　　Ｎａピルビン酸＋０．０２ｍｇ／ｍｌセリン
＋８０μｇ　／ｍｌゲンタマイシン）に浮遊させた。細
胞濃度は１２×１０５　個／ｍｌであった。この細胞浮
遊液を１ｍｌずつ、培養プレート（２４穴）の１５穴に
入れた。それらを３穴ずつ５群に分け、第１群は無添加
、第２群はＣＭＶ抗原１２ｎｇタンパク／ｍｌ、第３群
にはＢＣＧＦ０．１ｍｌ、第５群には同量のＣＭＶとＢ
ＣＧＦ、第５群にはＣＭＶと２０μｇ　／ｍｌのＰＷＭ
を添加した。この培養プレートを３７℃、５％ＣＯ２　
含有空気で６日間培養した。

【００１８】（３）マウス・ミエローマ細胞Ｐ３×６３
Ａｇ８Ｕ１株（Ｐ３ＵＩと略記する）前もってＰ３ＵＩ
を培養液Ｂ（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％胎児牛血清＋２
ｍＭグルタミン＋８０μｇ　／ｍｌゲンタマイシン）中
で培養しておいた。使用時の細胞濃度は６×１０５　個
／ｍｌであった。上記（２）の感作リンパ球（３穴を一
緒にした）５群とＰ３ＵＩを、それぞれ別々に無血清Ｒ
ＰＭＩ１６４０で２回洗浄した。各群３穴のリンパ球と
５×１０６　個のＰ３ＵＩとを試験管の中で一緒にした
。１，５００ｒｐｍ　で５分間遠心し、上清を捨てた。細胞ペレットを、試験管をたたくことによって、よく分
散させた。これに０．５ｍｌのポリエチレングリコール
液（ＲＰＭＩ１６４０５．７５ｍｌ＋ポリエチレングリ
コール１，０００　　３．５ｍｌ＋ジメチルスルホキサ
イド０．７５ｍｌ）（ＰＥＧ液と略記する）を加えて、
細胞をゆるやかに浮遊させた。１分後に０．５ｍｌＲＰ
ＭＩ１６４０を加え、さらに１分後に１ｍｌＲＰＭＩ１
６４０、さらに２分後に４ｍｌのＨＡＴ培養液（ＲＰＭ
Ｉ１６４０＋２０％胎児牛血清＋８０μｇ　／ｍｌゲン
タマイシン＋９５μＭ　ヒポキサンチン＋０．４μＭ　
アミノプテリン＋１．６μＭ　チミジン）、さらに２分
後には４ｍｌのＨＡＴ培養液を加えた。最後に、ＨＡＴ
培養液で２５ｍｌ細胞浮遊液とした。これを培養プレー
ト（９６穴）１枚に蒔いて、３７℃、５％ＣＯ２　含有
空気中で培養した。１週間毎に半量の培養液を新しいＨ
Ｔ培養液（ＨＡＴからＡを除去したもの）で交換してい
きハイブリドーマを得た。

【００１９】（４）ヒトＩｇＧと抗ＣＭＶ抗体の測定Ｅ
ＬＩＳＡによって測定した。ヒトＩｇＧを測定するため
にヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（１０μｇ　／ｍｌ）を、ある
いは抗ＣＭＶ抗体を測定するためにＣＭＶ（ＡＤ１６９
株）２μｇ　タンパク／ｍｌを５０μｌ　／穴ずつそれ
ぞれファルコン・ミクロテストＩＩＩ　の９６穴プレー
トに固定した。このプレートにハイブリドーマ培養上清
６０μｌ　を加えて、室温で１時間放置した。１％牛血
清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するハンクス塩類緩衝液
（ＨＢＳＳ−Ｂ）で３回洗浄の後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗
体−アルカリフォスファターゼ（２，０００倍希釈液）
を６０μｌ　加えて、室温で１時間反応させた。さらに
ＨＢＳＳ−Ｂで３回洗浄したのち、Ｐ−ニトロフェニル
フォスフェートを１Ｍ　ジエタノールアミン＋１ｍＭ　
　ＭｇＣｌ２　のｐＨ９．８溶液に０．６ｍｇ／ｍｌの
割合で溶かした溶液１００μｌ　を加えた。３０分から
６０分後に４０５ｎｍの吸光度を測定し、標準ＩｇＧ液
あるいは標準ＣＭＶ陽性血清との比較から、その値を算
出した。

【００２０】全群とも９６穴プレート１枚に細胞を蒔き
、９６穴中の、ハイブリドーマが成育してきた穴の数（
肉眼で判定）、さらにそのうちヒトＩｇＧを産生してい
るハイブリドーマをもつ穴の数、そして抗ＣＭＶ抗体を
産生している穴の数を表１に示した。ＣＭＶとＢＣＧＦ
を加えたときに最も多くの抗ＣＭＶ抗体産生ハイブリド
ーマが成育した。

【００２１】

【表１】

【００２２】実施例２ヒト脾臓リンパ球を、実施例１の（２）の如くＣＭＶあ
るいはＰＷＭで感作し、実施例１の（３）の如くＰ３Ｕ
Ｉと細胞融合を行った。得られたハイブリドーマのうち
、ＣＭＶに対するＭＣＡを産生しているハイブリドーマ
を以下の如くクローニングした。（１）ハイブリドーマのクローニングクローニングは限定希釈法を用いた。抗ＣＭＶ抗体陽性
の穴より細胞を取り出し、細胞数を数え培養液Ｂを用い
１個／穴あるいは１０個／穴で細胞を蒔いた。２週間後
に細胞が充分増殖したので、その上清に抗ＣＭＶ・ＭＣ
Ａがあるか否かをＥＬＩＳＡによって測定し、抗ＣＭＶ
・ＭＣＡ産生ハイブリドーマを選別した。

【００２３】こうして、ハイブリドーマＣ１、Ｃ３、Ｃ
４、Ｃ７、Ｃ２３およびＣ４１が樹立された。これらの
ハイブリドーマは安定にＩｇＧ型の抗ＣＭＶ・ヒトＭＣ
Ａを産生し続けている。ハイブリドーマＣ４１は、アメ
リカン　　タイプ　　カルチャーコレクション（ＡＴＣ
Ｃ）に１９８６年９月２９日に寄託され、寄託番号はＨ
Ｂ９２１５である。

【００２４】（２）抗ＣＭＶ・ヒトＭＣＡの調製得られ
たハイブリドーマの一つＣ４１を無血清培地ＩＴＥＳ（
ＲＰＭＩ１６４０　　２容＋ダルベッコＭＥＭ１容＋Ｆ
１２　　１容＋インシュリン８．５μｇ　／ｍｌ＋トラ
ンスフェリン２μｇ　／ｍｌ＋エタノールアミン２０μ
Ｍ　＋セレナイト２．５×１０−８Ｍ　）中で培養した
。その培養上清を限外濾過（アミコンＰ３０）で濃縮し
、０．０２Ｍ　リン酸ナトリウム（ｐＨ７．８）に対し
て透析した。同緩衝液で平衡化したＤＥ５２カラム（フ
ァルマシア社製）にかけ、未吸着分画にヒトＭＣＡを回
収した。ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド
電気泳動（ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｆａｔ
ｅ−ｐｏｌｙ−ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅ
ｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＳＤＳ−ＰＡＧＥ　）で分
析した結果、Ｈ鎖とＬ鎖からなる精製ＭＣＡ標品である
ことが確認された。

【００２５】実施例３（１）抗ＣＭＶ・ヒトＭＣＡの感染細胞に対する反応性
ＣＭＶのＡＤ１６９株あるいはＨｉ−１株を感染させた
ＨＥＬ細胞および感染させていない細胞に、抗ＣＭＶ・
ヒトＭＣＡであるＣ１、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ７、Ｃ２３、Ｃ
４１を反応させた。さらにフルオレッセンイソチオシア
ネイト（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｉｓｏｔｈｉｏｃｙ
ａｎａｔｅ，ＦＩＴＣ　）標識抗ヒトＩｇＧ抗体を反応
させ、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、いずれのＭＣ
Ａも非感染細胞には反応せず、感染細胞のみに反応した
。またＣ１、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ７はＡＤ１６９あるいはＨ
ｉ−１感染細胞の細胞質内ＣＭＶ抗原に反応して、細胞
膜上のＣＭＶ抗原には反応しなかった。他方、Ｃ２３と
Ｃ４１は細胞質内抗原と細胞膜上抗原の両方に反応した
。

【００２６】（２）抗ＣＭＶ・ＭＣＡの可溶化ウイルス
抗原に対する反応性抗ＣＭＶ・ＭＣＡのヘルペス属ウイルスに対する結合性
を調べるため、ＨＳＶ−１型２株、ＨＳＶ−２型２株、
ＶＺＶ２株、ＣＭＶ６株、ＥＢＶ１株を各々感染させた
ＨＥＬ細胞および非感染ＨＥＬ細胞から、実施例１の（
１）の如く可溶化抗原を調製し、実施例１の（４）の如
くＥＬＩＳＡを実施した。その結果を表２に示す。抗Ｃ
ＭＶ・ＭＣＡ（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ７、Ｃ２３、Ｃ４
１）はすべてＣＭＶにのみ結合し、他のヘルペス属ウイ
ルス、宿主細胞には結合しなかった。またＣ４１を除く
抗ＣＭＶ・ＭＣＡはＣＭＶ６株すべてに結合した。なお
、Ｈ１は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に対するヒト
ＭＣＡである。

【００２７】

【表２】＊）値は４０５ｎｍの吸収を示す。＊＊）０．１未満で
ある。

【００２８】実施例４抗ＣＭＶ・ヒトＭＣＡのウイルス中和活性ヒトＭＣＡ溶
液２００μｌ　、２００ＣＨ５０／ｍｌの新鮮モルモッ
ト血清を５倍希釈した溶液１００μｌ　およびＣＭＶ（
ＡＤ１６９株）７３７Ｐｆｕ　（ｐｌａｑｕｅ−ｆｏｒ
ｍｉｎｇ　ｕｎｉｔｓ）を含む溶液１００μｌ　を混合
し、３７℃で１時間インキュベートした。この混合液１
００μｌ　を６穴プレートに培養したＨＥＬ細胞にかけ
、３７℃で１時間インキュベートしたのち、０．５％（
Ｗ／Ｖ）アガロースおよび５％（Ｖ／Ｖ）ＦＣＳを含む
ＭＥＭ培地を加えて、ＣＯ２　インキュベーター内で１
１日間培養した。この単層細胞を１０％ホルマリン水溶
液で固定し、０．３％メチレンブルー水溶液によって染
色したのち、ＣＭＶ感染によるプラーク数（ｐｆｕ）を
計測した。中和活性は次のように表した。　　（ＭＣＡ　を入れない対象のｐｆｕ　）−（ＭＣＡ
　を入れたときのｐｆｕ　）　　──────────
───────────────────×１００　　
　　　　　　　　　　　　　　（ＭＣＡ　を入れない対
象のｐｆｕ　）　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　（％）

【００２９】結果を図１に示す。Ｃ２３
は０．７５μｇ　／ｍｌで、Ｃ４１は０．１８μｇ　／
ｍｌで５０％中和を示した。しかしながらＣ１、Ｃ３、
Ｃ４、Ｃ７は全く中和活性を示さなかった。またＨｉ−
１株を用いたときも、Ｃ２３は３．３μｇ　で１００％
中和、Ｃ４１は０．９５μｇ　／ｍｌで１００％中和を
示したのに対し、Ｃ３は１７．７μｇ　／ｍｌで３５％
の中和しか示さなかった。また、実施例３−（２）に掲
げたＡＤ１６９株以外のＣＭＶ株５株について中和活性
を調べたところ、Ｃ２３は１０μｇ　／ｍｌで９５％以
上の中和を全株について示した。一方Ｃ４１は実施例３
−（２）の表２に示したＥＬＩＳＡのデータと同様に、
１０μｇ　／ｍｌではＮｏ．１２株とＹＡＮ−３株につ
いては、各々２０％、６４％のやや弱い中和活性を示し
、他の株については８０％以上の中和活性を示した。

【００３０】実施例５抗ＣＭＶ・ヒトＭＣＡの免疫沈降分析ヒトＭＣＡが反応するウイルス粒子の構成成分が、何で
あるか決めるために、免疫沈降分析を行った。ＨＥＬ細
胞にＣＭＶ（ＡＤ１６９株）を感染させて、３５Ｓ−メ
チオニンでアイソトープ標識を行った。標識した細胞を
、０．０１Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ＋０．１５Ｍ　Ｎａｃ
ｌ＋１％デオキシコール酸ナトリウム＋１％Ｔｒｉｔｏ
ｎ×１００＋０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ
）＋１ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド（
ｐＨ７．４）（溶解液）によって溶解した。これに抗Ｃ
ＭＶ・ヒトＭＣＡを加えて、抗原・抗体複合物を形成さ
せておき、さらにプロテインＡ−セファロース４Ｂによ
って複合体を吸着精製した。これを、０．１２５Ｍ　Ｔ
ｒｉｓ・ＨＣｌ＋１％ＳＤＳ＋３％２−メルカプトエタ
ノール＋１５％グリセリン（ｐＨ８．２）で３分間１０
０℃処理し、その上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動にかけた。泳動後ゲルを乾燥させ、Ｘ線フィ
ルムに−７０℃でさらした。その結果を図２に示す。Ｃ
１は約６４，０００と約５０，０００に、Ｃ２は約６４
，０００と約４６，０００に、Ｃ４とＣ７は約６４，０
００に、Ｃ２３とＣ４１は約１３０，０００と約５５，
０００の分子量をもつウイルス抗原に反応することがわ
かった。

【００３１】実施例６抗ＣＭＶ・ＭＣＡのアイソタイプの同定ヒトＭＣＡのア
イソタイプの同定は以下の如く行った。Ｈ鎖の同定は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、Ｉ
ｇＧ４に対するウサギ抗血清を用いた免疫拡散法（オク
タロニー法）を用い、Ｌ鎖の同定は、ＡＤ１６９感染細
胞を抗原プレートとし、２次抗体にアルカリフォスファ
ターゼ標識したヤギ抗ヒトＫ鎖ないしはλ鎖を用いたＥ
ＬＩＳＡを行った。結果を表３および表４に示す。

【表３】

【表４】

【００３２】

【発明の効果】本発明のハイブリドーマは、ＣＭＶ感染
の診断薬として、またＣＭＶ感染症の予防および治療薬
として利用できる抗ＣＭＶ・ヒトＭＣＡを産生すること
ができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のハイブリドーマの産生する抗ＣＭＶ・
ヒトＭＣＡの、ＣＭＶに対する中和活性を示す図である
。

【図２】本発明のハイブリドーマの産生する抗ＣＭＶ・
ヒトＭＣＡの免疫沈降分析の結果を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　分子量約１３０，０００と約５５，０
００のサイトメガロウイルス抗原蛋白を認識し、サイト
メガロウイルスを中和するヒト・モノクローナル抗体を
産生する、アメリカン　　タイプ　　カルチャー　　コ
レクション（ＡＴＣＣ）に寄託番号ＨＢ９２１５として
寄託されているハイブリドーマＣ４１、またはそれと同
様な抗体産生能を有するハイブリドーマ。